JP2014506580A - インフルエンザの治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素およびマトリックス２外部ドメインポリペプチドに対して産生される抗体の組合せを使用して、インフルエンザ感染を診断、処置および予防するための組成物、ワクチン、および方法を提供する。さらに、本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のエピトープに対して産生されるヒト抗体と、インフルエンザＭ２タンパク質のエピトープに対して産生されるヒトモノクローナル抗体とを含む診断用、予防用、および治療用組成物を提供する。さらに、これらの組成物は、医薬担体を含む医薬組成物である。これらの組成物は、インフルエンザウイルス感染症を強く中和するとともに、すべてのインフルエンザ株に共通のタンパク質内の定常領域を認識する医薬組成物についての当技術分野における長年にわたる必要性に対処する。

Description

関連出願
本出願は、２０１１年２月１４日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６１／４４２，７３３の利益を主張し、上記仮出願の内容は、その全容が参考として本明細書に援用される。
配列表の援用
名称「３７４１８−５１８００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のテキストファイル（２０１２年１月６日に作成され、９１０ＫＢのサイズである）の内容は、その全容が参考として本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、一般に、インフルエンザ感染症の予防、診断、治療、および監視に関する。より詳細には、本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素またはマトリックス２タンパク質に対して産生されるヒト抗体の組合せを含む組成物に関する。そのような組成物は、インフルエンザを予防および処置するため、ならびにインフルエンザ感染症を診断および監視するための医薬組成物において有用である。
発明の背景
インフルエンザウイルスは、米国において集団の５〜２０％に感染し、毎年３０，０００〜５０，０００件の死亡をもたらす。インフルエンザＡウイルス感染によって引き起こされる疾患は、その周期性の性質を特徴とする。抗原ドリフトおよびシフトにより、異なるＡ株が毎年出現することが可能になる。加えて、病原性の高い株が一般集団内に入ってしまう脅威により、インフルエンザ感染症の新規治療の必要性が重視されている。
発明の概要
本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に対して産生されるヒト抗体と、インフルエンザＭ２タンパク質に対して産生されるヒトモノクローナル抗体とを含む診断用、予防用、および治療用組成物を提供する。さらに、本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のエピトープに対して産生された単離されたヒト抗体と、インフルエンザＭ２タンパク質のエピトープに対して産生された単離されたヒトモノクローナル抗体とを含む診断用、予防用、および治療用組成物を提供する。さらに、これらの組成物は、医薬担体を含む医薬組成物である。これらの組成物は、インフルエンザウイルス感染症を強く中和するとともに、すべてのインフルエンザ株に共通のタンパク質内の定常領域を認識する医薬組成物についての当技術分野における長年にわたる必要性に対処する。
詳細には、本発明は、（ａ）インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト抗体と、（ｂ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体とを含む組成物を提供する。この組成物の特定の実施形態では、Ｍ２ｅポリペプチドのエピトープに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体は、ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、または３２４２＿Ｐ０５である。さらに、ＨＡ糖タンパク質のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト抗体は、任意選択でＴＣＮ−５２２（３２１２＿Ｉ１２）、ＴＣＮ−５２１（３２８０＿Ｄ１８）、ＴＣＮ−５２３（５２４８＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５６３（５２３７＿Ｂ２１）、ＴＣＮ−５２６（５０８４＿Ｃ１７）、ＴＣＮ−５２７（５０８６＿Ｃ０６）、ＴＣＮ−５２８（５０８７＿Ｐ１７）、ＴＣＮ−５２９（５２９７＿Ｈ０１）、ＴＣＮ−５３０（５２４８＿Ｈ１０）、ＴＣＮ−５３１（５０９１＿Ｈ１３）、ＴＣＮ−５３２（５２６２＿Ｈ１８）、ＴＣＮ−５３３（５２５６＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５３４（５２４９＿Ｂ０２）、ＴＣＮ−５３５（５２４６＿Ｐ１９）、ＴＣＮ−５３６（５０９５＿Ｎ０１）、ＴＣＮ−５３７（３１９４＿Ｄ２１）、ＴＣＮ−５３８（３２０６＿Ｏ１７）、ＴＣＮ−５３９（５０５６＿Ａ０８）、ＴＣＮ−５４０（５０６０＿Ｆ０５）、ＴＣＮ−５４１（５０６２＿Ｍ１１）、ＴＣＮ−５４２（５０７９＿Ａ１６）、ＴＣＮ−５４３（５０８１＿Ｇ２３）、ＴＣＮ−５４４（５０８２＿Ａ１９）、ＴＣＮ−５４５（５０８２＿Ｉ１５）、ＴＣＮ−５４６（５０８９＿Ｌ０８）、ＴＣＮ−５４７（５０９２＿Ｆ１１）、ＴＣＮ−５４８（５０９２＿Ｐ０１）、ＴＣＮ−５４９（５０９２＿Ｐ０４）、ＴＣＮ−５５０（５０９６＿Ｆ０６）、ＴＣＮ−５５１（５２４３＿Ｄ０１）、ＴＣＮ−５５２（５２４９＿Ｉ２３）、ＴＣＮ−５５３（５２６１＿Ｃ１８）、ＴＣＮ−５５４（５２７７＿Ｍ０５）、ＴＣＮ−５５５（５２４６＿Ｌ１６）、ＴＣＮ−５５６（５０８９＿Ｋ１２）、ＴＣＮ−５５７（５０８１＿Ａ０４）、ＴＣＮ ５５８（５２４８＿Ｈ１０ｂ）、ＴＣＮ−５５９（５０９７＿Ｇ０８）、ＴＣＮ−５６０（５０８４＿Ｐ１０）、ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７）、ＳＣ０６−１４１、ＳＣ０６−２５５、ＳＣ０６−２５７、ＳＣ０６−２６０、ＳＣ０６−２６１、ＳＣ０６−２６２、ＳＣ０６−２６８、ＳＣ０６−２７２、ＳＣ０６−２９６、ＳＣ０６−３０１、ＳＣ０６−３０７、ＳＣ０６−３１０、ＳＣ０６−３１４、ＳＣ０６−３２３、ＳＣ０６−３２５、ＳＣ０６−３２７、ＳＣ０６−３２８、ＳＣ０６−３２９、ＳＣ０６−３３１、ＳＣ０６−３３２、ＳＣ０６−３３４、ＳＣ０６−３３６、ＳＣ０６−３３９、ＳＣ０６−３４２、ＳＣ０６−３４３、ＳＣ０６−３４４、ＣＲ６１４１、ＣＲ６２５５、ＣＲ６２５７、ＣＲ６２６０、ＣＲ６２６１、ＣＲ６２６２、ＣＲ６２６８、ＣＲ６２７２、ＣＲ６２９６、ＣＲ６３０１、ＣＲ６３０７、ＣＲ６３１０、ＣＲ６３１４、ＣＲ６３２３、ＣＲ６３２５、ＣＲ６３２７、ＣＲ６３２８、ＣＲ６３２９、ＣＲ６３３１、ＣＲ６３３２、ＣＲ６３３４、ＣＲ６３３６、ＣＲ６３３９、ＣＲ６３４２、ＣＲ６３４３、ＣＲ６３４４、２Ａ、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、またはＨ９８である。
ＨＡ糖タンパク質のエピトープは、任意選択で、ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号１９８）、ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＮＫ（配列番号２８３）、ＧＶＴＮＫＥＮＳＩＩＤＫ（配列番号２０２）、ＧＶＴＮＫＶＮＲＩＩＤＫ（配列番号２０１）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫ（配列番号２８１）、ＧＩＴＮＫＥＮＳＶＩＥＫ（配列番号２５７）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号２２５）、およびＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫ（配列番号２１６）である。インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質は、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含む。ＨＡ糖タンパク質の例示的なエピトープは、ＨＡ１サブユニット、ＨＡ２サブユニット、またはＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの両方を含む。その代わりに、またはそれに加えて、Ｍ２ｅポリペプチドのエピトープは、不連続エピトープである。例えば、Ｍ２ｅポリペプチドのエピトープは、ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号１）の２位、５位、および６位のアミノ酸、またはＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）の２位、５位、および６位のアミノ酸を含む。
本発明は、さらに、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインがそれぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲが、以下のアミノ酸配列：ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号２４７、５７１、５８６、５９７、６０３、６０９、６１５、６２７、６３３、６３７、６４３、６４９、６５８、６６４、６７０、３０３、２５１、２４２、または２２２；ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号２４８、５７２、５８７、５９２、５９８、６０４、６１０、６１６、６２８、６３４、６３８、６４４、６５０、６５５、６５９、６６５、６７１、３０６、２４９、３０７、または２２１；ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号５６８、５７３、５８８、５９３、５９９、６０５、６１１、６１７、６２９、６３５、６３９、６４５、６５１、６５６、６６０、６６６、６７２、７２５、２４６、２９０、または２２０；ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号５６９、５７４、５７７、５８０、５８３、５８９、５９４、６１２、６１８、６２１、６２４、６４０、６４６、６５２、６６１、６６７、２８５、２８９、２４５、２２４、または２１９；ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号５７０、５７５、５７８、５８１、５８４、５９０、５９５、６０１、６０７、６１３、６１９、６２２、６２５、６３１、６５３、６６２、６６８、３０５、２２３、または２３１；ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号２８９、５７６、５７９、５８２、５８５、５９１、５９６、６０２、６０８、６１４、６２０、６２３、６２６、６３２、６３６、６４２、６４８、６５４、６５７、６６３、６６９、３０８、２５０、２２７、または２８０を含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインがそれぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲが、以下のアミノ酸配列：ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号７２、１０３、１７９、１８７、２０３、２１１、２２８、２５２、２６０、２６８、２８４、２９３、または３０１；ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号７４、１０５、１８０、１８８、２０４、２１２、２２９、２３７、２５３、２６１、２６９、２８５、または２９４；ＶＨ ＣＤＲ３ 配列番号７６、１０７、１８１、１８９、１９７、２０５、２１３、２３０、２３８、２５４、２６２、２７０、２８６、または２９５；ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号５９、９２、１８４、１９２、２０８、１９２、２３３、２４１、２６５、または２７３；ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号６１、９４、１８５、１９３、２０９、２１７、２２６、２３４、２５８、２７４、または２８２；およびＶＬ ＣＤＲ３：配列番号６３、９６、１８６、１９４、２１０、２１８、２４３、２５９、２６７、２７５、２９１、または３００を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を提供する。
あるいは、または加えて、本発明は、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインがそれぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲが、以下のアミノ酸配列：ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号２４７、５７１、５８６、５９７、６０３、６０９、６１５、６２７、６３３、６３７、６４３、６４９、６５８、６６４、６７０、３０３、２５１、２４２、または２２２；ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号２４８、５７２、５８７、５９２、５９８、６０４、６１０、６１６、６２８、６３４、６３８、６４４、６５０、６５５、６５９、６６５、６７１、３０６、２４９、３０７、または２２１；ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号５６８、５７３、５８８、５９３、５９９、６０５、６１１、６１７、６２９、６３５、６３９、６４５、６５１、６５６、６６０、６６６、６７２、７２５、２４６、２９０、または２２０；ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号５６９、５７４、５７７、５８０、５８３、５８９、５９４、６１２、６１８、６２１、６２４、６４０、６４６、６５２、６６１、６６７、２８５、２８９、２４５、２２４、または２１９；ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号５７０、５７５、５７８、５８１、５８４、５９０、５９５、６０１、６０７、６１３、６１９、６２２、６２５、６３１、６５３、６６２、６６８、３０５、２２３、または２３１；ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号２８９、５７６、５７９、５８２、５８５、５９１、５９６、６０２、６０８、６１４、６２０、６２３、６２６、６３２、６３６、６４２、６４８、６５４、６５７、６６３、６６９、３０８、２５０、２２７、または２８０を含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインがそれぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲが、以下のアミノ酸配列：ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号１０９、１１２、１８２、１９０、２０６、２１４、２３９、２５５、２６３、２７１、２８７、２９６、または３０４；ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号１１０、１１３、１８３、１９１、２０７、２１５、２３２、２４０、２５６、２６４、２７２、２８８、または２９７；ＶＨ ＣＤＲ３ 配列番号７６、１０７、１８１、１８９、１９７、２０５、２１３、２３０、２３８、２５４、２６２、２７０、２８６、または２９５；ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号５９、９２、１８４、１９２、２０８、１９２、２３３、２４１、２６５、または２７３；ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号６１、９４、１８５、１９３、２０９、２１７、２２６、２３４、２５８、２７４、または２８２；およびＶＬ ＣＤＲ３：配列番号６３、９６、１８６、１９４、２１０、２１８、２４３、２５９、２６７、２７５、２９１、または３００を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を提供する。
本発明は、（ａ）以下のアミノ酸配列：配列番号３０９、３１３、３１７、３２１、３２５、３２９、３３３、３３７、３４１、３４５、３４９、３５３、３５７、３６１、３６５、３６９、３７３、３７７、３８１、３８５、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、１９９、４１７、４２３、４２９、４３５、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、５１３、５１９、５２５、５３１、５３７、５４３、５５０、５５６、または５６２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、および以下のアミノ酸配列：配列番号３１０、３１４、３１８、３２２、３２６、３３０、３３４、３３８、３４２、３４６、３５０、３５４、３５８、３６２、３６６、３７０、３７４、３７８、３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４２０、４２６、４３２、４３８、４４４、４５０、４５６、４６２、４６８、４７４、４８０、４８６、４９２、４９８、５０４、５１０、５１６、５２２、５２８、５３４、５４０、５４７、５５３、５５９、または５６５を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）以下のアミノ酸配列：配列番号４４、２７７、２７６、５０、２３６、２３５、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、または１７６を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および以下のアミノ酸配列：配列番号４６、２９２、５２、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、または１７８を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を提供する。
さらに、本発明は、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片と、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片とを含む、本明細書中に記載の組成物のいずれかを含む多価ワクチン組成物を提供する。あるいは、多価ワクチンは、本発明の抗体が結合するエピトープに結合する抗体を含む。本発明の例示的な抗体には、それだけには限定されないが、ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、３２４２＿Ｐ０５、ＴＣＮ−５２２（３２１２＿Ｉ１２）、ＴＣＮ−５２１（３２８０＿Ｄ１８）、ＴＣＮ−５２３（５２４８＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５６３（５２３７＿Ｂ２１）、ＴＣＮ−５２６（５０８４＿Ｃ１７）、ＴＣＮ−５２７（５０８６＿Ｃ０６）、ＴＣＮ−５２８（５０８７＿Ｐ１７）、ＴＣＮ−５２９（５２９７＿Ｈ０１）、ＴＣＮ−５３０（５２４８＿Ｈ１０）、ＴＣＮ−５３１（５０９１＿Ｈ１３）、ＴＣＮ−５３２（５２６２＿Ｈ１８）、ＴＣＮ−５３３（５２５６＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５３４（５２４９＿Ｂ０２）、ＴＣＮ−５３５（５２４６＿Ｐ１９）、ＴＣＮ−５３６（５０９５＿Ｎ０１）、ＴＣＮ−５３７（３１９４＿Ｄ２１）、ＴＣＮ−５３８（３２０６＿Ｏ１７）、ＴＣＮ−５３９（５０５６＿Ａ０８）、ＴＣＮ−５４０（５０６０＿Ｆ０５）、ＴＣＮ−５４１（５０６２＿Ｍ１１）、ＴＣＮ−５４２（５０７９＿Ａ１６）、ＴＣＮ−５４３（５０８１＿Ｇ２３）、ＴＣＮ−５４４（５０８２＿Ａ１９）、ＴＣＮ−５４５（５０８２＿Ｉ１５）、ＴＣＮ−５４６（５０８９＿Ｌ０８）、ＴＣＮ−５４７（５０９２＿Ｆ１１）、ＴＣＮ−５４８（５０９２＿Ｐ０１）、ＴＣＮ−５４９（５０９２＿Ｐ０４）、ＴＣＮ−５５０（５０９６＿Ｆ０６）、ＴＣＮ−５５１（５２４３＿Ｄ０１）、ＴＣＮ−５５２（５２４９＿Ｉ２３）、 ＴＣＮ−５５３（５２６１＿Ｃ１８）、ＴＣＮ−５５４（５２７７＿Ｍ０５）、ＴＣＮ−５５５（５２４６＿Ｌ１６）、ＴＣＮ−５５６（５０８９＿Ｋ１２）、ＴＣＮ−５５７（５０８１＿Ａ０４）、ＴＣＮ ５５８（５２４８＿Ｈ１０ｂ）、ＴＣＮ−５５９（５０９７＿Ｇ０８）、ＴＣＮ−５６０（５０８４＿Ｐ１０）、ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７）、ＳＣ０６−１４１、ＳＣ０６−２５５、ＳＣ０６−２５７、ＳＣ０６−２６０、ＳＣ０６−２６１、ＳＣ０６−２６２、ＳＣ０６−２６８、ＳＣ０６−２７２、ＳＣ０６−２９６、ＳＣ０６−３０１、ＳＣ０６−３０７、ＳＣ０６−３１０、ＳＣ０６−３１４、ＳＣ０６−３２３、ＳＣ０６−３２５、ＳＣ０６−３２７、ＳＣ０６−３２８、ＳＣ０６−３２９、ＳＣ０６−３３１、ＳＣ０６−３３２、ＳＣ０６−３３４、ＳＣ０６−３３６、ＳＣ０６−３３９、ＳＣ０６−３４２、ＳＣ０６−３４３、ＳＣ０６−３４４、ＣＲ６１４１、ＣＲ６２５５、ＣＲ６２５７、ＣＲ６２６０、ＣＲ６２６１、ＣＲ６２６２、ＣＲ６２６８、ＣＲ６２７２、ＣＲ６２９６、ＣＲ６３０１、ＣＲ６３０７、ＣＲ６３１０、ＣＲ６３１４、ＣＲ６３２３、ＣＲ６３２５、ＣＲ６３２７、ＣＲ６３２８、ＣＲ６３２９、ＣＲ６３３１、ＣＲ６３３２、ＣＲ６３３４、ＣＲ６３３６、ＣＲ６３３９、ＣＲ６３４２、ＣＲ６３４３、ＣＲ６３４４、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、およびＨ９８が含まれる。例えば、多価ワクチンは、そのネイティブコンフォメーションで提供される、以下のエピトープのうちの１つまたは複数を含むことができる：ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号１９８）、ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＮＫ（配列番号２８３）、ＧＶＴＮＫＥＮＳＩＩＤＫ（配列番号２０２）、ＧＶＴＮＫＶＮＲＩＩＤＫ（配列番号２０１）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫ（配列番号２８１）、ＧＩＴＮＫＥＮＳＶＩＥＫ（配列番号２５７）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号２２５）、ＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫ（配列番号２１６）、ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号１）、およびＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号１）。
多価ワクチンは、（ａ）インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質のエピトープに特異的に結合するヒト抗体と、（ｂ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体とを含む組成物も含む。
本発明は、本明細書中に記載の組成物のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。さらに、医薬組成物は、医薬担体を含む。
本発明は、被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、被験体に本明細書中に記載の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。医薬組成物は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前または後に投与することができる。
本発明は、処置を必要とする被験体においてインフルエンザウイルス感染症を治療するための方法であって、被験体に本明細書中に記載の医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。被験体は、インフルエンザウイルスに曝露されていてもよい。あるいは、または加えて、被験体は、インフルエンザ感染症であると診断されていなくてもよい。医薬組成物は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前または後に投与することができる。好ましくは、医薬組成物は、ウイルスのクリアランスを促進するか、またはインフルエンザ感染細胞を排除するために十分な用量で投与される。
本発明は、予防を必要とする被験体においてインフルエンザウイルス感染症を予防するための方法であって、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前に、被験体に本明細書中に記載のワクチン組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。この方法の特定の実施形態では、被験体は、インフルエンザ感染症にかかるリスクがある。医薬組成物は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前または後に投与することができる。好ましくは、医薬組成物は、ウイルスのクリアランスを促進するか、またはインフルエンザ感染細胞を排除するために十分な用量で投与される。
本発明によって提供される処置および予防方法は、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤（ｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、またはウイルス付着阻害剤（ｖｉｒａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を投与することをさらに含む。例示的な抗ウイルス薬には、それだけには限定されないが、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、またはＭ２イオンチャネル阻害剤が含まれる。これらの方法の特定の態様では、Ｍ２イオンチャネル阻害剤はアマンタジンまたはリマンタジンである。これらの方法の他の態様では、ノイラミニダーゼ阻害剤はザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。抗ウイルス薬は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前または後に投与することができる。
本発明によって提供される処置および予防方法は、第２の抗インフルエンザＡ抗体を投与することをさらに含む。第２の抗体は、任意選択で、本明細書中に記載の抗体である。第２の抗体は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露の前または後に投与することができる。
本発明は、被験体においてインフルエンザウイルス感染の存在を決定するための方法であって、（ａ）被験体から得た生物学的試料を本明細書中に記載の抗体または医薬組成物のいずれか１つと接触させる工程と、（ｂ）生物学的試料に結合する抗体の量を検出する工程と、（ｃ）生物学的試料に結合する抗体の量を対照値と比較し、それから被験体におけるインフルエンザウイルスの存在を決定する工程とを含む方法を提供する。任意選択で、対照値は、被験体から得た対照試料を本明細書中に記載の抗体または医薬組成物のいずれか１つと接触させ、対照試料に結合する抗体の量を検出することによって決定される。
本発明は、本明細書中に記載の抗体、組成物、または医薬組成物のいずれか１つを含む診断キットも提供する。
本発明は、本明細書中に記載のワクチン組成物を含む予防キットをさらに提供する。ワクチンは多価ワクチンであることが好ましい。用語「多価ワクチン」は、１つを超える感染性因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）、例えば、インフルエンザＨＡ糖タンパク質およびインフルエンザＭ２ｅポリペプチド、または分子のいくつかの異なるエピトープ、例えば、配列番号１９８、２８３、２０２、２０１、２８１、２５７、２２５、および２１６に示すＨＡエピトープに対して免疫応答を誘発する単一ワクチンを表す。あるいは、または加えて、用語多価ワクチンは、１つを超える感染性因子、例えば、インフルエンザＨＡ糖タンパク質およびインフルエンザＭ２ｅポリペプチドに対して産生されるヒト抗体の組合せの投与を表すことを意味する。
本発明の他の特長および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それに包含される。
図１は、遊離のＭ２ペプチドの有無における、Ｍ２発現構築体または対照ベクターをトランスフェクトした２９３−ＨＥＫ細胞に対する本発明の３種の抗体、および対照ｈｕ１４Ｃ２抗体の結合を示す写真である。 図２Ａは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３２に結合するヒトモノクローナル抗体を示すグラフである。図２Ｂは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３２に結合するヒトモノクローナル抗体を示すグラフである。 図３Ａは、Ｍ２バリアントの細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す表である（出現順に、それぞれ、配列番号１〜３、６７９および５〜４０）。 図３Ｂは、図３Ａに示されるＭ２バリアントに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図３Ｂは、図３Ａに示されるＭ２バリアントに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図３Ｃは、図３Ａに示されるＭ２バリアントに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図３Ｃは、図３Ａに示されるＭ２バリアントに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図４Ａは、アラニンスキャニング変異誘発に供されたＭ２ペプチドに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図４Ｂは、アラニンスキャニング変異誘発に供されたＭ２ペプチドに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図５は、ＣＨＯ細胞株であるＤＧ４４において安定に発現されたインフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を表すＭ２タンパクへのＭＡｂ ８ｉ１０および２３Ｋ１２の結合を示す一連の棒グラフである。 図６Ａは、変異Ｍ２ペプチドへの抗Ｍ２抗体の交差反応結合を示す表である（出現順に、それぞれ、配列番号６８０〜７０４）。 図６Ｂは、切断されたＭ２ペプチドへのＭ２抗体の結合活性を示す表である（出現順に、それぞれ、配列番号６８０、７０５〜７２４および１９）。 図７は、ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体で処理されたインフルエンザ感染マウスの生存を示すグラフである。 図８は、抗Ｍ２抗体がＭ２ｅのＮ末端の高度に保存された領域に結合することを示す説明図である（配列番号１９）。 図９は、粗製上清からの抗Ｍ２ｒＨＭＡｂクローンがＥＬＩＳＡ上でインフルエンザに結合し、一方、対照の抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ １４Ｃ２は容易にウイルスに結合しなかったことを示すグラフである。 図１０は、抗Ｍ２ｒＨＭＡｂがインフルエンザ感染細胞に結合したことを示す一連の写真である。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｃｚａ）Ａ／ＰＲ／８／３２に感染させたかまたは感染させなかった。２４時間後に粗製上清からのＡｂ結合を試験した。データはＦＭＡＴプレートスキャナーから収集した。 図１１は、粗製上清からの抗Ｍ２ｒＨＭＡｂクローンがインフルエンザのサブタイプであるＨ３Ｎ２、ＨＫ４８３、およびＶＮ１２０３ Ｍ２タンパク質をトランスフェクトした細胞に結合したことを示すグラフである。インフルエンザ株であるＨ３Ｎ２、ＨＫ４８３、およびＶＮ１２０３に対応する完全長Ｍ２ ｃＤＮＡをコードするプラスミド、ならびに空の（モック（ｍｏｃｋ））プラスミド対照を２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。１４Ｃ２、８ｉ１０、２３Ｋ１２、および２１Ｂ１５ ｍＡＢはトランスフェクタントへの結合について試験され、ＡＦ６４７を結合体化した抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出された。ＦＡＣＳ分析後の特異的なｍＡＢ結合の平均蛍光強度を示す。 図１２Ａ〜Ｂは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列である。ＶＨおよびＶｋについてのフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１〜４）および相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を示す。ＦＲ、ＣＤＲ、および遺伝子の名称は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）における命名法を使用して定義する。灰色ボックスは、薄青色ボックスで示されている生殖系列配列との同一性を表し、ハイフンはギャップを表し、白色ボックスは、生殖系列からのアミノ酸置換変異である。 図１２Ａ〜Ｂは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列である。ＶＨおよびＶｋについてのフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１〜４）および相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を示す。ＦＲ、ＣＤＲ、および遺伝子の名称は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）における命名法を使用して定義する。灰色ボックスは、薄青色ボックスで示されている生殖系列配列との同一性を表し、ハイフンはギャップを表し、白色ボックスは、生殖系列からのアミノ酸置換変異である。 図１２Ａ〜Ｂは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列である。ＶＨおよびＶｋについてのフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１〜４）および相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を示す。ＦＲ、ＣＤＲ、および遺伝子の名称は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）における命名法を使用して定義する。灰色ボックスは、薄青色ボックスで示されている生殖系列配列との同一性を表し、ハイフンはギャップを表し、白色ボックスは、生殖系列からのアミノ酸置換変異である。 図１２Ａ〜Ｂは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列である。ＶＨおよびＶｋについてのフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１〜４）および相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を示す。ＦＲ、ＣＤＲ、および遺伝子の名称は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）における命名法を使用して定義する。灰色ボックスは、薄青色ボックスで示されている生殖系列配列との同一性を表し、ハイフンはギャップを表し、白色ボックスは、生殖系列からのアミノ酸置換変異である。 図１３は、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂのパネルのＴＣＮ−０３２ Ｆａｂとの競合結合分析の結果を表すグラフである。指示された抗Ｍ２ｅ ｍＡｂは、１０μｇ／ｍＬのＴＣＮ−０３２ Ｆａｂ断片を用いて、または用いずにあらかじめ処理されたＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７のＭ２を発現する安定ＣＨＯトランスフェクタントに結合させるために使用した。細胞表面に結合した抗Ｍ２ｅ ｍＡｂは、ヤギ抗ｈｕＩｇＧ ＦｃＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ ＦＡＣＳで検出し、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、１つの実験に由来する。 図１４Ａは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３２およびＴＣＮ−０３１がＭ２ｅ由来合成ペプチドには結合しないが、ウイルス粒子およびウイルス感染細胞に結合する能力を表すグラフである。精製インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）をＥＬＩＳＡウェル上に１０μｇ／ｍｌでコーティングし、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、ｃｈ１４Ｃ２、およびＨＣＭＶ ｍＡｂ ２Ｎ９の結合を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃを使用して評価した。示した結果は、３つの実験を代表している。 図１４Ｂは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３２およびＴＣＮ−０３１がＭ２ｅ由来合成ペプチドには結合しないが、ウイルス粒子およびウイルス感染細胞に結合する能力を表すグラフである。Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／５０に由来するＭ２の２３ｍｅｒの合成ペプチドを、ＥＬＩＳＡウェル上に１μｇ／ｍｌでコーティングし、ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、ｃｈ１４Ｃ２、および２Ｎ９の結合をパネルａと同様に評価した。示した結果は、３つの実験を代表している。 図１４Ｃは、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３２およびＴＣＮ−０３１がＭ２ｅ由来合成ペプチドには結合しないが、ウイルス粒子およびウイルス感染細胞に結合する能力を表すグラフである。ＭＤＣＫ細胞をＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）に感染させ、続いてｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、ｃｈ１４Ｃ２、およびＨＣＭＶ ｍＡｂ ５Ｊ１２を用いて染色した。抗体の結合をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体を使用して検出し、フローサイトメトリーによって定量化した。示した結果は、３つの実験を代表している。 図１４Ｄは、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ ／１／５０（Ｄ２０）のＭ２外部ドメインを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または対照ｃｈ１４Ｃ２を含む一過性トランスフェクション上清を用いて染色し、５μｇ／ｍｌのＭ２ｅペプチドの有無において、Ｍ２への結合についてＦＭＡＴによって分析したことを表す一連の写真である。モック（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞は、ベクターだけを安定にトランスフェクトした２９３細胞である。示した結果は、１つの実験を代表している。 図１５Ａ〜Ｄは、マウスにおける抗Ｍ２ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の治療的有効性を表すグラフである。マウス（ｎ＝１０）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）（パネルＡ〜Ｂ）に、またはマウス（ｎ＝５）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ８／３４（Ｈ１Ｎ１）（パネルＣ〜Ｄ）に、鼻腔内接種によって感染させ、その後、感染後２４、７２、および１２０時間でｍＡｂを３回腹腔内（ｉｐ）注射し（マウス１匹当たり合計３回のｍＡｂ注射）、１４日間毎日計量した。生存率をａおよびｃに示し、一方、マウスの体重変化率をＢおよびＤに示す。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）に感染したマウスの処置試験について示した結果は、２つの実験を代表している。 図１５Ａ〜Ｄは、マウスにおける抗Ｍ２ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の治療的有効性を表すグラフである。マウス（ｎ＝１０）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）（パネルＡ〜Ｂ）に、またはマウス（ｎ＝５）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ８／３４（Ｈ１Ｎ１）（パネルＣ〜Ｄ）に、鼻腔内接種によって感染させ、その後、感染後２４、７２、および１２０時間でｍＡｂを３回腹腔内（ｉｐ）注射し（マウス１匹当たり合計３回のｍＡｂ注射）、１４日間毎日計量した。生存率をａおよびｃに示し、一方、マウスの体重変化率をＢおよびＤに示す。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）に感染したマウスの処置試験について示した結果は、２つの実験を代表している。 図１５Ａ〜Ｄは、マウスにおける抗Ｍ２ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の治療的有効性を表すグラフである。マウス（ｎ＝１０）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）（パネルＡ〜Ｂ）に、またはマウス（ｎ＝５）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ８／３４（Ｈ１Ｎ１）（パネルＣ〜Ｄ）に、鼻腔内接種によって感染させ、その後、感染後２４、７２、および１２０時間でｍＡｂを３回腹腔内（ｉｐ）注射し（マウス１匹当たり合計３回のｍＡｂ注射）、１４日間毎日計量した。生存率をａおよびｃに示し、一方、マウスの体重変化率をＢおよびＤに示す。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）に感染したマウスの処置試験について示した結果は、２つの実験を代表している。 図１５Ａ〜Ｄは、マウスにおける抗Ｍ２ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の治療的有効性を表すグラフである。マウス（ｎ＝１０）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）（パネルＡ〜Ｂ）に、またはマウス（ｎ＝５）を５×ＬＤ５０ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ８／３４（Ｈ１Ｎ１）（パネルＣ〜Ｄ）に、鼻腔内接種によって感染させ、その後、感染後２４、７２、および１２０時間でｍＡｂを３回腹腔内（ｉｐ）注射し（マウス１匹当たり合計３回のｍＡｂ注射）、１４日間毎日計量した。生存率をａおよびｃに示し、一方、マウスの体重変化率をＢおよびＤに示す。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）に感染したマウスの処置試験について示した結果は、２つの実験を代表している。 図１６は、Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４でチャレンジした後に抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２で処置したマウスの肺、肝臓、および脳におけるウイルス力価を表す一連のグラフである。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１９）を、４００μｇ／２００μＬの用量のＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、対照ヒトｍＡｂ ２Ｎ９、対照キメラｍＡｂ ｃｈ１４Ｃ２、ＰＢＳのｉ．ｐ．注射で処置するか、または未処置のままにした。組織ウイルス力価を、肺において（局所的な複製の指標として）、ならびに肝臓および脳において（Ｈ５Ｎ１感染の特徴である全身性拡散の指標として）、感染後第３日目および第６日目に１群当たり３匹のマウスから決定した。 図１７は、ＮＫ細胞による細胞溶解を増強することができるＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の能力を表すグラフである。ＭＤＣＫ細胞をＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに感染させ、ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、またはサブクラスがマッチした陰性対照ｍＡｂ ２Ｎ９で処理した。その後、細胞を精製ヒトＮＫ細胞でチャレンジし、細胞溶解の結果として放出される乳酸脱水素酵素を吸光度によって測定した。結果は、２つの異なる正常なヒトドナーを用いた２つの別々の実験を代表している。 図１８は、抗Ｍ２ ｍＡｂに結合したＭ２発現細胞の補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）を表すグラフである。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７のＭ２を発現する安定トランスフェクタントおよびモック対照を指示されたｍＡｂで処理し、続いてヒト補体でチャレンジした。溶解した細胞をヨウ化プロピジウム染色に続くＦＡＣＳ分析によって可視化した。データは２つの実験を代表している。 図１９Ａ〜Ｃは、エピトープがＭ２ｅの高度に保存されたＮ末端に位置することを示す、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２のＭ２変異体への結合を表すグラフである。Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／５０（Ｄ２０）（Ａ）のＭ２外部ドメインの各位置で置換されたアラニンを有する変異体、またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（ＶＮ）およびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７（ＨＫ）（Ｂ）を含む４０の野生型Ｍ２変異体を、２９３の細胞に一過性にトランスフェクトした。それぞれの野生型Ｍ２変異体の同一性を表６に列挙する。トランスフェクト細胞をｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または対照ｃｈ１４Ｃ２を用いて染色し、トランスフェクション後２４時間におけるＭ２への結合についてＦＡＣＳによって分析した。ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２は、Ｍ２ｅの１位、４位、または５位にアミノ酸置換を有するバリアントに結合しない。（Ｃ）ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２についての推定エピトープは、Ｍ２ｅの高度に保存された領域に生じ、ｃｈ１４Ｃ２について見られる推定エピトープと異なる。（Ａ）および（Ｂ）について示した結果は、３つの実験を代表している。 図１９Ａ〜Ｃは、エピトープがＭ２ｅの高度に保存されたＮ末端に位置することを示す、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２のＭ２変異体への結合を表すグラフである。Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／５０（Ｄ２０）（Ａ）のＭ２外部ドメインの各位置で置換されたアラニンを有する変異体、またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（ＶＮ）およびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７（ＨＫ）（Ｂ）を含む４０の野生型Ｍ２変異体を、２９３の細胞に一過性にトランスフェクトした。それぞれの野生型Ｍ２変異体の同一性を表６に列挙する。トランスフェクト細胞をｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または対照ｃｈ１４Ｃ２を用いて染色し、トランスフェクション後２４時間におけるＭ２への結合についてＦＡＣＳによって分析した。ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２は、Ｍ２ｅの１位、４位、または５位にアミノ酸置換を有するバリアントに結合しない。（Ｃ）ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２についての推定エピトープは、Ｍ２ｅの高度に保存された領域に生じ、ｃｈ１４Ｃ２について見られる推定エピトープと異なる。（Ａ）および（Ｂ）について示した結果は、３つの実験を代表している。 図１９Ａ〜Ｃは、エピトープがＭ２ｅの高度に保存されたＮ末端に位置することを示す、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２のＭ２変異体への結合を表すグラフである。Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／５０（Ｄ２０）（Ａ）のＭ２外部ドメインの各位置で置換されたアラニンを有する変異体、またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（ＶＮ）およびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７（ＨＫ）（Ｂ）を含む４０の野生型Ｍ２変異体を、２９３の細胞に一過性にトランスフェクトした。それぞれの野生型Ｍ２変異体の同一性を表６に列挙する。トランスフェクト細胞をｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または対照ｃｈ１４Ｃ２を用いて染色し、トランスフェクション後２４時間におけるＭ２への結合についてＦＡＣＳによって分析した。ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２は、Ｍ２ｅの１位、４位、または５位にアミノ酸置換を有するバリアントに結合しない。（Ｃ）ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２についての推定エピトープは、Ｍ２ｅの高度に保存された領域に生じ、ｃｈ１４Ｃ２について見られる推定エピトープと異なる。（Ａ）および（Ｂ）について示した結果は、３つの実験を代表している。 図２０は、ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２がＭ２ｅ上の同じ領域を認識することを表すグラフである。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７のＭ２を安定に発現するＣＨＯトランスフェクタントを１０μｇ／ｍＬのＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または２Ｎ９を用いて染色し、その後、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７−標識ＴＣＮ−０３１（ＴＣＮ−０３１ＡＦ６４７）またはＴＣＮ−０３２（ＴＣＮ−０３２ＡＦ６４７）を用いて検出し、フローサイトメトリーによって分析した。結果は３つの実験を代表している。 図２１は、抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２がＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９に感染した細胞に結合することを表すグラフである。ＭＤＣＫ細胞をインフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１４／９６、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９に感染させ、またはモック感染させた。感染後２４時間で、細胞をｍＡｂ ＴＣＮ−０３１、ＴＣＮ−０３２、または対照ｃｈ１４Ｃ２を用いて染色し、Ｍ２への結合についてＦＡＣＳによって分析した。示した結果は１つの実験についてのものである。
詳細な説明
インフルエンザウイルスは、Ａ、ＢおよびＣの３つの型からなる。インフルエンザＡウイルスは、ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリを含めた多種多様なトリおよび哺乳動物に感染する。動物において、ほとんどのインフルエンザＡウイルスは、気道および腸管の軽度の局部的な感染を引き起こす。しかし、死亡率が１００％に達する場合のある、家禽における全身性感染を引き起こす、Ｈ５Ｎ１などの病原性の高いインフルエンザＡ株が存在する。インフルエンザＡに感染した動物は、しばしばインフルエンザウイルスのリザーバとして作用し、特定のサブタイプは、種の壁を越えてヒトに渡ることが示されている。
インフルエンザＡウイルスは、ウイルス付着および細胞放出に必要とされる表面糖タンパク質、すなわち、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする２つの遺伝子の抗原性領域内の対立遺伝子変異に基づいてサブタイプに分類することができる。他の主要なウイルスタンパク質には、核タンパク質、ヌクレオカプシド構造タンパク質、膜タンパク質（Ｍ１およびＭ２）、ポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢおよびＰＢ２）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）が含まれる。現在、ＨＡの１６のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９つのＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）抗原バリアントがインフルエンザＡウイルスにおいて公知である。以前は、わずか３つのサブタイプがヒトに広まることが公知であった（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）。
しかし、近年、トリインフルエンザＡの病原性のＨ５Ｎ１サブタイプは、１９９７年および２００３年に香港で記録されたように種の壁を越え、ヒトに感染し、数人の患者の死に至ったことが報告されている。ヒトにおいて、トリインフルエンザウイルスは、気道ならびに腸管、肝臓、脾臓、腎臓、および他の臓器の細胞に感染する。トリインフルエンザ感染症の症状には、発熱、息切れおよび咳を含めた呼吸困難、リンパ球減少症、下痢、ならびに血糖値調節障害が含まれる。季節性インフルエンザと対照的に、最もリスクのある群は、集団の大部分を構成する健康な成人である。特定のトリインフルエンザＡサブタイプ、特にＨ５Ｎ１の高い病原性、およびクロスオーバーしてヒトに感染するその実証された能力のために、実際の流行および世界的流行の脅威を含めた、これらのウイルス株に関連した重大な経済的リスクおよび公衆衛生リスクが存在する。脅威の規模は、５０００万人を超える人が死亡した１９１８年のインフルエンザの世界的流行によって例示される。
現在、Ｈ５Ｎ１感染症の有効なワクチンは利用可能でなく、したがって、免疫グロブリンを用いた受動免疫療法が代替の戦略となり得る。１９１８年の世界的流行の間の受動免疫の使用により、死亡率が半減したと報告されている。したがって、ヒトにおける抗体の治療上の利益の観点から、Ｈ５Ｎ１を含めたインフルエンザ感染症を中和することができる抗体、好ましくはヒト抗体の必要性が存在する。
本発明は、２つのインフルエンザタンパク質、すなわち、赤血球凝集素（ＨＡ）およびマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）に対して産生されるヒト抗体を含む組成物を提供し、これらの組成物は、医薬品、特にＨ５Ｎ１を含めたインフルエンザ感染症の診断、予防、および処置のための医薬品において使用することができることを示す。
ＨｕＭ２ｅ抗体
本発明は、Ｍ２ｅに対して特異的である完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。任意選択で、抗体は、ヒトドナーのＢ細胞から単離される。例示的なモノクローナル抗体には、本明細書中に記載のＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、および３２４２＿Ｐ０５が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体は、ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、および３２４２＿Ｐ０５と同じエピトープに結合する抗体である。この抗体は、本明細書中でそれぞれｈｕＭ２ｅ抗体と呼ぶ。ｈｕＭ２ｅ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザＡ感染細胞に結合する；またはｃ）インフルエンザＡウイルスに結合する。
ｈｕＭ２ｅ抗体が結合するエピトープは、Ｍ２ポリペプチドの非直鎖状エピトープである。好ましくは、エピトープは、Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域を含む。より好ましくは、エピトープは、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）を完全に、または部分的に含む。最も好ましくは、エピトープは、配列番号１に従う番号付けにおいて、Ｍ２ｅポリペプチドの２位、５位および６位のアミノ酸を含む。２位のアミノ酸はセリンであり、５位のアミノ酸はトレオニンであり、６位のアミノ酸はグルタミン酸である。
ｈｕＭ２ｅ抗体は、配列番号４４、２７７、２７６、５０、２３６、２３５、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、または１７６のアミノ酸配列を有する重鎖可変、および配列番号４６、５２、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、または１７８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変を含む。好ましくは、３つの重鎖ＣＤＲは、配列番号７２、７４、７６、１０３、１０５、１０７、１７９、１８０、１８１、１８７、１８８、１８９、１９７、２０３、２０４、２０５、２１、２１２、２１３、２２８、２２９、２３０、２３７、２３８、２５２、２５３、２５４、２６０、２６１、２６２、２６８、２６９、２７０、２８４、２８５、２８６、２９３、２９４、２９５、および３０１（Ｋａｂａｔ方法によって決定）または配列番号１０９、１１０、７６、１１２、１１３、１０７、１８２、１８３、１８１、１９０、１９１、１８９、１９７、２０６、２０７、２０５、２１４、２１５、２１３、２３２、２３０、２３９、２４０、２３８、２５５、２５６、２５４、２６３、２６４、２６２、２７１、２７２、２７０、２８７、２８８、２８６、２９６、２９７、２９５、および３０４（Ｃｈｏｔｈｉａ方法によって決定）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５９、６０、６１、９２、９４、９６、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９４、２０８、２０９、２１０、２１７、２１８、２２６、２２３、２３４、２４１、２４３、２５８、２５９、２６５、２６７、２７３、２７４、２７５、２８２、２９１、および３００（Ｋａｂａｔ方法によって決定）または配列番号５９、６０、６１、９２、９４、９６、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９４、２０８、２０９、２１０、２１７、２１８、２２６、２２３、２３４、２４１、２４３、２５８、２５９、２６５、２６７、２７３、２７４、２７５、２８２、２９１、および３００（Ｃｈｏｔｈｉａ方法によって決定）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する。抗体はＭ２ｅに結合する。
Ｍ２ｅ抗体の重鎖は、例えば、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子などの生殖系列Ｖ（可変）遺伝子に由来する。
本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。ＩｇＨＶ４生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｌ１００８８、Ｍ２９８１２、Ｍ９５１１４、Ｘ５６３６０およびＭ９５１１７として示される。ＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ９２２１８、Ｘ７０２０８、Ｚ２７５０４、Ｍ９９６７９およびＡＢ０１９４３７として示される。本発明のＭ２ｅ抗体は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３ ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域も含む。ヒトＩｇＫＶ１ ＶＬ生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ５９３１５、Ｘ５９３１２、Ｘ５９３１８、Ｊ００２４８およびＹ１４８６５として示される。あるいは、Ｍ２ｅ抗体は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
別の態様では、本発明は、本発明によるｈｕＭ２ｅ抗体を含む組成物を提供する。様々な態様では、組成物は、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤、またはウイルス付着阻害剤をさらに含む。抗ウイルス薬は、例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、またはＭ２イオンチャネル阻害剤である。Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、例えば、アマンタジンまたはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。さらなる態様では、組成物は、第２の抗インフルエンザＡ抗体をさらに含む。
さらなる態様では、本発明によるｈｕＭ２ｅ抗体は、治療剤または検出可能な標識と作動可能に連結している。
さらに、本発明は、被験体にｈｕＭ２ｅ抗体を投与することによって、免疫応答を刺激し、インフルエンザウイルス感染症の症状を処置し、予防し、または緩和するため方法を提供する。
任意選択で、被験体に、それだけには限定されないが、インフルエンザウイルス抗体、抗ウイルス薬（ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤もしくはＭ２イオンチャネル阻害剤など）、ウイルス侵入阻害剤またはウイルス付着阻害剤などの第２の薬剤をさらに投与する。Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、例えば、アマンタジンまたはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。被験体は、インフルエンザウイルス感染症を患っているか、またはそれを発症する素因がある（例えば自己免疫疾患または炎症性障害など）。
別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスへの曝露の前および／または後に、被験体に本発明のｈｕＭ２ｅ抗体を投与する方法を提供する。例えば、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体を用いて、拒絶インフルエンザ感染症を処置または予防する。ｈｕＭ２ｅ抗体は、ウイルスのクリアランスを促進するか、またはインフルエンザＡ感染細胞を排除するために十分な用量で投与される。
また、本発明は、患者から得た生物学的試料をｈｕｍＭ２ｅ抗体と接触させること；生物学的試料に結合する抗体の量を検出すること；生物学的試料に結合する抗体の量を対照値と比較することによる、患者中におけるインフルエンザウイルス感染症の存在を決定するため方法を含む。
本発明はさらに、ｈｕＭ２ｅ抗体を含む診断キットを提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それに包含される。
本発明は、マトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメインに対して特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。この抗体は、本明細書中でそれぞれｈｕＭ２ｅ抗体と呼ぶ。
Ｍ２とは、インフルエンザウイルスおよびウイルス感染した細胞の表面上にホモ四量体として存在する、９６個のアミノ酸の膜貫通タンパク質である。Ｍ２は、インフルエンザＡ株全体にわたって高度に保存されている２３個のアミノ酸の外部ドメイン（Ｍ２ｅ）を含む。１９１８年に流行した株以降はわずかなアミノ酸変化しか起こっておらず、したがって、Ｍ２ｅはインフルエンザ治療の魅力的な標的である。以前の研究では、Ｍ２ｅの直鎖状配列に対応するペプチドを用いて免疫化して、Ｍ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）に特異的なモノクローナル抗体を誘導していた。対照的に、本発明は、完全長Ｍ２を細胞系内で発現させ、これにより、この細胞によって発現されたＭ２ｅに結合したヒト抗体の同定が可能となる新規プロセスを提供する。ｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２をトランスフェクトした細胞上のコンフォメーション決定基、ならびにインフルエンザ感染細胞上またはウイルス自体上のネイティブＭ２に結合することが示されている。ｈｕＭ２ｅ抗体は、直鎖状Ｍ２ｅペプチドには結合しなかったが、やはり細胞系内へのｃＤＮＡのトランスフェクトによって発現される、いくつかの天然のＭ２バリアントには結合する。したがって、本発明は、非常に幅広い範囲のインフルエンザＡウイルス株に対して新規の特異性を示す、ヒトモノクローナル抗体の同定および産生を可能にする。これらの抗体は、インフルエンザＡ感染症を同定するために診断的に、かつインフルエンザＡ感染症を処置するために治療的に使用し得る。
本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ｈｕＭ２ｅ抗体は、ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザＡ感染細胞に結合する；および／またはｃ）インフルエンザＡウイルス（すなわちバイロン（ｖｉｒｏｎ））に結合する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、ＡＤＣＣなどの免疫エフェクター機構によってインフルエンザ感染細胞を排除し、インフルエンザバイロンに結合することによって直接のウイルス排除を促進する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｎ末端のメチオニン残基が存在しないＭ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。例示的なＭ２ｅ配列には、以下の表１に記載の配列が含まれる。
一実施形態では、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、配列番号１に従う番号付けにおいて、Ｍ２ｅの２位〜７位のアミノ酸残基を完全にまたは部分的に含むＭ２ｅに結合する。例えば、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶＥＴ（配列番号４１）に完全にまたは部分的に結合し、最も好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）に完全にまたは部分的に結合し、好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２ｅタンパク質の非直鎖状エピトープに結合する。例えば、ｈｕＭ２ｅ抗体は、配列番号１に従う番号付けにおいて、Ｍ２ｅポリペプチドの２位、５位および６位を含むエピトープに結合し、ここで、ａ）２位のアミノ酸はセリンであり；ｂ）５位のアミノ酸はトレオニンであり；ｃ）６位のアミノ酸はグルタミン酸である。このエピトープに結合する例示的なｈｕＭ２ｅモノクローナル抗体は、本明細書中に記載のＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、および３２４２＿Ｐ０５抗体である。
ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）抗体は、以下の配列番号４３に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４）、以下の配列番号２７８に示す核酸配列によってコードされる短い重鎖可変領域（配列番号２７７）、以下の配列番号１９６に示す核酸配列によってコードされる長い重鎖可変領域（配列番号２７６）、および配列番号４５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６）を含む。
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら（１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁）によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２号、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．）によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１０９）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号１１０）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
２１Ｂ１５抗体は、以下の配列番号４７に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４）、以下の配列番号２７８に示す核酸配列によってコードされる短い重鎖可変領域（配列番号２７７）、以下の配列番号１９６に示す核酸配列によってコードされる長い重鎖可変領域（配列番号２７６）、および配列番号４８に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６）を含む。
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１０９）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号１１０）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）抗体は、以下の配列番号４９に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５０）、以下の配列番号２４４に示す核酸配列によってコードされる短い重鎖可変領域（配列番号２３６）、以下の配列番号２３５に示す核酸配列によってコードされる長い重鎖可変領域（配列番号１９５）、および配列番号５１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５２）を含む。
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）。ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）。
ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＦＴＶＳＳＮ（配列番号１１２）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹ（配列番号１１３）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）。ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）。
３２４１＿Ｇ２３抗体（本明細書でＧ２３とも呼ばれる）は、以下の配列番号１１５に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１１６）、および配列番号１１７に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１１８）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｇ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＧＹＳＷＮ（配列番号１７９）、ＦＭＦＨＳＧＳＰＲＹＮＰＴＬＫＳ（配列番号１８０）およびＶＧＱＭＤＫＹＹＡＭＤＶ（配列番号１８１）。Ｇ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＧＡＹＶＮ（配列番号１８４）、ＧＡＳＮＬＱＳ（配列番号１８５）およびＱＱＴＹＳＴＰＩＴ（配列番号１８６）。
Ｇ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＰＶＳＧＧＧ（配列番号１８２）、ＦＭＦＨＳＧＳＰＲ（配列番号１８３）およびＶＧＱＭＤＫＹＹＡＭＤＶ（配列番号１８１）。Ｇ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＧＡＹＶＮ（配列番号１８４）、ＧＡＳＮＬＱＳ（配列番号１８５）およびＱＱＴＹＳＴＰＩＴ（配列番号１８６）。
３２４４＿Ｉ１０抗体（本明細書でＩ１０とも呼ばれる）は、以下の配列番号１１９に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１２０）、および配列番号１２１に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１２２）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＹＷＳ（配列番号１８７）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１８８）およびＨＤＡＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１８９）。Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＮＬＱＳ（配列番号１９３）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＴＳ（配列番号１９０）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫ（配列番号１９１）およびＨＤＡＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１８９）。Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＮＬＱＳ（配列番号１９３）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
３２４３＿Ｊ０７抗体（本明細書でＪ０７とも呼ばれる）は、以下の配列番号１２３に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１２４）、および配列番号１２５に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１２６）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｊ０７抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＹＷＳ（配列番号１８７）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１８８）およびＨＤＶＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１９７）。Ｊ０７抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＮＬＱＳ（配列番号１９３）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
Ｊ０７抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＴＳ（配列番号１９０）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫ（配列番号１９１）およびＨＤＶＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１９７）。Ｊ０７抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＮＬＱＳ（配列番号１９３）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
３２５９＿Ｊ２１抗体（本明細書でＪ２１とも呼ばれる）は、以下の配列番号１２７に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１２８）、および配列番号１２９に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１３０）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｊ２１抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＹＮＷＩ（配列番号２０３）、ＨＩＹＤＹＧＲＴＦＹＮＳＳＬＱＳ（配列番号２０４）およびＰＬＧＩＬＨＹＹＡＭＤＬ（配列番号２０５）。Ｊ２１抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＤＫＦＬＮ（配列番号２０８）、ＧＡＳＮＬＨＳ（配列番号２００）およびＱＱＳＦＳＶＰＡ（配列番号２１０）。
Ｊ２１抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＳＳ（配列番号２０６）、ＨＩＹＤＹＧＲＴＦ（配列番号２０７）およびＰＬＧＩＬＨＹＹＡＭＤＬ（配列番号２０５）。Ｊ２１抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＤＫＦＬＮ（配列番号２０８）、ＧＡＳＮＬＨＳ（配列番号２０９）およびＱＱＳＦＳＶＰＡ（配列番号２１０）。
３２４５＿Ｏ１９抗体（本明細書でＯ１９とも呼ばれる）は、以下の配列番号１３１に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１３２）、および配列番号１３３に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１３４）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｏ１９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＴＹＭＮ（配列番号２１１）、ＶＦＹＳＥＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１２）およびＶＱＲＬＳＹＧＭＤＶ（配列番号２１３）。Ｏ１９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＳＴＬＱＳ（配列番号２１７）およびＱＱＴＹＳＩＰＬ（配列番号２１８）。
Ｏ１９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＬＳＶＳＳ（配列番号２１４）、ＶＦＹＳＥＴＲＴＹ（配列番号２１５）およびＶＱＲＬＳＹＧＭＤＶ（配列番号２１３）。Ｏ１９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＳＴＬＱＳ（配列番号２１７）およびＱＱＴＹＳＩＰＬ（配列番号２１８）。
３２４４＿Ｈ０４抗体（本明細書でＨ０４とも呼ばれる）は、以下の配列番号１３５に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１３６）、および配列番号１３７に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１３８）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｈ０４抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＴＹＭＮ（配列番号２１１）、ＶＦＹＳＥＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１２）およびＶＱＲＬＳＹＧＭＤＶ（配列番号２１３）。Ｈ０４抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＹＳＩＰＬ（配列番号２１８）。
Ｈ０４抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＬＳＶＳＳ（配列番号２１４）、ＶＦＹＳＥＴＲＴＹ（配列番号２１５）およびＶＱＲＬＳＹＧＭＤＶ（配列番号２１３）。Ｈ０４抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＹＳＩＰＬ（配列番号２１８）。
３１３６＿Ｇ０５抗体（本明細書でＧ０５とも呼ばれる）は、以下の配列番号１３９に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１４０）、および配列番号１４１に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１４２）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｇ０５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＦＷＳ（配列番号２２８）、ＹＶＹＮＲＧＳＴＫＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号２２９）およびＮＧＲＳＳＴＳＷＧＩＤＶ（配列番号２３０）。Ｇ０５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＨ（配列番号２３３）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
Ｇ０５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＳＳ（配列番号２０６）、ＹＶＹＮＲＧＳＴＫ（配列番号２３２）およびＮＧＲＳＳＴＳＷＧＩＤＶ（配列番号２３０）。Ｇ０５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＨ（配列番号２３３）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
３２５２＿Ｃ１３抗体（本明細書でＣ１３とも呼ばれる）は、以下の配列番号１４３に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１４４）、および配列番号１４５に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１４６）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｃ１３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＹＷＳ（配列番号１８７）、ＹＩＹＮＲＧＳＴＫＹＴＰＳＬＫＳ（配列番号２３７）およびＨＶＧＧＨＴＹＧＩＤＹ（配列番号２３８）。Ｃ１３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＮＴＰＩＴ（配列番号２４３）。
Ｃ１３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＡＳＩＳＳ（配列番号２３９）、ＹＩＹＮＲＧＳＴＫ（配列番号２４０）およびＨＶＧＧＨＴＹＧＩＤＹ（配列番号２３８）。Ｃ１３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＮＴＰＩＴ（配列番号２４３）。
３２５９＿Ｊ０６抗体（本明細書でＪ０６とも呼ばれる）は、以下の配列番号１４７に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１４８）、および配列番号１４９に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１５０）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｊ０６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＹＷＳ（配列番号１８７）、ＹＩＹＮＲＧＳＴＫＹＴＰＳＬＫＳ（配列番号２３７）およびＨＶＧＧＨＴＹＧＩＤＹ（配列番号２３８）。Ｊ０６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＮＴＰＩＴ（配列番号２４３）。
Ｊ０６抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＡＳＩＳＳ（配列番号２３９）、ＹＩＹＮＲＧＳＴＫ（配列番号２４０）およびＨＶＧＧＨＴＹＧＩＤＹ（配列番号２３８）。Ｊ０６抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＮＴＰＩＴ（配列番号２４３）。
３４１０＿Ｉ２３抗体（本明細書でＩ２３とも呼ばれる）は、以下の配列番号１５１に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１５２）、および配列番号１５３に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１５４）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｉ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＹＳＷＳ（配列番号２５２）、ＹＬＹＹＳＧＳＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２５３）およびＴＧＳＥＳＴＴＧＹＧＭＤＶ（配列番号２５４）。Ｉ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号２５８）およびＱＱＳＹＳＰＰＩＴ（配列番号２５９）。
Ｉ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＤＳＩＳＳ（配列番号２５５）、ＹＬＹＹＳＧＳＴＫＳ（配列番号２５６）およびＴＧＳＥＳＴＴＧＹＧＭＤＶ（配列番号２５４）。Ｉ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号２５８）およびＱＱＳＹＳＰＰＩＴ（配列番号２５９）。
３１３９＿Ｐ２３抗体（本明細書でＰ２３とも呼ばれる）は、以下の配列番号１５５に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１５６）、および配列番号１５７に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１５８）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｐ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＮＳＦＷＧ（配列番号２６０）、ＹＶＹＮＳＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２６１）およびＨＤＤＡＳＨＧＹＳＩＳ（配列番号２６２）。Ｐ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＴＩＳＴＹＬＮ（配列番号２６５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＴ（配列番号２６７）。
Ｐ２３抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＳＮ（配列番号２６３）、ＹＶＹＮＳＧＮＴＫ（配列番号２６４）およびＨＤＤＡＳＨＧＹＳＩＳ（配列番号２６２）。Ｐ２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＴＩＳＴＹＬＮ（配列番号２６５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＴ（配列番号２６７）。
３２４８＿Ｐ１８抗体（本明細書でＰ１８とも呼ばれる）は、以下の配列番号１５９に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１６０）、および配列番号１６１に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１６２）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｐ１８抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＡＹＨＷＳ（配列番号２６８）、ＨＩＦＤＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２６９）およびＰＬＧＳＲＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２７０）。Ｐ１８抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＴＬＱＮ（配列番号２７４）およびＱＱＳＹＳＶＰＡ（配列番号２７５）。
Ｐ１８抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＳＡ（配列番号２７１）、ＨＩＦＤＳＧＳＴＹ（配列番号２７２）およびＰＬＧＳＲＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２７０）。Ｐ１８抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＴＬＱＮ（配列番号２７４）およびＱＱＳＹＳＶＰＡ（配列番号２７５）。
３２５３＿Ｐ１０抗体（本明細書でＰ１０とも呼ばれる）は、以下の配列番号１６３に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１６４）、および配列番号１６５に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１６６）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
３２５３＿Ｐ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＤＹＷＳ（配列番号１８７）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１８８）およびＨＤＡＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１８９）。３２５３＿Ｐ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＤＬＱＳ（配列番号２８２）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
３２５３＿Ｐ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＧＳＩＴＳ（配列番号１９０）、ＦＦＹＮＧＧＳＴＫ（配列番号１９１）およびＨＤＡＫＦＳＧＳＹＹＶＡＳ（配列番号１８９）。３２５３＿Ｐ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＴＹＬＮ（配列番号１９２）、ＧＡＴＤＬＱＳ（配列番号２８２）およびＱＱＳＹＮＴＰＬＩ（配列番号１９４）。
３２６０＿Ｄ１９抗体（本明細書でＤ１９とも呼ばれる）は、以下の配列番号１６７に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１６８）、および配列番号１６９に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１７０）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
３２６０＿Ｄ１９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＤＮＹＩＮ（配列番号２８４）、ＶＦＹＳＡＤＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８５）およびＶＱＫＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号２８６）。３２６０＿Ｄ１９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＦＳＩＰＬ（配列番号２９１）。
３２６０＿Ｄ１９抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＦＳＶＳＤ（配列番号２８７）、ＶＦＹＳＡＤＲＴＳ（配列番号２８８）およびＶＱＫＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号２８６）。３２６０＿Ｄ１９抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＦＳＩＰＬ（配列番号２９１）。
３３６２＿Ｂ１１抗体（本明細書でＢ１１とも呼ばれる）は、以下の配列番号１７１に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１７２）、および配列番号１７３に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１７４）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
Ｂ１１抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＧＡＹＹＷＴ（配列番号２９３）、ＹＩＹＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２９４）およびＡＡＳＴＳＶＬＧＹＧＭＤＶ（配列番号２９５）。Ｂ１１抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号３００）。
Ｂ１１抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＤＳＩＴＳＧＡ（配列番号２９６）、ＹＩＹＹＳＧＮＴＹ（配列番号２９７）およびＡＡＳＴＳＶＬＧＹＧＭＤＶ（配列番号２９５）。Ｂ１１抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２３４）およびＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号３００）。
３２４２＿Ｐ０５抗体（本明細書でＰ０５とも呼ばれる）は、以下の配列番号１７５に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１７６）、および配列番号１７７に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１７８）を含む。
以下の配列中、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
３２４２＿Ｐ０５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＶＳＤＮＹＩＮ（配列番号３０１）、ＶＦＹＳＡＤＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８５）およびＶＱＫＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号２８６）。３２４２＿Ｐ０５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＦＳＩＰＬ（配列番号２９１）。
３２４２＿Ｐ０５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＳＧＦＳＶ（配列番号３０４）、ＶＦＹＳＡＤＲＴＳ（配列番号２８８）およびＶＱＫＳＹＹＧＭＤＶ（配列番号２８６）。３２４２＿Ｐ０５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：３２４２＿Ｐ０５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号２７３）、ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号２２６）およびＱＱＴＦＳＩＰＬ（配列番号２９１）。
また、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体には、配列番号４４、２７７、２７６、５０、２３６、２３５、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２または１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一である重鎖可変アミノ酸配列、および／または配列番号４６、５２、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一である軽鎖可変アミノ酸を含む抗体も含まれる。
あるいは、モノクローナル抗体は、ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１（２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、または３２４２＿Ｐ０５と同じエピトープに結合する抗体である。
Ｍ２ｅ抗体の重鎖は、例えばＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子などの生殖系列Ｖ（可変）遺伝子に由来する。
本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。ＩｇＨＶ４生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｌ１００８８、Ｍ２９８１２、Ｍ９５１１４、Ｘ５６３６０およびＭ９５１１７に示されている。ＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ９２２１８、Ｘ７０２０８、Ｚ２７５０４、Ｍ９９６７９およびＡＢ０１９４３７に示されている。本発明のＭ２ｅ抗体は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３ ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。また、本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域も含む。ヒトＩｇＫＶ１ ＶＬ生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ５９３１５、Ｘ５９３１２、Ｘ５９３１８、Ｊ００２４８、およびＹ１４８６５に示されている。あるいは、Ｍ２ｅ抗体は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
ＨＡ抗体Ｉ
本発明のＨＡ抗体はまた、ウイルス付着および細胞放出に必要とされる表面糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、または膜タンパク質（Ｍ１およびＭ２）などのインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の１つまたは複数の断片に特異的に結合することができるものであり得る。特定の実施形態では、本発明のＨＡ抗体は、Ｈ５Ｎ１株のＨＡ分子に特異的に結合することができる。これらは、ＨＡ分子のＨＡ１および／またはＨＡ２サブユニットに特異的に結合することができるものであり得る。これらは、ＨＡ分子のＨＡ１および／またはＨＡ２サブユニット上の直鎖状エピトープ、構造エピトープおよび／またはコンフォメーションエピトープに特異的に結合することができるものであり得る。ＨＡ分子は、ウイルスから精製するか、または組換え的に産生し、任意選択で使用前に単離することができる。あるいは、ＨＡは、細胞の表面に発現され得る。
診断目的のために、ＨＡ抗体はまた、核タンパク質、ヌクレオカプシド構造タンパク質、ポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢおよびＰＢ２）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を含めた、Ｈ５Ｎ１の表面上に存在しないタンパク質に特異的に結合することができるものであり得る。様々なＨ５Ｎ１株のタンパク質のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＳＤ）、ＥＭＢＬデータベースおよび／または他のデータベース中に見つけることができる。それぞれのデータベース中でそのような配列を見つけることは、十分に当業者の理解の範囲内である。別の実施形態では、本発明のＨＡ抗体は、上述したタンパク質および／またはポリペプチドの断片に特異的に結合することができ、断片は少なくとも、本発明のＨＡ抗体によって認識される抗原決定基を含む。本明細書中で使用する「抗原決定基」は、検出可能な抗原抗体複合体を形成するために十分に高い親和性で本発明のＨＡ抗体に結合することができる部分である。本明細書中で使用する用語「抗原決定基」および「エピトープ」は等価である。本発明のＨＡ抗体は、ＨＡの細胞外部分（本明細書中で可溶性ＨＡ（ｓＨＡ）とも呼ばれる）に特異的に結合することができても、できなくてもよい。
本発明のＨＡ抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体などのインタクトな免疫グロブリン分子であってもよく、またはＨＡ抗体は、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、およびインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１株もしくはその断片への特異的抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの断片を少なくとも含む（ポリ）ペプチドを含めた抗原結合断片であってもよい。好ましい実施形態では、ＨＡ抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
ＨＡ抗体は、単離されていない形または単離された形で使用することができる。さらに、ＨＡ抗体は、単独で、あるいは少なくとも１つのＨＡ抗体（またはそのバリアントもしくは断片）を含む混合物で使用することができる。したがって、ＨＡ抗体は、例えば、本発明の２つ以上の抗体、これらのバリアントまたは断片を含む医薬組成物として、組み合わせて使用することができる。例えば、異なるが相補的な活性を有する抗体を単一の治療において組み合わせて、所望の予防上、治療上または診断上の効果を達成することができ、あるいは、同一の活性を有する抗体を単一の治療において組み合わせて、所望の予防上、治療上または診断上の効果を達成することもできる。任意選択で、混合物は、少なくとも１つの他の治療剤をさらに含む。好ましくは、例えば、Ｍ２阻害剤（例えば、アマンタジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、リマンタジン）および／またはノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）などの治療剤は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染の予防および／または処置において有用である。
典型的には、ＨＡ抗体は、その結合パートナー、すなわち、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１またはその断片に、０．２×１０−４Ｍ、１．０×１０−５Ｍ、１．０×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍ未満、好ましくは１．０×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０−１０Ｍ未満、さらにより好ましくは１．０×１０−１１Ｍ未満、特に、１．０×１０−１２Ｍ未満である親和定数（Ｋｄ値）で結合することができる。親和定数は、抗体アイソタイプによって異なる場合がある。例えば、ＩｇＭアイソタイプの親和結合は、少なくとも約１．０×１０−７Ｍの結合親和性を指す。親和定数は、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して（例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して）測定することができる。
ＨＡ抗体は、例えば、試料もしくは懸濁液中で、可溶性の形におけるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１もしくはその断片に結合することができ、または担体（ｃａｒｒｉｅｒ）もしくは支持層、例えば、マイクロタイタープレート、膜およびビーズなどに結合もしくは付着したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１もしくはその断片に結合することができる。担体または支持層は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロン（登録商標）などでできていてもよい。そのような支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）の表面は、固体または多孔質であってもよく、任意の好都合な形状のものであってもよい。さらに、ＨＡ抗体は、精製された／単離された形または精製されていない／単離されていない形でインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に結合することができる。
ＨＡ抗体は中和活性を示す。中和活性は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９３５６（公開第ＷＯ２００８／０２８９４６号、その内容全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたように測定することができる。中和活性を測定する代替のアッセイは、例えば、ＷＨＯ Ｍａｎｕａｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２００５年、２００２．５版に記載されている。
本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）のＨＡ２サブユニット中のエピトープを認識し、これに結合する単離されたヒトＨＡ抗体であって、前記ＨＡ抗体が、例えば、Ｈ５サブタイプのＨＡを含めたインフルエンザウイルスに対する中和活性を有することを特徴とするＨＡ抗体に関する。Ｈ５サブタイプのそのようなＨＡを含む、世界的流行の脅威の観点から重要な株であるインフルエンザ株の例は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、およびＨ５Ｎ９である。Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株を少なくとも中和するＨＡ抗体が特に好ましい。好ましくは、ＨＡ抗体は、ＨＡタンパク質に結合するために、前記ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニット中のエピトープに依存しない。
定義
用語「ヒトＨＡ抗体」は、キメラ、ヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を含めたインタクトな免疫グロブリン、または免疫グロブリンの結合パートナー、例えば、Ｈ５Ｎ１への特異的な結合をインタクトな免疫グロブリンと競合する免疫グロブリンの断片を含む抗原結合ドメインおよび／もしくは可変ドメインを表す。構造にかかわらず、抗原結合断片は、インタクトな免疫グロブリンによって認識される同じ抗原に結合する。抗原結合断片は、ＨＡ抗体のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。
用語「ＨＡ抗体」は、当技術分野で公知のすべての免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスを含む。ＨＡ抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、ＨＡ抗体は、インタクトな抗体の５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分割することができ、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４にさらに分割される場合がある。
抗原結合断片には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および免疫グロブリンの断片を少なくとも含む（ポリ）ペプチド（上記断片は、上記（ポリ）ペプチドへ特異的抗原結合を与えるのに十分である）などが含まれる。上記断片は、合成で、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素切断もしくは化学切断によって作製することができ、あるいは上記断片は、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子操作することができる。作製方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ， Ｌａｎｅ編（１９８８年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＡ抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の結合部位を有することができる。１つを超える結合部位が存在する場合、結合部位は互いに同一であってもよく、または結合部位は異なっていてもよい。
ＨＡ抗体に関して、本明細書で使用する用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原上で認識されるエピトープと形状および荷電分布において相補的である抗原結合部位にかなりの程度まで通常寄与する、免疫グロブリンなどのＨＡ抗体の可変領域内の配列を意味する。ＨＡ抗体のＣＤＲ領域は、ネイティブコンフォメーションでタンパク質上に存在する場合の、または場合によっては、例えば、ＳＤＳ中の可溶化によって変性されたものとしてのタンパク質上に存在する場合の、タンパク質またはタンパク質断片の直鎖状エピトープ、不連続エピトープ、またはコンフォメーションエピトープに特異的となり得る。ＨＡ抗体のエピトープは、タンパク質の翻訳後修飾からなる場合もある。
本明細書で使用する用語「機能性バリアント」は、親ＨＡ抗体のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸によって変更されているが、依然として親ＨＡ抗体と結合パートナー、例えばＨ５Ｎ１への結合を競合することができるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むＨＡ抗体を指す。言い換えれば、親ＨＡ抗体のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列における修飾により、そのヌクレオチド配列によってコードされる、またはそのアミノ酸配列を含むＨＡ抗体の結合特性は著しく影響されず、変化もしない、すなわち、抗体は依然としてその標的を認識し、これに結合することができる。機能性バリアントは、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加、および欠失を含む保存的な配列修飾を有することができる。これらの修飾は、部位特異的変異誘発およびランダムＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準的な当技術分野で公知の技術によって導入することができ、天然ならびに非天然のヌクレオチドおよびアミノ酸を含むことができる。
保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が同様の構造的または化学的性質を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電の極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が含まれる。上記に使用した分類以外のアミノ酸残基ファミリーの分類も使用することができることが当業者に明確になる。さらに、ＨＡ抗体機能性バリアントは、非保存的アミノ酸置換、例えば、異なる構造的または化学的特性を有するアミノ酸残基とのアミノ酸の置き換えを有することができる。同様の軽微な変異はまた、アミノ酸の欠失もしくは挿入、または両方を含むことができる。免疫学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるのかを判定することにおけるガイダンスは、当技術分野で周知であるコンピュータープログラムを使用して見つけることができる。
ヌクレオチド配列内の変異は、トランジション変異もしくはトランスバージョン変異など、遺伝子座で行われる単一の変更（点変異）であってもよく、または代わりに、複数のヌクレオチドを単一の遺伝子座で挿入、欠失、もしくは変更することができる。加えて、１つまたは複数の変更を、ヌクレオチド配列内の任意の数の遺伝子座で行ってもよい。変異は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって実施することができる。
ＨＡ抗体に適用する場合、用語「ヒト」は、ヒトに直接由来するか、またはヒト配列に基づく分子を指す。ＨＡ抗体がヒト配列に由来するか、またはこれに基づき、続いて修飾される場合、このＨＡ抗体は、依然として、本明細書全体にわたって使用するようにヒトとみなされる。言い換えれば、ＨＡ抗体に適用する場合、用語ヒトは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するか、またはヒトもしくはヒトリンパ球中に存在する可変領域もしくは定常領域に基づき、何らかの形で修飾された可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。したがって、ヒトＨＡ抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み、置換および／または欠失（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含む場合がある。本明細書で使用する「基づく」とは、核酸配列が、鋳型から正確に、もしくは誤りがちなＰＣＲ方法などによって軽微な変異を伴ってコピーされ得るか、または鋳型に正確に、もしくは軽微な修飾を伴ってマッチするよう合成的に作製され得る状況を指す。ヒト配列に基づく半合成分子も、本明細書で使用するようにヒトとみなされる。
単鎖ＨＡ抗体
ＨＡ抗体の重鎖は、例えば、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子などの生殖系列Ｖ（可変）遺伝子に由来する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩＭ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＣ、Ｉｇｎａｔｏｖｉｔｃｈ Ｏ、Ｃｏｒｂｅｔｔ ＳＪ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ． Ｖ−ＢＡＳＥ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国：ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９７年）を参照）。本発明のＨＡ抗体は、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。ＨＡ抗体のＶＨ領域は、ＶＨ１またはＶＨ３ ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、ＨＡ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＶＨ１またはＶＨ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
本発明の特定の態様では、ＶＨ１生殖系列遺伝子は、ＶＨ１（１〜２）、ＶＨ１（１〜１８）、ＶＨ１（３〜２３）、またはＶＨ１（１〜６９）である。本発明の他の態様では、ＶＨ３生殖系列遺伝子はＶＨ３（３〜２１）である。
本発明のＨＡ抗体はまた、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２、およびＶＬ３からなる群より選択されるヒト生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩＭ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＣ、Ｉｇｎａｔｏｖｉｔｃｈ Ｏ、Ｃｏｒｂｅｔｔ ＳＪ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ． Ｖ−ＢＡＳＥ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国：ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９７年）を参照）。あるいは、ＨＡ抗体は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２、またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。ＨＡ抗体のＶＬ領域は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、ＨＡ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
本発明の特定の態様では、ＶＫＩ生殖系列遺伝子はＶＫＩ（Ａ２０）であり、ＶＫＩＩ生殖系列遺伝子はＶＫＩＩ（Ａ３）であり、ＶＫＩＩＩ生殖系列遺伝子はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）であり、ＶＫＩＶ生殖系列遺伝子はＶＫＩＶ（Ｂ３）である。本発明の他の態様では、ＶＬ１生殖系列遺伝子は、ＶＬ１（Ｖ１〜１３）、ＶＬ１（Ｖ１〜１６）、ＶＬ１（Ｖ１〜１７）、またはＶＬ１（Ｖ１〜１９）である。あるいは、ＶＬ２生殖系列遺伝子は、ＶＬ２（Ｖ１〜３）またはＶＬ２（Ｖ１〜４）である。さらに、ＶＬ３生殖系列遺伝子は、ＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＶＨ遺伝子座とＨＬ遺伝子座の具体的な組合せが、以下に記載されるそれぞれのＨＡ抗体について提供される。
本発明のＨＡ抗体のＣＤＲ領域は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔに記載されているように、Ｋａｂａｔら（１９９１年）によって決定された。本発明の特定の実施形態では、ＨＡ抗体は、本明細書に開示した２、３、４、５、または６つすべてのＣＤＲ領域を含む。好ましくは、ＨＡ抗体は、本明細書に開示したＣＤＲのうちの少なくとも２つを含む。
ＳＣ０６−１４１ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３１１に示す核酸配列および配列番号３１２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３０９）および軽鎖可変領域（配列番号３１０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜１８）であり、ＶＬ遺伝子座はＨＫＩＶ（Ｂ３）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−１４１抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＹＹＶＹ（ＨＣＤＲ１、配列番号２４７）、ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号２４８）およびＳＲＳＬＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５６８）。ＳＣ０６−１４１抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号５６９）、ＷＡＳＴＲＥＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５７０）およびＱＱＹＹＳＴＰＬＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号２８９）。
ＳＣ０６−２５５ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３１５に示す核酸配列および配列番号３１６に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３１３）および軽鎖可変領域（配列番号３１４）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ１（Ｖ１〜１６）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２５５抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−２５５抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＧＳＴＦＮＩＧＳＮＡＶＤ（ＬＣＤＲ１、配列番号５７４）、ＳＮＮＱＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５７５）およびＡＡＷＤＤＩＬＮＶＰＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号５７６）。
ＳＣ０６−２５７ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３１９に示す核酸配列および配列番号３２０に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３１７）および軽鎖可変領域（配列番号３１８）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ２（Ｖ１〜４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２５７抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−２５７抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（ＬＣＤＲ１、配列番号５７７）、ＥＶＳＮＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５７８）およびＳＳＹＴＳＳＳＴＹ（ＬＣＤＲ３、配列番号５７９）。
ＳＣ０６−２６０ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３２３に示す核酸配列および配列番号３２４に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３２１）および軽鎖可変領域（配列番号３２２）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ１（Ｖ１〜１７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２６０抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−２６０抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＧＳＲＳＮＶＧＤＮＳＶＹ（ＬＣＤＲ１、配列番号５８０）、ＫＮＴＱＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５８１）およびＶＡＷＤＤＳＶＤＧＹＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号５８２）。
ＳＣ０６−２６１ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３２７に示す核酸配列および配列番号３２８に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３２５）および軽鎖可変領域（配列番号３２６）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ１（Ｖ１〜１９）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２６１抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−２６１抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＤＹＶＳ（ＬＣＤＲ１、配列番号５８３）、ＤＮＮＫＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５８４）およびＡＴＷＤＲＲＰＴＡＹＶＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号５８５）。
ＳＣ０６−２６２ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３３１に示す核酸配列および配列番号３３２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３２９）および軽鎖可変領域（配列番号３３０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩ（Ａ２０）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２６２抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＳＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５８６）、ＧＩＳＰＬＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５８７）およびＧＰＫＹＹＳＥＹＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５８８）。ＳＣ０６−２６２抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号５８９）、ＤＡＳＴＬＲＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５９０）およびＱＲＹＮＳＡＰＰＩ（ＬＣＤＲ３、配列番号５９１）。
ＳＣ０６−２６８ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３３５に示す核酸配列および配列番号３３６に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３３３）および軽鎖可変領域（配列番号３３４）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２６８抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＭＧＭＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５９２）およびＳＳＧＹＹＰＥＹＦＱＤ（ＨＣＤＲ３、配列番号５９３）。ＳＣ０６−２６８抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＧＨＫＬＧＤＫＹＶＳ（ＬＣＤＲ１、配列番号５９４）、ＱＤＮＲＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５９５）およびＱＡＷＤＳＳＴＡ（ＬＣＤＲ３、配列番号５９６）。
ＳＣ０６−２７２ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３３９に示す核酸配列および配列番号３４０に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３３７）および軽鎖可変領域（配列番号３３８）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ２（Ｖ１〜３）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２７２抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＴ（ＨＣＤＲ１、配列番号５９７）、ＧＩＩＧＭＦＧＳＴＮＹＡＱＮＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５９８）およびＳＴＧＹＹＰＡＹＬＨＨ（ＨＣＤＲ３、配列番号５９９）。ＳＣ０６−２７２抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（ＬＣＤＲ１、配列番号５７７）、ＤＶＳＫＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６０１）およびＳＳＹＴＳＳＳＴＨＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６０２）。
ＳＣ０６−２９６ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３４３に示す核酸配列および配列番号３４４に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３４１）および軽鎖可変領域（配列番号３４２）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜２）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−２９６抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＹＭＨ（ＨＣＤＲ１、配列番号６０３）、ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６０４）およびＥＧＫＷＧＰＱＡＡＦＤＩ（ＨＣＤＲ３、配列番号６０５）。ＳＣ０６−２９６抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６４６）、ＤＡＳＳＲＡＴ（ＬＣＤＲ２、配列番号６０７）およびＱＱＹＧＳＳＬＷ（ＬＣＤＲ３、配列番号６０８）。
ＳＣ０６−３０１ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３４７に示す核酸配列および配列番号３４８に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３４５）および軽鎖可変領域（配列番号３４６）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（３〜２３）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩ（Ａ３）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３０１抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＩＹＡＭＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６０９）、ＡＩＳＳＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６１０）およびＡＹＧＹＴＦＤＰ（ＨＣＤＲ３、配列番号６１１）。ＳＣ０６−３０１抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（ＬＣＤＲ１、配列番号６１２）、ＬＧＳＮＲＡＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６１３）およびＭＱＡＬＱＴＰＬ（ＬＣＤＲ３、配列番号６１４）。
ＳＣ０６−３０７ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３５１に示す核酸配列および配列番号３５２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３４９）および軽鎖可変領域（配列番号３５０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ３（３〜２１）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３０７抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＳＭＮ（ＨＣＤＲ１、配列番号６１５）、ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＶＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６１６）およびＧＧＧＳＹＧＡＹＥＧＦＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号６１７）。ＳＣ０６−３０７抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＲＶＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６１８）、ＧＡＳＴＲＡＡ（ＬＣＤＲ２、配列番号６１９）およびＱＱＹＧＲＴＰＬＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号６２０）。
ＳＣ０６−３１０ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３５５に示す核酸配列および配列番号３５６に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３５３）および軽鎖可変領域（配列番号３５４）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３１０抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−３１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号６２１）、ＤＤＳＤＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６２２）およびＱＶＷＤＳＳＳＤＨＡＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６２３）。
ＳＣ０６−３１４ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３５９に示す核酸配列および配列番号３６０に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３５７）および軽鎖可変領域（配列番号３５８）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ１（Ｖ１〜１７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３１４抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号５７２）およびＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号５７３）。ＳＣ０６−３１４抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＹ（ＬＣＤＲ１、配列番号６２４）、ＲＤＧＱＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６２５）およびＡＴＷＤＤＮＬＳＧＰＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６２６）。
ＳＣ０６−３２３ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３６３に示す核酸配列および配列番号３６４に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３６１）および軽鎖可変領域（配列番号３６２）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３２３抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＧＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６２７）、ＤＩＩＧＭＦＧＳＴＮＹＡＱＮＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６２８）およびＳＳＧＹＹＰＡＹＬＰＨ（ＨＣＤＲ３、配列番号６２９）。ＳＣ０６−３２３抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６４６）、ＧＡＳＳＲＡＴ（ＬＣＤＲ２、配列番号６３１）およびＱＱＹＧＳＳＰＲＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号６３２）。
ＳＣ０６−３２５ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３６７に示す核酸配列および配列番号３６８に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３６５）および軽鎖可変領域（配列番号３６６）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ２（Ｖ１〜４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３２５抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＦＹＳＭＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６３３）、ＧＩＩＰＭＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６３４）およびＧＤＫＧＩＹＹＹＹＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号６３５）。ＳＣ０６−３２５抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（ＬＣＤＲ１、配列番号５７７）、ＥＶＳＮＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５７８）およびＳＳＹＴＳＳＳＴＬＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６３６）。
ＳＣ０６−３２７ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３７１に示す核酸配列および配列番号３７２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３６９）および軽鎖可変領域（配列番号３７０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３２７抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＴＨＡＩＳ（配列番号６３７）、ＧＩＩＡＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６３８）およびＧＳＧＹＨＩＳＴＰＦＤＮ（配列番号６３９）。ＳＣ０６−３２７抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＮＮＩＧＳＫＧＶＨ（配列番号６４０）、ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号６２２）およびＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（配列番号６４２）。
ＳＣ０６−３２８ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３７５に示す核酸配列および配列番号３７６に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３７３）および軽鎖可変領域（配列番号３７４）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３２８抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６４３）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６４４）およびＶＫＤＧＹＣＴＬＴＳＣＰＶＧＷＹＦＤＬ（ＨＣＤＲ３、配列番号６４５）。ＳＣ０６−３２８抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６４６）、ＧＡＳＳＲＡＴ（ＬＣＤＲ２、配列番号６３１）およびＱＱＹＧＳＳＬＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号６４８）。
ＳＣ０６−３２９ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３７９に示す核酸配列および配列番号３８０に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３７７）および軽鎖可変領域（配列番号３７８）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３２９抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＮＳＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６４９）、ＧＩＦＡＬＦＧＴＴＤＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６５０）およびＧＳＧＹＴＴＲＮＹＦＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号６５１）。ＳＣ０６−３２９抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＬＧ（ＬＣＤＲ１、配列番号６５２）、ＧＡＳＳＲＡＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６５３）およびＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号６５４）。
ＳＣ０６−３３１ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３８３に示す核酸配列および配列番号３８４に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３８１）および軽鎖可変領域（配列番号３８２）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３３１抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号５７１）、ＧＩＩＧＭＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６５５）およびＧＮＹＹＹＥＳＳＬＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号６５６）。ＳＣ０６−３３１抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号６２１）、ＤＤＳＤＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６２２）およびＱＶＷＤＳＳＳＤＨ（ＬＣＤＲ３、配列番号６５７）。
ＳＣ０６−３３２ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３８７に示す核酸配列および配列番号３８８に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３８５）および軽鎖可変領域（配列番号３８６）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩ（Ａ２０）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３３２抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＮＦＡＩＮ（ＨＣＤＲ１、配列番号６５８）、ＧＩＩＡＶＦＧＴＴＫＹＡＨＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６５９）およびＧＰＨＹＹＳＳＹＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号６６０）。ＳＣ０６−３３２抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＧＩＳＴＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６６１）、ＡＡＳＴＬＱＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６６２）およびＱＫＹＮＳＡＰＳ（ＬＣＤＲ３、配列番号６６３）。
ＳＣ０６−３３４ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３９１に示す核酸配列および配列番号３９２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３８９）および軽鎖可変領域（配列番号３９０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３３４抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＮＡＶＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６６４）、ＧＩＬＧＶＦＧＳＰＳＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６６５）およびＧＰＴＹＹＹＳＹＭＤＶ（ＨＣＤＲ３、配列番号６６６）。ＳＣ０６−３３４抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＮＮＩＧＲＮＳＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号６６７）、ＤＤＳＤＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６２２）およびＱＶＷＨＳＳＳＤＨＹＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６６９）。
ＳＣ０６−３３６ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３９５に示す核酸配列および配列番号３９６に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３９３）および軽鎖可変領域（配列番号３９４）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＩＩ（Ａ２７）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３３６抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号６７０）、ＧＩＦＧＭＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号６７１）およびＳＳＧＹＹＰＱＹＦＱＤ（ＨＣＤＲ３、配列番号６７２）。ＳＣ０６−３３６抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号６４６）、ＧＡＳＳＲＡＴ（ＬＣＤＲ２、配列番号６３１）およびＱＱＹＧＳＳＳＬＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号３０８）。
ＳＣ０６−３３９ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号３９９に示す核酸配列および配列番号４００に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３９７）および軽鎖可変領域（配列番号３９８）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３３９抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号３０３）、ＧＩＩＡＩＦＨＴＰＫＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号３０６）およびＧＳＴＹＤＦＳＳＧＬＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号７２５）。ＳＣ０６−３３９抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号６２１）、ＤＤＳＤＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号６２２）およびＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号６４２）。
ＳＣ０６−３４２ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号４０３に示す核酸配列および配列番号４０４に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４０１）および軽鎖可変領域（配列番号４０２）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＫＩＶ（Ｂ３）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３４２抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＳＹＡＩＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号２５１）、ＧＶＩＰＩＦＲＴＡＮＹＡＱＮＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号２４９）およびＬＮＹＨＤＳＧＴＹＹＮＡＰＲＧＷＦＤＰ（ＨＣＤＲ３、配列番号２４６）。ＳＣ０６−３４２抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＫＳＳＱＳＩＬＮＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（ＬＣＤＲ１、配列番号２４５）、ＷＡＳＴＲＥＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号５７０）およびＱＱＹＹＳＳＰＰＴ（ＬＣＤＲ３、配列番号２５０）。
ＳＣ０６−３４３ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号４０７に示す核酸配列および配列番号４０８に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４０５）および軽鎖可変領域（配列番号４０６）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ３（Ｖ２〜１４）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３４３抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＹＹＡＭＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号２４２）、ＧＩＳＰＭＦＧＴＴＴＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号３０７）およびＳＳＮＹＹＤＳＶＹＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号２９０）。ＳＣ０６−３４３抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＧＧＨＮＩＧＳＮＳＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号２２４）、ＤＮＳＤＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号２２３）およびＱＶＷＧＳＳＳＤＨ（ＬＣＤＲ３、配列番号２２７）。
ＳＣ０６−３４４ ＨＡ特異的単鎖Ｆｖ抗体は、配列番号４１１に示す核酸配列および配列番号４１２に示すアミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４０９）および軽鎖可変領域（配列番号４１０）を含む。ＶＨ遺伝子座はＶＨ１（１〜６９）であり、ＶＬ遺伝子座はＶＬ１（Ｖ１〜１３）である。
ＣＤＲを包含するアミノ酸を、以下の配列中で、太字で強調する。ＳＣ０６−３４４抗体の重鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＮＹＡＭＳ（ＨＣＤＲ１、配列番号２２２）、ＧＩＩＡＩＦＧＴＰＫＹＡＱＫＦＱＧ（ＨＣＤＲ２、配列番号２２１）およびＩＰＨＹＮＦＧＳＧＳＹＦＤＹ（ＨＣＤＲ３、配列番号２２０）。ＳＣ０６−３４４抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲ配列を有する：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ（ＬＣＤＲ１、配列番号２１９）、ＧＮＳＮＲＰＳ（ＬＣＤＲ２、配列番号２３１）およびＧＴＷＤＳＳＬＳＡＹＶ（ＬＣＤＲ３、配列番号２８０）。
ＩｇＧ ＨＡ抗体
ＣＲ６１４１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号２７９に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４１３に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１９９）を含む。ＣＲ６１４１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体はまた、配列番号４１５に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４１６に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４１４）を含む。
ＣＲ６２５５ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４１８に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４１９に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４１７）を含む。またＣＲ６２５５ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４２１に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４２２に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４２０）を含む。
ＣＲ６２５７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４２４に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４２５に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４２３）を含む。またＣＲ６２５７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４２７に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４２８に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４２６）を含む。
ＣＲ６２６０ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４３０に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４３１に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４２９）を含む。またＣＲ６２６０ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４３３に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４３４に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４３２）を含む。
ＣＲ６２６１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４３６に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４３７に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４３５）を含む。またＣＲ６２６１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４３９に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４４０に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４３８）を含む。
ＣＲ６２６２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４４２に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４４３に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４１）を含む。またＣＲ６２６２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４４５に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４４６に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４４４）を含む。
ＣＲ６２６８ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４４８に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４４９に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４７）を含む。またＣＲ６２６８ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４５１に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４５２に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４５０）を含む。
ＣＲ６２７２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４５４に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４５５に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４５３）を含む。またＣＲ６２７２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４５７に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４５８に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４５６）を含む。
ＣＲ６９６ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４６０に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４６１に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４５９）を含む。またＣＲ６２９６ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４６３に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４６４に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６２）を含む。
ＣＲ６３０１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４６６に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４６７に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４６５）を含む。またＣＲ６３０１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４６９に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４７０に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６８）を含む。
ＣＲ６３０７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４７２に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４７３に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４７１）を含む。またＣＲ６３０７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４７５に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４７６に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４７４）を含む。
ＣＲ６３１０ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４７８に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４７９に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４７７）を含む。またＣＲ６３１０ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４８１に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４８２に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４８０）を含む。
ＣＲ６３１４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４８４に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４８５に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４８３）を含む。またＣＲ６３１４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４８７に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４８８に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４８６）を含む。
ＣＲ６３２３ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４９０に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４９１に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４８９）を含む。またＣＲ６３２３ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４９３に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号４９４に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４９２）を含む。
ＣＲ６３２５ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４９６に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号４９７に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４９５）を含む。またＣＲ６３２５ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号４９９に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５００に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４９８）を含む。
ＣＲ６３２７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５０２に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５０３に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５０１）を含む。またＣＲ６３２７ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５０５に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５０６に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５０４）を含む。
ＣＲ６３２８ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５０８に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５０９に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５０７）を含む。またＣＲ６３２８ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５１１に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５１２に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５１０）を含む。
ＣＲ６３２９ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５１４に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５１５に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５１３）を含む。またＣＲ６３２９ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５１７に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５１８に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５１６）を含む。
ＣＲ６３３１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５２０に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５２１に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５１９）を含む。またＣＲ６３３１ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５２３に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５２４に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５２２）を含む。
ＣＲ６３３２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５２６に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５２７に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５２５）を含む。またＣＲ６３３２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５２９に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５３０に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５２８）を含む。
ＣＲ６３３４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５３２に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５３３に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５３１）を含む。またＣＲ６３３４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５３５に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５３６に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５３４）を含む。
ＣＲ６３３６ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５３８に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５３９に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５３７）を含む。またＣＲ６３３６ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５４１に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５４２に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５４０）を含む。
ＣＲ６３３９ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５４５に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５４６に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５４３）を含む。またＣＲ６３３９ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５４８に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５４９に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５４７）を含む。
ＣＲ６３４２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５５１に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５５２に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５５０）を含む。またＣＲ６３４２ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５５４に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５５５に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５５３）を含む。
ＣＲ６３４３ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５５７に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５５８に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５５６）を含む。またＣＲ６３４３ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５６０に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５６１に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５５９）を含む。
ＣＲ６３４４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５６３に示す重鎖ヌクレオチド配列および配列番号５６４に示す重鎖アミノ酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５６２）を含む。またＣＲ６３４４ ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体は、配列番号５６６に示す軽鎖ヌクレオチド配列および配列番号５６７に示す軽鎖アミノ酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５６５）を含む。
ＨＡ抗体エピトープ
本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質（ＨＡ）（赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）としても公知）のＨＡ２サブユニット内のエピトープを認識し、これに結合することができる単離されたヒトＨＡ抗体であって、上記ＨＡ抗体がＨ５サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルス５に対して中和活性を有することを特徴とする抗体に関する。Ｈ５サブタイプのそのようなＨＡを含む、世界的流行の脅威の観点から重要な株であるインフルエンザ株の例は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、およびＨ５Ｎ９である。Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株を少なくとも中和するＨＡ抗体が特に好ましい。好ましくは、本発明のＨＡ抗体は、ＨＡタンパク質に結合するのに、前記ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニット内のエピトープに依存しない。
本発明のいくつかの抗体（ＣＲ６３０７およびＣＲ６３２３など）は、コンフォメーションエピトープに依存せず、還元型においてでさえＨＡ２エピトープを認識する（ウエスタンブロッティングにおいて使用される場合）。これは、当技術分野の抗体に勝る利点である。なぜならば、タンパク質の別の部分における何らかの変異によりＨＡタンパク質内でコンフォメーション変化が誘導される際、そのようなコンフォメーション変化は、本発明の抗体がＨＡ２エピトープに結合するのを妨害しない可能性が高く、一方、コンフォメーションに依存する抗体は、そのような変異が起こる際に結合しにくい場合があるからである。
別の好ましい実施形態では、本発明のＨＡ抗体は、Ｈ１サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルスに対する中和活性も有し、好ましくは、ＨＡ抗体は、Ｈ２、Ｈ６および／またはＨ９サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルスに対する中和活性も有する。本発明のＨＡ抗体は、Ｈ５、ＨＩ、Ｈ２、Ｈ６、およびＨ９サブタイプ中に存在するＨＡ２エピトープ内に存在するエピトープと相互作用する（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９３５６を参照、ＷＯ２００８／０２８９４６として公開、参照によりその内容全体が組み込まれる）。本発明のＨＡ抗体は、このエピトープ共有のために、インフルエンザサブタイプ間で交差中和することが示されている。
本発明の別の好ましい態様では、本発明のＨＡ抗体は、アミノ酸配列：ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号１９８）、ＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＮＫ（配列番号２８３）、ＧＶＴＮＫＥＮＳＩＩＤＫ（配列番号２０２）、ＧＶＴＮＫＶＮＲＩＩＤＫ（配列番号２０１）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫ（配列番号２８１）、ＧＩＴＮＫＥＮＳＶＩＥＫ（配列番号２５７）、ＧＩＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号２２５）、およびＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫ（配列番号２１６）からなる群より選択されるエピトープに結合する。本発明の特定のＨＡ抗体、すなわち、ＣＲ６２６１、ＣＲ６３２５、およびＣＲ６３２９は、Ｈ５Ｎ１中に存在するＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫ（配列番号１９８）エピトープと相互作用し、Ｃ１７９の結合に確かに影響するＨＡ１中のＴＧＬＲＮ（配列番号２００）エピトープ内の変異によって妨害されない。さらに、ＣＲ６３０７およびＣＲ６３２３などの一部のＨＡ抗体は、Ｏｋｕｎｏら（１９９３年）に開示されているように、６位でのバリン−＞グルタミン酸変異（ＧＶＴＮＫＥＮＳＩＩＤＫ（配列番号２０２）によって例示）を伴うエスケープ変異体によってでさえ妨害されない。このエピトープは、ＨＡ２領域内の伸長されたアルファへリックスの一部である。最も溶媒に曝露されると予測される、この推定エピトープ内の残基を太字で強調する：ＧＶ−ＴＮＫＥＮＳＩＩＤＫ（配列番号２０２）。これらのアミノ酸は、ＨＡ抗体に最もアクセス可能であり、したがって、エピトープの最も重要な領域を形成する場合がある。この概念と一致して、強調された（太字の）アミノ酸は、示されているすべての配列において同一性および位置において絶対的に保存されている。この知識は、上記と同じ配列を担持しないインフルエンザサブタイプ（すなわち、Ｈ３、Ｈ７、およびＢ株）においてエピトープへの結合を予測するのに使用することができる。
ＨＡ抗体ＩＩ
本発明は、インフルエンザＡウイルスに結合し、インフルエンザＡウイルスが細胞に感染するのを阻害する中和ヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明の中和ヒトモノクローナル抗体は、インフルエンザウイルスの表面上に露出されているタンパク質内のエピトープに結合するが、本発明は、比較的不変のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に着目する。インフルエンザＨＡタンパク質に対して産生される中和ＭＡｂは、そのネイティブコンフォメーションで維持され、これは、アミノ酸配列に対する小さい変化に依存しないので、すべてのインフルエンザＡ株に対して優れた治療をもたらす。
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質は、感染前の標的細胞の表面上の単糖シアル酸含有受容体に結合することによって、ウイルスが標的細胞を認識することに関与している。さらに、インフルエンザＨＡタンパク質は、宿主エンドソーム膜をウイルス膜に融合させることによって、標的細胞内へのウイルスゲノムの侵入に関与している。
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質は、インフルエンザウイルスの表面上に見つかるホモ三量体内在性膜糖タンパク質である。宿主細胞のタンパク質合成機構を使用して、インフルエンザＨＡタンパク質は、小胞体中で単鎖前駆体ポリペプチド（ＨＡ０）として最初に合成され、そこでさらにホモ三量体としてアセンブルされる。得られるＨＡホモ三量体は、その後、ゴルジネットワークを介して細胞表面にエクスポートされる。細胞表面上に位置したＨＡホモ三量体は、宿主で産生されるプロテアーゼによって切断されて、２つのより小さいペプチドサブユニット、すなわち、ＨＡ１およびＨＡ２になる。ＨＡ２サブユニットは、ウイルス膜に繋ぎ止められた長いヘリックス鎖を形成し、一方、ＨＡ１サブユニットは、ＨＡ２サブユニットを覆って大きい小球を形成する。ＨＡ０前駆体を、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含有する成熟ＨＡタンパク質に変換する切断工程は、インフルエンザのウイルス病原性に必須である。構造的に、成熟ＨＡタンパク質は、中心のα−ヘリックスコイルを含有し、３つの球状ヘッドを有する全体的に円筒の形状をもたらす。ＨＡタンパク質、特に、成熟ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニットは、宿主細胞上の末端シアル酸を含むグリカンを含有する受容体に結合する。シアル酸がガラクトースに接続される様式、例えば、トリ血清型に見られるα２−３連結対ヒト血清型に見られるα２−６連結は、インフルエンザウイルスの種特異性を決定するだけでなく、異種間感染も予防する。しかし、Ｈ１およびＨ３などのＨＡの特定の血清型内で、トリからヒトに種特異性を変換するのに、フレームワーク配列中の２つのアミノ酸変異のみが要求される。
感染を媒介するために、インフルエンザＨＡタンパク質は、標的細胞の表面上に存在するシアル酸含有受容体に最初に結合する。これによって、標的細胞膜は、インフルエンザウイルスをエンドサイトーシスするか、または飲み込む。エンドソーム内部に入り、宿主細胞がそのコンパートメントを酸性化すると、インフルエンザＨＡタンパク質は、部分的にアンフォールドし、非常に疎水性の融合ペプチドを現し、これは、それ自体をエンドソーム膜内に挿入する。インフルエンザＨＡタンパク質の残りがリフォールドする際に、融合タンパク質は、エンドソーム膜を収縮させ、それをウイルス膜と融合する。細胞膜とウイルス膜が融合した後、ウイルスゲノムを含むウイルスの内容物が標的細胞の細胞質内に放出される。
少なくとも１６の異なるインフルエンザＡ赤血球凝集素血清型または抗原、すなわち、Ｈ１〜Ｈ１６が同定されている。ＨＡ血清型のＨ１〜Ｈ３のみが、通常、ヒトインフルエンザ感染を媒介する。しかし、特定のトリ種または哺乳動物種のみに感染すると考えられているインフルエンザ株は、変異してヒトに感染し得る。上述したように、インフルエンザが種の壁を越えることを可能にするのに、数個のアミノ酸のみがタンパク質全体の長さに沿って変化する必要がある。例えば、Ｈ５サブタイプの配列中の１つのアミノ酸変化は、トリに特異的なインフルエンザ株がヒトに感染性となることを可能にした（Ｈ５Ｎ１）。ブタ種に一般的なインフルエンザ株がヒトに対して致死性となったとき（Ｈ１Ｎ１）、世界的流行が発生した。インフルエンザＡとは対照的に、インフルエンザＢおよびＣウイルスはそれぞれ、ＨＡタンパク質の１つの形態のみを含有する。
具体的には、本発明は、以下の特徴を有する単離された完全ヒトモノクローナル抗体を提供する：ａ）インフルエンザＡウイルスに結合する；ｂ）インフルエンザＡと接触した細胞に結合する；ｃ）インフルエンザＡウイルスタンパク質のエピトープに結合する；任意選択で、ｄ）インフルエンザＡウイルス感染を中和する。インフルエンザＡウイルス感染を中和しない抗体を、例えば、コンジュゲート療法に使用することができる。特定の態様では、この抗体は、真核細胞に結合する。さらに、細胞は、任意選択でヒト細胞である。
別の態様では、この抗体は、ヒトドナーのＢ細胞から単離される。Ｂ細胞からの本発明の完全ヒトモノクローナル抗体の単離は、組換え法を使用して実施される。代替としてまたは追加的に、本発明の単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで培養された形質細胞の上清から単離される。形質細胞は、分化Ｂ細胞、形質Ｂ細胞、プラスマ細胞、またはエフェクターＢ細胞としても公知である。Ｂ細胞または形質細胞のいずれかから単離される完全ヒトモノクローナル抗体は、中和活性を示す。
本発明の抗体は、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のエピトープに結合する。本発明の抗体が結合する例示的なＨＡエピトープには、赤血球凝集素前駆体ペプチド（ＨＡ０）、ＨＡ１サブユニット、ＨＡ２サブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２を含有する成熟タンパク質、ならびに組換えＨＡポリペプチドが含まれる。あるいは、本発明の抗体は、赤血球凝集素前駆体ペプチド（ＨＡ０）、ＨＡ１サブユニット、ＨＡ２サブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２を含有する成熟タンパク質、または組換えＨＡポリペプチド内のエピトープに結合する。組換えＨＡポリペプチドは、例えば、配列番号７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、または７４４の配列によってコードされる。
本発明の抗体は、直鎖状または非直鎖状であるエピトープに結合する。本発明の特定の態様では、非直鎖状エピトープは、不連続エピトープである。
本発明の抗体は、
である。
本発明はさらに、
と同じエピトープに結合する抗体を包含する。
本発明は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む可変重鎖（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、ヒトＩＧＨＶ１（もしくは特に、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８）、ＩＧＨＶ２（もしくは特に、ＩＧＨＶ２−５）、ＩＧＨＶ３（もしくは特に、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、６６、ＩＧＨＶ３−７）、ＩＧＨＶ４（もしくは特に、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１）、もしくはＩＧＨＶ５（もしくは特に、ＩＧＨＶ５−５１）ＶＨ生殖系列配列またはその対立遺伝子、あるいはＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と相同である核酸配列によってコードされる、単離された完全ヒトモノクローナル抗ＨＡ抗体またはその断片を提供する。一態様では、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、またはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列配列と相同である核酸配列は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、またはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列配列またはその対立遺伝子と少なくとも７５％相同である。例示的な対立遺伝子には、それだけには限定されないが、
が含まれる。
本発明の抗体、または特に、本明細書に記載の任意の抗体は、治療剤または検出可能な標識に作動可能に連結することができる。
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体および薬学的担体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤、またはウイルス付着阻害剤を任意選択で含む。例示的な抗ウイルス薬には、それだけには限定されないが、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、およびＭ２イオンチャネル阻害剤が含まれる。この組成物の一実施形態では、Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、アマンタジンまたはリマンタジンである。代替としてまたは追加的に、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。この組成物は、第２の抗インフルエンザＡ抗体も含むことができる。第２の抗インフルエンザＡ抗体は、任意選択で本明細書に記載の抗体である。
本発明は、被験体に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験体において免疫応答を刺激する方法を提供する。
さらに、本発明は、被験体に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験体においてインフルエンザウイルス感染症を処置するための方法を提供する。この方法はさらに、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤、またはウイルス付着阻害剤を投与することを含む。
本発明は、インフルエンザウイルスへの被験体の曝露前、または感染前に、被験体に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験体においてインフルエンザウイルス感染症を予防するための方法も提供する。この方法はさらに、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤、またはウイルス付着阻害剤を投与することを含む。この方法は、ワクチン接種の方法とすることができる。
これらの方法の被験体は、インフルエンザ感染症を有している場合があり、またはインフルエンザウイルス感染症を発症する素因がある。インフルエンザ感染症を発症する素因がある被験体、あるいは感染症に罹患するリスクが上昇し得る被験体は、自己免疫疾患のために免疫系が損なわれている被験体、免疫抑制療法を受けている人（例えば、臓器移植の後に）、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）、または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、白血球を激減もしくは破壊する特定の形態の貧血に苦しめられている人、放射線療法または化学療法を受けている人、あるいは炎症性障害に苦しめられている人である。さらに、極端な幼齢または老齢の被験体は、リスクが増大している。感染した個体と物理的に接触している任意の人、または物理的にごく接近している任意の人は、インフルエンザウイルス感染症を発症するリスクが増大している。さらに、例えば、人口密集都市に居住している被験体、またはインフルエンザウイルスの感染が確認されたか、もしくはその疑いのある被験体にごく接近している被験体、または選択された職業、例えば、病院従事者、製薬研究者、感染地域への旅行者、または頻繁に飛行機を利用する人は、疾患のアウトブレイクに近接していることに起因してインフルエンザ感染症に罹患するリスクがある。
本明細書に記載の方法によれば、例示的な抗ウイルス薬には、それだけには限定されないが、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、およびＭ２イオンチャネルが含まれる。これらの方法の一態様では、Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、アマンタジンまたはリマンタジンである。代替としてまたは追加的に、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。
これらの方法は、第２の抗インフルエンザＡ抗体を投与することを任意選択で含む。例えば、抗体は、インフルエンザウイルスへの曝露前またはその後に投与される。これらの方法の特定の態様では、抗体は、ウイルスのクリアランスを促進するか、またはインフルエンザＡ感染細胞を排除するために十分な用量で投与される。第２の抗体は、任意選択で本明細書に記載の抗体である。
本発明はさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染症の存在を決定するための方法であって、（ａ）被験体から得た生物学的試料を、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の医薬組成物と接触させる工程、（ｂ）生物学的試料に結合する抗体の量を検出する工程、および（ｃ）生体試料に結合する抗体の量を対照値と比較し、それから被験体におけるインフルエンザウイルスの存在を決定する工程を含む、方法を提供する。
本発明は、本明細書に記載の抗体を含むワクチン組成物を提供する。この組成物は、薬学的担体を任意選択で含有する。
あるいは、本発明は、本明細書に記載の抗体のエピトープを含むワクチン組成物を提供する。この組成物は、薬学的担体を任意選択で含有する。
本発明のワクチンは、多価ワクチンである。用語「多価ワクチン」は、２つ以上の感染性因子、例えば、インフルエンザＡの複数の株に由来する組換えホモ三量体ＨＡ０タンパク質もしくはこれらの断片（表９を参照されたい）、または分子のいくつかの異なるエピトープ、例えば、インフルエンザＡの１つの株に由来する同じ組換えホモ三量体ＨＡ０タンパク質もしくはこれらの断片の直鎖状エピトープおよび不連続エピトープに対して免疫応答を誘発する単一ワクチンを表すように意味する。代替としてまたは追加的に、用語、多価ワクチンは、２つ以上の感染性因子に対して産生されるヒト抗体の組合せ、例えば、インフルエンザＡの複数の株に由来する組換えホモ三量体ＨＡ０タンパク質またはこれらの断片に対して産生されるＨｕＭＨＡ抗体の組合せの投与を表すように意味する（表９を参照されたい）。
本発明は、本明細書に記載の抗体を含む診断キットを提供する。
本発明は、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の抗体のエピトープを含む予防キットを提供する。代替としてまたは追加的に、本発明は、本明細書に記載のワクチン組成物を含む予防キットを提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、インフルエンザ感染を中和する、インフルエンザ赤血球凝集素糖タンパク質に対して特異的である完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。任意選択で、抗体は、哺乳動物ドナー、好ましくはヒトドナーのＢ細胞から単離される。本発明の特定の実施形態では、抗体は、インタクトなインフルエンザウイルスまたは全インフルエンザウイルスに結合するその能力について同定される。代替としてまたは追加的に、抗体は、複数のインフルエンザ株から単離される、または表９に示したインフルエンザＡウイルス株などの組換えタンパク質として作製される組換えホモ三量体インフルエンザＨＡ０タンパク質またはＨＡタンパク質（複数可）のエピトープに結合するその能力について同定および単離される。代替としてまたは追加的に、抗体は、感受性真核細胞のウイルス感染を阻害または中和するその能力について同定される。このプロファイルの例示的な中和抗体には、それだけには限定されないが、表１０に列挙した抗体が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体は、表１０に示した抗体と同じエピトープに結合する抗体である。特定の実施形態では、本発明の中和ヒトモノクローナル抗体は、抗ＨＡ抗体である。本発明のモノクローナル抗ＨＡ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ａ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のＨＡ１サブユニット中のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のＨＡ２サブユニット中のエピトープに結合する；ｃ）ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットからなるインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；ｄ）組換えホモ三量体インフルエンザＨＡ０タンパク質のエピトープに結合する；ｅ）感染細胞上に発現したインフルエンザＨＡタンパク質のエピトープに結合する；ｆ）改変細胞上に発現したインフルエンザＨＡタンパク質のエピトープに結合する；ｇ）インフルエンザウイルスに結合する；またはｈ）感受性真核細胞のウイルス感染を阻害する。
本発明の改変細胞は、インフルエンザＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片をトランスフェクトされ、またはそれで形質転換されている。用語「インフルエンザＨＡタンパク質断片」は、全タンパク質より小さい、またはそれ未満であるタンパク質の任意の部分を表すように意味する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、必ずしも機能的なインフルエンザＨＡタンパク質をコードするとは限らない。
本発明の感染細胞は、起源が哺乳動物、好ましくはヒトである。具体的には、哺乳動物細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養液中、およびこれらの任意の組合せで、インフルエンザＡウイルスに感染させられる。細胞は、活性または不活性ビリオンに感染させられる。例示的な不活性ビリオンは、これらの表面上でＨＡタンパク質を表示するが、これらは複製欠損性であり、したがって、細胞または被験体内で増殖することができない。
本発明のヒトモノクローナル抗体のエピトープは、膜貫通または内在性膜インフルエンザＡタンパク質を含む。具体的には、本発明のヒトモノクローナル抗体のエピトープは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を含む。
本発明のヒトモノクローナル抗体のエピトープは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の１つまたは複数のサブユニットを含む。本発明のＨＡタンパク質には、赤血球凝集素前駆体タンパク質（ＨＡ０）、ＨＡ１サブユニット、ＨＡ２サブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含有する成熟タンパク質、ならびに組換えＨＡタンパク質が含まれる。組換えＨＡタンパク質は、配列番号７２６を含有する。例示的な組換えタンパク質には、それだけには限定されないが、配列番号７２７〜７４４によって記述されるタンパク質が含まれる。
本発明のヒトモノクローナル抗体のエピトープは、直鎖状または非直鎖状である。例えば、非直鎖状エピトープは不連続である。不連続エピトープは、インフルエンザＨＡタンパク質がそのネイティブホモ三量体コンフォメーションで維持される場合にのみ、抗体結合に利用可能である。抗体が不連続エピトープに結合する場合、抗体は、標的タンパク質、すなわち、インフルエンザＨＡタンパク質の３次元表面に結合し、並べて置かれているアミノ酸が代わりに露出またはマスクされる。
本発明の組換えホモ三量体ＨＡ０タンパク質は、例えば、配列番号７２７〜７４４のいずれか１つによって記述される配列によってコードされる。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体、またはモノクローナル抗ＨＡ抗体は、膜結合性または可溶性組換えホモ三量体インフルエンザＨＡタンパク質に結合する。あるいは、本明細書に記載のモノクローナル抗ＨＡ抗体は、膜結合性および可溶性組換えホモ三量体インフルエンザＨＡタンパク質に結合する。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載のモノクローナル抗ＨＡ抗体は、インフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ２、およびＨ３に結合し、これらを中和する。本発明の他の実施形態では、モノクローナル抗ＨＡ抗体は、インフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ２、およびＨ３に結合し、これらのサブタイプ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、またはＨ３などの１つを中和する。特定の実施形態では、モノクローナル抗ＨＡ抗体は、インフルエンザサブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２に結合し、Ｈ１Ｎ１を中和する。
一態様では、可溶性および組換えホモ三量体インフルエンザＨＡタンパク質のＨＡ前駆体ポリペプチド（ＨＡ０）は、ファージＴ４フィブリチン内でコードされる三量体形成ドメイン（フォールドン（ｆｏｌｄｏｎ））を含有する。ファージＴ４フィブリチンから単離される例示的な三量体形成ドメインは、以下の配列を有し、ここでトロンビン切断部位はイタリック体および太字で示され、Ｔ４三量体形成ドメインまたは配列に下線が引かれ、Ｖ５タグは四角で囲まれ、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグは太字で示されている：
本明細書で使用する、用語「中和抗体」は、インフルエンザＡ感染症を阻害または防止するか、細胞内へのインフルエンザＡウイルス侵入を阻害または防止するか、インフルエンザ複製を阻害もしくは防止するか、宿主細胞からのインフルエンザ放出を阻害もしくは防止するか、または細胞、生物学的試料、もしくは被験体におけるインフルエンザＡ力価を低減する抗体を表すように意味する。好ましい実施形態では、本発明の中和抗体は、宿主細胞の細胞質コンパートメント内へのウイルス侵入を防止する。
本発明は、インフルエンザウイルスに結合し、感染を中和する完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に対して特異的な完全ヒトモノクローナル中和抗体を提供する。本明細書でそれぞれ参照される抗体は、ヒトモノクローナル抗ＨＡ（ｈｕＭＨＡ）抗体である。
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質は、インフルエンザウイルスの表面上に見つかるホモ三量体内在性膜糖タンパク質である。このホモ三量体タンパク質のネイティブコンフォメーションを模倣するために、本発明の方法は、ファージＴ４フィブリチンタンパク質の三量体形成ドメインまたはフォールドンドメインに作動可能に連結した単離ＨＡタンパク質前駆体を提供する。
得られる組換えホモ三量体フォールドンＨＡタンパク質は、ネイティブインフルエンザ赤血球凝集素ホモ三量体コンフォメーションを保持するだけでなく、可溶性にもなり、すなわち、このタンパク質は、ウイルス膜または細胞膜にもはや結合されない。具体的には、これらの組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、内在性膜ドメインまたは膜貫通ドメインを欠いている。特定の実施形態では、これらの組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニット、ならびに三量体形成ドメインを含み、得られる組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００のアミノ酸（ａａ）、またはその間の任意の長さのアミノ酸を含有する。好ましくは、これらの組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、５６５〜５７５のアミノ酸（ａａ）を含有する。組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、１５〜２５のａａを含有するＮ末端におけるシグナル切断部位をさらに含む。代替としてまたは追加的に、組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、インフルエンザＡウイルスサブタイプに応じてＨＡのアミノ酸５２５〜５３５に位置した膜貫通ドメインをさらに含む。好ましい実施形態では、ＨＡタンパク質は、インフルエンザＡウイルスの１つまたは複数の株に由来する。本発明の組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、分泌を可能にするためにネイティブシグナル配列を保持する。さらに、本発明の組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、ＨＡに由来しない同じシグナル配列を含有する。さらに、本発明の組換えＨＡホモ三量体タンパク質とともに使用されるシグナル配列には、免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナル配列などの、タンパク質の効率的な分泌を可能にする当技術分野で公知のシグナル配列が含まれる。あるいは、組換えＨＡホモ三量体タンパク質、またはそのＨＡ０前駆体は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅ−ｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）によって使用される発現コンストラクト中のネイティブシグナル配列を有することができる。シグナル配列は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持される、当技術分野で認められている細胞系、例えば、２９３ＨＥＫ細胞からの効率的な分泌を可能にするように保持または操作される。
組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、ネイティブＨＡ１／ＨＡ２プロテアーゼ切断部位を保持することができ、これは、ウイルス病原性にとって極めて重要である。本発明の一態様では、組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、置換されたＨＡ１／ＨＡ２プロテアーゼ切断部位を含有する。例えば、配列番号７３７によってコードされる組換えＨＡタンパク質は、ネイティブ切断部位を有するのではなく、別のＨＡタンパク質から置換された切断部位を有する。さらに、これらのタンパク質は、ＨＡ１サブユニット内にシアル酸含有受容体結合部位を任意選択で保持する。
本発明の方法によれば、血液、血清、血漿、または脳脊髄液から得られるヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の組換えおよび可溶性ＨＡホモ三量体と接触し、ここで、組換えおよび可溶性ＨＡホモ三量体は、ヒト抗体が結合するための標的として作用して、そのネイティブコンフォメーションでのインフルエンザＨＡホモ三量体に対する単離されたヒト抗体の特異性を確実にする。全体として方法は、感染性因子に感染したかまたはそれに対するワクチン接種を受けた被験体または患者から血清または血漿試料を得ることを含む。次いで、これらの血清または血漿試料は、感染性因子に関連する特定のポリペプチド、例えば、感染性因子感染細胞の表面に特異的に発現されるが、未感染細胞では発現されないポリペプチドなどに特異的な抗体を含有するものを同定するためにスクリーニングされる。具体的な実施形態では、血清または血漿試料は、感染細胞の表面に発現されるポリペプチドを発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞を試料と接触させることによってスクリーニングされる。具体的な実施形態では、血清または血漿試料は、例えば、インフルエンザＡウイルスの赤血球凝集素などの感染性因子の特定のタンパク質を代表する組換えタンパク質を試料と接触させることによってスクリーニングされる。具体的な実施形態では、血清または血漿試料は、インフルエンザＡウイルスのインタクトな全ビリオンなどの感染性因子の精製形態を試料と接触させることによってスクリーニングされる。具体的な実施形態では、血清または血漿試料は、例えば、インフルエンザＡウイルスのインタクトな全ビリオンなどの感染性因子の生きた形態を試料と接触させて、感受性細胞の感染を阻害または中和する血清抗体の存在を決定することによってスクリーニングされる。例示的な感受性細胞は、ＭＤＣＫ細胞などの真核細胞または哺乳動物細胞である。
対象とする感染性因子ポリペプチドまたはウイルスに特異的な抗体を含有する血清または血漿を有すると被験体または患者が同定されると、同じ被験体または患者から得られる単核細胞および／またはＢ細胞は、本明細書に記載の任意の方法または当技術分野において利用可能な任意の方法を使用して抗体を産生する細胞またはそのクローンを同定するために、使用される。抗体を産生するＢ細胞が同定されると、抗体の可変領域またはその断片をコードするｃＤＮＡが、標準的ＲＴ−ＰＣＲベクターおよび保存された抗体配列に特異的なプライマーを使用してクローニングされ、対象とする感染性因子ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の組換え産生のために使用される発現ベクターにサブクローニングされ得る。
より具体的には、Ｂ細胞は、特定のドナー、すなわち、ＨＡに特異的な抗体を含有する血清または血漿を有すると同定される被験体または患者から収集され、培養され、抗体は、これらのＢ細胞から培地中に分泌される。培地はこれらのＢ細胞から分離され、Ｂ細胞は溶解され、次いで貯蔵のために凍結される。次いで培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々なＨＡ標的への抗体結合および／または感染の阻害／中和についてスクリーニングされる。培養ウェルが所望の特異性の抗体を有すると同定される場合、抗体可変領域を増幅し、その後クローニングし、発現させ、組換え抗体の結合および機能について試験するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）がＢ細胞可溶化物に施される。
組換えおよび可溶性ＨＡホモ三量体に結合し、かつ／または全ビリオンに結合し、生ウイルスの感染を任意選択で阻害または中和する、表１０に列挙したＭＡｂなどのヒト抗体は、組換えで増幅させられ、インフルエンザウイルスに接触するリスクのある被験体に投与するための医薬組成物に処方される。さらに、組換えおよび可溶性ＨＡホモ三量体は、インフルエンザＡウイルスの複数の株を含めた、インフルエンザウイルスの複数の株に由来する。例示的なヒト抗体は、インフルエンザＡに特異的に結合し、インフルエンザＢおよびＣウイルス株に結合することができないことについて選択することができる。
本発明はさらに、完全長ＨＡを哺乳動物細胞系内で発現させ、これにより、この細胞によって発現されたＨＡに結合するヒト抗体の同定を可能とする新規プロセスを提供する。ｈｕＭＨＡ抗体は、ＨＡをトランスフェクトした細胞上のコンフォメーション決定基およびネイティブＨＡ（単離し得るか、またはインフルエンザ感染細胞上もしくはインフルエンザＡウイルス上に提示される場合にｈｕＭＨＡ抗体に接触し得る）に結合することが示されている。代替としてまたは追加的に、ｈｕＭＨＡ抗体は、ネイティブＨＡ、組換えホモ三量体ＨＡ、精製ウイルス、感染細胞、直鎖状ペプチド、合成ＨＡペプチド、ＨＡをトランスフェクトした哺乳動物細胞、および遺伝子改変されたバクテリオファージウイルスの表面に発現したＨＡ（これらは、遺伝子断片ディスプレイアッセイに使用される）に結合する。したがって、本発明は、非常に幅広い範囲のインフルエンザＡウイルス株に対して新規の特異性を示すヒトモノクローナル抗体の同定および産生を可能にする。これらの抗体は、インフルエンザＡ感染症を予防するために予防的に、インフルエンザＡ感染症を同定するために診断的に、さらにインフルエンザＡ感染症を処置するために治療的に使用し得る。さらに、本発明のｈｕＭＨＡ抗体が結合するエピトープは、インフルエンザＡ感染症を予防するためのワクチンとして使用される。
本発明のｈｕＭＨＡ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ａ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のＨＡ１サブユニット内のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のＨＡ２サブユニット内のエピトープに結合する；ｃ）ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットからなるインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する；ｄ）組換えホモ三量体インフルエンザＨＡ０タンパク質のエピトープに結合する；ｅ）感染細胞上に発現されるインフルエンザＨＡタンパク質のエピトープに結合する；ｆ）改変細胞上に発現されるインフルエンザＨＡタンパク質のエピトープに結合する；ｇ）インフルエンザウイルスに結合する；またはｈ）感受性真核細胞のウイルス感染を阻害する。本発明のｈｕＭＨＡ抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣなどの免疫エフェクター機構によってインフルエンザ感染細胞を排除し、インフルエンザビリオンに結合することによって、直接のウイルスのクリアランスを促進する。
ヒト血漿試料、Ｂ細胞培養上清（ＢＣＣ ＳＮ）、およびモノクローナルトランスフェクション上清をスクリーニングするのに使用される例示的なインフルエンザＡ株（ＭＮを以下の表８に示す）。生きた株を本明細書に記載の中和アッセイに使用した。不活化された株を本明細書に記載のウイルス結合アッセイに使用した。組換えホモ三量体ＨＡタンパク質を三量体ＨＡ結合アッセイに使用した。
例示的なＨＡ配列には、以下の表９に列挙した配列が含まれる。
一実施形態では、本発明のｈｕＭＨＡ抗体は、配列番号７２７〜７４４に従って番号付けしたとき、インフルエンザ赤血球凝集素の１位〜５２５位のアミノ酸残基を完全にまたは部分的に含むＨＡに結合する。あるいは、モノクローナル抗体は、表１０に列挙したｍＡｂと同じエピトープに結合する抗体である。
本発明の抗体は、インフルエンザＡを中和することができる。モノクローナル抗体は、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ； Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８４年においてＲ． Ｋｅｎｎｅｔらによって記載された公知の手順によって産生させることができる。適用されるさらなる物質および方法は、例えば、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７巻：６６４２〜６６４７頁、１９９３年に記載されたものなどの公知の手順に基づく。
これらの抗体は、適切に処方した後、予防剤もしくは治療剤として、または診断ツールとして使用することができる。
「中和抗体」は、その病原体が宿主内および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏの標的細胞内で感染を開始し、かつ／または永続させる能力を中和することができるものである。本発明は、好ましくはＨＡタンパク質に由来するインフルエンザウイルスの抗原を認識する中和モノクローナルヒト抗体を提供する。好ましくは本発明による抗体は、ＴＣＮ−５２２（ＢＣＣプレートおよびウェルの位置３２１２＿Ｉ１２に対応）、
と本明細書で呼ばれる新規モノクローナル抗体である。これらの抗体は、ヒト試料から最初に単離され、
と呼ばれるＢ細胞培養物によって産生される。これらの抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインフルエンザＡに対して幅広い中和活性または幅広い結合活性を有する。
抗体重鎖のＣＤＲはそれぞれ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と呼ばれる。同様に、抗体軽鎖のＣＤＲはそれぞれ、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と呼ばれる。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＣＤＲ１−−ＩＭＧＴ位置２７〜３８、ＣＤＲ２−−ＩＭＧＴ位置５６〜６５、およびＣＤＲ３−−ＩＭＧＴ位置１０５〜１１７のようにＩＭＧＴ番号方式によって定義される（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ Ｐ．ら、２００３年、 ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻（１号）：５５〜７７頁；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ Ｐ．、１９９７年、Ｕｎｉｑｕｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１８巻：５０９号；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ Ｐ．、１９９９年、Ｔｈｅ ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７巻：１３２〜１３６頁）。
指定した抗体のガンマ重鎖およびカッパまたはラムダ軽鎖の可変領域の配列を含む、抗体の配列が決定される。さらに、抗体配列をコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれの配列を、
について決定した。
太字の文字列で示した可変領域のＮ末端（または５’エンド）におけるシグナルペプチドおよびＣ末端（または３’エンド）における定常領域とともに、重鎖および軽鎖のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を以下に示す。
本発明は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む可変重鎖（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、ヒトＩＧＨＶ１（もしくは特に、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８）、ＩＧＨＶ２（もしくは特に、ＩＧＨＶ２−５）、ＩＧＨＶ３（もしくは特に、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、６６、ＩＧＨＶ３−７）、ＩＧＨＶ４（もしくは特に、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１）、もしくはＩＧＨＶ５（もしくは特に、ＩＧＨＶ５−５１）ＶＨ生殖系列配列またはその対立遺伝子、あるいはＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と相同である核酸配列によってコードされる、単離された完全ヒトモノクローナル抗ＨＡ抗体またはその断片を提供する。一態様では、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、またはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列配列と相同である核酸配列は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、またはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列配列またはその対立遺伝子と少なくとも７５％相同である。例示的な対立遺伝子には、それだけには限定されないが、
が含まれる。各対立遺伝子の例示的な配列を以下に示す。
本発明の特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩＧＫＶ１（または特に、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１−５）、ＩＧＫＶ２（または特に、ＩＧＫＶ２−３０）、ＩＧＫＶ３（または特に、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０）、ＩＧＫＶ４（または特に、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ４−１）、ＩＧＬＶ１（または特に、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−５５）、ＩＧＬＶ２（または特に、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−８）、ＩＧＬＶ３（または特に、ＩＧＬＶ３−２１もしくはＩＧＬＶ３−２５）、ＩＧＬＶ７（または特に、ＩＧＬＶ７−４３もしくはＩＧＬＶ７−４６）、またはＩＧＬＶ９（または特に、ＩＧＬＶ９−４９）、あるいはその対立遺伝子によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域をさらに含む。ＶＬ生殖系列遺伝子配列ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９またはその対立遺伝子、あるいはＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９ ＶＬ生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と相同であるヌクレオチド酸配列。さらに、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９ ＶＬ生殖系列配列またはその対立遺伝子と相同である核酸配列は、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９ ＶＬ生殖系列配列またはその対立遺伝子と少なくとも６５％相同である。
単離されたモノクローナル抗赤血球凝集素（ＨＡ）抗体（すなわち、本発明の抗赤血球凝集素抗体）の重鎖は、生殖系列Ｖ（可変）遺伝子、例えば、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子など、またはその対立遺伝子に由来する。
本発明のＨＡ抗体は、ヒトＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、またはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子配列は、例えば、配列番号４５７〜４８５に示されている。本発明のＨＡ抗体は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも７５％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくはＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも９８％、９９％相同である。ＨＡ抗体のＶＨ領域は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、もしくはＩＧＨＶ５ ＶＨ生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも７５％相同である。好ましくはＨＡ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％の生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％の生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
本発明のＨＡ抗体は、ヒトＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域も含む。ヒトＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９ ＶＬ生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子は、例えば、配列番号４８６〜５０８に示されている。あるいは、ＨＡ抗体は、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも６５％相同である核酸配列によってコードされるＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、またはＩＧＬＶ９ ＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくはＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子と少なくとも９８％、９９％相同である。ＨＡ抗体のＶＬ領域は、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも６５％相同である。好ましくはＨＡ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくはＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ７、もしくはＩＧＬＶ９生殖系列遺伝子配列またはその対立遺伝子によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
ＨＡ抗体ＩＩＩ
本発明は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質のステム領域の標的ペプチドに対して抗体を誘導することができる免疫原に関する。免疫原は、ペプチドまたは合成ペプチドである。特に、本発明の免疫原は、１つまたは複数のエピトープまたはエピトープユニットを含む。任意選択で、免疫原は、一般的な免疫刺激剤をさらに含む。本発明のこれらの免疫原は、ウイルスによる感染を予防するためのインフルエンザＡウイルスに対する抗体を誘導することができる。
一態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質のステム領域に対して特異性を有する保護モノクローナル抗体によって認識されるエピトープまたはエピトープユニットを有する免疫原を提供する。
抗体は、ＨＡ１およびＨＡ２ペプチドの両方に結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、もしくはＨ９８、またはモノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、もしくはＨ９８のＨＡタンパク質への結合と競合するモノクローナル抗体によって認識される。好ましくは、エピトープはＦ１０エピトープである。
いくつかの実施形態では、赤血球凝集素タンパク質は、中性ｐＨコンフォメーションにある。
免疫原は、ペプチドまたは合成ペプチドである。
いくつかの態様では、免疫原は、Ｆ１０エピトープの三次構造を模倣する非直鎖状配列を一緒に形成するように互いに空間的に位置した１つまたは複数のペプチドまたはペプチド断片を有する結合体である。任意選択で、１つまたは複数のペプチドまたはペプチド断片は、主鎖に連結されている。結合体は、モノクローナル抗体Ｆ１０のＨＡタンパク質への結合と競合する。
エピトープのｅコンフォメーションは、赤血球凝集素が中性ｐＨコンフォメーションにあるとき、ＨＡ１のアミノ酸残基１８、３８、３９、４０、および２９１、ならびにＨＡ２の１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５２、５３、および５６によって定義される。
いくつかの実施形態では、免疫原は、以下のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数を有するペプチドである。
［Ｘａａ０］ｍ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−［Ｘａａ０］ｐ、式中、好ましくは、Ｘａａ１は、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｈ、またはＹであり、Ｘａａ２は、Ｈ、Ｙ、Ｍ、Ｌ、またはＱである。最も好ましくは、Ｘａａ１はＹである。最も好ましくは、Ｘａａ２は、Ｈである。
［Ｘａａ０］ｍ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−［Ｘａａ０］ｐ、式中、好ましくは、Ｘａａ１は、Ｈ、Ｑ、Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、またはＴであり、Ｘａａ２は、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｅ、Ｒ、またはＴである。最も好ましくは、Ｘａａ１はＨである。最も好ましくは、Ｘａａ２はＱである。
［Ｘａａ０］ｍ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−［Ｘａａ０］ｐ、式中、好ましくは、Ｘａａ１はＩ、Ｖ、Ｍ、またはＬであり、Ｘａａ２は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｙ、Ｄ、Ａ、Ｓ、またはＥであり、Ｘａａ３はＧまたはＡであり、Ｘａａ４はＷ、Ｒ、またはＧである。最も好ましくは、Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＤであり、Ｘａａ３はＧであり、Ｘａａ４はＷである。
［Ｘａａ０］ｍ−Ｘａａ１−［Ｘａａ０］ｑＸａａ２−Ｘａａ３−［Ｘａａ０］ｑＸａａ４−［Ｘａａ０］ｒＸａａ５−［Ｘａａ０］ｑ−Ｘａａ６Ｘａａ７−［Ｘａａ０］ｑ−Ｘａａ８−［Ｘａａ０］ｐ、および［Ｘａａ０］ｍ−Ｘａａ１−［Ｘａａ０］ｑＸａａ２−Ｘａａ３−［Ｘａａ０］ｑＸａａ４−［Ｘａａ０］ｒＸａａ５−［Ｘａａ０］ｑ−Ｘａａ６Ｘａａ７−［Ｘａａ０］ｓ−［Ｘａａ８］ｔ−［Ｘａａ０］ｐ、式中、好ましくはＸａａ１はＫ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、またはＹであり、Ｘａａ２はＳまたはＴであり、Ｘａａ３はＱまたはＰであり、Ｘａａ４はＦ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、またはＴであり、Ｘａａ５はＩ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、またはＡであり、Ｘａａ６はＩ、Ｖ、Ｍ、またはＬであり、Ｘａａ７はＮ、Ｓ、Ｔ、またはＤであり、Ｘａａ８はＩ、Ｆ、Ｖ、Ａ、またはＴである。最も好ましくは、Ｘａａ１はＫであり、Ｘａａ２はＴであり、Ｘａａ３はＱであり、Ｘａａ４はＩであり、Ｘａａ５はＴであり、Ｘａａ６はＶであり、Ｘａａ７はＮであり、Ｘａａ８はＩである。
前述の配列のすべてについて、ｍおよびｐは、独立して０または１〜１００、好ましくは約１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、もしくは１〜１０であり、ｑは２であり、ｒは３であり、ｓは０または２であり、ｔは０または１であり、Ｘａａ０は、独立して任意のアミノ酸である。好ましくは、ｓは２であり、ｔは１である。
本発明のいくつかの態様では、１つまたは複数のアミノ酸はＤ−アミノ酸である。
任意選択で、免疫原は、アジュバントをさらに含み、または担体に結合体化されている。
様々な態様では、本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および／またはアジュバントと一緒に免疫原を含有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、抗インフルエンザ抗体またはその抗原結合断片をさらに含む。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、もしくはＨ９８、またはモノクローナル抗体Ｄ７、Ｄ８、Ｆ１０、Ｇ１７、Ｈ４０、Ａ６６、Ｄ８０、Ｅ８８、Ｅ９０、もしくはＨ９８のＨＡタンパク質への結合と競合するモノクローナル抗体である。本発明の免疫原をコートする核酸、およびこの核酸を含む組成物も本発明によって提供される。
本発明は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患または障害を罹患するリスクのある人に本明細書に記載の免疫原組成物を投与することによって前記疾患または障害を予防する方法をさらに含む。任意選択で、この方法は、抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤、またはウイルス付着阻害剤をさらに投与することを含む。抗ウイルス薬は、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、またはＭ２イオンチャネルである。Ｍ２イオンチャネル阻害剤はアマンタジン、またはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤はザナミビル、またはリン酸オセルタミビルである。
別の態様では、この方法は、群Ｉインフルエンザウイルスおよび／または群ＩＩインフルエンザウイルスに特異的な１つまたは複数の抗体をさらに投与することを含む。抗体は、インフルエンザウイルスを中和するのに十分な用量で投与される。
投与は、インフルエンザウイルスへの曝露前またはその後である。
被験体を処置する方法、および抗体をスクリーニングし、産生させる方法も開示されている。例えば、インフルエンザ感染症を罹患しているか、またはそのリスクのある被験体を処置する方法であって、開示したＨＡステム抗体などの開示した抗体の１つまたは複数を被験体に投与することを含む、方法が開示されている。例えば、被験体を処置する方法であって、インフルエンザウイルスの他の成分から単離されている中性ｐＨコンフォメーションでのインフルエンザ赤血球凝集素のステム領域を被験体に投与することを含み、被験体は、ステム領域に対して免疫応答を生じる、方法が開示されている。例えば、被験体を処置する方法であって、赤血球凝集素のヘッド領域から単離されている中性ｐＨコンフォメーションでのインフルエンザ赤血球凝集素のステム領域を被験体に投与することを含み、被験体は、ステム領域に対して免疫応答を生じる、方法が開示されている。例えば、被験体を処置する方法であって、インフルエンザウイルスの他の成分から単離されている中性ｐＨコンフォメーションでのインフルエンザ赤血球凝集素を被験体に投与することを含み、赤血球凝集素のヘッド領域は、ヘッド領域の抗原性を低減するように修飾されており、被験体は、ステム領域に対して免疫応答を生じる、方法が開示されている。例えば、表面に固定された赤血球凝集素に結合するように赤血球凝集素と反応する抗体をスクリーニングし、それによって対象とする抗体を同定することを含む方法が開示されている。例えば、赤血球凝集素のヘッド領域から単離されている中性ｐＨコンフォメーションでのインフルエンザ赤血球凝集素のステム領域に結合するように赤血球凝集素と反応する抗体をスクリーニングし、それによって対象とする抗体を同定することを含む方法が開示されている。例えば、インフルエンザウイルスの他の成分から単離されている中性ｐＨコンフォメーションでのインフルエンザ赤血球凝集素に結合するように赤血球凝集素と反応する抗体をスクリーニングし、それによって対象とする抗体を同定することを含み、赤血球凝集素のヘッド領域は、ヘッド領域の抗原性を低減するように修飾されている方法が開示されている。
いくつかの形態では、赤血球凝集素のヘッド領域は、グリコシル化部位を除去するか、または置きかえることによって修飾され得る。いくつかの形態では、赤血球凝集素のヘッド領域は、グリコシル化部位を付加することによって修飾され得る。いくつかの形態では、赤血球凝集素のヘッド領域は、ヘッド領域のすべてまたは一部を除去することによって修飾され得る。
いくつかの形態では、開示した抗体、開示した赤血球凝集素、および開示した方法は、被験体において免疫反応を生じさせることができる。例えば、いくつかの形態では、被験体は、インフルエンザ感染症を予防するかまたはその重症度を低減する、免疫応答を生じさせることができる。いくつかの形態では、免疫応答は、サブタイプ内のインフルエンザウイルスに反応性であり得る。いくつかの形態では、免疫応答は、クラスター内の各サブタイプにおけるインフルエンザウイルスに反応性であり得る。いくつかの形態では、免疫応答は、群内の各クラスターにおけるインフルエンザウイルスに反応性であり得る。いくつかの形態では、免疫応答は、群内の各サブタイプにおけるすべてのインフルエンザウイルスに反応性であり得る。いくつかの形態では、免疫応答は、群１内のインフルエンザウイルスに反応性であり得る。
いくつかの形態では、開示した方法は、抗体Ｆ１０が赤血球凝集素に結合することへの競合について対象とする抗体をスクリーニングし、それによってＦ１０と競合する抗体を同定することをさらに含むことができる。いくつかの形態では、赤血球凝集素は、群２インフルエンザウイルスの赤血球凝集素であり得る。いくつかの形態では、赤血球凝集素は、群１インフルエンザウイルスの赤血球凝集素であり得る。いくつかの形態では、開示した方法は、同定した抗体を産生させることをさらに含むことができる。開示した方法によって産生される抗体も開示されている。開示した方法によって同定される抗体も開示されている。
開示した組成物および方法は、インフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡウイルスを中和するモノクローナル抗体の発見に基づく。インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１クラスターインフルエンザウイルスなどの群ＩインフルエンザＡウイルスである。Ｈ１クラスターインフルエンザウイルスは、Ｈ１ａクラスターまたはＨ１ｂクラスターである。モノクローナル抗体は完全ヒトである。いくつかの形態では、モノクローナル抗体は、二価抗体、一価抗体、単鎖抗体、またはその断片であり得る。具体的には、このようなモノクローナルは、ＨＡ１またはＨＡ２ポリペプチドなどの赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）のステム領域上のエピトープに結合することができる。エピトープは非直鎖状であり得る。
エピトープは、ＨＡ１およびＨＡ２の両方を含むことができる。エピトープは非直鎖状であり得る。いくつかの形態では、エピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの１８位、３８位、４０位、２９１位におけるアミノ酸、ならびにＨＡ２ポリペプチドの１８位、１９位、２０位、２１位、３８位、４１位、４２位、４５位、４９位、５２位、５３位、および５６位におけるアミノ酸を含むことができる。
開示した組成物および方法は、ＨＡのステム領域内の高度に保存されたエピトープを標的にする、幅広く中和するヒト抗体を生成するためのプロトコールの発見にさらに基づく。プラスチック表面に吸収される短いＮ−グリカンおよび無荷電マンノースを産生するバキュロウイルス内で発現される三量体Ｈ５外部ドメインを使用すると、通常免疫優性の球状ヘッドをマスクしながらステムエピトープの支配的な提示が可能になった。したがって、単鎖またはＦａｂ発現ライブラリーをウイルスの膜融合タンパク質に曝露し、前記タンパク質に特異的に結合するライブラリー中の抗体を同定し、ライブラリーから抗体を単離することによって、病原性エンベロープウイルスに特異的に結合する単離抗体を産生させる方法も開示されている。融合タンパク質は、固体表面、例えば、プラスチックに固定することができる。いくつかの形態では、融合タンパク質は、野生型融合タンパク質と比較して、修飾されたグリコシル化を有することができる。例えば、融合は、昆虫細胞などの非哺乳動物細胞内で生じさせることができる。融合タンパク質は、例えば、三量体赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質であり得る。
例えば、生物学的適合性マトリックスにおいてコーティングされた、またはそれに埋め込まれた膜融合タンパク質（例えば、三量体赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質）を被験体に投与することによって、インフルエンザウイルスなどの病原性エンベロープウイルスに対して被験体にワクチン接種する方法も開示されている。いくつかの形態では、融合タンパク質は、野生型融合タンパク質と比較して、修飾されたグリコシル化を有することができる。
本明細書に記載のモノクローナル抗体を含む組成物、ならびに１つまたは複数の容器中の組成物および使用するための指示書を含むキットも開示されている。本発明はさらに、対象とする化合物とＦ１０抗体を接触させ、化合物−抗体複合体を検出することによって、前記Ｆ１０抗体への結合について化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法によって同定される化合物、および免疫原としてのこれらの使用も本発明に含まれる。
高親和性、交差サブタイプ、幅広く中和するヒト抗ＨＡ ｍＡｂが同定されている。具体的には、Ｈ５Ｎ１「トリインフルエンザ」およびＨ１Ｎ１「スペイン風邪」および「ブタインフルエンザ」株を含めた群１インフルエンザウイルスの中の著しく広い範囲に対する１０の中和ｍＡｂ（ｎＡｂ）を選択するために、ヒトＡｂファージディスプレイライブラリーおよびＨ５赤血球凝集素（ＨＡ）外部ドメインを使用した。これらのｎＡｂは、コンフォメーション変化の重要なエレメント、すなわち、融合ペプチドおよびヘリックスａＡの露出面が接近して並置される位置で、ステム領域内の新規の高度に保存された中和エピトープを認識することによって、付着後融合プロセスを阻害する。Ｈ５Ｎ１ ＨＡに結合した１つのｍＡｂ（ｍＡｂＦ１０）の結晶構造により、重鎖のみがＨＡステム領域内の高度に保存されたポケット内に入り、膜融合に必要とされるコンフォメーション変化を阻害することが明らかになる。このポケットを標的にするｎＡｂは、季節性および汎発性インフルエンザＡ感染症の両方に対して幅広く保護することができることが発見された。結晶構造によりさらに、Ｆ１０ ｍＡｂが結合するエピトープがＨＡ１のアミノ酸残基１８、３８、３９、４０、および２９１ならびにＨＡ２の１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５２、５３、および５６によって定義されることが明らかになった。このエピトープは、Ｆ１０エピトープと本明細書で呼ばれる。１６すべてのＨＡサブタイプの構造解析および配列分析により、このエピトープの２つのバリアントのみが存在し、ＨＡの２つの系統発生的分類（群１および２）に対応することが指摘される。この発見は、各群のサブセットに由来するｎＡｂの小カクテルは、季節性および汎発性インフルエンザの両方に対して幅広く保護することができることを示す。
注目すべきことに、非免疫ライブラリーから、同じＶＨ生殖系列遺伝子、ＩＧＨＶ１−６９＊０１を利用し、Ｙ１０２と等価な位置でチロシンを含むＣＤＲ３ループをコードするｎＡｂが単離された。これは、おそらくＨ１、および１９６８年より前に生まれたライブラリードナーについてはＨ２サブタイプに以前に曝露されていたことにより、幅広い抗ＨＡ交差免疫がＨ５にナイーブな集団に予め存在することを示す。この生殖系列ＶＨセグメントの反復使用、Ｎ挿入および／または生殖系列Ｄ遺伝子アセンブリーによって導入されるＣＤＲ３チロシンの共通性、ならびに発見されたｎＡｂによるＶＬ遺伝子の無差別使用は、このエピトープを認識することができる再配列ＶＨセグメントの前駆体頻度が著しいことを示す。このことは、ここで同定したＦ１０エピトープに適当に曝露すると、これらの広域スペクトルｎＡｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで容易に誘導され得ることを示す。これらの発見により、両群中のウイルスサブタイプに対するユニバーサル保護をもたらすための単純な解決策が開示された。
３つの独特な抗ＨＡ−１ ｓｃＦｖが５８のＨＡ−１陽性クローンの配列決定分析によって同定された。これらのｓｃＦｖは、３８Ｂおよび１Ｃと指定された。２ＡのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を本明細書に示す。１０の独特な抗ＨＡＯ ｓｃＦｖが９７のＨＡＯ陽性クローンの配列決定分析によって同定された。これらのｓｃＦｖは、７、８、１０、１７、４０、６６、８０、８８、９０、および９８と指定された。６つの異なるＶＨ遺伝子および１０の異なるＶＬ遺伝子が明らかになった。いくつかのｓｃＦｖは、同じＶＨ遺伝子を共有した。６つの異なるＶＨ遺伝子のうちの５つは、ＩＧＨＶ１−６９遺伝子ファミリーに属した。１０のＶＬ遺伝子のうちの３つは、カッパ鎖であった。２Ａ ｓｃＦｖは、中程度の中和抗体であり、３８Ｂおよび１Ｃは、非中和抗体である。１０のｓｃＦｖ、すなわち、７、８、１０、１７、４０、６６、８０、８８、９０、および９８は、強力な中和抗体である。インフルエンザ中和抗体の核酸およびアミノ酸配列を以下に示す。これらの抗体を作製する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４９５０（公開第ＷＯ２０１０／０２７８１８号）に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
インフルエンザ中和抗体の重鎖および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を、表１８で以下に示す。
抗体
別段に定義しない限りは、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を持つ。さらに、コンテキストによって別段に必要とされない限りは、単数形の用語には複数形も含まれ、複数形の用語には単数形も含まれる。一般に、本明細書中に記載の細胞や組織培養、分子生物学、およびタンパク質やオリゴ−またはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して、またその技術に関連して利用する用語は、当技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）には標準の技術を用いる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に行うようにもしくは本明細書中に記載のように行う。本発明の実施では、そうでないと具体的に指定しない限りは、当技術分野の技術範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の慣用方法を用い、その多くは、例示目的のために以下に記載されている。そのような技術は文献中に完全に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）を参照されたい。
本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および製薬化学に関連して、またその実験室手順および技術に関連して利用する用語は、当技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、製薬の調製、処方、および送達、ならびに患者の処置は標準の技術を用いる。
本発明の理解には以下の定義が有用である。
本明細書中で使用する用語「抗体」（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とは、本明細書中で「抗体」と互換性があるように使用する。
「単離された抗体」は、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収したものである。その天然の環境の夾雑物の構成成分は、抗体の診断的または治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定して抗体の９５重量％より高くまで、最も好ましくは９９重量％より高くまで；（２）スピンカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な度合まで；または（３）クマシーブルー、もしくは、好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離された抗体には組換え細胞内におけるｉｎ ｓｉｔｕの抗体が含まれる。なぜなら、当該抗体の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
基本的な４本鎖の抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５個の基本的なヘテロ四量体単位およびＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、したがって１０個の抗原結合部位を含み、一方で、分泌型のＩｇＡ抗体は、重合して、２〜５個の基本的な４本鎖の単位およびＪ鎖を含む多価の集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖の単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖と連結している一方で、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結している。また、それぞれのＨおよびＬ鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれのＨ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次いで、αおよびγ鎖のそれぞれについて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、μおよびεアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。それぞれのＬ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、次いでその他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨとアラインメントされており、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインメントされている。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬが一緒になって対合することで、単一の抗原結合部位が形成される。様々な抗体クラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ．、１９９４年、７１頁、および第６章を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に応じて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの一方に割り当てることができる。その重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つの免疫グロブリンのクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的軽微な差異に基づいてサブクラスへとさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
用語「可変」は、Ｖドメインの特定のセグメントが抗体間で配列が大規模に異なることを指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を定義する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸の範囲全体にわたって均等に分布しているわけではない。そうではなく、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２個のアミノ酸の長さの「超可変領域」と呼ばれる可変性が非常に高いより短い領域によって隔てられている１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチ（複数）からなる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、大体はβ−シートの立体配置をとっている４つのＦＲを含み、これらは、β−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結されている。それぞれの鎖中の超可変領域は、ＦＲによって非常に近接して形を保ち、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１年）参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
本明細書中で使用する用語「超可変領域」は、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の約残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）付近、ＶＨ中の約３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）付近；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１年））；ならびに／または「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））；ならびに／または「超可変ループ」／ＣＤＲからの残基（例えば、ＩＭＧＴ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）、ＶＨ中の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７巻：２０９〜２１２頁（１９９９年）、Ｒｕｉｚ， Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８巻：２１９〜２２１頁（２０００年））を含む。任意選択で、抗体は、以下の点の１つまたは複数で対称的な挿入物を有する：ＡＨｏに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ， Ａ． ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ， Ａ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３０９巻：６５７〜６７０頁（２００１年））。
「生殖系列核酸残基」は、定常または可変領域をコードしている生殖系列遺伝子中で天然に存在する核酸残基を意味する。「生殖系列遺伝子」は、生殖細胞（すなわち、卵子となる運命の細胞または***）中に見つかるＤＮＡである。「生殖系列変異」は、生殖細胞または単細胞段階の接合体に起こった特定のＤＮＡの遺伝性変化を指し、子孫に伝わる際、そのような変異は体内の全細胞に取り込まれる。生殖系列変異は、単一の体細胞が獲得する体細胞変異とは対照的である。一部の例では、可変領域をコードしている生殖系列ＤＮＡ配列中のヌクレオチドが変異しており（すなわち体細胞変異）、異なるヌクレオチドで置き換えられている。
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は少量存在し得る天然の変異の可能性以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対するものであり、特異性が高い。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対するものである様々な抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されていない状態で合成し得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体を任意の特定の方法によって産生することを要すると解釈されるべきでない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって調製するか、または細菌、真核動物もしくは植物細胞中で組換えＤＮＡ方法を用いて作製し得る（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
本明細書中のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）参照）。本発明は、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列を提供する。したがって、本明細書において主に対象とするキメラ抗体には、１つまたは複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列を含む抗体が含まれる。さらに、本明細書において主に対象とするキメラ抗体には、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列とを含むものが含まれる。また、本発明の対象とするキメラ抗体には、本明細書中に記載したものに関連する、または非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）等の異なる種に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含むものも含まれる。また、キメラ抗体には、霊長類化およびヒト化した抗体も含まれる。
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見つからない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するために行う。さらなる詳細には、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒト源から１つまたは複数のアミノ酸残基がその中に導入されたヒト抗体とみなされる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインからとる。ヒト化は、従来より、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従って、輸入超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行う。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満の部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。
「ヒト抗体」は、ヒトによって天然に産生される抗体中に存在する配列のみを含む抗体である。しかし、本明細書中で使用するヒト抗体は、本明細書中に記載の修飾および変異配列を含めた、天然に存在するヒト抗体には見つからない残基または修飾を含み得る。これらは、典型的には、抗体性能をさらに洗練または増強するために行う。
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位と、ＣＬならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とを含むものである。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。好ましくは、インタクトな抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁［１９９５年］参照）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成した多特異性抗体が含まれる。
語句、抗体の「機能的な断片または類似体」は、完全長抗体と共通の定性的な生物活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的な断片または類似体とは、ＩｇＥ免疫グロブリン分子が高親和性受容体のＦｃεＲＩに結合する能力を持つことを防止または実質的に減少するような様式で、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残りの「Ｆｃ」断片が生じ、この命名は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖の全長、ならびにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、および１つの重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。それぞれのＦａｂ断片は抗原結合に関して一価である、すなわち、これは、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、２つのジスルフィド結合したＦａｂ断片に大ざっぱに対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られ、これは、二価の抗原結合活性を有しているが、それでも抗原を架橋結合させることができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含めた追加の数残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の、本明細書中での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として最初に産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドによって形を保った、両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域中の配列によって決定され、この領域は、特定の種類の細胞上に見つかるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、密に非共有会合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。これらの２個のドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える６個の超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３個のループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、単一のポリペプチド鎖へと連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説には、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、１９９５年、上記を参照されたい。
用語「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、ＶＨおよびＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することによって調製する、小さな抗体断片を指し、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成される結果、二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片がもたらされる。二重特異性の二重特異性抗体は、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に、より完全に記載されている。
本明細書中で使用する「内部移行する」抗体は、哺乳動物細胞上の抗原（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）に結合した際に、細胞によって取り込まれる（すなわち進入する）ものである。内部移行する抗体には、もちろん、抗体断片、ヒトまたはキメラ抗体、および抗体結合体が含まれる。特定の治療上の応用では、ｉｎ ｖｉｖｏの内部移行が企図される。内部移行する抗体分子の数は、細胞、特に感染細胞を死滅させるまたはその成長阻害するために十分または適当となる数である。抗体または抗体結合体の効力に応じて、一部の例では、単一の抗体分子を細胞内に取り込むことが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるために十分である。例えば、特定の毒素は死滅させることに関して非常に強力であり、抗体と結合体化した毒素の分子１個の内部移行が、感染細胞を死滅させるために十分である。
本明細書中で使用する、抗体は、検出可能なレベル、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、もしくは１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａで抗原と反応する場合に、「免疫特異的である」、抗原「に特異的である」または「に特異的に結合する」と言われる。また、抗体のその同類抗原に対する親和性は、一般的に解離定数ＫＤとして表され、特定の実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、結合する場合、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤでＭ２ｅに特異的に結合する。抗体の親和性は、慣用技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、５１巻：６６０頁（１９４９年））に記載のものを用いて容易に決定することができる。
抗原、細胞またはその組織に対する抗体の結合特性は、一般に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光に基づいたアッセイを含めた免疫検出方法を用いて決定および評価し得る。
指定した抗体の「生物学的特徴」を有する抗体とは、その抗体の生物学的特徴のうちの１つまたは複数を保有するものであり、これにより、それが他の抗体から区別される。例えば、特定の実施形態では、指定した抗体の生物学的特徴を有する抗体は、指定した抗体によって結合されるものと同じエピトープに結合するおよび／または指定した抗体と共通のエフェクター機能を有する。
用語「拮抗体」抗体は、最も広範な意味で使用し、それが特異的に結合するエピトープ、ポリペプチド、または細胞の生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する抗体が含まれる。拮抗体抗体を同定する方法は、候補拮抗体抗体が特異的に結合したポリペプチドまたは細胞を候補拮抗体抗体と接触させること、およびポリペプチドまたは細胞に通常関連している１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
「感染細胞の成長を阻害する抗体」または「成長阻害」抗体は、抗体によって結合されるＭ２ｅエピトープを発現するまたは発現することができる感染細胞に結合し、その測定可能な成長阻害をもたらすものである。好ましい成長阻害抗体は、感染細胞の成長を、適切な対照と比較して２０％を超えて、好ましくは約２０％〜約５０％、さらにより好ましくは５０％を超えて（例えば約５０％〜約１００％）阻害し、対照は、典型的には、試験する抗体で処理していない感染細胞である。成長阻害は、細胞培養物中に約０．１〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、成長阻害は、感染細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定する。ｉｎ ｖｉｖｏの感染細胞の成長阻害は、当技術分野で知られている様々な方法で決定することができる。抗体は、抗体を体重１ｋｇあたり約１μｇ〜約１００ｍｇで投与した際、抗体を最初に投与した約５日間〜３カ月以内、好ましくは約５〜３０日間以内に、感染細胞のパーセントまたは感染細胞の合計数の減少がもたらされた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで成長阻害性である。
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導するものである。好ましくは、細胞は感染細胞である。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転位はアネキシン結合によって測定することができ；ＤＮＡの断片化はＤＮＡラダリングによって評価することができ；ＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞が少しでも増加することによって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理の細胞と比較して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍の、アネキシン結合の誘導をもたらすものである。
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因し、抗体アイソタイプによって異なる生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素を用いて標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害の形態を指す。抗体が細胞傷害性細胞を「武装」し、そのような死滅に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイを行い得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。その代わりまたはそれに加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）、９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価し得る。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。特定の実施形態では、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子バリアント、および選択的スプライシングされた形態も含まれる。ＦＣγＲＩＩ受容体には、類似のアミノ酸配列を有するが主にその細胞質ドメインが異なる、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）の総説Ｍ．を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．、１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）に総説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲが、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。また、この用語には、母性ＩｇＧを胎児に移行することを担っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：２４９頁（１９９４年））。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、ネイティブ源、例えば血液から単離し得る。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典補体経路の活性化は、補体系の第１構成成分（Ｃ１ｑ）が、その同類抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体の活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載のものなどのＣＤＣアッセイを行い得る。
用語「インフルエンザＡ」および「インフルエンザウイルスＡ」は、ウイルスのＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。インフルエンザウイルスＡには１種のみ、すなわちインフルエンザＡウイルスしか含まれず、これは、トリ、ヒト、ブタ、およびウマにおいてインフルエンザを引き起こす。インフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプの株が野鳥から単離されているが、疾患は一般的でない。インフルエンザＡウイルスの一部の分離株は、家禽および稀であるがヒトの両方において、重篤な疾患を引き起こす。
感染症を処置することを目的とした「哺乳動物」は、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの動物園、競技、またはペットの動物を含めた、任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「処置すること」もしくは「処置」または「緩和」は、治療処置および予防的または防御的手段をどちらも指し；その目的は、標的とした病理状態または障害を予防または減速（軽減）させることである。処置を必要とするものには、既に障害に罹患しているもの、および障害を罹患しやすいものまたは障害を予防すべきものが含まれる。被験体または哺乳動物は、治療的な量の本発明の方法による抗体を受けた後、患者が、以下のうちの１つまたは複数が観察可能かつ／もしくは測定可能に減少している、または存在しない場合に、感染症の「処置」が成功している：感染細胞の数の減少もしくは感染細胞が存在しないこと；全細胞中の感染細胞の割合が減少していること；および／または具体的な感染症に関連する症状のうちの１つもしくは複数がある程度まで緩和されていること；罹患率および死亡率が減少していること、ならびに生活の質の問題が改善されていること。処置の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通した慣用的な手順によって容易に測定可能である。
用語「治療上有効な量」は、被験体または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」ために有効な抗体または薬物の量を指す。前述の「処置すること」の定義を参照されたい。
「連用」投与とは、急性の様式との対照として、最初の治療効果（活性）を長期間維持するために薬剤（複数可）を連続的な様式で投与することをいう。「断続的な」投与とは、中断なしに継続的に行わず、むしろ周期的な性質である処置である。
１つまたは複数の追加の治療剤「と組み合わせた」投与には、同時（同時）および任意の順序で継続的な投与することが含まれる。
本明細書中で使用する「担体」には、製薬上許容される担体、賦形剤、または安定化剤が含まれ、これらは、使用する用量および濃度で、それに曝す細胞または哺乳動物に対して無毒性である。しばしば、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝化した水溶液である。生理的に許容される担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
本明細書中で使用する用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）、抗生物質、および細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素もしくは酵素活性毒素などの毒素（その断片および／またはバリアントを含む）、ならびに以下に開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が含まれることを意図する。他の細胞傷害剤を以下に記載する。
本明細書中で使用する「成長阻害性剤」は、細胞の成長を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで阻害する化合物または組成物を指す。成長阻害性剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を遮断する薬剤が含まれる。古典的なＭ期遮断剤には、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビノレルビンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどが含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃなどがある。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ編、第１章、題名「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」、Ｍｕｒａｋａｍｉら（Ｗ Ｂ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５年）、特に１３頁中に見つけることができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、どちらもイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（タキソテール（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促進し、脱重合を防止することによって微小管を安定化し、これは、細胞中の有糸***の阻害をもたらす。
本明細書中で使用する「標識」は、抗体と直接または間接的に結合体化して「標識した」抗体を生じる、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であるか（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学変換を触媒し得る。
本明細書中で使用する用語「エピトープでタグ付けした」は、「タグポリペプチド」と融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供できる程に十分な残基を有するが、それと融合させるポリペプチドの活性を妨害しない程に十分に短い。また、タグポリペプチドは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり独特であることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
「小分子」は、本明細書中で約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で互換性があるように使用し、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーを指す。ポリヌクレオチドには、ポリペプチドを発現する、または発現するように適応させ得る、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミド配列、ならびにより小さな操作した遺伝子セグメントが含まれ得る。
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列ならびにネイティブ配列に天然に付随するリボソームおよびポリメラーゼなどのタンパク質または複合体から実質的に分離された核酸である。この用語には、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列が包含され、組換えまたはクローニングしたＤＮＡ単離物および化学合成した類似体または異種系によって生物学的に合成した類似体が含まれる。実質的に純粋な核酸には、単離された形の核酸が含まれる。もちろん、これは、最初に単離されたままの核酸のことをいい、単離された核酸に後に人為的に付加した遺伝子または配列を排除しない。
用語「ポリペプチド」は、その慣用の意味、すなわち、アミノ酸の配列として使用する。ポリペプチドは、生成物の具体的な長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、具体的にそうでないと指定しない限りは、本明細書中で互換性があるように使用し得る。また、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当技術分野で知られている他の修飾（天然に存在するものおよび天然に存在しないもの両方）を指さないかあるいは排除しない。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその部分配列であり得る。本発明のコンテキストにおける具体的な対象とするポリペプチドは、ＣＤＲを含み、抗原またはインフルエンザＡ感染細胞に結合することができるアミノ酸部分配列である。
「単離ポリペプチド」は、その天然の環境の構成成分から同定ならびに分離および／または回収したものである。好ましい実施形態では、単離ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定してポリペプチドの９５重量％より高くまで、最も好ましくは９９重量％より高くまで、（２）スピンカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な度合まで、または（３）クマシーブルー、もしくは、好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離ポリペプチドには組換え細胞内にｉｎ ｓｉｔｕのポリペプチドが含まれる。なぜなら、そのポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、通常は、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
「ネイティブ配列」のポリヌクレオチドとは、天然に由来するポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するものである。「ネイティブ配列」のポリペプチドとは、天然に由来する（例えば任意の種由来の）ポリペプチド（例えば抗体）と同じアミノ酸配列を有するものである。そのようなネイティブ配列のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成の手段によって産生することができる。
本明細書中で使用する用語、ポリヌクレオチド「バリアント」は、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入によって本明細書中に具体的に開示するポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数を修飾し、コードされるポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を、本明細書中に記載のように、および／もしくは当技術分野で周知の多くの技術のうちの任意のものを用いて評価することによって、合成によって作製し得る。
本明細書中で使用する用語、ポリペプチド「バリアント」は、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入によって本明細書中に具体的に開示するポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、上記本発明のポリペプチド配列のうちの１つもしくは複数を修飾し、ポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を、本明細書中に記載のように、および／もしくは当技術分野で周知の多くのの技術のうちの任意のものを用いて評価することによって、合成によって作製し得る。
修飾を本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行っても、依然として望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードしている機能的分子が得られ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、等価、さらには改善された、本発明のバリアントまたはポリペプチドの一部分を作製することが所望される場合、当業者は、典型的には、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変化させるであろう。
例えば、タンパク質構造において、他のポリペプチド（例えば抗原）または細胞に結合するその能力を感知できるほど損失させずに、特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換し得る。タンパク質の結合能力および性質がタンパク質の生物学的な機能的活性を決定するため、特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、および、もちろんその根底にあるＤＮＡコード配列にも行い、それでも同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、その生物学的な有用性または活性を感知できるほど損失させずに、開示した組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードしている対応するＤＮＡ配列に様々な変化を行い得ることが企図される。
多くの場合、ポリペプチドバリアントは１つまたは複数の保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学分野の技術者によってポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないことが予想されるように、１つのアミノ酸で同様の特性を有する別のアミノ酸を置換するものである。
そのような変化を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を与えることにおけるヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が生じるタンパク質の二次構造に寄与し、ひいてはそれがタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めることは、理解されている。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換してもよく、それでも類似の生物活性を有するタンパク質が得られ得る、すなわち、さらには生物学的機能として等価なタンパク質が得られることは、当技術分野で知られている。そのような変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。また、当技術分野では、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行うことができることも理解されたい。米国特許４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所的平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。
米国特許４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸で類似の親水性値を有する別のものを置換し、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることを理解されたい。そのような変化では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
したがって、上記に概要を示したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似度、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づいている。様々な前述の特徴を考慮にいれた例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似度に基づいて行ってもよい。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する無荷電の極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。保存的変化を表し得る他のアミノ酸群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。バリアントは、非保存的変化も、またはそれに代えて含み得る。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によってネイティブ配列と異なる。バリアントは、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー性質に最小限の影響しか与えないアミノ酸の欠失または付加によっても（またはそれに代えて）修飾し得る。
ポリペプチドは、同時翻訳でまたは翻訳後にタンパク質の移動を指示する、タンパク質のＮ末端の端にシグナル（またはリーダー）配列を含んでいてもよい。また、ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドと固体担体との結合を強化するために、リンカーまたは他の配列と結合体化させてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域と結合体化させ得る。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を比較する際、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を、以下に記載するように最大一致についてアラインメントして、同じである場合に、２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較して、配列類似度の局所領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指し、配列と同じ数の連続的な位置の参照配列との比較を、２つの配列の最適なアラインメントを行った後に行い得る。
比較のための配列の最適なアラインメントは、生物情報学ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅスート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、初期設定パラメータを使用して実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームを包含している：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ．（１９７８年）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ．編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ．（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ ５巻：１５１〜１５３頁；Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ． ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８年）ＣＡＢＩＯＳ ４巻：１１〜１７頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ．（１９７１年）Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁；Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ． Ｎｅｓ， Ｍ．（１９８７年）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４巻：４０６〜４２５頁；Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｓｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ．（１９７３年）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ − ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．（１９８３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁。
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁の局所的同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁の類似度検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．）、または検査によって、実施し得る。
％配列同一性および配列類似度を決定するために適したアルゴリズムの好ましい一例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば、本明細書中に記載のパラメータとともに用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの％配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用可能である。
例示的な一例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチ残基対のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算することができる。それぞれの方向の単語ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合；１つもしくは複数の陰性スコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；または配列のどちらかの末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期設定として単語長（Ｗ）が１１および予測（Ｅ）が１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁参照）アラインメントでは、（Ｂ）が５０、予測（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
アミノ酸配列では、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算することができる。それぞれの方向の単語ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合；１つもしくは複数の陰性スコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；または配列のどちらかの末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。
一手法では、「％配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメント用の参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列中にも存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウのサイズ）で除算し、結果を１００で乗算することによって計算して％配列同一性を得ることで、計算する。
「相同性」は、最大％相同性をもたらすために配列のアラインメントを行い、必要な場合はギャップを導入した後に、非変異配列と同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列バリアント中の残基の割合を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドバリアントは、本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。
「ベクター」には、シャトルおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミド構築体は、プラスミドを細菌内で複製および選択するために、それぞれ複製起点（例えばＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」は、本発明の抗体断片を含めた抗体を細菌または真核細胞内で発現させるために必要な制御配列または調節エレメントを含むベクターを指す。適切なベクターを以下に開示する。
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形が含まれる。
本発明には、本発明のポリペプチドを含むヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体、ならびにその断片およびバリアントが含まれる。一実施形態では、抗体は、本明細書中でＴＣＮ−０３２ （８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１ （２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、３２４２＿Ｐ０５、ＴＣＮ−５２２（３２１２＿Ｉ１２）、ＴＣＮ−５２１（３２８０＿Ｄ１８）、ＴＣＮ−５２３（５２４８＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５６３（５２３７＿Ｂ２１）、ＴＣＮ−５２６（５０８４＿Ｃ１７）、ＴＣＮ−５２７（５０８６＿Ｃ０６）、ＴＣＮ−５２８（５０８７＿Ｐ１７）、ＴＣＮ−５２９（５２９７＿Ｈ０１）、ＴＣＮ−５３０（５２４８＿Ｈ１０）、ＴＣＮ−５３１（５０９１＿Ｈ１３）、ＴＣＮ−５３２（５２６２＿Ｈ１８）、ＴＣＮ−５３３（５２５６＿Ａ１７）、ＴＣＮ−５３４（５２４９＿Ｂ０２）、ＴＣＮ−５３５（５２４６＿Ｐ１９）、ＴＣＮ−５３６（５０９５＿Ｎ０１）、ＴＣＮ−５３７（３１９４＿Ｄ２１）、ＴＣＮ−５３８（３２０６＿Ｏ１７）、ＴＣＮ−５３９（５０５６＿Ａ０８）、ＴＣＮ−５４０（５０６０＿Ｆ０５）、ＴＣＮ−５４１（５０６２＿Ｍ１１）、ＴＣＮ−５４２（５０７９＿Ａ１６）、ＴＣＮ−５４３（５０８１＿Ｇ２３）、ＴＣＮ−５４４（５０８２＿Ａ１９）、ＴＣＮ−５４５（５０８２＿Ｉ１５）、ＴＣＮ−５４６（５０８９＿Ｌ０８）、ＴＣＮ−５４７（５０９２＿Ｆ１１）、ＴＣＮ−５４８（５０９２＿Ｐ０１）、ＴＣＮ−５４９（５０９２＿Ｐ０４）、ＴＣＮ−５５０（５０９６＿Ｆ０６）、ＴＣＮ−５５１（５２４３＿Ｄ０１）、ＴＣＮ−５５２（５２４９＿Ｉ２３）、ＴＣＮ−５５３（５２６１＿Ｃ１８）、ＴＣＮ−５５４（５２７７＿Ｍ０５）、ＴＣＮ−５５５（５２４６＿Ｌ１６）、ＴＣＮ−５５６（５０８９＿Ｋ１２）、ＴＣＮ−５５７（５０８１＿Ａ０４）、ＴＣＮ ５５８（５２４８＿Ｈ１０ｂ）、ＴＣＮ−５５９（５０９７＿Ｇ０８）、ＴＣＮ−５６０（５０８４＿Ｐ１０）、ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７）、ＳＣ０６−１４１、ＳＣ０６−２５５、ＳＣ０６−２５７、ＳＣ０６−２６０、ＳＣ０６−２６１、ＳＣ０６−２６２、ＳＣ０６−２６８、ＳＣ０６−２７２、ＳＣ０６−２９６、ＳＣ０６−３０１、ＳＣ０６−３０７、ＳＣ０６−３１０、ＳＣ０６−３１４、ＳＣ０６−３２３、ＳＣ０６−３２５、ＳＣ０６−３２７、ＳＣ０６−３２８、ＳＣ０６−３２９、ＳＣ０６−３３１、ＳＣ０６−３３２、ＳＣ０６−３３４、ＳＣ０６−３３６、ＳＣ０６−３３９、ＳＣ０６−３４２、ＳＣ０６−３４３、ＳＣ０６−３４４、ＣＲ６１４１、ＣＲ６２５５、ＣＲ６２５７、ＣＲ６２６０、ＣＲ６２６１、ＣＲ６２６２、ＣＲ６２６８、ＣＲ６２７２、ＣＲ６２９６、ＣＲ６３０１、ＣＲ６３０７、ＣＲ６３１０、ＣＲ６３１４、ＣＲ６３２３、ＣＲ６３２５、ＣＲ６３２７、ＣＲ６３２８、ＣＲ６３２９、ＣＲ６３３１、ＣＲ６３３２、ＣＲ６３３４、ＣＲ６３３６、ＣＲ６３３９、ＣＲ６３４２、ＣＲ６３４３、またはＣＲ６３４４と命名する抗体である。これらの抗体は、同じ細胞型の未感染の対照細胞と比較して、インフルエンザＡ感染細胞に優先的に結合する、または特異的に結合する。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、Ｍ２またはＨＡタンパク質に結合する。特定の実施形態では、本発明は、ネイティブコンフォメーションにおいてのみ存在する、すなわち、細胞中で発現されたままの、Ｍ２ｅまたはＨＡ内のエピトープに結合するヒト抗インフルエンザ抗体を提供する。特定の実施形態では、これらの抗体は、単離されたＭ２ｅポリペプチド、例えば２３個のアミノ酸残基のＭ２ｅ断片または単離されたＨＡポリペプチドに特異的に結合することができない。これらの抗体は、Ｍ２またはＨＡペプチドまたはタンパク質の非直鎖状（すなわちコンフォメーション）エピトープ（複数可）を認識することを理解されたい。
Ｍ２またはＨＡタンパク質内、特にＭ２ｅ内のこれらの特異的コンフォメーションのエピトープは、被験体におけるインフルエンザ感染症の発生を予防するためのワクチンとして使用し得る。
当業者には理解されるように、本明細書の抗体の一般的な説明ならびにそれを調製および使用する方法は、個々の抗体ポリペプチドの構成要素および抗体断片にも適用される。
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。しかし、好ましい実施形態では、これらはモノクローナルである。特定の実施形態では、本発明の抗体は、完全ヒト抗体である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野で知られており、一般に、例えば米国特許第６，８２４，７８０号に記載されている。典型的には、本発明の抗体は、以下にさらに記載する当技術分野で利用可能なベクターおよび方法を用いて、組換えによって産生する。ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によっても産生し得る（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
ヒト抗体はまた、内在性免疫グロブリンの産生が存在しない場合に完全ヒト抗体のレパートリーを産生することができる、トランスジェニック動物（例えばマウス）中で産生させ得る。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失により、内在性抗体の産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列変異体マウス内に移入することで、抗原誘発の際にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９号（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；およびＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。そのような動物を遺伝子操作して、本発明のポリペプチドを含むヒト抗体を産生させ得る。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトおよび非ヒト源に由来する配列をどちらも含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、これらのキメラ抗体は、ヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変領域残基および場合によっては一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
本発明のコンテキストでは、キメラ抗体には、ヒト超可変領域または１つもしくは複数のＣＤＲが保持されているが、配列の１つまたは複数の他の領域が非ヒト動物からの対応する配列で置き換えられている、完全ヒト抗体も含まれる。
キメラ抗体の作製に使用する、軽および重両方の非ヒト配列の選択は、抗体をヒト治療での使用に意図する場合に、抗原性およびヒトの抗非ヒト抗体応答を減少させるために重要である。キメラ抗体が抗原に対する高い結合親和性および他の望ましい生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい一方法によれば、キメラ抗体は、親のヒトおよび非ヒト配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的なキメラ生成物の分析プロセスによって調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者が精通している。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元コンフォメーション構造を例示およびディスプレイするコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエントおよび輸入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基が、抗原結合の影響に直接かつ最も大きく関与している。
上述のように、抗体（または免疫グロブリン）は、重鎖の定常領域中のアミノ酸配列の差異に基づいて、５つの異なるクラスに分類することができる。所定のクラス内のすべての免疫グロブリンは、非常に類似した重鎖定常領域を有する。これらの差異は、配列研究、またはより一般的には血清学的手段によって（すなわち、これらの差異に対するものである抗体を使用することによって）、検出することができる。本発明の抗体、またはその断片は、任意のクラスであってよく、したがって、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン重鎖を有し得る。ガンマ鎖はガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、またはガンマ４であってよく；アルファ鎖はアルファ１またはアルファ２であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＩｇＧである。ＩｇＧは、免疫グロブリン分子の機能をすべて実行することができるため、最も多用途の免疫グロブリンであるとみなされている。ＩｇＧは血清中の主要なＩｇであり、胎盤を横断する唯一のＩｇクラスである。ＩｇＧは補体の固定も行うが、ＩｇＧ４サブクラスは行わない。マクロファージ、単球、ＰＭＮおよび一部のリンパ球は、ＩｇＧのＦｃ領域に対するＦｃ受容体を有する。すべてのサブクラスが同等に良好に結合するわけではなく、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はＦｃ受容体に結合しない。ＰＭＮ、単球およびマクロファージ上のＦｃ受容体に結合することの結果は、これにより細胞がより良好に抗原の内部移行を行うことができることである。ＩｇＧは、貪食を増強するオプソニンである。ＩｇＧと他の細胞種上のＦｃ受容体との結合は、他の機能の活性化をもたらす。本発明の抗体は、任意のＩｇＧサブクラスのものであり得る。
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＩｇＥである。ＩｇＥは、抗原と相互作用する前でさえも好塩基球および肥満細胞上のＦｃ受容体に非常に密に結合するため、最も一般的でない血清Ｉｇである。好塩基球、肥満細胞に結合する結果、ＩｇＥはアレルギー反応に関与している。アレルゲンが細胞上のＩｇＥに結合することにより、アレルギー性症状をもたらす様々な薬理学的媒介物質の放出がもたらされる。ＩｇＥはまた、寄生蠕虫疾患においても役割を果たす。好酸球はＩｇＥのＦｃ受容体を有しており、好酸球とＩｇＥでコーティングされた蠕虫との結合により、寄生生物の死滅がもたらされる。ＩｇＥは補体を固定しない。
様々な実施形態では、本発明の抗体およびその断片は、カッパまたはラムダのどちらかである可変軽鎖を含む。ラムバ（ｌａｍｂａ）鎖は、例えば、ラムダ１、ラムダ２、ラムダ３、およびラムダ４を含めたサブタイプのうちの任意のものであり得る。
上述のように、本発明は、本発明のポリペプチドを含む抗体断片をさらに提供する。特定の状況下では、抗体全体ではなく抗体断片を使用する利点が存在する。例えば、断片はサイズがより小さいため、急速なクリアランスを可能にし、また、固形腫瘍などの特定の組織への接近の改善がもたらされ得る。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体；ならびに抗体断片から形成した多特異性抗体が含まれる。
様々な技術が抗体断片を産生するために開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって誘導していた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）参照）。しかし、これらの断片は、現在では組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は、すべてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、それから分泌させることができ、したがって、大量のこれらの断片の産生が容易となる。Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技術は、当業者に明らかであろう。
他の実施形態では、選択した抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する種は、ＦｖおよびｓＦｖだけである。したがって、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏ使用中における減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のどちらかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすために構築し得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、上記を参照されたい。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号などに記載されている「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得る。
特定の実施形態では、本発明の抗体は二重特異性または多重特異性である。二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体では、第１の抗原結合部位を、第２の抗原に対する結合部位と組み合わせ得る。あるいは、感染細胞に対する細胞防御機構を集中かつ局在化させるために、抗Ｍ２ｅアームを、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）などの白血球上の始動分子に結合するアーム、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と組み合わせ得る。また、二重特異性抗体は、感染細胞に対する細胞傷害剤を局在化させるために用いてもよい。これらの抗体は、Ｍ２ｅ結合アームおよび細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。ＷＯ９６／１６６７３は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５，８３７，２３４号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。完全長の二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいており、２本の鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組合せが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生じ、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって行う正しい分子の精製は多少厄介であり、生成物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
異なる手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、Ｉｇ重鎖定常ドメインとである。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つ中に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望する場合は免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主細胞内に同時トランスフェクトする。これにより、構築に使用する３本のポリペプチド鎖の不等な比が最適な収率の所望の二重特異性抗体をもたらす実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調節することに関してより高い柔軟性がもたらされる。しかし、等比の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または比が所望の鎖の組合せの収率に有意な影響を与えない場合は、２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクター内に挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアーム中に第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第２の結合特異性を提供する）からなる。二重特異性分子の半分にしか存在しない免疫グロブリン軽鎖が分離の容易な方法を提供するため、この非対称の構造が、所望の二重特異性化合物を所望しない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にすることが見い出された。この手法はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細には、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にすることができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖（複数可）と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」が第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ヘテロ二量体の収率を、ホモ二量体などの他の所望しない最終産物を超えて増加させる機構が提供される。
二重特異性抗体には、架橋結合または「ヘテロ結合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ結合体中の抗体の一方をアビジンとカップリングさせ、他方をビオチンとカップリングさせることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を所望しない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染症を処置するため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の好都合な架橋結合方法を用いて作製し得る。適切な架橋結合剤が当技術分野で周知であり、いくつかの架橋結合技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
二重特異性抗体を抗体断片から作製する技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製する手順を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。その後、作製されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。生じる二重特異性抗体は、酵素の選択的固定剤として使用することができる。
最近の進歩により、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収することが容易となり、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。それぞれのＦａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの定方向化学的カップリングに供して二重特異性抗体が形成された。そのようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を始動させることができた。
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製および単離する様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合によって連結させた。抗体のホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再度酸化して抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体のホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）によって記載されている「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬと連結したＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合することが強いられ、したがって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
２価より高い結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年）。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（および／または異化）され得る。本発明の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードしている核酸の組換え発現によって容易に産生することができる、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば四価の抗体）であることができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端にある３つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３〜約８個、好ましくは４個の抗原結合部位を含む（またはそれからなる）。多価抗体は、少なくとも１本のポリペプチド鎖（好ましくは２本のポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖（複数可）は２個以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでいてよく、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１本のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２個（好ましくは４個）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。ここで企図する軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択でＣＬドメインをさらに含む。
本発明の抗体には、単鎖抗体がさらに含まれる。
特定の実施形態では、本発明の抗体は内部移行抗体である。
本明細書中に記載する抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を、抗体もしくはその鎖をコードしているポリヌクレオチド内に導入することによって、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入および／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って最終抗体に到達し得るが、ただし、最終の構築体は所望の特徴を保有することを前提とする。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体の翻訳後プロセスも変更し得る。本発明のポリペプチドについて上述した変異および修飾のうちの任意のものを、本発明の抗体に含め得る。
変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年）によって記載されている「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。ここでは、残基または標的残基の基を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、アミノ酸とＰＳＣＡ抗原との相互作用に影響を与える。その後、置換に対して機能的感度を実証するアミノ酸位置を、追加または他の変異を置換部位にまたはその部位のために導入することによって洗練する。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は事前に決定されているが、変異の性質自体は事前に決定されていない。例えば、所定の部位における変異の性能を分析するために、ａｌａ走査またはランダム変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現された抗抗体バリアントを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から百個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。他の抗体の挿入バリアントには、抗体のＮまたはＣ末端に、酵素（例えばＡＤＥＰＴに対するもの）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合したものが含まれる。
別の種類のバリアントは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられている。置換変異誘発の最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的および非保存的置換が企図される。
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の、例えば、シートもしくはヘリックスコンフォメーションとしての構造、（ｂ）分子の標的部位での荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに関してその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。
また、抗体の正しいコンフォメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋結合を防止するために、一般にセリンで置換し得る。逆に、その安定性を改善するために（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）、システイン結合（複数可）を抗体に付加し得る。
置換バリアントの一種は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択する生じるバリアント（複数可）は、それを作製した親抗体と比較して生物学的特性が改善されている。そのような置換バリアントを作製する好都合な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を含む。手短に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を変異させて、それぞれの部位のすべての可能なアミノ置換を作製する。そのようにして作製された抗体バリアントを、それぞれの粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生産物との融合体として、一価の様式で線維状ファージ粒子からディスプレイされる。その後、本明細書中に開示したように、ファージディスプレイバリアントをその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾の候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはそれに加えて、抗体と抗原または感染細胞との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書中に詳述する技術に従った置換の候補である。そのようなバリアントを作製した後、バリアントのパネルを本明細書中に記載のようにスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
抗体の別の種類のアミノ酸バリアントは、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、抗体中に見つかる１つもしくは複数の炭水化物部分を欠失させる、および／または抗体中に存在しない１つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合またはＯ結合のどちらかである。Ｎ結合とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合することである。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素結合するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のどちらかをポリペプチド中に存在させることで、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖のＮ−アセイルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することをいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも用い得る。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加する、またはそれを置換することによっても行い得る（Ｏ結合グリコシル化部位）。
本発明の抗体は、エフェクター機能に関して、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために、改変されている。これは、抗体のＦｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成し得る。あるいは、またはそれに加えて、システイン残基（複数可）をＦｃ領域内の導入し、それによりこの領域中に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし得る。そのようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善した内部移行能力および／または増加した補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１７６巻：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）を参照されたい。Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３巻：２５６０〜２５６５頁（１９９３年）に記載のヘテロ二官能性架橋結合剤を用いて、増強した感染抑制活性を有するホモ二量体抗体も調製し得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、したがって増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３巻：２１９〜２３０頁（１９８９年）を参照されたい。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、抗体（特に抗体断片）内にサルベージ受容体結合エピトープを取り込み得る。本明細書中で使用する用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子の増加するｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を担っているＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
本発明の抗体はまた、例えば精製または診断的用途で使用するためのエピトープタグまたは標識を含むように改変し得る。本発明はまた、細胞傷害剤または成長阻害性剤などの抗癌剤と結合体化した抗体を含む免疫結合体を用いた治療にも関する。そのような免疫結合体の作製に有用な化学療法剤は上述した。
抗体と、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの１つまたは複数の小分子毒素との結合体も、本明細書中に企図される。
好ましい一実施形態では、本発明の抗体（完全長または断片）は、１つまたは複数のマイタンシノイド分子と結合体化している。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸***（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、特定の微生物も、マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号に開示されている。
その治療指数を改善する試みとして、マイタンシンおよびマイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合体化させた。マイタンシノイドを含む免疫結合体およびその治療上の使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：８６１８〜８６２３頁（１９９６年）は、ヒト結腸直腸癌に対して誘導されるモノクローナル抗体Ｃ２４２と連結した、ＤＭ１と命名されたマイタンシノイドを含む免疫結合体を記載している。この結合体は、培養結腸癌細胞に対して細胞傷害性が高いことが判明し、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。
抗体−マイタンシノイドの結合体は、抗体またはマイタンシノイド分子のどちらの生物活性を顕著に減少させずに、抗体をマイタンシノイド分子と化学的に連結することによって調製する。抗体分子１個あたり平均して３〜４個のマイタンシノイド分子が結合体化したものが、抗体の機能または溶解度に負の影響を与えずに標的細胞の細胞傷害を増強することにおいて有効性が示されているが、１個の毒素／抗体の分子でさえも、裸の抗体を使用するよりも細胞傷害を増強させると予測される。マイタンシノイドは当技術分野で周知であり、既知の技術によって合成するか、天然源から単離することができる。適切なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号ならびに本明細書中で上記引用した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香環中または他の位置で修飾されたマイタンシノール類似体、例えば様々なマイタンシノールエステルである。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁（１９９２年）に開示されているものを含めて、抗体結合体を作製するための多くの連結基が当技術分野で知られている。連結基には、上記同定した特許中に開示したジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、またはエステラーゼに不安定な基が含まれ、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
免疫結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製し得る。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、１７３巻：７２３〜７３７頁［１９７８年］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載のように調製することができる。炭素−１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体と結合体化させるための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞傷害薬の細胞中での放出を促進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁（１９９２年）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用し得る。
別の目的免疫結合体は、１つまたは複数のカリケアマイシン分子と結合体化した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡの切断を生じることができる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製には、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号（すべてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。抗体が結合体化することができる別の薬物は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは、どちらも細胞内作用部位を有しており、形質膜を容易に横断しない。したがって、これらの薬剤の、抗体に媒介される内部移行による細胞取り込みは、その細胞傷害効果を大きく増強させる。
本発明の抗体と結合体化させることができる他の薬剤の例には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載されているＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として総合的に知られている薬剤ファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
使用できる酵素活性毒素およびその断片には、例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
本発明には、さらに、抗体と核溶解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成した免疫結合体も含まれる。
感染細胞を選択的に破壊するためには、抗体は放射性の高い原子を含む。様々な放射性同位体が、放射結合体化抗ＰＳＣＡ抗体の生成に利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｃ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が含まれる。結合体を診断のために使用する場合、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含み得る。
放射標識または他の標識は、既知の方法によって結合体内に取り込ませる。例えば、ペプチドを、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いて、生合成または化学アミノ酸合成し得る。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０はリシン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、８０巻：４９〜５７頁を用いて、ヨウ素−１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）は、他の方法を詳細に記載している。
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製する。ＤＮＡの長さは、結合体の２つの部分を、互いに隣接して、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードしている領域によって隔てられてコードしている、それぞれの領域を含み得る。
本発明の抗体は、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５参照）を活性のある抗癌薬へと変換するプロドラッグ活性化酵素と結合体化させることによる、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（ＡＤＥＴ）でも使用する（例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照）。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素構成成分には、プロドラッグを、より活性のある細胞傷害性のあるその形態へと変換する様式でプロドラッグに作用することができる、任意の酵素が含まれる。本発明の方法において有用な酵素には、それだけには限定されないが、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアルカリフォスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬５−フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なプロテアーゼ、例えば、ｓｅｒｒａｔｉａプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼならびにカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）等；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用な炭水化物切断酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するために有用なβ−ラクタマーゼ；そのアミン窒素をそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するために有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれる。あるいは、当技術分野で「抗体酵素」としても知られている、酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８巻：４５７〜４５８頁（１９８７年）参照）。抗体−抗体酵素の結合体は、抗体酵素を感染細胞集団に送達するために、本明細書中に記載のように調製することができる。
本発明の酵素は、上述のヘテロ二官能性架橋結合試薬を使用することなどの当技術分野で周知の技術によって、抗体と共有結合させることができる。あるいは、少なくとも本発明の酵素の機能的に活性のある部分に連結した少なくとも本発明の抗体の抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６０４〜６０８頁（１９８４年）を参照されたい。
抗体の他の修飾が本明細書中で企図される。例えば、抗体を、様々な非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの１つと連結させ得る。また、抗体は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロ乳濁液中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ， Ａ．編、（１９８０年）に開示されている。
また、本明細書中に開示した抗体は、免疫リポソームとしても処方する。「リポソーム」は、薬物を哺乳動物に送達するために有用な、様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さな小胞である。リポソームの構成成分は、一般的に、生体膜の脂質配置に類似の二重層の形態で配置されている。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４０３０頁（１９８０年）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開のＷＯ９７／３８７３１などに記載されているように、当技術分野で知られている方法によって調製する。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法によって作製することができる。リポソームを、定義された孔径のフィルターを通して押出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５７巻：２８６〜２８８頁（１９８２年）に記載のように、ジスルフィド交換反応によって、リポソームと結合体化させることができる。化学療法剤を任意選択でリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８１巻（１９号）１４８４頁（１９８９年）を参照されたい。
本発明の抗体またはその断片は、様々な生物学的または機能的特徴のうちの任意のものを保有し得る。特定の実施形態では、これらの抗体は、インフルエンザＡに特異的な抗体またはＭ２タンパク質に特異的な抗体であり、これは、これらの抗体が、正常な対照細胞と比較して、それぞれインフルエンザＡまたはそのＭ２タンパク質に特異的に結合する、または優先的に結合することを示す。特定の実施形態では、抗体はＨｕＭ２ｅ抗体であり、これは、これらの抗体が、正常な対照細胞と比較して、Ｍ２ｅタンパク質、好ましくは、Ｍ２タンパク質が細胞中で発現されている、またはウイルス上に存在する場合にのみ存在するＭ２ｅドメインのエピトープに特異的に結合することを示す。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、この抗体が特異的または優先的に結合するポリペプチドまたは細胞の生物活性を部分的または完全に遮断または阻害する、拮抗抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体は、この抗体が結合する感染細胞の成長を部分的または完全に遮断または阻害する、成長阻害抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体はアポトーシスを誘導する。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または補体依存性細胞傷害を誘導または促進する。
インフルエンザウイルスに特異的な抗体を同定および産生する方法
本発明は、実施例４に例示される、Ｍ２ｅタンパク質に対して産生されるヒト抗インフルエンザ抗体の同定、および実施例１３に例示される、ＨＡタンパク質に対して産生されるヒト抗インフルエンザ抗体の同定のための新規方法を提供する。これらの方法は、感染性因子によって細胞表面に発現される他のポリペプチド、またはさらに感染性因子それ自体の表面に発現されるポリペプチドに特異的な抗体を同定するために容易に適応され得る。
全体として方法は、感染性因子に感染したまたはそれに対するワクチン接種を受けた患者から血清試料を得ることを含む。これらの血清試料は、次いで感染性因子に関連する特定のポリペプチド、例えば感染性因子感染細胞の表面に特異的に発現されるが、未感染細胞ではされないポリペプチドまたはタンパク質などに特異的な抗体を含有するものを同定するためにスクリーニングされる。具体的な実施形態において血清試料は、感染細胞の表面に発現されるポリペプチドを発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞を試料と接触させることによってスクリーニングされる。
目的の感染性因子ポリペプチドに特異的な抗体を含有する血清を有すると患者が同定されると、同じ患者から得られた単核細胞および／またはＢ細胞は、本明細書に記載の任意の方法または当技術分野において利用可能な任意の方法を使用して抗体を産生する細胞またはそのクローンを同定するために、使用される。抗体を産生するＢ細胞が同定されると、抗体の可変領域またはその断片をコードするｃＤＮＡが、標準的ＲＴ−ＰＣＲベクターおよび保存された抗体配列に特異的なプライマーを使用してクローニングされ、目的の感染性因子ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の組換え産生のために使用される発現ベクターにサブクローニングされ得る。
一実施形態において本発明は、インフルエンザＡ感染細胞に特異的に結合する抗体を同定するための方法であって、インフルエンザＡウイルスまたはＭ２タンパク質を発現する細胞を、インフルエンザＡに感染した患者から得た生物学的試料と接触させる工程、細胞に結合する生物学的試料中の抗体の量を決定する工程、および決定された量を対照値と比較する工程を含み、決定された値が対照値より少なくとも２倍を超えて大きい場合にインフルエンザＡ感染細胞に特異的に結合する抗体が示唆される方法を提供する。
種々の実施形態においてＭ２またはＨＡタンパク質を発現する細胞は、インフルエンザＡウイルス感染細胞、またはＭ２またはＨＡタンパク質を発現するポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞である。代替えとして細胞は、Ｍ２ｅドメインおよび、タンパク質が依然として細胞に会合し、かつ完全長Ｍ２タンパク質中に存在する場合と同様の様式でＭ２ｅドメインが細胞表面に存在する十分な追加的Ｍ２配列を含むＭ２タンパク質の一部を発現できる。Ｍ２またはＨＡ発現ベクターを調製し、本明細書に記載のものを含む適切な細胞にトランスフェクトする方法は、Ｍ２およびＨＡ配列が公的に入手可能であるという観点から容易に達成され得る。例えば、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＳＤ）、（Ｍａｃｋｅｎら、２００１年、「Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」ｉｎ Ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＩＶ． Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．、Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ ＆ Ｈａｍｐｓｏｎ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１０３〜１０６頁に記載のワールドワイドウェブ上のｆｌｕ．ｌａｎ１．ｇｏｖ）およびＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）のＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＣ）（ワールドワイドウェブ上のｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｍｓｃ／ｉｎｆｌ＿ａ＿ｖｉｒｕｓ．ｓｈｔｍｌ）を参照されたい。
Ｍ２ｅまたはＨＡ発現細胞または上に記載のウイルスは、インフルエンザＡに感染した患者から得た生物学的試料を、Ｍ２またはＨＡポリペプチドを発現する細胞に選択的に結合する抗体の存在について標準的生物学的技術を使用してスクリーニングするために使用される。例えば、特定の実施形態において抗体は、標識されることができ、例えばＦＭＡＴまたはＦＡＣ分析を使用して、細胞に関連する標識の存在を検出し得る。具体的な実施形態において生物学的試料は、血液、血清、血漿、気管支洗浄物または唾液である。本発明の方法は、ハイスループットな技術を使用して実施され得る。
同定されたヒト抗体は、次いでさらに特徴付けられ得る。例えば、抗体の結合のために必要または十分であるＭ２ｅまたはＨＡタンパク質中の特定のコンフォメーションエピトープは、例えば発現されるＭ２ｅまたはＨＡポリペプチドの部位特異的変異誘発を使用して決定され得る。これらの方法は、細胞表面に発現される任意のタンパク質に結合するヒト抗体を同定するために容易に適用され得る。さらにこれらの方法は、組換えＭ２ｅまたはＨＡを発現する細胞またはウイルス感染細胞ではなく、ウイルス自体への抗体の結合を決定するためにも適用され得る。
抗体、その可変領域またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の組換え産生のための発現ベクターにサブクローニングされ得る。一実施形態においてこれは、同定されたヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を含有する血清からの患者由来の単核細胞を得る工程、単核細胞からＢ細胞クローンを産生する工程、Ｂ細胞を抗体産生形質細胞になるように誘導する工程、およびヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を含有するかどうかを決定するために形質細胞によって産生された上清をスクリーニングする工程によって達成される。ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を産生するＢ細胞クローンが同定されると、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の可変領域またはその一部をコードするＤＮＡをクローニングするために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が実施される。これらの配列は、次いでヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の組換え産生に適する発現ベクターにサブクローニングされる。結合特異性は、Ｍ２ｅまたはＨＡポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞に結合する組換え抗体の能力を決定することによって確認され得る。
本明細書に記載する方法の具体的な実施形態において、末梢血またはリンパ節から単離されたＢ細胞は、例えばそれらがＣＤ１９陽性であることに基づいて選別され、かつ例えば１ウェルあたり単一の細胞特異性ほどの少なさで、例えば９６、３８４または１５３６ウェルの構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に蒔かれる。細胞は、抗体産生細胞、例えば形質細胞に分化するように誘導され、培養上清は回収され、例えばＦＭＡＴまたはＦＡＣＳ分析を使用して感染性因子ポリペプチドをその表面に発現する細胞への結合について検査される。次いで、陽性ウェルを全ウェルＲＴ−ＰＣＲにかけて、クローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅する。重鎖および軽鎖可変領域またはその一部をコードする得られたＰＣＲ産物は組換え発現のためのヒト抗体発現ベクターにサブクローニングされる。得られた組換え抗体は、次いでそれらの本来の結合特異性を確認するために検査され、かつ感染性因子の種々の分離株にわたる全体の特異性についてさらに検査され得る。
したがって一実施形態においてヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を同定する方法は、以下の通り実施される。第１に、完全長またはほぼ完全長のＭ２またはＨＡ ｃＤＮＡをＭ２またはＨＡタンパク質発現のための細胞系にトランスフェクトする。第２に、個々のヒト血漿試料または血清試料を、細胞発現Ｍ２またはＨＡに結合する抗体について検査する。最後に、血漿陽性または血清陽性の個体由来のＭＡｂを同じ細胞発現Ｍ２またはＨＡへの結合について特徴付ける。さらにＭＡｂの精密な特異性のさらなる定義付けは、この時点で実施することができる。
これらの方法は、（ａ）直鎖状Ｍ２ｅペプチド内のエピトープ、（ｂ）Ｍ２ｅの複数のバリアントにおける共通エピトープ、（ｃ）Ｍ２ホモ四量体のコンフォメーション決定基、および（ｄ）Ｍ２ホモ四量体の複数のバリアントの共通コンフォメーション決定基、に特異的な抗体を含む様々な異なるＨｕＭ２ｅ抗体を同定するために実施され得る。最後の分類が、この特異性がインフルエンザのすべてのＡ株についておそらく特異的であることから特に望ましい。
これらの方法は、（ａ）直鎖状ＨＡペプチド内のエピトープ、（ｂ）ＨＡの複数のバリアント内の共通エピトープ、（ｃ）ＨＡタンパク質またはホモ三量体のコンフォメーション決定基、および（ｄ）ＨＡタンパク質またはホモ三量体の複数のバリアントの共通コンフォメーション決定基に特異的な抗体を含む様々な異なるヒトモノクローナル抗ＨＡ抗体を同定するために実施され得る。最後の分類が、この特性がインフルエンザのすべてのＡ株についておそらく特異的であることから特に望ましい。
本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチドは、ヒト抗体ポリペプチドの保存領域に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応による増幅を含む当技術分野において利用可能な方法および本明細書に記載の方法により、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を発現する細胞から単離され得る。例えば、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ＷＯ９２／０２５５１、米国特許第５，６２７，０５２号、またはＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：７８４３〜４８頁（１９９６年）に記載の分子生物学的技術によりＢ細胞からクローニングされ得る。特定の実施形態において、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を発現するクローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方の全体または一領域をコードするポリヌクレオチドは、サブクローニングされ、かつ配列決定される。コードされるポリペプチドの配列は、ポリヌクレオチド配列から容易に決定され得る。
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、本発明の抗体およびポリペプチドを組換え的に産生するために、当技術分野において公知の手順および本明細書に記載の手順を使用して発現ベクターにサブクローニングされ得る。
Ｍ２ｅまたは感染細胞もしくは組織への抗体（またはその断片の）結合特性は、一般に例えば、免疫蛍光に基づくアッセイ（免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など）が挙げられる免疫検出法を使用して決定および評価され得る。免疫アッセイ法は、抗体がインフルエンザＡの１つまたは複数の特定の株由来のＭ２ｅに特異的に結合し、かつ正常対照細胞を認識しない、または交差反応しないかどうかを決定するための対照および手順を含むことができる。
感染性因子またはそのポリペプチド、例えばＭ２またはＨＡに対する抗体を産生する患者を同定するための血清の予備スクリーニングに続いて、本発明の方法は、典型的には患者または被験体からあらかじめ得た生物学的試料からのＢ細胞の単離または精製を含む。患者または被験体は、現在もしくは以前に特定の疾患または感染症であると診断されたもしくは疑われたもしくは有していたことがあってよく、または患者もしくは被験体は、特定の疾患または感染症を有さないと考えられてもよい。典型的には患者または被験体は、哺乳類であり、具体的な実施形態においてはヒトである。生物学的試料は、リンパ節もしくはリンパ節組織、胸水、末梢血、腹水、腫瘍組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）をこれだけに限らないが含むＢ細胞を含有する任意の試料であり得る。種々の実施形態においてＢ細胞は、特定の疾患または感染症に罹患した生物学的試料などの様々な種類の生物学的試料から単離される。しかし、Ｂ細胞を含む任意の生物学的試料が本発明の任意の実施形態について使用され得ることは理解される。
単離されるとＢ細胞は、例えば、プラスマ細胞、形質芽細胞または形質細胞へのＢ細胞の増殖または発達を支持する条件下でＢ細胞を培養することによって抗体を産生するように誘導される。次いで抗体は、典型的にはハイスループットな技術を使用して、標的抗原、例えば特定の組織、細胞、感染性因子またはポリペプチドに特異的に結合する抗体を同定するためにスクリーニングされる。特定の実施形態において、特異抗原、例えば抗体が結合する細胞表面ポリペプチドは、未知である一方で他の実施形態においては抗体が特異的に結合する抗原は既知である。
本発明によりＢ細胞は、生物学的試料、例えば腫瘍、組織、末梢血またはリンパ節試料から当技術分野において公知かつ利用可能な任意の手段によって単離され得る。Ｂ細胞は、典型的にはＦＡＣＳによってそれらの表面のＢ細胞特異的マーカー、例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８および／または表面ＩｇＧの存在に基づいて選別される。しかし当技術分野において既知の他の方法、例えばＣＤ１９磁性ビーズまたはＩｇＧ特異的磁性ビーズを使用するカラム精製に続くカラムからの溶出も使用できる。しかし、任意のマーカーを利用するＢ細胞の磁気分離は、特定のＢ細胞の損失を生じる場合がある。したがって特定の実施形態において、単離された細胞は選別されないが、しかし代わりに腫瘍から単離されたフィコール−精製単核細胞は、適切なまたは望ましい１ウェルあたりの特異性の数で直接蒔かれる。
感染性因子特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、Ｂ細胞は典型的には低密度（例えば１ウェルあたり単一の細胞特異性、１ウェルあたり細胞１〜１０個、１ウェルあたり細胞１０〜１００個、１ウェルあたり細胞１〜１００個、１ウェルあたり細胞１０個未満、または１ウェルあたり細胞１００個未満）で、マルチウェルまたはマイクロタイタープレートに、例えば９６、３８４もしくは１５３６ウェルの構造に蒔かれる。Ｂ細胞が最初に１ウェルあたり細胞１個を超える密度で蒔かれる場合、次いで本発明の方法は、抗原特異的抗体を産生すると同定されたウェルにおいて、１ウェルあたり単一の細胞特異性が達成されるまで細胞を希釈する引き続きの工程を含むことができ、それにより抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の同定を促進する。細胞上清またはその一部および／または細胞は、将来の検査のためおよび抗体ポリヌクレオチドの後の回収のために凍結および保存され得る。
特定の実施形態においてＢ細胞は、Ｂ細胞による抗体の産生に有利な条件下で培養される。例えばＢ細胞は、抗体産生形質芽球、プラスマ細胞または形質細胞を得るためにＢ細胞の増殖および分化に有利な条件下で培養され得る。具体的な実施形態においてＢ細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＣＤ４０リガンドなどのＢ細胞***促進因子の存在下で培養される。詳細な一実施形態においてＢ細胞は、それらをフィード細胞および／またはＣＤ４０リガンドなどの他のＢ細胞活性化因子とともに培養することによって抗体産生細胞に分化する。
細胞培養上清またはそれらから得た抗体は、標的抗原に結合するそれらの能力について、本明細書に記載のものを含む当技術分野において利用可能な常法を使用して検査され得る。具体的な実施形態において培養上清は、標的抗原に結合する抗体の存在についてハイスループットな方法を使用して検査される。例えばＢ細胞は、複数の細胞上清を同時に採取し、かつ標的抗原に結合する抗体の存在について検査するためにロボットプレートハンドラーを使用できるようにマルチウェルマイクロタイターディッシュで培養され得る。具体的な実施形態において抗原は、ビーズ、例えば常磁性またはラテックスビーズ）に抗体／抗原複合体の捕捉を促進するために結合される。他の実施形態において抗原および抗体は、（異なる標識で）蛍光標識され、ＦＡＣＳ分析が標的抗原に結合する抗体の存在を同定するために実施される。一実施形態において抗体結合は、ＦＭＡＴ（商標）分析および装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して決定される。ＦＭＡＴ（商標）は、生細胞またはビーズを使用する、混合および読取りの、非放射性アッセイである、ハイスループットスクリーニングのための蛍光マクロ共焦点プラットホームである。
対照試料（例えば未感染細胞または異なる感染性因子などの生物学的試料）と比較して、特定の標的抗原（例えば感染組織もしくは細胞、または感染性因子などの生物学的試料）への抗体の結合を比較する場合における種々の実施形態において、対照試料に結合する量と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍多く抗体が特定の標的抗原に結合する場合に、抗体は特定の標的抗原に選択的に結合すると考えられる。
抗体鎖、その可変領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の手段を利用して細胞から単離され得る。一実施形態においてポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）例えば、重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列またはその相補物に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、当技術分野において利用可能な常法を使用する逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して単離される。一実施形態において陽性ウェルは、クローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅するためにすべてのウェルがＲＴ−ＰＣＲにかけられる。これらのＰＣＲ産物は、配列決定され得る。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはその一部をコードする得られたＰＣＲ産物は、次いでヒト抗体発現ベクターにサブクローニングされ、当技術分野における常法により組換え的に発現される（例えば米国特許第７，１１２，４３９号を参照されたい）。本明細書に記載の腫瘍特異的抗体またはその断片をコードする核酸分子は、核酸切断、連結、形質転換およびトランスフェクションのための任意の種々の周知の手順により増殖または発現され得る。それにより特定の実施形態において抗体断片の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞においてが好ましい場合がある（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８巻：４９７〜５１５頁（１９８９年））。特定の他の実施形態において抗体またはその抗原結合断片の発現は、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳類細胞を含む）または植物細胞を含む真核宿主細胞においてが好ましい場合がある。適切な動物細胞の例として、これだけに限らないがミエローマ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が挙げられる。植物細胞の例として、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびイネの細胞が挙げられる。当業者に公知の方法により、かつ本開示に基づいて、核酸ベクターは、具体的な宿主系における外来配列の発現のために設計されることができ、次いで腫瘍特異的抗体（またはその断片）をコードするポリヌクレオチド配列は挿入され得る。調節エレメントは、具体的な宿主に応じて変化する。
可変領域および／または定常領域をコードするポリヌクレオチドを含有する１つまたは複数の複製可能な発現ベクターは、調製され、かつ抗体の産生が生じる例えばマウスＮＳＯ系などの非産生ミエローマ細胞系またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌である適切な細胞系を形質転換するために使用され得る。有効な転写および翻訳を得るために、各ベクターにおけるポリヌクレオチド配列は、適切な調節配列、とりわけ可変ドメイン配列に機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきである。このような抗体産生のための具体的な方法は、一般に十分に周知であり、かつ日常的に使用される。例えば分子生物学的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（２００１年）も参照されたい）によって記載されている。必要ではないが、特定の実施形態において組換え抗体をコードするポリヌクレオチドの領域は、配列決定され得る。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら、（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４巻：５４６３頁（１９７７年））および、それへの改善を含むＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載のとおり実施され得る。
具体的な実施形態において得られた組換え抗体またはその断片は、次いでそれらの本来の特異性を確認するために検査され、例えば関連する感染性因子での全体の特異性についてさらに検査され得る。具体的な実施形態において、本明細書に記載の方法により同定または産生された抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）もしくはアポトーシスを介する細胞死滅、および／または巧みにその内部移行する能力について検査される。
ポリヌクレオチド
本発明は、他の態様において、ポリヌクレオチド組成物を提供する。好ましい実施形態においてこれらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、例えばインフルエンザＡ、Ｍ２、Ｍ２ｅまたはＨＡ（可溶性または組換え）に結合する抗体の可変鎖の領域をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖（コードまたはアンチセンス）もしくは２本鎖（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子として、これだけに限らないがイントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１形式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が挙げられる。代替としてまたは追加的に、コード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド中に存在する。同様に代替としてまたは追加的にポリヌクレオチドは、他の分子および／または本発明の支持物質に連結される。本発明のポリヌクレオチドは、例えば生物学的試料中のインフルエンザＡ抗体の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、および本発明のポリペプチドの組換え産生において使用される。
したがって本発明の別の態様により、本明細書に記載のいくつかまたはすべてのポリヌクレオチド配列、これらのポリヌクレオチド配列の相補物、およびこれらのポリヌクレオチド配列の縮重バリアントを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の配列を有するポリペプチドを含む、正常な対照非感染細胞と比較してインフルエンザＡ感染細胞に選択的に結合できるポリペプチドをコードする。さらに本発明は、本発明の任意のポリペプチドをコードするすべてのポリヌクレオチドを含む。
他の関連する実施形態において本発明は、本明細書に記載の配列に実質的な同一性を有する、例えば本明細書に記載の方法（例えば標準的パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して決定される場合に、本発明のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれを超える配列同一性を備えるポリヌクレオチドバリアントを提供する。当業者は、これらの値がコドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮して２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認める。
典型的にはポリヌクレオチドバリアントは、１つまたは複数の置換、追加、欠損および／または挿入を、好ましくはバリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原結合特性が、本明細書に明確に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して実質的に減少しないように含有する。追加的な実施形態において本発明は、本明細書に開示の１つまたは複数の配列と同一またはそれに相補的な配列の種々の長さの近接ストレッチを含むポリヌクレオチド断片を提供する。例えば本明細書に開示の１つまたは複数の配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００もしくは１０００またはそれを超える近接ヌクレオチドおよびそれらの間のすべての中間の長さを含むポリヌクレオチドが本発明によって提供される。本明細書で使用する用語「中間の長さ」は、１６、１７、１８、１９など、２１、２２、２３など、３０、３１、３２など、５０、５１、５２、５３など、１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３など、などの引用値の間の任意の長さを、２００〜５００、５００〜１，０００などの間のすべての整数を含んで表して意味する。
本発明の他の実施形態において、中程度から高度なストリンジェンシーの条件下で本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当技術分野において周知である。例示の目的のために、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査するための適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での前洗浄、５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの一晩のハイブリダイゼーション、続く０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣでの６５℃、２０分間、それぞれ２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することなどによって容易に操作できることを理解する。例えば他の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を、例えば６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除き上に記載の条件を含む。
好ましい実施形態においてポリヌクレオチドバリアントまたは断片によってコードされるポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様の結合特異性（すなわち同じエピトープまたはインフルエンザＡ株に特異的または選択的に結合する）を有する。特定の好ましい実施形態において、上に記載のポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチドバリアント、断片およびハイブリダイズする配列は、本明細書に明確に記載のポリペプチド配列でのレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％のレベルの結合活性を有するポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチドまたはその断片は、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と、それら全体の長さがかなり変化できるように組み合わせられ得る。ほぼ任意の長さの核酸断片が、好ましくは調製および目的の組換えＤＮＡ手順における使用の容易さによって完全長が制限されて使用される。例えば完全長約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（すべての中間の長さを含む）を有する例示的ポリヌクレオチドセグメントは、本発明の多数の実施に含まれる。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列があることは当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列にわずかな相同性を保有する。それにもかかわらず、本発明のポリペプチドをコードするが、コドン使用における差異によって変化するポリヌクレオチドは、本発明によって明確に意図される。さらに本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠損、追加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変更される内在性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、必要ではないが、変化した構造または機能を有する。対立遺伝子は、標準的技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定され得る。
本発明の特定の実施形態において、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発は、コードされるポリペプチドの結合特異性または結合強度などの１つまたは複数の特性を変化させるために実施される。変異誘発のための技術は、当技術分野において周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方でバリアントを作製するために広く使用される。部位特異的変異誘発などの変異誘発手法は、本明細書に記載のポリペプチドのバリアントおよび／または誘導体の調製のために使用される。この手法によって、ポリペプチド配列中の特異的な改変がそれらをコードする基となるポリヌクレオチドの変異誘発を通じて作製される。これらの技術は、例えば、１つまたは複数の前述の考慮すべき事柄を組み込んで１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化をポリヌクレオチドに導入することによって、配列バリアントを調製および検査するためのストレートなアプローチを提供する。
部位特異的変異誘発は、十分なサイズのプライマー配列および欠損接合部を超える両側での安定な二重鎖を形成するための配列の複雑性を提供するために、ヌクレオチド配列の所望の変異および十分な数の近接ヌクレオチドを含む特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を通じて、変異体の産生を可能にする。変異は、選択されるポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチド自体の特性を改善、変更、減少、改変もしくは他に変化させるため、および／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性もしくは一次配列を変更するために使用される。
本発明の他の実施形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、例えばＰＣＲプライマーとして使用される。目的配列に特異的にハイブリダイズするそのような核酸プローブの能力は、所与の試料における相補配列の存在の検出を可能にする。しかし、変異種プライマーまたは、他の遺伝子構築体の調製における使用のためのプライマーの調製のための配列情報の使用などの他の使用も本発明によって包含される。そのように本明細書に開示の１５ヌクレオチド長の近接配列と同じ配列であるかまたは相補的である少なくとも約１５ヌクレオチド長の近接配列の配列領域を含む本発明の核酸セグメントは、特に有用である。より長い近接した同一のまたは相補的な配列、例えば完全長配列およびすべての間の長さを含む約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００の配列（すべての中間の長さを含む）も、特定の実施形態において使用される。
本明細書に開示のポリヌクレオチド配列と同一またはそれに相補的な１０〜１４、１５〜２０、３０、５０もしくはさらに１００〜２００ヌクレオチドほどの（加えて中間の長さも含む）近接ヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えばサザンおよびノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして、ならびに／または例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のためのプライマーとして具体的に意図される。断片の全サイズおよび相補ストレッチ（複数可）のサイズは、最終的には目的の使用または具体的な核酸セグメントの適用に依存する。より小さな断片は、一般的に、近接相補領域の長さが約１５から約１００ヌクレオチドの間などで変化できるハイブリダイゼーション実施形態において使用されるが、より大きな近接相補性ストレッチは、検出しようとする長さの相補配列に応じて使用され得る。
長さ約１５〜２５ヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二本鎖分子の形成を可能にする。長さ１２塩基を超えるストレッチにわたる近接相補性配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させるためには一般に好ましいが、それにより得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５から２５までの近接ヌクレオチドの遺伝子相補性ストレッチまたは所望によりさらに長いヌクレオチドの遺伝子相補性ストレッチを有する核酸分子は、一般的に好ましい。
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に開示の任意の配列の任意の部分から選択される。必要とされるのは、プローブまたはプライマーとして利用しようとする長さ約１５〜２５ヌクレオチドから完全長配列までのおよび完全長配列を含む本明細書に記載の配列または配列の任意の連続部分を精査することだけである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配される。例えば、全配列の端から端へのプライマーの使用も期待できる。
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片もしくはバリアントは、例えば自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施されているとおり化学的手段によって断片を直接合成する工程によって容易に調製される。さらに断片は、米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲ（商標）技術などの核酸複製技術の応用によって、選択した配列を組換え産生のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学の当業者に一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術によって得られる。
ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のポリペプチドの製造のための組換え技術を提供する。本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、およびミニ染色体を含むいかなる種類の細胞または生物においても複製可能であるものを含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの伝播または複製に適したベクター、または本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。このようなベクターは当技術分野において公知であり、市販されている。
本発明のポリヌクレオチドは合成され、次いで全体または一部が組み合わされ、例えば、適切な制限部位および制限酵素を使用した線状化ベクター中へのポリヌクレオチドのサブクローニングなどを含む、慣用的な分子細胞生物学技術を使用してベクター中に挿入される。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。これらのプライマーもまた、ベクター中へのサブクローニングを容易にするための制限酵素切断部位を含む。複製可能なベクター成分は一般に、これらに限定されるわけではないが、以下のうち１つまたは複数を含む：シグナル配列、複製開始点、および１つまたは複数のマーカーまたは選択遺伝子。
本発明のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその機能的同等物は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター中に挿入される。当業者に周知の方法が、対象とするポリペプチドをコードする配列および適切な転写および翻訳制御エレメントを含む、発現ベクターを構築するために使用される。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙに記述されている。
様々な発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含むおよび発現させるために利用される。これらの系は、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系を含むがこれらに限定されるわけではない。一実施形態において、対象とするモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域が、ヌクレオチドプライマーを使用してハイブリドーマ細胞から増幅される。これらのプライマーは、当業者よって合成されるか、またはマウスおよびヒト可変領域増幅用のプライマーを販売している市販の供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照）から購入してもよい。プライマーを使用して重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し、次いでＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクター中にそれぞれ挿入する。これらのベクターを、次いでＥ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳類ベースの発現系中に導入する。ＶＨおよびＶＬドメインの融合物を含む多量の単鎖タンパク質が、これらの方法を使用して製造される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）を参照）。
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導可能なプロモーターを含む任意の数の適した転写エレメントおよび翻訳エレメントが使用される。
原核生物宿主での使用に適したプロモーターの例は、ｐｈｏａプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが適している。細菌系において使用するためのプロモーターもまた、通常、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ配列を含む。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導可能なプロモーターが使用される。
様々なプロモーター配列が真核生物に関して知られており、任意のものが本発明に従って使用される。事実上すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列はすべて、真核生物発現ベクター中に適当に挿入される。
哺乳類細胞系において、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。哺乳類宿主細胞中のベクターのポリペプチド発現は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって、ただしこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合可能であるという条件で、制御される。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を作出する必要があれば、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択マーカーとともに有利に使用され得る。適した発現ベクターの一例は、ＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ−３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。
多くのウイルスに基づく発現系が、ポリペプチドの哺乳類発現のために利用可能である。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、対象とするポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現可能な生存ウイルスを得ることができる（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．およびＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１巻：３６５５〜３６５９頁）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞中の発現を増加させることができる。
細菌系において、発現されるポリペプチドのための意図された使用に応じて、多くの発現ベクターのいずれかが選択される。例えば、多量が所望される場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を誘導するベクターが使用される。これらのベクターは、これらに限定されるわけではないが、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、対象とするポリペプチドをコードする配列をアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基のβ−ガラクトシダーゼの配列とともにインフレームでベクター中にライゲーションすることができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：５５０３〜５５０９頁）などの多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクターなどを含む。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用される。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着に続く遊離グルタチオン存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。このような系において製造されたタンパク質は、クローニングされた対象とするポリペプチドがＧＳＴ部分から随意に遊離できるようにヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターが使用される。酵母宿主とともに使用するための他の適したプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは、エノラーゼなどの他の糖分解酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。総説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）およびＧｒａｎｔら（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３巻：５１６〜５４４頁を参照されたい。成長条件により制御される転写というさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域を含む。酵母発現において使用するための適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記述されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかにより駆動される。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターは、単独でまたはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用される（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７年）ＥＭＢＯ Ｊ．（６巻：３０７〜３１１頁）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターが使用される（Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ．ら（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ．３巻：１６７１〜１６８０頁；Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ．ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４巻：８３８〜８４３頁；およびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ．ら（１９９１年）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．７７巻：８５〜１０５頁）。これらの構築体は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞中に導入することができる。このような技術は、多くの一般に利用可能な総説において記述されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ， Ｓ．またはＭｕｒｒｙ， Ｌ．Ｅ．、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２年）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；１９１〜１９６頁を参照されたい）。
昆虫系もまた、対象とするポリペプチドを発現させるために使用される。例えば、１つのこのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞においてまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫において外来遺伝子を発現させるためにベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。ポリペプチドをコードする配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、外被タンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで組換えウイルスを使用して、例えば、対象とするポリペプチドが発現されるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｅ．Ｋ．ら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１巻：３２２４〜３２２７頁）。
特定の開始シグナルもまた、対象とするポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用される。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチド、その開始コドン、および上流配列をコードする配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかしながら、コード配列、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供される。さらに、挿入されたポリヌクレオチドを確実に正確に翻訳するために、開始コドンは正しいリーディングフレームにある。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものである。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増加される。例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリンをコードする遺伝子において同定されたものなどを含む、多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例は、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関するＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’の位置でベクター中にスプライシングされるが、好ましくはプロモーターから５’側に位置する。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターもまた、典型的に、転写終結のためおよびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合により３’非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、抗ＰＳＣＡ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載の発現ベクターを参照されたい。
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するために適した宿主細胞は、上述した原核生物、酵母、植物または高等真核生物の細胞である。この目的のために適した原核生物の例は、グラム陰性またはグラム陽性細菌などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）などのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も適する。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最もよく使用される。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主などの糸状菌類などの多くの他の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書において使用される。
特定の実施形態において、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する、または発現されたタンパク質を所望の形に処理する能力について選択される。このようなポリペプチドの修飾は、これらに限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を含む。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能を容易にするために使用される。そのような翻訳後活性について特殊な細胞機構および特徴的な機構を有する、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８などの異なる宿主細胞が、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択される。
例えば、米国特許第４８１６５６７号および第６３３１４１５号に記載のものを含む、抗体またはその断片の発現に特に適合させた方法および試薬もまた当技術分野において知られており、利用可能である。様々な実施形態において、抗体重鎖および軽鎖、またはその断片は、同じまたは別個の発現ベクターから発現される。一実施形態において、両鎖は同じ細胞において発現され、それにより機能的抗体またはその断片の形成を容易にする。
治療用抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）に結合体化されている、および免疫結合体自体が感染細胞破壊において有効性を示す場合などの特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合、完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質が細菌において産生される。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現に関しては、例えば、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照されたい。発現後、抗体は可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムによって精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現した抗体を精製するために使用したのと同様のプロセスを使用して行うことができる。
グリコシル化ポリペプチドおよび抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞および昆虫細胞を含む。非常に多くのバキュロウイルス株およびバリアントならびに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｉｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアント、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に利用可能であり、このようなウイルスが、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書中でウイルスとして使用される。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として利用される。
培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞における抗体ポリペプチドおよびその断片の伝播の方法が、本発明に包含される。本発明の方法において使用される哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３または懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、ポリペプチド産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改良した慣用的な栄養培地中で培養する。
長期にわたる高収率の組換えタンパク質産生のために、安定な発現が一般に好ましい。例えば、対象とするポリヌクレオチドを安定して発現する細胞株が、同じまたは別個のベクター上にウイルスの複製開始点および／または外因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して形質転換される。ベクター導入後、細胞を富栄養培地中で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与え、その存在によって導入した配列を発現するのに成功する細胞の成長および回復を可能にすることである。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞型に適切な組織培養技術を使用して増殖させる。
形質転換した細胞株を回復させるために、複数の選択系が使用される。これらの選択系は、これらに限定されるわけではないが、ｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いられる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら（１９７７年）Ｃｅｌｌ １１巻：２２３〜３２頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９９０年）Ｃｅｌｌ ２２巻：８１７〜２３頁）遺伝子を含む。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性も選択のための基準として使用される；例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．７７巻：３５６７〜７０頁）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ．ら（１９８１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１５０巻：１〜１４頁）；およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ与えるａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）。さらなる選択遺伝子が記述されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にし、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８５巻：８０４７〜５１頁）。可視マーカーの使用が普及しており、アントシアニン、ベータ−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーが形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性または安定なタンパク質発現の量を定量化するために広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．ら（１９９５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５５巻：１２１〜１３１頁）。
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は対象とする遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在および発現が確認される。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列中に挿入される場合、配列を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能がないことによって同定される。
別法として、単一プロモーターの制御下で、マーカー遺伝子をポリペプチドをコードする配列とともにタンデムに配置する。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現もまた示す。別法として、所望のポリヌクレオチド配列を含むおよび発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手順によって同定される。これらの手順は、これらに限定されるわけではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ、あるいは、例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のためのメンブレン、溶液、またはチップを用いた技術を含むイムノアッセイ技術を含む。
ポリヌクレオチドにコードされる産物の発現を検出および測定するための、産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用した様々なプロトコールが当技術分野において知られている。非限定的な例は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。所与のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体（複数）を利用した、２部位モノクローナルベースイムノアッセイがいくつかの用途に好ましいが、競合結合アッセイもまた利用することができる。これらのまたは別のアッセイが、他の場所では、Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｒ．ら（１９９０年；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ， Ｄ．Ｅ．ら（１９８３年；Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１５８巻：１２１１〜１２１６頁）に記載されている。
様々な標識および結合体化技術が当業者に公知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用される。ポリヌクレオチドに関連した配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを製造するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識したヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅を含む。別法として、配列、またはその任意の部分をｍＲＮＡプローブ製造のためのベクター中にクローニングする。このようなベクターは当技術分野において公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドの添加によってＲＮＡプローブをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成するために使用される。これらの手順は、様々な市販のキットを使用して行われる。使用される適したレポーター分子または標識は、これらに限定されるわけではないが、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤に加えて基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などを含む。
組換え細胞により産生されるポリペプチドは、配列および／または使用されるベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に含まれる。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜からのコードされるポリペプチドの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計される。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをさらに含む融合ポリペプチドとして産生される。このような精製を容易にするドメインは、これらに限定されるわけではないが、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ａｍｇｅｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）において利用されるドメインを含む。第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に特異的な配列などの切断可能なリンカー配列を精製ドメインとコードされるポリペプチドの間に含めることが、精製を容易にするために使用される。例示的な発現ベクターは、対象とするポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前の６個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．ら（１９９２年、Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ．３巻：２６３〜２８１頁）に記載の通りＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を製造するために使用されるベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ， Ｄ．Ｊ．ら（１９９３年；ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２巻：４４１〜４５３頁）に提供されている。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは異種ポリペプチドと融合しており、これはシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってもよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）配列である。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルから選択される。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列に加えてウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
組換え技術を使用する場合、ポリペプチドまたは抗体は細胞内に、ペリプラズム空間に産生されるか、または直接培地中に分泌される。ポリペプチドまたは抗体が第１工程として細胞内に産生される場合、宿主細胞または溶解断片の微粒子破片は例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記述している。手短に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）存在下において約３０分かけて融解する。細胞破片を遠心分離によって除去する。ポリペプチドまたは抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系の上清は一般に、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。場合により、タンパク質分解を阻害するために前の工程のいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれ、外来汚染物質の成長を避けるために抗生物質が含まれる。
細胞から調製したポリペプチドまたは抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製され、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、ポリペプチドまたは抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体またはその断片を精製するために使用される（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５巻：１５６７１５７５（１９８６年））に推奨される。親和性リガンドが結合する基質（ｍａｔｒｉｘ）は、最も一般的にはアガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定な基質は、アガロースで達成できるものよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。ポリペプチドまたは抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収されるポリペプチドまたは抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程（複数可）に続いて、対象とするポリペプチドまたは抗体および夾雑物質を含む混合物を、約ｐＨ２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用して、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．０２５Ｍ塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。
医薬組成物
本発明は、所望の純度の本発明のポリペプチド、抗体、またはモジュレーター、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｉｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年））を含む医薬処方物をさらに含む。特定の実施形態において、医薬処方物は、例えば、凍結乾燥処方物または水性溶液の形態における保管中のポリペプチドまたは抗体の安定性を向上させるために調製される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度で受容者に対して非毒性であり、例えば、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリデンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロースおよび塩化ナトリウムなどの等張化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。特定の実施形態において、治療処方物は、５〜２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度のポリペプチドまたは抗体を含むことが好ましい。
本明細書の処方物はまた、特定の適応、例えば、処置されるべき感染症の処置に、または望ましくない副作用を防止するために適した１つまたは複数のさらなる治療薬を含む。好ましくは、さらなる治療薬は、本発明のポリペプチドまたは抗体の補足的な活性を有し、両者は互いに悪影響を及ぼさない。例えば、本発明のポリペプチドまたは抗体に加えて、さらなるまたは第２の抗体、抗ウイルス薬、抗感染症薬および／または心臓保護剤が処方物に添加される。このような分子は、意図される目的のために有効な量で医薬処方物中に適当に存在する。
活性成分、例えば、本発明のポリペプチドおよび抗体および他の治療薬はまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメチルメタサイレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中にも封入される。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｉｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年）に記載されている。
徐放製剤が調製される。徐放製剤の適した例は、これらに限定されるわけではないが、マトリックスが成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどである、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含む。徐放マトリックスの非限定的な例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与用に使用される処方物は、好ましくは無菌である。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
診断用途
本発明の抗体およびその断片、ならびに治療用組成物は、正常な対照細胞および組織と比較して、感染した細胞または組織に特異的に結合または優先的に結合する。したがって、これらのＡ型インフルエンザ抗体は、本明細書中に記載のものを含む様々な診断および予後予測方法のいずれかを使用して、患者、生物学的試料、または細胞集団中の感染細胞または組織を検出するために使用される。抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ特異的抗体の感染細胞を検出する能力は、その結合特異性に依存し、異なる患者から、および／またはＡ型インフルエンザの異なる株に感染した患者から得られた感染細胞または組織に結合する能力を試験することによって容易に決定することができる。
診断方法は一般に、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料、または組織生検などの患者から得られた生物学的試料をＡ型インフルエンザ、例えば、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体に接触させる工程と、対照試料または所定のカットオフ値と比較して抗体が試料に優先的に結合するかどうかを決定し、それにより感染細胞の存在を示す工程とを含む。特定の実施形態において、適切な対照正常細胞または組織試料と比較して少なくとも２倍、３倍、または５倍以上のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体が感染細胞に結合する。所定のカットオフ値は、例えば、試験される生物学的試料の診断アッセイを行うために使用される同じ条件下でいくつかの異なる適切な対照試料に結合するヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の量を平均化することによって決定される。代替としてまたは追加的に、赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質は、上記方法においてインフルエンザウイルスで置換される。ＨＡタンパク質は、ウイルス、宿主細胞（例えば、任意の哺乳動物細胞）の表面上、または組換えおよび可溶性形態で提示される。この診断法のＨＡバージョンにおいて、対照タンパク質は、変性ＨＡタンパク質、直鎖状ＨＡペプチド、同様のサイズおよび形状であるが異なった配列の無関係のタンパク質、または所定のカットオフ値のものである。
結合抗体は、本明細書中に記載の、および当技術分野において公知の手順を使用して検出される。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、結合抗体の検出を容易にするために、検出可能な標識、例えば、フルオロフォアに結合体化されたヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を使用して実践される。しかしながら、これらはまたヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の二次検出方法を使用しても実践される。これらは例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈殿、凝集、補体結合および免疫蛍光を含む。
特定の手順において、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体は標識される。標識は直接検出される。直接検出される例示的な標識は、これらに限定されるわけではないが、放射性標識および蛍光色素を含む。別法として、または加えて、標識は酵素などの部分であり、これは検出されるために反応または誘導体化されなければならない。同位体標識の非限定的な例は、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐおよび３５Ｓである。使用される蛍光材料は、これらに限定されるわけではないが、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む。
酵素標識は、現在利用されている比色技術、分光測光技術、蛍光分光測光技術、またはガス定量技術のうちのいずれかによって検出される。これらの手順において使用される多くの酵素が知られており、本発明の方法により利用される。非限定的な例は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、および酸性ホスファターゼである。
抗体は、既知の方法によってこのような標識にタグ付けされる。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビス（ｂｉｄ）−ジアゾ化ベンザジンなどのカップリング剤が、上述の蛍光標識、化学発光標識、および酵素標識に抗体をタグ付けするために使用される。酵素は、典型的には、カルボジイミド、過ヨウ素酸塩、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子を使用して抗体に結合される。様々な標識化技術が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ｂ巻、１０３頁（１９７４年）、Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８４巻、３７６２頁（１９７３年）ならびにＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３３巻、５２９頁（１９７３年）に記載されている。
本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体は、本明細書中に記載の代表的なアッセイを使用して、Ａ型インフルエンザ感染を有する患者と有さない患者を識別すること、および患者が感染しているかどうかを決定することができる。１つの方法によると、Ａ型インフルエンザ感染にかかっている疑いのある、またはかかっていることが分かっている患者から生物学的試料を得る。好ましい実施形態において、生物学的試料は患者の細胞を含む。試料を、例えば、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を試料中に存在する感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件で、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体に接触させる。例えば、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、３０分、１時間、６時間、１２時間、２４時間、３日、またはこれらの中間の任意の時点の間、試料をヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体に接触させる。結合したヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体の量を測定し、例えば、所定の値または正常組織試料から測定した値であってもよい対照値と比較する。対照試料と比較して患者試料に結合した抗体の増加した量は、患者試料中の感染細胞の存在を示すものである。
関連方法において、患者から得た生物学的試料を、抗体を感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件で、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体に接触させる。結合抗体を次いで検出し、結合抗体の存在は試料が感染細胞を含むことを示す。本実施形態は特に、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体が正常細胞に検出可能なレベルで結合しない場合に有用である。
異なるヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体は、異なる結合特性および特異性特性を有する。これらの特性に応じて、特定のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体が、１つまたは複数のＡ型インフルエンザ株の存在を検出するために使用される。例えば、特定の抗体は、ただ１つのまたはいくつかのインフルエンザウイルス株に特異的に結合するが、他の抗体は異なるインフルエンザウイルスのすべてまたは大部分の株に結合する。ただ１つのＡ型インフルエンザ株に特異的な抗体は、感染株を同定するために使用される。
特定の実施形態において、感染細胞に結合する抗体は、好ましくは、検出される感染を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において感染の存在を示すシグナルを発生する。別法としてまたは加えて、抗体は、検出される感染を有さない個体の少なくとも約９０％において、感染の非存在を示す陰性シグナルを発生する。抗体はそれぞれ上記の基準を満たすが、本発明の抗体は感度を高めるために組み合わせて使用される。
本発明はまた、本発明の抗体を使用して診断アッセイおよび予後予測アッセイを行うのに有用なキットも含む。本発明のキットは、標識されたまたは標識されていない形態の本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を含む適した容器を含む。加えて、抗体が間接的な結合アッセイに適した標識化形態で供給される場合、キットは、適切な間接アッセイを行うための試薬をさらに含む。例えば、キットは、標識の性質に応じて酵素基質または誘導化剤を含む１つまたは複数の適した容器を含む。対照試料および／または使用説明書もまた含まれる。
治療的／予防的使用
受動免疫は、ウイルス疾患の予防および処置のための有効で安全な方法であることが分かっている（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれるＫｅｌｌｅｒら、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．１３巻：６０２〜１４頁（２０００年）；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１１４頁（２００２年）；Ｓｈｉｂａｔａら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．５巻：２０４〜１０頁（１９９９年）；およびＩｇａｒａｓｈｉら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．５巻：２１１〜１６頁（１９９９年）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を使用した受動免疫は、インフルエンザの緊急の予防および処置のための迅速な処置方法を提供する。
本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体およびその断片、ならびに治療用組成物は、正常な対照の非感染細胞および組織と比較して、感染した細胞に特異的に結合または優先的に結合する。したがって、これらのヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体は、患者、生物学的試料、または細胞集団中の感染細胞または組織を選択的に標的化するために使用される。これらの抗体の感染特異的結合特性を踏まえて、本発明は、感染細胞の成長を制御する（例えば、阻害する）方法、感染細胞を死滅させる方法、および感染細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。これらの方法は、感染細胞を本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体に接触させる工程を含む。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで、およびｉｎ ｖｉｖｏで実践される。
様々な実施形態において、本発明の抗体はもともと治療的に活性である。別法として、または加えて、本発明の抗体は、細胞傷害剤または成長阻害剤、例えば、放射性同位体または毒素に結合体化され、この抗体に結合または接触した感染細胞を処置するのに使用される。
一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザ感染であると診断された、発症するリスクがある、または有する疑いのある患者に本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を提供する工程を含む、患者において感染を処置または予防する方法を提供する。本発明の方法は、感染症の第１線処置、継続処置において、または再発性もしくは難治性感染の処置において使用される。本発明の抗体による処置は、単独処置である。別法として、本発明の抗体を用いる処置は、１つまたは複数のさらなる治療薬もまた患者を処置するために使用される併用療法レジメンの１つの構成要素または相である。
インフルエンザウイルス関連疾患または障害のリスクのある被験体は、感染した人と接触した患者、または別の何らかの方法でインフルエンザウイルスに曝露された患者を含む。予防薬の投与は、疾患または障害を予防する、またはそうでなければその進行を遅れさせるように、インフルエンザウイルス関連疾患または障害に特徴的な症状の徴候の前に行うことができる。
様々な態様において、ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡは被験体の感染と実質的に同時に、またはその後に投与される（すなわち治療的処置）。別の態様において、抗体は治療上の利益を提供する。様々な態様において、治療上の利益は、１つまたは複数のインフルエンザ感染の症状または合併症の進行、重症度、頻度、期間または確率、１つまたは複数のインフルエンザ株のウイルス力価、ウイルス複製あるいはウイルスタンパク質の量の低下または抑制を含む。さらに別の態様では、治療上の利益は、インフルエンザ感染からの被験体の回復の迅速化または促進を含む。
被験体におけるインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するための方法が、さらに提供される。一実施形態において、方法は、被験体における、１つまたは複数のインフルエンザ株または分離株のインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するための有効量のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を被験体に投与する工程を含む。
１つまたは複数のインフルエンザ株／分離株またはサブタイプによる感染から被験体を保護する、または被験体の感染に対する感受性を減少させるための方法、すなわち、予防方法がさらに提供される。一実施形態において、方法は、１つまたは複数のインフルエンザ株／分離株またはサブタイプによる感染から被験体を保護するために有効な、または、被験体の感染に対する感受性を減少させるために有効な量のインフルエンザＭ２またはＨＡそれぞれに特異的に結合するヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を被験体に投与する工程を含む。
場合により、被験体は、これらに限定されるわけではないが、インフルエンザウイルス抗体、抗ウイルス薬（ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤またはＭ２イオンチャンネル阻害剤など）、ウイルス侵入阻害剤またはウイルス付着阻害剤などの第２の作用物質をさらに投与される。Ｍ２イオンチャンネル阻害剤は、例えば、アマンタジン、またはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。
低下または減少させることができるインフルエンザ感染の症状または合併症は、例えば、悪寒、熱、咳、咽喉炎、鼻鬱血、副鼻腔鬱血、鼻感染症、副鼻腔感染症、体の痛み、頭痛、倦怠感、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳痛または死亡を含む。
ヒトおよび非ヒト患者のｉｎ ｖｉｖｏ処置に関して、患者は通常、本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体を含む医薬処方物を投与または提供される。ｉｎ ｖｉｖｏ治療において使用する場合、本発明の抗体は、治療的に有効な量（すなわち、患者のウイルス負荷量を除去するまたは減少させる量）で患者に投与される。抗体は、既知の方法に従って、例えば、ボーラスのような静脈内投与など、またはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路によって、ヒト患者に投与される。抗体は、可能な場合は、標的細胞部位にまたは静脈内に非経口投与されてもよい。抗体の静脈内または皮下投与が、特定の実施形態において好ましい。本発明の治療用組成物は、患者または被験体に、全身に、非経口的に、または局所的に投与される。
非経口投与では、抗体は、薬学的に許容される非経口ビヒクルを伴って単位用量の注射用形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に処方される。このようなビヒクルの例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルもまた使用される。リポソームは担体として使用される。ビヒクルは、等張性および化学安定性を高める物質などの少量の添加剤、例えば、緩衝剤および防腐剤を含む。抗体は、典型的には上記のようなビヒクル中に約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
用量および投薬レジメンは、感染の性質および抗体に結合体化された特定の細胞傷害剤または成長阻害剤（使用される場合）の特性などの、医師によって容易に決定される様々な因子、例えば、その治療指数、患者および患者の既往歴に依存する。一般に、治療上有効な量の抗体が患者に投与される。特定の実施形態では、投与される抗体の量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲である。感染の種類および重症度に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば、１回もしくは複数回の別々の投与によるか、または持続注入による患者への投与の最初の候補投与量である。この療法の経過は、従来の方法およびアッセイによって、医師または他の当業者に公知に基準に基づいて、容易に監視される。
１つの特定の実施形態において、細胞傷害剤に結合体化した抗体を含む免疫結合体が患者に投与される。好ましくは、免疫結合体は細胞によって内部移行されて、免疫結合体の結合する細胞を死滅させる治療的有効性の増加をもたらす。一実施形態において、細胞傷害剤は感染細胞中の核酸を標的化または妨害する。このような細胞傷害剤の例は上述されており、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
他の治療レジメンは、本発明のＨｕＭ２ｅ抗体の投与と併用される。併用投与は、別個の処方物または単一の医薬処方物を使用する同時投与、および好ましくは両方（またはすべて）の活性剤が生物学的活性を同時に発揮する間に一定期間が存在する、いずれかの順での逐次投与を含む。好ましくは、このような併用療法は相乗的な治療効果をもたらす。
特定の実施形態において、本発明の抗体の投与を、感染病原菌に関連する別の抗原に対する別の抗体と併用投与することが望ましい。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本発明は、遺伝子治療による抗体の投与方法を提供する。このような抗体をコードする核酸の投与は、「治療的有効量の抗体を投与すること」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を生じさせるための遺伝子治療の使用に関するＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
別の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅまたは抗ＨＡ抗体が、結合抗体の構造、例えば、コンフォメーションエピトープを決定するために使用され、この構造を次に用いて、例えば、化学的モデリングおよびＳＡＲ法によってこの構造を有するまたは模倣するワクチンを開発するために後に使用される。このようなワクチンはその後、Ａ型インフルエンザ感染を予防する。
本明細書において参照したおよび／または出願データシートに列挙した、すべての上記米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願公開および非特許刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１：組換えＭ２ｅタンパク質を発現する細胞を用いたヒト血漿に存在するＭ２ｅ特異的抗体のスクリーニングおよび特徴付け
Ｍ２に特異的であり、インフルエンザＡ感染細胞およびインフルエンザウイルス自体に結合することができる完全ヒトモノクローナル抗体が、以下に記載されるように、患者の血清において同定された。
細胞株におけるＭ２の発現
インフルエンザサブタイプであるＨ３Ｎ２に見出される誘導されたＭ２配列に対応する、Ｍ２完全長ｃＤＮＡを含む発現構築体を２９３細胞にトランスフェクトした。
Ｍ２ ｃＤＮＡは、下記のポリヌクレオチド配列および配列番号５３によってコードされる。
Ｍ２の細胞表面の発現が、抗Ｍ２ｅペプチドに特異的なＭＡｂ １４Ｃ２を用いて確認された。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７（ＨＫ４８３）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３）由来の２つの他のＭ２バリアントを次の分析のために用いた。それらの発現は、本発明のＭ２ｅ特異的モノクローナル抗体を用いて測定した。それは、１４Ｃ２結合が、Ｍ２ｅにおける様々なアミノ酸置換によって抑制される場合があるためである。
末梢血における抗体のスクリーニング
Ｍ２に結合する抗体について、１２０を超える個体の血漿試料を試験した。それらのうちいずれも、Ｍ２ｅペプチドに対して特異的な結合を示さなかった。しかしながら、１０％の血漿試料は、２９３−Ｍ２ Ｈ３Ｎ２細胞株に特異的に結合する抗体を含んでいた。これは、抗体が、Ｍ２ホモ四量体のコンフォメーション決定基への結合、Ｍ２ホモ四量体の多重バリアントのコンフォメーション決定基への結合として特徴付けることができ；それらは、直鎖状Ｍ２ｅペプチドに対して特異的ではあり得なかったことを示す。
抗Ｍ２ ＭＡｂの特徴付け
このプロセスを介して同定されたヒトＭＡｂは、Ｍ２ホモ四量体上のコンフォメーションエピトープに結合することが分かった。それらは、元の２９３−Ｍ２トランスフェクタント、ならびに２つの他の細胞発現Ｍ２バリアントに結合した。１４Ｃ２ ＭＡｂは、Ｍ２ｅペプチドに結合することに加えて、Ｍ２バリアントの配列に対してより感受性があることが分かった。さらに、１４Ｃ２は、インフルエンザビリオンに容易に結合しないが、コンフォメーションに特異的な抗Ｍ２ ＭＡｂは結合した。
これらの結果は、本発明の方法が、Ｍ２の特異的な免疫付与を必要とせずに、インフルエンザに対する正常なヒト免疫応答からＭ２ ＭＡｂの同定を可能にすることを示す。免疫療法のために用いられる場合、これらの完全ヒトＭＡｂは、ヒト化マウス抗体よりも患者によって良好に容認されるという潜在能力を有する。さらに、１４Ｃ２およびＧｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＭＡｂが直鎖状Ｍ２ｅペプチドに結合するのとは対照的に、本発明のＭＡｂはＭ２のコンフォメーションエピトープに結合し、Ａ型インフルエンザ感染細胞に対してだけでなく、ウイルス自体に対しても特異的である。本発明のＭＡｂの別の利点は、いずれも、すでに試験されたＭ２バリアントのすべてに結合することであり、したがって、それらが、特定の直鎖状アミノ酸配列に限定されないことが示される。
実施例２：Ｍ２特異的抗体の同定
単核細胞または実施例１に記載されたヒト血清において同定されたＭＡｂのうちの３種を発現するＢ細胞は、クローン集団に希釈され、抗体を産生するように誘導された。抗体を含む上清は、インフルエンザ株であるインフルエンザサブタイプのＨ３Ｎ２由来の完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングされた。陽性染色／結合を示した上清は、インフルエンザ株であるインフルエンザサブタイプのＨ３Ｎ２由来の完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞上、ならびに対照としてのベクターを単独でトランスフェクトした細胞上で再度、再スクリーニングされた。
次に、抗体の可変領域は、上清が陽性結合を示したＢ細胞のウェルからレスキュークローニングされた。一過性トランスフェクションを２９３ＦＴ細胞に行って、これらの抗体を再構成および産生した。再構成された抗体の上清は、レスキューされた抗Ｍ２Ｅ抗体を同定するために、上記で詳述された完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングされた。３つの異なる抗体：８ｉ１０、２１Ｂ１５、および２３Ｋ１２が同定された。第４の追加の抗体クローンである４Ｃ２は、レスキュースクリーニングによって単離された。しかしながら、それは唯一ではなく、それがクローン８ｉ１０とは異なるドナー由来であるとしても、クローン８ｉ１０とまったく同じ配列を有していた。
これらの抗体のカッパおよびガンマ可変領域の配列を下記に示す。
クローン８ｉ１０（ＴＣＮ−０３２に対応）：
抗Ｍ２クローン８ｉ１０のカッパＬＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片としてクローニングされたが（下記参照）、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号５４（上段）および配列番号５５（下段）によってコードされる。
８ｉ１０カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号５４、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号５６の残基１〜１３１に対応する）である。
８ｉ１０カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
下記は、カッパＬＣ定常領域をすでに含む発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１にクローニングされた８ｉ１０のカッパＬＣ可変領域の例である（上段のポリヌクレオチド配列は配列番号６５に対応し、下段のポリヌクレオチド配列は配列番号６６に対応し、アミノ酸配列は配列番号５６に対応する）。黒色の塩基は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター配列を表し、下線を引いた塩基は、クローニングされた抗体配列を表す。また、本明細書に記載される抗体は、発現ベクターであるｐＣＥＰ４にクローニングされた。
８ｉ１０ガンマＨＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号６７（上段）および配列番号６８（下段）によってコードされる。
８ｉ１０ガンマＨＣの翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号６７、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号６９の残基１〜１３８に対応する）である。
８ｉ１０ガンマＨＣのアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
下記は、ガンマＨＣ定常領域をすでに含む発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした８ｉ１０のガンマＨＣ可変領域の例である（上段のポリヌクレオチド配列は配列番号７８に対応し、下段のポリヌクレオチド配列は配列番号７９に対応し、アミノ酸配列は配列番号６９に対応する）。黒色の塩基はｐｃＤＮＡ３．１ベクター配列を表し、下線を引いた塩基はクローニングされた抗体配列を表す。
ガンマＨＣのフレームワーク４（ＦＲ４）領域は、通常、２つのセリン（ＳＳ）で終了し、その結果、完全なフレームワーク４領域は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８０）であるべきである。ガンマＨＣ定常領域およびガンマＨＣ可変領域がクローニングされているベクターに受容しているＸｈｏ１部位およびそのＸｈｏ１部位の下流にある１つの付加的な塩基は、フレームワーク４のこの最終のアミノ酸をコードする最後の塩基を提供する。しかしながら、元のベクターは、Ｘｈｏ１部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号８１）が作られ、機能するすべてのガンマＨＣクローンに存在するフレームワーク４の末端でのアミノ酸変化：セリンからアルギニン（ＳからＲ）への置換を引き起こすＸｈｏ１部位の下流の「Ａ」ヌクレオチドを含む場合になされるサイレントな変異に適応しなかった。このようにして、完全なフレームワーク４領域はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＲ（配列番号８２）と読まれる。今後の構築体が作製されつつあり、そこでは、Ｘｈｏ１部位の下流の塩基は「Ｃ」ヌクレオチドである。したがって、代替の実施形態におけるガンマＨＣ可変領域配列のクローニングに使用されるＸｈｏ１部位の作製は、サイレントな変異であり、フレームワーク４のアミノ酸配列をその適切なＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８０）に修復する。これは、本明細書に記載されるすべてのＭ２ガンマＨＣクローンについていえる。
クローン２１Ｂ１５：
抗Ｍ２クローン２１Ｂ１５のカッパＬＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号８３および配列番号８４によってコードされる。
２１Ｂ１５カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号８３、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号２９８に対応する）である。
２１Ｂ１５カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
カッパＬＣ可変領域をクローニングするために用いられるプライマーは多様性の領域全体で伸長し、その設計ではウォッブル塩基位置を有していた。このようにして、フレームワーク４領域では、ＤまたはＥアミノ酸が生じ得た。ある場合には、レスキューされた抗体におけるこの位置のアミノ酸は、Ｂ細胞において産生された元の親アミノ酸でなくてもよい。大部分のカッパＬＣでは、この位置はＥである。上記のクローン（２１Ｂ１５）からすると、フレームワーク４（ＤＩＫＲＴ）（配列番号５４４）におけるＤが観察された。しかしながら、周囲のアミノ酸からすると、これは、プライマーの結果として起こった可能性があり、人為的な結果であり得る。Ｂ細胞由来の天然の抗体は、この位置にＥを有していた可能性がある。
２１Ｂ１５ガンマＨＣ可変領域はＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号８５（上段）および配列番号８６（下段）によってコードされる。
２１Ｂ１５ガンマＨＣの翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号８７、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号６９の残基１〜１３８に対応する）である。
２１Ｂ１５ガンマＨＣのアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
クローン２３Ｋ１２（ＴＣＮ−０３１に対応）：
抗Ｍ２クローン２３Ｋ１２のカッパＬＣ可変領域はＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片（下記参照）としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列の配列番号８８（上段）および配列番号８９（下段）によってコードされる。
２３Ｋ１２カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号９０、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号９１に対応する）である。
２３Ｋ１２カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号９７（上段）および配列番号９８（下段）によってコードされる。
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号９９、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号１００に対応する）である。
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
実施例３：保存された抗体可変領域の同定
３種の抗体カッパＬＣおよびガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列をアラインメントさせ、下記に示されるように、保存された領域および残基を同定した。
３種のクローンのカッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列のアラインメント（出現順に、それぞれ配列番号６７３〜６７５）：
３種のクローンのガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列のアラインメント（出現順に、それぞれ配列番号６７６〜６７８）：
クローン８Ｉ１０および２１Ｂ１５は２人の異なるドナーに由来したが、まったく同じ正確なガンマＨＣを有し、カッパＬＣにおいては、フレームワーク１領域の４位にあるたった１個のアミノ酸（アミノ酸Ｍ対Ｖ、上記参照）が異なる（カッパＬＣのフレームワーク４におけるＤ対Ｅウォッブル位置を除く）。
抗体の可変領域の配列比較は、クローン８ｉ１０の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ４由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
抗体の可変領域の配列比較は、クローン２１Ｂ１５の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ４由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
抗体の可変領域の配列比較は、クローン２３Ｋ１２の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ３由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
実施例４：Ｍ２抗体の産生および特徴付け
上述された抗体は、２９３ＰＥＡＫ細胞におけるラージスケールの一過性トランスフェクションによって、ミリグラム量で産生された。粗製な未精製の抗体上清を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上でインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３２（ＰＲ８）ウイルスに結合する抗体を調べ、同様にラージスケールの一過性トランスフェクションによって産生された対照抗体１４Ｃ２の結合と比較した。抗Ｍ２組換えヒトモノクローナル抗体はインフルエンザに結合し、対照抗体は結合しなかった（図９）。
また、ＰＲ８ウイルス感染ＭＤＣＫ細胞上での結合を試験した（図１０）。対照抗体１４Ｃ２、ならびに３種の抗Ｍ２Ｅクローン：８Ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２はすべて、ＰＲ８感染細胞の表面上に発現したＭ２タンパク質への特異的な結合を示した。未感染細胞上では結合は観察されなかった。
プロテインＡカラム上で上清から抗体を精製した。ＦＡＣｓ分析は、濃度が１μｇ／ｍｌである精製した抗体を用いて行い、細胞表面上にＭ２タンパク質を発現している一過性にトランスフェクトした２９３ＰＥＡＫ細胞への抗体の結合を調べた。モック（ｍｏｃｋ）トランスフェクトした細胞、およびインフルエンザサブタイプであるＨ３Ｎ２、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３）、またはＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７ ＨＫ４８３Ｍ２タンパク質を一過性にトランスフェクトした細胞への結合を調べることによって、結合を測定した。陽性対照として、抗体１４Ｃ２を用いた。未染色および二次抗体だけの対照は、バックグラウンドの決定に役立った。Ｍ２タンパク質をトランスフェクトした細胞の特異的な染色は、３種すべての細胞について観察された。さらに、３種すべてのクローンは、高病原性株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７のＭ２タンパク質に非常によく結合し、一方、Ｈ３Ｎ２ Ｍ２タンパク質に十分に結合した陽性対照１４Ｃ２は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のＭ２タンパク質に非常により弱く結合し、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７のＭ２タンパク質には結合しなかった。図１１を参照されたい。
抗体２１Ｂ１５、２３Ｋ１２、および８Ｉ１０は、Ｍ２タンパク質を安定に発現する２９３−ＨＥＫ細胞の表面に結合したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（図１を参照されたい）。さらに、これらの抗体の結合は、５ｍｇ／ｍｌの２４マーのＭ２ペプチドの存在によって競合せず、一方、直鎖状Ｍ２ペプチドに対して生じた、対照のキメラマウスＶ−領域／ヒトＩｇＧ１カッパ１４Ｃ２抗体（ｈｕ１４Ｃ２）の結合は、Ｍ２ペプチドによって完全に阻害された（図１を参照）。これらのデータは、これらの抗体が、直鎖状Ｍ２ｅペプチドとは対照的に、細胞またはウイルス表面に発現したＭ２ｅに存在するコンフォメーションエピトープに結合することを裏付ける。
実施例５：ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体のウイルス結合
ＵＶ不活性化したインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＰＢＳ中１．２μｇ／ｍｌ、２５μｌ／ウェルで３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に播種され、４℃で一晩インキュベートされた。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルでＰＢＳ中の１％脱脂粉乳でブロッキングし、その後、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる２回目の洗浄後、指示された濃度のＭＡｂを３連で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いてさらに洗浄後、各ウェルに対して、ＰＢＳ／１％ミルク中に１／５０００に希釈したセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）の２５μｌを添加し、プレートを室温で１時間放置した。最終のＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ基質である１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウェルで添加し、暗所中、室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウェルの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。１０μｇ／ｍｌでのＭＡｂ８Ｉ１０結合の吸光度にデータを正規化する。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
実施例６：完全長Ｍ２バリアントへのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
Ｍ２バリアント（ｉｎ ｖｉｖｏでの高い病原性表現型を有するものを含む）を分析のために選択した。配列については図３Ａを参照されたい。
Ｍ２ ｃＤＮＡ構築体をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、下記の通り分析した：ＦＡＣＳによる一過性トランスフェクタントを分析するために、１０ｃｍ組織培養プレート上の細胞を０．５ｍｌの細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、回収した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを補充した０．６ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。各々のトランスフェクタントは、０．２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中、１μｇ／ｍｌの指示されたＭＡｂと混合され、細胞５×１０５〜１０６個／試料であった。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、各試料は、１μｇ／ｍｌのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７−抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む０．１ｍｌ中に再懸濁させた。再び細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏデバイス（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーを行った。データは、Ｍ２−Ｄ２０一過性トランスフェクタントの平均蛍光の割合として表される。バリアント結合に関するデータは、２つの実験を代表している。アラニン変異体に関するデータは、標準誤差を含む３つの別々の実験からの平均の読み出しである。結果を図３Ｂおよび３Ｃに示す。
実施例７：Ｍ２結合を評価するためのアラニンスキャニング変異誘発
抗体結合部位を評価するために、アラニンは、部位特異的変異誘発によって指示された個々のアミノ酸位置で置換された。
Ｍ２ ｃＤＮＡ構築体をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、実施例６において上述されるように分析した。結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。図８は、エピトープがＭ２ポリペプチドのアミノ末端の高度に保存された領域にあることを示す。図４Ａ、４Ｂおよび図８に示されるように、エピトープは、Ｍ２ポリペプチドの２位のセリン、５位のスレオニン、および６位のグルタミン酸を含む。
実施例８：エピトープブロッキング
ＭＡｂ ８Ｉ１０および２３Ｋ１２が同じ部位に結合するかどうかを決定するために、インフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を表すＭ２タンパク質をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株のＤＧ４４に安定に発現させた。細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を処理し、回収した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを補充したＦＡＣＳ緩衝液中、１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞は、１０μｇ／ｍｌのＭＡｂ（または２Ｎ９対照）で１時間４℃で予め結合され、次にＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、直接的に結合体化されたＡＦ６４７−８Ｉ１０または−２３Ｋ１２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識されたを用いて、予めブロッキングされた３つの細胞試料を細胞１０６個／試料について１μｇ／ｍｌで染色した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて前述の通りに進行させた。データは、標準誤差を含む３つの別々の実験からの平均の読み出しである。結果を図５に示す。
実施例９：Ｍ２バリアントおよび短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｍ２ペプチドに対するヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
他のＭ２ペプチドバリアントに対するｍＡｂ ８ｉ１０および２３Ｋ１２の交差反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。ペプチド配列を図６Ａおよび６Ｂに示す。さらに、同様のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｍ２短縮型ペプチドに対する結合活性を測定した。
要約すると、平底３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、一晩４℃で、２５μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液中、２μｇ／ｍＬの各ペプチドでコーティングした。プレートを３回洗浄し、１時間室温で１％ミルク／ＰＢＳでブロッキングした。３回の洗浄後、ＭＡｂの滴定量（ｔｉｔｅｒ）を添加し、１時間室温でインキュベートした。希釈したＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＦＣ特異的（Ｐｉｅｒｃｅ）を、３回の洗浄後に各ウェルに添加した。１時間室温でプレートをインキュベートし、３回洗浄した。１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウェルで添加し、暗闇中、室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウェルの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
実施例１０：致命的なウイルスチャレンジから保護するためのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の能力のｉｎ ｖｉｖｏ評価
高病原性のトリインフルエンザ株を用いた致命的なウイルスチャレンジからマウスを保護するための抗体２３Ｋ１２および８Ｉ１０の能力を試験した。
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、各群１０匹からなる５群に無作為に選んだ。感染の１日前（第−１（マイナス１）日）、感染の２日後（第＋２（プラス２）日に、２００μｇの抗体を２００μｌの腹腔内注射を介して投与した。第０（ゼロ）日に、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４インフルエンザウイルスの約ＬＤ９０（致死量９０）を３０μｌの容積で鼻腔内に投与した。生存率は、感染後の第１日から第２８日を通じて観察した。結果を図７に示す。
実施例１１：Ｍ２抗体ＴＣＮ−０３２ （８Ｉ１０）、２１Ｂ１５、ＴＣＮ−０３１ （２３Ｋ１２）、３２４１＿Ｇ２３、３２４４＿Ｉ１０、３２４３＿Ｊ０７、３２５９＿Ｊ２１、３２４５＿Ｏ１９、３２４４＿Ｈ０４、３１３６＿Ｇ０５、３２５２＿Ｃ１３、３２５５＿Ｊ０６、３４２０＿Ｉ２３、３１３９＿Ｐ２３、３２４８＿Ｐ１８、３２５３＿Ｐ１０、３２６０＿Ｄ１９、３３６２＿Ｂ１１、および３２４２＿Ｐ０５の特徴づけ
ＦＡＣＳ
完全長Ｍ２ ｃＤＮＡ（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７）を合成し（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。次いで、これをリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、ＣＨＯ−ＨＫ Ｍ２−発現細胞の安定したプールを作った。抗Ｍ２ Ｍａｂのパネルのために、ＩｇＧ重鎖および軽鎖の組合せのそれぞれからの一過性トランスフェクションからの上清の２０μｌ試料を用いて、ＣＨＯ−ＨＫ Ｍ２の安定細胞系を染色した。結合した抗Ｍ２ ｍａｂを、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で生存細胞上で可視化した。フローサイトメトリーをＦＡＣＳＣａｎｔｏおよび付随のＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）の分析を用いて行った。
ＥＬＩＳＡ
β−プロピオラクトン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって不活性化された精製インフルエンザＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）をビオチン化し（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）でプレコーティングされた、２５μｌＰＢＳ中の３８４ウェルプレートに４℃で１６時間吸着させた。プレートをＰＢＳ中のＢＳＡでブロックし、ＩｇＧ重鎖および軽鎖の組合せのそれぞれからの一過性トランスフェクションからの上清の試料を、１：５の最終希釈で添加し、それに続いてＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて発色させた。
この分析の結果を以下の表２に示す。
陽性対照：ｍＡｂ ８Ｉ１０のＩｇＧ重鎖および軽鎖の組合せによる一過性トランスフェクションからの上清
陰性対照：ｍＡｂ ２Ｎ９のＩｇＧ重鎖および軽鎖の組合せによる一過性トランスフェクションからの上清
ＭＦＩ＝平均蛍光強度。
実施例１２：ヒト抗体は、ヒトおよび非ヒトインフルエンザＡウイルスの間で高度に保存された保護的なエピトープを明らかにする
インフルエンザは、世界中で重大な公衆衛生の脅威であり続けている。感染からの保護をもたらし得るワクチンおよび抗ウイルス剤が入手可能である。しかし、ワクチン抗原の毎年の再製剤化を必要とさせるインフルエンザゲノムの適応性、および循環ウイルス集団において急速に現れて確立され得る抗ウイルス剤に対する耐性のために、新しいウイルス株が持続的に出現する。加えて、有効なワクチンを設計し、製造するのに必要とされる時間のために、新しい世界的流行株の拡散を封じ込めることが困難である。高度に保存されたウイルスエピトープを標的にするモノクローナル抗体は、代替の保護パラダイムを提案することができる。ここでは、本発明者らは、インフルエンザマトリックス２タンパク質、すなわち、Ｍ２ｅの外部ドメイン中の以前は未知であったコンフォメーションエピトープを認識する、健康なヒト被験体のＩｇＧ＋メモリーＢ細胞に由来するモノクローナル抗体のパネルの単離を記述する。この抗体結合領域は、インフルエンザＡウイルスにおいて高度に保存されており、主にトリおよびブタに感染する病原性の高いウイルス、ならびに現在の２００９ブタ起源Ｈ１Ｎ１世界的流行株（Ｓ−ＯＩＶ）を含めて、これまでに検出されたほとんどすべての株に存在する。さらに、これらのヒト抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体は、Ｈ５Ｎ１またはＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを用いた致命的なチャレンジからマウスを保護する。これらの結果は、ウイルスＭ２ｅが、ヒトにおいて広く交差反応性で保護的な抗体を誘発することができることを示唆する。したがって、これらのヒト抗体の組換え型は、広範囲のインフルエンザＡ株の感染から保護するための有用な治療剤を提供することができる。
緒言
季節性インフルエンザ流行病は、米国において毎年２００，０００を超える人を入院させ、世界で推定５００，０００人を死亡させる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． （２００４） ＪＡＭＡ ２９２：１３３３−１３４０）。抗原ドリフトとして公知の構造的な変異性を導く、ウイルスゲノム中で常に発生している点変異のために、ほとんどの個体において、免疫系は、季節性株から部分的な保護しかもたらさない。世界的流行株は、ウイルス抗原決定基のより急進的なシフトをもたらす、異なるウイルス間でのゲノム再集合イベントのために、より低い免疫耐性に直面する（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）。その結果として、世界的流行性インフルエンザは、広範囲におよぶ疾病、死、および経済的破壊を引き起こす潜在性を有する。インフルエンザ流行病および世界的流行の脅威と戦うためのワクチンおよび抗ウイルス剤が入手可能である。しかし、インフルエンザワクチンの株組成は、例年の基準に基づいてインフルエンザの季節の前に決定しなければならず、どの株が支配的となるかを前もって予測することは、非常に困難である。さらに、ワクチンで誘導される防御免疫応答を免れる株の出現は比較的急速であり、これはしばしば、不十分な保護をもたらす（Ｃａｒｒａｔ Ｆ， Ｆｌａｈａｕｌｔ Ａ． （２００７） Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ： ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｒｉｆｔ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：６８５２−６８６２）。抗ウイルス薬には、ウイルスタンパク質ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の機能を阻害するオセルタミビルおよびザナミビル、ならびにウイルスＭ２タンパク質のイオンチャネル機能を阻害するアダマンタンが含まれる（Ｇｕｂａｒｅｖａ ＬＶ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｌａｎｃｅｔ ３５５：８２７−８３５； Ｗａｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５５８５−５５９４）。抗ウイルス剤は、感受性のウイルス株に有効であるが、ウイルスの耐性が急速に生じ得、これは、これらの薬物を効果的でないようにする潜在性を有する。２００８〜２００９年の米国のインフルエンザ季節において、試験された季節性Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２インフルエンザ分離株のほぼ１００％が、それぞれオセルタミビルまたはアダマンタン抗ウイルス剤に耐性であった（ＣＤＣ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｕｒｖｅｙ：ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ｗｅｅｋｌｙ／ｗｅｅｋｌｙａｒｃｈｉｖｅｓ２００８−２００９／ｗｅｅｋｌｙ２３．ｈｔｍ）。
抗インフルエンザ抗体を使用する受動免疫療法は、ウイルス感染を予防または処置するための代替のパラダイムを代表する。この手法の有用性の証拠は、１９１８年のインフルエンザ世界的流行の間に受動的な血清移植（ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が使用され、ある程度成功したほぼ１００年前に遡る（（Ｌｕｋｅ ＴＣ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４５：５９９− ６０９）。抗インフルエンザモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によってもたらされる保護は、インフルエンザウイルスの抗原異質性のために典型的には幅が狭いが、最近、いくつかのグループが、ウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）のステム領域内の保存されたエピトープに結合する保護的なｍＡｂを報告した（Ｏｋｕｎｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：２５５２−２５５８； Ｔｈｒｏｓｂｙ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２００８） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３： ｅ３９４２； Ｓｕｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６：２６５−２７３； Ｃｏｒｔｉ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ４１９０２）。これらのエピトープは、インフルエンザウイルスのあるサブセットに制限されると思われ；これらの抗ＨＡ ｍＡｂは、Ｈ３およびＨ７サブタイプのウイルスに対して保護をもたらすことが予想されない。これらのうち、Ｈ３サブタイプは循環ヒト株の重要な成分を含み（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＣＡ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３４０−３４６）、一方、Ｈ７サブタイプは、ヒトにおいて死亡を引き起こした病原性の高いトリ株を含む。（Ｆｏｕｃｈｉｅｒ ＲＡ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１３５６−１３６１； Ｂｅｌｓｅｒ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５：８５９−８６５）。
インフルエンザウイルスの表面上に存在する３つの抗体標的のうち、ウイルスＭ２タンパク質（Ｍ２ｅ）の外部ドメインは、ＨＡまたはＮＡよりもはるかにより高度に保存されており、Ｍ２ｅを広く保護的なｍＡｂの魅力的な標的にしている。Ｍ２ｅに対するモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで保護的であることが示されており（Ｗａｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ８０：１６８−１７７； Ｌｉｕ Ｗ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ９３：１３１−６； Ｆｕ ＴＭ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８５：２１８−２２６； Ｔｒｅａｎｏｒ ＪＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４：１３７５−１３５７； Ｂｅｅｒｌｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ ６：２２４−２３４）、いくつかのグループは、Ｍ２ｅに基づくワクチン戦略を用いた感染に対する保護を実証した（Ｆｕ ＴＭ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：１４４０−１４４７； Ｆａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：２９９３−３００３； Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎ ＶＡ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１３９９−１４０２； Ｎｅｉｒｙｎｃｋ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：１１５７−１１６３； Ｔｏｍｐｋｉｎｓ ＳＭ， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １３：４２６−４３５； Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：２６１６−２６２６）。これらの場合において、精製Ｍ２タンパク質またはＭ２ｅ配列に由来するペプチドは、動物中で抗Ｍ２ｅ抗体を産生させるための免疫原として、またはワクチン候補として使用されている。本試験において、本発明者らは、ウイルス粒子およびウイルス感染細胞上にディスプレイされるＭ２タンパク質に結合するヒトＢ細胞から直接ｍＡｂを単離した。さらに、本発明者らは、これらの抗体は、致命的なインフルエンザＡウイルスチャレンジからマウスを保護し、これらは、広範囲のヒトおよび動物インフルエンザＡウイルス分離株に由来するＭ２バリアントを認識することができることを実証する。特性のこの組合せは、インフルエンザＡウイルス感染を予防および処置するためのこれらの抗体の有用性を増強することができる。
結果および考察
ヒトＢ細胞に由来する抗Ｍ２ｅ ｍＡｂのファミリーの単離。ヒトにおける天然のインフルエンザ感染症に対する体液性免疫応答を調べるために、本発明者らは、Ｍ２ｅ血清陽性の被験体のＩｇＧ＋メモリーＢ細胞から抗体を単離した。１４０の健康な成人、米国ソースドナーからの血清試料を、ウイルスＭ２遺伝子（Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／５０ Ｈ１Ｎ１に由来）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面に発現されるＭ２ｅとの反応性について試験した。２３のＭ２ｅ血清陽性の被験体のうちの５つからのＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を、これらが増殖し、ＩｇＧ分泌プラスマ細胞に分化する条件下で培養した。Ｂ細胞培養ウェルを、細胞−表面Ｍ２ｅに対するＩｇＧ反応性に関してスクリーニングし、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）遺伝子を、１７の陽性ウェルからＲＴ−ＰＣＲによってレスキューし、組換え発現および精製のためにヒトＩｇＧ１定常領域バックグラウンド中に組み込んだ。１７の抗Ｍ２ｅ ｍＡｂのうちの１５のＶＨおよびＶＬ配列を、２つの関連群に分ける（表３）（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能）。群Ａにおいて、生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントの割り当ては、ＩＧＨＶ４−５９＊０１であり、一方、群Ｂにおいて、生殖系列遺伝子セグメントはＩＧＨＶ３−６６＊０１である。さらに２つの遠縁のｍＡｂ ６２Ｂ１１および４１Ｇ２３（群Ｃ）は、群Ａの生殖系列Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ４−５９＊０１とアミノ酸残基差異がわずか５つである生殖系列Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ４−３１＊０３を利用する。これらのｍＡｂのすべては、同じ軽鎖Ｖ遺伝子ＩＧＫＶ１−３９＊０１またはその対立遺伝子ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１を利用し、生殖系列重鎖またはカッパ鎖配列からの体細胞超変異の証拠を示す（図１２）。競合的結合実験は、これらのヒトｍＡｂのすべてが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の表面に発現されたネイティブＭ２ｅ上の同様の部位に結合するように思われることを示した（図１３）。本発明者らは、群ＡおよびＢのそれぞれから１つのｍＡｂをさらなる特徴付けのために選択し、それぞれＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２と命名した。
インフルエンザウイルスの表面への高親和性結合。ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２はともに、約１００ｎｇ／ｍＬの最大半量結合を有する高いアビディティを伴って、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）に直接結合した（図１４ａ）。表面プラズモン共鳴によって決定した場合にそれぞれ１４ｎＭおよび３ｎＭの親和性（ＫＤ）でウイルスに結合したＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２からＦａｂ断片を調製した（表４）。ヒトｍＡｂは、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／５０）のＭ２ｅドメインに対応する２３アミノ酸合成ペプチドに、認め得るほどには結合しなかった（図１４ｂ）。精製Ｍ２を用いた免疫化によって最初に生成されたマウス抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ １４Ｃ２（ｃｈ１４Ｃ２）のキメラ誘導体（Ｚｅｂｅｄｅｅ ＳＬ ａｎｄ Ｌａｍｂ ＲＡ． （１９８８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：２７６２−２７７２）は、ヒトｍＡｂで観察された挙動と反対の挙動を示し、ウイルスにほとんど結合しなかったが、１０ｎｇ／ｍＬのペプチドへの最大半量結合を伴って、単離された２３ｍｅｒのＭ２ｅペプチドに堅調に結合した（図１４ａおよび１４ｂ）。興味深いことに、ヒトｍＡｂおよびｃｈ１４Ｃ２はともに、同様のアビディティを伴って、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）に感染したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の表面に結合した（図１４ｃ）。したがって、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂによって認識されるウイルスエピトープは、ウイルスおよび感染細胞の両方の表面に存在し、アクセス可能であり、一方、ｃｈ１４Ｃ２によって結合されるエピトープは、感染細胞の表面のみにおいてアクセス可能であるように思われる。ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂは、Ｍ２ｅに由来する固定化された合成ペプチドに認め得るほどには結合せず、さらに、そのようなペプチドは、哺乳動物細胞の表面に発現されたＭ２ｅへのこれらの抗体の結合に関して競合しない（図１４ｄ）という本発明者らの観察結果は、Ｍ２ｅエピトープ内の二次構造が、ヒト抗体による結合に重要であるという考えを支持する。ｃｈ１４Ｃ２がプラスチックに固定化されたペプチドに結合することは、このｍＡｂの結合に関して、より高次の構造の重要性が低いことを示唆する。
Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１ウイルスでの致命的なチャレンジからの保護。次に、本発明者らは、マウスにおけるインフルエンザ感染症の致命的なチャレンジモデルにおける、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の保護的な効力を調べた。動物を、５×ＬＤ５０ユニットの高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）で鼻腔内チャレンジし、ウイルスチャレンジから１日後に処置を開始した場合、両ヒトｍＡｂは保護的であった。対照的に、ヒトサイトメガロウイルスｇＢのｇｐ１１６部分のＡＤ２エピトープを標的にする、サブクラスがマッチした、無関係の対照ｍＡｂ ２Ｎ９を用いて、またはビヒクル対照を用いて同様の処置レジメンに供されたマウスは、より少ない程度に保護されるか、またはまったく保護されず、ヒトｍＡｂで処置したマウスについて７０〜８０％の生存に対し、対照ｍＡｂについて２０％の生存およびビヒクルについて０％の生存をもたらした（図１５ａ）。抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ｃｈ１４Ｃ２は、このモデルにおいて実質的な保護を与えなかったが（２０％の生存；図１５ａ）、このｍＡｂは、インフルエンザウイルスの他の株に感染したマウスの肺においてウイルスの力価を減少させることを示した（Ｔｒｅａｎｏｒ ＪＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４：１３７５−１３５７）。ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２処置群における動物を含む動物のすべては、感染後の第４日〜第８日の体重減少に続いて、第１４日の試験の最後まで、生存動物の体重の段階的な増加を示し（図１５ｂ）、このことは、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂは、感染を完全に予防することによってではなく、重症度または感染の程度を減少させることによって保護をもたらしたことを示す。実際に、それぞれの処置コホート中の追加の動物からの肺、脳、および肝臓組織の免疫組織学的分析およびウイルス負荷分析の結果は、ｃｈ１４Ｃ２またはサブクラスがマッチした対照ｍＡｂ ２Ｎ９ではなく、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂで処置された動物における、肺を越えた脳へのウイルスの拡散の減少と一致し、おそらく肝臓へのウイルスの拡散の減少とも一致する。しかし、対照ｍＡｂに対する、肺におけるウイルス負荷へのヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの効果は、より弱かった（それぞれ表５および図１６）。
ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂによって与えられる保護が、その広い結合挙動を反映するかどうかを試験するために、本発明者らは、比較的多岐にわたるＨ１Ｎ１ウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４のマウスに適合した分離株を用いて、同様のｉｎ ｖｉｖｏチャレンジ試験を実施した。１００パーセントのＰＢＳで処置したマウスまたはサブクラスがマッチした対照抗体で処置したマウスはこのウイルスによって死亡し、一方、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２で処置した動物の大部分は生存した（６０％；図１５ｃ）。このウイルスについて、ｃｈ１４Ｃ２で処置したマウスには、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの生存利益と同様の生存利益がもたらされた（図１５ｃ）。感染の過程全体にわたるそれぞれの処置群における体重変化およびその後の消散は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染したマウスのパターンと同様であるパターンに従った（図１５ｄ）。
ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂおよびｃｈ１４Ｃ２は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４およびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ウイルスに由来する、細胞表面に発現したＭｅ２（図１９ｂ、表６）、ならびにＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に感染した細胞（図１４ｃ）に結合した。抗体に媒介される保護の機構は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または補体依存性細胞傷害による感染した宿主細胞の死滅を含む場合がある（Ｗａｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ８０：１６８−１７７； Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５５９８−５６０５）。本発明者らは、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂおよびｃｈ１４Ｃ２を用いて、これらの機構の両方に関する証拠をｉｎ ｖｉｔｒｏで見つけた（図１７および表６）。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４と比較した場合に、高病原性トリウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４によるチャレンジ後のｃｈ１４Ｃ２と比較した場合のヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂで観察されたｉｎ ｖｉｖｏ保護の増強についての説明は、ｃｈ１４Ｃ２がインフルエンザビリオンに結合すると思われない一方で、ヒトｍＡｂがウイルスに直接結合する独特な能力に起因し得る（図１４ａ）。ウイルスに結合する抗体の保護特性は、抗体依存性ウイルス溶解（ｖｉｒｏｌｙｓｉｓ）（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：４２７−４３４）および宿主細胞によるオプソノファゴサイトーシス（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介したクリアランス（Ｈｕｂｅｒ ＶＣ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：７３８１− ７３８８）などの機構を含むことを予想することができる。これらの機構の一部は、抗体と宿主Ｆｃ受容体との効率的な相互作用を必要とする。本発明者らのマウスチャレンジ実験では、試験したｍＡｂのすべてはヒト定常領域を有していた。しかし、他の試験は、ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体と生産的に相互作用することができることを示した（Ｃｌｙｎｅｓ ＲＡ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：４４３−４４６）。
病理学的変化およびウイルス抗原は、ウイルスでチャレンジしたすべてのマウスの肺において検出された。マウスは、すべての群にわたって同様の肺病変部を有していたが、ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２群中のマウスは、肺におけるウイルス抗原発現がより少ない傾向を有した。脳および肝臓内で、病変部は、ＴＣＮ−３１群中のマウスにおいて検出されず、ＴＣＮ−０３２群中の３匹のマウスのうちの１匹のみが脳内のウイルス抗原の何らかの証拠を示した。病理学的変化／ウイルス抗原：＋＋＋重度／多い、＋＋中程度／中程度、＋軽度／いくらか、±わずか／希有、−観察されず／陰性。
一番上のＭ２ｅ配列は、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）に由来し、４３の野生型バリアントのＭ２外部ドメインアミノ酸１〜２３のアラインメントのための参照配列として使用される。灰色ボックスは参照配列とのアミノ酸同一性を表し、白色ボックスはアミノ酸置換変異である。ＨＫ、ＶＮ、およびＤ２０を除く非同一配列のこのリストは、参考文献１１および２７で使用されたＭ２配列に由来した。配列データは、Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）からのものである。
Ｍ２ｅの高度に保存されたＮ末端セグメントへの結合。ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの独特のウイルス結合特性をより良好に理解するために、本発明者らは、Ｍ２ｅドメイン中のその結合部位をマッピングした。Ｍ２ｅに由来する直鎖状ペプチドへのヒトｍＡｂの感知できる結合の欠如により、そのエピトープの微細構造マッピングの合成ペプチド手法が排除された。代わりに、ｃＤＮＡをトランスフェクトした哺乳動物細胞の表面に発現したＭ２ｅアラニン置換バリアントおよび天然に存在するＭ２バリアントへのｍＡｂの結合を、フローサイトメトリーによって定量化した。２３アミノ酸のＭ２外部ドメイン中のそれぞれの位置がアラニンで置換されたＭ２変異タンパク質のパネルを用いた結合実験により、成熟した（メチオニンでクリップされた（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｃｌｉｐｐｅｄ））Ｍ２ポリペプチドの第１（Ｓ）、第４（Ｔ）、および第５（Ｅ）の位置が、ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２の両方の結合に重要であることが明らかになった（図１９ａ）。対照的に、ｃｈ１４Ｃ２の結合は、アラニンで成熟したＭ２の１４位が置換された場合、選択的に減少した（図１９ａ）。これらの観察結果は、多岐にわたる、天然に存在するＭ２バリアントのパネルを用いた試験で確認した；４位でのプロリンとの置換（表６：Ａ／Ｐａｎａｍａ／１／１９６６ Ｈ２Ｎ２、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１１４４／１９９９ Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１１８０／１９９９ Ｈ３Ｎ２、およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＹＵ４２７／２００３ Ｈ９Ｎ２）ならびに５位でのグリシンとの置換（表６：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＳＦ１／２００３ Ｈ９Ｎ２）は、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの結合の減少と相関したが、ｃｈ１４Ｃ２と相関しなかった（図１９ｂ、表６）。これらの結果は、ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２はともに、成熟したＭ２ｅのＮ末端の１〜５位でＳＬＬＴＥのコア配列を認識することを示唆する。これは、これらのｍＡｂがＣＨＯ細胞の表面に発現したＭ２ｅへの結合を互いに有効に競合することを示すデータによって支持される（図２０）。対照的に、本発明者らの結果は、ｃｈ１４Ｃ２は、空間的に異なり、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂによって認識されるＳＬＬＴＥコアの下流である部位に結合することを示す。実際に、以前の試験では、１４Ｃ２はプロセシングされたＭ２ｅの５〜１４位で配列ＥＶＥＲＴＰＩＲＮＥＷを有する相対的に広い、直鎖状エピトープに結合することが示された（Ｗａｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ８０：１６８−１７７）。
ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２によって認識されるエピトープは、非常に類似している可能性が高いが、いくつかのＭ２ｅ変異体への結合において、これらのヒトｍＡｂの間でいくつかの差異が存在した。例えば、ＴＣＮ−０３１は、成熟したＭ２ｅ配列の残基２（Ｌ）および３（Ｌ）に対してＴＣＮ−０３２より大きな依存性を有するように思われる（図１９ａ）。これらの２つのヒトｍＡｂのＶＨ領域は、異なる可変、多様性、および連結遺伝子セグメントを利用し、これらは、これらのｍＡｂの間で観察された結合における軽微な差異を説明することができる。興味深いことに、そのＶＨ構成の差異にもかかわらず、これらのヒトｍＡｂは、異なるカッパ鎖連結セグメントを伴っていても、同じ生殖系列カッパ鎖Ｖ遺伝子セグメントを利用する。
Ｍ２ｅのＮ末端領域におけるヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの結合領域の局在化は、インフルエンザＡウイルス中の上記ポリペプチドのこの部分における著しく高い配列保存を踏まえると特に重要である。Ｍ２をコードするウイルスＭ遺伝子セグメントは、ディファレンシャルスプライシングを介して内部ウイルスタンパク質Ｍ１もコードする。しかし、スプライス部位は、Ｍ２およびＭ１の共有Ｎ末端の下流に位置し、同一の８アミノ酸Ｎ末端配列を有する２つの異なる成熟したポリペプチドをもたらす（Ｌａｍｂ ＲＡ ａｎｄ Ｃｈｏｐｐｉｎ ＰＷ （１９８１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１２：７２９−７３７）。この領域に結合する宿主抗Ｍ２ｅ抗体からのウイルスエスケープについての選択肢は、Ｍ２タンパク質だけでなく、Ｍ１タンパク質に対しても変化をもたらす、Ｎ末端領域におけるエスケープ変異として限定される場合がある。実際に、Ｍ２ｅのこのＮ末端８アミノ酸セグメントは、ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｃｇｉ）のカタログに載せられている１３６４の独特の完全長Ｍ２バリアントにおいてほぼ完全な同一性を示し、一方、はるかに低いレベルの保存が、この領域の下流のＭ２ｅ配列において見られる（図１９ｃ）。現に、コアのヒト抗Ｍ２ｅ抗体エピトープＳＬＬＴＥは、それぞれヒト、ブタおよびトリウイルスの９７％、９８％、および９８％を含めて、ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａｂａｓｅのカタログに載せられている１３６４の独特の完全長Ｍ２ｅ配列の約９８％において存在する。これは、Ｍ２ｅペプチドまたはタンパク質を用いた免疫化によって誘発される抗Ｍ２ｅ ｍＡｂの直鎖状結合部位内のはるかに低い保存と対照をなす。例えば、１４Ｃ２およびＺ３Ｇ１（Ｗａｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ８０：１６８−１７７）は、インフルエンザＡウイルスの４０％未満において保存された配列に結合し、この領域内の保存は、トリウイルスおよびブタウイルスにおいてさらにより低い（表７）。
ペプチドで誘発された抗体によって認識される直鎖状Ｍ２ｅエピトープは、一部のウイルス分離株中に存在するエスケープ変異および天然の置換に対してより感受性となり得る。例えば、ｍＡｂ １４Ｃ２へのＰ１０ＬおよびＰ１０Ｈエスケープ変異は、Ｍ２ｅの中心部分にマッピングされており（Ｚｈａｒｉｋｏｖａ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：６６４４−６６５４）、こうした同じ置換は、一部の病原性の高いＨ５Ｎ１株に由来するＭ２ｅバリアントにおいても起こる。本発明者らは、ｃｈ１４Ｃ２ではなく、ヒトｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２は、Ｐ１０Ｌ置換を含むＨ５Ｎ１ウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７（ＨＫ）に由来するＭ２バリアントに結合することを見出した（図１９ｂ、表６）。したがって、１４Ｃ２の特異性と同様の特異性を有するモノクローナル抗体は、広範囲の治療剤としての有用性が限定される可能性が高い。
５人のヒト被験体の調査において、本発明者らは、Ｍ２ｅの保存されたＮ末端領域に結合する１７の独特の抗Ｍ２ｅ抗体を見つけたが、１４Ｃ２および他のペプチドで誘発された抗体によって認識される直鎖状エピトープを含むＭ２ｅに由来するペプチドとのＩｇＧ反応性を観察しなかった。自然に感染したか、またはワクチン接種されたヒトにおけるＭ２ｅに対する見かけ上均一な抗体応答と対照的に、Ｍ２ｅに由来するペプチドで免疫されたマウスは、保存されたＮ末端およびさらに下流領域を含む、Ｍ２ｅにおける様々な特異性を有する抗体を産生した（Ｆｕ ＴＭ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８５：２１８−２２６）。ヒト免疫系が、より多岐にわたり、したがって持続的な保護性がより低い下流部位ではなく、Ｍ２ｅの高度に保存されたＮ末端セグメントをもっぱら標的にする体液性応答を進化させたと推測するのは魅力的である。Ｍ２ｅのこの内部領域を認識するヒト抗体の証拠がないにもかかわらず、Ｍ遺伝子の進化の分析は、Ｍ２ｅのこの領域がヒトインフルエンザウイルスにおいて強い正の選択下にあることを示唆する（Ｆｕｒｕｓｅ Ｙ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２９：６７）。この知見に関する１つの説明は、選択圧が抗体以外の免疫機構によってこの内部領域に向けられていることである。例えば、ヒトＴ細胞エピトープがこれらの内部Ｍ２ｅ部位にマッピングされている（Ｊａｍｅｓｏｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：８６８２−８６８９）。
２００９ Ｈ１Ｎ１ Ｓ−ＯＩＶの認識。広く保護的な抗インフルエンザｍＡｂは、病原性の高い世界的流行ウイルス株の大流行のイベントにおいてヒトを保護または処置するための受動免疫療法において使用することができる。免疫療法剤としてのそのようなｍＡｂについての潜在性の極めて重要な試験は、上記ｍＡｂが、将来のウイルスの再集合イベントから進化する場合があるウイルス株を認識することができるかどうかである。好適例として、ヒト抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１およびＴＣＮ−０３２を、現在のＨ１Ｎ１ブタ起源世界的流行株（Ｓ−ＯＩＶ）を認識するその能力について試験した。これらのｍＡｂは、この株がヒトにおいて発生したと考えられる時期より前の２００７年以前に採取したヒト血液試料に由来した（Ｎｅｕｍａｎｎ Ｇ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４５９：９３１−９３９）。両ヒトｍＡｂは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／２００９（Ｓ−ＯＩＶ Ｈ１Ｎ１、世界的流行）およびＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１４／１９９６（Ｈ１Ｎ１、季節性）に感染したＭＤＣＫ細胞に結合し、一方、ｃｈ１４Ｃ２は、季節性ウイルスに感染した細胞にのみ結合した（図２１）。この広い結合挙動が、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４の場合と同様に保護と相関することを証明する場合、これらのヒトｍＡｂは、Ｓ−ＯＩＶ世界的流行株または将来発生する場合のある、おそらく他の世界的流行株を予防または処置するのに有用となり得る。
ヒトが、インフルエンザ感染症に対してほぼユニバーサルな保護を与えることができる抗体を産生する能力を有することは注目すべきであるが、このこれまで記述されなかったクラスの抗体の発見は、そもそもこのウイルスがなぜ、免疫能を有する個体において増殖感染を展開することができるのかという疑問を提起する。この見かけ上のパラドックスは、保護的なＭ２ｅエピトープの性質およびその関連する免疫原性によって説明することができる。Ｍ２ｅは、特に、免疫優性のウイルス糖タンパク質ＨＡおよびＮＡと比較した場合、ヒトにおいて低い免疫原性を示すように思われることが他者によって言及されている（Ｆｅｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｖｉｒｏｌ Ｊ ３：１０２； Ｌｉｕ Ｗ， ｅｔ ａｌ． （２００３） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ３５：１４１−１４６）。したがって、保護的な抗Ｍ２ｅ抗体は、多くの個体中に存在するが、最適以下の力価で存在し得る。ほとんどの個体がＭ２ｅに対する検出可能な体液性応答を呈しなかったという本発明者らの観察結果は、この概念を支持する。本発明者らは、健康な被験体の本発明者らのコホート内で本発明者らがサンプリングした個体のうちの２０％未満（２３／１４０）が、検出可能な血清レベルの抗Ｍ２ｅ抗体を有していたことを観察した。この現象の理由は明確でないが、同様の状況はＨＣＭＶにおいて存在し、ここでは、ＨＣＭＶ血清陽性の被験体のうちの少数のみが、ＨＣＭＶのｇＢ複合体内の広く保存された中和ＡＤ２エピトープに対する測定可能な抗体を有する（Ｍｅｙｅｒ Ｈ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：２３７５−２３８３； Ａｙａｔａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ４３：３８６−３９２； Ｎａｖａｒｒｏ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ５２：４５１−４５９）。
インフルエンザの脅威に対する免疫療法による消散のための重要な必要条件は、既存のウイルスおよび発生中のウイルス中に保存されている保護エピトープの同定であろう。天然のインフルエンザＭ２に対するヒト免疫応答の大規模なサンプリングを使用して、本発明者らは、Ｍ２ｅの高度に保存されたＮ末端領域内の天然で免疫原性の保護的なエピトープを同定した。本試験で記載したものを含めて、このエピトープに対するヒト抗体は、世界的流行性および季節性インフルエンザの予防および処置に有用となり得る。
方法
メモリーＢ細胞培養。全血試料を、ＩＲＢに認可されたインフォームドコンセント下で正常なドナーから収集し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的な技術によって精製した。Ｂ細胞培養物を、ＰＢＭＣ、Ｍ２発現細胞を用いた選択によって濃縮されたＢ細胞、または以前に記載したように、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）上のＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに対する抗体を用いた非ＩｇＧ＋細胞の負の欠乏（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を介してＰＢＭＣから濃縮されたＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を使用して用意した（（Ｗａｌｋｅｒ Ｌ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：２８９−２９３）。簡単に言えば、Ｂ細胞の活性化、増殖、終末分化、および抗体分泌を促進するために、細胞を、フィーダー細胞および健康なドナーに由来するマイトジェン刺激ヒトＴ細胞から作製した馴化培地の存在下で３８４ウェルのマイクロタイタープレート中に播種した。培養上清を８日後に収集し、蛍光画像法（ＦＭＡＴシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、インフルエンザウイルスＭ２（Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／５０ Ｈ１Ｎ１）を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞上に発現したＭ２タンパク質への結合反応性についてハイスループット形式でスクリーニングした。
Ｂ細胞培養物からの組換えｍＡｂの再構成。磁性ビーズ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、溶解したＢ細胞培養物からｍＲＮＡを単離した。遺伝子特異的プライマーを用いた逆転写（ＲＴ）の後、フランキング制限部位を有するＶＨ、Ｖ、およびＶλファミリー特異的プライマーを使用して、可変ドメイン遺伝子をＰＣＲ増幅した（Ｗａｌｋｅｒ Ｌ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：２８９−２９３）。予想されるサイズのアンプリコンを産生しているＰＣＲ反応物を、９６ウェルのＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して特定し、可変ドメインアンプリコンを、ヒトＩｇＧ１、Ｉｇκ、またはＩｇλ定常領域を含むｐＴＴ５発現ベクター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃａｎａｄａ、Ｏｔｔａｗａ、カナダ）中にクローニングした。それぞれのＶＨプールを、個々のＢＣＣウェルからの対応するＶκ、またはＶλのプールと組み合わせ、２９３−６Ｅ細胞内で一過性にトランスフェクトして組換え抗体を生成した。馴化培地をトランスフェクション後の第３日〜第５日に収集し、ＨＥＫ２９３細胞上に発現したＭ２タンパク質への抗体結合についてアッセイした。個々のクローンを陽性プールから単離し、独特のＶＨおよびＶＬ遺伝子を配列決定によって同定した。これらからモノクローナル抗体を続いて発現させ、結合活性について再アッセイした。
ＥＬＩＳＡ。ウイルス抗原を検出するために、１０．２μｇ／ｍＬのＵＶ不活化したＨ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、２５μＬのＰＢＳ／ウェル中、３８４ウェルのプレートに４℃で１６時間受動的に吸着させるか、またはβ−プロピオラクトンで不活化したＰＲ８（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をビオチン化し（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ）、ニュートラビジンでコーティングされたプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に同様に吸着させた。ウイルスをコーティングしたプレートおよびビオチン化ウイルスをコーティングしたプレートを、それぞれ１％ミルクまたはＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。指示された濃度のｍＡｂの結合を、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出し、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて可視化した。Ｍ２ｅペプチド、すなわち、ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号６８０）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を１μｇ／ｍＬで受動的に吸着させ、ペプチドへの抗体結合を同じ方法によって検出した。
ウイルス感染細胞のＦＡＣＳ分析。ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染後のＭ２ｅを検出するために、ＭＤＣＫ細胞を、ＰＲ８を用いて、６０：１の感染の多重度（ＭＯＩ）で、３７℃で１時間処理し、その後培地を交換した。感染したＭＤＣＫ細胞を１６時間さらに培養した後、指示されたｍＡｂを用いて細胞を染色するために回収した。結合した抗Ｍ２ ｍＡｂを、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて生細胞上で可視化した。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で実施した。抗Ｍ２ ｍＡｂのパネルについて、ＩｇＧ重鎖および軽鎖の組合せのそれぞれからの一過性トランスフェクションからの上清の２０μＬの試料を、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８３／９７のＭ２を発現する２９３の安定な細胞株を染色するのに使用した。ＦＡＣＳ分析を上記のように実施した。
Ｍ２バリアント分析。Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／１／１９５０（Ｄ２０）を表す外部ドメインの各位置での単一のａｌａ変異を伴う個々の完全長Ｍ２ ｃＤＮＡ変異体を合成し、ならびにＭ２の４３の天然に存在するバリアントを合成した（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。これらをプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一過性にトランスフェクトした後、ＨＥＫ２９３細胞を、１％ウシ胎仔血清および０．２％ＮａＮ３を補充したＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中の１μｇ／ｍＬの指示されたｍＡｂで処理した。結合した抗Ｍ２ ｍＡｂを、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて生細胞上で可視化した。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて実施した。天然に存在するバリアントへの相対的な結合は、正規化されたＭＦＩ（％） １００×（ＭＦＩ実験トランスフェクト−ＭＦＩモックトランスフェクト）／（ＭＦＩＤ２０−ＭＦＩモックトランスフェクト）の式を使用して、Ｄ２０一過性トランスフェクト細胞のそれぞれのｍＡｂ染色の百分率として表した。
マウスにおける治療的有効性試験。動物試験を、施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）プロトコール下で行った。本発明者らは、各群１０匹のマウス（雌性 生後６〜８週 ＢＡＬＢ／Ｃ）からなる６群に、５×ＬＤ５０のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４を鼻腔内に接種したか（図１５ａおよびｂ）、または各群５匹のマウスからなる６群に、５×ＬＤ５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４を鼻腔内に接種した（図１５ｃおよびｄ）。感染後の２４、７２、および１２０時間に、マウスに４００μｇ／２００μＬの用量の抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３１ ＴＣＮ−０３２、対照ヒトｍＡｂ ２Ｎ９、対照キメラｍＡｂ ｃｈ１４Ｃ２、ＰＢＳを腹腔内注射したか、または未処置のままにした。マウスを２週間毎日計量し、体重減少が感染前の体重の２０％を超えた際に（図１５ａおよび１５ｂに示したＨ５Ｎ１試験、および図１５ｃおよび１５ｄに示したＨ１Ｎ１試験）安楽死させた。
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／２００９感染細胞に対する抗体反応性。ＭＤＣＫ細胞を培地単独またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／２００９（Ｈ１Ｎ１）もしくはＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１４／１９９６（Ｈ１Ｎ１）を含む培地を用いて、約１のＭＯＩで感染させ、３７℃で２４時間培養した。細胞を、トリプシンを用いて組織培養プレートから剥がし、完全に洗浄し、その後、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。細胞を１μｇ／ｍｌの指示された抗体とともにインキュベートし、一次抗体結合を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを処理した。
抗体結合の競合分析。抗体を含む一過性トランスフェクション上清を、５μｇ／ｍＬのＭ２ｅペプチドＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の有無における、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ／５０ Ｈ１Ｎ１）に由来するＭ２で安定にトランスフェクトした２９３の細胞、またはモックトランスフェクト細胞への結合に関してスクリーニングした。結合した抗Ｍ２ ｍＡｂを、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中７００ｎｇ／ｍｌの抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ ＦＭＡＴ Ｂｌｕｅを用いて検出し、蛍光画像法（ＦＭＡＴシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって可視化した。
実施例１３：精製全不活化インフルエンザＡビリオンに結合し、組換えホモ三量体ＨＡタンパク質に結合し、感染性インフルエンザＡを中和する、ヒト血漿中に存在するＨＡ特異的抗体のスクリーニングおよび特徴付け
ＨＡに特異的であり、精製全不活化インフルエンザＡビリオンに結合し、組換えホモ三量体ＨＡタンパク質に結合し、生きたインフルエンザＡを中和することができる完全ヒトモノクローナル抗体を、以下に記載するように患者の血漿中で同定した。
組換え可溶性ＨＡの発現
例えば、表９に列挙したインフルエンザサブタイプ中に見つかる派生ＨＡ配列に対応するＨＡ前駆体（ＨＡ０）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有する発現コンストラクトを生成した。本発明の組換えＨＡ０前駆体ポリペプチドは、内在性膜または膜貫通ドメインを欠き、ＨＡ０外部ドメインのＣ末端に追加のアミノ酸を含有し、例えば、配列：
（式中、トロンビン切断部位は、太字およびイタリック体で示され、バクテリオファージＴ４フィブリチン「フォールドン」または三量体形成ドメインに下線が引かれ、三量体形成ドメインの最後のアミノ酸「Ｇ］は、四角で囲まれた「Ｖ５」エピトープタグの開始点であり、その後に太字のヘキサヒスチジン（ＨＩＳ）エピトープタグが続く）に対応する。前述のＣ末端領域内のヘキサ−ＨＩＳタグは、本発明の組換えＨＡタンパク質の精製に使用される。したがって、三量体形成ドメインを含有する組換えＨＡ０前駆体タンパク質は、本発明の組換えＨＡホモ三量体タンパク質とみなされる。
本発明の組換えＨＡホモ三量体タンパク質は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅ−ｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）によって行われたように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持される当技術分野で認められている細胞系、例えば、２９３ＨＥＫ細胞からの効率的な分泌を可能にするために、ネイティブシグナル配列を保持する。さらに、これらの組換えＨＡホモ三量体タンパク質またはそのＨＡ０前駆体内で、例えば、配列番号７３７を除く表９に示した配列のすべてにおいて、ネイティブＨＡ１／ＨＡ２ウイルスプロテアーゼ切断部位は維持されていた。配列番号７３７では、アミノ酸３３７〜３４７に位置し、配列「ＰＱＲＥＧＧＲＲＲＫＲ」（配列番号１２５０）からなるネイティブ切断部位が配列「ＰＱＴＥＴＲ」（配列番号１２５１）で置換されていた。
さらに、組換えＨＡホモ三量体タンパク質またはそのＨＡ０前駆体の例示的な受容体結合ドメインは、以下の構造エレメントを含む：１９０α−ヘリックス、１３０−ループ、および２２０−ループ（インフルエンザＡ株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４の配列を参照されたい）（またはＧｅｎＢａｎｋ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、およびＴｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖを含む公共データベースにアクセスし、配列をダウンロードすることによって当業者が容易に得ることができる他のインフルエンザＡ株における等価なＨＡ構造）（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４〜４１０頁）。この発現コンストラクトによってコードされる組換えＨＡホモ三量体タンパク質またはそのＨＡ０前駆体が部分的または完全に発現され、被験体に投与される本発明の他の実施形態では、これらの受容体結合ドメインは修飾され得る。用語「修飾された」は、１つまたは複数の構造エレメントの除去を表すように意味する。代替としてまたは追加的に、「修飾された」は、ＨＡの受容体結合ドメインの構造エレメント内の１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、反転、または転位を表すように意味する。例えば、本発明のＨｕＭＨＡ抗体が結合する直鎖状または不連続エピトープは、感染症を予防するためにインフルエンザ感染症に罹患するリスクのある被験体に投与される。代替としてまたは追加的に、本発明のＨｕＭＨＡ抗体が結合する直鎖状または不連続エピトープは、インフルエンザ感染を予防するためにインフルエンザウイルスに曝露される前に被験体に投与される。他の実施形態では、コンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープの構造模倣体が被験体に投与される。上記タンパク質が例えばワクチンとして予防目的で使用される場合、被験体において得られる免疫応答を制御するために１つまたは複数の受容体結合ドメインを修飾することが有利となり得る。任意選択で修飾されるＨＡの例示的な構造エレメントには、それだけには限定されないが、ＨＡの１９０α−ヘリックス、１３０−ループ、および２２０−ループが含まれる。
本発明の組換えホモ三量体ＨＡタンパク質は、以下のアミノ酸配列によってコードされ、式中、ネイティブ配列は太字で示され、配列番号７２６の配列は標準である（表９も参照されたい）：
配列番号７２７〜７４４の組換えおよび可溶性ＨＡ発現コンストラクトを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。組換えＨＡ０タンパク質、またはそのそれぞれのサブユニットＨＡ１およびＨＡ２に切断され、ジスルフィド連結されたＨＡを、Ｃ末端のヘキサ−ＨＩＳタグを使用して標準的手順によって培養上清から精製した。予想サイズの組換えタンパク質が存在することを裏付けるために、精製タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または変性クーマシーゲルによって分析した。
実施例１４：末梢血中の抗体のスクリーニング
１２６の個体の血清または血漿試料を、マイクロアレイスキャニングシステムを使用して組換え可溶性ホモ三量体ＨＡタンパク質（表９）に結合し、標準的ＥＬＩＳＡ技法を使用して全不活化インフルエンザＡビリオン（表１０）に結合し、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／０６またはＨ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５でのＭＤＣＫ細胞のウイルス感染を阻害または中和する、ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングした。血漿試料の一部は、組換え可溶性ＨＡホモ三量体タンパク質に特異的に結合し、不活化ビリオンに結合し、ウイルス感染力を中和したＩｇＧ抗体を含有していた。これは、抗体がＨＡホモ三量体中の直鎖状または不連続エピトープに結合でき、ＨＡホモ三量体の複数のバリアントのコンフォメーション決定基に結合できることを示す。可溶性標的には、それだけには限定されないが、表２に列挙したインフルエンザウイルス株および表１１に列挙した不活化ウイルス株に由来する例示的な組換えＨＡタンパク質が含まれる。
実施例１５：ＨＡ特異的抗体の同定およびレスキュー
ヒト血液試料から精製したＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を９日間培養することによって、これらのメモリーＢ細胞を活性化し、増殖させ、分化させてＩｇＧ分泌形質細胞にした。ＩｇＧを含有するＢ細胞培地を、マイクロアレイスキャニングシステムを使用して組換え可溶性ホモ三量体ＨＡタンパク質（表９）に結合し、標準的ＥＬＩＳＡ技法を使用してインフルエンザＡ全ウイルス（表１０）に結合し、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／０６またはＨ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５でのＭＤＣＫ細胞のウイルス感染を阻害または中和する、ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングした。表１２、１３、および１４に示したように、３９のＢＣＣウェルがいくつかのウイルス、ＨＡ、または中和プロファイルを有するＩｇＧ抗体を含有することが同定され、次いで抗体の可変領域を対応するＢ細胞培養液からクローニングした。
各ＢＣＣウェルからのモノクローナル重鎖および軽鎖対を用いた一過性トランスフェクションを２９３ ６Ｅ細胞に行って、抗体を再構成および産生した。次いで再構成された抗体の上清を、レスキューされた抗ＨＡ抗体を同定するために、マイクロアレイスキャニングシステムを使用して組換え可溶性ホモ三量体ＨＡタンパク質（表９）に結合し、標準的ＥＬＩＳＡ技法を使用して全インフルエンザＡウイルス（表１１）に結合し、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／０６、および／またはＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９、および／または Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５でのＭＤＣＫ細胞のウイルス感染を阻害または中和する、ＩｇＧについてスクリーニングした。前述の標的に対するヒトＩｇＧ抗体の結合および中和を、専売の陽性対照抗体ＴＣＮ−０３２（インフルエンザＡのマトリックス２タンパク質のＮ末端に特異的、米国特許出願第１２／７９５，６１８号）の結合、または幅広くＨＡ特異的な非中和ｍＡｂ ＴＣＮ−５０４（３２５１Ｋ１７としても公知であり、本明細書に記載されている）、およびこれらの同じ標的に対する専売の陰性対照抗体ＴＣＮ−２０２（ヒトサイトメガロウイルスｇＢ上のＡＤ２部位Ｉエピトープに特異的）の結合と比較した。
レスキューされた抗体の配列を決定する。さらに、抗体配列をコードするポリヌクレオチドのそれぞれの配列を決定する。
実施例１６：不活化全インフルエンザＡビリオンを使用する、Ｂ細胞培養上清またはモノクローナルトランスフェクション上清中のＩｇＧの結合プロファイル
ＢＣＣ ＳＮまたはモノクローナルトランスフェクション上清中のヒトｍＡｂが精製ウイルスに結合するか否かを決定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を以下の方法に従って行った。簡単に言えば、様々な精製インフルエンザＡウイルスサブタイプ株を、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングした。次いで、表１２に示したｍＡｂのＢＣＣ上清、または表１５に示したモノクローナルトランスフェクション上清の１つの希釈液、および陽性対照抗体（ＴＣＮ−０３２）の様々な希釈液を、ウイルスがコーティングされたウェルに添加した。非結合抗体を洗浄して除き、結合抗体をＨＲＰに結合体化された抗ヒト抗体で検出した。色素原（ＴＭＢ）がＨＲＰ結合体によって酸化され、青色になるとき、抗インフルエンザ抗体の存在が検出された。ＨＣｌの添加によって反応を停止すると、抗体陽性ウェルが黄色に変わる。黄色は、４５０ｎｍで最大の吸光度を有する。
方法：
Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（商標）プレートに３μｇ／ｍｌの不活化インフルエンザＡビリオンを２５μｌ／ウェルでコーティングする。
プレートを４℃で一晩インキュベートする。
４℃からプレートを取り出し、ＥＬ４０５ｘ（洗浄プログラム：ＥＬＩＳＡ＿４ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝食塩水（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含むＰＢＳ）で４回洗浄する。
プレートに１％のミルク／ＰＢＳを２０μｌ／ウェルで添加する。
６μｇ／ｍｌの１：３希釈液によって対照ｍＡｂ曲線を作成する。
５μｌの各ＢＣＣ ＳＮまたはモノクローナル一過性トランスフェクション上清および対照ｍＡｂ曲線を、プレートマップに従ってプレートにスタンプする。
室温（ＲＴ）で２時間（ｈｒ）インキュベートする。
ＥＬ４０５ｘ（洗浄プログラム：ＥＬＩＳＡ＿４ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含むＰＢＳでプレートを４回洗浄する。
１：５０００に希釈したポリクローナル抗体（ｐＡｂ）ヤギ抗ヒト（αＨｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を２５μｌ／ウェルで添加する。
ＲＴで１ｈｒインキュベートする。
ＥＬ４０５ｘ（洗浄プログラム：ＥＬＩＳＡ＿４ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含むＰＢＳでプレートを４回洗浄する。
希釈無しでＵｌｔｒａ−ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を２５μｌ／ウェルで添加する。
ＲＴで３０分（ｍｉｎ）展開する。
０．３Ｍの濃度の塩酸（ＨＣｌ）を２５μｌ／ウェルで添加することにより停止する。
Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘを用いて４５０ｎｍでプレートを読み取る。
以下の対照抗体のうちの１つまたは複数をこれらの実験に使用した：ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７としても公知であり、本明細書に記載されている）、ＴＣＮ−０３２（８Ｉ１０としても公知、インフルエンザＡ Ｍ２タンパク質に特異的）、およびＴＣＮ−２０２（２Ｎ９としても公知、ヒトサイトメガロウイルスｇＢ上のＡＤ２部位Ｉエピトープに特異的）タンパク質。
以下の精製ウイルスをこれらの実験に使用した：Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号７２８）、Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（配列番号７２９）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号７３０）。表１５に示したように、一過性トランスフェクション上清中のヒトモノクローナル抗体は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、および／またはＨ３Ｎ２ウイルスのうちの１つまたは複数に強く結合し、元のＢＣＣ ＳＮ（表１２）中のＩｇＧ抗体のウイルス結合プロファイルを再現する。
実施例１７：三量体ＨＡを使用する、Ｂ細胞培養上清またはモノクローナルトランスフェクション上清中のＩｇＧの結合プロファイル
ＢＣＣ ＳＮまたはモノクローナルトランスフェクション上清中のヒトｍＡｂが組換えホモ三量体ＨＡタンパク質の１つまたは複数に結合するか否かを決定するために、マイクロアレイスキャニングシステムを以下の方法に従って使用した。２０枚のＮｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｐ（Ｓｃｈｏｔｔ）ガラススライドを３ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト、Ｆｃ特異的抗体とともに加湿チャンバー内で一晩インキュベートする。Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｐスライドは、捕捉抗体に結合するＮＨＳエステル反応基で終わるヒドロゲルを含有する。次いで、５０ｍＭのＮａＢｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）緩衝液中の５０ｍＭのエタノールアミンを使用して揺り動かしながら１時間反応をクエンチし、その後超純水で３回洗浄する。トランスフェクション上清を３８４ウェルアレイのソースプレートに移す。ＢＣＣまたはモックトランスフェクション培地中の３μｇ／ｍｌから開始して０μｇ／ｍｌで終わる抗体の８点の３倍連続希釈液で対照アレイソースプレートを作製する。ＢＣＣまたはトランスフェクション上清アレイソースプレートおよび対照プレートの両方を、２０枚の準備したスライドとともにＡｕｓｈｏｎ ２４７０マイクロアレイプリンター上にロードする。
マイクロアレイを、プリントされるトランスフェクション上清の数に応じて、多様な数の特長および複製物を伴って、４８のサブアレイブロックにプリントする。プリントされたマイクロアレイを、プリンターの湿度制御されたチャンバー（８０％）内で、プリント後少なくも１時間（一晩まで）静置させる。次いでこれらをプリンターから迅速に取り出し、洗浄し、スピン乾燥させて、試料をインキュベートするためのスライドを準備する。リフタースリップを各スライド上に配置し、試料９０μｌをそれぞれに添加する。合計２０枚のスライドについて各スライドに、１８の所定濃度のＶ５−タグ付きＨＡ三量体の１つ、１μｇ／ｍｌのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ特異的抗体、またはブランクを載せる。次いでスライドを、加湿チャンバー内で、室温で一晩インキュベートする。洗浄し、スピン乾燥させ、新しいリフタースリップを適用した後、抗ヒトＩｇＧとともにインキュベートされたスライドを除く１９枚のスライドを、１：１０００に希釈したビオチンに結合体化された抗Ｖ５とともに１時間インキュベートする。その後、スライドを再び洗浄し、乾燥させ、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの１：３００の希釈液とともに１時間インキュベートするように準備した。さらに洗浄し、乾燥させ、準備した後、２０枚すべてのスライドを、キットの指示書に従ってＴｙｒａｍｉｄｅ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ試薬とともに１時間インキュベートする。最終的な洗浄および乾燥の後、５９４ｎｍの励起波長および６１９ｎｍ〜６４１ｎｍの範囲の発光帯で、Ａｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４３００Ａでスライドをスキャンする。Ａｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアを使用してデータを収集し、次いで結合プロファイルについて分析する。
方法：
１．ヤギ抗ヒト、ＦＣ特異的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ、１０ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ０．０５＆Ｔｗｅｅｎ中で３ｍｇ／ｍｌに希釈し、リフタースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ）の下で、９０μｌを使用して２０枚のＮｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｐスライド（Ｓｃｈｏｔｔ）に適用する。
２．加湿チャンバー内で、室温で一晩インキュベートする。
３．リフタースリップを取り除いて、ｐＨ８．０の５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム十水和物（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓ２４８−５００）中の５０ｍＭのエタノールアミン（Ｆｉｓｈｅｒ）ですべてのスライドをクエンチする。
４．室温でインキュベートしながら１時間クエンチする。
５．すべてのスライドを洗浄する（揺り動かしながら、３×２分のＭｉｌｌｉＱ水洗浄）。
６．すべてのスライドをＡｕｓｈｏｎ ２４７０ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙプリンター上にロードする。
７．トランスフェクション培地中に対照抗体を添加して、３μｇ／ｍｌから開始して０μｇ／ｍｌで終わる抗体の８点の３倍連続希釈液を形成することによって対照プレートを準備する。対照希釈液を４つのアレイソースプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に移す。
８．すべてのアレイソースプレート、対照、および試料をＡｕｓｈｏｎ ２４７０マイクロアレイプリンター上にロードし、すべての必要な流体レベルを確認した後、堆積を始める。複製物の数は、プリントされるトランスフェクション上清の数に基づく。一般に１〜１０の複製物である。
９．堆積後、少なくとも１時間〜一晩スライドを静置させる。
１０．直ちに洗浄し（２％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、５分；ＭｉｌｌｉＱ水、２分、３×）、スピン乾燥させる（２０００ＲＰＭで１分間）。
１１．リフタースリップを使用して、以下の濃度のＨＡ ９０μｌを適用する：
１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０％のブロッカーカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ、＃３７５２８）を使用してホモ三量体ＨＡを所望の濃度にする。
１２．加湿チャンバー内で、室温で一晩インキュベートする。
１３．直ちに洗浄し（２％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、５分；ＭｉｌｌｉＱ水、２分、３×）、スピン乾燥させる（２０００ＲＰＭで１分間）。
１４．リフタースリップを使用して、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰとともに以前にインキュベートしたスライドを除くすべてのスライドを、１×ＰＢＳ ０．０５％のＴｗｅｅｎ２０中１μｇ／ｍｌの抗Ｖ５ビオチン（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１３６０Ｂ）９０μｌとともに加湿チャンバー内で、室温で１時間インキュベートする。
１５．直ちに洗浄し（２％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、５分；ＭｉｌｌｉＱ水、２分、３×）、スピン乾燥させる（２０００ＲＰＭで１分間）。
１６．リフタースリップを使用して、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼが結合体化されたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１０３０）９０μｌとともに加湿チャンバー内で、室温で１時間インキュベートする。
１７．直ちに洗浄し（２％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、５分；ＭｉｌｌｉＱ水、２分、３×）、スピン乾燥させる（２０００ＲＰＭで１分間）。
１８．キットの指示書（ＴＳＡ Ｋｉｔ ＃２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔ２０９３５）に従ってＴｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ試薬を調製する。簡単に言えば、過酸化水素溶液１μｌを増幅緩衝液２００μｌ中に希釈する。過酸化水素／増幅緩衝液の溶液２０μｌを採取し、新鮮な増幅緩衝液１９４０μｌに添加する。次いでＴｙｒａｍｉｄｅ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０μｌを添加し、合計２ｍｌの増幅試薬を得る。
１９．２０枚すべてのスライドを増幅試薬とともに加湿チャンバー内で、室温で１時間インキュベートする。
２０．直ちに洗浄し（２％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、５分；ＭｉｌｌｉＱ水、２分、３×）、スピン乾燥させる（２０００ＲＰＭで１分間）。
２１．５９４ｎｍの励起波長および６１９ｎｍ〜６４１ｎｍの範囲の発光帯でのＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４３００Ａ、または同様の能力を有する光学スキャナーですべてのスライドをスキャンする。
２２．ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ７または同様のソフトウェアを使用して各スライド上に鋳型を与え、特長データを収集する。
２３．各ＨＡ三量体への結合プロファイルについて特長データを分析する。
表１６に示したように、一過性トランスフェクション上清中のヒトモノクローナル抗体は、組換えホモ三量体ＨＡタンパク質のうちの１つまたは複数に強く結合し、元のＢＣＣ ＳＮ（表１２）中のＩｇＧ抗体のウイルス結合プロファイルを再現する。
実施例１８：Ｂ細胞培養上清またはモノクローナルトランスフェクション上清中のＩｇＧの中和プロファイル
完全ＤＭＥＭ培地（１０％のＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、１×ピルビン酸ナトリウムを補充）中に、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり３×１０３個の細胞でＭＤＣＫ細胞を蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。
インフルエンザＡウイルスを、ＢＣＣ上清またはモノクローナルトランスフェクション上清または陽性対照中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）とともにプレインキュベートし、所望の濃度で、プールしたＢＣＣ上清中またはモックトランスフェクション上清中に希釈し、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。ボイドボリュームおよび希釈液は、３７℃で、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、２００ｍＭのマンノース、および１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で作製し、全容積は３０μｌ／ウェルであった。
各試料ウェルは：
（ａ）２０μｌ／ウェルのＢＣＣ上清；または
（ｂ）２０μｌ／ウェルのモノクローナルトランスフェクション
（ｃ）１０μｌ／ウェル中、３０００ＩＵ／ウェルのＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６（Ｈ１Ｎ１）；または
（ｅ）１０μｌ／ウェル中、３０００ＩＵ／ウェルのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）；または
（ｆ）１０μｌ／ウェル中、３０００ＩＵ／ウェルのＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）
を含有していた。
感染前に、ＰＢＳ、Ｍｇ２＋、およびＣａ２＋を含有する溶液を用いて６０μｌ／ウェルでＭＤＣＫ細胞を１回洗浄した。洗浄後、ウイルス／ｍＡｂ混合物２５μｌを移し、３７℃で４時間感染を進めた。
４時間感染させた後、ＭＤＣＫ細胞を完全ＤＭＥＭで２回洗浄した。最後の洗浄後、２５μｌ／ウェルの完全ＤＭＥＭが残っており、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
一晩インキュベートした後、培地を除去し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（カタログ番号５１−２０９０ＫＺ）２０μｌを各ウェルに添加し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。次に、Ｍ３８４ Ａｔｌａｓプレート洗浄機を使用してウェルを３回洗浄した。
最後の洗浄後、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、および１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を１５μｌ／ウェルで添加し、ＲＴで少なくとも５分間インキュベートした。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、および１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗Ｍ２ｅ ｍＡｂ ＴＣＮ−０３２を２０μｌ／ウェルで各ウェルに添加し、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋を含むＰＢＳを用いて、Ａｔｌａｓプレート洗浄機を使用してウェルを１回洗浄した。２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））および２０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を２０μｌ／ウェルで添加し、暗所中、室温で４５分間インキュベートした。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋を含むＰＢＳを用いて、Ａｔｌａｓプレート洗浄機を使用してウェルを３回洗浄した。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、および１％のＢＳＡを含むＰＢＳ ２０マイクロリットルを各ウェルに添加し、プレートを黒色シールテープでシールした。ＩＮ Ｃｅｌｌ分析器を使用してスキャンすることによってプレートを分析した。具体的には、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェア、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ「３８４ＧＧ Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＦ６４７ ４ｘ」を使用してスキャンを行った。スキャンの分析は、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌ Ｂｏｘソフトウェア、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉ ＧＧ Ｄｅｎｓｉｔｙ ４」を使用して行った。
アッセイにより、インフルエンザＡ感染症を個々に中和した上清を十分に検出することができた。任意のカットオフを１５０核タンパク質（ＮＰ）＋細胞以下とし、破壊細胞単層を有するウェルを減じた場合、合計１２２ウェルに陽性のスコアを付けた。
この方法を使用して同定された例示的なインフルエンザ中和抗体は、
である。これらの抗体のいくつかの個々の中和活性を表１７に示す。
ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７）、ＴＣＮ−５５６（５０８９＿Ｋ１２）、ＴＣＮ−５５７（５０８１＿Ａ０４）、ＴＣＮ−５５９（５０９７＿Ｇ０８）、およびＴＣＮ−５６０（５０８４＿Ｐ１０）を含むいくつかの抗体は、非中和性である場合があると同定された。これらの抗体は、本発明の中和抗体と同様に、配列バリアントおよびコンフォメーションバリアントを含む幅広い範囲のＨＡタンパク質に結合する。本発明の特定の実施形態では、ＴＣＮ−５０４（３２５１＿Ｋ１７）、ＴＣＮ−５５６（５０８９＿Ｋ１２）、ＴＣＮ−５５７（５０８１＿Ａ０４）、ＴＣＮ−５５９（５０９７＿Ｇ０８）、およびＴＣＮ−５６０（５０８４＿Ｐ１０）を含む非中和抗体は、抗体−薬物結合体として使用することができる。
他の実施形態
本発明の特定の実施形態は説明を目的に本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の変更がされてもよい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載される場合を除いて、限定されない。
本発明は、本発明の詳細な説明とともに記載されるが、先行する記載は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するためであって、限定することを意図していない。他の態様、利点、および変更は、下記の特許請求の範囲内にある。
本明細書に言及されている特許および科学文献は、当業者に利用可能である知識を定着させる。本明細書において引用されたすべての米国特許および公開されたまたは公開されていない米国特許出願は参照により援用される。本明細書において引用されたすべての公開された外国特許および特許出願は参照により本明細書に援用される。本明細書において引用された受入番号によって指定されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ寄託は参照により本明細書に援用される。本明細書に引用されたすべての他の刊行された参考文献、資料、写本および科学文献は参照により本明細書に援用される。
本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、記載されているが、形式および詳細における種々の変更は、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなしにその中でなされてもよいことは当業者によって理解されよう。

Claims (29)

  1. （ａ）インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト抗体、および
    （ｂ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体
    を含む、組成物。
  2. 前記Ｍ２ｅポリペプチドのエピトープに特異的に結合する前記単離されたヒトモノクローナル抗体が、
    である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＨＡ糖タンパク質のエピトープに特異的に結合する前記単離されたヒト抗体が、
    である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＨＡ糖タンパク質の前記エピトープが、
    である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記Ｍ２ｅポリペプチドの前記エピトープが不連続エピトープである、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記Ｍ２ｅポリペプチドの前記エピトープが、
    ａ）ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号１）の２位、５位、および６位のアミノ酸、または
    ｂ）ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）の２位、５位、および６位のアミノ酸
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  7. （ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨドメインおよび該ＶＬドメインは、それぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
    を含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片、および
    （ｂ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨドメインおよび該ＶＬドメインは、それぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
    を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片
    を含む、組成物。
  8. （ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨドメインおよび該ＶＬドメインは、それぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
    を含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片、および
    （ｂ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨドメインおよび該ＶＬドメインは、それぞれ、３つの相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を含み、それぞれのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
    を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片
    を含む、組成物。
  9. （ａ）以下のアミノ酸配列：
    を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、および以下のアミノ酸配列：
    を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、単離されたヒト抗ＨＡ抗体またはその抗原結合断片、および
    （ｂ）以下のアミノ酸配列：
    を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および以下のアミノ酸配列：
    を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその抗原結合断片
    を含む、組成物。
  10. 請求項７、８、または９に記載の組成物を含む、多価ワクチン組成物。
  11. 請求項１に記載の組成物を含む、多価ワクチン組成物。
  12. 請求項１、７、８、または９に記載の組成物および医薬担体を含む、医薬組成物。
  13. 被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該被験体に請求項１２に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
  14. インフルエンザウイルス感染症の処置を必要とする被験体においてインフルエンザウイルス感染症を処置するための方法であって、該被験体に請求項１２に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
  15. 前記被験体がインフルエンザウイルスに曝露された、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記被験体がインフルエンザ感染症であると診断されていない、請求項１５に記載の方法。
  17. インフルエンザウイルス感染症の予防を必要とする被験体においてインフルエンザウイルス感染症を予防するための方法であって、インフルエンザウイルスへの該被験体の曝露の前に、該被験体に請求項１０または１１に記載のワクチンを投与する工程を含む、方法。
  18. 抗ウイルス薬、ウイルス侵入阻害剤またはウイルス付着阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項１４または１７に記載の方法。
  19. 前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤、またはＭ２イオンチャネル阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｍ２イオンチャネル阻害剤がアマンタジンまたはリマンタジンである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ノイラミニダーゼ阻害剤がザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである、請求項１９に記載の方法。
  22. 第２の抗インフルエンザＡ抗体を投与する工程をさらに含む、請求項１４または１７に記載の方法。
  23. 前記抗体が、インフルエンザウイルスへの曝露の前または後に投与される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記被験体は、インフルエンザ感染症にかかるリスクがある、請求項１５に記載の方法。
  25. 前記組成物を、ウイルスのクリアランスを促進するためかまたはインフルエンザ感染細胞を排除するために十分な用量で投与する、請求項１４または１７に記載の方法。
  26. 被験体においてインフルエンザウイルス感染の存在を決定するための方法であって、
    （ａ）該被験体から得た生物学的試料を請求項１、７〜９のいずれか一項に記載の抗体と接触させる工程、
    （ｂ）該生物学的試料に結合する該抗体の量を検出する工程、および
    （ｃ）該生物学的試料に結合する抗体の量を対照値と比較することにより、該被験体におけるインフルエンザウイルスの存在を決定する工程
    を含む、方法。
  27. 前記対照値が、前記被験体から得た対照試料を請求項１、７〜９のいずれか一項に記載の抗体と接触させ、そして該対照試料に結合する該抗体の量を検出することによって決定される、請求項２６に記載の方法。
  28. 請求項１、７、８、または９に記載の組成物を含む、診断キット。
  29. 請求項１０または１１に記載のワクチンを含む、予防キット。
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