JP2014517683A - 治療抗体を改善する相関突然変異分析の方法 - Google Patents

Abstract

計算的アプローチを通して抗体の製造可能性または開発可能性を改善する方法。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年３月１１日出願の米国仮出願第６１／４５１，９２９号の利益を主張し、該出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

抗体は、種々の疾患の治療のために、非常に効果的で成功した治療用分子であることが分かっているため、生物薬剤業界内で最適なモダリティとなっている。ますます多くの抗体ベースの治療用分子が臨床研究に参入するにつれて、発見の初期段階で候補抗体を評価して改善することが、より重要になっている。該プロセスは、分子、製造可能性、および開発可能性評価および設計別品質等の異なる用語で呼ばれている。この点に関して、抗体工学のための計算方法の適用が、投資される費用および時間を削減するために、効率的な実験設計のための貴重なツールとして現れている。

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤを含む、免疫グロブリン部類のタンパク質に属する。ヒト血清中の最も豊富な免疫グロブリン部類は、概略的構造が図１に示される、ＩｇＧである（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ １９８１、Ｈｕｂｅｒ １９８４、Ｒｏｕｘ １９９９）。ＩｇＧ構造は、２本の軽鎖および２本の重鎖といった４本の鎖を有し、各軽鎖は２つのドメインを有し、各重鎖は４つのドメインを有する。抗原結合部位は、可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメイン、ならびに定常軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１）ドメインを含有する、Ｆａｂ領域（抗原結合断片）中に位置する。重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン領域は、Ｆｃ（結晶化可能断片）と呼ばれる。ヒンジジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンサブクラスの間で変化する（ＰａｐａｄｅａおよびＣｈｅｃｋ １９８９）。ＦｃＲｎ結合部位は、抗体のＦｃ領域中に位置する（Ｍａｒｔｉｎら、２００１）。可変ドメインであるＶＬおよびＶＨは、リンカーポリペプチドを通してともに融合することができ、これは、ｓｃＦｖ、すなわち一本鎖可変断片をもたらす。ｓｃＦｖ自体は、延長した血清の半減期を提供するＦｃ領域が欠如しているが、癌において多くの用途を有する。より小さいサイズのｓｃＦｖが腫瘍細胞への高い浸透を可能にすると主張される。

抗体または可変ドメイン断片の可溶性および安定性等の薬学的性質を改善するように試行が行われてきた。これらの試行は、同種抗体配列の整合に基づいて、残基を最も頻繁なものに突然変異させることと、ターン立体配座を形成する高い傾向を有するアミノ酸を用いてβターンを設計することと、溶剤暴露残基の親水性を増加させることと、追加の水素結合またはジスルフィド結合を追加することと、多数の変異形のライブラリベースのスクリーニングと、生体外または生体内方法による指向進化とを含む。これらのアプローチの多くの組み合わせる方法も、文献で報告されている（ＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒおよびＢｅｄｏｕｅｌｌｅ ２００６、Ｗａｎｇら２００９）。別の工学的方法では、非常にわずかに発現された抗体またはｓｃＦｖからの相補性決定領域が、有利な生物物理学的性質を有する好ましい枠組上に移植された（Ｊｕｎｇら１９９９）。これらのアプローチのうちのいくつかは、公開された論文で論評されている（ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ２００８）。これらの方法のうちのそれぞれは、単独で、または組み合わせて、安定性を増加することの限定的成功を得ているが、それらのうちのいずれも、異なる標的に対する抗体の全ての場合において機能することを保証されていない。

本明細書では、複数の標的に対して、抗体において一貫して性質を向上させた、簡略化された方法が提供される。より重要なことには、利益は、凝集のレベルを低減させること、酸化へのより高い耐性、ｐＨが５から７に変化させられたときに沈殿を排除すること、粘度を減少させること、および発現レベルを改善すること等、安定性を改善することのみを超えたものである。

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計算的アプローチを通して抗体の製造可能性または開発可能性を改善する方法が本明細書で説明される。本明細書で説明される方法は、（ｉ）対保存残基位置の、残基の生理化学的性質に基づく特定と、（ｉｉ）その対保存から、どのように対象とする抗体配列が逸脱するかを評価することと、（ｉｉｉ）逸脱位置を、生殖細胞系または関連生殖細胞系配列内の等価の位置で見出されるアミノ酸と置換することとにかかわる。この方法はしばしば、生殖細胞系列残基に関する問題を特定し、それらを関連生殖細胞系列残基に置き換えることを提案する。この計算方法は、種々の抗原に対する１０個よりも多くの抗体に適用されている。提案された単一または組み合わせの点突然変異は、発現とともに１つ以上の物理的および化学的性質の一貫した向上をもたらした。

第１の態様では、目的とする抗体可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質の１つ以上の特性を改善する方法が本明細書で提供される。本方法は、ａ）残基の生理化学的性質に基づく、可変ドメイン枠組内の対保存残基位置の特定と、ｂ）ａ）で特定された対保存残基位置から、どのようにして目的とする枠組のアミノ酸配列の抗体可変ドメインが逸脱するかを判定することと、ｃ）ｂ）からの逸脱であると判定される１つ以上のアミノ酸残基を、生殖細胞系または関連生殖細胞系配列内の等価の位置で見出されるアミノ酸と置換することとを含む。

対保存残基は、ｉ）生殖細胞系列サブタイプを目的とする抗体可変ドメインに割り当てることと、ｉｉ）（ｉ）で特定された同一の生殖細胞系列サブタイプに属する複数の可変ドメインのフレームワーク領域を整合させることと、ｉｉｉ）整合可変ドメイン内の各位置におけるアミノ酸を、小疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、負電荷を持つ、またはグリシン／欠失として、分類することと、ｉｖ）各対位置の保存スコアを計算することと、ｖ）閾値計算に基づいて、共変または相関突然変異対あるいは対保存残基位置を判定することとによって、特定することができる。

保存スコアを判定する好ましい方法は、同一生理化学的特性に属する対の数を計算することと、異なる生理化学的特性に属する対の数でその合計を減算することとを含む。例えば、２０個のアミノ酸が、疎水性（Ｈ）および極性（Ｐ）という２つのグループに分類されるとき、保存スコア＝（ＨｉＨｊの数＋ＰｉＰｊの数）−ＨｉＰｊの数であり、式中、ｉ＝１、Ｎ−１、ｊ＝ｉ＋１からＮ、Ｎ＝目的とする標的配列の長さである。

目的とする抗体可変ドメイン内の逸脱は、目的とする標的配列からのアミノ酸対を、多重配列整合から特定される相関または共変対と比較することによって判定することができる。
言い換えれば、標的配列の中の逸脱は、可変ドメイン配列のデータベースを使用して特定される、対保存位置の観察されたパターンとは異なるものである。逸脱であると判定されるアミノ酸のうちの１つ以上は、生殖細胞系配列または関連生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸と置換することができる。ある実施形態では、逸脱であると判定される全てのアミノ酸は、生殖細胞系配列または関連生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸と置換される。

好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン、例えば、ｓｃＦｖまたは抗体を含む。重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインは、ヒト可変ドメインであり得る。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。

本方法は、抗原結合タンパク質の１つ以上の特性を改善するために有用である。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、治療用タンパク質である。本方法によって変化させられ得る特性は、過渡的または安定的に移入された宿主細胞内の向上した発現、増加した熱安定性、低減した凝集傾向、増加した生体内半減期、増加した保管期間、増加した折り畳み効率、光誘起酸化への増加した耐性、保管状態中の低減したクリッピング、低減した粘度、ｐＨ変化に対する低減した感受性、ならびに低減した化学的および物理的劣化を含む。

第２の態様では、第１の態様の方法によって改善された抗原結合タンパク質が本明細書で説明される。

第３の態様では、第１の態様の方法によって改善された抗原結合タンパク質の抗体可変ドメインをコード化する、単離核酸が本明細書で説明される。好ましい実施形態では、本方法は、抗体可変ドメイン内の１つ以上の残基を、生殖細胞系列または関連生殖細胞系列残基と置換することを含む。

第４の態様では、第３の態様の単離核酸を含む、宿主細胞が本明細書で説明される。

抗体の概略的構造である。ＩｇＧ１抗体の概略図であり、ドメインが示される。ＩｇＧ１抗体は、２本の重鎖（より長い長さ）および２本の軽鎖（より短い長さ）を伴うＹ字形の四量体である。２本の重鎖は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によってともに連結される。Ｆａｂ−抗原結合断片、Ｆｃ−結晶化可能断片、ＶＬ−可変軽鎖ドメイン、ＶＨ−可変重鎖ドメイン、ＣＬ−定常（配列変動なし）軽鎖ドメイン、ＣＨ１−定常重鎖ドメイン１、ＣＨ２−定常重鎖ドメイン２、ＣＨ３−定常重鎖ドメイン３。 相補性決定領域（薄い影付き）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を示す、抗体の可変ドメイン断片の結晶構造のリボン表現。可変ドメインは、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）から成る。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、高い配列変動性を有し、結合に関与する。フレームワーク領域は、主にβ鎖二次構造およびターンから成る。ＶＬドメインは、広い界面領域に至るＶＨドメインに接触する。 生理化学的性質（疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、負電荷を持つ等）に基づいて、相関アミノ酸対を分析し、アミノ酸置換を特定して共変違反を是正するために使用されるスキームのフローチャート。違反を修正するアミノ酸置換は、密接に関係する生殖細胞系配列の中の対応する位置における残基の調査を通して特定される。さらに、データベース内の対応する位置におけるアミノ酸の構造的状況および発生頻度もまた、単一のアミノ酸置換にさらに絞り込むために考慮される。 ヒト生殖細胞系配列との標的抗体の可変（ａ）重鎖および（ｂ）軽鎖ドメイン配列の整合。標的配列への同一性の割合（％）に基づく、上位５つだけの密接に関係する生殖細胞系列が、ここでは整合において示されている。相関突然変異分析を通して修飾のために特定された位置が、線で囲まれている。 ヒト生殖細胞系配列との標的抗体の可変（ａ）重鎖および（ｂ）軽鎖ドメイン配列の整合。標的配列への同一性の割合（％）に基づく、上位５つだけの密接に関係する生殖細胞系列が、ここでは整合において示されている。相関突然変異分析を通して修飾のために特定された位置が、線で囲まれている。 標的抗体配列の中の相関突然変異対および違反を特定するために本明細書で説明される方法を実現する、コンピュータプログラムの出力の一部。保存スコアおよび閾値を使用して判定されるような目的とする標的配列内の位置およびその共変位置が、示されている。括弧の内側の数字は、保存スコアを示す。プラス（＋）は、パターンが既知の後列配列で観察されるものに類似することを示し、マイナス（−）は、パターンが既知の抗体配列で観察されるものとは異なることを示す［共変違反または逸脱］。角括弧の内側に示される割合は、その位置における配列変動性の尺度である、エントロピーを示す。Ｆ５１の場合、それは位置Ｖ１３、Ａ１９、Ｉ２１、Ｃ２３、Ｌ４２、Ｐ４５、Ｐ４９、Ｌ５２、Ｉ５３、Ｖ６３、Ｐ６４、Ｌ７８、Ｉ８０、Ｖ８３、Ｖ９０、およびＣ９３に相関することに留意されたい。しかしながら、Ｆ５１は、マイナス（「−」）符号によって示されるように、あらゆる場合において違反である（相関性がない）。これは、位置５１におけるＰｈｅが小疎水性残基に突然変異させられるべきであることを示唆する。 親抗体および相関突然変異分析を通して特定される突然変異体の過渡的発現。最大で２０倍の発現の改善が、親分子と比較して変異体に見られる。 （ａ）親抗体および相関突然変異分析を通して特定される突然変異体の示差走査熱量測定プロファイル。変異体は、親と比較して同等または改善された熱安定性を呈する。具体的には、最大数の突然変異を有する変異体が、熱安定性の最高の改善を示す。（ｂ）Ｋｉｎｅｘａを使用した親抗体およびその変異体の結合分析。親抗体および変異体は、類似（Ｋｄの２倍差以内の）結合特性を呈する。 ヒト生殖細胞系配列との標的抗体の可変（ａ）重鎖および（ｂ）軽鎖ドメイン配列の整合。標的配列への同一性の割合（％）に基づく、上位５つだけの密接に関係する生殖細胞系列が、ここでは整合において示されている。修飾のために相関突然変異分析を通して特定された位置が線で囲まれている。 ヒト生殖細胞系配列との標的抗体の可変（ａ）重鎖および（ｂ）軽鎖ドメイン配列の整合。標的配列への同一性の割合（％）に基づく、上位５つだけの密接に関係する生殖細胞系列が、ここでは整合において示されている。修飾のために相関突然変異分析を通して特定された位置が線で囲まれている。 第２の標的抗体のために作製および分析された変異体のリスト。Ｙ２３１Ｆ突然変異は相関突然変異分析によって示唆されなかったことに留意されたい。 ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式での親抗体およびその変異体の過渡的発現レベル。（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、２５０ｍｌ産生実行時の過渡的発現レベルおよび精製収率に対応する。（ｃ）は、１０ｍｌ産生実行時の繰り返しの発現試験に対応する。変異体は、親抗体と比較して、同等またはより良好な発現を有していた。具体的には、最大数の突然変異を有する変異体が、発現レベルの最大改善を示した。 相関突然変異分析に基づいて設計された、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式での親抗体およびその変異体のＳＥＣによって測定された凝集レベル。 （ａ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式および（ｂ）ＩｇＧ形式での親抗体およびその変異体の熱安定性プロファイル。全ての変異体が、親抗体と比較して同等または向上した熱安定性を示す。具体的には、最大数の突然変異を有する変異体が、熱安定性の最大改善を示す（エンタルピーおよび融解温度の両方が改善した）。 （ａ）親抗体およびその変異体のＦＡＣＳベースの結合分析。全ての変異体が、（ｂ）に示される幾何平均分析によって示されるように、この分析で類似結合プロファイルを示す。 （ａ）相関突然変異分析を通して特定された第３の標的抗体およびその変異体の発現レベル。変異体は、親抗体と比較して、３倍から４倍改善された発現レベルを示す。最大数の突然変異を有する変異体が、発現レベルの最大改善を示す。（ｂ）この特定の場合において、結合分析は、最大数の突然変異を有する変異体が、わずかに低いＩＣ５０値を示すことを明らかにする。 他の２つの述べられた実施例と一致して、相関突然変異分析を通して特定された変異体が、改善された熱安定性を示す。最大数の突然変異を有する設計（Ｆ１５）は、熱安定性の最大改善を示す。 第４の標的親抗体および相関突然変異分析を通して設計されたその変異体の発現力価レベル。突然変異の数が増加させられるにつれて、発現レベルの増分的改善が見られた。

定義
「抗原結合タンパク質」は、１つ以上の抗体可変ドメインを含有し、抗原と特異的に結合するタンパク質またはポリペプチドである。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、相互作用して、ともに抗原と特異的に結合する、２つの可変ドメインを含む。抗原結合タンパク質の実施形態は、抗原と特異的に結合する、本明細書で様々に定義されるような抗体およびその断片を含む。抗原結合タンパク質は、随意に、１つ以上の翻訳後修飾を含んでもよい。

本明細書で使用されるような「特異的に結合する」とは、抗原結合タンパク質が他のタンパク質よりも優先的に抗原に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する」とは、抗原結合タンパク質が他のタンパク質よりも抗原に対してより高い親和性を有することを意味する。抗原と特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１×１０^−７Ｍ以下、２×１０^−７Ｍ以下、３×１０^−７Ｍ以下、４×１０^−７Ｍ以下、５×１０^−７Ｍ以下、６×１０^−７Ｍ以下、７×１０^−７Ｍ以下、８×１０^−７Ｍ以下、９×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８Ｍ以下、２×１０^−８Ｍ以下、３×１０^−８Ｍ以下、４×１０^−８Ｍ以下、５×１０^−８Ｍ以下、６×１０^−８Ｍ以下、７×１０^−８Ｍ以下、８×１０^−８Ｍ以下、９×１０^−８Ｍ以下、１×１０^−９Ｍ以下、２×１０^−９Ｍ以下、３×１０^−９Ｍ以下、４×１０^−９Ｍ以下、５×１０^−９Ｍ以下、６×１０^−９Ｍ以下、７×１０^−９Ｍ以下、８×１０^−９Ｍ以下、９×１０^−９Ｍ以下、１×１０^−１０Ｍ以下、２×１０^−１０Ｍ以下、３×１０^−１０Ｍ以下、４×１０^−１０Ｍ以下、５×１０^−１０Ｍ以下、６×１０^−１０Ｍ以下、７×１０^−１０Ｍ以下、８×１０^−１０Ｍ以下、９×１０^−１０Ｍ以下、１×１０^−１１Ｍ以下、２×１０^−１１Ｍ以下、３×１０^−１１Ｍ以下、４×１０^−１１Ｍ以下、５×１０^−１１Ｍ以下、６×１０^−１１Ｍ以下、７×１０^−１１Ｍ以下、８×１０^−１１Ｍ以下、９×１０^−１１Ｍ以下、１×１０^−１２Ｍ以下、２×１０^−１２Ｍ以下、３×１０^−１２Ｍ以下、４×１０^−１２Ｍ以下、５×１０^−１２Ｍ以下、６×１０^−１２Ｍ以下、７×１０^−１２Ｍ以下、８×１０^−１２Ｍ以下、または９×１０^−１２Ｍ以下の抗原に体する結合親和性を有し得る。

本明細書で意味されるような「抗体」は、少なくとも２つの可変領域、多くの場合は重鎖および軽鎖可変領域を含有する、タンパク質である。したがって、「抗体」という用語は、一本鎖Ｆｖ抗体（リンカーによって接合される重鎖および軽鎖可変領域を含有するｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２′、Ｆａｂ′、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第３版内の第９章、Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．２８４−２８６で説明されているような）、またはほ乳類で見出される自然発生ＩｇＧ抗体等の２本の全長重鎖および２本の全長軽鎖を含有する全長抗体（同書）を包含する。すなわち、そのようなＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプであり得、かつヒト抗体であり得る。抗体の構造を説明したＣａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓおよびＣａｐｒａの部分は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、「抗体」という用語は、ラクダおよび他のヒトコブラクダ種ならびにサメで見出される自然発生抗体等の、２本の重鎖を含有し、軽鎖を含有しない二量体抗体を含む。例えば、Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０、Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １４：２９０１−２９０９を参照されたい。抗体は、単一特異的（つまり、一種類だけの抗原に結合する）または多特異的（つまり、一種類よりも多くの抗原に結合する）であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異的（すなわち、２つの異なる種類の抗原に結合する）であり得る。さらに、抗体は、一価、二価、または多価であり得、それは一度に１個または２個またはそれ以上の抗原分子に結合することができることを意味する。そのような抗体の可能な形式のうちのいくつかは、多くの他の可能な抗体形式の中でも、単一特異的または二重特異的全長抗体、単一特異的一価抗体（その関連部分が参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開国際公開第２００９／０８９００４号および米国公開第２００７／０１０５１９９号で説明されるような）、二価単一特異的または二重特異的二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ、単一特異的一価ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ、ならびに米国公開第２００９／０３１１２５３号（その関連部分が参照することにより本明細書に組み込まれる）で説明されている多特異的結合タンパク質および二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。

「抗体可変ドメイン」抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、典型的には、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を呈し、３つの超可変領域、すなわち、相補性決定領域またはＣＤＲが加わる。ＣＤＲは、抗原認識および結合に主に関与する。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整合させられ、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．（２０１０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ第２巻（第２版）内、Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ編）。

「可変ドメイン枠組」領域は、Ｋａｂａｔの定義によって定義される。しかしながら、ＣｈｏｔｈｉａおよびＡＨｏ等の構造ベースの定義も、フレームワーク領域を定義するために使用することができる。既知の抗体配列番号付け方式の近年の論評については、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．（２０１０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ第２巻（第２版）内、Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ編を参照されたい。

「重鎖可変ドメイン」は、重鎖遺伝子座に由来する可変ドメインである。このドメインは、抗原結合部位またはパラトープを含み、アミノ酸配列は、標的上の標的抗原または結合部位（エピトープ）に応じて変化し得る。

「軽鎖可変ドメイン」は、軽鎖遺伝子座に由来する可変ドメインである。このドメインは、抗原結合部位またはパラトープを含み、アミノ酸配列は、標的上の標的抗原または結合部位（エピトープ）に応じて変化し得る。

「ヒト軽鎖可変ドメイン」は、ヒト軽鎖遺伝子座に由来する可変ドメインである。このドメインは、抗原結合部位またはパラトープを含み、アミノ酸配列は、標的上の標的抗原または結合部位（エピトープ）に応じて変化し得る。

「ヒト重鎖可変ドメイン」は、ヒト重鎖遺伝子座に由来する可変ドメインである。このドメインは、抗原結合部位またはパラトープを含み、アミノ酸配列は、標的上の標的抗原または結合部位（エピトープ）に応じて変化し得る。

「ヒト抗体」は、軽鎖と、重鎖とを含む、抗体であり、可変および一定領域の両方は、ヒト遺伝子座に由来する。

「生理化学的性質に基づくアミノ酸のグループ分けまたは分類」アミノ酸は、それらの生理化学的性質に基づいて分類される。１つのグループ分けの方法では、配列の中の２０個の自然発生アミノ酸およびアミノ酸欠失が、小疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、およびＰｒｏ、芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ、中立極性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、負電荷を持つ：ＡｓｐおよびＧｌｕ、正電荷を持つ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ、側鎖なし：Ｇｌｙおよび欠失等の６つのグループに分類される。別のグループ分けの方法では、アミノ酸および欠失は、疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ、極性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ、帯電：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ、側鎖なし：Ｇｌｙおよび欠失等の４つのグループに分類される。さらに別のグループ分けの方法では、アミノ酸Ｃｙｓが、疎水性ならびに中立極性残基と見なされ得、Ｈｉｓが極性アミノ酸と見なされ得る。

「保存スコア」は、同一生理化学的特性に属する対の合計、と異なる生理化学的特性に属する対の合計でそれを減算するものとして定義される。例えば、６グループ分類については、保存スコア＝Ｘｉ Ｘｊの数−Ｘｉ Ｙｊの数であり、式中、ＸおよびＹは、小疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、負電荷を持つ、またはグリシン／欠失アミノ酸であってもよいが、ＸはＹに等しくなく、ｉ＝１、Ｎ−１、ｊ＝ｉ＋１、Ｎ、Ｎ＝標的配列可変ドメインの長さである。

「閾値」またはカットオフは、保存スコアを、多重配列整合で使用される（Ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴデータベースからの）既知の可変ドメイン配列の総数で除し、１００倍したものとして定義される。ある実施形態では、閾値は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。好ましい実施形態では、多重配列整合は、少なくとも５個の既知の可変ドメイン、少なくとも１０個の既知の可変ドメイン、少なくとも２０個の既知の可変ドメイン、少なくとも５０個の既知の可変ドメイン、少なくとも７５個の既知の可変ドメイン、少なくとも１００個の既知の可変ドメイン、少なくとも１５０個の既知の可変ドメイン、少なくとも２００個の既知の可変ドメイン、少なくとも２５０個の既知の可変ドメイン、少なくとも３００個の既知の可変ドメイン、少なくとも４００個の既知の可変ドメイン、少なくとも５００個の既知の可変ドメイン、少なくとも６００個の既知の可変ドメイン、少なくとも７００個の既知の可変ドメイン、少なくとも８００個の既知の可変ドメイン、少なくとも９００個の既知の可変ドメイン、少なくとも１０００個の既知の可変ドメイン、少なくとも１５００個の既知の可変ドメイン、少なくとも２０００個の既知の可変ドメイン、少なくとも３０００個の既知の可変ドメイン、少なくとも４０００個の既知の可変ドメイン、または少なくとも５０００個の既知の可変ドメインを含む。

「生殖細胞系配列」は、所与の抗体配列との配列同一性の最高の割合（％）を有する、ヒト生殖細胞系配列として定義される。生殖細胞系配列は、ヒト生殖細胞系配列データベースとの所与の抗体配列の比較に基づいて特定される。

「関連生殖細胞系配列」は、所与の抗体配列と８０％を上回る配列同一性を共有する、ヒト生殖細胞系配列である。しばしば、関連生殖細胞系列は、所与の抗原配列との配列同一性の最高の割合（％）を有する、上位５つのヒト生殖細胞系配列を指す。時として、関連生殖細胞系配列を特定するために使用されるカットオフ率は、所与の標的抗体配列と８０％を上回る配列同一性を共有する、５つよりも少ない生殖細胞系配列があるときに、８０％から７０％に下げられる。

使用されるデータベース：基本的に、抗体可変ドメイン配列を含有する、いかなるデータベースも使用することができる。好ましいデータベースは、ヒト生殖細胞系配列データベース、Ｋａｂａｔ（ＷｕおよびＫａｂａｔ １９７０）、抗体配列データベース、および／またはＩＭＧＴ抗体配列データベースを含む。これらのデータベースは、軽鎖および重鎖対データベースを生成するようにさらに処理され得、それはＶＬ／ＶＨ界面における相関対突然変異を分析するために使用される。

「相関突然変異、対保存残基位置、または共変」は、アミノ酸対の生理化学的性質の共同変化として定義される。所与の抗体配列の中の全ての可能な位置的な対が、相関突然変異挙動を分析するために考慮される。例えば、配列の中の位置１が、位置２と比較され、次いで、位置３、次いで、位置４と比較される等である。

「相関突然変異、対保存残基位置、または共変からの逸脱」は、既知の可変ドメイン配列の多重配列整合を使用して特定される、対保存残基位置の観察されたパターンとは異なる、標的配列の中のアミノ酸対として定義される。例えば、標的配列の中の位置ｉおよびｊが、異なる生理化学的特性を有する（例えば、ｉが疎水性であり、ｊが極性アミノ酸である）一方で、データベースでは、等価の位置ｉおよびｊは、同一生理化学的グループ分けに属する（例えば、ｉおよびｊの両方がアミノ酸の疎水性グループに属する）。

「対応する位置」は、配列整合に基づいて特定される。２つの異なる抗体に属する２つの位置は、従来の配列整合で視認されたとき、２つの配列を整合させるときに一方が他方のアミノ酸の下に位置付けられる場合に、対応すると見なされる。

「配列を整合させる」有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進対整合を使用して、関連配列のグループから多重配列整合を作成する。それはまた、整合を作成するために使用されるクラスタ化関係を示すツリーも描画する。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の累進整合方法の簡素化版を使用し、本方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３によって説明されるものに類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００というデフォルトギャップ重量、０．１０というデフォルトギャップ長重量、および加重末端ギャップを含む。

さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア、９に設定された閾値Ｔパラメータ、ギャップなし拡張、ｋという電荷ギャップ長、１０＋ｋという費用をトリガするツーヒット方法、１６に設定されたＸ_ｕ、およびデータベース検索段階のために４０、アルゴリズムの出力段階のために６７に設定されたＸ_ｇを使用する。ギャップ付き整合は、約２２ビットに対応するスコアによってトリガされる。

多重配列整合に一般的に使用されている別のアルゴリズムは、ＣｌｕｓｔａｌまたはＣｌｕｓｔａｌＷである（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ １９８８）。Ｃｌｕｓｔａｌパラメータは、ギャップペナルティを含む。他の一般的に使用されているアルゴリズムは、ＭＵＳＣＬＥと呼ばれる。

「改善された発現」とは、改善前の抗原結合タンパクと比較して、本発明の方法によって改善された、宿主細胞における抗原結合タンパク質の増加した発現として本明細書で定義される。宿主細胞は、抗原結合タンパク質の構成要素をコード化する１つ以上の核酸が過渡的に移入されるか、または安定的に移入され得る。改善された発現は、少なくとも５％の改善、少なくとも１０％の改善、少なくとも１５％、少なくとも２０％の改善、少なくとも２５％の改善、少なくとも３０％の改善、少なくとも３５％の改善、少なくとも４０％の改善、少なくとも４５％の改善、少なくとも５０％の改善、少なくとも５５％の改善、少なくとも６０％の改善、少なくとも６５％の改善、少なくとも７０％の改善、少なくとも７５％の改善、少なくとも８０％の改善、少なくとも８５％の改善、少なくとも９０％の改善、少なくとも９５％の改善、少なくとも１００％の改善、または２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、または少なくとも１００倍であってもよい。

「改善された熱安定性」とは、改善前の抗原結合タンパクと比較して、本発明の方法によって改善された、抗原結合タンパク質の融解温度（Ｔｍ）の上昇として本明細書で定義される。熱安定性改善は、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、または少なくとも１０℃であり得、抗原結合タンパク質のＴｍを測定する方法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、ならびに遠および近紫外線ＣＤ分光法を含むが、それらに限定されない。

［発明の詳細な説明］
本明細書では、計算的アプローチを通して抗体の製造可能性または開発可能性を改善する方法が説明される。理想的には、候補抗体分子は、よく発現するべきであり、いずれの凝集問題も有するべきではなく、より高い物理的および化学的安定性、ならびに光誘起酸化への耐性等の他の改善された生物物理学的性質を有するべきである。本明細書で説明される方法は、（ｉ）生理化学的性質に基づく、対保存残基位置の特定と、（ｉｉ）観察された対保存から、どのように目的とする抗体配列が逸脱するか（「違反」）を評価することと、（ｉｉｉ）免疫原性を低減させるために、逸脱位置を、配列および構造的状況を保つ生殖細胞系または関連生殖細胞系配列で見出されるアミノ酸と置換することを扱う。

観察された違反は、非生殖細胞系列残基に限定されず、さらに、本方法は、しばしば、生殖細胞系列残基に関する問題を特定し、それらが関連する生殖細胞系列残基に置き換えられることを提案する。本方法は、異なる抗原に結合する十数個の抗体に適用され、２９３およびＣＨＯ細胞における熱安定性および過渡的発現の一貫した改善を観察している。しばしば、全ての違反を修正させた抗体構築物が、熱安定性および発現の最大の改善を示す。これは、本明細書で説明される方法によって特定された違反が有意義なものであり、成功が偶然の成果ではないことを示唆する。一般に、熱安定性の観察される改善は、分子および修正された違反の数に依存して、１℃から１２℃まで様々であり、発現の改善は、過渡的発現において２倍から１００倍まで様々である。

共変または相関突然変異分析の第１のステップは、関連抗体配列の多重配列整合に基づいて、相関性があるか、または共変する対位置を特定することを伴う（図３）。この目的で、２０個の自然発生アミノ酸が、それらの生理化学的性質に基づいて、種々のグループに分類される。例えば、６グループ分類では、２０個のアミノ酸は、小疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、および負電荷を持つ残基として分類される。配列の中のグリシンおよび欠失は、第６のグループと見なされる。保存スコアは、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５４：１７９−１９４，２００４（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．２００４）で説明されているものに類似する式を使用して、各対位置に対して計算される。保存スコアは、同一生理化学的グループに属する対の数で、異なる生理化学的グループに属する対の数でその合計を減算するものとして定義される。例えば、３つのグループに分類される２０個のアミノ酸の場合、保存スコア＝ＨｉＨｊの数＋ＰｉＰｊの数−［ＨｉＰｊの数＋ＨｊまたはＰｊを伴うｉにおける欠失の数］である。式中、ｉ＝１、Ｎ−１、ｊ＝ｉ＋１、Ｎ、Ｎ＝目的とする標的配列の配列長、Ｈ−疎水性、Ｐ−極性アミノ酸である。保存スコアは、正または負の整数であり得る。

閾値またはカットオフは、保存スコア×１００／配列の総数として定義される。保存スコアに基づいて、異なる閾値レベル（６０から９０％）で相関性がある対位置が特定される。相関突然変異分析の第２のステップは、標的抗体配列における逸脱（または共変逸脱）、すなわち、関連抗体配列では相関性がある（既知の抗体配列が、目的とする標的配列と同じサブタイプに属する）が、標的配列では相関性がない対を特定することを伴う。相関突然変異分析の第３のステップは、共変違反を修正することを伴う。これは、どのアミノ酸が関連抗体配列のデータベース内の共変違反位置で頻繁に発生しているかを調べることによって、行われてもよい。さらに、好ましい実施形態では、置換アミノ酸が、生殖細胞系列または関連生殖細胞系配列で見出され、配列および構造的状況が生殖細胞系配列の場合のように維持されることを確実にするように、注意が払われる。このステップは、突然変異により生じ得る免疫原性の可能性を低減させるように行われる。
本発明の方法によって改善された抗原結合タンパク質

基本的に、抗体可変ドメインを含む、いかなる抗原結合タンパク質も、本明細書で説明される方法によって分析され得、違反が可変ドメインの配列で見出されたとき、違反残基の、非違反残基、例えば、生殖細胞系列または関連生殖細胞系列残基による置換を通して改善され得る。好ましい抗原結合タンパク質は、治療抗体である。改善された治療抗体は、軽鎖の可変ドメインおよび／または重鎖の可変ドメインにおいて１つ以上の違反が「修正」されたものであり得る。

ある実施形態では、本明細書で説明される方法によって分析および改善された抗原結合タンパク質は、臨床試験において、または臨床用途のための開発において使用するために承認された治療抗体である。そのような治療抗体は、非ホジキンリンパ腫を治療するために承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体である、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照）、Ｇｅｎｍａｂによって現在開発されている抗ＣＤ２０である、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号で説明されている抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、およびＰＲＯ７０７６９（「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されたＰＣＴ／ＵＳ第２００３／０４０４２６号）、乳癌を治療するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体である、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（例えば、米国特許第５，６７７，１７１号を参照）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって現在開発されているペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））、米国特許第４，７５３，８９４号で説明されている抗Ｈｅｒ２抗体、種々の癌の臨床試験におけるキメラ抗ＥＧＦＲ抗体である、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号、ＰＣＴ国際公開第９６／４０２１０号）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、米国特許第６，２３５，８８３号）、Ｇｅｎｍａｂによって現在開発されているＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（米国第１０／１７２，３１７号）、４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、およびＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号、Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．１９８７，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５２（２）：５４９−６０、Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５−２０、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３）、ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＰＣＴ国際公開第９５／２００４５号、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９３，２２（１−３）：１２９４６、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９３，６７（２）：２４７−５３、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７３（２）：２２８−３５、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０５（２）：２７３−８０）、ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３（ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣａｎａｄａおよびＣｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号、米国特許第６，５０６，８８３号、Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（１）：７１−８１）、ｍＡｂ−８０６（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（２）：６３９−４４）、ＫＳＢ−１０２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＭＲ１−１（ＩＶＡＸ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ国際公開第０１６２９３１Ａ２号）、およびＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ国際公開第０１／８８１３８号）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療のために現在承認されているヒト化モノクローナル抗体である、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体である、ムロモナブＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標））、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体である、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体である、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ−３Ｆｃ融合である、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、Ｈｕｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された完全ヒトＴＮＦ抗体である、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ−１４８）、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＣＤ１４７抗体である、ＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＩＬ８抗体である、ＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＭＵＣ１８抗体である、ＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１である、ペムツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されている抗ＭＵＣ１抗体である、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体である、Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体である、ＶＬＡ−１ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体である、ＬＴＢＲ ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されている抗ＴＧＦ−ベータ２抗体である、ＣＡＴ−１５２、Ａｂｂｏｔｔによって開発されている抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体である、ＡＢＴ ８７４（Ｊ６９５）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅによって開発されている抗ＴＧＦベータ１抗体である、ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されている抗エオタキシン１抗体である、ＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．によって開発されている抗Ｂｌｙｓ抗体である、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．によって開発されている抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体である、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＶＥＧＦ抗体である、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗組織因子抗体である、抗組織因子（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＩｇＥ抗体である、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＸｏｍａによって開発されている抗ＣＤ１１ａ抗体である、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されているＭＬＮ−０２抗体（以前はＬＤＰ−０２）、Ｇｅｎｍａｂによって開発されている抗ＣＤ４抗体である、ＨｕＭａｘ ＣＤ４、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発されている抗ＩＬ１５抗体である、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘによって開発されているＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発されている抗ヘパラナーゼＩ抗体である、ＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発されているＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂによって開発されているＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、ＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ４抗体である、ＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ８０抗体である、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ２３である、ＩＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗イディオタイプ抗体である、ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ＫＤＲ抗体である、ＩＭＣ−１Ｃ１１、
Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ｆｌｋ−１抗体である、ＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ＶＥカドヘリン抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されている抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体である、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（登録商標）（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されている抗ＣＤ２２抗体である、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されている抗ＣＴＬＡ４抗体である、ＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されている抗ＣＤ３０抗体である、ＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されているＭＤＸ−０７０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されているＭＤＸ−０１８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発されている抗Ｈｅｒ２抗体である、Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ−１）、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＣＤ４抗体である、ＨｕＭａｘ（登録商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＩＬ１５抗体である、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発されている抗ＴＮＦアルファ抗体である、ＣＮＴＯ １４８、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発されている抗サイトカイン抗体である、ＣＮＴＯ １２７５、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発されている抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体である、ＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発されている抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体である、ＭＯＲ２０１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ＣＤ３ 抗体である、Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビジリズマブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ガンマインターフェロン抗体である、ＨｕＺＡＦ．ＲＴＭ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗アルファ５ベータ１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ＩＬ−１２、Ｘｏｍａによって開発されている抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体である、ＩＮＧ−１、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＮｏｖａｒｔｉｓによって開発されているヒト化抗ＩｇＥ抗体である、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、およびＸｏｍａによって開発されている抗ベータ２インテグリン抗体である、ＭＬＮ０１を含むが、それらに限定されず、この段落内の上で引用される参考文献の全ては、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。

本明細書で説明される方法によって分析され、改善され得る、追加の抗原結合タンパク質は、以下の米国特許および公開特許出願で説明されているものを含む（それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる：第７３６４７３６号、第７８７２１０６号、第７８７１６１１号、第７８６８１４０号、第７８６７４９４号、第７８４２７８８号、第７８３３５２７号、第７８２４６７９号、第７８０７７９８号、第７８０７７９５号、第７８０７１５９号、第７７３６６４４号、第７７２８１１３号、第７７２８１１０号、第７７１８７７６号、第７７０９６１１号、第７７００７４２号、第７６５８９２４号、第７６２８９８６号、第７６１８６３３号、第７６０１８１８号、第７５９２４３０号、第７５８５５００号、第７５７９１８６号、第７５７２４４４号、第７５６９３８７号、第７５６６７７２号、第７５４１４３８号、第７５３７７６２号、第７５２４４９６号、第７５２１０５３号、第７５２１０４８号、第７４９８４２０号、第７４４９５５５号、第７４３８９１０号、第７４３５７９６号、第７４２３１２８号、第７４１１０５７号、第７３７８０９１号、第７３７１３８１号、第７３３５７４３号、第７２８８２５３号、第７２８５２６９号、第７２６５２１２号、第７１３５１７４号、第７０８４２５７号、第７０８１５２３号、第６１６９１６７号、第６１４３８７４号、第４５９９３０６号、第４５０４５８６号、第７７０５１３０号、第７５９２４２９号、第６８４９４５０号、第７８２０８７７号、第７７９４９７０号、第７５６３４４２号、第７４２２７４２号、第７３２６４１４号、第７２８８２５１号、第７２０２３４３号、第７１４１６５３号、第７０９０８４４号、第７０７８４９２号、第７０３７４９８号、第６９２４３６０号、第６６８２７３６号、第６５００４２９号、第６２３５８８３号、第５８８５５７４号、第７８７２１１３号、第７８０７７９６号、第７７８６２７１号、第７７６７７９３号、第７７６３４３４号、第７７４４８８６号、第７７４１１１５号、第７７０４５０１号、第７６３８６０６号、第７４１１０５０号、第７３０４１４４号、第７２８５６４３号、第７２７３６０９号、第７１９９２２４号、第７１３８５００号、第７０６７４７５号、第７０５７０２２号、第７０４５１２８号、第６７９３９１９号、第６７４０５２２号、第６７１６５８７号、第６５９６８５２号、第６５６２９４９号、第６５２１２２８号、第６５１１６６５号、第６２３２４４７号、第６１８４３５９号、第６１７７０７９号、第６１５０５８４号、第６１１０６９０号、第６０７２０３７号、第６０１５５５９号、第６００４５５３号、第５９６９１１０号、第５９６１９７４号、第５９２５７４０号、第５８９２００１号、第５７８５９６７号、第５７２８８１３号、第５７１７０７２号、第５６７７４３０号、第５６２０８８９号、第５５９１６３０号、第５５４３３２０号、第２０１１００５２６０４号、第２０１１００４５５３７号、第２０１１００４４９８６号、第２０１１００４００７６号、第２０１１００２７２８７号、第２０１１００１４２０１号、第２０１１０００８８４１号、第７８８８４８２号、第７８８７７９９号、第２０１００２９２４４２号、第２０１００２５５５３８号、第２０１００２５４９７５号、第２０１００２４７５４５号、第２０１００２０９４３５号、第２０１００１９７００５号、第２０１００１８３６１６号、第２０１００１１１９７９号、第２０１０００９８６９４号、第２０１０００４７２５３号、第２０１０００４０６１９号、第２０１０００３６０９１号、第２０１０００３４８１８号、第２０１０００２８９０６号、第２０１０００２８３４５号、第２０１０００１５７２３号、第７７９５４１３号、第２００９０３０６３５１号、第２００９０２８５８２４号、第２００９０２７４６８８号、第２００９０２６３３８３号、第２００９０２４００３８号、第２００９０２３８８２３号、第２００９０２３４１０６号、第２００９０２２６４４７号、第２００９０２２６４３８号、第２００９０２１４５５９号、第２００９０１９１２１２号、第２００９０１７５８８７号、第２００９０１５５２７４号、第２００９０１５５１６４号、第２００９００７４７５８号、第２００９００４１７８４号、第２００８０２９２６３９号、第２００８０２４８０４３号、第２００８０２２１３０７号、第２００８０１６６３５２号、第２００８０１５２５８７号、第２００８０１０７６５５号、第２００８００６４１０４号、第２００８００３３１５７号、第２００７０２３７７５９号、第２００７０１９６３７６号、第２００７００６５４４４号、第２００７００１４７９３号、第２００６０２７５２９２号、第２００６０２６３３５４号、第２００６０２４６０６４号、第２００６０１２７３９３号、第２００６００７８９６７号、第２００６０００２９３１号、第２００５０１５２８９６号、第２０５０１２４５３７号、第２００５０００４３５３号、第２００５０００３４００号、第２００４０２６００６４号、第２００４００９７７１２号、第２００３００２６８０６号、第２００１００２７１７９号、第５５５２２８６号、第５１０６７６０号、第４８４５１９８号、第４５５８００６号、第２０１００３０５３０７号、第７７９０６７４号、第７６９５９４８号、第７６６６８３９号、第２００９０２０８４８９号、および第２００８０１３２６８８号。

一実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、１個から６個のＣＤＲを含む抗体である。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ抗体を含む、任意の種類であってもよい。具体的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ型抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体である。

ある実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、多特異的抗体であり、とりわけ、「ダイアボディ」とも呼ばれる、二重特異的抗体である。これらは、２つ以上の異なる抗原または単一の抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。ある実施形態では、二重特異的抗体は、ヒトエフェクタ細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する。そのような抗体は、腫瘍細胞等の標的発現細胞に対するエフェクタ細胞応答を標的とするのに有用である。好ましい実施形態では、ヒトエフェクタ細胞抗原は、ＣＤ３である。米国特許第７，２３５，６４１号。二重特異的抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。１つのそのような方法は、細胞において共発現されたときに重鎖のヘテロ二量体形成を促進する、「ノブ」および「穴」を作成するため等に、重鎖のＦｃ部分を設計することを伴う。米国第７，６９５，９６３号。別の方法はまた、重鎖のＦｃ部分を設計することを伴うが、細胞において共発現されたときに重鎖のホモ二量体形成を阻止しながら、ヘテロ二量体形成を促すために、静電操縦を使用する。その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開第０９／０８９，００４号。

一実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、ミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに接合されたｓｃＦｖを含む、最小限化抗体様タンパク質である。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１を参照されたい。

一実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、ドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ヒト抗体の重（ＶＨ）または軽（ＶＬ）鎖のいずれかの可変領域に対応する、抗体の機能的結合ドメインである。ｄＡＢは、約１３ｋＤａ、または完全抗体のサイズの１０分の１未満の分子量を有する。ｄＡＢは、細菌、酵母、およびほ乳類細胞システムを含む、種々の宿主においてよく発現される。加えて、ｄＡｂは、高度に安定しており、凍結乾燥または熱変性等の厳しい条件に曝された後でさえも活性を保持する。例えば、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，１７２，１９７号、米国第２００４／０１１０９４１号、欧州特許第０３６８６８４号、米国特許第６，６９６，２４５号、ＰＣＴ国際公開第０４／０５８８２１号、ＰＣＴ国際公開第０４／００３０１９号、およびＰＣＴ国際公開第０３／００２６０９号を参照されたい。

一実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、抗体断片である。種々の実施形態では、改良型抗体結合タンパク質は、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片を含むが、それらに限定されない。

改良型結合抗体断片のさらなる実施例は、以下を含むものを含むが、それらに限定されない：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｉｖ）単一の可変から成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、（ｖ）単離フレームワークおよびＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ′）_２断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが関連して抗原結合部位を形成することを可能にする、ペプチドリンカーによって連結される、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ第９２／０９９６５号）、および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多特異的断片である、「ダイボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９、ＷＯ９４／１３８０４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８）。

抗体断片は、さらに修正されてもよい。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定させられ得る（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５）。

ある実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結し、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成され得る。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ）をコード化するＤＮＡの間のペプチドリンカーをコード化するＤＮＡを融合することによって調製されている。結果として生じるポリペプチドは、２つの可変ドメインの間の柔軟リンカーの長さに応じて、抗原結合単量体を形成するように自ら折り重なり戻ることができ、または多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶ_ＬおよびＶ_Ｈを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技法は、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７で説明されているものを含む。

一実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、抗体融合タンパク質（時として「抗体複合体」と呼ばれる）である。複合体パートナーは、タンパク性または非タンパク性であり得、後者は、概して、抗原結合タンパク質上および複合体パートナー上の官能基を使用して生成される。ある実施形態では、抗体は、抗体薬剤複合体を形成するように、非タンパク性化学物質（薬剤）に複合体化される。

いくつかの実施形態では、本発明の改善された抗原結合タンパク質は、単離タンパク質または実質的に純粋なタンパク質である。「単離」タンパク質は、自然状態でそれに伴う物質のうち少なくとも一部を伴わないものであり、例えば、所与のサンプル中で、総タンパク量の少なくとも約５重量％または少なくとも約５０重量％を成す。単離タンパク質は、状況に応じて、総タンパク含量の５から９９．９重量％を形成し得ることが理解される。例えば、タンパク質は、タンパク質が増加した濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモータまたは高発現プロモータの使用を通して、有意により高い濃度で作製され得る。この定義には、当技術分野で公知である多種多様の生物および／または宿主細胞における抗原結合タンパク質の産生が含まれる。

改善された抗原結合タンパク質は、さらに修飾されてもよい。改善された抗原結合タンパク質の共有結合修飾が、本発明の範囲内に含まれ、必ずではないが概して、翻訳後に行われる。例えば、抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮあるいはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、抗原結合タンパク質の数種類の共有結合修飾が、分子に導入される。

システイニル残基が、最も一般的に、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じるように、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させられる。システイニル残基はまた、ブロモトリフロオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートが、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるため、この作用物質との反応によって誘導体化される。パラ臭化ブロモフェナシルも有用であり、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで行われる。

リシニルおよびアミノ末端残基が、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの作用物質を用いた誘導体化には、リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。アルファアミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬は、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応を含む。

アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、反応が、グアニジン官能基の高いｐＫ_ａにより、アルカリ条件で行われることを要求する。さらに、これらの試薬は、リシン基ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応してもよい。

チロシル残基の特異的修飾が、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入することに特に着目して、行われてもよい。最も一般的には、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンが使用される。チロシル残基は、好適な前述のクロラミンＴ方法である、放射免疫測定で使用するための標識タンパク質を調製するように、^１２５Ｉまたは^１３１Ｉを使用してヨウ素化される。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ′）との反応によって選択的に修飾され、ＲおよびＲ′は、随意に、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等の異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。

二官能性薬剤を用いた誘導化は、種々の方法で使用するために、抗原結合タンパク質を水不溶性支持マトリクスまたは表面に架橋させるために有用である。一般に使用されている架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダート等の誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる、光活性化可能な中間体をもたらす。代替として、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号、および第４，３３０，４４０号で説明されている臭化シアン活性化炭水化物および反応基質等の反応性水不溶性マトリクスが、タンパク質の固定化のために採用される。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。代替として、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。

他の修飾には、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。

本発明の範囲内に含まれる改善された抗原結合タンパク質の別の種類の共有結合修飾は、タンパク質の糖鎖付加パターンを改変することを含む。当技術分野で公知であるように、糖鎖付加パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論議される、特定の糖鎖付加アミノ酸残基の存在または欠如）、およびタンパク質が産生される宿主細胞または生物の両方に依存し得る。特定の発現系が、以下で考察される。

ポリペプチドの糖鎖付加は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン等のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付着の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかの存在が、潜在的な糖鎖付加部位を作成する。Ｏ結合型糖鎖付加は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへのＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースといった糖のうちの１つの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されてもよい。

改善された抗原結合タンパク質への糖鎖付加部位の追加は、（Ｎ結合型糖鎖付加部位に対して）上記のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって、利便的に達成される。改変はまた、（Ｏ結合型糖鎖付加部位に対して）開始配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の追加または置換によって、行われてもよい。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、とりわけ、所望のアミノ酸に転換するコドンが生成されるように、事前選択された塩基における標的ポリペプチドをコード化するＤＮＡを突然変異させることによる、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通して改変される。

改善された抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学または酵素結合によるものである。これらの手順は、ＮおよびＯ結合型糖鎖付加のための糖鎖付加能力を有する宿主細胞においてタンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用される結合モードに応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもの等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのもの等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのもの等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させられてもよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６で説明されている。

改善された抗原結合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グルコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸という化合物または同等の化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドを無傷のまま残して、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グルコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって、およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって説明されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されているように、種々の内部および外部グリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的な糖鎖付加部位における糖鎖付加は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明されているように、ツニカマイシンという化合物の使用によって防止されてもよい。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。

改善された抗原結合タンパク質の別の種類の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号で記載される方式で、抗原結合タンパク質を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン等の種々のポリオールであるが、それらに限定されない、種々の非タンパク性ポリマーに結合することを含む。加えて、当技術分野で公知であるように、ＰＥＧ等のポリマーの追加を促進するように、アミノ酸置換が、抗原結合タンパク質内の種々の位置で作製されてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の改善された抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、１つ以上の指標の追加を含む。

「指標基」という用語は、任意の検出可能な指標を意味する。好適な指標基の実施例は、放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次的レポータによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）等を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、指標基は、可能性のある立体障害を低減させるように、種々の長さのスペーサアームを介して、改善された抗原結合タンパク質に連結される。タンパク質を指標化するための種々の方法が、当技術分野で公知であり、本発明を行う際に使用されてもよい。

特異的標識は、発色団、蛍光体、およびフルオロフォアを含むが、それらに限定されない、光学色素を含み、後者は多くの場合で特異的である。フルオロフォアは、「小分子」フルオロまたはタンパク性フルオロのいずれかであり得る。

「蛍光標識」は、その固有蛍光性質を介して検出され得る、任意の分子を意味する。好適な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ染料（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー、およびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を含むが、それらに限定されない。フルオロフォアを含む好適な蛍光標識は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋで説明されている。

好適なタンパク性蛍光標識はまた、ＧＦＰのウミシイタケ、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）、またはクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ５５７６２）を含む、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９、Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２−４７１、Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）、およびウミシイタケ（国際公開第９２／１５６７３号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９８／１４６０５号、国際公開第９８／２６２７７号、国際公開第９９／４９０１９号、米国特許第５２９２６５８号、第５４１８１５５号、第５６８３８８８号、第５７４１６６８号、第５７７７０７９号、第５８０４３８７号、第５８７４３０４号、第５８７６９９５号、第５９２５５５８号）を含むが、それらに限定されない。上記で引用された参考文献の全ては、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
単離核酸

本明細書で説明される方法は、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列が改変される、ステップを含む。アミノ酸配列の改変は、抗原結合タンパク質またはその一部分をコード化する核酸配列内の１つ以上のコドンを変化させることによって、最も良好に達成される。したがって、ある特定の態様では、本発明は、改善された抗原結合タンパク質またはその改良型部分、例えば、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインをコード化する、単離核酸に関する。

好ましい実施形態では、既存のコドンに取って代わるコドンは、抗原結合タンパク質を発現するように選択される細胞で優先的に使用されるコドンである。例えば、抗原結合タンパク質が大腸菌において発現される場合、大腸菌で優先的に使用される所与のアミノ酸に対するコドンを使用するように注意が払われるべきである。

本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖形態の両方でのＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに対応する相補配列を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ、およびその組み合わせを含む。本発明の核酸分子は、全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子、ならびにその断片の組み合わせを含む。本発明の核酸は、優先的にヒト供給源に由来するが、本発明は、ヒト以外の種に由来するものも含む。

「単離核酸」は、自然発生源から単離される核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する、隣接遺伝子配列から分離されている核酸である。例えば、ＰＣＲ生成物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチド等のテンプレートから酵素的に、または化学的に合成された核酸の場合、そのようなプロセスに起因する核酸は単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形態である、またはより大きい核酸構築物の構成要素としての核酸分子を指す。１つの好ましい実施形態では、核酸は、汚染内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で概説されている物等）によって、その構成要素ヌクレオチド配列の特定、操作、および回収を可能にする実質的に純粋な形態で、かつ量または濃度で、少なくとも一度単離されている、ＤＮＡまたはＲＮＡに好ましくは由来している。そのような配列は、好ましくは、典型的には真核細胞遺伝子に存在する、内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、オープンリーディングフレームの形態で提供および／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームからの５′または３′に存在することができ、同配列は、コーディング領域の操作または発現に干渉しない。

本発明の改善されたアミノ酸配列は、通常、変異体をコード化し、その後、本明細書で概説されるように細胞培養中で組み換えＤＮＡを発現する、ＤＮＡを産生するように、カセットまたはＰＣＲ突然変異生成または当技術分野で周知である他の技法を使用して、抗原結合タンパク質をコード化するＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異生成によって調製される。

当業者によって理解されるように、遺伝子コードの縮退により、極めて多数の核酸が作製され得、その全てが、改善された抗原結合タンパク質をコード化する。したがって、特定のアミノ酸配列を特定すると、当業者であれば、コード化されたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に修飾することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。

本発明はまた、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態で、発現系および構築物を提供する。加えて、本発明は、そのような発現系および構築物を含む、宿主細胞を提供する。

典型的には、宿主細胞のうちのいかなるもので使用される発現ベクターも、プラスミド維持のため、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有するであろう。集合的に「フランキング配列」と呼ばれる、そのような配列は、ある特定の実施形態では、典型的には、以下のうちの１つ以上を含む：プロモータ、１つ以上のエンハンサ配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよび受容体巣プライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコード化する配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコード化する核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカー要素等のヌクレオチド配列。これらの配列のうちのそれぞれが、以下で考察される。

随意に、ベクターは、「タグ」コード化配列、すなわち、改善された抗原結合タンパク質コード配列の５′または３′末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく、オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓ等）、または市販の抗体が存在する、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）、またはｍｙｃ等の別の「タグ」をコード化する。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの改善された抗原結合タンパク質の親和性精製または検出のための手段としての機能を果たすことができる。親和性精製は、例えば、親和性マトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィによって、達成することができる。随意に、タグは、後に、切断のためのあるペプチダーゼを使用すること等の種々の手段によって、精製された改善された抗原結合タンパク質から除去することができる。

フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来する）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、１つよりも多くの供給源からのフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であってもよい。したがって、フランキング配列源は、フランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、かつ宿主細胞機構によって活性化することができるならば、任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎動物、または任意の植物であってもよい。

本発明のベクターで有用なフランキング配列は、当技術分野で周知であるいくつかの方法のうちのいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングによって、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に特定されているものであり、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適正な組織源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が知られている。ここで、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングのための本明細書で説明される方法を使用して合成されてもよい。

フランキング配列の全てが知られているか、一部分のみが知られているかにかかわらず、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、および／または同一あるいは別の種からのオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片等の好適なプローブを用いてゲノムライブラリを選別することによって、得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片が、例えば、コード配列または１つあるいは複数の別の遺伝子さえも含有し得る、ＤＮＡのより大きい断片から単離されてもよい。単離は、適正なＤＮＡ断片を産生する制限エンドヌクレアーゼ消化、その後に続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に公知である他の方法を使用した単離によって達成されてもよい。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者に容易に明白であろう。

複製起点は、典型的には、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択されたベクターが複製起点部位を含有しない場合、起点は、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに結合することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点が、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、種々のウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶあるいはＢＰＶ等のパピローマウイルス）が、ほ乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。概して、複製起点構成要素は、ほ乳類発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起源は、ただウイルス早期プロモータを含有するという理由から、しばしば使用される）。

転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端への３′に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、ポリＴ配列が後に続く、Ｇ−Ｃが豊富な断片である。配列は、ライブラリから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として商業的に購入さえされるが、本明細書で説明されるもの等の核酸合成のための方法を使用して、容易に合成することもできる。

選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培地で成長させられる宿主細胞の生存および成長に必要なタンパク質をコード化する。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、原核宿主細胞用のアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンへの耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補完する、または（ｃ）複合または規定培地から利用できない決定的に重要な栄養素を供給する、タンパク質をコード化する。具体的な選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利に、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核および真核宿主細胞の両方での選択に使用されてもよい。

他の選択可能な遺伝子が、発現されるであろう遺伝子を増幅するために使用されてもよい。増幅は、成長または細胞生存のために重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、組み換え細胞の継続的世代の染色体内で一列になって繰り返される、プロセスである。ほ乳類細胞に対する好適な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモータを持たないチミジンキナーゼ遺伝子を含む。ほ乳類細胞形質転換体が、選択圧下に置かれ、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択可能な遺伝子により、生存するように一意的に適合される。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続して増加させられる条件下で、形質転換細胞を培養することによって課せられ、それにより、改善された抗原結合タンパク質等の、選択可能な遺伝子および別の遺伝子をコード化するＤＮＡの両方の増幅をもたらす。結果として、改善された抗原結合タンパク質等の増加した量のポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。

リボソーム結合部位が、通常、ｒｎＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。本要素は、典型的には、プロモータへ３′のおよび発現されるポリペプチドのコード配列の５′に位置する。ある実施形態では、１つ以上のコーディング領域が、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に動作可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写産物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。

糖鎖付加が真核宿主細胞発現系で所望される場合等のいくつかの場合では、糖鎖付加または収量を改善するように、種々のプレまたはプロ配列を操作してもよい。例えば、特定の単一のペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、またはプロ配列を追加してもよく、それはまた、糖鎖付加に影響を及ぼし得る。最終タンパク質生成物は、（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対する）−１位置で、完全には除去されていない場合がある、発現から起こる１つ以上の追加のアミノ酸を有し得る。例えば、最終タンパク質生成物は、アミノ末端に付着した、ペプチダーゼ切断部位で見出される、１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。代替として、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態をもたらし得る。

本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、改善された抗原結合タンパク質をコード化する分子に機能的に連結される、プロモータを含有するであろう。プロモータは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５′）（概して約１００から１０００ｂｐ以内）に位置する、非転写配列である。プロモータは、従来、誘導性プロモータおよび構成的プロモータの２つの部類のうちの１つにグループ分けされる。誘導性プロモータは、栄養素の存在または欠如あるいは温度の変化等の培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下のＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。一方、構成的プロモータは、それらが動作可能に連結される遺伝子を均一に転写し、すなわち、遺伝子発現に対する制御をほとんど、または全く伴わない。種々の可能性のある宿主細胞によって認識される、多数のプロモータが周知である。好適なプロモータは、制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロモータを除去し、所望のプロモータ配列をベクターに挿入することによって、本発明の改善された抗原結合タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコード化する、ＤＮＡに動作可能に連結される。

酵母宿主とともに使用するための好適なプロモータもまた、当技術分野で周知である。酵母エンハンサが、酵母プロモータとともに有利に使用される。ほ乳類宿主細胞とともに使用するための好適なプロモータが周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるものを含むが、それらに限定されない。他の好適なほ乳類プロモータは、異種ほ乳類プロモータ、例えば、熱ショックプロモータおよびアクチンプロモータを含む。

対象とされ得る追加のプロモータは、ＳＶ４０早期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３′長末端反復に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）、メタロチオネインからのプロモータおよび調節配列Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、およびベータラクタマーゼプロモータ等の原核生物プロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）を含むが、それらに限定されない。また、組織特異性を呈し、トランスジェニック動物で利用されている、以下の動物転写制御領域も対象とする：膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６、Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）、膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ球様細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳腺、リンパ球様、および肥満細胞で活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１ ：２６８−２７６）、肝臓で活性であるアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３−５８）、肝臓で活性であるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞で活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳の乏突起膠細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）、および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。

エンハンサ配列が、高等な真核生物による、本発明の改善された抗原結合タンパク質の軽鎖または重鎖をコード化するＤＮＡの転写を増加させるように、ベクターに挿入されてもよい。エンハンサは、転写を増加させるようにプロモータに作用する、通常は、長さが約１０〜３００ｂｐである、ＤＮＡのｃｉｓ作用要素である。エンハンサは、配向および位置に比較的依存せず、転写単位への５′および３′の両方の位置で見出されている。ほ乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサ配列が、公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン、およびインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルスからのエンハンサが、使用される。ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス早期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、および当技術分野で公知であるアデノウイルスエンハンサが、真核生物プロモータの活性のための例となる強化要素である。エンハンサは、コード配列への５′または３′のいずれかでベクターに位置付けられてもよいが、典型的には、プロモータからの部位５′に位置する。抗体の細胞外分泌を促進するように、適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコード化する配列を、発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の種類に依存し、異種シグナル配列を、天然シグナル配列で置き換えることができる。ほ乳類宿主細胞で機能的であるシグナルペプチドの実施例は、米国特許第４，９６５，１９５号で説明されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８で説明されているインターロイキン−２受容体のシグナル配列、ＥＰ特許第０３６７５６６号で説明されているインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号で説明されているＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、ＥＰ特許第０４６０８４６号で説明されているＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド等を含む。

ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたときに発現を促進する、１つ以上の要素を含有してもよい。実施例は、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）、およびマトリクス付着領域（ＭＡＲ）を含む。ＭＡＲは、クロマチンの構造的組織化を仲介し、「位置」効果から統合ベクターを防護してもよい。したがって、ＭＡＲは、ベクターが安定した形質転換体を作成するために使用されるときに特に有用である。いくつかの天然および合成ＭＡＲ含有核酸が、当技術分野、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号、第７，３２６，５６７号、第６，１７７，６１２号、第６，３８８，０６６号、第６，２４５，９７４号、第７，２５９，０１０号、第６，０３７，５２５号、第７，４２２，８７４号、第７，１２９，０６２号で公知である。

本発明の発現ベクターは、市販のベクター等の開始ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもよく、または含有しなくてもよい。本明細書で説明されるフランキング配列のうちの１つ以上がベクターにまだ存在していない場合、それらは、個別に得られ、ベクターに結合させることができる。フランキング配列のうちのそれぞれを得るために使用される方法が、当業者に周知である。

ベクターが構築され、改善された抗原結合タンパク質、またはその構成要素、例えば、軽鎖、重鎖、または改善された抗原結合配列を含む軽鎖および重鎖をコード化する、核酸分子がベクターの適正な部位に挿入された後、完成したベクターが、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入されてもよい。選択された宿主細胞への改善された抗原結合タンパク質の発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の公知の技法を含む、周知の方法によって達成されてもよい。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の種類によるであろう。これらの方法および他の好適な方法が、当業者に周知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に記載されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されたときに、後に培地から（宿主細胞がそれを培地の中へ分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）収集することができる、改善された抗原結合タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（糖鎖付加またはリン酸化反応）のために望ましい、または必要であるポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子に折り畳む容易性等の種々の要因に依存するであろう。宿主細胞は、真核または原核であってもよい。

発現のための宿主として利用可能なほ乳類細胞系が当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系を含むが、それに限定されず、本発明の組み換えポリペプチドを作製するために、当技術分野で公知である発現系で使用される任意の細胞系を使用することができる。一般に、宿主細胞は、改善された抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターで形質転換される。採用され得る宿主細胞の中には、原核生物、酵母、または高等な真核細胞がある。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または桿菌を含む。高等な真核細胞は、昆虫細胞およびほ乳類起源の確立された細胞系を含む。好適なほ乳類宿主細胞系の例は、サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）のＣＯＳ−７系（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび無血清培地で成長する関連細胞系等のそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１で説明されているようにアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系、２９３、２９３ ＥＢＮＡ、またはＭＳＲ ２９３等のヒト胎児腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常２倍体細胞、一次組織の生体外培養に由来する組織、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞を含む。随意に、種々のシグナル変換またはレポータ分析でポリペプチドを使用することが望ましいときに、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３、またはＳ４９等のほ乳類細胞系を、ポリペプチドの発現に使用することができる。代替として、酵母等の下等な真核生物で、または細菌等の原核生物でポリペプチドを産生することが可能である。好適な酵母は、サッカロマイセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス株、カンジダ、または異種ポリペプチドを発現することが可能な任意の酵母株を含む。好適な細菌株は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、または異種ポリペプチドを発現することが可能な任意の細菌株を含む。ポリペプチドが酵母または細菌において作製される場合、例えば、機能性ポリペプチドを得るために、適切な部位のリン酸化反応または糖鎖付加によって、その中で産生されるポリペプチドを修飾することが望ましくあり得る。そのような共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を使用して達成することができる。ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を、１つ以上の昆虫発現ベクターの中の好適な制御配列に動作可能に連結し、昆虫発現系を採用することによって、産生することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．からキット形態（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）で市販されており、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）、およびＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）で説明されているように、当技術分野で周知である。無細胞翻訳系もまた、本明細書で開示される核酸構築物に由来するＲＮＡを使用してポリペプチドを産生するために採用することができる。細菌、真菌、酵母、およびほ乳類細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって説明されている。好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列に動作可能に連結される、本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」である。
医薬組成物

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の１つまたは複数の改善された抗原結合タンパク質の治療的有効量を、薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントとともに含む、医薬組成物を提供する。ある実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、薬剤と複合体化される抗体または二重特異的抗体を含む、抗体である。本発明の医薬組成物は、液体、凍結、および凍結乾燥組成物を含むが、それらに限定されない。

好ましくは、製剤物質は、採用される投与量および濃度において受容者に非毒性である。具体的実施形態では、改善された抗原結合タンパク質の治療的有効量を含む、医薬組成物が提供される。

ある実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための製剤物質を含有してもよい。そのような実施形態では、好適な製剤物質は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、またはリシン等）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸等）、増量剤（マンニトールまたはグリシン等）、キレート剤（エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン等）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）、着色、着味、および賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウム等）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキジン、ソルビン酸、または過酸化水素等）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０等のポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール等）、安定性強化剤（蔗糖またはソルビトール等）、等張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトール、ソルビトール等）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントを含むが、それらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８” Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。

ある実施形態では、最適な医薬組成物が、例えば、意図された投与経路、送達形式、および所望の投与量に応じて、当業者によって判定されるであろう。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。ある実施形態では、そのような組成物は、本発明の改善された抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、生体内放出速度、および生体内クリアランス率に影響を及ぼし得る。ある実施形態では、医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、水性または非水性の性質のいずれかであってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく、非経口投与用の組成物で一般的な他の物質が補充された、注射用蒸留水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水が、さらなる例となるビヒクルである。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝剤、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、さらに、ソルビトールまたはそれの好適な代替物を含んでもよい。本発明のある実施形態では、改善された抗原結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥固体または水溶液の形態の随意的な製剤化剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって、調製されてもよい。さらに、ある実施形態では、改善された抗原結合タンパク質生成物は、蔗糖等の適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。

本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。代替として、組成物は、吸入のため、または経口等の消化管を通した送達のために選択されてもよい。そのような薬学的に容認可能な組成物の調製は、当技術分野の技能内である。製剤組成物は、好ましくは、投与の部位に対して許容できる濃度で存在する。ある実施形態では、生理学的ｐＨで、またはわずかに低いｐＨで、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内で、組成物を維持するために、緩衝剤が使用される。

非経口投与が考慮されるとき、治療用組成物は、薬学的に容認可能なビヒクル中に所望の改善された抗原結合タンパク質を含む、発熱物質を含まない非経口的に容認可能な水溶液の形態で提供され得る。非経口注射用の特に好適なビヒクルは、改善された抗原結合タンパク質が、適正に保存された無菌等張液として製剤化される、無菌蒸留水である。ある実施形態では、調製は、所望の分子の、蓄積注射を介して送達することができる生成物の制御または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソーム等の作用物質との製剤化を伴うことができる。ある実施形態では、循環において持続時間を促進する効果を有する、ヒアルロン酸も使用されてもよい。ある実施形態では、所望の抗原結合タンパク質を導入するために、埋込型薬剤送達デバイスが使用されてもよい。

医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。これらの実施形態では、改善された抗原結合タンパク質は、乾燥した吸入可能粉末として有利に製剤化される。具体的な実施形態では、改善された抗原結合タンパク質吸入溶液もまた、エアロゾル送達用の推進剤とともに製剤化されてもよい。ある実施形態では、溶液が霧状化されてもよい。肺投与またはそのための製剤化方法は、参照することにより組み込まれ、化学的修飾タンパク質の肺送達を説明する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号でさらに説明されている。

また、製剤を経口で投与できることも考慮される。この様式で投与される改善された抗原結合タンパク質は、錠剤またはカプセル等の固体投薬形態の配合で習慣的に使用される担体を用いて、または用いることなく製剤化することができる。ある実施形態では、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大限化され、前全身性分解が最小限化されるときに、消化管内の点で製剤の活性部分を放出するように設計されてもよい。改善された抗原結合タンパク質の吸収を促進するように、追加の作用物質を含むことができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も採用されてもよい。

持続または制御送達製剤中に改善された抗原結合タンパク質を伴う製剤を含む、追加の医薬組成物が、当業者に明白となるであろう。リポソーム担体、生体内分解性ミクロスフェアまたは多孔質ビーズ、および蓄積注射等の種々の他の持続または制御送達手段を製剤化するための技法も、当業者に公知である。例えば、参照することにより組み込まれ、医薬組成物の送達のための多孔質高分子微粒子の制御放出を説明する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。持続放出調合剤は、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で、半透性ポリマーマトリクスを含んでもよい。制御放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（それぞれが参照することにより組み込まれる、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ ０５８４８１号で開示されているような）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸ガンマエチルの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７−５５６）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ １３３，９８８号）を含んでもよい。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知であるいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができる、リポソームを含んでもよい。例えば、参照することにより組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ ０３６，６７６号、第ＥＰ ０８８，０４６号、およびＥＰ １４３，９４９号を参照されたい。

生体内投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌調合剤として提供される。滅菌は、無菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後にいずれかに行われてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液で保管することができる。非経口組成物は、概して、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルの中へ配置される。

本発明の態様は、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、国際特許出願国際公開第０６１３８１８１Ａ２号（ＰＣＴ／ＵＳ第２００６／０２２５９９号）で説明されているように、医薬組成物として使用することができる、自己緩衝の改善された抗原結合タンパク質製剤を含む。

上で論じたように、ある特定の実施形態は、改善された抗原結合タンパク質に加えて、この項および本明細書の他の場所実例として説明されるもの等の１つ以上の賦形剤を含む、改善された抗原結合タンパク質タンパク質組成物、特に、薬学的な改善された抗原結合タンパク質組成物を提供する。賦形剤は、粘度の調整等の製剤の物理的、化学的、または生物学的性質を調整すること、および／または有効性を改善する、および／またはそのような製剤を安定させる本発明のプロセス、ならびに例えば、製造、出荷、保管、使用前調製、投与中、およびその後に発生する応力による、劣化および腐敗に対する処理等の多種多様の目的で、この点に関して本発明で使用することができる。

それぞれがその全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，” Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，” ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ内、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）、およびＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，” Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）等の種々の解説が、具体的には、特に獣医学および／またはヒト医学的用途のためのタンパク質医薬品およびプロセスに関して、本発明による自己緩衝タンパク質製剤用の賦形剤および同賦形剤のプロセスに関する部分で、タンパク質安定化、ならびにこの点に関して有用な製剤化材料および方法について利用可能である。

例えば、製剤のイオン強度および／または等張性を調整するため、および／または本発明による組成物のタンパク質あるいは他の成分の可溶性および／または物理的安定性を改善するために、塩が、本発明のある実施形態に従って使用されてもよい。

周知であるように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、ならびにタンパク質中の荷電および極性基を遮蔽し、それらの静電相互作用、引力、および反発相互作用の強度を低減させることによって、タンパク質の天然状態を安定させることができる。イオンはまた、特に、タンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって、タンパク質の変性状態を安定させることもできる。さらに、タンパク質中の荷電および極性基とのイオン相互作用はまた、分子間静電相互作用を低減させ、それにより、タンパク質凝集および不溶性を防止するか、または低減させることもできる。

イオン種は、タンパク質へのそれらの効果が有意に異なる。本発明による医薬組成物を製剤化する際に使用することができる、イオンおよびタンパク質へのそれらの効果のいくつかのカテゴリランキングが開発されている。一例は、イオンおよび極性非イオン溶質を、溶液中のタンパク質の立体配座安定性へのそれらの効果別にランク付けする、ホフマイスターシリーズである。安定化溶質は、「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化溶質は、「カオトロピック」と呼ばれる。コスモトロープは、一般的に、溶液からタンパク質を沈殿させる（「塩析」）ために高濃度（例えば、１モル超の硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般的に、タンパク質を変性させる、および／または可溶化する（「塩溶」）ために使用される。「塩溶」および「塩析」するイオンの関連有効性が、ホフマイスターシリーズでそれらの位置を定義する。

遊離アミノ酸を、増量剤、安定剤、および酸化防止剤、ならびに他の標準用途として、本発明の種々の実施形態による改善された抗原結合タンパク質製剤で使用することができる。製剤中のタンパク質を安定させるために、リシン、プロリン、セリン、およびアラニンを使用することができる。グリシンは、正しいケーキ構造および性質を確保するように凍結乾燥で有用である。アルギニンが、液体および凍結乾燥製剤の両方で、タンパク質凝集を阻害するために有用であり得る。メチオニンが、酸化防止剤として有用である。

ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、蔗糖、およびソルビトール、例えば、グリセロールおよびプロピレングリコール等の多価アルコール、および本明細書の考察の目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、物理的および化学的分解プロセスからタンパク質を保護するように、液体および凍結乾燥製剤の両方で、有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の等張性を調整するために有用である。

本発明の選択実施形態で有用なポリオールの中には、凍結乾燥製剤中のケーキの構造的安定性を確保するために一般的に使用される、マンニトールがある。それは、ケーキへの構造的安定性を確保する。それは、概して、冷凍保護剤、例えば、蔗糖とともに使用される。等張性を調整するための好ましい薬剤の中でも、および輸送中の凍結融解応力または製造プロセス中のバルクの調製に対して保護する安定剤として、ソルビトールおよび蔗糖がある。グルコースおよびラクトース等の還元糖（遊離アルデヒドまたはケトン基を含有する）は、表面リシンおよびアルギニン残基を糖化し得る。したがって、それらは、概して、本発明による使用のための好ましいポリオールの中にはない。加えて、酸性条件下でフルクトースおよびグルコースに加水分解され、その結果として糖化を引き起こす、蔗糖等のそのような反応種を形成する糖も、この点に関して本発明の好ましいポリオールの中にはない。ＰＥＧが、タンパク質を安定させるために、および抗凍結剤として有用であり、この点に関して本発明で使用することができる。

改善された抗原結合タンパク質製剤の実施形態はさらに、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面上の吸着の影響、ならびに変性および空気・液体、固体・液体、および液体・液体界面での結果的凝集の影響を受けやすくあり得る。これらの効果の増減は、概して、タンパク質濃度と逆比例する。これらの有害な相互作用の増減は、概して、タンパク質濃度と逆比例し、典型的には、製品の出荷および取扱中に生成されるもの等の物理的撹拌によって悪化させられる。

界面活性剤は、表面吸着を防止する、最小限化する、または低減させるために日常的に使用される。この点に関して本発明での有用な界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、およびポロキサマー１８８を含む。

界面活性剤はまた、タンパク質の立体配座安定性を制御するためにも一般的に使用される。任意の所与の界面活性剤が、典型的には、いくつかのタンパク質を安定させ、他のタンパク質を不安定化するであろうから、この点に関して界面活性剤の使用は、タンパク質に特異的である。

ポリソルベートは、酸化分解の影響を受けやすく、しばしば、供給されたときに、タンパク質残基側鎖、特に、メチオニンの酸化を引き起こす十分な量の過酸化物を含有する。その結果として、ポリソルベートは、慎重に使用されるべきであり、使用されるときに、それらの最低有効濃度で採用されるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきであるという一般規則を例示する。

改善された抗原結合タンパク質製剤の実施形態はさらに、１つ以上の酸化防止剤を含む。ある程度、周囲酸素および温度の適正なレベルを維持することによって、ならびに光への暴露を回避することによって、タンパク質の有害な酸化を医薬製剤で防止することができる。タンパク質の酸化分解を防止するために、酸化防止賦形剤も使用することができる。この点に関して有用な酸化防止剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、およびキレート剤がある。本発明による治療用タンパク質製剤で使用するための酸化防止剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の保管期間の全体を通してそれらの活性を維持する。ＥＤＴＡが、この点に関して本発明による好ましい酸化防止剤である。

酸化防止剤は、タンパク質を損傷し得る。例えば、特にグルタチオン等の還元剤が、分子内ジスルフィド結合を撹乱し得る。したがって、本発明で使用するための酸化防止剤は、とりわけ、製剤中のタンパク質を自ら損傷する可能性を排除するか、または十分に低減させるように選択される。

本発明による製剤は、タンパク質補因子であり、かつあるインスリン懸濁液を形成するために必要な亜鉛等のタンパク質配位錯体を形成するために必要である、金属イオンを含んでもよい。金属イオンはまた、タンパク質を分解する、いくつかのプロセスを阻害することもできる。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する、物理的および化学的プロセスを触媒し得る。

アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために、マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用することができる。Ｃａ^＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。しかしながら、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、およびＺｎ^＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様に、Ｃａ^＋２およびＳｒ^＋２は、因子ＶＩＩＩを安定させることができ、それは、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２およびＺｎ^＋２、Ｃｕ^＋２およびＦｅ^＋２によって不安定化し得、その凝集は、Ａｌ^＋３イオンによって増加し得る。

改善された抗原結合タンパク質製剤の実施形態はさらに、１つ以上の防腐剤を含む。防腐剤は、同じ容器からの１回よりも多くの抜き出しを伴う、複数投与非経口製剤を開発するときに必要である。それらの主要な機能は、微生物成長を阻害し、薬剤製品の保管期間または使用期間の全体を通して製品の無菌性を確保することである。一般的に使用されている防腐剤は、ベンジルアルコール、フェノール、およびｍ−クレゾールを含む。防腐剤は、小分子非経口剤との使用の長い歴史を有するが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほぼ必ず、タンパク質への不安定化効果（凝集）を有し、これは、複数投与タンパク質製剤でのそれらの使用を制限する主要な要因となっている。現在まで、ほとんどのタンパク質薬剤は、単回使用のみのために製剤化されている。しかしながら、複数投与製剤が可能であるとき、それらは、患者の利便性および増加した市場性を可能にするという追加利点を有する。良好な例は、保存製剤の開発が、より利便的な多用途注射ペン表現の商品化につながった、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例である。ｈＧＨの保存製剤を含有する、少なくとも４本のそのようなペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、およびＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥、二重チャンバカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）が、フェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールを用いて製剤化される。

いくつかの側面が、保存投薬形態の製剤化および開発中に考慮される必要がある。薬剤製品中の有効防腐剤濃度が、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を低下させることなく、抗菌有効性を与える濃度範囲を伴う投与量で、所与の防腐剤を試験することを必要とする。

予期され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥した製品は、防腐剤を伴わずに凍結乾燥し、使用時に希釈剤を含有する防腐剤を用いて再構成することができる。これは、防腐剤がタンパク質と接触している時間を短縮し、関連安定性リスクを著しく最小限化する。液体製剤では、防腐剤の有効性および安定性が、製品保管期間（約１８から２４ヶ月）全体にわたって維持されるべきである。留意するべき重要な点としては、防腐剤の有効性が、活性薬剤および全ての賦形剤構成要素を含有する最終製剤で示されるべきである。

改善された抗原結合タンパク質製剤は、概して、とりわけ、特定の投与経路および方法のため、特定の投与量および投与頻度のため、特定の疾患の特定の治療のため、バイオアベイラビリティおよび持続性の範囲を伴って、設計されるであろう。したがって、製剤は、経口的、経耳的、経眼的、直腸内、および経膣的を含むが、それらに限定されない、任意の好適な経路による、ならびに静脈および動脈注射、筋肉注射、および皮下注射を含む、非経口経路による、送達のために、本発明に従って設計されてもよい。

いったん医薬組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、結晶として、または脱水あるいは凍結乾燥粉末として、無菌バイアルの中に保管することができる。そのような製剤は、使用の準備ができた形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保管され得る。本発明はまた、単回投与単位を産生するためのキットも提供する。本発明のキットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有してもよい。本発明のある特定の実施形態では、単一および多重チャンバ付き事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ）を含有する、キットが提供される。

採用される改善された抗原結合タンパク質を含有する医薬組成物の治療的有効量は、例えば、治療状況および目的に好適に依存するであろう。当業者であれば、治療の適切な投与量レベルが、部分的に、送達される分子、改善された抗原結合タンパク質が使用される適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および／または状態（年齢および全般的健康）に依存するであろうということを理解するであろう。ある実施形態では、臨床医が、最適な治療効果を得るように、投与量を滴定し、投与経路を修正してもよい。

医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてもよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの実施例は、全て参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４７５，１９６号、第４，４３９，１９６号、第４，４４７，２２４号、第４，４４７，２３３号、第４，４８６，１９４号、第４，４８７，６０３号、第４，５９６，５５６号、第４，７９０，８２４号、第４，９４１，８８０号、第５，０６４，４１３号、第５，３１２，３３５号、第５，３１２，３３５号、第５，３８３，８５１号、および第５，３９９，１６３号で説明されている。

実施例１
この実施例では、より低い熱安定性を有する、わずかに発現する抗体１が、改善された熱安定性とともに、過渡的に移入された細胞における発現レベルを増加させるように設計される。図４ａは、ヒト生殖細胞系配列との抗体１配列の整合を示す。抗体１への配列同一性の割合（％）によって示される、上位５つの密接に関係するヒト生殖細胞系列のみが、この図に示されている。これに基づいて、抗体１の可能なサブタイプが判定される。この場合、抗体１配列の可変重鎖は、ＶＨ３サブタイプに属し、可変軽鎖は、ＶＫ２サブタイプに属する。次のステップで、抗体１の可変軽鎖および可変重鎖配列が、それぞれ、Ｋａｂａｔデータベース（ＷｕおよびＫａｂａｔ １９７０）で見出されるＶＫ２およびＶＨ３配列に対して整合させられた。多重配列整合で相関突然変異を受けるアミノ酸対を特定するために、２０個のアミノ酸が、それらの生理化学的性質に基づいて、小疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、負電荷を持つ、および欠失／グリシンの６つのグループに分類された。保存スコアが、以前に論じられたように計算された。特定された保存対が、６０から９０％カットオフレベルで調査された。典型的には、６０％が、より低いカットオフレベルとして使用され、しばしば、より高い閾値が、さらなる有意性を暗示する。

次いで、特定された相関突然変異対に相関性があるか否かを確認するように、標的抗体１配列が調査された。相関対保存の観察されたパターンから逸脱する抗体１配列内の位置が、突然変異に印付けられた。例えば、抗体配列１の軽鎖内の位置Ｆ５１は、位置Ｖ１３、Ａ１９、Ｉ２１、Ｃ２３、Ｌ４２、Ｐ４５、Ｐ４９、Ｌ５２、Ｉ５３、Ｖ６３、Ｐ６４、Ｌ７８、Ｉ８０、Ｖ８３、Ｖ９０、およびＣ９３に相関しない（違反）（図５）。抗体１配列内の位置Ｆ５１は、芳香族であり、パートナー位置は、小疎水性の性質である。これは、違反を修正するために、位置Ｆ５１が小疎水性アミノ酸と置換されるべきであることを暗示する。置換される小疎水性残基を特定するために、密接に関係する生殖細胞系配列内のＦ５１の対応する位置で見出される残基が、図４ｂに示されるように調査された。さらに、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴデータベース内のＦ５１の対応する位置で見出される残基の頻度も考慮された。図４ｂから、位置Ｆ５１がＬｅｕに変異させられるべきであることが明白である。そして、残基Ｌｅｕは、データベース内のこの位置で最も頻繁である（６９％）。さらに、Ｆ５１Ｌ突然変異がいずれの明白な構造的問題（立体障害、水素結合の妨害、埋没コア領域における極性アミノ酸の導入等）も引き起こさなかったことを確認するように、可変ドメイン抗体１のモデル化された構造が調査された。

ＶＬ／ＶＨ界面における違反を特定するために、ドメイン・ドメイン相互作用に関与するアミノ酸対が、可変ドメインのモデル化された構造に基づいて特定された。第１の残基の任意の側鎖重原子が、第２の残基の任意の側鎖重原子から６．５オングストローム以内である場合に、２つの残基は相互作用していると見なされる。次いで、多重配列整合が、個々の鎖の場合と同じ方法で調査された。

軽鎖内のＰ１０５位置、ならびに重鎖内のＱ１およびＲ１６位置において、この抗体１配列内にさらに３つの違反があった。これらの違反は、Ｆ５１の場合で論じられるように修正された。設計された構築物の過渡的発現レベルが、図６に示される。親抗体は、非常に弱い発現体（２〜３ｍｇ／Ｌ）である。設計された構築物の全てが、親と比較して高い発現レベルを示した。図７ａは、示差走査熱量測定を通して決定される、熱安定性プロファイルを示す。設計された構築物の全てが、融解温度（転移点）およびエンタルピー（曲線の下の領域）の両方で、同等またはより高い熱安定性を示す。特に、全ての違反を修正させた構築物が、（融解温度およびエンタルピーの両方で）熱安定性の最大改善を示す。図７ｂは、全ての設計された構築物の結合プロファイルを示す。図から分かるように、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）分析によって判定される、変異体の親和性は、親との２倍差以内である。
実施例２

別の標的に対する抗体２は、より低い熱安定性を伴う、わずかに発現する分子である。加えて、このＩｇＧ抗体がｓｃＦｖ−Ｆｃ形式に変換されたときに、高レベルの凝集がみられる。相関突然変異分析が、実施例１の場合のように実行された。合計８つの違反が、抗体２配列のフレームワーク領域で特定された（図８）。点突然変異体の設計された構築物および点突然変異体の組み合わせが、図９に記載される。ここでは、Ｙ２３１Ｆ突然変異が抗体モデリングおよび構造分析を通して特定されたことに留意しなければならない。全ての他の突然変異は、相関突然変異分析を通して特定された。

図１０は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式での抗体２およびその変異体の過渡的発現レベルを示す。図１０ａは、タンパク質Ａ結合によって判定される、力価レベルを示し、１０ｂは、精製収率（ｍｇ／Ｌ）を示し、（ｃ）は、１０ｍｌスケールでの繰り返しの発現試験を示す。モデリングおよび構造分析を通して判定されたＹ２３１Ｆ突然変異を伴う変異体を除いて、全ての他の変異体は、親分子と同様に、または親分子よりも良好に発現した。特に、全ての違反（合計８つの突然変異）を修正させた変異体が、発現レベルの最大改善を示した。図１１は、親および変異体のサイズ排除クロマトグラフィによって判定される、凝集レベルを示す。全ての変異体が、親分子と比較して、はるかに低いレベルの凝集を示した。図１２ａは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式での親および変異体の熱安定性プロファイルを示す。図１２ｂは、ＩｇＧ形式での親および選択された変異体の熱安定性プロファイルを示す。全ての違反を修正させた構築物は、熱安定性の最大改善を示した（融解温度およびエンタルピーの両方が増加させられている）。図１３は、ＦＡＣＳベースの結合分析を示す。図から分かるように、全ての変異体が類似結合プロファイルを呈した。
実施例３

これは、適度に良好に発現する（２９３細胞における過渡的トランスフェクションで３０〜５０ｍｇ／Ｌ）抗体を扱う実施例である。相関突然変異分析が、上記の実施例のように実行された。合計６つの違反が、この場合に特定された。相関突然変異分析に基づいて設計された、親およびその変異体の過渡的発現レベルが、図１４に示される。ここでは、再度、全ての違反を修正させた構築物が、発現の最大改善を示した。図１４ｂは、変異体の阻害分析を示す。最大数の突然変異を有した構築物が、阻害の５倍減少を示した。これは、ＣＤＲ表面の近くに位置する２つの電荷突然変異によるものである可能性が高かった。それにもかかわらず、この実施例でも、最大数の突然変異を有した構築物が、熱安定性の最大改善を示した（図１５）。より重要なことには、変異体は、製剤緩衝剤のｐＨ変動に対して感受性がより低かった。親分子は、ｐＨが５．２から７．４に増加させられたときにゲルを形成した。親と違って、変異体（Ｆ１５）は、ｐＨが５．２から７．４に増加させられたときに沈殿しなかった。
実施例４

この実施例では、わずかに発現する抗体が、相関突然変異分析を通して分析された。以前の場合と同様に、示唆された突然変異は、過渡的に移入された２９３細胞内で発現の改善をもたらした。最大数の突然変異を有した構築物が、親より１０倍良好に発現した（図１６）。
参考文献
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Claims (20)

1. 対象とする抗体可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質の１つ以上の特性を改善する方法であって、
   ａ）残基の生理化学的性質に基づく、可変ドメインフレームワーク内の対保存残基位置の特定と、
   ｂ）対象とするフレームワークのアミノ酸配列の前記抗体可変ドメインが、どのようにしてａ）で特定された前記対保存残基位置から逸脱するかを判定することと、
   ｃ）ｂ）からの逸脱であると判定された１つ以上のアミノ酸残基を、生殖細胞系または関連生殖細胞系配列内の対応する位置で見出されるアミノ酸で置換することと、
   を含む、方法。
2. 対保存残基は、
   ｉ）生殖細胞系列サブタイプを前記対象とする抗体可変ドメインに割り当てることと、
   ｉｉ）（ｉ）で特定された前記生殖細胞系列サブタイプに属する複数の可変ドメインのフレームワーク領域を整合させることと、
   ｉｉｉ）整合可変ドメイン内の各位置における前記アミノ酸を、小疎水性、芳香族、中立極性、正電荷を持つ、負電荷を持つ、またはグリシン／欠失として分類することと、
   ｉｖ）各対位置について保存スコアを計算することと、
   ｖ）閾値計算に基づいて相関突然変異対を決定することと、
   によって特定される、請求項１に記載の方法。
3. 前記保存スコアは、同一分類に属する対の数に等しく、異なる分類に属する対の数でその合計を減算する、請求項２に記載の方法。
4. 前記対象とする抗体可変ドメイン内の逸脱は、前記対象とする配列内のアミノ酸対を、既知の可変ドメイン配列の多重配列整合および前記閾値計算を使用して特定された、対保存残基位置の観察されたパターンと比較することによって判定される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 逸脱であると判定された１つ以上のアミノ酸残基が、前記生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸で置換される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 全ての逸脱が、前記生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸で置換される、請求項５に記載の方法。
7. 逸脱であると判定される１つ以上のアミノ酸残基が、関連生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸で置換される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. 全ての逸脱が、関連生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸で置換される、請求項７に記載の方法。
9. 全ての逸脱が、前記生殖細胞系配列または関連生殖細胞系配列内のその位置で見出されるアミノ酸で置換される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記軽鎖可変ドメインは、ヒト軽鎖可変ドメインである、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記抗原結合タンパク質は、抗体である、請求項１０に記載の方法。
14. 前記抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖを含む、請求項１０に記載の方法。
16. 前記抗原結合タンパク質の発現が改善される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記抗原結合タンパク質の熱安定性が改善される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって改善された、抗原結合タンパク質。
19. 請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって改善された、抗原結合タンパク質の抗体可変ドメインをコード化する、単離核酸であって、前記方法は、前記抗体可変ドメイン内の１つ以上の残基を、生殖細胞系列または関連生殖細胞系列残基で置換することを含む、単離核酸。
20. 請求項１９に記載の単離核酸を含む、宿主細胞。