JP2014239688A - 複製欠損アレナウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
i)4つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(糖タンパク質(GP)、核タンパク質(NP)、基質タンパク質Z及びRNA依存性RNAポリメラーゼL)の内の1つ又は複数を、正常細胞では感染性の伝播が妨げられるが、かかる細胞では遺伝子発現が可能なままであるように除去又は突然変異させ、
ii)1つ又は複数のタンパク質をコードする、又は宿主遺伝子発現を調整する外来リボ核酸を、4つのアレナウイルスプロモータ(Sセグメントの5’UTR及び3’UTR、並びにLセグメントの5’UTR及び3’UTR)の内の1つ又は複数から、又はそれぞれウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII若しくはRNAポリメラーゼIIIで解読することができるさらに導入されたプロモータから導入及び転写し、タンパク質をコードする、又は宿主遺伝子発現を調整するリボ核酸を、それら自体により又はアレナウイルスタンパク質のオープンリーディングフレームとの融合によるリードスルーとして転写し、
iii)任意で1つ又は複数の内部リボソーム侵入部位を、アレナウイルス感染細胞においてタンパク質の発現を高めるようにウイルス転写配列に導入する。
i)4つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(糖タンパク質(GP)、核タンパク質(NP)、基質タンパク質Z、RNA依存性RNAポリメラーゼL)の内の1つ又は複数、例えば2つ、3つ又は4つを、アレナウイルスベクター感染細胞では依然として遺伝子発現が可能であるが、正常細胞では感染性粒子の形成を妨げるように除去又は突然変異する。
ii)1つ又は複数のタンパク質をコードする外来核酸を導入することができる。代替的に又は付加的に、外来核酸を宿主遺伝子の発現を調整するために組み込んでもよい。これらの外来核酸としては、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ミクロRNA(miRNA)及びそれらの前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの外来核酸を、4つのアレナウイルスプロモータ(Sセグメントの5’UTR及び3’UTR、並びにLセグメントの5’UTR及び3’UTR)の内の1つ又は複数、例えば2つ又は3つから、又はそれぞれウイルスUTR、28SリボソームRNAプロモータ、β−アクチンプロモータ又は5SリボソームRNAプロモータにおいて自然状態で見出されるウイルスプロモータ配列の複製物のようなウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIにより解読することができるさらに導入されたプロモータ配列から転写する。タンパク質をコードする、又は宿主遺伝子発現を調整するリボ核酸を、それら自体により、又はアレナウイルスタンパク質のオープンリーディングフレームとの融合によるリードスルーとして転写及び翻訳し、宿主細胞におけるタンパク質の発現が、1つ又は複数、例えば2つ、3つ又は4つの内部リボソーム侵入部位を適当な場所(複数可)でウイルス転写配列に導入することにより高められ得る。
i)これらに限定されないが、ウイルス(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス(RSV))、細菌(例えばマイコバクテリウム、ヘモフィルス種(haemophilus spp.)及び肺炎球菌種(pneumococcus spp.))、寄生生物(例えばプラスモジウム(plasmodia)、アメーバ(amebia)及びフィラリア(philaria))、並びにプリオン(例えば従来及び変異型のクロイツフェルト・ヤコブ病及び狂牛病を引き起こす感染性因子)による感染;
ii)これらに限定されないが、I型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡及び乾癬を含む自己免疫疾患;
iii)これらに限定されないが、黒色腫、前立腺癌、乳癌、肺癌及び神経芽細胞腫を含む腫瘍性疾患;
iv)これらに限定されないが、II型糖尿病、肥満症及び痛風を含む代謝性疾患;
v)これらに限定されないが、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む変性疾患;
vi)これらに限定されないが、ハンチントン病、重症複合型免疫不全症及び脂質蓄積症を含む遺伝性疾患;
vii)これらに限定されないが、タバコ及びアルコール中毒を含む物質依存症;並びに
viii)これらに限定されないが、季節性又は通年性の鼻炎結膜炎、喘息及び湿疹を含むアレルギー性疾患。
野生型アレナウイルスゲノム(図1C)から始め、アレナウイルスベクターゲノムを、両方のセグメントの5’及び3’非翻訳領域(UTR)、及び好ましくは同様に遺伝子間領域(IGR)上で少なくとも必須調節因子を保持するように設計する。感染細胞での遺伝子発現に必要とされる最小限のトランス作用因子が、発現され得るオープンリーディングフレームとしてベクターゲノム中に維持されるが、これらのトランス作用因子を、ゲノムの異なる位置に置くことができ、また自然状態とは異なるプロモータの制御下に置くことができる、又は内部リボソーム侵入部位から発現することができる。4つのウイルス遺伝子(NP、L、GP、Z)の内の少なくとも1つを除去するか又は機能的に不活性化する。対象となる核酸の1つ又は複数のさらなる遺伝子又はストレッチを、アレナウイルスベクターゲノムに挿入し、4つのウイルスプロモータ(Sセグメントの5’UTR及び3’UTR、並びにLセグメントの5’UTR及び3’UTR)の内の1つの制御下で、又は内部リボソーム侵入部位から、若しくはウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIにより解読することができるプロモータから感染細胞での発現を可能にするように配置及び配向する。図1Cは、アレナウイルスGPのオープンリーディングフレーム(ORF)を、オバルブミン(OVA)又は緑色蛍光タンパク質(GFP)のORFのいずれかに置き換える1つの例を示す。
アレナウイルスベクターにおける1つ又は複数のウイルス遺伝子の「欠失」(除去又は機能的な不活性化のいずれかを表す)(本明細書中では糖タンパク質(GP)の欠失を例に取っている)のために、アレナウイルスベクターは、トランス型で欠失ウイルス遺伝子(複数可)、例えば本発明の実施例ではGPを提供する細胞で生成及び増殖しなければならない。かかる相補性細胞株(以下C細胞と称する)を、BHK−21、HEK293又はVERO(本明細書中ではBHK−21を例に取っている)等の哺乳動物細胞株に、対象となるウイルス遺伝子(複数可)の発現に関する1つ又は複数のプラスミド(相補性プラスミド、Cプラスミドと称される)をトランスフェクトすることにより生成する。Cプラスミド(複数可)(例えば図2Aを参照されたい)が、哺乳動物細胞における発現に適した1つ又は複数の発現カセット、例えばポリアデニル化シグナルを有するCMV又はEF1αプロモータ等の哺乳動物ポリメラーゼIIプロモータの制御下で生成される、アレナウイルスベクターで欠失したウイルス遺伝子(複数可)を発現する。さらに、相補性プラスミドは、哺乳動物細胞における遺伝子発現に適した発現カセット、例えば上記のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下での、哺乳動物選択マーカー、例えばピューロマイシン耐性カセットを特徴とし、又はウイルス遺伝子転写産物(複数可)の後に、内部リボソーム侵入部位、例えば脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位が続き、その後哺乳動物耐性マーカーが続く。大腸菌での産生に関して、さらにプラスミドは、細菌選択マーカー、例えばアンピシリン耐性カセットを特徴とする。
必要となるプラスミドは2種類である:
i)C細胞において細胞内でアレナウイルスの最低限のトランス作用因子を発現する2つのプラスミド(TFプラスミドと称される)(例えば図2Bを参照されたい)。ベクターは、本発明の実施例では例えばLCMVのNPタンパク質及びLタンパク質に由来する。
ii)C細胞において細胞内でアレナウイルスベクターゲノムのセグメント、例えば図1Cに記載のように修飾が設計されたセグメントを発現するプラスミド(GSプラスミドと称される)(例えば図2Cを参照されたい)。TFプラスミドは、哺乳動物細胞においてタンパク質発現に適した発現カセット、典型的には例えば好ましくはポリアデニル化シグナルと組合せたもののいずれか1つである、CMV又はEF1αプロモータ等の哺乳動物ポリメラーゼIIプロモータの制御下で各アレナウイルスベクターのNPタンパク質及びLタンパク質を発現する(図2B)。GSプラスミドはベクターの小(S)ゲノムのセグメント及び大(L)ゲノムのセグメントを発現する。典型的に、ポリメラーゼI駆動発現カセット(図2C)又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7)駆動発現カセットを使用することができ、後者は、一次転写産物のプロセシングのために3’末端リボザイムを有するのが好ましく、これにより正確な端部が得られる。T7ベースのシステムを使用する場合、C細胞におけるT7の発現が、回収プロセスにおいてTFプラスミドに類似するように構築したさらなる発現プラスミドを含むことにより、T7を提供することにより、又は安定してT7をさらに発現するようにC細胞を構築することにより与えられなければならない。
1日目:M6ウェルプレートにおいて典型的に80%のコンフルエントであるC細胞を、2つのTFプラスミドと、2つのGSプラスミドとの混合物とトランスフェクトする。これに関して、リン酸カルシウムベース、リポソームベースのプロトコル又はエレクトロポレーション等の一般的に使用される戦略のいずれかを利用することができる。
アレナウイルスベクター調製物の感染性を測定するために、C細胞を、以下で概説されるウイルス学において一般的に使用される原理に従って典型的なイムノフォーカスアッセイに使用する。
本発明はさらに、上記のように遺伝子組み換えアレナウイルスを含むワクチン及び医薬製剤に関する。他の用途でのワクチン及び医薬製剤を、当該技術分野で標準的な手法に従って調製する。
本発明はさらに、上記のように遺伝子組み換えアレナウイルスを使用するワクチン接種及び遺伝子治療の方法に関する。
i)これらに限定されないが、ウイルス(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス(RSV))、細菌(例えばマイコバクテリウム、ヘモフィルス種及び肺炎球菌種)、寄生生物(例えばプラスモジウム、アメーバ及びフィラリア)、並びにプリオン(例えば従来及び変異型のクロイツフェルト・ヤコブ病及び狂牛病を引き起こす感染性因子)により引き起こされる感染;
ii)これらに限定されないが、I型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡及び乾癬を含む自己免疫疾患;
iii)これらに限定されないが、黒色腫、前立腺癌、乳癌、肺癌及び神経芽細胞腫を含む腫瘍性疾患;
iv)これらに限定されないが、II型糖尿病、肥満症及び痛風を含む代謝性疾患;
v)これらに限定されないが、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む変性疾患;
vi)これらに限定されないが、ハンチントン病、重症複合型免疫不全症及び脂質蓄積症を含む遺伝性疾患;並びに
vii)これらに限定されないが、タバコ及びアルコール中毒を含む物質依存症。
本発明はさらに、遺伝子組み換えアレナウイルスを感染させた細胞培養物における対象となるタンパク質の発現に関する。培養細胞においてタンパク質又は対象となる核酸のストレッチ、例えば対象となる抗原の発現に使用する場合、以下の2つの手法が想定される:
i)対象となる細胞型に、1つ又は複数、例えば2つ、3つ又は4つの感染の多重度(MOI)でアレナウイルスベクター調製物を感染させ、これにより感染の直後には既に全ての細胞で対象となるタンパク質が産生される。
ii)代替的には、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンは、ウイルス駆動性のタンパク質発現レベルに関して選択することができる。その後、個々のクローンは、アレナウイルスベクターの非細胞溶解性により無限に増殖することができる。このアプローチに関係なく、その後、対象となるタンパク質(複数可)を、産生されるタンパク質(複数可)の特性に応じて、培養上清又は細胞自体のいずれかから回収(及び精製)することができる。
2:相補的に発現するウイルス遺伝子、
3:内部リボソーム侵入部位、
4:哺乳動物選択マーカー、例えばピューロマイシン耐性遺伝子、
5:ポリアデニル化シグナル、
6:アンピシリン耐性カセット、
7:複製起点、
8:ウイルストランス作用因子、例えばNP ORF、
9:ウイルストランス作用因子、例えばL ORF、
10:C細胞においてアレナウイルスゲノムのセグメントの発現を促進するプロモータ、例えばポリメラーゼIプロモータ、
11:Sセグメントの5’UTR、
12:対象となる抗原、
13:SセグメントのIGR、
14:NP遺伝子、
15:Sセグメントの3'UTR、
16:ポリメラーゼIターミネータ、
17:Lセグメントの5’UTR、
18:Z遺伝子、
19:LセグメントのIGR、
20:L遺伝子、
21:Lセグメントの3’UTR。
Claims (14)
- 感染細胞において遺伝情報を増幅及び発現する能力があるが、正常な遺伝子組み換えしていない細胞ではさらなる感染性の子孫ウイルス粒子を産生することができないゲノムを含有するように組み換えられる、感染性アレナウイルス粒子。
- 対象となるタンパク質又はペプチドをコードするさらなる核酸を含む、請求項1に記載のアレナウイルス粒子。
- 宿主遺伝子の発現を調整するさらなる核酸を含む、請求項1に記載のアレナウイルス粒子。
- 修飾ゲノムを含み、
i)4つのアレナウイルスオープンリーディングフレーム(糖タンパク質(GP)、核タンパク質(NP)、基質タンパク質Z及びRNA依存性RNAポリメラーゼL)の内の1つ又は複数を、正常細胞では複製が妨げられるが、アレナウイルスベクター感染細胞では遺伝子発現が可能なままであるように除去又は突然変異させ、
ii)1つ又は複数の対象となるタンパク質をコードする、又は宿主遺伝子発現を調整する外来リボ核酸を、4つのアレナウイルスプロモータ(Sセグメントの5’UTR及び3’UTR、並びにLセグメントの5’UTR及び3’UTR)の内の1つ又は複数の制御下で、及び/又はそれら自体により又はアレナウイルスタンパク質のオープンリーディングフレームとの融合によるリードスルーとして発現した、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、細胞RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIで解読することができる調節因子の制御下で発現し、
iii)任意で1つ又は複数の内部リボソーム侵入部位を、アレナウイルスベクター感染細胞において対象となるタンパク質の発現を高めるように導入する、請求項2又は3に記載のアレナウイルス粒子。 - 該アレナウイルスオープンリーディングフレームの糖タンパク質(GP)を除去又は突然変異させる、請求項4に記載のアレナウイルス粒子。
- 該アレナウイルスオープンリーディングフレームの糖タンパク質(GP)を除去し、1つ又は複数の対象となるタンパク質をコードする、又は宿主遺伝子発現を調整する外来リボ核酸に置き換える、請求項5に記載のアレナウイルス粒子。
- 該アレナウイルスオープンリーディングフレームの糖タンパク質(GP)を除去し、感染性生物、腫瘍又はアレルゲンに由来するペプチド抗原又はタンパク質抗原をコードする外来リボ核酸に置き換える、請求項5に記載のアレナウイルス粒子。
- 該アレナウイルスオープンリーディングフレームの糖タンパク質(GP)を除去し、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)及びミクロRNA(miRNA)から選択される外来リボ核酸に置き換える、請求項5に記載のアレナウイルス粒子。
- アレナウイルスがリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のアレナウイルス粒子。
- 呼吸器合胞体ウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原及びヒト型結核菌に由来する抗原から選択される抗原をコードする外来リボ核酸を含む、請求項9に記載のアレナウイルス粒子。
- 請求項2〜10のいずれか一項に記載のアレナウイルス粒子を含むワクチン又は又は医薬製剤。
- 患者においてウイルス、細菌、寄生生物及びプリオンによる感染を予防する方法であって、請求項2〜10のいずれか一項に記載のアレナウイルス粒子を、それを必要とする患者に治療的に有効な量投与することを含む、方法。
- 患者においてウイルス、細菌、寄生生物及びプリオンにより引き起こされる感染、自己免疫疾患、腫瘍性疾患、代謝性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、アレルギー性疾患又は物質依存症を治療する方法であって、請求項2〜10のいずれか一項に記載のアレナウイルス粒子を、それを必要とする患者に治療的に有効な量投与することを含む、方法。
- 細胞培養物において対象となるタンパク質を発現する、又は遺伝子発現を変更する方法であって、該細胞培養物に請求項2〜10のいずれか一項に記載のアレナウイルス粒子を感染させる、方法。
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