JP2014507146A - Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質をコードする核酸分子およびそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

ＨＢＶコアタンパク質の新規コンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびに前記タンパク質配列を発現する遺伝子構築物／ベクターおよびワクチンが、本明細書に提供される。提供される核酸配列を用いてＨＢＶに対する免疫応答を生成するための方法も提供される。本発明の幾つかの態様は、そのような核酸分子および／または組成物を個人に投与するステップを含む、１つ以上のＨＢＶ遺伝子型からのコア抗原に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸配列、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質およびそのフラグメント、改善されたＨＢＶワクチン、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導するための方法改善、ならびに個人をＨＢＶに対して予防的および／または治療的に免疫化するための方法改善に関する。

本出願は、参照として本明細書に組み込まれる、２０１１年２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／４４２，１６２号の優先権を主張する。

Ｂ型肝炎は、世界中で流行している一般的な感染症であり、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌の発生につながる。相当数の肝炎症例が、この疾患の無症候性のため、報告されていない。それにもかかわらず、約３億５千万件の慢性Ｂ型肺炎の症例が毎年報告されている。肝炎に感染した人口の大部分は、発展途上国または開発途上国の人々である。

ウイルスは、そのエンベロープタンパク質上に存在する抗原エピトープに基づいて、４つの主な血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に分類される。ゲノム配列の変異に従って、ＨＢＶには少なくとも８つの遺伝子型（Ａ〜Ｈ）が存在する。ＨＢＶの代替の遺伝子型は、流行した地理的分布を有する。

表１ ＨＢＶ遺伝子型の地理的分布。

ＨＢＶゲノムは、主に二本鎖であるが、他方よりも長い一本の鎖から生じる一本鎖の領域を有する、環状ＤＮＡ分子である。二本鎖領域は、約３０２０長のヌクレオチドの短鎖の一本鎖と約３３２０長のヌクレオチドの長鎖の一本鎖とのハイブリダイゼーションから生じる。その長鎖のハイブリダイズされていないヌクレオチド上の一本鎖領域は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼと関連している。ＨＢＶゲノムＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは、両方ともに、複数のＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）分子によって形成されるヌクレオカプシド内に含有される。ＨＢＶコアタンパク質は、ＨＢＶ表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）および脂質分子によってエンベロープされる。

ＨＢＶゲノムは、４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：１）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＯＲＦ、２）２つの開始コドンを有するＯＲＦ（ここで、第２開始コドンに連結された配列は、コアタンパク質をコードし、追加の上流開始コドンを含む配列は、ｐｒｅ−Ｃと呼ばれる配列をコードする）、３）３つの開始コドンを有するＯＲＦ（ここで、１つは、表面タンパク質（ｇｐ２７）をコードし、１つはｐｒｅ−Ｓ２と呼ばれる配列（ｇｐ３６）をコードする上流開始コドンを含み、ｐｒｅ−Ｓ１と呼ばれる配列（ｇｐ４２）をコードする更に上流の開始コドンを含む別のもの）、ならびに４）その機能がよく理解されていないタンパク質であるＨＢｘＡｇをコードするＯＲＦ、を含有する。

ＨＢＶ感染の予防ワクチンおよび治療は、慢性保菌者の血漿から精製されたサブウイルス粒子、または安定的にトランスフェクトされた真核細胞系において組換えタンパク質として産生されたサブウイルス粒子の注射を伴う。サブウイルス粒子はウイルスタンパク質であり、そのようなワクチンは、多くの場合、サブユニットワクチンと呼ばれる。ＨＢＶタンパク質は、個人に投与されて、個人の免疫系の標的になる。非感染の個人では、サブユニットワクチンに対する免疫応答は、ＨＢＶ感染から非感染の個人を保護する。感染した個人では、ワクチンにより誘導される免疫応答は、治療効果を有することができる。

Ｃｈｉｓａｒｉ Ｆ．Ｖ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．，２０００．１５６：１１１７−１１３２およびＰｕｍｐｅｕｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１．４４：９８−１１４は、ＨＢＶゲノム構造を開示する。Ｄｅｎｙ Ｐ．およびＦ．Ｚｏｕｌｉｍ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ２０１０，Ａｕｇ，５８（４）：２４５ ５３は、Ｂ型肝炎ウイルス診断および治療について考察する。Ｍｉｃｈｅｌ Ｍ．Ｌ．およびＰ．Ｔｉｏｌｌａｉｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ２０１０，Ａｕｇ，５８（４）：２８８ ９５は、Ｂ型肝炎ワクチン、ならびにこれらの保護効能および治療可能性について考察する。特許文献１は、ＨＢＶアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含有する免疫原の使用を開示する。特許文献２は、ＨＢＶコード配列、タンパク質、ならびに組換え全長ＨＢＶ表面抗原およびＨＢＶコア抗原を含むワクチンを含むワクチンを開示する。ＨＢＶ表面抗原は、全体として、３種類の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、およびＳタンパク質）から構成される。特許文献３は、ＨＢＶコード配列、タンパク質、およびヒトにおける発現が最適化されたコドンであるＢ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする核酸を含むワクチンを開示する。特許文献４は、組換えベクターを使用するＨＢＶ配列の送達を開示する。

利用可能なＨＢＶワクチンは、いくらかの効能を示すが、産生するには費用がかかる。加えて、血漿誘導サブユニットワクチンも、安全性に関して問題を有する。組換え生ベクター、合成ペプチド、およびＨＢＶタンパク質のコドン最適化コード配列を含むＤＮＡワクチンが含まれる幾つかのワクチン手法が、探求されてきた。これらの他の手法は、今までのところ様々な限定された効能を有してきた。加えて、ゲノムの差に起因して、幾つかのＨＢＶワクチンは、幾つかの地理上の地域において肯定的な効能を示し、他の地域では限定された効能を示した。

動物およびヒトの疾患に対してワクチン接種するための核酸配列の直接投与が研究されており、所望の抗原の必要な発現を生じ、免疫応答をもたらし、最終的にこの技術の成功をもたらすために、多くの努力が、核酸送達の効果的および効率的な手段に焦点を合わせてきた。

ＤＮＡワクチンは内在抗原合成を可能にし、このことは、サブユニットワクチンではめったに得られない、ＣＤ８＋組織適合性複合体のクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球を誘導する。加えて、持続期間にわたって発生する抗原合成は、低い応答性の克服を助け、追加免疫注射の必要性を排除または低減することができる。更に、ＤＮＡワクチンは、非常に安定し、産生することが簡単であると思われる。更に、広範囲の細胞免疫応答は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および免疫グロブリンリーダー配列の付加のような戦略の組み合わせによって誘導することができる。

ＤＮＡワクチンは、安全で、安定しており、容易に産生され、ヒトにおいて十分に許容され、前臨床試験はプラスミド組込みの証拠をほとんど示していない［Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８、Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９］。加えて、ＤＮＡワクチンは、ワクチンの効能がベクターに対する概存抗体価による影響を受けないので、反復投与に十分に適している［Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３］。しかし、ＤＮＡワクチンの臨床適応における１つの主な障害は、より大型の動物に移ったときのプラットフォームの免疫原性の減少である［Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０］。

ＤＮＡワクチン免疫原の操作における最近の技術的進歩は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および免疫グロブリンリーダー配列の付加のような、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性を改善し［Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３、Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９、Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３］、ならびに電気穿孔のようなプラスミド送達系における技術を、最近開発している［Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８、Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９、Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ＤＮＡ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｏｃａｌ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３］。インビボ電気穿孔技術は、ヒト臨床試験においてブレオマイシンのような抗癌薬を送達するため、および多くの前臨床研究において多数の動物種に使用されてきた。加えて、研究は、コンセンサス免疫原の使用が、未変性抗原単独と比較して、細胞免疫応答の幅を拡大できることを示唆している［Ｙａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ−１ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４］。

ＨＢＶ抗原をコードする核酸構築物、およびＨＢＶに対して免疫応答を誘導するのに有用な組成物の必要性が、依然として存在する。経済的であり、効果的である、ＨＢＶに対して効果的なワクチンの必要性が、依然として存在する。中和抗体レベルを増加し、Ｔ細胞成分を誘発する効果的なワクチンの必要性が、依然として存在する。広範囲の遺伝子型を有するＨＢＶ株に対して効果的であるものを含む、ＨＢＶに対して効果的なワクチン、および好ましくは世界中で効果的である汎用ワクチンの必要性が、依然として存在する。

国際公開第２００４／０２６８９９号 国際公開第２００８／０９３９７６号 国際公開第２００９／１３０５８８号 国際公開第２０１０／１２７１１５号

本発明の態様には、ＨＢＶに対して免疫応答を誘導するのに有用なワクチンが含まれる。多数の遺伝子型に対する広範囲の有効性を有するＨＢＶ免疫治療ワクチンの開発は、普遍的に保存されたＨＢＶコア特異的抗原を標的にすることに基づいた、ＨＢＶ感染の治療ＤＮＡワクチンを使用することによってもたらすことができる。コンセンサスＨＢＶ免疫原の利用は、より広範囲の細胞免疫応答を誘導し、異なるウイルス株の間で配列非類似性の程度を最小限にするのに有用であり得る。

本明細書において提供されるものは、配列番号２を含むタンパク質、配列番号２と９５％相同であるタンパク質、配列番号２のフラグメント、配列番号２のフラグメントと９５％相同であるタンパク質、配列番号４、配列番号４と９５％相同であるタンパク質、配列番号４のフラグメント、配列番号４のフラグメントと９５％相同であるタンパク質、配列番号６、配列番号６と９５％相同であるタンパク質、配列番号６のフラグメント、および配列番号６のフラグメントと９５％相同であるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である。

上記に記載された１つ以上のタンパク質分子をコードする配列を含む核酸分子も、提供される。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１、配列番号１と９５％相同である核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントと９５％相同である核酸配列、配列番号３、配列番号３と９５％相同である核酸配列、配列番号３のフラグメント、配列番号３のフラグメントと９５％相同である核酸配列、配列番号５、配列番号５と９５％相同である核酸配列、配列番号５のフラグメント、および配列番号５のフラグメントと９５％相同である核酸配列からなる群から選択される配列を含む。

本発明の幾つかの態様は、そのような核酸分子および／または組成物を個人に投与するステップを含む、１つ以上のＨＢＶ遺伝子型からのコア抗原に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。

本発明の追加的な態様は、個人をＨＢＶ感染から保護する方法を提供する。方法は、そのような核酸配列または組成物を含む核酸分子の予防有効量を前記個人に投与するステップを含み、ここで、核酸配列は、前記個人の細胞において発現され、保護免疫応答は、前記核酸配列によりコードされたタンパク質に対して誘導される。

本発明の幾つかの態様において、ＨＢＶに感染している個人を治療する方法が提供される。方法は、そのような核酸分子および／または組成物の治療有効量を前記個人に投与するステップを含む。

本発明の態様は、追加的に、配列番号２を含むタンパク質、配列番号２と９５％相同であるタンパク質、配列番号２のフラグメント、配列番号２のフラグメントと９５％相同であるタンパク質、配列番号４、配列番号４と９５％相同であるタンパク質、配列番号４のフラグメント、配列番号４のフラグメントと９５％相同であるタンパク質 配列番号６、配列番号６と９５％相同であるタンパク質、配列番号６のフラグメント、および配列番号６のフラグメントと９５％相同であるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質をコードする核酸を含むワクチンに関する。ワクチンは、アジュバントタンパク質またはアジュバントタンパク質をコードする核酸配列を更に含むことができる。幾つかの実施形態において、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはランテスである。

核酸分子を含むワクチンは、配列番号１、配列番号１と９５％相同である核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントと９５％相同である核酸配列、配列番号３、配列番号３と９５％相同である核酸配列、配列番号３のフラグメント、配列番号３のフラグメントと９５％相同である核酸配列、配列番号５、配列番号５と９５％相同である核酸配列、配列番号５のフラグメント、および配列番号５のフラグメントと９５％相同である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子を含むことができる。ワクチンは、アジュバントタンパク質をコードする核酸配列を更に含むことができる。幾つかの実施形態において、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはランテスである。

４つの重複ＯＲＦから構成されるＨＢＶゲノムの構造を示すマップである。 ｐＭコア発現実験の結果を示す。図３Ａは、インビトロ翻訳プロトコールの結果を示す。図３Ｂは、ウエスタンブロットの結果を示す。 ｐＭコア発現実験の結果を示す。図３Ａは、インビトロ翻訳プロトコールの結果を示す。図３Ｂは、ウエスタンブロットの結果を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の大きさの高まりを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の大きさの高まりを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の大きさの高まりを示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌の大きさの高まりを示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌の大きさの高まりを示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌の大きさの高まりを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ分泌の大きさの高まりを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ分泌の大きさの高まりを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ分泌の大きさの高まりを示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるインターフェロン−ガンマＴ細胞応答を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるインターフェロン−ガンマＴ細胞応答を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるインターフェロン−ガンマＴ細胞応答を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるインターフェロン−ガンマＴ細胞応答を示す。 ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における腫瘍壊死因子αＴ細胞応答を示す。 ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における腫瘍壊死因子αＴ細胞応答を示す。 ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における腫瘍壊死因子αＴ細胞応答を示す。 ｐＭコアでワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における腫瘍壊死因子αＴ細胞応答を示す。 ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのデータを示す。 ＣＳＦＥ標識細胞を使用して、ＣＤ８ Ｔ細胞によるペプチド処理標的細胞のインビボでの排除を、ワクチン接種した、およびワクチン接種しなかった動物において比較した実験のデータを示す。 ｐＶａｘベクター（対照）により、またはＨＢＶ Ｍコアを発現するプラスミドｐＭコアにより処理した、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の繁殖率の比較を示す。 ｐＶａｘベクター（対照）により、またはＨＢＶ Ｍコアを発現するプラスミドｐＭコアにより処理した動物からの血清の段階希釈における抗ＨＢＶコア抗体の比較を示す。 ｐＶａｘベクター（対照）により、またはＨＢＶ Ｍコアを発現するプラスミドｐＭコアにより処理した動物からの血清の段階希釈における抗ＨＢＶコア抗体の比較を示す。 脾臓および肝臓の細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋からのＴＮＦ−ａおよびＩＦＮ−ｇの率を示す。 免疫化されたマウスにより誘導されたクリアランスが肝臓に影響を与えたかを、血清中のＡＬＴレベルを測定することにより決定する実験のデータを示す。

１．定義

本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載するだけの目的であり、限定的であることを意図しない。明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈から明白に示されない限り、複数の対象を含む。

本明細書における数値範囲の列挙では、同じ程度の正確さでその間に介在するそれぞれの数が、明確に考慮される。例えば、６〜９の範囲では、７および８の数が６および９に加えて考慮され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数が明確に考慮される。
ａ．アジュバント

「アジュバント」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、ＤＮＡプラスミドおよび本明細書以降に記載されるコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を増強する任意の分子を意味する。
ｂ．抗体

「抗体」は、本明細書で使用されるとき、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの部類の抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄが含まれるそのフラグメント、フラグメント、もしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二官能性抗体、およびその誘導体を意味する。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和精製抗体、または所望のエピトープもしくはそれから誘導される配列に対して十分な結合特異性を示すそれらの混合物であり得る。
ｃ．コード配列

「コード配列」または「コードする核酸」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個人または哺乳動物の細胞において発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に動作可能に連結している開始および終結シグナルを更に含むことができる。
ｄ．補体

「補体」または「相補」は、本明細書で使用されるとき、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列

「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、本明細書で使用されるとき、特定のＨＢＶ抗原の複数の亜型の整列の分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を、調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンを使用して、特定のＨＢＶ抗原の複数の亜群または血清群に対して広範囲の免疫性を誘導することができる。
ｆ．電気穿孔

「電気穿孔」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「電気動力学的促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、本明細書で交換可能に使用されるとき、生体膜内の微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電界パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水のような生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側に通過することを可能にする。
ｇ．フラグメント

「フラグメント」は、本明細書で核酸配列に関して使用されるとき、全長野生型株ＨＢＶ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする、核酸配列またはその一部を意味する。フラグメントは、下記に記載されるタンパク質フラグメントをコードする様々なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡフラグメントであり得る。

「フラグメント」または「免疫原性フラグメント」は、ポリペプチド配列に関して、全長野生型株ＨＢＶ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。コンセンサスタンパク質のフラグメントは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のコンセンサスタンパク質を含むことができる。幾つかの実施形態において、コンセンサスタンパク質のフラグメントは、少なくとも２０個以上のアミノ酸、少なくとも３０個以上のアミノ酸、少なくとも４０個以上のアミノ酸、少なくとも５０個以上のアミノ酸、少なくとも６０個以上のアミノ酸、少なくとも７０個以上のアミノ酸、少なくとも８０個以上のアミノ酸、少なくとも９０個以上のアミノ酸、少なくとも１００個以上のアミノ酸、少なくとも１１０個以上のアミノ酸、少なくとも１２０個以上のアミノ酸、少なくとも１３０個以上のアミノ酸、少なくとも１４０個以上のアミノ酸、少なくとも１５０個以上のアミノ酸、少なくとも１６０個以上のアミノ酸、少なくとも１７０個以上のアミノ酸、少なくとも１８０個以上のアミノ酸のコンセンサスタンパク質を含むことができる。
ｈ．遺伝子構築物

本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。コード配列は、核酸分子が投与される個人の細胞において発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に動作可能に連結している開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用されるとき、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞の中に存在するとき、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に動作可能に連結している必要な調節要素を含有する遺伝子構築物を意味する。
ｉ．同一

「同一」または「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用されるとき、配列が、特定の領域にわたって同じである残基の特定の率を有することを意味する。率は、２つの配列を最適に整列すること、２つの配列を特定の領域にわたって比較すること、同一残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を生じること、一致した位置の数を、特定の領域内の位置の総数で割ること、結果に１００を掛けて、配列同一性の率を生じることによって、計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、または整列が１つ以上の付着末端を生じ、特定の比較領域が、単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較すると、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等であると考慮することができる。同一性は、手作業により、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０のようなコンピューター配列アルゴリズムを使用して実施することができる。
ｊ．免疫応答

「免疫応答」は、本明細書で使用されるとき、ＨＢＶコンセンサス抗原のような抗原の導入に応答した宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、またはその両方の形態であり得る。
ｋ．核酸

「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、一緒に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変種を、所定の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または二本鎖と一本鎖の配列の両方の部分を含有することができる。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであることができ、ここで核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成法により、または組換え法により得ることができる。
ｌ．動作可能に連結する

「動作可能に連結する」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子の発現が、空間的に連結しているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との間隔は、プロモーターが誘導される遺伝子における、プロモーターと、それが制御する遺伝子との間隔とほぼ同じであり得る。当該技術において知られているように、この間隔の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。
ｍ．プロモーター

「プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、細胞において核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成的または天然に誘導される分子を意味する。プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含み、その発現を更に増強し、かつ／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更することができる。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含むことができ、これらは、転写の開始部位から数千塩基対まで位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源から誘導することができる。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構造的に、あるいは発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導作用物質のような外部刺激に応答して、差動的に調節することができる。プロモーターの代表例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。
ｎ．シグナルペプチド

「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載されているＨＢＶタンパク質のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を意味する。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指示する。本明細書において使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、細胞からの分泌の際に、多くの場合成熟タンパク質と呼ばれるタンパク質の残りの部分から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に連結される。タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドまたはリーダー配列を連結することに関して、本明細書に参照されているように、シグナルペプチド／リーダー配列はタンパク質のＮ末端メチオニンと代わり、これは核酸配列の開始コドンでコードされ、次にシグナルペプチドコード配列を有さないタンパク質をコードする。したがって、例えば、配列番号４は、配列番号２のＮ末端に連結されたシグナルペプチド／リーダー配列を有する配列番号２であり、すなわち、配列番号４は、配列番号２のＮ末端に連結されたシグナルペプチドを含むタンパク質である。配列番号２の最初の残基「Ｘａａ」は、シグナルペプチドが存在しない場合、典型的にはメチオニンである。しかし、配列番号４のような、配列番号２に連結されたシグナルペプチドを含むタンパク質は、Ｘａａで残基１のメチオニンを、タンパク質にシグナルペプチドを連結させる残基に代える。したがって、配列番号２のＮ末端残基は、開始配列でコードされる場合、メチオニン以外のいずれかであり得る。配列番号２のＮ末端へのシグナルペプチド／リーダー配列の結合は、典型的には、Ｎ末端メチオニンを排除する。本明細書で使用されるとき、配列番号４は、配列番号２のＮ末端Ｘａａ残基が排除されているにもかかわらず、配列番号２のＮ末端に連結されたシグナルペプチド／リーダー配列を有する配列番号２を含むことが意図される。同様に、配列番号４のコード配列は、配列番号２をコードするコード配列の５’末端に連結したシグナルペプチド／リーダー配列のコード配列を有する配列番号２のコード配列を含む。開始コドンは、配列番号２のコード配列において「ｎｎｎ」であり得るが、シグナルペプチド／リーダー配列のコード配列が、配列番号２をコードするコード配列の５’末端に連結したとき、排除される。本明細書で使用されるとき、配列番号４のコード配列は、ｎｎｎが生じる配列番号２のコード配列の５’末端に連結したシグナルペプチド／リーダー配列のコード配列を有する配列番号２のコード配列を含むことが意図される。したがって、例えば、配列番号３は、ｎｎｎの代わりに、配列番号１の５’末端に連結されたシグナルペプチド／リーダー配列のコード配列を有する配列番号１を含むことが意図される。幾つかの実施態様において、ｎｎｎは、配列番号１の５’末端の開始コドンである。
ｏ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用されるとき、核酸の複合混合物におけるように、第１核酸配列（例えば、プローブ）が第２核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、確定されたイオン強度のｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択することができる。Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡（標的配列がＴ_ｍで過剰に存在するので、５０％のプローブが平衡を占める）でハイブリダイズする温度（確定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下）であり得る。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度のような約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短プローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、約５０個を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特定的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣでの洗浄および６５℃での０．１％ＳＤＳ。
ｐ．実質的に相補的

「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、第１配列が第２配列の補体と、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１８０個、２７０個、３６０個、４５０個、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
ｑ．実質的に同一

「実質的に同一」は、本明細書で使用されるとき、第１配列および第２配列が、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１８０個、２７０個、３６０個、４５０個、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、あるいは第１配列が第２配列の補体と実質的に相補的である場合、核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。
ｒ．亜型または血清型

「亜型」または「血清型」は、本明細書で使用されるとき、交換可能に、ＨＢＶを参照して、１つの亜型が異なる亜型と別に免疫系により認識されるような、ＨＢＶの遺伝子変種を意味する。
ｓ．変種

「変種」は、核酸に関して本明細書で使用されるとき、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部もしくはフラグメント、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の補体もしくはその一部、（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下、参照核酸、その補体もしくはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。

「変種」は、ペプチドまたはポリペプチドに関して、アミノ酸の挿入、欠失、または保存置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。変種は、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質も意味する。アミノ酸の保存置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸と代えることは、典型的には僅かな修正を伴って、当該技術において認識されている。これらの僅かな修正は、部分的には、当該技術において理解されているようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することにより確認することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換して、依然としてタンパク質機能を保持できることは、当該技術において知られている。１つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、タンパク質の生物学的活性の保持をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、抗原性および免疫原性と十分相関することが報告されている有用な測度である、ペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は参照として本明細書に組み込まれる。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、ペプチドが生物学的活性、例えば免疫原性を保持することをもたらし、このことは当該技術において理解されている。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に匹敵するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の特性により明らかなように、アミノ酸、特にこれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存していることが理解される。
ｔ．ベクター

「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、複製の起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであることができ、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
２．ＨＢＶコア抗原

ＨＢＶコアタンパク質は、交差提示のために、１）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、２）Ｔヘルパー細胞応答、および／もしくは３）Ｂ細胞応答、または好ましくは前述の全てを誘導する免疫仲介ウイルスクリアランスの重要な標的を提示する。

表２は、ＨＢＶ−Ａ、ＨＢＶ−Ｂ、ＨＢＶ−Ｃ、ＨＢＶ−Ｄ、およびＨＢＶ−Ｅ遺伝子型のコア抗原と、表で「ＨＢＶ−Ｍコア」と呼ばれるコンセンサスＨＢＶコアタンパク質の遺伝子型の類似性を示す。幾つかの実施形態において、ＨＢＶ Ｍコア構築物は、広範囲のＨＢＶコア標的に増大した相同性を有するように設計された。設計されたＭコア構築物を有するコア抗原の遺伝子型の類似性は、広範囲のＨＢＶコア標的に対する相同性を増大した。全ての遺伝子型は、ＨＢＶの汎用免疫治療ワクチンにおいて提示されるべきである。

本明細書において提供されるものは、哺乳動物において１つ以上のＨＢＶ血清型に対して免疫応答を誘発できる抗原である。抗原は、抗ＨＢＶ免疫応答が誘導され得る免疫原として特に効果的になる、コアタンパク質エピトープを含むことができる。ＨＢＶ抗原は、全長翻訳産物、その変種、そのフラグメント、またはその組み合わせを含むことができる。

コンセンサスＨＢＶコアタンパク質（配列番号２）が提供される。ＨＢＶコアタンパク質コンセンサス配列のＮ末端にＩｇＥリーダーを含むアミノ酸配列が生成された。したがって、同じく提供されるものは、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質（配列番号２）に連結してＩｇＥリーダーコンセンサスＨＢＶコアタンパク質（配列番号４）を提供する、ＩｇＥリーダー（配列番号７）を有するタンパク質である。提供される幾つかの実施形態は、ＨＢＶコアタンパク質コンセンサス配列のＣ末端に連結されたＨＡタグ（配列番号８）も含む。したがって、ＨＢＶコアタンパク質コンセンサス配列（配列番号２）に連結されたＩｇＥリーダー（配列番号７）およびＨＢＶコアタンパク質コンセンサス配列のＣ末端に連結されたＨＡタグ（配列番号８）を含む、ＨＢＶコアタンパク質コンセンサスタンパク質（配列番号６）が提供される。

タンパク質は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６と相同であり得る。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列に９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列に９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列に９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列に９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列に９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。

幾つかの実施形態において、タンパク質はリーダー配列を含まない。幾つかの実施形態において、タンパク質はＩｇＥリーダーを含まない。コンセンサスタンパク質のフラグメントは、コンセンサスタンパク質を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含むことができる。配列番号２、配列番号４、および配列番号６の免疫原性フラグメントを提供することができる。免疫原性フラグメントは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含むことができる。幾つかの実施形態において、フラグメントは、例えば、ＩｇＥリーダーのような免疫グロブリンリーダーのようなリーダー配列を含む。幾つかの実施形態において、フラグメントはリーダー配列を含まない。幾つかの実施形態において、フラグメントは、リーダー配列ＩｇＥリーダーを含まない。

配列番号２、配列番号４、および配列番号６のアミノ酸配列相同性の免疫原性フラグメントを有するタンパク質の免疫原性フラグメントを提供することができる。そのような免疫原性フラグメントは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６と９５％相同であるタンパク質を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含むことができる。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性フラグメントに９６％の相同性を有する免疫原性フラグメントに関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性フラグメントに９７％の相同性を有する免疫原性フラグメントに関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性フラグメントに９８％の相同性を有する免疫原性フラグメントに関する。幾つかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性フラグメントに９９％の相同性を有する免疫原性フラグメントに関する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、例えば、ＩｇＥリーダーのような免疫グロブリンリーダーのようなリーダー配列を含む。幾つかの実施形態において、フラグメントはリーダー配列を含まない。幾つかの実施形態において、フラグメントは、リーダー配列ＩｇＥリーダーを含まない。
３．遺伝子配列、構築物、およびプラスミド

配列番号２、配列番号４、および配列番号６、ならびに相同性タンパク質、免疫原性フラグメント、および相同性タンパク質の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を、日常的に生成することができる。したがって、コンセンサス配列に９５％までの相同性、コンセンサス配列に９６％までの相同性、コンセンサス配列に９６％までの相同性、コンセンサス配列に９７％までの相同性、コンセンサス配列に９８％までの相同性、およびコンセンサス配列に９９％までの相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子を提供することができる。同様に、本明細書に記載されている免疫原性フラグメントおよび本明細書に記載されているタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列も、提供される。

コンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸分子が生成された。ワクチンは、ヒトにおいて安定性および発現が最適化されるように生成された配列の群から選択される１つ以上のコンセンサス型免疫原性タンパク質をコードする、１つ以上の核酸配列を含むことができる。ＨＢＶコアタンパク質コンセンサスタンパク質（配列番号２）をコードする核酸配列（配列番号１）、ＩｇＥリーダーＨＢＶコアタンパク質コンセンサスタンパク質（配列番号４）をコードする核酸配列（配列番号３）、およびＩｇＥリーダーＨＢＶコアタンパク質コンセンサスタンパク質ＨＡタグ（配列番号６）をコードする核酸配列（配列番号５）。幾つかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列に９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。幾つかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列に９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。幾つかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列に９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。幾つかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列に９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。幾つかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列に９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるコンセンサスタンパク質のコード配列に相同である本明細書に開示されるコード配列を有する核酸分子は、本明細書に開示される相同性タンパク質配列をコードするコード配列の５’末端に連結されたＩｇＥリーダー配列をコードする配列を含む。

幾つかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。幾つかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。

幾つかの実施形態は、配列番号１、配列番号３、および配列番号５のフラグメントに関する。フラグメントは、配列番号１、配列番号３、および配列番号５の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。フラグメントは、配列番号１、配列番号３、および配列番号５のフラグメントと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同であり得る。幾つかの実施形態において、フラグメントは、例えば、ＩｇＥリーダーのような免疫グロブリンリーダーのようなリーダー配列をコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、フラグメントは、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。幾つかの実施形態において、フラグメントは、リーダー配列ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。

本明細書において提供されるものは、コンセンサスタンパク質配列、コンセンサスタンパク質配列と相同の配列、コンセンサスタンパク質配列のフラグメント、およびコンセンサスタンパク質配列のフラグメントと相同の配列が含まれる、開示されるＨＢＶコア抗原をコードする核酸配列を含むことができる、遺伝子構築物である。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞に存在することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドを含む線状微小染色体であり得る。

遺伝子構築物は、また、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルス、および組換えワクチンが含まれる組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、細胞内に生存する弱毒生微生物または組換え微生物ベクターの遺伝子材料の一部であり得る。

遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現の調節要素を含むことができる。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

核酸配列は、ベクターになり得る遺伝子構築物を構成することができる。ベクターは、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で哺乳動物の細胞内に抗原を発現することができる。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができる。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、細胞を、抗原をコードする核酸でトランスフェクトするのに有用であることができ、形質転換された宿主細胞は培養され、抗原の発現が生じる条件下で維持される。

コード配列を、発現の安定性および高いレベルのために最適化することができる。幾つかの場合において、コドンは、分子内結合によって形成されるようなＲＮＡの二次構造形成を低減するために選択される。

ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができ、抗原コード配列の上流にあり得る開始コドン、および抗原コード配列の下流にあり得る終止コドンを更に含むことができる。開始および終結コドンは、抗原コード配列と共にフレーム内にあり得る。ベクターは、抗原コード配列と動作可能に連結しているプロモーターを含むこともできる。抗原コード配列と動作可能に連結しているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターのようなサイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、また、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターであり得る。プロモーターは、また、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されており、その内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

ベクターは、ＨＢＶコアタンパク質コード配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルを含むこともできる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβグロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。

ベクターは、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質コード配列の上流にエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶのうちの１つのようなウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能の増強は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および国際公開公報第９４／０１６７３７号に記載されており、それぞれの内容は参照として完全に組み込まれる。

ベクターは、ベクター染色体外性を維持し、細胞内にベクターの複数のコピーを産生するため、哺乳類の複製の起点を含むこともできる。ベクターは、エプスタイン・バーウイルスの複製の起点を含むことができるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４、および組込みなしで高コピーエピソーム複製を生じることができる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域であり得る。ベクターは、ｐＶＡＸ１、または本明細書に記載されている変種プラスミドのような変化を有するｐＶａｘ１変種であり得る。変種ｐＶａｘ１プラスミドは、主鎖ベクタープラスミドｐＶＡＸ１の２９９８塩基対変種である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置している。Ｔ７プロモーター／初回抗原刺激部位は、塩基６６４〜６８３にある。多重クローニング部位は、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン抵抗性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣ起点は、塩基２３２０〜２９９３にある。

Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づいて、以下の突然変異体がｐＶＡＸ１の配列において見出され、これを本明細書に記載されたプラスミド１〜６のセットの主鎖として使用した：
Ｃ＞Ｇ ２４１ ＣＭＶプロモーター、
Ｃ＞Ｔ １９４２ 主鎖、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）の下流、
Ａ＞− ２８７６ 主鎖、カンマイシン遺伝子の下流、
Ｃ＞Ｔ ３２７７ ｐＵＣの複製の起点（複製起点）高コピー数突然変異体（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８５を参照すること）、
Ｇ＞Ｃ ３７５３ ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ複製起点の最末端、
塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の主鎖においてＡＣＴからＣＴＧに変わる。
ベクターの主鎖は、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製欠損アデノウイルス型５（Ａｄ５）ベクターであり得る。

ベクターは、ベクターが投与される哺乳類またはヒトの細胞における遺伝子発現に十分に適切であり得る調節配列を含むこともできる。コンセンサスＨＢＶコード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含むことができる。

ベクターは、エシェリキア・コリ（大腸菌）におけるタンパク質産生に使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）であり得る。ベクターは、酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株におけるタンパク質産生に使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）でもあり得る。ベクターは、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用することができる、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。ベクターは、参照として完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む、日常的な技術および容易に入手可能な出発材料によりタンパク質を産生する発現ベクターまたは系であり得る。
４．薬学的組成物

本明細書において提供されるものは、約１ナノグラムから約１０ｍｇのＤＮＡを含む、本発明による薬学的組成物である。幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ、またはそれ以上；および２）１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム以下、または１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム以下、または１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ以下を含む。幾つかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラムから約１０ｍｇのＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ナノグラムから約５ｍｇのＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ナノグラムから約１ｍｇのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラムから約１００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０マイクログラムから約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５マイクログラムから約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ナノグラムから約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ナノグラムから約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。

本発明の薬学的組成物は、使用される投与様式に従って処方される。薬学的組成物が注射用薬学的組成物である場合、これらは滅菌で発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張製剤が好ましく使用される。一般に、等張のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。幾つかの場合において、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。幾つかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。

好ましくは、薬学的組成物はワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。

本明細書に提供されるものは、哺乳動物において、１つ以上の遺伝子型のＨＢＶに対して免疫応答を生成することができるワクチンである。ワクチンは、上記に記載された遺伝子構築物を含むことができる。

科学的理論に束縛されることはないが、ワクチンを使用して、１つ以上の遺伝子型のＨＢＶに対して広範囲に免疫応答（液性、細胞性、または両方）を誘発することができる。ワクチンは、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質配列のコード配列（配列番号２）、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質配列に連結したＩｇＥリーダー（配列番号４）、およびＨＡタグ配列に連結したコンセンサスＨＢＶコアタンパク質に連結したＩｇＥリーダー（配列番号６）を含むことができる。ワクチンは、（配列番号１）のようなコンセンサスＨＢＶコアタンパク質配列の特定のコード配列（配列番号２）、（配列番号３）のようなコンセンサスＨＢＶコアタンパク質配列に連結したＩｇＥリーダー（配列番号４）、および（配列番号５）のようなＨＡタグ配列に連結したコンセンサスＨＢＶコアタンパク質に連結したＩｇＥリーダー（配列番号６）を含むことができる。

幾つかの代替的な実施形態には、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質に相同の１つ以上のタンパク質、およびコンセンサスＨＢＶコアタンパク質に相同の１つ以上のタンパク質の免疫原性フラグメントを含むものが含まれる。

幾つかの実施形態は、本明細書に記載されている１つ以上の組成物を個人に投与することを含む、ＨＢＶコアタンパク質に対して免疫応答を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態は、本明細書に記載されている１つ以上の組成物を投与することを含む、ＨＢＶ感染に対して個人を予防的にワクチン接種する方法を提供する。幾つかの実施形態は、本明細書に記載されている１つ以上の組成物を投与することを含む、ＨＢＶに感染した個人を治療的にワクチン接種する方法を提供する。投与する前のＨＢＶ感染の診断は、日常的に実施することができる。

ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列を含む、複数の同じまたは異なるプラスミドを含むことができる。

ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に記載されており、これらは参照として完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれることを阻害する要素または試薬を更に含むことができる。ワクチンは、ＨＢＶコアタンパク質のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンを細胞に導入することができる。

ワクチンは、上記に記載された遺伝子構築物または抗原を含む組換えワクチンであり得る。ワクチンは、１つ以上のタンパク質サブユニットの形態の１つ以上のコンセンサスＨＢＶコアタンパク質、１つ以上のコンセンサスＨＢＶコアタンパク質を含む１つ以上の死滅ウイルス粒子、または１つ以上のコンセンサスＨＢＶコアタンパク質を含む１つ以上の弱毒化ウイルス粒子を含むこともできる。弱毒化ワクチンは、弱毒化生ワクチン、死菌ワクチン、および１つ以上のコンセンサスＨＢＶコアタンパク質をコードする外来遺伝子を送達する組換えベクターを使用するワクチン、ならびにサブユニットおよび糖タンパク質ワクチンであり得る。弱毒化生ワクチン、外来抗原を送達する組換えベクターを使用するもの、サブユニットワクチン、および糖ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号に記載されており、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。

ワクチンは、世界中の複数の特定の地域からの複数のＨＢＶ遺伝子型に向けられているベクターおよび／またはタンパク質を含むことができる。提供されるワクチンを使用して、治療または予防免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができ、これらはコンセンサスＨＢＶコアタンパク質に対して、またＨＢＶウイルスの複数の遺伝子型にわたって広く向けられる。そのような抗体および細胞を単離することができる。

ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤を更に含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンのような小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子が含まれ得るトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤であり得る。

トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在する。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンのような小胞を含むことができ、ヒアルロン酸を遺伝子構築物と共に投与に使用することもできる。幾つかの実施形態において、ＤＮＡベクターワクチンは、脂質、レクチンリポソーム、もしくはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、国際公報第０９３２４６４０号を参照すること）のような当該技術において既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子のようなトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含むこともできる。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

薬学的に許容される賦形剤はアジュバントであり得る。アジュバントは、ワクチンにおいて、代替的なプラスミドに発現される、または上記のプラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される、他の遺伝子であり得る。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞攻撃ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、Ｄ８６（ＩｇＥからのシグナル配列を欠失し、場合によりシグナルペプチドを含むＩＬ−１５が含まれる）からなる群から選択される。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはこれらの組み合わせであり得る。

有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ランテス、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびこれらの機能的フラグメントをコードするものが含まれる。
５．送達の方法

本明細書において提供されるものは、ＨＢＶウイルス感染に対する免疫応答が誘導され得る特に有効な免疫原となるエピトープを含む、ＨＢＶコアタンパク質の遺伝子構築物およびタンパク質を提供する薬学的製剤、好ましくはワクチンを送達する方法である。ワクチンを送達する、またはワクチン接種の方法は、治療的および／または予防的な免疫応答を誘導するために提供することができる。ワクチン接種の方法は、複数のＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を哺乳動物において生成することができる。ワクチンを個体に送達して、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強することができる。ワクチンの送達は、細胞内で発現され、細胞の表面に送達され、その時点で免疫系が認識し、細胞性、液性、または細胞性および液性の応答を誘導する核酸分子としてのＨＡ抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの送達は、本明細書に考察されているワクチンを哺乳動物に投与して、複数のＨＢＶウイルスに対する免疫応答を哺乳動物に誘導および誘発することに使用できる。

哺乳動物へのワクチンの送達、その結果としての哺乳動物の細胞へのベクターの送達によって、トランスフェクトされた細胞は、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質を発現および分泌する。これらの分泌タンパク質または合成抗原は、免疫系により外来性であると認識され、抗原に対して作製された抗体、および抗原に対して特異的なＴ細胞応答が含まれ得る免疫応答を開始する。幾つかの例では、本明細書において考察されたワクチンでワクチン接種された哺乳動物は、初回抗原刺激免疫系を有し、ＨＢＶウイルス株を負荷したとき、初回抗原刺激免疫系は、体液性、細胞性、または両方のいずれかにかかわらず、続くＨＢＶウイルスの急速な除去を可能にする。ワクチンを個体に送達して、個体の免疫系の活性を調節し、それにより免疫応答を増強することができる。

ワクチンをＤＮＡワクチンの形態で送達することができ、ＤＮＡワクチンを送達する方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、両方とも参照として完全に組み込まれる。

ワクチンを哺乳動物に投与して、免疫反応を哺乳動物に誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
ａ．併用治療

薬学的組成物、好ましくは本明細書に記載されているワクチンは、タンパク質または遺伝子コードアジュバントと組み合わせて投与することができ、これらには、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ランテス、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、もしくはＴＡＰ２、またはこれらの機能性フラグメントが含まれ得る。
ｂ．投与経路

ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入、口腔内投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内 鞘内、および関節内、またはこれらの組み合わせを含む異なる経路で投与することができる。獣医学的使用では、組成物を、通常の獣医学の診療に適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波のような他の物理的方法により投与することができる。

ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔を用いるおよび用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルス、および組換えワクシニアのようなリポソーム仲介、ナノ粒子促進組換えベクターを含む幾つかの周知の技術により哺乳動物に送達することができる。ＨＢＶ抗原は、ＤＮＡ注入を介し、インビボ電気穿孔を伴って送達することができる。
ｃ．電気穿孔

ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、細胞膜に可逆的細孔を形成させるのに有効なエネルギーのパルスを、哺乳動物の組織に送達すように構成され得る電気穿孔装置を使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、使用者により予め設定された電流入力と同様の定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリーまたはハンドルアセンブリーを含むことができる。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録器、入力要素、状況報告要素、通信ポート、記憶装置構成要素、電源、および電源スイッチが含まれる、電気穿孔装置の様々な要素の１つ以上を含み、組み込むことができる。電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔機（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用することにより達成され、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進することができる。

本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進することができる電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．による米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものが含まれ、これらの内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達の促進に使用することができる他の電気穿孔装置および電気穿孔法には、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号の特許法１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号において提供されたものが含まれ、これらはその全体が参照として組み込まれる。

Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール式電極システムおよびこれらの使用を記載する。モジュール式電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能定電流パルス制御装置から複数の針電極へ導電性インクを提供する電気コネクタ、および電源を含むことができる。操作者は、支持構造に装填された複数の針電極を掴み、それらを身体または植物の選択された組織の中にしっかりと挿入することができる。次に生体分子は、選択された組織内に皮下注射針を介して送達される。プログラム可能定電流パルス制御装置を作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に適用される。適用された定電流電気パルスは、複数の電極の間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全ての内容は、参照として本明細書に組み込まれる。

Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．により提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用される電気穿孔装置を記載する。電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアにより特定される動電学的装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、電極配列の間に一連のプログラム可能定電流パルスパターンを、使用者の制御およびパルスパラメータの入力に基づいて生成し、電流波形データの記憶および取得を可能にする。電気穿孔装置は、また、針電極の配列を有する交換可能な電極ディスク、注入針の中央注入チャンネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全ての内容は、参照として本明細書に組み込まれる。

電極配列および方法は、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、米国特許公開第２００５／００５２６３０号を、筋肉のような組織のみならず、他の組織または臓器の中にも深く侵入するように適合させることができる。電極配列の構成のため、注入針（選択された生体分子を送達する）も、標的臓器の中に完全に挿入され、注入は、電極により予め描かれた領域内の標的組織に対して垂直に施用される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは長さが２０ｍｍであり、ゲージが２１である。

加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込む幾つかの実施形態において考慮されるように、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載される電気穿孔装置が存在する。更に、様々な装置のいずれかを使用したＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注入する方法を描写する２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を網羅する特許が、本明細書において考慮される。上記の特許は、その全体が参照として組み込まれる。
ｄ．ワクチンを調製する方法

本明細書において提供されるものは、本明細書で考察されているＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製する方法である。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類発現プラスミドへの最終サブクローニングステップの後、当該技術において既知の方法を使用して、大規模発酵タンク中の細胞培養物への接種に使用することができる。

本発明のＥＰ装置で使用されるＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して処方および製造することができるが、好ましくは、これらは２００７年５月２３日出願の米国公開出願第２００９０００４７１６号に記載されている最適化プラスミド製造技術を使用して製造される。幾つかの例において、これらの研究に使用されるＤＮＡプラスミドを、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方することができる。製造技術は、また、契約対象特許である２００７年７月３日出願の米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものに加えて、当業者に一般的に既知の様々な装置およびプロトコールを含む、または組み込む。上記に参照された出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明を下記の実施例において更に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためにのみ提示されていることを理解するべきである。上記の考察および例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って様々な用途および条件に適合させることができる。したがって、本明細書において示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前記の記載から当業者には明白である。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることも意図される。

コンセンサスＨＢＶコアタンパク質は、ＨＢＶ修飾またはＭコア構築物とも呼ばれ、ＨＢＶ遺伝子型のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥからのエピトープ配列により設計した。これらの遺伝子型からのＨＢＶコアタンパク質配列は、広範囲の遺伝子型に対して免疫を誘導し、したがってＨＢＶの汎用ワクチンをもたらすコンセンサスコアの構成物に含まれるように選択した。幾つかの実施形態において、Ｍコア構築物の修飾は、ＩｇＥリーダー配列の付加を含んだ。幾つかの実施形態では、Ｍコアタンパクを、増強発現のためのコドン最適化およびＲＮＡ最適化の使用によりコードした。

ＩｇＥリーダーおよびＨＡタグを有するＭコア配列をコードする核酸配列（配列番号５）を、発現ベクターｐＶＡＸにクローンして、構築物ｐＭコアを生じた。インビトロ発現試験をｐＭ構築物の使用により実施し、ｐＶＡＸを対照として使用した。陽性発現を示す結果を、図２Ａおよび２Ｂに示されているゲル画像で表す。

Ｃ５７ＢＬ／６トランスジェニックマウスを、それぞれ４匹のマウスの２群に分け、２週間に１回の間隔で２０μｇのＤＮＡによる３回の電気穿孔免疫化に使用した（群１−ｐＶＡＸベクター対照、群２ ｐＭコア）。マウスを、０日目、１４日目、２８日目に免疫化し、３５日目に殺処理した。脾臓、肝臓、および血清を、殺処理した動物から採取した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統のインビボ研究は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマＴ細胞（ＩＦＮ−γ）、ならびに脾臓から取ったＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａの分泌の大きさに高まりを示す。図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭコアによるＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン接種が、脾臓からのＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の大きさを高めたことを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ｐＭコアによるＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン接種が、脾臓からのＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−α分泌の大きさを高めたことを示す。図５Ａおよび５Ｂは、ｐＭコアによるＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン接種が、脾臓からのＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ分泌の大きさを高めたことを示す。

肝臓へのＨＢＶ特異的Ｔ細胞移動も、ｐＭコアＤＮＡワクチンを投与した動物において示された。高頻度でのＨＢＶコア抗原特異的Ｔ細胞の標的化、および肝臓に対するエフェクター機能は、ＨＢＶ免疫療法の開発の重要な目標である。免疫化の後、動物を殺処理し、肝臓を取り出し、肝臓へのＨＢＶ特異的エフェクターＴ細胞移動を決定した。結果は、ｐＭコアワクチンがエフェクターＴ細胞をインビボで肝臓に駆動することを示す。図６Ａおよび６Ｂは、インターフェロン−γＴ細胞肝臓応答を示す。図７Ａおよび７Ｂは、ｐＭコアのワクチン接種によりもたらされる腫瘍壊死因子α肝臓免疫応答およびに上昇した応答を示す。

ＭコアＤＮＡ構築物によりコードされるｐＭコアコンセンサス免疫原は、強力に平衡したＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を駆動する。誘導されたＴ細胞は、高頻度で肝臓に移動し、ＨＢＶ感染後の免疫クリアランスのために正確なエフェクター表現型を示す。

図８は、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを使用した、ｐＭコアにより誘導される細胞性免疫応答を示す。脾細胞を、ｐＭコアの全長におよび、８個のアミノ酸と重複する、１５ｍｅｒペプチドの２つのプールで刺激した。Ｒ１０培地中の２００，０００個の脾細胞を、９６ウエルＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）被覆プレートで平板培養し、特定のペプチドプールの存在により５％ＣＯ_２中、３７℃で一晩刺激した。細胞を洗浄し、プレートを、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）と共に一晩インキュベートした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ、５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩、およびニトロブルーテトラゾリウムクロリドを連続的に使用して、スポットを発生させた。スポットは、自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り機（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用してカウントした。図８に示されているように、ｐＭコアによる免疫化は、強力な細胞性免疫応答を誘導することができた。データは、主要なエピトープがペプチドプール２に偏っていることを示した。平均ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答は、脾細胞百万個あたり約２０００（±２１０）ＳＦＵであった。

インビボ細胞傷害性アッセイにおいて、研究は、フローサイトメトリーと組み合わせたカルボキシフルオセイン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化を使用して実施した。細胞個体群の細胞における細胞***を評価した。脾細胞を未処置マウスから単離し、２つの個体群に分けた。ＣＦＳＥで高く標識した一方の個体群を、関連するペプチド（例えば、ＨＢＶコアペプチド）でパルスした。ＣＦＳＥで低く標識した他方の個体群を、関連性のないペプチド（例えば、ＨＣＶ ＮＳ３ペプチド）でパルスした。標識したペプチド処理細胞を組み合わせ、フロー分析が実施される養子移入実験に使用した。処理した標識化標的細胞の組み合わせた群を、対照群と免疫群の２群のマウスに投与した。脾細胞をそれぞれの群のマウスから単離し、試料をフローサイトメトリーかけた。ＣＦＳＥの量を測定した。典型的には、そのような実験において２つのピークが形成され、第１は関連性のないペプチドであり、第２は、ピークにおいてより大きいＣＦＳＥを示している免疫ペプチドである。

図９は、ワクチン接種により誘導されたＣＤ８ Ｔ細胞が、インビボで標的細胞を特異的に排除できることを示す。結果は、未処置マウスの脾臓および肝臓の試料が、関連性のないペプチドおよび関連するペプチドのピークにおける細胞とほぼ等しい量を含有したことを示し、一方、結果は、免疫化群のうち、関連するペプチドでパルスしたものから誘導された細胞のピークが、関連性のないペプチドより有意に低いことを明確に示す。これらのデータは、ＨＢＶペプチドで処理された標的細胞が、ＨＢＶワクチンで免疫化されたマウスにおいて特異的に排除されたが、非免疫化マウスでは排除されなかったことを示す。関連性のないペプチドで処理された標的細胞の排除は、仮にあったとしても、ＨＢＶワクチンで免疫化されたマウスと非免疫化マウスでは同じであり、ＨＢＶペプチドで処理された標的細胞の排除より有意に少なかった。

図１０は、ＣＦＳＥ標識化を使用するＴ細胞繁殖アッセイから集めたデータを示す。ｐＶａｘベクター（対照）により、またはＨＢＶ Ｍコアを発現するプラスミドｐＭコアにより処理した、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の繁殖率を比較した。簡潔には、単離された脾細胞を、製造会社の説明書に従ってカルボキシフルオセイン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。染色された細胞を生理食塩水で３回洗浄し、ｐＭコア特異的重複ペプチドで刺激した。細胞を３７℃で９６時間インキュベートした。４８時間後、５０％の培養培地を取り出し、新たなＲ１０に代えた。４日目に細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８特異的モノクローナウ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。細胞を、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を有するＰＢＳで固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得した。データをＦｌｏｗＪｏプログラムの使用により分析した。低ＣＦＳＥおよび中ＣＦＳＥ個体群を繁殖細胞と考慮した。図１０に示されているように、脾臓から単離されたＣＤ３＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞と比較してより多く繁殖した。

図１１Ａおよび１１Ｂは、ｐＶａｘベクター（対照）により、またはＨＢＶ Ｍコアを発現するプラスミドｐＭコアにより処理した動物からの血清の段階希釈における抗ＨＢＶコア抗体の比較を示すＥＬＩＳＡデータである。簡潔には、高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、１μｇ／ｍｌのＰＢＳ中ＨＢｃＡＧタンパク質により４℃で２４時間被覆し、次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより室温で２時間ブロックした。段階的に希釈した血清試料をウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、結合血清抗体を、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（図１１Ａ）またはＩｇＡ（図１１Ｂ）で明らかにした。ペルオキシダーゼ結合Ａｂを、テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用して検出し、４５０ｎｍでのＯＤを、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで測定した。免疫化マウスから集めた血清における抗原特異的液性応答が、観察された。

図１２は、脾臓および肝臓の細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの率を示す。

ＨＢＶの小型動物モデルが不在であるので、ＨＢｃＡｇを使用し、流体力学的注入を介してマウスの肝臓に一過的にトランスフェクトした。免疫化マウスの肝臓に、ｐＭコアまたはＨＣＶ ＮＳ３／４Ａのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後の免疫組織化学的染色は、ＮＳ３／４Ａでトランスフェクトしたものと比較して、ＨＢｃＡｇトランスフェクト肝細胞のクリアランスを示した。血清中のＡＬＴレベルを測定して、免疫化マウスにより誘導されたクリアランスが肝損傷を引き起こさなかったことを確実にした。図１３の結果は、免疫化マウスにより誘導されたクリアランスが肝損傷を引き起こさなかったことを示す。

Claims (23)

1. 配列番号２を含むタンパク質、配列番号２と９８％相同であるタンパク質、少なくとも２０個のアミノ酸であり、配列番号２を含むタンパク質の免疫原性フラグメント、および少なくとも２０個のアミノ酸である配列番号２と９８％相同であるタンパク質の免疫原性フラグメントからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含む、核酸分子。
2. 前記タンパク質のＮ末端に連結されるシグナルペプチドを更に含む、請求項１に記載の核酸分子。
3. 配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
4. 配列番号１を含む核酸配列、配列番号１と９８％相同である核酸配列、配列番号１によってコードされる、少なくとも２０個のアミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を含むそのフラグメント、および配列番号１によってコードされるタンパク質と９８％相同であるタンパク質の少なくとも２０個のアミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を含むそのフラグメントからなる群から選択される１つ以上の配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
5. 前記核酸配列の５’末端に連結されるシグナルペプチドを更に含む、請求項１に記載の核酸分子。
6. 配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
7. 前記核酸分子がプラスミドである、請求項１に記載の核酸分子。
8. 前記核酸分子が発現ベクターであり、前記１つ以上のタンパク質をコードする配列が調節要素に動作可能に連結される、請求項１に記載の核酸分子。
9. 前記核酸分子がウイルス粒子に組み込まれる、請求項１に記載の核酸分子。
10. 配列番号２を含むタンパク質の前記免疫原性フラグメントが、少なくとも６０個、少なくとも１２０個、または少なくとも１８０個のアミノ酸である、請求項１に記載の核酸分子。
11. 配列番号２と９８％相同であるタンパク質の前記免疫原性フラグメントが、少なくとも６０個、少なくとも１２０個、または少なくとも１８０個のアミノ酸である、請求項１に記載の核酸分子。
12. 請求項１に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、ＨＢＶ抗原に対する免疫応答を誘導する方法。
13. 請求項１に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、個人をＨＢＶ感染から保護する方法。
14. 請求項１に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、ＨＢＶ感染と診断された個人を保護する方法。
    
15. 配列番号２、
    配列番号２と９８％相同であるタンパク質、
    配列番号２の２０個以上のアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性フラグメント、
    ２０個以上のアミノ酸を含む配列番号２と９８％相同であるタンパク質の免疫原性フラグメント、
    からなる群から選択される、タンパク質。
16. 配列番号２を含むタンパク質の前記免疫原性フラグメントが、少なくとも６０個、少なくとも１２０個、または少なくとも１８０個のアミノ酸である、請求項１５に記載のタンパク質。
17. 配列番号２と９８％相同であるタンパク質の前記免疫原性フラグメントが、少なくとも６０個、少なくとも１２０個、または少なくとも１８０個のアミノ酸である、請求項１５に記載のタンパク質。
18. 配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１５に記載のタンパク質。
19. 請求項１５に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、ＨＢＶ抗原に対する免疫応答を誘導する方法。
20. 請求項１５に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、個人をＨＢＶ感染から保護する方法。
21. 請求項１５に記載の核酸分子を個人に投与することを含む、ＨＢＶ感染と診断された個人を保護する方法。
22. 請求項１に記載の核酸分子と、
    アジュバント分子と、
    を含む、対象におけるＨＢＶに対する免疫応答の生成に有用なワクチン。
23. 前記アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはランテスである、請求項２２に記載のワクチン。