JP2014517352A - 高分解能ルミネッセンス顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

試料（２）の高解像度画像（５５）を作成するための顕微鏡検査方法において、ａ）励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを試料（２）に施す工程、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つの試料（２）を使用する工程と、ｂ）構造化照明により試料（２）を励起して発光させる工程であって、その際には、構造化照明の少なくとも３つの回転位置および回転位置当たり少なくとも３つのオフセット位置を実現することによって、試料を、構造化照明の少なくとも９通りの様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）において、繰り返して照明する工程と、ｃ）発光している試料（２）を、各異なる照明状態のそれぞれにおいて、繰り返して複数の画素を有する１つのフラット・パネル検出器上に結像することにより、各異なる照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれを対象として、画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）を１つずつ得る工程と、ｄ）それぞれの画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）から、ブリンキングにより引き起こされる該画像列内のそれぞれの画素の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数（４６）を利用して、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画を作成することにより、各異なる照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれを対象として、高解像度原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）を１つずつ得る工程と、ｅ）得られた各原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理（４２）を通じて、各原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する該高解像度画像（５５）を作成する工程とからなる方法。

Description

本発明は、発光する試料の高解像度画像を作成するための顕微鏡検査方法ならびに顕微鏡に関する。

顕微鏡法を利用した試料調査は、幅広い裾野を持つ技術分野であり、その技術解決策も多岐にわたっている。これまでに、古典的な光学顕微鏡法をはじめとして、多種多様な顕微鏡検査方法が開発されてきた。

ルミネッセンス顕微鏡法は、生物プレパラートの調査を目的とする光学顕微鏡法の古典的な適用領域の１つである。そこでは、試料、例えば細胞部分に固有のマーキングを施すために、特定の染料（いわゆる燐光体または蛍光体）が使用される。この試料に、励起ビームを照射し、それにより励起されたルミネッセンス光が、適切な検出器を用いて検出される。そのために通常は、光学顕微鏡内に、１つのダイクロイック・ビーム・スプリッタが、これに複数のブロック・フィルタを組み合わせて、備えられているが、それにより励起ビームから蛍光ビームを分割して、それを切り離して観察できるようにしている。このやり方により、光学顕微鏡の内部で、個々の異なる染色後の細胞部分を描画することが可能となる。当然ながら同じ１つのプレパラートの複数の部分を、プレパラートの他とは異なるそれぞれの構造に特異的に付着するようになっている様々な染料を使用して、同時に染色することも可能である。この方法は、多重発光と呼ばれる。それ自体が発光する、すなわちマーキング剤を添加しなくとも発光する試料についても、測定を行うことができる。

ルミネッセンスとは、ここでは広く一般に行われているように、燐光および蛍光を表す上位概念として解釈されるものである、すなわち、これは、この両方のプロセスを包括したものである。

他にも試料調査のために、レーザ走査顕微鏡法（ＬＳＭ：Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙとも略称される）を使用することが知られているが、このレーザ走査顕微鏡法では、ある１つの照射された３次元画像から、１つの共焦点検出配列（この場合、話題となるのは共焦点ＬＳＭである）、または試料の非線形相互作用（いわゆる多光子レーザ顕微鏡法）を利用して、対物レンズの焦点面内に位置する面だけが再現されるようになっている。それにより、１つの光学断面が得られるが、この光学断面を試料の深度別に複数撮影することによって、引き続いて、適切なデータ演算処理装置の助けを借りて、これらの異なる光学断面から試料の３次元画像を合成して生成することができる。したがって、レーザ走査顕微鏡法は、厚みのあるプレパラートの調査に適したものとなっている。

物理法則により定まる回折限界を超えた分解能を実現するために、最近になり様々なアプローチ法が開発されている。これらの顕微鏡検査方法は、古典的な顕微鏡と比べて一段と高い横方向および／または軸方向の光学分解能を使用者が自由に利用できることを特色としている。本願明細書においては、そのような顕微鏡検査方法を、それにより光学的回折限界を超えた分解能が達成されることから、高分解能顕微鏡検査方法と呼んでいる。これに対して、回折限界顕微鏡を古典的な顕微鏡と呼んでいる。回折限界顕微鏡は、公知である広視野光学顕微鏡法またはレーザ走査顕微鏡法を実現するものである。

高分解能顕微鏡検査方法の一例が（特許文献１）において論じられている。そこでは、構造化照明方式を利用して、非線形の様々なプロセスが利用し尽くされるようになっている。非線形性のものとして利用されるのは、蛍光の飽和現象である。構造化照明方式により、オブジェクトの空間スペクトルの、光学系の伝達関数に対する相対的なオフセットが行われるようになっている。このスペクトルのオフセットとは、具体的には、Ｖｍを構造化照明の周波数としたときに、オブジェクトの空間周波数Ｖ０が、Ｖ０−Ｖｍの空間周波数で伝達されることを意味している。それにより、この光学系により最大限伝達可能な所与の空間周波数において、伝達関数の最大周波数をオフセット周波数Ｖｍ分上回っている、オブジェクトの空間周波数の伝達が可能となる。このアプローチ法は、画像作成用の再構築アルゴリズムとして、１回のフーリエ・フィルタリングを必要とする他にも、１つの画像を得るために、複数回の記録を必要としている。すなわち、本願明細書の解像顕微鏡検査方法の当該説明箇所との関係においても内容全体が援用されているこの（特許文献１）においては、例えば１つの振幅／位相グリッドによる、試料の一種の広視野構造化照明方式が使用されるようになっている。試料中の蛍光についても同様に、広視野検出が行われる。ところでこのグリッドは、少なくとも３つの、例えば０°、１２０°、および２４０°の、異なる回転位置に移動され、さらにそれぞれの回転位置において、グリッドは３つ以上の異なる位置に変位されるようになっている。この３つの回転位置の、それぞれ３つのオフセット位置（すなわち合計して少なくとも９種類の照明状態）を対象として、試料の広視野検出が行われる。さらにこのグリッドは、使用される光学配列がこの周波数までは伝達することができるという周波数である限界周波数に可能な限り近い周波数を有している。その後には、フーリエ・フィルタリングを使用しながら、上記で言及した変位が行われるが、その際には特にそれぞれの画像において０次回折および＋１次／−１次回折が評価されるようになっている。この顕微鏡検査方法は、ＳＩＭ法（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：構造化照明顕微鏡法）とも呼ばれるものである。

この原理では、明領域にある試料の蛍光が飽和状態に達するように、（例えば何らかのグリッドによる）構造化が集中的に行われる場合に、分解能の向上が得られることになる。そのときに試料の構造化照明は、試料表面に正弦分布を最早示すことなく、それどころかむしろ、飽和効果のために、光学的限界周波数を超えるさらに一段と高い高調波周波数を有することになる。ＳＩＭ法のこの展開構成形態は、飽和パターン励起顕微鏡法（ＳＰＥＭ：Ｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも呼ばれるものである。

グリッドの向きに対して垂直である、１つの線状の照明によっても、ＳＩＭ法のさらにもう１つの展開構成形態を達成することができる。この場合は一種の線状照明が行われることになるが、そこではグリッド構造が、この線に沿って復元されるようになっている。すなわち、この照明の線は、グリッドにより構造化されている。この線状の照明により、一種の共焦点スリット検出が可能となり、それにより、再び分解能を向上することができる。この検査方法は、ＳＬＩＭ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも略称されるようになっている。

（非特許文献１）は、このＳＩＭ原理を取り上げたものではあるが、しかし、そこでは、共焦点照明を利用した試料のスキャニング法とあわせ、それに続くフーリエ・フィルタリングによる検出法が使用されるようになっている。この原理は、ＩＳＭ（Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と呼ばれる。そこでは、同じ１つの構造化照明に９通りのオリエンテーションは存在せず、むしろ、画像のラスター・スキャンに際しては、それぞれのスキャン位置、すなわちラスター状態が、ある１つの照明状態に相当しており、構造化照明は、試料の一種のスポット照明となっている。

（非特許文献２〜４）の開示から、さらにもう１つの高分解能ルミネッセンス顕微鏡検査方法が知られている。この方法は、蛍光体のブリンキング特性を利用したものである。同じ１つの試料の複数の蛍光体が、統計学的に相互依存関係にないブリンキングを行う場合は、ある１つのいわゆるキュムラント関数を使用した適切なフィルタリングにより、試料のイメージングを行うことによって、物理的に予め決まっている光学的解像限界を超えた、分解能のかなりの向上を達成することが可能となる。そのようなキュムラント関数の一例が、例えば２次自己相関関数である。そこでは高解像度画像を作成するために、複数の個別画像からなる１つの列を記録して、続いて、このキュムラント関数を使用して、これらの個別画像をまとめて１つの単独画像を得るようにしているが、この単独画像の解像度は、このときには、さらに一段と高いものとなっている。この方法は、「Ｓｕｐｅｒ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ（超高解像度オプティカル・フラクチュエーション・イメージング）」という用語を略してＳＯＦＩ法と呼ばれる。

従来技術においては、他にもさらに複数の高分解能顕微鏡検査方法を組み合わせることが知られている。例えば（特許文献２）には、個々の試料ゾーンを対象として、分解能および測定速度の観点から、それぞれに最適の検査方法を導入できるようにすることを目的としている、多種多様な高分解能顕微鏡検査方法の組み合わせ方式が記載されている。

欧州特許第１１５７２９７号明細書 独国特許出願公開第１０２００８０５４３１７号明細書

Ｃ．ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）、Ｊ．エンデルライン（Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ）， "Ｉｍａｇｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ"， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １０４， １９８１０１（２０１０） Ｔ．デルティンガー（Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ）他， "Ｆａｓｔ， ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ−ｆｒｅｅ， ３Ｄ ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ （ＳＯＦＩ）"， ＰＮＡＳ （２００９）， ｐ２２２８７−２２２９２ Ｔ．デルティンガー（Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ）他， "Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｐｉｘｅｌｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ （ＳＯＦＩ）"， Ｏｐｔ． Ｅｘｐｒｅｓｓ， ３０．０８．２０１０， １８（１８）： ｐ１８８７５−８５， ｄｏｉ： １０．１３６４／ＩＥ．１８．０１８８７５ Ｓ．ガイスビューラー（Ｇｅｉｓｓｂｕｅｈｌｅｒ）他， "Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＯＦＩ ａｎｄ ＳＴＯＲＭ"， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｏｐｔ． Ｅｘｐｒｅｓｓ ２， ｐ４０８−４２０ （２０１１）

本発明は、分解能の向上が達成される顕微鏡検査方法ならびに顕微鏡を得ることを課題として成されたものである。

この課題は、本発明に従って、試料の高解像度画像を作成するための顕微鏡検査方法であって、ａ）励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを試料に施す工程、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つの試料を使用する工程と、ｂ）構造化照明により試料を励起して発光させる工程であって、その際には試料を、構造化照明の様々な照明状態において、繰り返して照明する工程と、ｃ）発光している試料を、各異なる照明状態のそれぞれにおいて、繰り返して１つの検出器上に結像することにより、各異なる照明状態のそれぞれを対象として、画像列を１つずつ得る工程と、ｄ）それぞれの画像列から、ブリンキングにより引き起こされる画像列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数を利用して、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画を作成することにより、各異なる照明状態のそれぞれを対象として、高解像度原画を１つずつ得る工程と、ｅ）得られた各原画から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理を通じて、それぞれの個別画像と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する高解像度画像を作成する工程とを含む、顕微鏡検査方法により解決される。

上述の課題は、他にもさらに本発明に従って、試料の高解像度画像を作成するための顕微鏡検査方法であって、ａ）励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを試料に施す工程、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つの試料を使用する工程と、ｂ）構造化照明により試料を励起して発光させる工程であって、その際には試料を、構造化照明の様々な照明状態を一揃いにして１セットとしたものを使用して、繰り返して照明する工程と、ｃ）それぞれのセットにおいて、それぞれのセット内の各異なる照明状態のそれぞれにおいて、発光している試料を１つの検出器上に結像することにより、いずれのセットにも異なる照明状態ごとに画像が１つずつ含まれている、複数のセットからなる１つの列を得る工程と、ｄ）それぞれのセットから、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理を通じて、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画を作成することにより、複数の原画からなる１つの列を得る工程と、ｅ）複数の原画からなる列から、ブリンキングにより引き起こされる列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数を利用して、各原画と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する高解像度画像を作成する工程とを含む、顕微鏡検査方法によっても解決される。

上述の課題は、試料の高解像度画像を作成するための顕微鏡であって、試料は、励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを備えるか、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出するものであり、顕微鏡が、１つの検出ビーム・パスおよび１つの照明ビーム・パスを有しており、検出ビーム・パスは試料を検出器上に結像させ、また照明ビーム・パスは、構造化照明により試料を照明してこれを発光励起させるようになっており、さらに照明ビーム・パスは、様々な照明状態を実現するための１つの装置を有しており、顕微鏡が他にも１つの演算制御装置を有しており、演算制御装置により、試料が、構造化照明の様々な照明状態において、繰り返して照明されており、発光している試料が、各異なる照明状態のそれぞれにおいて、繰り返して１つの検出器上に結像されており、それにより各異なる照明状態のそれぞれを対象として、画像列が１つずつ得られているように、顕微鏡が制御され、また演算制御装置により、それぞれの画像列から、ブリンキングにより引き起こされる画像列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数を利用して、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画が作成されることにより、各異なる照明状態のそれぞれを対象として、高解像度原画が１つずつ得られており、さらに演算制御装置により、得られた各原画から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理を通じて、それぞれの個別画像と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する高解像度画像が作成されるようになっている、顕微鏡によっても同様に解決される。

最後に上述の課題は、他にも、試料の高解像度画像を作成するための顕微鏡であって、試料は、励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを備えるか、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出するものであり、顕微鏡が、１つの検出ビーム・パスと１つの照明ビーム・パスとを有しており、その際に検出ビーム・パスは試料を検出器上に結像させ、また照明ビーム・パスは、構造化照明により試料を照明してこれを発光励起させるようになっており、さらに照明ビーム・パスは、様々な照明状態を実現するための１つの装置を有しており、顕微鏡が他にも１つの演算制御装置を有しており、演算制御装置により、試料が、構造化照明の様々な照明状態を一揃いにして１セットとしたものを使用して、繰り返して照明されており、それぞれのセットにおいて、それぞれのセット内の各異なる照明状態のそれぞれにおいて、発光している試料が検出器上に結像されていることにより、いずれのセットにも異なる照明状態ごとに画像が１つずつ含まれている、複数のセットからなる１つの列が得られているように、前記顕微鏡が制御され、また演算制御装置により、それぞれのセットから、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理を通じて、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画が作成されることにより、複数の原画からなる１つの列が得られており、さらに演算制御装置により、複数の原画からなる列から、ブリンキングにより引き起こされる列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数を利用して、各原画と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する高解像度画像が作成されるようになっている、顕微鏡によっても解決される。

本発明に従った方法においては、ＳＩＭ／ＩＳＭ原理の各素子が、ＳＯＦＩ原理の各素子と組み合わされるようになっている。その際には組み合わせを絶妙に行うことにより、個々の高解像度画像を組み合わせた場合に生じるような係数√２のさらに上を行く解像度の向上が達成されることになる。この画像の解像度は、それ自体としては、要する工数が同じであっても、本発明に従った方法の個々の特徴に記載されるそれぞれの画像を平均して得られるような解像度よりも高くなる。

ＳＩＭ原理を利用する場合は、構造化照明の少なくとも３つの回転位置および回転位置当たり少なくとも３つのオフセット位置を実現することによって、試料の照明が、構造化照明の少なくとも９種類の照明状態において行われることになる。発光している試料は、これらの異なる照明状態のそれぞれにおいて、複数の画素を持つ１つのフラット・パネル検出器上に繰り返して結像される。それぞれの画素について、ブリンキングにより引き起こされる画像列内の発光強度の変動が評価されるようになっている。

ＩＳＭ原理を利用する場合は、それぞれの照明状態が、ラスター・スキャンの際に生じる、異なるスキャン位置によりもたらされる。従来型のＬＳＭとは異なり、それぞれの異なる照明状態における試料の画像は、蛍光を発する素子の構造を明示する解像度を有している。これは例えば、相応の分解能を有する広視野検出方式により行われるとよい。

この場合は、様々な照明状態において獲得される、蛍光を発する試料のそれぞれの画像により、これらの画像を一揃いにした１つのセットが具現されることになる。そのようなセットを複数獲得する作業を繰り返すことによって、複数のセットからなる１つの列が得られる。この複数のセットからなる列から、次には、以下に示す２通りの方法により、１つの高解像度画像を得ることができる。

１．ＳＩＭ／ＩＳＭに関して知られている演算処理方式を利用し、１回のフーリエ・フィルタリングを使用しながら、それぞれのセットを１つの高解像度原画に変換するとよい。この場合は、そうすることによって、複数の原画からなる１つの列が得られる。この複数の画像からなる列が、続いて１つのキュムラント関数を使用しながら、ＳＯＦＩアプローチ法に従って、解像度がさらに一段と向上されている１つの最終的な画像に換算される。このときに、この最終的な画像の解像度は、原画の解像度と比べて格段と向上されており、結果として、ＳＩＭ原理もしくはＳＯＦＩ原理を使用して獲得されたそれぞれの画像を単純に合体させた場合よりも格段と優れているかもしれない解像度が得られることになる。

２．しかし、いずれのセットにも様々な照明状態における試料の画像が１つずつ含まれている、複数のセットからなる列を、まず最初にそれぞれの照明状態を対象として、ＳＯＦＩ原理を利用して、キュムラント関数を使用しながら、いずれのセットにもそれぞれの照明状態に関して原画が１つずつ含まれている、複数の原画からなる別の１つのセットに換算するようにしてもよい。この複数の原画からなるセットは、続いてＳＩＭ／ＩＳＭに従ったアプローチ法を利用して、解像度が同様にさらに向上された１つの最終的な画像に変換される。

ＳＩＭ原理の各特徴は、本発明の内容に包摂されるために、本願明細書における発明の開示内容においては、ＳＩＭ原理の細部に取り組んでいる次に挙げる各刊行物の内容全体が援用されている。（特許文献１）、独国特許出願公開第１９９０８８８３号明細書、Ｍ．グスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ）， ”Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｒｈ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ ｕｎｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １３．０９．２００５， １０２（３７）： １３０８１−６， Ｅｐｕｂ ２．９０．２００５； Ｒ．ハインツマン（Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ）、Ｃ．クリーマー（Ｃｒｅｍｅｒ）， （１９９８）， Ｐｒｏｃ． ＳＰＩＥ ｉｎｔ． Ｓｏｃ． Ｏｐｔ． Ｅｎｇ． ３５６８， ｐ１８５−１９５。ＩＳＭ関係の刊行物の開示である（非特許文献１）についても同様である。

本発明においては、それ以外にもさらにＳＯＦＩ原理の各特徴が使用されるために、この原理に関連した次に挙げる開示についても同様に、その内容全体が援用されている。（非特許文献２）およびそれに付属する「Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、（非特許文献３）、および（非特許文献４）。

本発明に従った方法においては、適切に励起された後には、統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカが試料に施されるようになっている。そこではマーカとして、具現されることになる試料の様々な構造に付加するようになっている、慣用のラベルまたはその他の物質が備えられるようになっている。あるいはその代わりに、既に相応に発光している試料を使用してもかまわない。すなわち結局のところ、統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する様々な構造を有する試料のイメージングが、顕微鏡により行われるようになっている。ここで「統計学的にブリンキングを行う」とは、個々のマーカまたは試料分子が、いずれも隣接するマーカまたは分子とは関係なく、２通りの発光ビーム状態の間を常に行き来することを意味するものである。これは、最も単純なケースにおいては、発光ビームが放出される状態と、発光ビームが一切放出されない状態であるとよい。しかし、放出される発光ビームが２種類あり、その種類が入れ替わるようにすること、例えば波長が入れ替わったり、偏光状態が入れ替わったりすることなども考えられる。試料のこの特性は、ＳＯＦＩ原理で使用される各素子を適用するためには不可欠である、というのも、この特性が備わっている場合だけに、キュムラント関数により、１つの画像列を１つの単独高解像度画像に転換することが可能となるからである。

異なる照明状態における試料の複数の画像からなるセットが複数そろった１つの列から、フーリエ変換を利用して、解像度がさらに高い複数の原画からなる１つの列への換算が行われるようになっている、上記で言及した第２の変形例を使用する場合は、このブリンキング挙動が、同じ１つのセット内では、極力変化しないようにすべきである。その結果として、１つのセットの記録が行われる時間である、平均ブリンキング周期で測った時間の長さは、短くなるはずであり、すなわちブリンキング周期の逆数、または、非常に好ましくはこの逆数のごく一部よりも長くはならないはずである。これは、セット・レートが、平均画像周期よりも小さい、好ましくはそれよりも１０倍小さくなっているという特徴に相当している。このときには、１つのセット内で、関与している各分子のブリンキング状態が変化しないことが保証されている。その後、複数の原画からなる列において実施されるＳＯＦＩ処理にとって、これは有利である。

したがって、本発明の展開構成形態の一例においては、好ましいことにも、画像記録速度および使用される各分子のブリンキング・レートが適宜互いに適合化されるようになっている。これは、１つには、適切なマーカ分子または試料分子を選択することにより達成することができる。当然ながら、適宜影響を与えることにより、各分子のブリンキング・レートが適合化されるようにしてもよい。これについて、考慮の対象となるのは、特に温度、励起ビームとして作用する照明ビームの波長、励起ビームとして作用する照明ビームの強度など、分子により異なってくる様々な物理影響量である。他にも、例えばガイスビューラー（Ｇｅｉｓｓｂｕｅｈｌｅｒ）他が解説しているように、化学的に影響を与えることも考えられる。さらには、上記で言及した状態に到達するために、所与のブリンキング・レートに対して、画像記録時間もしくしはセット・レート（複数の画像を有するそれぞれのセットのレート）が相応に適合化されるようにしてもよい。

上記および下記においては、本発明に従った方法の各特徴を引き合いに出しながら、本発明について説明を行っているが、その限りにおいて、本発明に従った方法に対応している、上記で言及した各特徴からなる顕微鏡に関しても、本発明に従った方法に関するそれらの説明が準用されるものとする。この顕微鏡にとり重要であるのは、説明されている本発明に従った方法の各特徴を実現するための、顕微鏡の相応の動作が、顕微鏡の演算制御装置により保証される点にある。この演算制御装置は、それに適しているように、例えばプログラミングを適切に行うことにより、構成されている。当然ながら、個々の特徴の説明が、顕微鏡だけに基づいて行われるような場合は、逆のことが言える。その場合これらの特徴は、顕微鏡検査方法に関する説明にも準用されることになる。

ＳＩＭ、ＳＬＩＭ、およびＳＰＥＭに関しては、既に説明したように、構造化照明のローテーションが必要となる。これらの顕微鏡検査方法を実現するために、第２および第３の照明ビーム・パスの共通部内のグリッドに、１つのイメージ・フィールド・ローテータが後置されている場合は、このローテーションを非常に簡単に実現することができる。このイメージ・フィールド・ローテータは、例えば１つのアッベ・ケーニッヒ・プリズムにより実現されたものであるとよい。この後置式イメージ・フィールド・ローテータは、ＳＬＩＭ原理にとっては非常に有利であるが、なぜならばその場合は、グリッドの鉛直方向の位置および線状の照明に必要な調整が１回だけで済み、そうでない場合にグリッド回転時に要求されるようなトラッキングが不要となるからである。

言うまでもないが、上記で指摘した各特徴および下記でさらに解説されることになる各特徴は、提示されているそれぞれの組み合わせにおいてだけではなく、むしろ、本発明の範囲を逸脱することなく、それ以外の組み合わせにおいても、または単独でも、導入できるものである。

以下では、添付図面を例にとり、本発明をさらに詳しく解説するが、これらの図面にも、本発明の本質的な特徴が開示されている。

組み合わせ型顕微鏡を示す概略図。 異なる照明状態の下で得た試料の複数の広視野画像から１つの高解像度画像を作成する工程を明らかにするための図式図。 図２および図３に示される原理を組み合わせて実行される、異なる照明状態における試料の１つの画像列から１つの高解像度画像を作成する工程を具体的に説明するための図式図。 図２および図３に示される原理を組み合わせて実行される、解像度がさらに一段と向上されている画像を作成する方法の第１実施形態を示す図。 同様に図２および図３に示される原理を組み合わせて実行される、同様に解像度がさらに一段と向上されている画像を作成する方法の第２実施形態を示す図。

図１には、古典的な顕微鏡検査方法、すなわち、分解能に回折限界による制限を受ける顕微鏡検査方法を、高分解能顕微鏡検査方法、すなわち、分解能が回折限界を超えて向上されている顕微鏡検査方法と同期で実施することができる１つの顕微鏡１が示されている。

この顕微鏡１は、従来型のレーザ走査顕微鏡をベースとして構成されたものであり、１つの試料２がそれにより把握されるようになっている。そのために顕微鏡１は、全ての顕微鏡検査方法のためのビームが通過するようになっている、１つの対物レンズ３を有している。

この対物レンズ３は、１つのビーム・スプリッタ４を介して、１つの鏡筒レンズ５と共に、この試料を、図示の例においては通常可能ないずれかのフラット・パネル検出器となっている１つのＣＣＤ検出器６上に結像する。この限りにおいて、この顕微鏡１は、一種の従来型光学顕微鏡モジュール７を利用できるようになっており、試料２から対物レンズ３および鏡筒レンズ５を通過してＣＣＤ検出器６に至るビーム・パスは、従来の広視野検出ビーム・パス８に当該している。ビーム・スプリッタ４は、図１に両方向矢印により示唆されるように、ダイクロイック特性を異にする様々なビーム・スプリッタ、もしくは米国特許第２００８／００８８９２０号明細書に従った様々なアクロマチック・ビーム・スプリッタ間の入れ替えを可能とするために、交換式となっている。

対物レンズ３に至るビーム・パスには、さらに１つのレーザ走査モジュール９が結合されており、そのＬＳＭ照明ビーム・パスおよび検出ビーム・パスは、ビーム・スプリッタ機能も併せ持つ１つのスイッチング・ミラー１１を介して、対物レンズ３に至るビーム・パスにカップリングされるようになっている。すなわち、このスイッチング・ミラー１１からビーム・スプリッタ４を通過して対物レンズ３に至るビーム・パスは、照明ビーム・パスと検出ビーム・パスとが１つにまとまったビーム・パスである。これは、レーザ走査モジュール９についても、すなわち広視野検出ビーム・パス８についても言えるが、なぜならば、後ほどさらに詳しく解説することになるように、広視野検出ビーム・パス８と一緒に、すなわちＣＣＤ検出器６と一緒に、顕微鏡検査方法を実現するようになっている照明ビームもまた、スイッチング・ミラー１１のところでカップリングされるからである。

スイッチング・ミラー１１およびビーム・スプリッタ４は、１つにまとめられて１つのビーム・スプリッタ・モジュール１２を形成しているが、それによりスイッチング・ミラー１１およびビーム・スプリッタ４を、アプリケーションに応じて入れ替えることが可能となる。これもまた、両方向矢印により分かり易く示されている。さらにビーム・スプリッタ・モジュール１２内には、１つのエミッション・フィルタ１３が備えられているが、これは、広視野検出ビーム・パス８内に位置して、この広視野検出ビーム・パス８を通り伝播可能なスペクトルの各成分を、適宜フィルタリングするようになっている。当然ながらこのビーム・スプリッタ・モジュール１２内のエミッション・フィルタ１３も交換式となっている。

レーザ走査モジュール９は、動作のために必要なレーザ・ビームを、１本の光ファイバ１４を介してレーザ・モジュール１５から受け取るようになっている。
図１に示される構成方式においては、ビーム・スプリッタ・モジュール１２のところに、より正確にはスイッチング・ミラー１１のところに、集光照明ビーム・パス１６がカップリングされるようになっており、様々な顕微鏡検査方法のための照明ビームは、集光照明ビーム・パス１６を通って走るようになっている。この集光照明ビーム・パス１６には、個々の照明モジュールの様々な照明ビーム・パスがカップリングされている。例えば１つの広視野照明モジュール１７により、１つのスイッチング・ミラー１８を介して、広視野照明ビームが集光照明ビーム・パス１６に結合されることにより、１つの鏡筒レンズ２７と対物レンズ３とを介して、試料２の広視野照明が行われる。この広視野照明モジュールは、例えば１つのＨＢＯ超高圧水銀ショートアークランプを有しているとよい。さらにもう１つ照明モジュールとして、スイッチング・ミラー１８が適切な姿勢を取ったときには、ＴＩＲＦ照明を実現するようになっている、１つのＴＩＲＦ照明モジュール１９が備えられている。そのためにこのＴＩＲＦ照明モジュール１９は、レーザ・モジュール１５からのビームを１本の光ファイバ２０を介して受け取るようになっている。このＴＩＲＦ照明モジュール１９は、前後方向に変位可能な１つのミラー２１を有している。この前後方向の変位により、ＴＩＲＦ照明モジュール１９から放出される照明ビームは、放出される照明ビームの主伝播方向に対して垂直に変位されることになるが、それにより結論としてはＴＩＲＦ照明が、対物レンズ３のところで、対物レンズの光軸に対してある１つの調整可能な角度を成して入射することになる。そうすることによって、カバー・ガラスのところでの全反射に必要な角度を簡単に確保できるようにしている。当然ながら、それ以外にもこの角度調整をもたらすために適した手段はいろいろある。

さらに集光照明ビーム・パスには、１つのマニピュレータ・モジュール２２の照明ビーム・パスが結合されているが、このマニピュレータ・モジュール２２も同様に、詳細には図示されない１本の光ファイバを介して、レーザ・モジュール１５からビームを受け取って、スポット状または線状のビーム分布を、試料２の表面に沿って、走査が行われるように案内するようになっている。すなわち、このマニピュレータ・モジュール２２は、実質的にレーザ走査顕微鏡の照明モジュールに相当するものであり、したがって、このマニピュレータ・モジュール２２を、レーザ走査モジュール９の検出器、またはＣＣＤ検出器６の広視野検出方式と組み合わせて動作させることも可能となっている。

集光照明ビーム・パス１６内にはさらに、顕微鏡１により試料２内に伝達可能な限界周波数を下回るグリッド定数を持つ、１つのグリッド２３が備えられている。このグリッド２３は、集光照明ビーム・パス１６の光軸に対して横向きに変位できるようになっている。そのために、１つの適切な変位駆動装置２４が備えられている。

集光照明ビーム・パス１６内にはさらに、照明方向でこのグリッドに後置される、１つのローテータ駆動装置２６により回転されるようになっている、１つのイメージ・フィールド・ローテータ２５がはめ込まれている。このイメージ・フィールド・ローテータは、例えば１つのアッベ・ケーニッヒ・プリズムであるとよい。

顕微鏡１の各モジュールおよび各駆動装置ならびに各検出器は全て、詳細には図示されない複数の配線を介して、１つの制御装置２８に接続されている。この接続は、例えば１本のデータ兼制御バスを介して行われるとよい。この制御装置２８は、顕微鏡１を様々な動作モードにおいて制御するようになっている。

したがって、この制御装置２８により、この顕微鏡１において、古典的な顕微鏡法、すなわち広視野顕微鏡法（ＷＦ：Ｗｉｄｅ Ｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、レーザ走査顕微鏡法（ＬＳＭ）、および全反射照明蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦ：Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を実施することが可能となっている。図１の顕微鏡は実質的に、レーザ・スキャナ照明に適した２つのモジュール、すなわち、レーザ走査モジュール９ならびにマニピュレータ・モジュール２２を有している。当然ながら、これとは別の組み合わせも考えられる。これらのモジュールは、複数の鏡筒レンズおよび対物レンズ３を介して、試料２の表面に結合されている。マニピュレータ・モジュール２２には、レーザ走査モジュールの励起部分だけが含まれ、検出機能はこれには含まれていない。それにより、試料をスポット状に照明することが可能となり、この照明スポットを試料２の表面に沿ってラスター・スキャンすることが可能となる。マニピュレータ・モジュール２２内には、他にも１つの切換えユニット、例えば１つの切換えレンズまたはシリンドリカル・レンズを配置して、これを利用して、スポット状の照明と線状の照明との切換えが行われるようにすると好適である。この線状の照明は、特に集光照明ビーム・パス１６の１つの中間結像の中に位置するグリッド２３が、ビーム・パス内に旋回されて、この線状の照明の線に対して垂直に位置する場合に、特に有利となる。

このグリッド２３の代わりに、試料２内の構造化照明を作成するために、１つの可変調整式ストライプ・モジュレータ、または１つのＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を導入することもできる。その場合は当然ながら、変位駆動装置２４とならび、グリッド２３をビーム・パス内／外に旋回可能であるように構成することも、最早不要となる。

イメージ・フィールド・ローテータ２５によって、グリッド２３（またはこれに置き換わる素子）により作成される構造化照明を、集光照明ビーム・パス１６の光軸まわりに回転させることが可能となり、それにより、構造化照明は、試料２内で様々な角度に位置するようになる。

個々の動作モード間の切換えを行うために、スイッチング・ミラー１８および１１、ならびにビーム・スプリッタ４の位置調節が適宜行われるようになっている。そのために、その実現にあたっては、各動作モード間の切換えを順次行うことができるようにするために、複数のフリップ・ミラーまたはスウィング・ミラーが使用されるようにするとよい。あるいは、その代わりに、異なるモジュールの同時動作を可能にする、複数のダイクロイック・ミラーも考えられる。

ビーム・スプリッタ４は、ダイクロイック・ビーム・スプリッタとして実施されると好適であるが、そこでは、ＣＣＤ検出器６を使用して検出されることになるそれぞれのマーキング分子の蛍光エミッションのスペクトル部分が、広視野検出ビーム・パス８内に入り込み、それ以外のスペクトル成分が可能な限り透過されるように、スペクトル特性を調整できるようになっている。エミッション特性を異にする様々なマーキング分子の可用性に関して、さらにフレキシビリティを持たせるために、ビーム・スプリッタ・モジュール１２内には、例えば同じ１つのフィルタ・ホイール上に、複数の異なるビーム・スプリッタ４およびエミッション・フィルタ１３が、交換可能であるように配置されている。

ところで、上記で説明した顕微鏡は、高解像度顕微鏡画像を作成するために利用されるものである。制御装置２８は、それに適するように、例えば適切なプログラミングを通じて、構成されている。図４および５に基づき可能性のあるプロセスの進行過程について解説する前に、まずは図２および３に基づき、本願明細書の説明対象である顕微鏡検査方法の構成成分である、本質的な各特徴および原理について解説する。

図２は、例示的にＳＩＭコンセプトを明らかにしたものである。このＳＩＭ法のためには、図１の顕微鏡１において顕微鏡検査される試料の広視野イメージングが繰り返して行われ、またその際には、それぞれのイメージング工程に対して、異なる照明状態が設定されるようになっている。それにより、複数の個別画像４０からなる１つのセット３９が得られることになる。これらの画像４０は、照明ビーム・パス８を通り試料表面に当たる照明の構造化パターン４１に関して、異なるものとなっている。見れば分かるように、異なる画像４０の構造化パターン４１は異なっている。図２においては上面図で示されているこのセット３９から明らかであるように、合計９枚の個別画像４０が存在している、すなわち、その構造化パターン４１には、９種類のオリエンテーションがある。これらの異なる構造化パターンは、図２の概略図においては、それぞれの画像の符号４０に「Ｏ１」から「Ｏ９」を付け足すことにより明確にされている。それぞれの個別画像４０を上から見た、この図２の上面図に示されるように、これらの９通りのオリエンテーションは、構造化パターン４０のオフセット位置もしくは回転位置に関して、異なるものとなっている。この９という数字は、使用されるオリエンテーションの数を例示的に示したものである。本願明細書の一般説明箇所にＳＩＭ原理に関して列記されている各刊行物から知られているように、９よりも多い数も考えられる。

このセット３９のそれぞれの個別画像４０は、順次記録されるようになっているが、その際には、各画像４０の記録工程の合間に、照明の構造化パターン４１が変位もしくは回転されるようになっている。

続いて、このセット３９全体から、１回のフーリエ変換４２を利用して、１つの高解像度画像４３が作成される。この画像４３は、以下で図４に基づきさらに詳しく解説するように、解像度をさらに向上する処理を施すための原画として利用されるようになっている。

すなわち、図２は、ＳＩＭ原理を分かり易く説明したものである。もっとも、その構造化パターン４１については、あくまでも例示的なものであると解釈されたい。構造化パターンは、特に線の構造化パターンである必要は全くない。図式的に書き込まれているそれぞれの線は、線に沿ってさらに構造化されたものであってもかまわない。

同様に、冒頭で指摘したそれぞれのＳＩＭ刊行物において使用される線状の照明に代わり、（非特許文献１）から知られているような、共焦点検出方式の走査が行われる共焦点スポット照明（ｅｉｎｅ ｇｅｓｃａｎｎｔｅｎ ｋｏｎｆｏｋａｌｅ Ｐｕｎｋｔ−Ｂｅｌｅｕｃｈｔｕｎｇ）を導入することも可能である。当然ながら、その場合は、同じ１つの構造化照明に９通りのオリエンテーションは存在せず、むしろ試料のスキャニングから獲得された、適切な数の個別画像が存在することになる。この場合は、それぞれの画像４０が、画像のラスター・スキャンの際の、ある１つの特定のスキャン位置、すなわち、ある１つの特定のラスター状態に相当している。

図３には、高分解能顕微鏡検査のために導入されるさらにもう１つの原理が図式的に示されている。この原理によると、複数の画像４５からなる１つの列４４が記録されるが、冒頭でＳＯＦＩコンセプトとの関連で解説したように、それぞれの画像４５には、試料２内の各蛍光体の他の画像のものとは異なるブリンキング状態が含まれている。各画像の符号４５に付け足されているサフィックスは、この列４４が、一種の時間列であることを明らかにするものである。それぞれの個別画像には、「ｔ１」から「ｔｎ」が付け足されている。この列４４から、１つのキュムラント関数４６を使用した処理を利用して、再び１つの高解像度原画４７が作成される。すなわちｎ個の画像が、１つの単独画像４７に転換されるようになっている。

さて次には、まずは高分解能顕微鏡法の第１の方法から、図４に基づき解説することとする。そのためには、いずれも複数の画像４０．ｏ１から４０．ｏ９からなるセット３９が複数、繰り返して作成される。作成をこのように繰り返すことによって、合計ｎ個のセット３９．ｔ１から３９．ｔｎが存在しており、またそれぞれのセット内には、ＳＩＭコンセプトのために必要となる、照明状態の様々なオリエンテーションが存在しているが、これは、図４においては図２と同じ符号を採用することにより明確にされている。当然ながらＳＩＭ原理ではなく、ＩＳＭ原理が導入されるケースについても、これと同じことが言える。

ここで、フーリエ・フィルタリング４２を導入することにより、それぞれのセット３９．ｔ１から３９．ｔｎから、複数の原画４９．ｔ１から４９．ｔｎからなる１つの列５０が作成される。これらの原画４９は、間に時間をおいて作成されたものであり、またこれらの原画４９には、ＳＩＭ原理が導入されるために、顕微鏡により先験的に提供される解像度よりも高い解像度を有する画像情報が含まれている。次には、キュムラント関数４６を採用しながらこの列５０が１つの高解像度画像５１に換算されるようになっている。この解像度は、それぞれの原画４９における解像度よりも高くなっている。

第２の顕微鏡検査方法においては、それぞれのオリエンテーション．ｏ１から．ｏ９を対象として、複数の画像４５からなる列４４が１つずつ記録されることにより、それぞれのオリエンテーションに対して専用の列が１つずつ存在するようにしている。これらの列は、続いてキュムラント関数４６を導入しながら１つの高解像度原画に換算され、それにより複数の原画５３．ｏ１から５３．ｏ９からなる１つのセット５４が与えられるようにしている。つまり、このセット５４はＳＩＭ原理に必要な様々な照明構造における原画５３を含む。ＳＩＭ原理の使用についてもこれと同じことが言える。この複数の原画からなるセット５４は、続いてフーリエ・フィルタリング４２を使用しながら１つの高解像度画像５５に換算されるが、その空間解像度は、それぞれの原画５３の空間解像度よりも高くなっており、またそれぞれの原画５３の空間解像度も、顕微鏡１の光学系により物理的な限界に基づき本来許容される空間解像度よりも高くなっている。

Claims (8)

1. 試料（２）の高解像度画像（５５）を作成するための顕微鏡検査方法であって、
   ａ） 励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを該試料（２）に施す工程、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つの試料（２）を使用する工程と、
   ｂ） 構造化照明により該試料（２）を励起して発光させる工程であって、その際には該試料を、該構造化照明の様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）において、繰り返して照明する工程と、
   ｃ） 該発光している試料（２）を、各異なる照明状態のそれぞれにおいて、繰り返して１つの検出器上に結像することにより、該各異なる照明状態（．ｏ１〜ｏ９）のそれぞれを対象として、画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）を１つずつ得る工程と、
   ｄ） それぞれの画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）から、該ブリンキングにより引き起こされる該画像列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数（４６）を利用して、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画を作成することにより、該各異なる照明状態（．ｏ１〜ｏ９）のそれぞれを対象として、高解像度原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）を１つずつ得る工程と、
   ｅ） 該得られた各原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理（４２）を通じて、該各原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する該高解像度画像（５５）を作成する工程と
   を含む方法。
2. 試料（２）の高解像度画像（５１）を作成するための顕微鏡検査方法であって、
   ａ） 励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを該試料（２）に施す工程、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つの試料（２）を使用する工程と、
   ｂ） 構造化照明により該試料（２）を励起して発光させる工程であって、その際には該試料を、該構造化照明の様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）を一揃いにして１セットとしたものを使用して、繰り返して照明する工程と、
   ｃ） それぞれのセットにおいて、それぞれのセット内の該様々な照明状態のそれぞれにおいて、該発光している試料（２）を１つの検出器上に結像することにより、いずれのセットにも様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）ごとに画像（４０）が１つずつ含まれている、複数のセット（３９．ｔ１〜３９．ｔｎ）からなる１つの列を得る工程と、
   ｄ） 該それぞれのセット（３９．ｔ１〜３９．ｔｎ）から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理（４２）を通じて、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画（４９．ｔ１〜４９．ｔｎ）を作成することにより、複数の原画（４９．ｔ１〜４９．ｔｎ）からなる１つの列（５０）を得る工程と、
   ｅ） 該複数の原画（４９．ｔ１〜４９．ｔｎ）からなる列（５０）から、該ブリンキングにより引き起こされる該列（５０）内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数（４６）を利用して、該各原画（４９．ｔ１〜４９．ｔｎ）と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する該高解像度画像（５１）を作成する工程と
   を含む方法。
3. ある１つの平均ブリンキング・レートでブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカまたは１つの試料を使用して、工程ｃ）において、１つのセット（３９．ｔ１〜３９．ｔｎ）を作成するための時間の長さが、該平均ブリンキング・レートの逆数以下、好適には該逆数の１／１０以下となるように、それぞれの画像の記録時間が選定される、請求項２に記載の方法。
4. 前記様々な照明状態が、前記構造化照明の３つの回転位置および回転位置当たり少なくとも３つのオフセット位置を有しており、前記試料が複数の画素を有する１つのフラット・パネル検出器上に結像される、請求項１、２または３に記載の方法。
5. 試料（２）の高解像度画像（５５）を作成するための顕微鏡であって、該試料（２）は、励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを備えるか、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出するものであり、該顕微鏡が、
   ・ １つの検出ビーム・パス（８）および１つの照明ビーム・パス（１６）であって、該検出ビーム・パス（８）は該試料（２）を１つの検出器（６）上に結像させ、また該照明ビーム・パス（１６）は、構造化照明により該試料（２）を照明してこれを発光励起させるようになっており、さらに、該照明ビーム・パス（１６）は、様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）を実現するための１つの装置を有している、前記１つの検出ビーム・パス（８）および１つの照明ビーム・パス（１６）と、
   ・ １つの演算制御装置（２８）であって、該演算制御装置（２８）により、該試料（２）が、該構造化照明の該様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）において、繰り返して照明されて、該発光している試料が、該様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれにおいて、繰り返して１つの検出器上に結像されていることによって、各異なる照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれを対象として、画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）が１つずつ得られているように、該顕微鏡（１）が制御される、前記１つの演算制御装置（２８）と
   を備え、
   該演算制御装置（２８）により、それぞれの画像列（４４．ｏ１〜４４．ｏ９）から、該ブリンキングにより引き起こされる該画像列内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数（４６）を利用して、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画が作成されることにより、該各異なる照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれを対象として、高解像度原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）が１つずつ得られ、
   該演算制御装置（２８）により、該得られた各原画（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）から、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理（４２）を通じて、それぞれの個別画像（５３．ｏ１〜５３．ｏ９）と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する該高解像度画像（５５）が作成される、
   顕微鏡。
6. 試料（２）の高解像度画像を作成するための顕微鏡であって、該試料（２）は、励起後に統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出する１つのマーカを備えるか、または、励起後に局所的に分散した状態で統計学的にブリンキングを行うように発光ビームを放出するものであり、該顕微鏡が、
   ・ １つの検出ビーム・パス（８）および１つの照明ビーム・パス（１６）であって、該検出ビーム・パス（８）は該試料（２）を１つの検出器上（６）に結像させ、また該照明ビーム・パス（１６）は、構造化照明により該試料（２）を照明してこれを発光励起させるようになっており、さらに、該照明ビーム・パス（１６）は、様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）を実現するための１つの装置を有している、前記１つの検出ビーム・パス（８）および１つの照明ビーム・パス（１６）と、
   ・ １つの演算制御装置（２８）であって、該演算制御装置（２８）により、該試料（２）が、該構造化照明の様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）を一揃いにして１セットとしたものを使用して、繰り返して照明されており、それぞれのセットにおいて、それぞれのセット内の該様々な照明状態（．ｏ１〜．ｏ９）のそれぞれにおいて、発光している試料が１つの検出器（６）上に結像されていることにより、いずれのセットにも異なる照明状態ごとに画像が１つずつ含まれている、複数のセットからなる１つの列が得られているように、前記顕微鏡（１）が制御される、前記１つの演算制御装置（２８）と
   を備え、
   該演算制御装置（２８）により、それぞれのセットから、１回のフーリエ・フィルタリングを含む一定の演算処理（４２）を通じて、光学的なイメージング分解能を超えて向上されたある１つの空間分解能を有する１つの原画（４９．ｔ１〜．ｔ９）を作成することにより、複数の原画（４９．ｔ１〜．ｔ９）からなる１つの列（５０）が得られ、
   該演算制御装置（２８）により、該複数の原画（４９．ｔ１〜．ｔ９）からなる列（５０）から、該ブリンキングにより引き起こされる該列（５０）内の蛍光強度の変動を評価する１つのキュムラント関数（４６）を利用して、該各原画（４９．ｔ１〜．ｔ９）と比べて向上されたある１つの空間分解能を有する該高解像度画像（５５）が作成される、
   顕微鏡。
7. 前記試料（２）またはその１つのマーカが、ある１つの平均ブリンキング・レートでブリンキングを行うように発光ビームを放出し、１つのセット（３９．ｔ１〜３９．ｔｎ）を作成するための時間の長さが、該平均ブリンキング・レートの逆数以下、好適には該逆数の１／１０以下となるように、それぞれの画像の記録時間が決定されている、請求項６に記載の顕微鏡。
8. 前記様々な照明状態が、前記構造化照明の３つの回転位置および回転位置当たり３つのオフセット位置を有しており、前記検出ビームパス（８）が、複数の画素を有する１つのフラット・パネル検出器（６）上に前記試料（２）を結像させる、請求項５、６または７に記載の顕微鏡。

Images