JP2014508295A - 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法 - Google Patents

白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2014508295A
JP2014508295A JP2013554613A JP2013554613A JP2014508295A JP 2014508295 A JP2014508295 A JP 2014508295A JP 2013554613 A JP2013554613 A JP 2013554613A JP 2013554613 A JP2013554613 A JP 2013554613A JP 2014508295 A JP2014508295 A JP 2014508295A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
abl
bcr
patient
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2013554613A
Other languages
English (en)
Inventor
シャラット シング，
シンジュン リウ，
ケリー ディー． ヘスター，
Original Assignee
ネステク ソシエテ アノニム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ネステク ソシエテ アノニム filed Critical ネステク ソシエテ アノニム
Publication of JP2014508295A publication Critical patent/JP2014508295A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/24—Apparatus for enzymology or microbiology tube or bottle type
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/029—Separating blood components present in distinct layers in a container, not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3496—Plasmapheresis; Leucopheresis; Lymphopheresis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3621—Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3627—Degassing devices; Buffer reservoirs; Drip chambers; Blood filters
    • A61M1/3633—Blood component filters, e.g. leukocyte filters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A61M2202/0439—White blood cells; Leucocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Abstract

本発明は、抗癌剤のような治療剤の細胞内濃度を変化させることなく、白血球及び／又は循環腫瘍細胞のような血液細胞のサブセットを血液試料から濾過により単離又は回収するための新規な装置及び方法を提供する。技術常識に反して、本発明の装置及び方法は、有利なことに、抗癌剤のような治療剤の実質的な希釈なしで、白血球及び／又は循環腫瘍細胞のような回収された細胞からの細胞ライセートを提供する。
【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、米国特許仮出願第６１／４４４，０４４号（出願日：２０１１年２月１７日）及び米国特許仮出願第６１／４８９，９９８号（出願日：２０１１年５月２５日）についての優先権を主張するものである。これらの仮出願の開示内容は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。
発明の背景
[0002]癌は、米国において２番目の死亡原因である。癌の診断及び予後のための発癌マーカーの正確な分析の必要性が以前にも増して存在する。例えば、多くの種々の発癌マーカーの検出により、医師が早期段階の癌を検出して、癌の増悪をモニターすることが可能となり得る。薬物治療開始前に抗癌治療に対する患者の応答性を知っておくことにより、医師は個々の患者について最良の治療方針を選択できる。さらに、治療の過程で薬物の有効性を日常的に分析することにより、特定の抗癌剤に対する患者の無応答性が明らかになることがある。この情報を用いて薬物治療計画の選択を改善することができる。
[0003]発癌マーカー分析のための現在の方法は、全血のような正常細胞と癌細胞との不均質混合物中において悪性細胞を調べることに基づく。ＬｅｕｋｏＬＯＣＫトータルＲＮＡ単離システム（Ａｍｂｉｏｎ）のような方法は、使い捨て白血球除去フィルターに血液試料を通過させることにより、全血から循環悪性細胞を捕捉する。典型的には、これらの除去フィルターにＰＢＳのような緩衝液を流して悪性細胞を回収する。この洗浄ステップは、細胞が以前に曝露された抗癌剤の細胞内濃度を変化させ、そのことにより細胞内でｄｅ ｎｏｖｏシグナル伝達応答を引き起こし、発癌マーカーの発現を変更する可能性がある。その結果、分析試料中の発癌マーカーの発現は、特定の抗癌治療に対する患者の応答を不正確に反映する可能性がある。このことは、誤った診断及び／又は予後評価を導き得る。本発明は、抗癌剤の細胞内濃度を変化させることなく血液細胞のサブセットを単離するための方法及び装置を提供することにより、この潜在的な誤りの源を克服する。
[0004]本発明は、治療剤（すなわち抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤））の細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）濃度を変化させることなく、血液細胞のサブセット（例えば、正常白血球、疾病白血球、悪性白血球、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を血液試料から濾過により単離、採取及び／又は回収するための装置及び方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、濾過デバイスと収集チューブとを含む細胞単離装置を提供する。
[0005]一態様において、本発明は、
全血試料において白血球を赤血球から単離及び分離するための装置であって、
上部チャンバー、下部チャンバー、及び上部チャンバーと下部チャンバーとの間の１又は複数の積層フィルターメンブレンを含む濾過デバイスであって、１又は複数の積層フィルターメンブレンが白血球を保持できる、濾過デバイスと、
全血試料から赤血球を収集するための収集チューブと、
を含み、
濾過デバイスは収集チューブの上に置かれ、赤血球は白血球から分離され、遠心処理後に収集チューブ中に収集される、装置
を提供する。好ましい態様では、下部チャンバーは上部チャンバーと収集チューブの間に配置される。
[0006]他の実施形態において、本発明は、
治療剤（例えば抗癌剤）の実質的な希釈なしで白血球のライセートを全血試料から調製するための方法であって、
（ａ）全血試料を細胞単離（濾過）装置（例えば、本明細書に記載の装置）に装填するステップと、
（ｂ）装置を遠心処理して、白血球を１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉して、赤血球を収集チューブ中に分離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に洗浄ステップを行わずに、１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉された白血球を溶解緩衝液で溶解し、それにより白血球のライセートを得るステップと、
を含む方法を提供する。
[0007]他の態様において、本発明は、
対象における抗癌剤の効力をモニターする方法であって、
対象は血液学的悪性疾患を有し、該方法は、
抗癌剤を対象に投与するステップであって、抗癌剤の１回目の投与が時間Ｔ１に行われるステップと、
ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルを、時間Ｔ２に対象からの試料において測定するステップと、
治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルに基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0008]いくつかの実施形態では、方法は、ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態を、抗癌剤の１回目の投与前のＴ０に測定するステップをさらに含む。いくつかの場合には、血液学的悪性疾患は、リンパ腫又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のような白血病である。Ｔ１とＴ２の間の時間の差は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４週間のような約１週間〜約６ヶ月間である。Ｔ０とＴ１の間の時間の差は、約１日〜約３週間である。いくつかの他の態様では、方法は、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのような少なくとも１つの他のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルを測定するステップをさらに含む。
[0009]いくつかの態様では、治療方針は、抗癌剤用量を変更すること、抗癌剤を変更すること、さらなる抗癌剤を含めること、治療期間を変更すること、及び現在の治療方針を維持することから選択される。
[0010]いくつかの態様では、試料は単離細胞の抽出物を含む。いくつかの態様では、単離細胞を、少なくとも１つの抗癌剤（例えば２つの抗癌剤）と、Ｔ０（治療開始前）にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。他の場合には、単離細胞を、少なくとも２つの抗癌剤と、治療方針を決定する前のＴ２にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。
[0011]さらに別の実施形態では、本発明は、
血液学的悪性疾患を有する対象における抗癌剤を選択する方法であって、
ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、対象からの試料からの単離細胞において測定するステップと、
治療開始前に、単離細胞を少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートするステップと、
ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、インキュベートした細胞において測定するステップと、
治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルに基づいて選択するステップと、
を含む方法を提供する。
[0012]いくつかの態様では、治療方針は、抗癌剤を選択すること、抗癌剤用量を選択すること及び治療期間を決定することからなる群から選択される。いくつかの他の態様では、方法は、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのような少なくとも１つの他のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルを測定するステップをさらに含む。
[0013]すなわち、本発明は、
血液学的悪性疾患を有する対象における抗癌剤を選択する方法であって、
１）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、対象からの試料からの単離細胞において測定するステップと、
２）治療開始前に、単離細胞を少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートするステップと、
３）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、インキュベートした細胞において測定するステップと、
治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルに基づいて選択するステップと、
を含む方法を提供する。
[0014]本発明はまた、
対象における抗癌剤の効力をモニターする方法であって、
対象は血液学的悪性疾患を有し、該方法は、
ａ）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態を、抗癌剤の１回目の投与前のＴ０に測定するステップと、
ｂ）対象に抗癌剤を投与するステップであって、抗癌剤の１回目の投与が時間Ｔ１に行われるステップと、
ｃ）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルを、時間Ｔ２に対象からの試料において測定するステップと、
ｄ）治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬ活性化状態及び／又は発現レベルに基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0015]本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から当業者にとって明らかである。
本発明の一実施形態のフローチャートである。 細胞単離装置の実施形態を示す。図２Ａは上部チャンバーの実施形態である。図２Ｂ〜Ｃは、キャップを有する上部チャンバーを示し、図２Ｄ〜Ｅは下部チャンバーであり、図２Ｆ〜Ｇは収集チューブである。 種々の漏斗機能を有する下部チャンバーの実施形態を示す。 細胞単離装置の実施形態を示す。図４Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図４Ｂは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図４Ｃは収集チューブの実施形態であり、図４Ｄは、上部チャンバー、下部チャンバー及び収集チューブの集合体の実施形態である。 細胞単離装置の他の実施形態を示す。図５Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｂは、キャップを有する上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｃは、キャップを有する収集チューブの実施形態であり、図５Ｄは、下部チャンバー及び漏斗の実施形態である。 細胞単離装置の他の実施形態を示す。図５Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｂは、キャップを有する上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｃは、キャップを有する収集チューブの実施形態であり、図５Ｄは、下部チャンバー及び漏斗の実施形態である。 細胞単離装置の他の実施形態を示す。図５Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｂは、キャップを有する上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｃは、キャップを有する収集チューブの実施形態であり、図５Ｄは、下部チャンバー及び漏斗の実施形態である。 細胞単離装置の他の実施形態を示す。図５Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｂは、キャップを有する上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図５Ｃは、キャップを有する収集チューブの実施形態であり、図５Ｄは、下部チャンバー及び漏斗の実施形態である。 細胞単離装置のさらに別の実施形態を示す。図６Ａは上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図６Ｂは、中間スリーブを有する上部及び下部チャンバーの実施形態であり、図６Ｃは、下部チャンバーの実施形態である。 濾過によりＫ５６２細胞から調製された細胞ライセートにおいて、全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬがともに検出及び測定できることを示す。濾過後の細胞における全ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルは、無濾過試料において観察されるレベルと同様である。さらに、図７Ｂは、濾過後のＫ５６２細胞におけるリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルが、無処理細胞において検出されるレベルに匹敵することを示す。 全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル（図８Ａ）及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル（図８Ｂ）がともに細胞ライセートにおいて検出及び測定できることを示す。ここで、細胞ライセートは、Ｋ５６２細胞を添加した血液試料から調製され、濾過メンブレンを通して濾過され、マイクロアレイ（例えば、本明細書に記載の近接媒介性イムノアッセイ）により分析される。図８Ｂは、種々の速度で遠心処理された異なる試料における全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの回収率が比較できることを示す。回収されたホスホＢＣＲ−ＡＢＬ（６３．６０％）及び全ＢＣＲ−ＡＢＬ（１４１．５５％）シグナルの最高のパーセンテージは、ＰＡＬＬ濾過メンブレン及び６００ｒｐｍでの遠心処理を用いたものからであった。 種々の量のＫ５６２細胞を添加した血液試料から調製され、濾過メンブレンを通して濾過され、マイクロアレイ（例えば、本明細書に記載の近接媒介性イムノアッセイ）により分析された細胞ライセートにおいて、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル（Ａ）が検出及び測定できることを示す。本発明の方法は、Ｋ５６２細胞を添加した試料におけるホスホＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを検出するために用いることができる。特に、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの測定されたレベルは、血液試料に加えたＫ５６２細胞の数と関係する。図９Ｂは全ＢＣＲ−ＡＢＬの回収率を示す。 種々の量のＫ５６２細胞を添加した血液試料から調製され、濾過メンブレンを通して濾過され、マイクロアレイ（例えば、本明細書に記載の近接媒介性イムノアッセイ）により分析された細胞ライセートにおいて、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル（Ａ）が検出及び測定できることを示す。本発明の方法は、Ｋ５６２細胞を添加した試料におけるホスホＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを検出するために用いることができる。特に、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの測定されたレベルは、血液試料に加えたＫ５６２細胞の数と関係する。図９Ｂは全ＢＣＲ−ＡＢＬの回収率を示す。 本発明の一実施形態において分析した患者を要約する図である。患者１は活動性ＣＭＬを有し、２００６年１２月から治療を受けている。活動性ＣＭＬを同様に有する患者２はイマチニブ治療を１月から受けている。 患者１（Ａ）において、患者２（例えば１８５，９３４ＣＵ／ｍｌ±１１，０１９ＣＵ／ｍｌ）（Ｂ）と比較して、血液１ｍｌ当たりのホスホＢＣＲ−ＡＢＬの量がより少ない（例えば１０，９７９ＣＵ／ｍｌ±１，２４５ＣＵ／ｍｌ）ことを示す。このことは、患者１がイマチニブ治療に応答することを示唆する。値は、血液バックグラウンドを除去せずに決定した。 本明細書に記載の方法により決定したＢＣＲ−ＡＢＬの活性化（リン酸化）レベルの検出を示す。患者１から単離した細胞ライセート試料は、実施例６に記載の方法に従って１：５及び１：２０に希釈した。標準試料は、ライセート８０μｌ当たり種々の細胞数（例えば、１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０又は０個の細胞／８０μｌ）を有する無処理Ｋ５６２細胞ライセートである。図１２Ａの上のパネルはＢＣＲ−ＡＢＬ ＣＥＥＲアッセイの画像を示す。 本明細書に記載の方法により決定したＢＣＲ−ＡＢＬの活性化（リン酸化）レベルの検出を示す。患者１から単離した細胞ライセート試料は、実施例６に記載の方法に従って１：５及び１：２０に希釈した。標準試料は、ライセート８０μｌ当たり種々の細胞数（例えば、１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０又は０個の細胞／８０μｌ）を有する無処理Ｋ５６２細胞ライセートである。図１２Ａの上のパネルはＢＣＲ−ＡＢＬ ＣＥＥＲアッセイの画像を示す。 患者１の血液試料をイマチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理することが、ニロチニブ処理と比較してリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの量を劇的に減少させたことを示す。図１３ＡはＢＣＲ−ＡＢＬ ＣＥＥＲアッセイの画像を示す。 患者１の血液試料における活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルが、漸増量のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ又はニロチニブ）で処理した場合に変化することを示す。異なる濃度の薬物を患者１の血液試料と１．５時間、３７℃でインキュベートした。１μＭイマチニブ処理後の平均ＣＵ値は２６であり、０．１μＭイマチニブ処理後は１１０であった。図１４の上のパネルはＢＣＲ−ＡＢＬ ＣＥＥＲアッセイの画像を示す。 イマチニブが、患者１の血液試料における活性化ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の低減についてニロチニブよりも効果的であることを示す。棒グラフは、１μＭイマチニブ処理が無処理試料と比較して活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル（Ａ）を減少させたことを示す。図１５Ｂは血液バックグラウンド除去後のものである。 他のリン酸化シグナル伝達経路構成要素（例えば、ＣＲＫＬ（Ａ）、ＡＫＴ（Ｂ）、ＳＴＡＴ５（Ｃ）、ＳＲＣ（Ｄ））の経路プロファイルを示す。これは、ダサチニブ治療が患者１の血液試料において活性化ＡＫＴ、ＳＴＡＴ４及びＳＲＣのレベルを低減できることを示す。患者の血液試料を１μＭダサチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理することは、１０μＭイマチニブ又は１０μＭニロチニブのいずれよりも効果的であった。 患者１の血液試料が非常に高いレベルの全ＢＣＲを含有する（約８，０００，０００ＣＵ／ｍｌ）ことを示す。 ニロチニブが、患者２のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理血液試料における活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルの減少について、イマチニブと比較してより効果的であることを示す。図１８Ａは、患者２の血液試料を１０μＭニロチニブとともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることが、ホスホＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率の低減について最も効果的な処理であったことを示す。リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルは、患者血液試料を異なる投与量のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で１．５時間、３７℃でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した後に検出及び測定した。図１８Ｂは、漸増投与量のニロチニブが活性化ＢＣＲ−ＡＢＬを減少させるが、イマチニブは患者２の血液試料に影響しないことを示す。ホスホＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率は、１０μＭニロチニブでは３９．３５％に減少したが、１０μＭイマチニブでは９６．４６％に減少したにすぎなかった。 患者２の血液試料をダサチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理することが、活性化ＣＲＫＬ（Ａ）、ＡＫＴ（Ｂ）、ＳＴＡＴ５（Ｃ）及びＳＲＣ（Ｄ）のレベルを低減できることを示す。他方、イマチニブ又はニロチニブでの同様の処理はリン酸化ＡＫＴのみを低減させる。 チロシンキナーゼ阻害剤でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理された複数の患者の血液試料においてリン酸化ＣＲＫＬレベルが検出及び測定できることを示す。イマチニブ及びニロチニブのようなＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、患者１の血液試料においてのみＣＲＫＬレベルを低減でき、患者２ではできない。図２０Ａ、Ｂは、ホスホＣＲＫＬレベル（ＣＵ／ｍｌ血液）が、１０μＭイマチニブ又は１０μＭニロチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した患者１試料において無処理試料と比較して減少したことを示す。同様に、図２０Ｃ、Ｄは、患者１試料において、ホスホＣＲＫＬシグナルのパーセンテージがｉｎ ｖｉｔｒｏ処理により減少したことを示す。同様の応答は患者２試料では観察されなかった。 チロシンキナーゼ阻害剤でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理された複数の患者の血液試料においてリン酸化ＣＲＫＬレベルが検出及び測定できることを示す。イマチニブ及びニロチニブのようなＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、患者１の血液試料においてのみＣＲＫＬレベルを低減でき、患者２ではできない。図２０Ａ、Ｂは、ホスホＣＲＫＬレベル（ＣＵ／ｍｌ血液）が、１０μＭイマチニブ又は１０μＭニロチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した患者１試料において無処理試料と比較して減少したことを示す。同様に、図２０Ｃ、Ｄは、患者１試料において、ホスホＣＲＫＬシグナルのパーセンテージがｉｎ ｖｉｔｒｏ処理により減少したことを示す。同様の応答は患者２試料では観察されなかった。 患者１及び患者２が、イマチニブ及びニロチニブに対して同様には応答しないことを示す。活性化ＡＫＴは、イマチニブ処理後に患者１の試料では増加したが、患者２の試料では減少した。ニロチニブに応答して、ＡＫＴレベルは、無処理試料と比較して患者１の試料ではほとんど変化しないままであるが、患者２の試料では大きく減少する。図２１Ａ、Ｂは、算出した結果を、アッセイした１０００細胞当たりの活性化ＡＫＴのピコグラムで示す。図２１Ｃ、Ｄは、決定した結果を、ＣＥＥＲアッセイから回収したＡＫＴシグナルのパーセンテージで示す。 患者１及び患者２が、イマチニブ及びニロチニブに対して同様には応答しないことを示す。活性化ＡＫＴは、イマチニブ処理後に患者１の試料では増加したが、患者２の試料では減少した。ニロチニブに応答して、ＡＫＴレベルは、無処理試料と比較して患者１の試料ではほとんど変化しないままであるが、患者２の試料では大きく減少する。図２１Ａ、Ｂは、算出した結果を、アッセイした１０００細胞当たりの活性化ＡＫＴのピコグラムで示す。図２１Ｃ、Ｄは、決定した結果を、ＣＥＥＲアッセイから回収したＡＫＴシグナルのパーセンテージで示す。 患者１（Ａ）及び患者２（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理血液試料の活性化ＳＴＡＴ５プロファイルを示す。ダサチニブ処理は、患者１及び患者２の試料におけるホスホＳＴＡＴ５レベルを減少させた。イマチニブ又はニロチニブ処理は、同程度には活性化ＳＴＡＴ５を変化させなかった。 患者１及び患者２の試料のいずれにおいても、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブに応答してホスホＳＲＣのレベルがより低いことを示す。図２３Ａ、Ｂは、算出したホスホＳＲＣレベルを、アッセイした１０００細胞当たりのピコグラムで示す。図２３Ｃ、Ｄは、ホスホＳＲＣレベルを、回収したホスホＳＲＣシグナルのパーセンテージで示す。 患者１及び患者２の試料のいずれにおいても、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブに応答してホスホＳＲＣのレベルがより低いことを示す。図２３Ａ、Ｂは、算出したホスホＳＲＣレベルを、アッセイした１０００細胞当たりのピコグラムで示す。図２３Ｃ、Ｄは、ホスホＳＲＣレベルを、回収したホスホＳＲＣシグナルのパーセンテージで示す。 本研究に参加した患者のリストを示す。患者はＣＭＬと診断され、標的治療を受けた。ＣＥＥＲアッセイによるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害のｉｎ ｖｉｖｏ調節を、これらの患者においてモニターした。 本研究に参加した何人かの患者のリストを示す。アスタリスクは、本発明の細胞単離装置のチューブの実施形態を用いて処理した血液試料を示す。その他の血液試料は９６ウェルの実施形態を用いて処理した。 正常健常対象の血液試料におけるＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ及びＡＢＬの発現レベルを示す。 複数の時点での患者１（Ａ）及び患者７（Ｂ）の活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを示す。ＷＢＣ＝白血球。ｐＢＣＲ−ＡＢＬ＝ホスホＢＣＲ−ＡＢＬ。ｔＢＣＲ−ＡＢＬ＝全ＢＣＲ−ＡＢＬ。％Ｐ／Ｔ＝パーセンテージでのホスホＢＣＲ−ＡＢＬ／ｔＢＣＲ−ＡＢＬ。 複数の時点での患者２のＢＣＲ−ＡＢＬプロファイルを示す。図２８Ａは、ｐＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＢＣ比が、５／１１に採取した血液において下落し、１０／１２までに増加したことを示す。アスタリスクは、ｐＢＣＲ−ＡＢＬデータが、グラフ上で値が視覚化されるように１０倍したものであることを示す。図２８Ｂは、ｐＢＣＲ−ＡＢＬ／全ＢＣＲ−ＡＢＬ比が５／１１に最低であったことを示す。図２８Ｃは、ＢＣＲ−ＡＢＬについてのＭｏｌｅｃｕｌａｒＭＤキットを用いる定量ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果及びｍＲＮＡの低いレベルを示す。ＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬのパーセンテージは、試料に存在するｍＲＮＡの量とともに変動する。 複数の時点での患者３のＷＢＣ数及びｐＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＢＣ比を示す（Ａ）。図２９Ｂは、全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル並びにｍＲＮＡパーセンテージの変化を示す。 複数の時点での患者８の全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを示す（Ａ）。図３０Ｂは、治療薬をイマチニブからダサチニブに変更した後の、全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベル並びにｍＲＮＡパーセンテージの変化を示す。 複数の時点での患者１４（Ｂ）及び患者１８（Ａ）における全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを示す。 イマチニブ又はニロチニブでのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理に対する患者１４の応答を示す。全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及びホスホＢＣＲ−ＡＢＬレベルは薬物処理により減少した。
発明の詳細な説明
Ｉ．イントロダクション
[0048]本発明は、有利なことに、抗癌剤［例えばチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、スニチニブ（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（ＺＡＣＴＩＭＡ）（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）］のような治療剤の細胞内濃度を変化させることなく、血液細胞のサブセット（例えば、正常及び／又は悪性白血球、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を血液試料から濾過により単離又は回収するための新規な装置及び方法を提供する。技術常識に反して、本発明の装置及び方法は、抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）のような治療剤の実質的な希釈なしで、白血球、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞のような回収された細胞からの細胞ライセートを提供する。
[0049]ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）と関連する。特に、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質は、癌の病原にとって重要な活性チロシンキナーゼである。イマチニブ（グリベック（登録商標））は、現在、ＣＭＬと新たに診断された患者のための第１選択治療薬であるが、患者の約２０〜２５％は、耐久性のある完全な細胞遺伝学的応答を達成しない。継続したイマチニブ治療下でのＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性の再活性化が耐性の主な原因であることが研究により示されている。それ自体で、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性の測定は、イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤での治療に対する応答を予測すること、及びこのような阻害剤に対して耐性を発生する患者を同定することにおいて有用性がある。
[0050]いくつかの実施形態では、本発明の装置及び方法は、関心対象の細胞（例えば、白血球、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞）を、血液のような試料から単離又は回収し、そこからライセートを調製するために用いることができ、例えば得られた細胞ライセート中に存在するＢＣＲ−ＡＢＬのような分析物は、その発現及び／又は活性化レベルについて、協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ（商標））（協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）としても知られる。）のようなアッセイを用いて調べることができる。ＣＥＥＲ（商標）は次の特許文書（これらは、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載されている：国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレット、国際公開第２００９／０１２１４０号パンフレット、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット、国際公開第２０１０／１３２７２３号パンフレット、国際公開第２０１１／００８９９０号パンフレット及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３３８６（出願日：２０１０年１０月２０日）。
[0051]特定の実施形態では、少なくとも１種の発癌融合タンパク質、それらの基質及び／又はその他のシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＣＲＫＬ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｃ−ＡＢＬ、ｃ−ＣＢＬ、ＳＨＣ、ＳＨＰ−２、ＶＡＶ、ＢＡＰ−１、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＰＩ３Ｋ）の発現／活性化プロファイリングを、本発明の装置及び方法を用いて調製した細胞ライセートについて行って、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患（例えば慢性骨髄性白血病）の患者についての阻害剤治療の効力を決定できる。いくつかの場合には、患者は、本明細書に記載のチロシンキナーゼ阻害剤での治療のような阻害剤治療を受けることができる。特定の場合には、白血病細胞は、チロシンキナーゼ阻害剤の実質的な希釈なしでそのような患者の血液試料から単離される。いくつかの他の場合には、チロシンキナーゼ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理後の試料における発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達経路構成要素の発現／活性化プロファイリングは、価値のある情報を提供して、臨床家が効果的な治療計画を選択することを可能にする。
[0052]非限定的な例として、チロシンキナーゼ阻害剤治療を受けている患者の血液試料を分析して治療の有効性を決定できる。患者の血液を採取し、関心対象の細胞（例えば、白血球、白血病細胞及び／又は循環腫瘍細胞）を、本発明の装置及び方法を用いる濾過により単離する。次いで細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）のようなアッセイを用いて調べて、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）、それらの基質（例えば、ＣＲＫＬ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｃ−ＡＢＬ、ｃ−ＣＢＬ、ＳＨＣ、ＳＨＰ−２、ＶＡＶ及び／又はＢＡＰ−１のようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質）及び／又はその他のシグナル伝達分子の活性化状態及び／又は総量に対するチロシンキナーゼ阻害剤処理の効果を決定する。特定の実施形態では、白血球、白血病細胞及び／又は循環腫瘍細胞の数、並びにリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬ及びその他のシグナル伝達経路構成要素のプロファイルを決定できる。リン酸化シグナル比も分析から算出でき、患者の予後を決定するために用いることができる。特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤治療の効力は、患者において、チロシンキナーゼ阻害剤を時間Ｔ１に投与し、ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルを時間Ｔ２に患者からの試料において測定し、治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルに基づいて決定することによってモニターできる。
[0053]他の非限定的な例として、（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤治療を受けていない）患者の血液試料を少なくとも１種の阻害剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に、白血球、白血病細胞及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離できる。特定の場合には、ＣＭＬと診断された患者から採取した全血試料を少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ）で処理する。関心対象の細胞（例えば白血病細胞）は、本発明の装置及び方法を用いる濾過により単離される。次いで細胞を溶解し、例えばＣＥＥＲ（商標）のようなアッセイを用いて調べて、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）、それらの基質（例えば、ＣＲＫＬ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｃ−ＡＢＬ、ｃ−ＣＢＬ、ＳＨＣ、ＳＨＰ−２、ＶＡＶ及び／又はＢＡＰ−１のようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質）及び／又はその他のシグナル伝達分子の活性化状態及び／又は総量に対するチロシンキナーゼ阻害剤処理の効果を決定する。特定の実施形態では、適切なチロシンキナーゼ阻害剤は、患者について、ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態又はレベルを試料からの単離細胞において測定し、治療開始前に、単離細胞を少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤のような少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートし、ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態又はレベルを、インキュベートした細胞において測定し、治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態又はレベルに基づいて選択することに基づいて選択できる。
ＩＩ．定義
[0054]本明細書において、以下の用語は、特に断らない限り、それらの用語に割り当てられた意味を有する。
[0055]用語「癌」は、異所性細胞の制御不能な成長を特徴とするクラスの疾患の任意のメンバーを含む。この用語は、悪性、良性、軟部組織又は固形と特徴付けられるかに関わらないすべての既知の癌及び新生物状態、並びに転移前及び転移後癌を含むすべての段階及びグレードの癌を含む。異なる型の癌の非限定的な例は、血液学的悪性疾患（例えば、白血病、リンパ腫）；骨肉腫（例えばユーイング肉腫）；軟部組織肉腫（例えば、***性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、横紋筋肉腫）；その他の軟部組織悪性疾患、甲状腺乳頭癌；前立腺癌；胃癌（例えば胃）；乳癌；肺癌（例えば非小細胞肺癌）；消化管及び胃腸の癌（例えば、結腸直腸癌、胃腸間質性腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌）；食道癌；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；絨毛癌；及び頭頚部癌を含む。本明細書において、「腫瘍」は少なくとも１種の癌性細胞を含む。
[0056]「血液学的悪性疾患」は、血液、骨髄及び／又はリンパ節に影響する任意の型の癌を含む。血液学的悪性疾患の例は、これらに限定されないが、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む。異なる種類の白血病の非限定的な例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び大顆粒リンパ球性白血病を含む。ＣＭＬのサブタイプは、例えば慢性単球性白血病を含む。ＡＬＬのサブタイプは、例えば前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、プロＢ細胞急性リンパ性白血病、前駆Ｔ細胞急性リンパ性白血病及び急性混合性白血病を含む。ＣＬＬのサブタイプは、例えばＢ細胞前リンパ球性白血病を含む。ＡＭＬのサブタイプは、例えば急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病を含む。異なる種類のリンパ腫の例は、これらに限定されないが、例えば小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ−ＰＬＬ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫としても知られる）及びその他のＮＫ細胞又はＴ細胞リンパ腫のようなホジキンリンパ腫（４つのサブタイプ）及び非ホジキンリンパ腫を含む。
[0057]用語「分析物」は、任意の関心対象の分子、典型的には、その存在、量及び／又は特性が決定されるポリペプチドのような巨大分子を含む。いくつかの場合には、分析物は、癌性細胞の細胞構成要素、好ましくは発癌融合タンパク質又はシグナル伝達分子である。
[0058]用語「変換する」は、本明細書で定義される分析物を抽出又は分析物を変化若しくは改変するための、分析物又は試料の物理的及び／又は化学的変化を含む。本明細書において、分析物のレベル又は濃度又は活性化状態を測定するための分析物又は試料の抽出、操作、化学沈殿、ＥＬＩＳＡ、複合体形成、免疫抽出、物理的若しくは化学的改変はすべて変換を構成する。言い換えると、分析物又は試料が変換ステップの前後で同一でない限り、変化又は改変は変換である。
[0059]本明細書において、用語「希釈系列」は、具体的な試料（例えば細胞ライセート）又は試薬（例えば抗体）の一連の降順の濃度を含むことを意図する。希釈系列は、典型的には、試料又は試薬の計量された開始濃度を希釈剤（例えば希釈緩衝液）と混合して、より低い濃度の試料又は試薬を創出するプロセス、及びこのプロセスを所望の数の系列希釈が得られるまで十分な回数反復することによって作製される。試料又は試薬は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００又は１０００倍に系列希釈して、試料又は試薬の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の降順の濃度を含む希釈系列を作製できる。例えば、１ｍｇ／ｍｌの開始濃度で捕捉抗体試薬の２倍の系列希釈を含む希釈系列は、ある量の開始濃度の捕捉抗体を等量の希釈緩衝液と混合して０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の捕捉抗体を得、このプロセスを反復して、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０３２５ｍｇ／ｍｌ等の捕捉抗体濃度を得ることによって作製できる。
[0060]用語「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、別々のタンパク質を元来コードする２つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質を含む。このような遺伝子融合体は、典型的には、ある遺伝子の末端エキソンを染色体転座が第２の遺伝子からのインタクトなエキソンで置き換える場合に生じる。このことにより、転写、スプライシング及び翻訳されて機能的融合タンパク質を生成できる単一遺伝子が創出される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、発癌融合タンパク質、すなわち発癌に関与する融合タンパク質である。発癌融合タンパク質の例は、これらに限定されないが、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＤＥＫ−ＣＡＮ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＲＡＲα−ＰＭＬ、ＩＲＥＬ−ＵＲＧ、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１、ＡＭＬ１−ＭＴＧ８、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＬＹＴ−１０−Ｃα１、ＨＲＸ−ＥＮＬ、ＨＲＸ−ＡＦ４、ＮＰＭ−ＡＬＫ、ＩＧＨ−ＭＹＣ、ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ、ＴＥＬ−ＴＲＫＣ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＴＣＲ−ＲＢＴＮ２、ＣＯＬ１Ａ１−ＰＤＧＦ、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ−ＰＴＣ、ＴＭＲＳＳ−ＥＲＧ及びＴＰＲ−ＭＥＴを含む。
[0061]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達物質」は、細胞が細胞外シグナル又は刺激を応答（典型的には、細胞内部の規則正しい一連の生化学的反応を伴う。）に転換するプロセスを行うタンパク質又はその他の分子を含む。シグナル伝達分子の例は、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ−１／ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ−４、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ Ａ〜Ｃ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、ＲＴＫ１０６のような受容体チロシンキナーゼ、及びｐ９５ＥｒｂＢ２のような受容体チロシンキナーゼの切断型；Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ及びＬＩＭＫのような非受容体チロシンキナーゼ；Ａｋｔ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ７０ Ｓ６キナーゼ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＤＫ、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＰＴＥＮ、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７及びパキシリンのようなチロシンキナーゼシグナル伝達カスケード要素；エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラロコルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体及びオーファン受容体のような核ホルモン受容体；核受容体活性化補助因子及びリプレッサー；及びそれらの組み合わせを含む。
[0062]用語「試料」は、本明細書において、患者から得られる任意の生物学的検体を含む。試料は、限定することなく、全血、血漿、血清、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、便（すなわち糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、穿刺吸引液（例えば、無作為乳輪周縁（ｐｅｒｉａｒｅｏｌａｒ）穿刺吸引により採取される）、任意のその他の体液、腫瘍（例えば針生検）又はリンパ節（例えばセンチネルリンパ節生検）の生検のような組織試料（例えば腫瘍組織）、及びそれらの細胞抽出物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、全血又はその分画成分（例えば、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば末梢血単核細胞）及び／又は数少ない循環細胞）である。特定の実施形態では、試料は、当技術分野で知られる任意の技術を用いて固形腫瘍の白血球又は循環細胞を全血又は全血の細胞画分から単離することにより得られる。他の実施形態では、試料は、例えば固形腫瘍からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
[0063]本明細書において、用語「循環細胞」は、固形腫瘍から転移又は微小転移した腫瘍外細胞を含む。循環細胞の例は、これらに限定されないが、循環腫瘍細胞、癌幹細胞及び／又は腫瘍に向けて遊走する細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環血管新生促進性骨髄系細胞、循環樹状細胞）を含む。
[0064]「生検」は、診断又は予後評価のために組織試料を取り出すプロセス及び組織検体自体のことをいう。当技術分野で知られる任意の生検技術を本発明の方法及び組成物に対して用いることができる。用いられる生検技術は、他の因子のなかでも、評価される組織の型並びに腫瘍のサイズ及び型（例えば、固形又は懸濁（すなわち血液又は腹水））に一般的に依存する。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、穿刺吸引生検）、外科的生検及び骨髄生検を含む。生検技術は、例えばＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編、第１６版、２００５、第７０章及び第Ｖ部全体で説明されている。当業者は、生検技術を行って、与えられた組織試料における癌性及び／又は前癌性細胞を同定できることを認識している。
[0065]用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、典型的にはヒトが挙げられるが、その他の動物（例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ）であってもよい。
[0066]「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、例えばガラス（例えばスライドガラス）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ）、紙、メンブレン（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））、繊維束又は任意のその他の適切な基材のような固体支持体上に固定化又は保持された捕捉抗体の個別のセット及び／又は希釈系列を含む。捕捉抗体は、一般的に、共有又は非共有の相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合）により固体支持体上に固定化又は保持される。いくつかの場合には、捕捉抗体は、固体支持体に結合した捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本発明のアッセイで用いるアレイは、典型的には、複数の異なる捕捉抗体及び／又は捕捉抗体濃度を含み、該抗体及び／又は濃度は、異なる既知の／アドレス可能な場所で固体支持体の表面に共役している。
[0067]用語「捕捉抗体」は、試料（例えば、白血球又は数少ない循環細胞の細胞抽出物）における少なくとも１種の関心対象の分析物に特異的な（すなわち、該分析物と結合するか、該分析物により結合されるか、又は該分析物と複合体形成する）固定化抗体を含むことを意図する。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、アレイにおいて固体支持体上に保持される。任意の種々の発癌融合タンパク質又はシグナル伝達分子を固体支持体上に固定化するために適切な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。
[0068]用語「検出抗体」は、本明細書において、試料における少なくとも１種の関心対象の分析物に特異的な（すなわち、該分析物と結合するか、該分析物により結合されるか、又は該分析物と複合体形成する）検出可能標識を含む抗体を含む。この用語は、少なくとも１種の関心対象の分析物に特異的な抗体であって、該抗体が、検出可能標識を含む別の種により結合され得る抗体も包含する。検出可能標識の例は、これらに限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）標識、化学反応性標識、蛍光標識、酵素標識、放射活性標識及びそれらの組み合わせを含む。任意の種々の発癌融合タンパク質又はシグナル伝達分子の活性化状態及び／又は総量を検出するための適切な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。非限定的な例として、種々のリン酸化型シグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｋｔ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ、ＭＥＫ）に対するリン酸化部位特異的抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
[0069]用語「活性化状態依存性抗体」は、試料における少なくとも１種の関心対象の分析物の特定の活性化状態に特異的な（すなわち、該分析物と結合するか、該分析物により結合されるか、又は該分析物と複合体形成する）検出抗体を含む。好ましい実施形態では、活性化状態依存性抗体は、少なくとも１種の分析物（例えば、少なくとも１種の発癌融合タンパク質又はシグナル伝達分子）のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体形成状態を検出する。いくつかの実施形態では、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質のＡＢＬキナーゼドメインのリン酸化は、活性化状態依存性抗体を用いて検出する。他の実施形態では、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー同士のヘテロ２量体複合体の形成は、活性化状態依存性抗体を用いて検出する。
[0070]活性化状態依存性抗体を用いる検出に適切な発癌融合タンパク質の活性化状態の非限定的な例は、リン酸化型のＢＣＲ−ＡＢＬ、ＤＥＫ−ＣＡＮ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＲＡＲα−ＰＭＬ、ＩＲＥＬ−ＵＲＧ、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１、ＡＭＬ１−ＭＴＧ８、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＬＹＴ−１０−Ｃα１、ＨＲＸ−ＥＮＬ、ＨＲＸ−ＡＦ４、ＮＰＭ−ＡＬＫ、ＩＧＨ−ＭＹＣ、ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ、ＴＥＬ−ＴＲＫＣ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＴＣＲ−ＲＢＴＮ２、ＣＯＬ１Ａ１−ＰＤＧＦ、Ｅ２Ａ−ＨＬＦ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ−ＰＴＣ、ＴＭＲＳＳ−ＥＲＧ及びＴＰＲ−ＭＥＴを含む。活性化状態依存性抗体を用いる検出に適切なシグナル伝達分子の活性化状態（括弧内に列挙する）の例は、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ９５：切断型（Ｔｒ）−ＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５：Ｔｒ−ｐ−ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−Ｍｅｔ（ｐ−ｃ−Ｍｅｔ又はｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ複合体）、ＥＲ（ｐ−ＥＲ（Ｓ１１８、Ｓ１６７）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＫＩＴ（ｐ−ＫＩＴ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲＩ（ｐ−ＨＧＦＲＩ）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲａ（ｐ−ＰＤＧＦＲａ）；ＰＤＧＦＲＰ（ｐ−ＰＤＧＦＲＰ）；ＶＥＧＦＲＩ（ｐ−ＶＥＧＦＲＩ、ＶＥＧＦＲＩ：ＰＬＣｇ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣｙ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン表面、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；Ｔｉｅ１（ｐ−Ｔｉｅ１）；Ｔｉｅ２（ｐ−Ｔｉｅ２）；ＥｐｈＡ（ｐ−ＥｐｈＡ）；ＥｐｈＢ（ｐ−ＥｐｈＢ）；ＮＦＫＢ及び／又はＩＫＢ（ｐ−ＩＫ（Ｓ３２）、ｐ−ＮＦＫＢ（Ｓ５３６）、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢａ）；Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ（Ｔ３０８、Ｓ４７３））；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｂａｄ（ｐ−Ｂａｄ（Ｓ１１２、Ｓ１３６）、Ｂａｄ：１４−３−３）；ｍＴｏｒ（ｐ−ｍＴｏｒ（Ｓ２４４８））；ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ２２９、Ｔ３８９））；Ｍｅｋ（ｐ−Ｍｅｋ（Ｓ２１７、Ｓ２２１））；Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ（Ｔ２０２、Ｙ２０４））；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１（Ｔ３５７、Ｓ３６３））；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ（Ｔ１８３、Ｙ１８５））；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８（Ｔ１８０、Ｙ１８２））；Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ−３（Ｙ７０５、Ｓ７２７））；Ｆａｋ（ｐ−Ｆａｋ（Ｙ５７６））；Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ（Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ７８０））；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３（Ｓ３９２、Ｓ２０））；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３））；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓ６３））；ｃＳｒｃ（ｐ−ｃＳｒｃ（Ｙ４１６））；及びパキシリン（ｐ−パキシリン（Ｙ１１８））を含む。
[0071]用語「活性化状態非依存性抗体」は、試料における少なくとも１種の関心対象の分析物に、それらの活性化状態と関係なく特異的な（すなわち、該分析物と結合するか、該分析物により結合されるか、又は該分析物と複合体形成する）検出抗体を含む。例えば、活性化状態非依存性抗体は、リン酸化型及び非リン酸化型の少なくとも１種の発癌融合タンパク質又はシグナル伝達分子のような少なくとも１種の分析物を検出できる。
[0072]用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡのような１本鎖又は２本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを含む。核酸は、合成、自然に存在する及び自然に存在しない、そして参照核酸と同様の結合特性を有する既知のヌクレオチド類似体又は修飾主鎖残基若しくは結合を含有する核酸を含む。このような類似体の例は、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイト、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する自然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。そうでないと示さない限り、特定の核酸配列は、明示的に示す配列とともに、従来の様式で改変されたそのバリアント及び相補配列も暗黙的に包含する。
[0073]用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体及び／又は非受容体チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する任意の種々の治療剤又は薬物を含む。いずれの特定の理論と結び付けられることなく、チロシンキナーゼ阻害剤は、一般的に、酵素のＡＴＰ結合部位に結合することにより標的チロシンキナーゼを阻害する。チロシンキナーゼ阻害剤の例は、これらに限定されないが、イマチニブ（グリベック（登録商標）；ＳＴＩ５７１）、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標）；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、それらの誘導体、それらの類似体及びそれらの組み合わせを含む。本発明で用いるために適切なさらなるチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば米国特許第５，６１８，８２９号、米国特許第５，６３９，７５７号、米国特許第５，７２８，８６８号、米国特許第５，８０４，３９６号、米国特許第６，１００，２５４号、米国特許第６，１２７，３７４号、米国特許第６，２４５，７５９号、米国特許第６，３０６，８７４号、米国特許第６，３１３，１３８号、米国特許第６，３１６，４４４号、米国特許第６，３２９，３８０号、米国特許第６，３４４，４５９号、米国特許第６，４２０，３８２号、米国特許第６，４７９，５１２号、米国特許第６，４９８，１６５号、米国特許第６，５４４，９８８号、米国特許第６，５６２，８１８号、米国特許第６，５８６，４２３号、米国特許第６，５８６，４２４号、米国特許第６，７４０，６６５号、米国特許第６，７９４，３９３号、米国特許第６，８７５，７６７号、米国特許第６，９２７，２９３号及び米国特許第６，９５８，３４０号に記載されている。当業者は、本発明で用いるために適切なその他のチロシンキナーゼ阻害剤を知っている。いくつかの場合には、チロシンキナーゼ阻害剤は、限定することなく、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム又は亜鉛塩のようなアルカリ又はアルカリ土類金属塩；第３級アミン又は第４級アンモニウム塩のようなアンモニウム塩；及びコハク酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、二塩酸塩、サリチル酸塩、ヘミコハク酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、カルバミン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ピルビン酸塩、オキサロ酢酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩又は安息香酸塩のような酸性塩を含む薬学的に許容される形で投与される。
[0074]用語「インキュベートする」は、「接触する」及び「曝露する」と同義に用いられ、そうでないと示さない限り、いずれの具体的な時間又は温度要件も意味しない。
[0075]用語「治療方針」は、血液学的悪性疾患（例えば、白血病、リンパ腫）のような癌に付随する１又は複数の症状を緩和又は予防するために取られる任意の治療アプローチを含む。この用語は、癌の個体の健康を改善するのに有用な任意の化合物、薬物、手順及び／又は計画を施用することを包含し、本明細書に記載の任意の治療剤を含む。当業者は、治療方針又は現在の治療方針の用量を、本発明の方法を用いて決定した少なくとも１種の発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルに基づいて変更（例えば増加又は減少）できることを認識している。
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0076]本発明は、有利なことに、抗癌剤［例えばチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）］のような治療剤の細胞内濃度を変化させることなく、血液細胞のサブセット（例えば、白血球（例えば正常及び／又は悪性白血球）、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を血液試料から濾過により単離又は回収するための新規な装置及び方法を提供する。技術常識に反して、本発明の装置及び方法は、抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）のような治療剤の実質的な希釈なしで、白血球、白血病細胞、泡沫細胞及び／又は循環腫瘍細胞のような回収された細胞からの細胞ライセートを提供する。
[0077]いくつかの場合には、本発明は、固形腫瘍のホモジネート、ライセート又は細胞抽出物から腫瘍細胞を単離するための装置及び方法を提供する。
[0078]特定の実施形態では、本発明の装置及び方法は、関心対象の分析物のような標的タンパク質を分解又は脱リン酸化できるプロテアーゼ及びホスファターゼを含有する血漿を実質的に除去し、標的タンパク質アッセイに影響し得る干渉タンパク質も実質的に除去する。
[0079]図１は、腫瘍細胞を単離及び採取するための本発明の方法の一実施形態を表す。当業者は、本発明の範囲内の方法のその他の変更及び改変を認識している。
[0080]一つの方法１００において、患者（例えば、ＣＭＬに罹患している（任意選択で治療されている）患者）からの腫瘍細胞を単離及び採取する。図１に示すように、全血を収集し（１１０）、濾過して赤血球を除去する。いくつかの場合には、患者からの全血は、単離前に抗癌剤（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤）での処理をしてもしなくてもよい。有利なことに、本発明における方法は、細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで存在する阻害剤又は治療剤の量及び濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで確実に維持する。いくつかの態様では、本発明は、治療剤（例えば抗癌剤）の実質的な希釈なしで又は本質的に治療剤の希釈なしで、白血球のライセートを全血試料から調製する方法を提供する。収集された全血は本明細書に記載の装置に装填する。いくつかの態様では、血液は白血球の単離前に新たに採血する。新しい血液試料が入手可能でないならば、血液試料は、採血後、例えば、３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、３６時間、４８時間内に処理できる。試料は、典型的には処理前に室温で保存される。いくつかの態様では、プロテアーゼ及び／又はホスファターゼ阻害剤を血液試料に加えることができる（１１０）。その後、血液を、例えばチューブ又はバイアル内で穏やかに上下に逆さまにすることにより混合する。
[0081]その後、赤血球を、典型的にはフィルター又はメンブレンを通して遠心処理により除去する（１２１）。いくつかの態様では、特別に設計された濾過装置が、本明細書で示すようにして用いられる。好ましくは、赤血球は、遠心処理後に収集チューブ中に存在する。一態様では、方法は、バイアル又はチューブ装置を遠心処理して、白血球をフィルターメンブレンの積層収集体（１又は複数のフィルター）のようなフィルターメンブレン上に捕捉又は単離して（１４２）、赤血球（及び血漿）を収集チューブ中に分離するステップを含む。
[0082]赤血球（及び血漿）の濾過又は遠心処理の後、溶解緩衝液を用いて、捕捉された白血球を溶解する（１６７）。一態様では、タンパク質後期溶解緩衝液を用いることができる。捕捉後に、白血球をその後に溶解するが、捕捉後の洗浄ステップを行わずに白血球のライセートを調製する。全血細胞中の治療剤濃度は、手順１００の前後で同じである。いくつかの場合には、治療剤濃度は、手順１００の前に１０μＭであり、手順１００の後に１０μＭである。他の場合には、治療剤濃度は、手順１００の前に１μＭであり、手順１００の後に１μＭである。さらに別の場合には、治療剤濃度は、手順１００の前に０．１μＭであり、手順１００の後に０．１μＭである。ライセートを、次いで、第２収集チューブ中に、例えば遠心処理により収集する（１７３）。白血球からのライセートは、治療剤（例えば抗癌剤）の実質的な希釈がないか、又は本質的に治療剤の希釈がない。つまり、治療剤（例えば抗癌剤）のｉｎ ｖｉｖｏ細胞内濃度は、細胞ライセート中の治療剤（例えば抗癌剤）のｉｎ ｖｉｔｒｏ濃度と本質的又は実質的に同じである。
[0083]他の態様において、本発明は、
治療剤（例えば抗癌剤）の実質的な希釈なしで白血球（例えば正常、悪性及び／又は疾病白血球）のライセートを全血試料から調製する方法であって、
（ａ）全血試料を細胞単離（濾過）装置（例えば、本明細書に記載の装置）に装填するステップと、
（ｂ）装置を遠心処理して、白血球を１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉して、赤血球（及び血漿）を収集チューブ中に分離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に洗浄ステップを行わずに、１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉された白血球を溶解緩衝液で溶解し、それにより白血球のライセートを得るステップと、
を含む方法を提供する。
[0084]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、収集チューブを第２収集チューブに置き換えるステップをステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間にさらに含む。いくつかの他の実施形態では、本発明の方法は、ステップ（ｃ）で白血球を溶解した後に、第２収集チューブを含む装置を遠心処理するステップと、白血球のライセートを第２収集チューブ中に収集するステップと、をさらに含む。
[0085]いくつかの実施形態では、全血試料は、治療剤（例えば抗癌剤）を受けている対象から得られる。他の実施形態では、全血試料は、装置に装填する前に治療剤（例えば抗癌剤）とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。
[0086]さらなる実施形態では、全血試料は、アテローム動脈硬化症を有するか又はその疑いがあるか或いはアテローム動脈硬化症のための治療（例えばスタチン治療）を受けている対象から得られる。他の実施形態では、全血試料は、血液学的悪性疾患（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のような白血病）のような癌を有するか又はその疑いがあるか或いは癌のための治療（例えば抗癌剤治療）を受けている対象から得られる。
[0087]特定の実施形態では、少なくとも１つの発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルは白血球のライセートにおいて測定される。好ましい実施形態では、少なくとも１つの発癌融合タンパク質はＢＣＲ−ＡＢＬである。関心対象の発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達分子のさらなる例は本明細書に記載する。
[0088]すなわち、一態様において、本発明は、
全血試料において白血球（例えば正常、悪性及び／又は疾病白血球）を赤血球（及び血漿）から単離及び分離するための装置であって、
上部チャンバー、下部チャンバー、及び上部チャンバーと下部チャンバーとの間の１又は複数の積層フィルターメンブレンを含む濾過デバイスであって、１又は複数の積層フィルターメンブレンが白血球を保持できる濾過デバイスと、
全血試料から赤血球（及び血漿）を収集するための収集チューブと、
を含み、
濾過デバイスは収集チューブの上に置かれ、赤血球（及び血漿）は白血球から分離され、遠心処理後に収集チューブ中に収集される、装置
を提供する。
[0089]いくつかの実施形態では、全血試料は濾過デバイスの上部チャンバーに装填される。他の実施形態では、濾過デバイスは２、３又は４の積層フィルターメンブレンを含む。いくつかの実施形態では、上部チャンバーは、それに取り付けられたスナップキャップ（ｓｎａｐ−ｃａｐ）の蓋をさらに含む。
[0090]さらなる実施形態では、装置は第２収集チューブをさらに含み、赤血球（及び血漿）を含有する（第１）収集チューブは（第１）遠心処理後に第２収集チューブで置き換えられる。いくつかの場合には、白血球のライセートは、上部チャンバーへの溶解緩衝液の添加及び（第２）遠心処理の後に第２収集チューブ中に収集される。特定の場合には、溶解緩衝液は、１又は複数の積層フィルターメンブレンを洗浄せずに上部チャンバーに加えられる。いくつかの実施形態では、溶解緩衝液は、フィルター上で少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０分間、好ましくは約１５〜約３０分間、４℃（又は氷上）でインキュベートした後に、遠心処理して第２収集チューブ中に収集される。
[0091]代替の実施形態では、装置は第２収集チューブをさらに含み、１又は複数の積層フィルターメンブレンは遠心処理後に（例えばピンセットを用いて）濾過デバイスから取り出され、第２収集チューブに入れられる。いくつかの場合には、第２収集チューブは、溶解緩衝液を含有し、白血球は、１又は複数の積層フィルターメンブレンを第２収集チューブに入れるか又は第２収集チューブ中でインキュベートした後に溶解される。
[0092]いくつかの場合には、本発明の装置を用いて調製したライセートは、顆粒球（多形核白血球）（例えば、好中球、好塩基球、好酸球）；無顆粒白血球（単核白血球）（例えば、リンパ球及び単球のような末梢血単核細胞）；白血病細胞（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞）；マクロファージ（例えば泡沫細胞）；及びそれらの混合物のような正常及び／又は悪性（例えば癌性）白血球の細胞抽出物を含む。
[0093]いくつかの実施形態では、全血試料に存在する白血球、白血病細胞、泡沫細胞、循環細胞又はその他の細胞は、関心対象の少なくとも１種の治療剤（例えば少なくとも１種の抗癌剤）とのインキュベーションの前、途中及び／又は後に、少なくとも１種の増殖因子を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激できる。刺激増殖因子としては、これらに限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ＴＧＦ−α、ＰＩＧＦ、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＮＲＧ１、ＰＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、サイトカインが挙げられる。全血で見出される細胞の刺激及び溶解のためのプロトコールは、国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレット（これは、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載されている。
[0094]いくつかの実施形態では、全血試料は、癌を有するか又は有する疑いがある対象から得られる。いくつかの場合には、癌は、癌細胞における染色体転座による発癌融合タンパク質の形成により引き起こされることがある。このような癌の非限定的な例は、血液学的悪性疾患、骨肉腫、軟部組織肉腫及びそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、血液学的悪性疾患は、白血病又はリンパ腫である。一つの好ましい実施形態では、白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。他の場合には、対象は、抗癌剤治療を受けているか又は受けていない。
[0095]いくつかの他の実施形態では、抗癌剤は、モノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤のようなシグナル伝達阻害剤（すなわち細胞***阻害剤）；増殖阻害剤；化学療法剤（すなわち細胞傷害性薬物）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞のような異所性細胞の制御不能な増殖を低減又は抑止する能力を有する任意のその他の化合物を含む。いくつかの実施形態では、単離細胞は、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせた少なくとも１種のシグナル伝達阻害剤、増殖阻害剤及び／又はホルモン療法剤で処理される。
[0096]シグナル伝達阻害剤の例は、限定することなく、トラツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））、アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））、ペニツムマブ（ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））及びトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））のようなモノクローナル抗体；メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びバンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）のようなチロシンキナーゼ阻害剤；及びそれらの組み合わせを含む。
[0097]例示的な増殖阻害剤は、シロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）及びエベロリムス（ＲＡＤ００１）のようなｍＴＯＲ阻害剤；１Ｌ６−ヒドロキシメチル−キロ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２錯体）、ＡＰＩ−２、癌原遺伝子ＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５マーペプチド（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：５３４０７〜５３４１８頁（２００４）、ＫＰ３７２−１、及びＫｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５：１１４４〜１１４５頁（２００３）及びＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、４：４６３〜４７６頁（２００３）に記載の化合物のようなＡｋｔ阻害剤；及びそれらの組み合わせを含む。
[0098]化学療法剤の非限定的な例は、白金ベースの薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレア）、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ラルチトレキセド）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標）））、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシド）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン）、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらの類似体及びそれらの組み合わせを含む。
[0099]ホルモン療法剤の例は、限定することなく、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））、レトロゾール（フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））、ボロゾール、エキセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、ホルメスタン（レンタロン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）（登録商標）））、選択的エストロゲン受容体調節物質（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン）、ステロイド（例えばデキサメタゾン）、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）（例えば、フィナステリド、ゴセレリン）、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを含む。
[0100]癌ワクチンの非限定的な例は、ＡＮＹＡＲＡ（Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＤＣＶａｘ−ＬＢ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＥＰ−２１０１（ＩＤＭ Ｐｈａｒｍａ）、ＧＶ１００１（Ｐｈａｒｍｅｘａ）、ＩＯ−２０５５（Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＧＮ２２５（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）及びＳｔｉｍｕｖａｘ（Ｂｉｏｍｉｒａ／Ｍｅｒｃｋ）を含む。
[0101]放射線療法剤の例は、これらに限定されないが、腫瘍抗原を指向する抗体と任意選択でコンジュゲートした４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉのような放射性核種を含む。
[0102]いくつかの他の実施形態では、全血試料は、アテローム動脈硬化症（動脈硬化性血管疾患又はＡＳＶＤとしても知られる）を有するか又は有する疑いがある対象から得られる。アテローム動脈硬化症は、典型的には動脈血管に影響する疾患であり、動脈壁における慢性炎症応答であり、泡沫細胞のようなマクロファージの蓄積が大部分の原因であり、機能的高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によりマクロファージから脂質及びコレステロールが適切に取り除かれることなく低密度リポタンパク質（コレステロール及びトリグリセリドを運ぶ血漿タンパク質）により促進される。アテローム動脈硬化症の治療のために適切な薬物の例は、限定することなく、アトロバスタチン（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ）及びトルバスト（Ｔｏｒｖａｓｔ））、フルバスタチン（レスコール（Ｌｅｓｃｏｌ））、ロバスタチン（メバコール（Ｍｅｖａｃｏｒ）、アルトコール（Ａｌｔｏｃｏｒ）、アルトプレブ（Ａｌｔｏｐｒｅｖ））、メバスタチン（コンパクチン（Ｃｏｍｐａｃｔｉｎ））、ピタバスタチン（リバロ（Ｌｉｖａｌｏ）、ピタバ（Ｐｉｔａｖａ））、プラバスタチン（プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、セレクチン（Ｓｅｌｅｋｔｉｎｅ）、リポスタット（Ｌｉｐｏｓｔａｔ））、ロスバスタチン（クレストール（Ｃｒｅｓｔｏｒ））、シンバスタチン（ゾコール（Ｚｏｃｏｒ）、リペックス（Ｌｉｐｅｘ））のようなスタチン、それらの組み合わせ、並びにエゼチミブとシンバスタチン（バイトリン（Ｖｙｔｏｒｉｎ））、ロバスタチンとナイアシン（アドビコール（Ａｄｖｉｃｏｒ））、アトロバスタチンとベシル酸アムロジピン（カデュエット（Ｃａｄｕｅｔ））、及びシンバスタチンとナイアシン（シムコール（Ｓｉｍｃｏｒ））のような組み合わせ調製物を含む。いくつかの場合には、対象は、アテローム動脈硬化症薬（例えばスタチン）での治療を受けているか又は受けていない。
[0103]他の実施形態では、全血試料は、少なくとも１種の抗癌剤のような少なくとも１種の治療剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に、白血球を単離する。特定の実施形態では、フィルターメンブレン上に保持又は捕捉される白血球は、正常白血球、悪性白血球又はそれらの組み合わせを含む。
[0104]特定の実施形態では、本発明の装置は、関心対象の細胞（例えば悪性白血球（例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞））を、細胞回収又は単離後にいずれの洗浄ステップもなく回収又は単離することによって、全血試料からライセート又は細胞抽出物を調製する。このようにして得られる細胞抽出物は、ＢＣＲ−ＡＢＬのような少なくとも１種の発癌融合タンパク質、それらの基質、それらの経路又はそれらの組み合わせの発現及び／又は活性化のレベルについて分析できる。いずれの特定の理論と結び付けられることなく、細胞単離後の洗浄ステップの必要性を排除することは、抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）のような治療剤の細胞内濃度を変化させることなく関心対象の細胞を血液から回収できるので、有利である。以下の実施例で示すように、いずれの洗浄ステップもなく本明細書に記載の装置を用いる細胞単離は、単離後に細胞を洗浄する当技術分野の慣例に反して、抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、グリベック（登録商標）、タシグナ（登録商標）、スプリセル（登録商標）））のような治療剤の細胞内での実質的な希釈なしで、回収された細胞からの細胞抽出物をもたらす。
[0105]特定の実施形態では、本発明の装置は、本明細書で示す装置と実質的に同様又は同一である。当業者は、例えば、装置に装填する試料の容量、装置をスピンするために用いる遠心機の型、装置の上部チャンバーに加える溶解緩衝液の容量のようなパラメータを考慮して、本明細書に記載の装置の１又は複数の要素の寸法を変動できることを認識している。
[0106]ここで図２Ａ〜Ｇに移って、これらの図で示すように、試料収集のための濾過デバイス又は装置がある。図２Ａは、雄のらせん状のうね又はねじ山２１０を有する円筒状チューブである、装置２０１の上部部分又はチャンバーである。キャップ２１５を有する上部部分は図２Ｂ〜Ｃに示す。この上部部分２０１は、試料がこぼれることを防ぐようにパチンと閉まるキャップ２１５を任意選択で有することができる。いくつかの実施形態では、スナップキャップ蓋２１５は、ストラップ２１７により上部部分に繋留され、試料及び／又は試薬を濾過デバイスに加えた後に上部チャンバーの開口部を確実に閉じるために用いることができる。本発明の装置の上部チャンバー２０１は、好ましくは、図２Ｄ〜Ｅに示すように下部反り部分又はチャンバー２２２に取り付けられている。上部部分のねじ山２１０は、下部部分又はチャンバー２２２の雌の溝２２１に確実に嵌る。好ましくは、上部及び下部チャンバーの内径は同様であり、液体が通過することを可能にする円筒状チューブを創出する。
[0107]いくつかの態様では、濾過デバイス又は装置の下部チャンバー２２２は、内部ねじ山を一端２２１に有する円筒状チューブである（図２Ｅ）。いくつかの態様では、１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の積層フィルターメンブレンを、上部及び下部チャンバーが確実に一緒に取り付けられる前に、上部チャンバーのねじ山と下部チャンバーのねじ山の間に置く。フィルターは、図２Ｅに示すように下部チャンバーのピン歯車２２５上にある。
[0108]具体的な態様では、フィルターメンブレンは、Ｐａｌｌフィルター（例えばＬｅｕｋｏｓｏｒｂ Ｍｅｄｉｕｍ）のような２〜４（例えば、２、３又は４）層のフィルターであり得る。他の態様では、濾過デバイスは、キットにあるもののように、使用前に一緒に連結される別々のチャンバーとフィルターとの組立体である。濾過デバイスは、赤血球（及び血漿）を患者血液試料から分離するために図２Ｆ〜Ｇに示すように収集チューブ２５０の上に置くことができる。図２Ａ、図２Ｄ及び図２Ｆの部分を一緒に接合又は嵌めて、本発明の装置濾過デバイスの一実施形態を形成する。濾過デバイス（上部及び下部チャンバー）は、赤血球を患者血液試料から分離するために収集容器２５０の上に置くことができる。組み立てられた濾過デバイスの下部チャンバーは、開口部２５５を介して収集容器内に位置し、上部チャンバーは、収集容器の開口部の上にある。収集容器２５０の例は、これらに限定されないが、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、１４ｍｌ、１６ｍｌ等の容積を有するプラスチック培養チューブのようなチューブを含む。
[0109]いくつかの態様では、本発明の濾過デバイスの下部部分は、下部部分内に内蔵又は任意選択の漏斗を有する。図３Ａ〜Ｅに示すように、漏斗はいくらか角のある寸法を有して、試料が、下部部分の内壁を下に行くことなく下部チャンバーへ及び下部チャンバーを通って収集チューブへと確実に通過するようにできる。例えば、図３Ａは、水平面に対して約２°の内部漏斗３０１を示す。図３Ｂは、水平面に対しておよそ７°の内部漏斗３１０を示す。いくつかの他の態様では、図３Ｃは、水平面に対しておよそ１２°の漏斗を示す。図３Ｄ及び図３Ｅは、本発明の漏斗設計のさらに別の実施形態である。当業者は、漏斗設計が、ろ液が下部部分の壁から離れるような任意の角度であり得ることを理解している。適切な角度は、漏斗部分について１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°、１１°、１２°、１３°、１４°、１５°、１６°、１７°、１８°、１９°、２０°以上である。代替の実施形態では、図３Ｅは、本発明の濾過デバイスの下部部分内への漏斗挿入体３２５を示す。
[0110]いくつかの態様では、本発明の濾過デバイスは図４Ａ〜Ｄに示されるものである。図４Ａは、上部部分又はチャンバー４１０と、下部部分又はチャンバー４２０と、それらの間のフィルター積層体４１２と、の分解組立図を示す。図４Ａにおいて、図４０５はデバイスを見下ろし、図４２２はデバイスを見上げる。図４Ｂは、一緒にねじ止めされた上部部分４３０と下部チャンバー又は部分４２０とを示す。図４Ｂにおいて、図４０５はデバイスを見下ろし、図４２５はデバイスを見上げる。図４Ｃは収集チューブ４３５を示す。操作において、いくつかの態様では、収集チューブ４３５は好ましくは赤血球を保持する。図４Ｃにおいて、図４３４はデバイスを見下ろし、図４４０はデバイスを見上げる。図４Ｄは、上部チャンバー４１０及び下部チャンバー又は部分４２０と接合された収集チューブ４３５を描く。図４Ｄにおいて、図４０５はデバイスを見下ろし、図４６１はデバイスを見上げる。
[0111]いくつかの実施形態では、操作において、プロテアーゼ及び／又はホスファターゼ阻害剤を含む溶液混合物で処理したある容量（例えば１ｍｌ）の患者血液を、組み立てた細胞単離装置の上部チャンバーに装填する。装置は、アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）６Ｒ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ソーバルレジェンド（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ）遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はヘラエウスメガフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ）遠心機（Ｋｅｎｄｒｏ）のような卓上又は臨床用遠心機で遠心処理できる。いくつかの態様では、装置は、５〜３０分間、６００〜２，０００ｒｐｍ、４℃で遠心処理される。遠心処理後に、赤血球（及び血漿）を含有する収集容器を細胞単離装置から取り出し、蓋をして取っておく。
[0112]さらなる実施形態では、第２収集容器は濾過デバイスに取り付けられる。細胞ライセートのための第２収集チューブの非限定的な例は、１．５ｍｌ及び２ｍｌの微量遠心チューブを含む。洗浄ステップなしで、溶解緩衝液を濾過デバイスの上部チャンバーに加える。上部チャンバーに蓋をし、濾過デバイス及び第２収集チューブを激しく振とうする。いくつかの場合には、細胞単離装置を４℃で、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０分間、好ましくは約１５〜約３０分間インキュベートする。装置は、次いで、遠心処理できる（例えば、３，０００ｒｐｍ、５分間）。細胞ライセートを、−７０℃での貯蔵のために他の遠心容器（例えば微量遠心チューブ）に移すことができる。
[0113]図５Ａ〜Ｄは、本発明の試料収集のための濾過デバイス又は装置５００の代替の実施形態を示す。この実施形態では、上部部分５０１と、スリーブ又は中間接続部５２２を有する底部部分又はチャンバー５３０と、がある。中間接続部又はスリーブ５２２は、上部５０１又は底部部分５３０に任意選択で固定できる。図５Ｂに示すように、いくつかの態様では、上部部分はうね又は雄のうねを有し、スリーブ又は底部部分に固定できる。図５Ｂでは、装置をキャップ５１０とともに示す。図５Ｃは、底部部分５３０が、この部分を密閉したままにするためのキャップ５３４を任意選択で有し得ることを示す。図５Ｄは、雌の溝を明確に示す下部チャンバー又は部分５２２を描く。この部分は、スリーブがデバイスの底部部分に不可欠であるように底部部分に任意選択で固定できる。
[0114]図６Ａ〜Ｃは、本発明のさらに別の態様を示す。図６Ａは、本発明のデバイスの断面図であり、底部部分６１０が、接合を可能にするスリーブ６３３を有する上部部分６２５と接合されている。図６Ｂの図内挿入図は、ねじ山６２５と漏斗部を有する中間部６３３とが一緒に接合された部分の拡大図である。収集チャンバー６１０も示す。図６Ｃは、ピン歯車構造を有する中間部を示す。任意選択で、フィルター積層体はこのピン歯車上にある。
[0115]他のさらなる実施形態では、細胞単離装置を遠心処理し、赤血球を収集して収集チューブ中に取っておいた後に、濾過デバイスの上部チャンバー及び下部チャンバーを分ける（例えば、ねじを外す）。ピンセットを用いて、分離された白血球及び／又は循環腫瘍細胞を含有するフィルターメンブレン４２２（図４Ａ）を、細胞溶解緩衝液を含有する第２収集容器に入れる。第２収集容器の非限定的な例は、１．５ｍｌ及び２ｍｌの微量遠心チューブを含む。いくつかの場合には、第２収集容器を、４℃で、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０分間、好ましくは約１５〜約３０分間さらにインキュベートする。他の態様では、第２収集容器を氷上に置き、合計で３０分間、１０分ごとに１０秒間短くボルテックスする。いくつかの実施形態では、細胞ライセートを−７０℃で貯蔵する。他の実施形態では、ライセートを含有する容器を遠心処理して、フィルターメンブレン及び細胞断片を取り除く。細胞ライセートの上清を、−７０℃での貯蔵のために他のチューブに移すことができる。
[0116]いくつかの実施形態では、本発明の装置は、滅菌キットとして提供される。いくつかの場合には、滅菌キットは、上部チャンバー（任意選択でスナップキャップ蓋が取り付けられた）と下部チャンバーと１又は複数のフィルターメンブレン（例えば、１、２、３又は４層のフィルターメンブレン）の積層体とを含む濾過デバイス、及び１又は複数の収集チューブ（任意選択でスナップキャップ蓋を有する）を含む。各要素は、別々に包装でき、組み立てられたキット又は各要素は、滅菌包装に入れることができる。他の場合には、滅菌キットは、チューブフィルターユニットと１又は複数の収集チューブ（任意選択でスナップキャップ蓋を有する）とを含む。チューブフィルターユニットは、１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の複数）のフィルターメンブレンが一端に添えられた円筒状チューブを含み、メンブレンは全血試料からの健常及び悪性白血球及び／又は循環腫瘍細胞を保持できる。特定の場合には、フィルターメンブレンは、ＰＡＬＬフィルター（例えばＬｅｕｋｏｓｏｒｂ Ｍｅｄｉｕｍ）のような（例えば、２、３又は４）層のフィルターである。さらに別の場合には、滅菌キットは、チューブフィルターユニットとプラスチックアダプタと１又は複数の収集チューブ（任意選択でスナップキャップ蓋を有する）とを含む。アダプタは収集チューブの開口部に位置し、チューブフィルターユニットのフィルターメンブレンに確実に取り付けられている。
[0117]さらなる実施形態では、本発明の装置は、複数の濾過デバイス又はチューブフィルターユニットと、多重ウェル又は多重チューブ収集容器（例えば、２ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル又は９６ウェルプレート）と、を含む。いくつかの場合には、複数の濾過デバイスは、図４Ｄに描く少なくとも２つ以上のデバイスと実質的に同様であり得る。いくつかの他の実施形態では、濾過デバイスのアレイは９６ウェル細胞単離プレートのような多重ウェルプレートであり得る。例えば、第１の９６ウェル濾過プレートに、フィルターメンブレン（例えば、ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＡｃｒｏｐｒｅｐ（ＰＡＬＬ）又はＬｅｕｋｏｓｏｒｂ（ＰＡＬＬ））又はそれと実質的に同様のメンブレンを嵌めることができる。他の実施形態では、第１の９６ウェル濾過プレートは、これらに限定されないが、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ．＃ＭＡＭＩＣ８５１０及び＃ＭＳＢＣＳ１２１０のようなフィルターメンブレンが嵌められた商業的に入手可能な多重ウェルプレートであるか又はそれと実質的に同様である。いくつかの場合には、商業的に入手可能な多重ウェルプレートは、滅菌され、フィルターメンブレンが嵌められた第１多重ウェルプレートと、第１多重ウェルプレートの下に嵌り、収集容器として用いることができる第２多重ウェルプレートと、を含む。これらの実施形態では、新たに収集された血液を、第１の９６ウェル細胞単離プレートのウェルに装填できる。第１多重ウェルプレートは、上述の濾過デバイスの上部及び下部チャンバーの両方と類似する。第２の９６ウェルマイクロプレートは、血液収集プレート（これは、収集チューブと類似する）として働くことができ、第１多重ウェルプレート、すなわちフィルターメンブレンを有する細胞単離プレートの下に置くことができる。このプレート組立体は、室温で約５分間、約６００ｒｐｍ〜３，０００ｒｐｍ（例えば、約６００ｒｐｍ、１，０００ｒｐｍ、２，０００ｒｐｍ、３，０００ｒｐｍ）の速度で遠心処理できる。遠心処理の後、フィルターメンブレンを遠心チューブに移し、フィルターメンブレン上の細胞をある容量の溶解緩衝液（例えば、３００μｌの溶解緩衝液）で処理して、短くボルテックスし、細胞を溶解できる。細胞ライセートを含有する遠心チューブを氷上に約３０分間置いて、約１０分ごとに短くボルテックスに供することができる。その後、チューブを約１５分間遠心処理して、細胞破片を上清から分離できる。ライセートを含有する上清を、収集及び分析できる。いくつかの態様では、複数の濾過デバイスは、コンピュータ制御の下のロボット電機子で操作される。ハイスループット試料分析を行い、複数の試料を分析する。溶解緩衝液を添加して捕捉された白血球を溶解するステップ（１６７）のような手順１００のステップは、コンピュータで動くロボットシステムを用いて任意選択で行われる。いくつかの態様では、本明細書に記載の抗癌剤を用いる患者血液試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理及び試料分析はハイスループット様式で行われる。
ＩＶ．癌治療のための薬物選択及び最適化
[0118]いくつかの態様では、本発明は、血液学的悪性疾患の対象における癌治療の効力をモニターする方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、１又は複数の調節解除されたシグナル伝達経路を下方制御又は遮断するための適当な治療を選択するための方法を提供する。いくつかの他の態様では、本発明は、癌を有し、癌治療のための治療コースを受けている対象における治療を最適化及び／又は毒性を低減するための方法を提供する。よって、本発明を用いて、与えられた患者の癌又は腫瘍における活性化発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達タンパク質の収集により提供される特定の分子サインに基づいて、個別化治療の設計を容易にすることができる。
[0119]したがって、一態様において、本発明は、
対象における抗癌剤の効力をモニターする方法であって、
対象は、血液学的悪性疾患を有し、該方法は、
（ａ）抗癌剤を対象に投与するステップであって、抗癌剤の１回目の投与が時間Ｔ１に行われるステップと、
（ｂ）癌の細胞を、時間Ｔ２に対象からの試料において単離するステップと、
（ｃ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｄ）対象からの試料における時間Ｔ２での発癌融合タンパク質の活性化状態及び／又は発現レベルを測定するステップと、
治療方針を発癌融合タンパク質の活性化状態及び／又は発現レベルに基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0120]いくつかの実施形態では、方法は、発癌融合タンパク質の活性化状態を、抗癌剤の１回目の投与前のＴ０に測定するステップをさらに含む。いくつかの場合には、発癌融合タンパク質は、ＢＣＲ−ＡＢＬである。いくつかの場合には、血液学的悪性疾患は、リンパ腫、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のような白血病である。Ｔ１とＴ２の間の時間の差は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４週間のような約１週間〜約６ヶ月間である。Ｔ０とＴ１の間の時間の差は、約１日〜約３週間である。いくつかの他の態様では、方法は、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５、及びＳＲＣのような少なくとも１つの他のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルを測定するステップをさらに含む。
[0121]いくつかの態様では、治療方針は、抗癌剤用量を変更すること、抗癌剤を変更すること、さらなる抗癌剤を含めること、治療期間を変更すること、及び現在の治療方針を維持することから選択される。
[0122]いくつかの態様では、試料は、単離細胞の抽出物を含む。いくつかの態様では、単離細胞を、少なくとも１つの抗癌剤（例えば２つの抗癌剤）と、Ｔ０（治療開始前）にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。他の場合には、単離細胞を、少なくとも２つの抗癌剤と、治療方針を決定する前のＴ２にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。
[0123]さらに別の実施形態において、本発明は、
血液学的悪性疾患を有する対象における抗癌剤を選択する方法であって、
（ａ）癌の細胞を対象から単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）発癌融合タンパク質の活性化状態レベルを、対象からの試料からの単離細胞において測定するステップと、
（ｄ）治療開始前に、単離細胞を少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートするステップと、
（ｅ）治療開始前に、少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートした単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｆ）発癌融合タンパク質の活性化状態レベルを、インキュベートした細胞において測定するステップと、
（ｇ）治療方針を発癌融合タンパク質の活性化状態レベルに基づいて選択するステップと、
を含む方法を提供する。
[0124]他の実施形態において、本発明は、
血液学的悪性疾患を有する対象における抗癌剤を選択する方法であって、
（ａ）癌の細胞を対象から単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、対象からの試料からの単離細胞において測定するステップと、
（ｄ）治療開始前に、単離細胞を少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートするステップと、
（ｅ）治療開始前に、少なくとも１つの抗癌剤とともにインキュベートした単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｆ）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、インキュベートした細胞において測定するステップと、
（ｇ）治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルに基づいて選択するステップと、
を含む方法を提供する。
[0125]いくつかの態様では、治療方針は、抗癌剤を選択すること、抗癌剤用量を選択すること及び治療期間を決定することからなる群から選択される。いくつかの他の態様では、方法は、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのような少なくとも１つの他のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルを測定するステップをさらに含む。
[0126]他の態様において、本発明は、
癌を有し、癌治療のための治療コースを受けている対象における治療を最適化及び／又は毒性を低減するための方法であって、
（ａ）抗癌剤（例えば、グリベック（登録商標）、タシグナ（登録商標）、スプリセル（登録商標）のような少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤）の投与後に癌細胞を単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、本明細書に記載のアッセイを用いて測定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化の測定されたレベルを、治療期間中のより早い時点で測定された発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化のレベルと比較するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）からの比較に基づいて、対象についての治療方針のその後の用量、又は異なる治療方針を対象に施用すべきかどうかを決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0127]特定の実施形態では、全発癌融合タンパク質及び活性化（例えばリン酸化）発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）のレベルが、本発明の抗体に基づくアッセイに従って細胞抽出物において測定され、全発癌融合タンパク質レベルに対する活性化発癌融合タンパク質レベルの比（例えば、ホスホ／全ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質レベルの比）が算出できる。そして、これを用いて、対象についての治療方針を、例えば発癌融合タンパク質レベルのホスホ／全体の比を、より早い時点（例えば、抗癌剤治療期間中のより早い時点、又は抗癌剤治療前の時点）に対象者について算出した同様の比と比較することによって評価できる。
[0128]他の態様において、本発明は、
癌治療のための適切な抗癌剤を選択するための方法であって、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、本明細書に記載のアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較することによって、抗癌剤が、癌治療について適切又は不適切であるかを決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0129]好ましい実施形態では、癌治療のための適切な抗癌剤を選択するための方法は、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、発癌融合タンパク質に特異的な捕捉抗体の希釈系列を含み、捕捉抗体が固体支持体上に保持されるアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較するステップと、
（ｅ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化している（例えば実質的に減少している）場合に、抗癌剤が、癌治療に適切であると示すステップと、
を含む。
[0130]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば血液学的悪性疾患のような癌治療のための適切な抗癌剤の選択を助けるか又は支援するのに有用であり得る。他の実施形態では、本発明の方法は、癌（例えば血液学的悪性疾患）の治療のための適切な抗癌剤の選択を改善するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化していない（例えば実質的に減少していない）場合に、抗癌剤が癌治療に不適切であると示すステップをさらに又は代わりに含む。さらなる実施形態では、細胞抽出物中に存在する少なくとも１種のシグナル伝達分子が、少なくとも１種の発癌融合タンパク質に加えて検出され、抗癌剤は、この「分子プロファイル」に基づいて適切又は不適切であると決定される。
[0131]さらに別の態様において、本発明は、
抗癌剤での治療に対する癌の応答を同定するための方法であって、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、本明細書に記載のアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較することによって、癌が抗癌剤での治療に対して応答性又は非応答性であると同定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0132]好ましい実施形態では、抗癌剤での治療に対する癌の応答を同定するための方法は、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、発癌融合タンパク質に特異的な捕捉抗体の希釈系列を含み、捕捉抗体が固体支持体上に保持されるアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較するステップと、
（ｅ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化している（例えば実質的に減少している）場合に、癌が抗癌剤での治療に対して応答性であると示すステップと、
を含む。
[0133]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤での治療に対する癌（例えば血液学的悪性疾患）の応答の同定を助けるか又は支援するのに有用であり得る。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤での治療に対する癌（例えば血液学的悪性疾患）の応答の同定を改善するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化していない（例えば実質的に減少していない）場合に、癌が抗癌剤での治療に対して非応答性であると示すステップをさらに又は代わりに含む。さらなる実施形態では、細胞抽出物中に存在する少なくとも１種のシグナル伝達分子が少なくとも１種の発癌融合タンパク質に加えて検出され、癌は、この「分子プロファイル」に基づく治療に応答性又は非応答性であると同定される。
[0134]さらに別の態様において、本発明は、
抗癌剤での治療に対する癌を有する対象の応答を予測するための方法であって、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、本明細書に記載のアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較することによって、抗癌剤での治療に対して対象が応答する可能性を予測するステップと、
を含む方法を提供する。
[0135]好ましい実施形態では、抗癌剤での治療に対する癌を有する対象の応答を予測するための方法は、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、発癌融合タンパク質に特異的な捕捉抗体の希釈系列を含み、捕捉抗体が固体支持体上に保持されるアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較するステップと、
（ｅ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化している（例えば実質的に減少している）場合に、対象が抗癌剤での治療に対して応答する可能性があると示すステップと、
を含む。
[0136]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、癌（例えば血液学的悪性疾患）のための抗癌剤での治療に対する対象の応答の可能性の予測を助けるか又は支援するのに有用であり得る。他の実施形態では、本発明の方法は、癌（例えば血液学的悪性疾患）のための抗癌剤での治療に対する対象の応答の可能性の予測を改善するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化していない（例えば実質的に減少していない）場合に、対象が抗癌剤での治療に対して応答する可能性がないと示すステップをさらに又は代わりに含む。さらなる実施形態では、細胞抽出物中に存在する少なくとも１種のシグナル伝達分子が、少なくとも１種の発癌融合タンパク質に加えて検出され、対象者が治療に対して応答する可能性は、この「分子プロファイル」に基づいて予測される。
[0137]さらなる態様において、本発明は、
癌を有する対象が抗癌剤での治療に対して耐性であるかを決定するための方法であって、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、本明細書に記載のアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下又はより早い時間での抗癌剤の存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較することによって、対象が抗癌剤での治療に対して耐性又は感受性であるかを決定するステップと、
を含む方法を提供する。
[0138]好ましい実施形態では、癌を有する対象が抗癌剤での治療に対して耐性であるかを決定するための方法は、
（ａ）癌の細胞を、抗癌剤の投与の後又は抗癌剤とのインキュベーションの前に単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物における発癌融合タンパク質の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルを、発癌融合タンパク質に特異的な捕捉抗体の希釈系列を含み、捕捉抗体が固体支持体上に保持されるアッセイを用いて決定するステップと、
（ｄ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルを、抗癌剤の非存在下又はより早い時間での抗癌剤の存在下で作製した参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較するステップと、
（ｅ）発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化のレベルが、参照発現及び／又は活性化プロファイルと比較して変化していない（例えば実質的に減少していない）場合に、対象が抗癌剤での治療に対して耐性であると示すステップと、
を含む。
[0139]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤での治療に対して耐性である癌を有する対象の同定、又は癌を有する対象が抗癌剤での治療に対して耐性であるかの決定を助けるか又は支援するのに有用であり得る（ここで、対象は、例えば血液学的悪性疾患のような癌を有する）。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤での治療に対して耐性である癌を有する対象の同定、又は癌を有する対象が抗癌剤での治療に対して耐性であるかの決定を改善するのに有用であり得る（ここで、対象は、例えば血液学的悪性疾患のような癌を有する）。
[0140]いくつかの実施形態では、方法は、発癌融合タンパク質について検出された発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）のレベルが、参照発現又は活性化プロファイルと比較して変化している（例えば実質的に減少している）場合に、対象が抗癌剤での治療に対して感受性であると示すステップをさらに又は代わりに含む。癌を有する対象が抗癌剤での治療に対して耐性であり得ることの理由の非限定的な例は、関心対象の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）における１又は複数の変異の存在、治療計画を遵守しないこと、及び／又は最適以下の薬物用量の投与を含む。最適以下の薬物用量の抗癌剤に関して、方法は、対象に投与する抗癌剤の次の又はその後の用量を増加するステップをさらに含むことができる。さらなる実施形態では、細胞抽出物中に存在する１又は複数のシグナル伝達分子が、１又は複数の発癌融合タンパク質に加えて検出され、対象は、この「分子プロファイル」に基づいて治療に対して耐性又は感受性であると同定される。
Ｖ．発癌融合タンパク質
[0141]特定の実施形態では、少なくとも１種の発癌融合タンパク質の発現／活性化プロファイリング単独、又はその基質及び／又はその他のシグナル伝達経路タンパク質の発現／活性化プロファイリングとの組み合わせは、本発明の装置及び方法を用いて調製される細胞ライセートについて行って、例えば、それを必要とする患者（例えば、慢性骨髄性白血病のようなＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患の患者）についてのチロシンキナーゼ阻害剤治療の効力を決定できる。有利なことに、発癌融合タンパク質及びその他の分析物は、チロシンキナーゼ阻害剤の細胞内濃度を変化させることなく本発明の装置及び方法により調製された細胞ライセートにおいて調べられる。
[0142]いくつかの実施形態では、発癌融合タンパク質及びそれらの関連する新生物の形成を引き起こすヒト腫瘍における転座としては、これらに限定されないが、下記のものが挙げられる。
[0143]慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）：フィラデルフィア染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ（キナーゼ）をもたらす転座である。
[0144]急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）：キメラ発癌タンパク質としては例えば下表のものが挙げられる。
Figure 2014508295
[0145]バーキットリンパ腫：ｃ−ｍｙｃ遺伝子転座ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）。最も一般的なキメラ腫瘍性タンパク質はｃ−ｍｙｃ／ＩＧＨである。
[0146]ＡＭＬ：第８染色体の一部から第２１染色体への転座。得られるキメラ腫瘍性タンパク質はＲＵＮＸ１／ＥＴＯである。別の転座ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）はＴＥＬ／ＴｒｋＣ（キナーゼ）キメラ腫瘍性タンパク質をもたらす。
[0147]ユーイング肉腫：第１１染色体と第２２染色体の間の転座。得られるキメラ腫瘍性タンパク質はＥＷＳ／ＦＬＩ（転写因子）である。
[0148]ＤＦＳＰ：９５％を超えるＤＦＳＰ腫瘍は、染色体転座ｔ（１７；２２）を有し、これはキメラ腫瘍性タンパク質ＣＯＬ１Ａ１／ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦＲに結合し、ＰＤＧＦＲを活性化する）をもたらす。
[0149]急性前骨髄球性白血病：ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）と示される転座。得られるキメラ腫瘍性タンパク質はＲＡＲα／ＰＭＬ（転写複合体タンパク質）である。
[0150]プロＢ細胞急性リンパ性白血病：転座ｔ（１７；１９）、これはキメラ腫瘍性タンパク質Ｅ２Ａ／ＨＬＦ（アポトーシス阻害剤）をもたらす。
[0151]急性プレＢ細胞白血病：転座ｔ（１；１９）。キメラ腫瘍性タンパク質はＥ２Ａ／Ｐｂｘ１（キナーゼ基質）である。
[0152]横紋筋肉腫：ｔ（２：１３）（ｑ３５；ｑ１４）の転座。これはキメラ腫瘍性タンパク質ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ（転写因子）をもたらす。
[0153]非常に若年の小児の軟部組織悪性疾患：ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）再編成。これは次のキメラ腫瘍性タンパク質をもたらす：タンパク質チロシンキナーゼＥＴＶ６／ＮＴＲＫ３（キナーゼ）。
[0154]甲状腺乳頭癌：キメラ腫瘍性タンパク質はＲＥＴ／ＰＴＣ（キナーゼ）である。
[0155]前立腺癌：キメラ腫瘍性タンパク質はＴＭＲＳＳ／ＥＲＧ（キナーゼ）である。
[0156]発癌融合タンパク質及びそれらの関連する新生物の形成を引き起こすヒト腫瘍における転座のさらなる例を下表に示す。
Figure 2014508295
ＶＩ．実施例
[0157]以下の実施例は、特許請求の範囲に係る発明を（限定するためではなく）説明するために提供される。
実施例１ 例示的細胞単離装置：
[0158]本実施例は、濾過方法を用いて患者全血から白血球を分離するための例示的細胞単離装置について記載する。本発明の細胞単離装置の実施形態及び態様を、図２〜６に描く。
[0159]本発明の細胞単離装置は、赤血球を、全血に存在する他の細胞から分離するために用いられる。特に、白血球及び／又は循環腫瘍細胞が、全血に存在する著しい数の赤血球及び血漿から分離される。本発明の細胞単離装置は濾過デバイスと収集容器とを含む。濾過デバイスは、上部チャンバー、下部チャンバー、及び上部チャンバーと下部チャンバーとの間の１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の複数）の積層フィルターメンブレンを含む組立体である。上部及び下部チャンバーは、これらに限定されないが、ポリプロピレン及びポリスチレンのような材料から製造できる。いくつかの実施形態では、フィルターメンブレンは、８μｍのポアサイズと３５５．６〜５５８．８μｍの厚さとを有し、７０〜８０％の白血球保持収率を有する。フィルターメンブレンの非限定的な例は、白血球単離膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰＡＬＬ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＳＰ０６６９）を含む。
[0160]典型的には、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤で処理した１ｍｌの患者血液を細胞単離装置の上部チャンバーに装填する。ユニットを５〜３０分間、６００〜２０００ｒｐｍ（例えば８００ｒｐｍ）、４℃で、卓上遠心機（例えば、アレグラ６Ｒ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ソーバルレジェンド遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ヘラエウスメガフュージ遠心機（Ｋｅｎｄｒｏ））で遠心処理する。いくつかの場合には、赤血球を含有する第１収集容器を、細胞単離装置から取り出し、第２収集容器を取り付ける。洗浄ステップなしで、２００μｌ〜１ｍｌの溶解緩衝液を、濾過デバイスの上部チャンバーに加える。上部チャンバーに蓋をし、濾過デバイスと第２収集容器とを１５〜３０分間、４℃で激しく振とうする。濾過デバイス及び第２収集容器を遠心機に入れ、約３，０００ｒｐｍで約５分間スピンする。細胞ライセートは、−７０℃での貯蔵のために別の容器に移すことができる。
[0161]他の場合には、赤血球を含有する第１収集容器を細胞単離装置から取り出し、フィルターメンブレンを含有する濾過デバイスを取り外す。上部チャンバー及び下部チャンバーのねじを外してこれらを分離する。ピンセットを用いて、分離された白血球を含有するフィルターメンブレンを、溶解緩衝液を含有する第２収集容器に入れる。第２収集容器の非限定的な例は、１．５ｍｌ及び２ｍｌの微量遠心チューブを含む。いくつかの場合には、第２収集容器を、４℃で、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、６０又は１２０分間、好ましくは約１５〜約３０分間さらにインキュベートする。他の場合には、第２収集容器を氷上に置き、合計で３０分間、１０分ごとに１０秒間短くボルテックスする。いくつかの実施形態では、細胞ライセートを−７０℃で貯蔵する。他の実施形態では、ライセートを含有する容器を遠心処理して、フィルターメンブレン及び細胞断片を取り除く。細胞ライセートの上清を、−７０℃での貯蔵のために他のチューブに移す。
[0162]さらに別の実施形態では、細胞単離装置は、チューブフィルターユニットと収集容器とを含む（図２６）。チューブフィルターユニットは、１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の複数）のフィルターメンブレンが一端に添えられた円筒状チューブを含み、メンブレンは全血試料からの健常及び悪性白血球及び／又は循環腫瘍細胞を保持できる。特定の場合には、フィルターメンブレンはＰＡＬＬフィルター（例えばＬｅｕｋｏｓｏｒｂ Ｍｅｄｉｕｍ）のような複数（例えば、２、３又は４）層のフィルターである。いくつかの場合には、各フィルターは、８μｍのポアサイズ、３５５．６〜５５８．８μｍの厚さ及び７０〜８０％の白血球保持収率を有する。いくつかの場合には、チューブフィルターユニットをプラスチックアダプタにより収集容器に取り付ける。チューブフィルターユニットのフィルターメンブレンは、収集チューブの開口部に位置するアダプタに確実に取り付けられている。収集容器の例は、これらに限定されないが、３ｍｌ、５ｍｌ、８ｍｌ、１４ｍｌ及び１６ｍｌのプラスチック培養チューブを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤で処理した１ｍｌの患者全血を細胞単離装置のチューブフィルターユニットの頂部に装填する。装置を、５〜３０分間、６００〜２０００ｒｐｍ（例えば８００ｒｐｍ）、４℃で、卓上遠心機（例えば、アレグラ６Ｒ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ソーバルレジェンド遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ヘラエウスメガフュージ遠心機（Ｋｅｎｄｒｏ））で遠心処理する。いくつかの場合には、赤血球を含有する収集チューブを細胞単離装置から取り出し、新しい収集チューブを取り付ける。洗浄ステップなしで、２００μｌ〜１ｍｌの溶解緩衝液を、細胞単離装置のチューブフィルターユニットの開口部に加える。装置を密閉又は蓋をし、次いで、１５〜３０分間、４℃で激しく振とうする。細胞単離装置を、約３０００ｒｐｍで約５分間、卓上遠心機で遠心処理及びスピンする。次いで、細胞ライセートを、−７０℃での貯蔵のために収集容器から別の容器に移すことができる。
[0163]さらに別の実施形態では、本発明の細胞単離装置は、複数の濾過デバイス又はチューブフィルターユニットと、多重ウェル又は多重チューブ収集容器と、を含む。上記の濾過デバイス及びチューブフィルターユニットを多重フォーマットプレート（例えば、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル又は９６ウェルプレート）のウェルに取り付けることができる。
実施例２ 細胞単離装置を用いる濾過方法によるＣＭＬ患者血液からの腫瘍細胞単離プロトコール：
[0164]本実施例は、本発明の方法を用いて個別の患者全血においてＣＭＬ腫瘍細胞を単離及び採取するために用いたプロトコールを説明する。患者からの全血は、単離前にＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理をしてもしなくてもよい。
[0165]新たに採取した血液試料が腫瘍細胞の単離のために最良である。新しい試料を得ることができないならば、血液試料は採血後１〜３日以内に処理できる。ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ｃａｔ．ｎｏ．＃３６６６４３、ＥＤＴＡ（Ｋ２）滅菌チューブ）中に収集した試料は採血した日に処理のために送る。試料は処理前に室温に維持しなければならない。この時点で試料の冷蔵又は冷凍を回避することが重要である。
[0166]ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ＃３６６６４３）中で受領した血液試料はプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤で処理する。血液のチューブを、ゆっくりと４〜６回逆さまにすることにより穏やかに混合し、次いで、血液１ｍＬ当たり０．０５ｍＬのプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを加える。プロトコールのこの時点で、腫瘍細胞及び白血球は、「腫瘍細胞及び白血球の単離及び溶解」との表題の本実施例のセクションに進むことによって血液試料から単離できる。任意選択で、血液試料はそのセクションに進む前に薬物で処理できる。
患者血液試料の薬物処理：
[0167]ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤のような薬物をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈した後、血液試料に加える。１．０ｍＬの患者の血液試料を培養チューブに入れる。所望の濃度の薬物を患者の血液の各アリコートに加える。例えば、１０μＭ、１μＭ又は０．１μＭの薬物濃度に相当する１０μｌ、１μｌ又は０．１μｌをチューブに加える。別のチューブ中の１ミリリットル（１ｍｌ）の無処理血液を対照として用いることができる。次いで、チューブをＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４時間インキュベートする。その後、薬物で処理した試料は、試料の腫瘍細胞及び白血球を単離及び溶解するために、次のセクションの手順に従ってさらに処理できる。
腫瘍細胞及び白血球の単離及び溶解：
[0168]チューブをゆっくりと４〜６回逆さまにすることにより、濾過デバイスに加える血液試料を穏やかに混合する。１ｍｌのピペットを用いて、１ｍＬの血液試料を、収集チューブに収容される濾過デバイスの上部チャンバーに装填する。試料を装填した後、濾過デバイスをパチンと閉める。細胞単離装置をアレグラ６Ｒ遠心機に入れ、１５分間、１，０００ｒｐｍ、４℃で遠心処理する。遠心処理の後、細胞単離装置を遠心機から取り出す。赤血球を含有する第１収集チューブを濾過ユニットから取り出し、第２の清浄な収集チューブで置き換える。血液を含有する第１収集チューブに安全のために蓋をし、室温で後の使用のために保存する。
[0169]２００μＬの溶解緩衝液（氷上に維持）を、白血球を有するメンブレンを含有する濾過デバイスの上部チャンバーに加え、次いで、ユニットをパチンと閉める。細胞単離装置を、４℃に維持した振とう（回転）台に置く。振とう台は、細胞単離装置とともに、サイクル当たり２分間の振とうと次いで５分間の休止とを含む３サイクルを経る。次に、細胞単離装置を２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心処理する。第２収集チューブ中にある細胞ライセートを、ＢＣＲ−ＡＢＬアッセイ及びその他の経路マーカーアッセイのようなＣＥＥＲイムノアッセイにおいて用いるために、１ｍＬのピペットを用いて２ｍＬの遠心チューブに移す。任意選択で、細胞ライセートは−７０℃で貯蔵する。
実施例３ 抗癌剤を希釈しない濾過方法による全血からの白血球の単離及び採取：
[0170]本実施例は、濾過方法を用いて患者全血から白血球を単離及び溶解するためのプロトコールについて記載する。正常で健常な白血球に加えて、全血からの慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）腫瘍細胞のような悪性白血球を、薬物濃度を希釈することなく、そして混入赤血球の量に干渉することなく単離できる。いくつかの実施形態では、患者からの全血は、単離前に、少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理をしてもしなくてもよい。慢性骨髄性白血病は白血球の癌である。これは、骨髄における主に骨髄系細胞の増加した調節されていない成長及び血液中のこれらの細胞の蓄積を特徴とする白血病の１つの形である。よって、血液中の著しい数の赤血球及び血漿から離して腫瘍細胞を白血球とともに抽出することにより、患者のＣＭＬ腫瘍における発癌マーカーのレベルを決定することは、診断及び予後評価のために重要になってくる。本実施例は、患者血液からの白血球及び／又は循環腫瘍細胞の回収を、抗癌剤を希釈せずに可能にする濾過方法について記載する。
[0171]典型的には、患者血液を、ＥＤＴＡ又はその他の抗凝固剤を含有する血液収集チューブ中に採血し、逆さまにすることにより穏やかに混合する。血液試料は室温で貯蔵し、２４〜７２時間以内に処理し、典型的には冷蔵又は冷凍しない。全血を含有するチューブを、上下に穏やかに逆さまにすることにより混合し、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含む溶液混合物で処理する。溶液混合物は、オルトバナジン酸ナトリウム（２００ｍＭ、２ｍＭの最終濃度）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）プロテアーゼ阻害剤（５０×；１×の最終濃度）及びハルト（Ｈａｌｔ）ホスファターゼ阻害剤（１００×；２×の最終濃度）を含むことができ、患者の血液試料と混和する。プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤の例は、これらに限定されないが、ハルトプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；コンプリートウルトラ（ＵＬＴＲＡ）及びＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；プロテアーゼ阻害剤セット（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；及びホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩ〜ＩＶ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む。
[0172]細胞単離装置を用いて、患者血液試料中の白血球及び／又は循環腫瘍細胞のようなその他の細胞から赤血球を分離する。細胞単離装置は、図示されるように、濾過デバイスと収集容器とを含む。いくつかの態様では、濾過デバイスは、濾過デバイスの上部チャンバー及び下部チャンバーの間に１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の複数）の白血球保持フィルターメンブレンを挿入することにより組み立てる。フィルターメンブレンは、８μｍのポアサイズ、３５５．６〜５５８．８μｍの厚さ及び７０〜８０％の白血球保持収率を有することができる。フィルターメンブレンの非限定的な例は、白血球単離膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰＡＬＬ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＳＰ０６６９）を含む。組み立てた濾過デバイスを収集容器の上に置く。細胞単離装置の蓋を外した後、血液試料をその中に装填する。収集容器の例は、これらに限定されないが、３ｍｌ、５ｍｌ、８ｍｌ、１４ｍｌ又は１６ｍｌの容量を有するプラスチック培養チューブのようなチューブを含む。
[0173]患者の血液試料から白血球及び／又は循環腫瘍細胞を単離及び溶解する例示的な方法は次のステップを含む。プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤で前処理した１ｍｌの血液試料を、逆さまにすることにより穏やかに混合する。次に、１ｍｌの血液試料を、上記のようにして組み立てた細胞単離装置の上部チャンバーに装填する。細胞単離装置を、アレグラ６Ｒ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ソーバルレジェンド遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はヘラエウスメガフュージ遠心機（Ｋｅｎｄｒｏ）のような臨床用又は卓上遠心機に入れる。典型的には、細胞を５〜３０分間、６００〜２，０００ｒｐｍ（例えば８００ｒｐｍ）、４℃で遠心処理する。アダプタを遠心処理中に用いて、細胞単離装置を遠心機のロータに収納できる。遠心処理の後、細胞単離装置を遠心機から取り出し、濾過デバイスを通過した赤血球を含有する収集容器から濾過デバイスを分離する。赤血球を有する収集容器は、生物安全性のために蓋をして取っておくことができる。
[0174]いくつかの実施形態では、新しい収集容器（例えば、これらに限定されないが、別の収集チューブ又は微量遠心チューブ）を濾過デバイスの下に置く。洗浄ステップを加えることなく、２００μｌ〜１ｍｌの溶解緩衝液を濾過デバイスの上部チャンバーに加える。上部チャンバーに蓋をし、濾過デバイス及び新しい収集容器を１５〜３０分間、４℃で激しく振とうする。濾過デバイス及び新しい収集容器を微量遠心機のような遠心機に入れ、約３，０００ｒｐｍで約５分間スピンする。細胞ライセートを、−７０℃での貯蔵のために他の遠心容器（例えば微量遠心チューブ）に移すことができる。
[0175]他の実施形態では、細胞単離装置を遠心機から取り出して赤血球を含有する収集チューブから濾過デバイスを分離した後、濾過デバイスの上部チャンバー及び下部チャンバーの間の１又は複数のフィルターメンブレンを単離する。上部及び下部チャンバーを取り外し（例えば、ねじを外す）、フィルターメンブレンを、ピンセットを用いて単離する。メンブレンを、１ｍｌの細胞溶解緩衝液を含有する新しい収集容器（例えば、１．５ｍｌ又は２．０ｍｌの微量遠心チューブ）に入れる。フィルターメンブレン上の細胞を溶解するために、新しい収集容器を直ちにボルテックスする。次いで、容器を氷上に置き、合計で３０分間、１０分ごとに１０秒間短くボルテックスする。次いで、細胞ライセートを別の容器（例えば、１．５ｍｌ又は２．０ｍｌの微量遠心チューブ）に移し、−７０℃で貯蔵する。
実施例４ ９６ウェル細胞単離装置を用いる濾過方法による細胞の単離：
[0176]本実施例は、例えば全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ、唾液及び／又は穿刺吸引液（ＦＮＡ）のような試料からの、濾過方法又は磁性ビーズ捕捉を伴う濾過方法を用いる単離細胞の回収であって、単離細胞が、本発明において、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ）の活性化状態及び／又は総量を検出するために用いることができる回収を示す。特に、本実施例は、濾過方法単独又は抗ＣＤ４５抗体を用いる磁性ビーズ捕捉後の濾過方法を用いる、Ｋ５６２細胞（すなわちヒト慢性骨髄性白血病株化細胞からの細胞）を加えた血液からのＫ５６２細胞の回収、その後のＫ５６２細胞ライセートの調製、並びに少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）、その基質、その経路又はそれらの組み合わせの発現及び／又は活性化状態の決定を示す。本実施例は、濾過方法又は抗ＣＤ４５抗体を用いる磁性ビーズ捕捉前の濾過方法を用いる患者血液試料からの血液細胞のサブセット（すなわち白血球）の回収、その後の細胞ライセートの調製、並びに少なくとも１種の発癌融合タンパク（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）、その基質、その経路又はそれらの組み合わせの発現及び／又は活性化状態の決定も示す。患者試料収集及び細胞単離の後のいずれの洗浄ステップの必要性も排除することにより、本明細書に記載の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤のような抗癌剤の細胞内濃度を変化させることなく関心対象の細胞を血液から回収でき、有利である。技術常識に反して、本実施例に記載の方法は、抗癌剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、グリベック（登録商標）、タシグナ（登録商標）、スプリセル（登録商標）））の実質的な希釈なしで、回収された細胞からの細胞ライセートを提供する。
[0177]９６ウェル細胞単離プレートを、新たに収集した血液から白血球及び／又はＫ５６２細胞を単離するために調製できる。まず、９６ウェル濾過プレートから元来のメンブレンを取り除き、フィルターメンブレン（例えば、ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｃｒｏｐｒｅｐ（ＰＡＬＬ）及びＬｅｕｋｏｓｏｒｂ（ＰＡＬＬ））で置き換えることができる。これらの実施形態では、Ｋ５６２細胞を添加したか又はしていない、新たに収集した血液を、９６ウェル細胞単離プレートのウェルに装填できる。第２の９６ウェルマイクロプレートは、廃棄血液収集プレートとして働くことができ、フィルターメンブレンを有する細胞単離プレートの下に置かれる。プレート組立体を、室温で約５分間、約６００ｒｐｍ〜３，０００ｒｐｍ（例えば、約６００ｒｐｍ、１，０００ｒｐｍ、２，０００ｒｐｍ、３，０００ｒｐｍ）の速度で遠心処理できる。遠心処理の後、フィルターメンブレンを遠心チューブに移し、フィルターメンブレン上の細胞を、細胞を溶解するためにある容量の溶解緩衝液（例えば、３００μｌの溶解緩衝液）で処理して、短く直ちにボルテックスできる。細胞ライセートを含有する遠心チューブを氷上に約３０分間置いて、約１０分ごとに短くボルテックスに供することができる。チューブを約１５分間遠心処理して、細胞破片を上清から分離できる。ライセートを含有する上清を収集し、マイクロアレイ（例えば近接媒介性イムノアッセイ）により分析して、発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ）を検出できる。
[0178]Ｋ５６２細胞を添加したか又はしていない、新たに収集した血液は、抗ＣＤ４５抗体を用いる磁性ビーズ捕捉による最初の処理の後、本明細書に記載の細胞単離のための濾過方法を経ることができる。Ｋ５６２細胞を添加したか又はしていない、新たに収集した血液は、抗ＣＤ４５抗体と結合した洗浄済み磁性ビーズ（例えばＣＤ４５ダイナルビーズ（Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とインキュベートできる。洗浄済み磁性ビーズは製造者の取扱説明書に従って調製できる。例えば、手順は、１）抗ＣＤ４５抗体と結合した１００μｌの磁性ビーズを１．５ｍｌの遠心チューブに移すステップと、２）１ｍｌの緩衝液を加え、穏やかに混合するステップと、３）遠心チューブを磁石上に１分間置くステップと、４）上清を取り除くステップと、５）チューブを磁石から取り除き、磁性ビーズを１００μｌの緩衝液に再懸濁するステップと、を含み得る。特定の場合には、１００μｌの洗浄済みビーズをＫ５６２添加血液試料の各々に加えることができる。次いで、試料は４℃の低温室中又は室温で、回転装置上で約２０分〜２時間インキュベートできる。インキュベーション時間は、例えば少なくとも２０分、３０分、１時間、１．５時間又は２時間であってよい。次に、試料を磁石（例えばダイナマグ（ＤｙｎａＭａｇ）磁石）上に置くことができる。上清を収集し、９６ウェル細胞単離プレートのウェルに装填できる。濾過による細胞単離のための方法は上記のようにして行うことができる。
[0179]血液細胞のサブセット（例えば白血球）は、新たに収集したＣＭＬ患者血液試料から、本明細書に記載の濾過方法により単離できる。特定の場合には、血液試料を、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）及びそれらの組み合わせ）を摂取するＣＭＬ患者から収集できる。本発明の利点は、チロシンキナーゼ治療を受けている患者からのものを含む患者の血液試料がさらなる洗浄又は処理を必要としないことである。上記と同様に、９６ウェル細胞単離プレートを、９６ウェル濾過プレートから元来のメンブレンを取り除き、関心対象の血液細胞（例えば白血球）を捕捉できるメンブレンフィルター（例えば、ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＡｃｒｏｐｒｅｐ（ＰＡＬＬ））で置き換えることによって調製できる。ＣＭＬ患者から新たに収集した血液を９６ウェル細胞単離プレートのウェルに装填し、第２の９６ウェルマイクロプレートを、フィルターメンブレンを有する細胞単離プレートの下に置くことができる。プレート組立体は、室温で約５分間、約６００ｒｐｍ〜３，０００ｒｐｍ（例えば、約６００ｒｐｍ、１，０００ｒｐｍ、２，０００ｒｐｍ、３，０００ｒｐｍ）の速度で遠心処理できる。遠心処理の後、フィルターメンブレンを遠心チューブに移すことができる。細胞を溶解するために、約３００μｌの溶解緩衝液をチューブに加え、次いで、チューブを短くボルテックスできる。細胞ライセートを含有するチューブを氷上に約３０分間置いて、約１０分ごとに短くボルテックスに供することができる。チューブを約１５分間遠心処理して、細胞物質を上清から分離できる。ライセートを含有する上清を収集し、マイクロアレイアッセイ（例えば、本明細書に記載の近接媒介性イムノアッセイ）により分析できる。
[0180]ＣＭＬ患者から新たに収集した血液は、本明細書に記載の細胞単離のための濾過方法の前に、抗ＣＤ４５抗体を用いる磁性ビーズ捕捉により最初に処理できる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４５抗体と結合した洗浄済み磁性ビーズ（例えばＣＤ４５ダイナルビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、ＣＭＬ患者から収集した血液とインキュベートできる。洗浄済み磁性ビーズは製造者の取扱説明書に従って調製でき、例えば、手順は、１）抗ＣＤ４５抗体と結合した１００μｌの磁性ビーズを１．５ｍｌの遠心チューブに移すステップと、２）１ｍｌの緩衝液を加え、穏やかに混合するステップと、３）遠心チューブを磁石上に１分間置くステップと、４）上清を取り除くステップと、５）チューブを磁石から取り除き、磁性ビーズを１００μｌの緩衝液に再懸濁するステップと、を含み得る。特定の場合には、１００μｌの洗浄済みビーズをＫ５６２添加血液試料の各々に加えることができる。次いで、試料は４℃の低温室中又は室温で、回転装置上で約２０分〜２時間インキュベートできる。インキュベーション時間は、例えば少なくとも２０分、３０分、１時間、１．５時間又は２時間であってよい。次に、試料を磁石上に置くことができる。上清を収集し、９６ウェル細胞単離プレートのウェルに装填できる。濾過による細胞単離のための方法は上記のようにして行うことができる。
[0181]図７は、Ｋ５６２細胞を添加した血液試料から本発明の白血球濾過方法を用いることにより単離されたＫ５６２細胞から調製された細胞ライセートにおいて、全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬがともに検出及び測定できることを示す。図７Ａは、濾過後の細胞における全ＢＣＲ−のレベルが、無濾過試料で観察されるレベルと同様であったことを示す。さらに、図７Ｂは、濾過後のＫ５６２細胞におけるリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルが、無処理細胞において検出されるレベルと同等であったことを示す。
[0182]図８Ａ、Ｂは、全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルがともに、細胞ライセートにおいて検出及び測定されたことを示す。細胞ライセートは、Ｋ５６２細胞を添加した血液試料から調製し、濾過メンブレンを通して濾過し、マイクロアレイ［例えば近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１００１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））］により分析した。特に、本明細書に記載の方法により単離された５，０００細胞を、ＢＣＲ−ＡＢＬ ＣＥＥＲアッセイにおいて用いた。種々の速度で遠心処理した異なる試料における全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの回収率を比較した。図８Ａは、ＰＡＬＬフィルターメンブレンを用いる濾過装置と、６００ｒｐｍの速度での遠心処理ステップと、を含む本発明の細胞単離方法の後に単離されたＫ５６２細胞において、全ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの１４１．５５％の回収があったことを示す。これと比較して、細胞単離方法がＬｅｕｋｏＬｏｃｋフィルターメンブレンと６００ｒｐｍの速度での遠心処理ステップとを含む場合、全ＢＣＲ−ＡＢＬシグナル回収は１２８．８８％であった。顕著には、遠心速度を１，０００ｒｐｍに増加した場合に回収率は６２．７１％に減少した。図８Ｂは、Ｋ５６２細胞を添加した１ｍｌ血液試料から本発明の方法を用いることにより単離した細胞におけるリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率を示す。ＰＡＬＬ濾過メンブレンを用いて細胞を単離することと、濾過装置を６００ｒｐｍで遠心処理することと、を含む濾過方法を用いて単離したＫ５６２細胞において、６３．６０％のリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルが検出された。ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ濾過メンブレンを用いて細胞を単離することと、濾過装置を１，０００ｒｐｍで遠心処理することと、を含む濾過方法を用いて単離したＫ５６２細胞において、５９．６４％のリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルが検出された。遠心速度を６００ｒｐｍに減少した場合に、回収率は、ＬｅｕｋｏＬｏｃｋメンブレンを用いて５７．８９％に減少した。
[0183]図９Ａは、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルが、種々の量のＫ５６２細胞を添加した血液試料から調製し、濾過メンブレンを通して濾過し、マイクロアレイ（例えば、本明細書に記載の近接媒介性イムノアッセイ）により分析した細胞ライセートにおいて検出及び測定されたことを示す。本発明の方法を用いて、Ｋ５６２細胞を添加した試料におけるホスホＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを検出した。特に、測定されるリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルは、血液試料に加えたＫ５６２細胞の数と関係する。リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率は、３００，０００個のＫ５６２細胞を添加した試料について１２３．３２％、１００，０００個のＫ５６２細胞を添加した試料について７５．２１％、３０，０００個のＫ５６２細胞を添加した試料について６３．１６％、１０，０００個のＫ５６２細胞を添加した試料について１５９．１２％であった。
[0184]図９Ｂは、細胞を血液に添加した場合の、濾過後に回収されたＫ５６２細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬシグナルを示す。リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率は、１，０００，０００個のＫ５６２細胞を添加した試料について６３．６０％であり、合計で１０８．６１％であった。
実施例５ ９６ウェル細胞単離装置を用いる濾過方法によるＣＭＬ患者血液からの腫瘍細胞単離のためのプロトコール：
[0185]本実施例は、濾過方法を用いて、患者全血から慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）腫瘍細胞を単離及び採取するためのプロトコールを示す。好ましい実施形態では、患者からの全血は、単離前に、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理をしてもしなくてもよい。慢性骨髄性白血病は白血球の癌である。これは、骨髄における主に骨髄系細胞の増加した制御されていない成長及び血液中のこれらの細胞の蓄積を特徴とする白血病の１つの形である。９５％のＣＭＬ癌細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬ腫瘍性タンパク質を発現する。よって、血液中の赤血球から離して腫瘍細胞を白血球とともに抽出することにより、患者のＣＭＬ腫瘍におけるＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを決定することは重要になってくる。本実施例は、患者血液からの腫瘍細胞（例えば白血球）の回収を可能にする濾過方法について記載する。
[0186]典型的には、患者血液を、ＥＤＴＡを含有する血液収集チューブ中に採血し、逆さまにすることにより穏やかに混合する。全血試料を室温で貯蔵し、２４時間以内に処理する。濾過プレートは、全血からの白血球の回収を可能にするメンブレンをウェルの底部に有する９６ウェルプレートを含む。濾過プレートが商業的に入手可能でないならば、濾過プレートは、これらに限定されないが、ａ）元来のフィルターメンブレンをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）９６ウェルユニフィルタープレートから取り除くステップ、ｂ）ＬｅｕｋｏＬＯＣＫトータルＲＮＡフィルターメンブレンを、そのフィルターカートリッジ筐体から取り出すステップ、ｃ）０．２５インチ径の穴をＬｅｕｋｏＬＯＣＫトータルＲＮＡフィルターメンブレンに開けて、９６ウェル濾過プレートのウェルに合う円形メンブレンを新たに創出するステップ、及びｄ）新しい円形ＬｅｕｋｏＬＯＣＫトータルＲＮＡフィルターメンブレンを、元来のメンブレンがないワットマン９６ウェルユニフィルタープレートに穏やかに入れるステップのような一連のステップによって調製できる。次に、９６ウェルマイクロプレートを９６ウェル濾過プレートの下に置き、両方のプレートを一緒にテープで封止して、濾過プレートデュエットを形成する。９６ウェルマイクロプレートは通過血液を収集するように働く。
[0187]濾過方法は次のステップを含むことができる。患者血液試料を、１ｍｌピペットを用いて、５〜１０回ピペット操作により上下させることにより混合する。１ｍｌピペットを用いて、３００μｌの患者血液を、予め作製した９６ウェル濾過プレートデュエットのウェルに装填する。プレートデュエットを、卓上遠心機（例えばアレグラ６Ｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））中で５分間、３，０００ｒｐｍ、室温で遠心処理する。遠心処理の後、プレートデュエットを遠心機から取り出す。テープを取り除き、プレートデュエットのプレートを分離する。１１４ｍｍ（４１／２”）解剖ピンセットを用いて、円形ＬｅｕｋｏＬＯＣＫフィルターメンブレンを濾過プレートのウェルから取り出し、３００μｌのタンパク質溶解緩衝液を含有する２ｍｌの遠心チューブに入れる。次に、遠心チューブを直ちにボルテックスする。遠心チューブを氷上に置き、合計で３０分間、１０分ごとに１０秒間短くボルテックスする。ライセートを、１ｍｌピペットを用いて、新しい２ｍｌの遠心チューブに移す。この時点で、ライセートを−７０℃で貯蔵するか、又は少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ）の活性化状態及び／又は総量を検出するアッセイにおいて用いる。
[0188]濾過方法は次のステップを含むこともできる。患者血液試料を、チロシンキナーゼ阻害剤で処理した後、濾過して、腫瘍細胞（例えば白血球）を患者血液から回収する。特定の場合には、１．２ｍｌの新たに収集した患者血液を、培養チューブに移し、特定の濃度範囲のチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、１０μＭ、１μＭ若しくは０．１μＭのダサチニブ、１０μＭ、１μＭ若しくは０．１μＭのイマチニブ、及び１０μＭ、１μＭ若しくは０．１μＭのニロチニブ）を加える。血液を、約１〜２４時間（例えば、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４時間）、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で、又は室温でインキュベートする。
実施例６ １回目及び２回目の採血からの患者２の血液試料からホスホＢＣＲ−ＡＢＬ、全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びＢＣＲレベルを決定するためのＣＥＥＲイムノマイクロアレイのプロトコール：
[0189]本実施例は、患者の血液試料におけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現及び活性化を検出するためのＣＥＥＲイムノマイクロアレイを行う手順を示す。白血球及び循環腫瘍細胞は本明細書に記載の方法に従って単離する。単離細胞を溶解し、近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１００１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））において用いる。特定の実施形態では、プロトコールは、患者の血液試料を、ＢＣＲと結合する磁性ビーズで処理することを含む。
ＣＥＥＲイムノマイクロアレイのためのＫ５６２細胞ライセートの希釈：
[0190]無処理Ｋ５６２細胞ライセートを本発明の方法（例えば、実施例２及び３に記載の方法）に従って調製した。アッセイ希釈緩衝液中での無処理Ｋ４６２細胞ライセートの系列希釈を表１に従って行った。細胞ライセートは３つのＣＥＥＲスライドによりスクリーニングした。
Figure 2014508295
ＣＥＥＲイムノマイクロアレイのための患者血液試料からの細胞ライセートの希釈：
[0191]患者血液試料から調製した細胞ライセートを本発明の方法（例えば、実施例１、２及び１０に記載の方法）に従って調製した。３つのＣＥＥＲスライドで用いるための患者細胞ライセートの希釈の手順を表２に示す。
Figure 2014508295
ＣＥＥＲイムノマイクロアレイの手順：
１．ブロッキングスライド：
１．１． スライドをＴＢＳＴで２回すすぐ。
１．２． スライドを、８０μｌのタンパク質フリー（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液で１時間ブロッキングする。
１．３． ブロッキングステップ後にＴＢＳＴで２回洗浄する。
１．４． アッセイ希釈緩衝液（２％ＢＳＡ／０．１％トリトン／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／ＴＢＳ）１ｍｌ当たり１０μｌの１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を加える。
２．細胞ライセートとのインキュベーション：
２．１． 表＃＃及び＃＃に記載のアッセイ希釈緩衝液での細胞ライセートの系列希釈を行う。
２．２． ビーズとのインキュベーションのために細胞ライセートのアリコートを取り出し、等容量のアッセイ希釈緩衝液を、磁性ビーズ（例えばＢＣＲ−１６８４ビーズ）とインキュベートしないライセートのアリコートに加える。
２．３． ８０μｌの細胞ライセートをスライドに加え、スライドを密閉する。
２．４． 室温で１晩インキュベートする。
２．５． １回目の洗浄が１．２５ｍｌのＴＢＳＴを用いる迅速なすすぎであり、残りの洗浄がそれぞれ３分間であるようにして５回、スライドを洗浄する。
３．検出抗体とのインキュベーション：
３．１． 標識抗体を、アッセイ希釈緩衝液中で適当な濃度に希釈する。
３．１．１ ４Ｇ１０−ＨＲＰ：１：３２０に希釈（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃０５−７７７）。
３．１．２ ＢＣＲ−ＧＯ−ＡＦ５１２９：１：８０及び１：１６０に希釈（Ｒ＆Ｄ ＃ＡＦ５１２９）。
３．１．３ Ａｂｌ−ＨＲＰ−ＡＦ５４１４：１：９００に希釈（Ｒ＆Ｄ ＃ＡＦ５４１４）。
３．１．４ ＢＣＲ−ＨＲＰ−１６８４−Ｂ−デキストラン：１：８０に希釈（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ ＃１６８４−Ｂ）。
３．１．５ ＧＯ−デキストラン：１：８０に希釈。
３．２． ８０μｌの抗体溶液を適当なスライドに加え、室温で２時間インキュベートする。
３．２．１ フリーＢＣＲスライドについて：ＢＣＲ−ＨＲＰ １：８０、ＧＯ−デキストラン１：８０。
３．２．２ 全ＢＣＲ−ＡＢＬスライドについて：Ａｂｌ−ＨＲＰ １：９００、ＢＣＲ−ＧＯ １：８０。
３．２．３ ホスホＢＣＲ−ＡＢＬスライドについて：４Ｇ１０−ＨＲＰ １：３２０、ＢＣＲ−ＧＯ １：１６０。
３．３． １回目の洗浄が１．２５ｍｌのＴＢＳＴを用いる迅速なすすぎであり、残りの洗浄がそれぞれ３分間であるようにして５回、スライドを洗浄する。
４．チラミド媒介シグナル増幅：
４．１． ８０μｌのビオチン−チラミドを１：３２０希釈で５０ｍＭグルコース／ＰＢＳ中に加える（ＢＣＲ−ＨＲＰ＋ＧＯ−デキストランについて）。
４．２． ８０μｌのビオチン−チラミドを６．２５ｕｇ／ｍＬで５０ｍＭグルコース／ＰＢＳ−ＲＫ中に加える（４Ｇ１０−ＨＲＰ＋ＢＣＲ−ＧＯ及びＡＢＬ−ＨＲＰ＋ＢＣＲ−ＧＯについて）。
４．３． 暗所で１５分間インキュベートする。
４．４． １回目の洗浄が１．２５ｍｌのＴＢＳＴを用いる迅速なすすぎであり、残りの洗浄がそれぞれ３分間であるようにして５回、スライドを洗浄する。
５．アレクサフロール（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）コンジュゲートストレプトアビジンとのインキュベーション：
５．１． ８０μｌのストレプトアビジン−アレクサ６４７（アッセイ希釈緩衝液中０．４μｇ／ｍｌ（１：４，０００希釈））と４０分間インキュベートする。
５．２． １回目の洗浄が１．２５ｍｌのＴＢＳＴを用いる迅速なすすぎであり、残りの洗浄がそれぞれ３分間であるようにして５回、スライドを洗浄する。
５．３． 水で１回洗浄する。
５．４． 枠を取り除き、スライドを水で２回すすぐ。
５．５． スライドを５０ｍｌチューブ中、１５００ｒｐｍで３分間遠心処理する。
６．スライドを乾燥させ、適当なレーザ設定でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒスキャナで走査する：
６．１． スライドを乾燥させる。
６．２． スライドを、適当なレーザ設定でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒスキャナで走査する。
６．３． 画像及び走査設定をファイル及びサーバに保存する。
実施例７ 活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを特徴とする血液学的悪性疾患の患者について抗癌治療を選択するための方法：
[0192]本実施例は、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患（例えば慢性骨髄性白血病）の患者について抗癌治療を選択するための方法を示す。患者は、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患について以前に治療されておらず、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）のような薬物をまだ受けていない。患者の血液試料を採取し、種々の投与量での異なる抗癌剤と、１．５時間、３７℃でインキュベートした。このｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物処理の後、白血球及び／又は循環腫瘍細胞を患者血液から回収する。単離細胞を溶解し、近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１００１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））において用いる。薬物処理患者試料におけるシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＲＣ）の分析物の発現／活性化プロファイリングに基づく経路プロファイルを、抗癌剤の存在下で決定する。プロファイルを用いて、正の臨床転帰を達成することをねらいとする抗癌治療計画を選択する。
[0193]すなわち、本発明は、
血液学的悪性疾患を有する対象における抗癌剤を選択するための方法であって、
１）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、対象からの試料からの単離細胞において測定するステップと、
単離細胞を少なくとも１つの抗癌剤と治療開始前にインキュベートするステップと、
３）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルを、インキュベートした細胞において測定するステップと、
治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態レベルに基づいて選択するステップと、
を含む方法を提供する。本発明はまた、
対象における抗癌剤の効力をモニターするための方法であって、
対象は血液学的悪性疾患を有し、該方法は、
１）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態を、抗癌剤の１回目の投与前のＴ０に測定するステップと、
２）抗癌剤を対象に投与するステップであって、抗癌剤の１回目の投与が時間Ｔ１に行われるステップと、
２）ＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルを、時間Ｔ２に対象からの試料において測定するステップと、
３）治療方針をＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態及び／又は発現レベルに基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
実施例８ 患者１：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害プロファイルに基づいて治療の効力を決定及び／又は最良の治療戦略を選択するための経路プロファイリング：
[0194]本実施例は、対象の血液試料におけるシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＲＣ）の分析物の発現／活性化プロファイリングに基づく、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患（例えば慢性骨髄性白血病）の患者についての阻害剤治療の効力の決定を示す。特定の場合には、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）での治療のような阻害剤治療を受けていることがある。他の実施形態では、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質の存在及び／又は活性化状態を、近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８／０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９／００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１０／０１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））を用いて測定できる。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理後の対象の試料におけるキナーゼ及びその他のシグナル伝達経路構成要素の発現／活性化プロファイリングは、価値のある情報を提供して、臨床家が効果的な治療計画を選択することを可能にする。
[0195]一例では、患者（患者１）の血液試料を分析して、患者のイマチニブ治療の有効性を決定した。患者１は、５５歳の白人女性で、初期診断は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であった。彼女は活動性ＣＭＬであり、診断以降イマチニブを受けている。患者の血液を採取し、白血球を、上記の方法を用いて単離した。簡単に述べると、患者１の全血試料を、濾過プレートを通して濾過して白血球及び循環腫瘍細胞を回収した。次いで細胞を溶解し、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ）の活性化状態及び／又は総量を検出する近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ、ＣＯＰＩＡ）において用いた。特定の場合には、近接アッセイにおいて用いた捕捉抗体の希釈系列は、１：５又は１：２０に希釈して、所望の濃度を達成する。白血球の数並びにリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬ及びその他のシグナル伝達経路構成要素のプロファイルを、近接アッセイを用いて決定した。リン酸化シグナル比も分析から算出して、患者の予後を決定するために用いた。
[0196]好ましい実施形態では、患者の血液試料は、白血球又は循環腫瘍細胞を単離する前に阻害剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートできる。特定の場合には、ＣＭＬと診断された患者から採取した全血試料を、０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭのＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ）で１．５時間、３７℃で処理する。白血球又は循環腫瘍細胞を、全血から、濾過方法を用いて単離し、当業者に知られる技術を用いて溶解する。次いで、細胞ライセートを近接アッセイにおいて用いて、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子の活性化状態及び／又は総量に対するＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤処理の効果を決定する。いくつかの実施形態では、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理はリン酸化ＣＲＫＬのレベルを低減できる。いくつかの場合には、患者試料におけるＣＲＫＬ活性化はＢＣＲ−ＡＢＬ活性化によるものであり得る。さらに別の実施形態では、ダサチニブのような特定の阻害剤は活性化型のＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣを減弱できる。他の場合には、イマチニブ及びニロチニブのようなその他の阻害剤は、同じ患者におけるリン酸化ＡＫＴ及びＳＴＡＴ５のレベルを低減できないことがある。特定の場合には、リン酸化ＡＫＴ及びＳＴＡＴシグナル伝達はＢＣＲ−ＡＢＬ活性化状態に依存しないことがある。他の態様では、イマチニブを現在受けている患者は、ＣＲＫＬ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質の発現／活性化の減弱により、イマチニブとダサチニブのような組み合わせ治療に応答する可能性があり、該治療を受けるべきである。
[0197]図１０は、本研究で分析した患者について記載する。患者１は活動性ＣＭＬであり、治療を少なくとも５年受けている。患者２も活動性ＣＭＬであり、イマチニブ治療を１年受けている。図１１Ａ、Ｂは、患者１が、患者２と比較して血液１ｍｌ当たりより少ない量のホスホＢＣＲ−ＡＢＬを有したことを示し（１０，９７９ＣＵ／ｍｌ 対 １８５，９３４ＣＵ／ｍｌ）、このことは、患者１がイマチニブ治療に応答していたことを示唆する。図１２Ａ、Ｂは、白血球及びその他の循環腫瘍細胞の濾過単離の後にサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定したＢＣＲ−ＡＢＬの全レベル及び活性化（リン酸化）レベルの検出を示す。近接アッセイは、Ｋ５６２細胞における蛍光体−ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを決定できる。図１３Ａ、Ｂは、患者１の血液試料のイマチニブでのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理が、ニロチニブ処理と比較してリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの量を劇的に減少させたことを示す。図１４及び１５は、患者１の血液試料における活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルが、漸増量のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で処理した場合に変化したことを示す。本実験では、患者１の血液試料を１．５時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、種々の量のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（例えば、１０μＭ、１μＭ若しくは０．１μＭのイマチニブ又は１０μＭ、１μＭ若しくは０．１μＭのニロチニブ）で処理した。結果は、平均ホスホＢＣＲ−ＡＢＬシグナルが、１０μＭイマチニブについて８４ＣＵ、１μＭイマチニブについて２６ＣＵ、０．１μＭイマチニブについて１１０ＣＵであったことを示す。活性化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの平均レベルは、１０μＭニロチニブについて４７ＣＵ、１μＭニロチニブについて６１ＣＵ、０．１μＭニロチニブについて３０６ＣＵであった。図１５Ａ、Ｂは、イマチニブが、患者１の血液試料において活性化ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質を低減することについてニロチニブよりも効果的であったことを示す。活性化ＢＣＲ−ＡＢＬシグナルの回収率は、１μＭイマチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した試料において−１８．４６％であり、１μＭニロチニブに曝露した試料において１９．１５％であった（図１５Ｂ）。図１６Ａ〜Ｄは、ＣＲＫＬ（Ａ）、ＡＫＴ（Ｂ）、ＳＴＡＴ５（Ｃ）及びＳＲＣ（Ｄ）のような他のリン酸化シグナル伝達経路構成要素の経路プロファイルを示す。ダサチニブ治療は、患者１の血液試料における活性化ＡＫＴ、ＳＴＡＴ４及びＳＲＣのレベルを低減したが、イマチニブ又はニロチニブは低減しなかったことが示される。図１７は、患者１の血液試料が、非常に高いレベルの全ＢＣＲ（８００万ＣＵ／ｍｌ）を含有したことを示す。
実施例９ 患者２：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害プロファイルに基づいて治療の効力を決定及び／又は最良の治療戦略を選択するための経路プロファイリング：
[0198]本実施例は、対象の血液試料におけるシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＲＣ）の分析物の発現／活性化プロファイリングに基づく、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患（例えば慢性骨髄性白血病）の患者についての阻害剤治療の効力の決定を示す。特定の場合には、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）での治療のような阻害剤治療を受けていることがある。他の実施形態では、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質の存在及び／又は活性化状態を、近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８／０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９／００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１０／０１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））を用いて測定できる。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理後の対象の試料におけるキナーゼ及びその他のシグナル伝達経路構成要素の発現／活性化プロファイリングは、価値のある情報を提供して、臨床家が効果的な治療計画を選択することを可能にする。
[0199]一例では、患者（患者２）は、３９歳の白人男性であり、１月にＣＭＬと診断された。患者２は、診断以降イマチニブを受け、活動性疾患を有する。好ましい実施形態では、患者の血液を採取し、白血球を、上記の方法を用いて単離する。簡単に述べると、患者２の全血試料を、濾過プレートを通して濾過して白血球及び循環腫瘍細胞を回収した。次いで細胞を溶解し、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ）の活性化状態及び／又は総量を検出する近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ、ＣＯＰＩＡ）において用いた。特定の場合には、近接アッセイにおいて用いた捕捉抗体の希釈系列は、１：５又は１：２０に希釈して、所望の濃度を達成できる。白血球数並びにリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬ及びその他のシグナル伝達経路構成要素のプロファイルを、近接アッセイを用いて決定できる。リン酸化シグナル比も分析から算出して、患者の予後を決定するために用いることができる。
[0200]好ましい実施形態では、患者の血液試料は、白血球又は循環腫瘍細胞を単離する前に阻害剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートできる。特定の場合には、ＣＭＬと診断された患者から採取した全血試料を、１ｕＭのＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ）で１．５時間、３７℃で処理する。白血球又は循環腫瘍細胞を、全血から、濾過方法を用いて単離し、当業者に知られる技術を用いて溶解する。細胞ライセートを、次いで、近接アッセイにおいて用いて、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子の活性化状態及び／又は総量に対するＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤処理の効果を決定する。いくつかの実施形態では、ニロチニブでのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理は、患者の血液試料において回収されるホスホＢＣＲ−ＡＢＬの割合を低減するが、イマチニブは低減しない。特定の場合には、この経路プロファイルを有する患者は、イマチニブと比較してニロチニブ治療に対してよりよく応答する可能性がある。他の実施形態では、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理はリン酸化ＣＲＫＬに対して影響しないことがあり得る。さらに別の実施形態では、ダサチニブのような特定の阻害剤は活性化型のＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣを減弱できる。他の場合には、イマチニブ及びニロチニブのようなその他の阻害剤は、同じ患者試料におけるリン酸化ＡＫＴのレベルを低減できる。さらに別の場合には、リン酸化ＳＴＡＴ５及びＳＲＣは、イマチニブ及びニロチニブでのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理により約２０％低減される。さらに別の態様では、イマチニブを現在受けている患者は、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質の発現／活性化の減弱により、ダサチニブ治療に応答する可能性があり、該治療を受けるべきである。
[0201]図１８Ａ、Ｂは、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬが、患者２の血液試料を異なる投与量のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で１．５時間、３７℃でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した後に検出及び測定されたことを示す。これは、ニロチニブが、イマチニブと比較して、患者２のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理血液試料の活性化ＢＣＲ−ＡＢＬの低減についてより効果的であることも示す。ニロチニブの濃度を増加すると（例えば、０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）、活性化ＢＣＲ−ＡＢＬは減少するが、イマチニブの濃度を変化させてもあまり影響がなかった（図１８Ｂ）。イマチニブは、患者２における活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルに対してほとんど影響しなかった。図１９Ａ〜Ｄは、患者２の血液試料をダサチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理することが活性化ＡＫＴ（Ｂ）、ＳＴＡＴ５（Ｃ）及びＳＲＣ（Ｄ）のレベルを低減させたことを示す。他方、イマチニブ又はニロチニブでの同様の処理はリン酸化ＡＫＴのみを低減させた（例えば、無処理試料における１００％と比較して、１０μＭイマチニブ処理試料において５５．５４％）。
実施例１０ 慢性骨髄性白血病についてのイマチニブに対する患者の血液試料の経路プロファイルの比較：
[0202]本実施例は、対象の血液試料におけるシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＲＣ）の分析物の発現／活性化プロファイリングに基づく経路プロファイルを決定し、比較して、種々の治療計画の効力を確立できることを示す。好ましい実施形態では、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５及びＳＲＣのようなＢＣＲ−ＡＢＬ基質の存在及び／又は活性化状態を、近接アッセイ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８／０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９／００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１０／０１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載の協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））を用いて測定できる。他の実施形態では、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）及びそれらの組み合わせ）での治療のような阻害剤治療を受けていることがある。他の実施形態では、患者血液試料は、チロシンキナーゼ阻害剤でｉｎ ｖｉｔｒｏで１．５時間、３７℃で処理できる。その後、循環腫瘍細胞及び／又は白血球を、本明細書に記載の濾過方法を用いて血液試料から回収できる。単離細胞を溶解し、少なくとも１種の発癌融合タンパク質（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ）及び／又はシグナル伝達分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＳＨＣ、ＰＩ３Ｋ、ＣＲＫＬ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ５、ＳＲＣ）の活性化状態及び／又は総量を検出する近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ、ＣＯＰＩＡ）において用いることができる。これらのタンパク質の測定したレベルは、同じ患者又は他の患者の試料間で比較できる。経路プロファイルの比較により、臨床家がＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性疾患の患者について最も効果的な治療を選択することが可能になる。
[0203]図２０Ａ〜Ｄは、リン酸化ＣＲＫＬレベルが、チロシンキナーゼ阻害剤でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した血液試料において検出及び測定されたことを示す。本実験では、近接アッセイにおいて用いた捕捉抗体は１：１０又は１：５０に希釈して、所望の濃度を達成した。患者１は、患者２と比較してより高いレベルの活性化ＣＲＫＬを示した。イマチニブ及びニロチニブのようなＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、ＣＲＫＬレベルを患者１の血液試料においてのみ低減し、患者２では低減しなかった。
[0204]図２１Ａ〜Ｄは、患者１及び患者２がイマチニブ及びニロチニブに対して同様には応答しないことを示す。活性化ＡＫＴレベルは、イマチニブ処理後に患者１の試料において増加したが、これらは患者２の試料では減少した。ニロチニブに対する応答において、ＡＫＴレベルは患者１の試料においてほぼ変化しないままであるが、これらは患者２の試料では大きく減少する。
[0205]図２２Ａ、Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏダサチニブ処理が、ホスホＳＴＡＴ５レベルを患者１（Ａ）及び２（Ｂ）の試料において低減できることを示す。活性化ＳＴＡＴ５レベルは、処理を受けていないか、１０μＭイマチニブ又は１０μＭニロチニブ処理を受けた、患者１又は患者２のいずれの試料においても同様である。
[0206]図２３Ａ〜Ｄは、患者１及び患者２の試料がいずれも、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブに対する応答においてより低いレベルのホスホＳＲＣを有することを示す。ダサチニブは、イマチニブ及びニロチニブと比較して、患者１及び患者２試料のいずれにおいても、ホスホＳＲＣレベルを減少させることについてより効果的であった。
実施例１１ ＣＭＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬの活性化の検出及びモニタリング：
[0207]本実施例は、ＣＭＬと診断された患者における治療応答をモニターする本発明の方法について示す。本実施例は、方法が、限定数の細胞からの多重のタンパク質の発現及び活性化状態を検出できることを示す。本実施例は、本発明の細胞単離装置及びＣＥＥＲイムノアッセイを用いる方法が、ｍＲＮＡに基づく分析と比較して、機能的標的調節のより感度が高く定量的な分析を提供することを示す。
[0208]ＣＭＬ治療応答をモニターするための伝統的な方法は、細胞遺伝学的試験、骨髄穿刺塗抹標本の評価、Ｐｈ染色体の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、及びリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含む。典型的には、細胞遺伝学的試験又は骨髄穿刺塗抹標本の評価は、治療の３、６及び１２ヶ月目に又はＣＣｙＲが達成されるまで行われる。現在、Ｑ−ＰＣＲは治療応答について最も感度が高い試験である。本発明は、Ｑ−ＰＣＲよりも感度が高く、患者の血液試料における薬物の除去又は希釈を必要としない、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害のｉｎ ｖｉｖｏ調節をモニターする方法を提供する。
[0209]本研究では、全ＢＣＲ−ＡＢＬ及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬのレベルを、ＣＭＬ患者から本発明の方法を用いて分析した。図２４は、本研究において評価した患者の表を示す。診断の日時及び患者の治療方針を記録した。血液は、研究の過程の種々の時点で採血した。白血球及び循環腫瘍細胞を患者血液試料から単離し、本明細書に記載の方法に従って溶解した。細胞ライセートを、実施例６に記載の方法により処理して分析した。患者血液試料におけるＢＣＲ−ＡＢＬ及びその他のシグナル伝達分子（例えば、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＣＲＫＬ、ＳＴＡＴ５）の発現及び活性化の調節を、近接アッセイ（例えば、ＣＯＰＩＡ、ＣＥＥＲ）を用いて決定した。協同的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）のような近接アッセイの詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２（出願日：２０１０年７月１５日）並びに米国特許出願公開第２００８／０２６１８２９号、米国特許出願公開第２００９／００３５７９２号及び米国特許出願公開第２０１０／０１６７９４５号（これらの開示は、ここで参照されることによりそのまま本明細書に組み入れられる。）に記載されている。
薬物治療後の患者におけるＣＭＬ増悪のモニタリング：
[0210]図２５は、本発明の方法を用いて患者試料において検出された全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを表す。患者試料のさらなる詳細は本実施例に記載する。
[0211]全ＢＣＲ、ＡＢＬ及びＢＣＲ−ＡＢＬレベルを、正常で健常な対象の血液試料から決定した。予想通り、ＢＣＲ−ＡＢＬレベルは負であった（図２６を参照されたい）。
[0212]患者１は、２００６年１２月にＣＭＬと診断され、イマチニブ（グリベック）治療を受けた。イマチニブに対する患者１の応答を決定するために、全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを３つの時点（１／３１、４／２５及び１０／２４）で分析した。患者１は、時点１に０．１３０のリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬ／白血球比、時点２に０．１３３の比、第３の時点３に０．０７８の比を有した（図２７Ａ）。時点間のリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルの変化は、ｍＲＮＡの値が時点２及び３においてそれぞれ０．０４±０．０１％及び０．０４％であったので、ｍＲＮＡ発現アッセイにより検出されなかった。ＲＮＡ発現アッセイは、標準ベースライン値から３対数低減した活性腫瘍細胞を検出する。ＣＥＥＲイムノマイクロアレイの利点は、これが、３対数を超えて低減したホスホＢＣＲ−ＡＢＬを検出することである。
[0213]患者７からの結果は、ＢＣＲ−ＡＢＬレベルのｍＲＮＡレベルが検出不能であったが、全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルは、ＣＥＥＲイムノマイクロアッセイを用いて検出されたことを示す。本発明の方法は、全ＢＣＲ−ＡＢＬよりも、活性化ＢＣＲ−ＡＢＬの検出について１０倍より感度が高いことが証明された。特に、ＣＥＥＲイムノアッセイは、活性腫瘍細胞を有する患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現及び活性化状態を０．０５％の全白血球比まで検出し、これは、標準ベースライン値から４対数を超える低減に相当する。患者７は、５月にＣＭＬと診断され、４月にイマチニブ治療を開始した。治療に対する応答を治療後の２つの時点（例えば６月及び２月）にモニターした。結果は、ホスホＢＣＲ−ＡＢＬが時間とともに減少したことを示す（図２７Ｂの棒グラフ及び線グラフを参照されたい）。
[0214]患者２は、１月に診断され、２月にイマチニブ治療を受けた。患者からの白血球及びＣＴＣを、２／２及び３／２に採取した血液から、細胞単離装置の９６ウェルの実施形態を用いて単離及び溶解した。１０／１２及び１２／２１に採取した血液から本発明の細胞単離装置のチューブの実施形態を用いた。本発明の方法を用いて、患者２が、５月の時点でより低いレベルの活性化ＢＣＲ−ＡＢＬを発現したことが決定された（例えば、図２８Ａ、Ｂの棒グラフ及び線グラフを参照されたい）。しかし、レベルは１０月までに増加した。ＣＥＥＲイムノアッセイからの結果はｍＲＮＡ発現データと相関する。標準的な方法（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬについてＭｏｌｅｃｕｌａｒＭＤキット）を用いるＱ−ＰＣＲの正確性及び低レベルのｍＲＮＡを図２８Ｃに強調する。ＡＢＬに対するＢＣＲ−ＡＢＬの％は、試料に存在するｍＲＮＡの量とともに変動した。
患者試料におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物応答のモニタリング：
[0215]ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物処理に対する患者２の応答を決定するために、血液試料を、種々の量のイマチニブ又はニロチニブで処理し、全ＢＣＲ−ＡＢＬ及びＢＣＲ−ＡＢＬの活性化状態をアッセイした。ＣＥＥＲイムノアッセイは、患者７の試料において薬物処理に対する応答を検出でき、それため、このアッセイが、患者についての最良の治療を決定するのに有用なツールであることを示した。
[0216]患者３は、ＣＭＬと診断され、ダサチニブ（スプリセル）治療を受けた。全ＢＣＲ−ＡＢＬレベル及び活性化ＢＣＲ−ＡＢＬレベルを、５つの時点（２／０７ ４／０４／、７／２５、８／２２／及び１０／１７）にモニターした。２／０７及び４／０４に採取した血液は細胞単離装置の９６ウェルの実施形態を用いて処理し、７／２５及び８／２２に採取した血液は本発明の装置のチューブの実施形態を用いて処理した。図２９Ａは、ｐＢＣＲ／ＷＢＣ比が１０／１７に最低であったことを示す。図２９Ｂは、ホスホＢＣＲ−ＡＢＬレベルが７／２５の試料においてピークになり、１０／１７の試料においてその最低レベルに減少したことを示す。患者３はダサチニブに応答し、図２９Ａに強調するように、最後の時点でより低いレベルの活性化ＢＣＲ−ＡＢＬを有した。ホスホＢＣＲ−ＡＢＬについてのＣＥＥＲアッセイの結果はｍＲＮＡ発現データと相関する。
[0217]患者８は、２００７年７月にＣＭＬと診断され、０５／２５にイマチニブからダサチニブ治療に変更した。血液を５／１８及び６／２０に採取し、本発明の細胞単離装置の９６ウェルの実施形態を用いて処理した。本発明のチューブの実施形態を用いて、７／１８、０８／１８及び１０／１３に採取した血液からの白血球及びＣＴＣを単離及び溶解した。図３０Ａは、ホスホＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＢＣ比が５／１８から８／１８まで減少したが、０３／１３に増加したことを示す。ホスホＢＣＲ−ＡＢＬ／全ＢＣＲ−ＡＢＬ比は、患者がダサチニブを受けている間に増加し（図３０Ｂ）、これはおそらくＣＭＬの増悪による。
[0218]患者１８は、０８／２０のニロチニブでの最初の治療に対して、次いで、０８／２２のポナチニブでの治療に対して応答した。本研究においてこの患者から採血したすべての血液は本発明の細胞単離装置のチューブの実施形態を用いて処理した。本発明の方法からの結果は、ｐＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＢＣ比が治療の過程で減少したことを示す。当業者に知られる標準的な方法により決定したｍＲＮＡ比も、測定した期間中のＢＣＲ−ＡＢＬの減少を示す。
[0219]患者１４は、６月にＣＭＬと診断され、６／２８にヒドロキシウレア治療を、０８／２９にダサチニブ治療を受けた。８／２９及び１０／０３に採取した血液を、本発明の細胞単離装置のチューブの実施形態を用いて処理した。図３１Ｂは、活性化ホスホＢＣＲ−ＡＢＬレベル（ｐＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＢＣ比）が第１時点（６／２８）の後に減少し、最後の時点（１０月２０日）で最低であったことを示す。患者１４の血液試料は、異なる濃度のイマチニブ又はニロチニブでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した。図３２Ａ、Ｂは、薬物処理に対する患者１４のｉｎ ｖｉｔｒｏ応答がイマチニブ又はニロチニブ処理によるリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬの低減を導くことを示す。
結論：
[0220]本実施例は、２０名のＣＭＬ患者から得られた細胞ライセートにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ発現及びリン酸化の分析を示す。本実施例は、細胞単離方法及びＣＥＥＲイムノアッセイを含む本発明の方法の使用を示す。特に、白血球及び循環腫瘍細胞は、患者の全血試料から、血液中の薬物レベルを除去又は希釈することなく単離された。異なるレベルのＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害が標的治療を受けた患者において観察された。本実施例は、ＣＥＥＲイムノアッセイによるＢＣＲ−ＡＢＬの検出が高いレベルの機能的感度を有し、ＣＭＬ増悪をモニターするために臨床的有用性を有することも示す。本発明の方法は、薬物の効力をスクリーニング及びモニターするために用いることができ、これは、標的治療を受けるＣＭＬ患者にとって非常に利益となる。同様に、方法は、臨床家が患者についての最も効果的な治療オプションを決定することを支援できる。
[0221]国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３３８６（出願日：２０１０年１０月２０日）を含む、本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許出願は、各刊行物又は特許出願が参照により組み入れられることが個々に具体的に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられている。本明細書に記載の発明は、明確な理解を目的として図面及び実施例によりいくらか詳細に説明されているが、本発明の教示に鑑みて、いくらかの変更及び改変を、添付の特許請求の範囲及びその精神を逸脱することなく本発明に対して行うことができることは、当業者にとって明らかである。

Claims (27)

  1. 全血試料において白血球を赤血球から単離及び分離するための装置であって、
    上部チャンバー、下部チャンバー、及び上部チャンバーと下部チャンバーとの間の１又は複数の積層フィルターメンブレンを含む濾過デバイスであって、前記１又は複数の積層フィルターメンブレンが前記白血球を保持できる、濾過デバイスと、
    前記全血試料から赤血球を収集するための収集チューブと、
    を含み、
    前記濾過デバイスは前記収集チューブの上に置かれ、前記赤血球は前記白血球から分離され、遠心処理後に前記収集チューブ中に収集される、装置。
  2. 前記全血試料は前記濾過デバイスの上部チャンバーに装填される、請求項１に記載の装置。
  3. 前記濾過デバイスは２、３又は４つの積層フィルターメンブレンを含む、請求項１又は２に記載の装置。
  4. 前記上部チャンバーは、それに取り付けられたスナップキャップ蓋をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
  5. 第２収集チューブをさらに含み、前記赤血球を含有する前記収集チューブは遠心処理後に前記第２収集チューブで置き換えられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
  6. 前記白血球のライセートが、前記上部チャンバーへの溶解緩衝液の添加及び遠心処理の後に前記第２収集チューブ中に収集される、請求項５に記載の装置。
  7. 前記溶解緩衝液は、前記１又は複数の積層フィルターメンブレンを洗浄せずに前記上部チャンバーに加えられる、請求項６に記載の装置。
  8. 第２収集チューブをさらに含み、前記１又は複数の積層フィルターメンブレンは遠心処理後に前記濾過デバイスから取り出され、前記第２収集チューブに入れられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
  9. 前記第２収集チューブは溶解緩衝液を含有する、請求項８に記載の装置。
  10. 前記全血試料は、血液学的悪性疾患を有するか又は有する疑いのある対象から得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
  11. 前記血液学的悪性疾患は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項１０に記載の装置。
  12. 前記対象は治療剤での治療を受けているか又は受けていない、請求項１０又は１１に記載の装置。
  13. 前記治療剤は抗癌剤である、請求項１２に記載の装置。
  14. 前記抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、モノクローナル抗体、ワクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の装置。
  15. 前記チロシンキナーゼ阻害剤は、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の装置。
  16. 前記全血試料は、前記白血球の単離前に前記治療剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートされる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の装置。
  17. 前記白血球は、正常白血球、悪性白血球、疾病白血球及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の装置。
  18. 前記装置は複数の濾過デバイスである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の装置。
  19. 治療剤の実質的な希釈なしで白血球のライセートを全血試料から調製するための方法であって、
    （ａ）前記全血試料を請求項１〜１８のいずれか一項に記載の装置に装填するステップと、
    （ｂ）前記装置を遠心処理して、前記白血球を前記１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉し、前記赤血球を前記収集チューブ中に分離するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）の間で洗浄ステップを行わずに、前記１又は複数の積層フィルターメンブレン上に捕捉された前記白血球を溶解緩衝液で溶解し、それにより白血球のライセートを得るステップと、
    を含む方法。
  20. 前記収集チューブを第２収集チューブで置き換えるステップをステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）の間にさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ステップ（ｃ）で前記白血球を溶解した後に、前記第２収集チューブを含む前記装置を遠心処理するステップと、白血球の前記ライセートを前記第２収集チューブ中に収集するステップと、をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記全血試料は治療剤を受けている対象から得られる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記治療剤は抗癌剤である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記全血試料は、前記装置への装填前に治療剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートされる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  25. 少なくとも１つの発癌融合タンパク質及び／又はシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化レベルが白血球の前記ライセートにおいて測定される、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 少なくとも１つの発癌融合タンパク質はＢＣＲ−ＡＢＬを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記装置は複数の濾過デバイスである、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
JP2013554613A 2011-02-17 2012-02-16 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法 Pending JP2014508295A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161444044P 2011-02-17 2011-02-17
US61/444,044 2011-02-17
US201161489998P 2011-05-25 2011-05-25
US61/489,998 2011-05-25
PCT/US2012/025491 WO2012154257A1 (en) 2011-02-17 2012-02-16 Apparatus and method for isolating leukocytes and tumor cells by filtration

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015190265A Division JP6220368B2 (ja) 2011-02-17 2015-09-28 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014508295A true JP2014508295A (ja) 2014-04-03

Family

ID=45809642

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013554613A Pending JP2014508295A (ja) 2011-02-17 2012-02-16 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法
JP2015190265A Expired - Fee Related JP6220368B2 (ja) 2011-02-17 2015-09-28 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015190265A Expired - Fee Related JP6220368B2 (ja) 2011-02-17 2015-09-28 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9535052B2 (ja)
EP (1) EP2675494B1 (ja)
JP (2) JP2014508295A (ja)
KR (1) KR101511889B1 (ja)
CN (1) CN103501832B (ja)
AU (1) AU2012254154B2 (ja)
BR (1) BR112013020992A2 (ja)
CA (1) CA2826643C (ja)
DK (1) DK2675494T3 (ja)
ES (1) ES2587054T3 (ja)
HK (1) HK1189180A1 (ja)
IL (1) IL227778A (ja)
MX (1) MX344673B (ja)
RU (1) RU2578848C2 (ja)
SG (1) SG192270A1 (ja)
WO (1) WO2012154257A1 (ja)
ZA (1) ZA201306947B (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9707326B2 (en) * 2012-07-25 2017-07-18 3M Innovative Properties Company Mobile system for separating donor blood by means of gravitational force
JP6392769B2 (ja) * 2012-11-20 2018-09-19 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨークＴｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ Ｏｆ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｉｔｙ Ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 生体試料を収集するための医療装置および方法
CN103849562B (zh) * 2012-12-05 2015-06-10 北京东方华辉生物医药科技有限公司 一种用于生物样本体外纯化处理的套管
CN104178454B (zh) * 2013-05-24 2019-03-08 益善生物技术股份有限公司 一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法
EP3054001B1 (en) * 2013-09-30 2024-03-20 Sekisui Medical Co., Ltd. Device for concentration and separation of circulating tumor cells, and method for concentration and separation of circulating tumor cells
CN103614339B (zh) * 2013-11-22 2016-08-17 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 一种细胞分离方法
CN103940997B (zh) * 2014-03-21 2017-01-04 上海柏慧康生物科技有限公司 一种乳腺癌循环肿瘤细胞检测***及试剂盒
US9796166B2 (en) 2014-03-24 2017-10-24 Fenwal, Inc. Flexible biological fluid filters
US10376627B2 (en) 2014-03-24 2019-08-13 Fenwal, Inc. Flexible biological fluid filters
US9782707B2 (en) 2014-03-24 2017-10-10 Fenwal, Inc. Biological fluid filters having flexible walls and methods for making such filters
US10159778B2 (en) 2014-03-24 2018-12-25 Fenwal, Inc. Biological fluid filters having flexible walls and methods for making such filters
US9968738B2 (en) 2014-03-24 2018-05-15 Fenwal, Inc. Biological fluid filters with molded frame and methods for making such filters
CN103868918B (zh) * 2014-04-01 2016-06-29 武汉纳达康生物科技有限公司 一种非法添加成分的检测管及检测方法
RU2696484C2 (ru) * 2014-05-14 2019-08-02 ДиЭнЭй ГЕНОТЕК ИНК. Устройство для сбора, транспортировки и хранения биомолекул из биологического образца
PL70912Y1 (pl) * 2014-07-04 2019-08-30 Gorka Andrzej Urządzenie przesiewowe
KR101776245B1 (ko) 2014-11-20 2017-09-11 울산과학기술원 입자 여과 장치 및 입자 여과 방법
ES2818569T3 (es) * 2015-09-09 2021-04-13 Drawbridge Health Inc Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras
US10859563B2 (en) * 2015-12-01 2020-12-08 General Electric Company Erythrocyte aggregation and leukocyte isolation
EP3847965A1 (en) * 2015-12-11 2021-07-14 Babson Diagnostics, Inc. Specimen container and method for separating serum or plasma from whole blood
CN106635769B (zh) * 2016-11-07 2019-06-28 深圳市达科为生物工程有限公司 细胞分离装置以及细胞分离方法
KR20190116979A (ko) 2017-01-10 2019-10-15 드로브릿지 헬스, 인크. 샘플 수집을 위한 장치, 시스템, 및 방법
AU2018212006B2 (en) * 2017-01-30 2020-09-10 Vivebio Scientific, Llc Plasma separation device
RU176517U1 (ru) * 2017-04-25 2018-01-22 Александр Викторович Хаймин Аппарат для получения жизнеспособных лейкоцитов
CN109207340B (zh) * 2017-06-30 2022-08-12 开启基因股份有限公司 核酸萃取组件
EP3470142A1 (de) * 2017-10-11 2019-04-17 Orthogen AG Vorrichtung mit einer ersten kammer zur aufnahme eines körperfluids
RU2669859C1 (ru) * 2018-01-18 2018-10-16 Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Фильтр для сбора биологического материала при эндовитреальных операциях
KR102075422B1 (ko) * 2019-04-05 2020-02-11 주식회사 이뮤니스바이오 세포 회수용 튜브 및 이를 포함하는 주사 키트
RU2728266C1 (ru) * 2019-09-27 2020-07-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) Способ культивирования клеток злокачественных лимфоидных опухолей
US11623034B2 (en) 2020-01-03 2023-04-11 Fenwal, Inc. System and method to lyse and remove red blood cells from a cell product
CN116064218B (zh) * 2023-04-06 2023-08-15 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 一种富集血液异常大细胞的智能装置

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2125027A1 (de) * 1970-05-20 1971-12-02 Wilson Pharm & Chem Corp Vorrichtung zum Abtrennen von wäßrigen Lösungen aus Suspensionen
JPS5628663A (en) * 1979-06-09 1981-03-20 Abimed Analysen Tech Centrifugal separating glass doubling as filtration
JP2005525114A (ja) * 2002-04-24 2005-08-25 ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド 全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置および方法
JP2008503206A (ja) * 2004-05-25 2008-02-07 日立化成工業株式会社 癌感受性を測定する方法
EP2260943A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-15 Innosieve Diagnostics B.V. Microfilter centrifuge tube

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4915848A (en) * 1986-04-21 1990-04-10 Miles Laboratories, Inc. Red blood cell filtering system
US5618829A (en) 1993-01-28 1997-04-08 Mitsubishi Chemical Corporation Tyrosine kinase inhibitors and benzoylacrylamide derivatives
JP3246620B2 (ja) * 1993-02-22 2002-01-15 旭メディカル株式会社 白血球除去フィルター支持体
HUT74451A (en) 1993-07-15 1996-12-30 Cancer Res Campaign Tech Prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors, systems contg. them and process for preparing them
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US5639757A (en) 1995-05-23 1997-06-17 Pfizer Inc. 4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidines as tyrosine kinase inhibitors
US5556544A (en) * 1995-09-08 1996-09-17 Didier; Emmanuel R. Concentrator & filter
DE69710712T3 (de) 1996-04-12 2010-12-23 Warner-Lambert Co. Llc Umkehrbare inhibitoren von tyrosin kinasen
US6145688A (en) * 1996-07-17 2000-11-14 Smith; James C. Closure device for containers
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
US6100254A (en) 1997-10-10 2000-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibitors of protein tyrosine kinases
US6740665B1 (en) 1999-02-10 2004-05-25 Ramachandran Murali Tyrosine kinase inhibitors and methods of using the same
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
CA2376951A1 (en) 1999-06-30 2001-01-04 Peter J. Sinclair Src kinase inhibitor compounds
EP1206260A4 (en) 1999-06-30 2002-10-30 Merck & Co Inc SRC-KINASE INHIBITING COMPOUNDS
DE60006541D1 (de) 1999-06-30 2003-12-18 Merck & Co Inc Src-kinase hemmende verbindungen
ATE309241T1 (de) 1999-09-10 2005-11-15 Merck & Co Inc Tyrosin kinase inhibitoren
TR200201051T2 (tr) 1999-10-19 2002-09-23 Merck & Co., Inc. Tirosin kinaz inhibitörleri.
WO2001028993A2 (en) 1999-10-19 2001-04-26 Merck & Co. Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6794393B1 (en) 1999-10-19 2004-09-21 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6313138B1 (en) 2000-02-25 2001-11-06 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6420382B2 (en) 2000-02-25 2002-07-16 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
FR2814080B1 (fr) * 2000-09-20 2003-02-28 Maco Pharma Sa Dispositif de filtration a plusieurs milieux filtrants et systeme a poches le comprenant
ES2255621T3 (es) 2001-06-22 2006-07-01 MERCK & CO., INC. Inhibidores de tirosina quinasa.
WO2003011836A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6927293B2 (en) 2001-08-30 2005-08-09 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
DE20218503U1 (de) * 2002-11-28 2003-03-06 Macherey Nagel Gmbh & Co Hg Trennvorrichtung zur Behandlung von Biomolekülen
JP2005283356A (ja) 2004-03-30 2005-10-13 Sumitomo Metal Mining Co Ltd 土壌含有量調査試験液を遠心濾過するための方法、機構及び装置
US20060246575A1 (en) 2005-01-13 2006-11-02 Micronics, Inc. Microfluidic rare cell detection device
RU2285543C2 (ru) * 2005-02-02 2006-10-20 Закрытое акционерное общество "Научно-производственное предприятие "ИНТЕРОКО" Устройство для удаления гелей, микроагрегатных частиц и лейкоцитов из продуктов крови
BRPI0717416A2 (pt) 2006-09-21 2013-11-12 Prometheus Lab Inc Método para realizar um imunoensaio complexo de alta produtividade, e, arranjo
MX2009003048A (es) 2006-09-21 2009-09-07 Prometheus Lab Inc Disposiciones a base de anticuerpo para detectar transductores de multiple señal en celulas circulantes raras.
KR101553723B1 (ko) 2007-07-13 2015-09-16 네스텍 소시에테아노님 항체­기반 어레이를 사용한 폐 암 치료를 위한 약물 선별법
ES2545760T3 (es) 2008-02-25 2015-09-15 Nestec S.A. Selección de fármacos para terapia del cáncer de mama utilizando matrices de anticuerpos
FR2934049B1 (fr) * 2008-07-16 2010-10-15 Millipore Corp Unite et procede de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide.
US8301258B2 (en) 2008-08-14 2012-10-30 The Chinese University Of Hong Kong Methods and devices for preventing ankle sprain injuries
US20100053386A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Fujifilm Corporation Imaging device, method of driving imaging device and imaging apparatus
CA2761777A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
AU2010273319B2 (en) 2009-07-15 2015-01-22 Nestec S.A. Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2125027A1 (de) * 1970-05-20 1971-12-02 Wilson Pharm & Chem Corp Vorrichtung zum Abtrennen von wäßrigen Lösungen aus Suspensionen
JPS5628663A (en) * 1979-06-09 1981-03-20 Abimed Analysen Tech Centrifugal separating glass doubling as filtration
JP2005525114A (ja) * 2002-04-24 2005-08-25 ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド 全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置および方法
JP2008503206A (ja) * 2004-05-25 2008-02-07 日立化成工業株式会社 癌感受性を測定する方法
EP2260943A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-15 Innosieve Diagnostics B.V. Microfilter centrifuge tube

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130127513A (ko) 2013-11-22
JP6220368B2 (ja) 2017-10-25
WO2012154257A1 (en) 2012-11-15
KR101511889B1 (ko) 2015-04-13
CA2826643C (en) 2016-04-12
SG192270A1 (en) 2013-08-30
BR112013020992A2 (pt) 2016-10-11
CA2826643A1 (en) 2012-11-15
ES2587054T3 (es) 2016-10-20
MX2013009545A (es) 2014-03-31
DK2675494T3 (en) 2016-07-25
US20130323711A1 (en) 2013-12-05
JP2016029378A (ja) 2016-03-03
RU2578848C2 (ru) 2016-03-27
AU2012254154B2 (en) 2015-11-05
IL227778A (en) 2017-10-31
NZ613971A (en) 2015-06-26
CN103501832A (zh) 2014-01-08
CN103501832B (zh) 2016-10-19
HK1189180A1 (zh) 2014-05-30
MX344673B (es) 2017-01-04
RU2013142287A (ru) 2015-03-27
ZA201306947B (en) 2016-07-27
EP2675494B1 (en) 2016-05-18
AU2012254154A1 (en) 2013-08-22
US9535052B2 (en) 2017-01-03
EP2675494A1 (en) 2013-12-25
IL227778A0 (en) 2013-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6220368B2 (ja) 白血球及び腫瘍細胞を濾過により単離するための装置及び方法
JP6301892B2 (ja) 発癌性融合タンパク質を検出するための近接媒介性アッセイ
US10697967B2 (en) Methods for predicting response of triple-negative breast cancer to therapy
US20170285044A1 (en) Methods for predicting and improving the survival of gastric cancer patients
NZ613971B2 (en) Apparatus and method for isolating leukocytes and tumor cells by filtration

Legal Events

Date Code Title Description
A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20140728

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140902

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20141202

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150526