JP2014235076A

JP2014235076A - Hemolysis reagent and hemolysis method using the same

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Publication number: JP2014235076A
Application number: JP2013116613A
Authority: JP
Inventors: 植松　千宗; Chihiro Uematsu; 千宗植松; 宗郎前嶋; Muneo Maejima
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2013-06-03
Publication date: 2014-12-15
Anticipated expiration: 2033-06-03
Also published as: JP6177009B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a hemolysis reagent allowing a hemolysis process to be selectively and easily performed on a blood sample of 1 mL or more.SOLUTION: The hemolysis reagent includes: at least one kind of anion surfactant which has a hydrophilic part and a hydrophobic part, and in which the hydrophobic part is a chain hydrocarbon; and at least one kind of surfactant which has a hydrophilic part and a hydrophobic part and in which the hydrophobic part has a cyclic hydrocarbon.

Description

本発明は、血球を破壊するための試薬、並びにそれを用いる血球破壊方法及び細菌検査装置に関する。 The present invention relates to a reagent for destroying blood cells, a blood cell disruption method using the reagent, and a bacteria test apparatus.

敗血症・菌血症の診断において、本来無菌である血液から細菌（細菌あるいは真菌）等を迅速に検出することは重要である。敗血症・菌血症は、診断や適切な治療が遅れることで患者が重篤な状態になるリスクのある感染症であるためである。検体である患者の血液から検出される細菌の種を同定し、その細菌の抗生物質に対する感受性を測定することで、効果のある抗生物質の種類及びその濃度を決定することができる。つまり治療方針を立てることが可能となり、ひいては適正な治療につながる。 In diagnosis of sepsis and bacteremia, it is important to quickly detect bacteria (bacteria or fungi) from blood that is inherently sterile. This is because sepsis / bacteremia is an infectious disease at risk of a patient becoming serious due to delay in diagnosis and appropriate treatment. By identifying the species of bacteria detected from the blood of the patient as a specimen and measuring the sensitivity of the bacteria to antibiotics, the type and concentration of the effective antibiotic can be determined. In other words, it is possible to make a treatment policy, which leads to appropriate treatment.

血液を対象とした細菌検査では、まず、患者から採集した血液に関して血液培養検査を実施する。これは、血液検体で検出される細菌の濃度が、敗血症や菌血症と診断される場合であっても１０ＣＦＵ／ｍＬ程度と小さいためである。この程度の濃度では、血液中におよそ１０^９個／ｍＬの濃度で存在する赤血球やおよそ１０^７個／ｍＬの濃度で存在する白血球が邪魔をして、そのままでは細菌を検出することが困難である。そこで、８時間〜１晩程度、培養ボトル中で血液培養を行い、細菌を増殖させてから検査を行うことが一般的である。 In a blood test for blood, first, a blood culture test is performed on blood collected from a patient. This is because the concentration of bacteria detected in the blood sample is as small as about 10 CFU / mL even when sepsis or bacteremia is diagnosed. At this level of concentration, red blood cells present at a concentration of about 10 ⁹ cells / mL in the blood and white blood cells present at a concentration of about 10 ⁷ cells / mL get in the way, making it difficult to detect bacteria. is there. Therefore, it is common to perform blood culture in a culture bottle for about 8 hours to 1 night, and to test after growing bacteria.

血液培養で陽性判定がなされた検体については、塗抹検査を実施する。すなわち、存在する菌が球菌であるか又は桿菌であるかを顕微鏡にて観察し、さらにグラム染色液にて染色して、菌がグラム陽性菌であるか又はグラム陰性菌であるかを判定する。グラム染色における染色性の違いは細胞壁の構造の違いに由来し、細胞壁のペプチドグリカン層が厚く脂質が少ない細胞壁を持つ場合は紫色に染まり、グラム陽性菌と判断される。一方、ペプチドグリカン層が薄く脂質が多い細胞壁を持つ場合には朱色に染まり、グラム陰性菌と判断される。この細胞壁の構造の違いは、菌を判定する上で重要な情報であり、球菌、桿菌の判定と共に細菌検査においては不可欠のものである。 For specimens that are positively determined in blood culture, a smear test is performed. That is, it is observed with a microscope whether the bacteria present are cocci or bacilli, and further stained with a Gram stain to determine whether the bacteria are Gram-positive or Gram-negative . The difference in staining property in Gram staining is derived from the difference in the structure of the cell wall. When the cell wall has a thick peptidoglycan layer and a cell wall with little lipid, it is stained purple and is judged to be a Gram-positive bacterium. On the other hand, when the peptidoglycan layer is thin and has a cell wall rich in lipids, it is dyed vermilion and is judged to be a gram-negative bacterium. This difference in the structure of the cell wall is important information for judging bacteria, and is indispensable in the bacterial test together with the judgment of cocci and bacilli.

続いて、培養ボトルからのサンプルを培地に塗布して分離培養を行い、形成されたコロニーから菌懸濁液を調製する。この菌懸濁液を、同定検査用デバイス、あるいは薬剤感受性検査用デバイスに導入し装置内で培養することによって、存在する菌の同定及び薬剤感受性の評価を実施する。ここで、血液培養検査装置と同定・薬剤感受性検査装置は別々に独立したものを使用している。同定・薬剤感受性検査装置の同定検査用デバイスの測定結果から細菌の同定を行い、薬剤感受性検査用デバイスの測定結果からその細菌の抗生物質に対する感受性を決定している。 Subsequently, the sample from the culture bottle is applied to the medium and subjected to separation culture, and a bacterial suspension is prepared from the formed colonies. This bacterial suspension is introduced into an identification test device or a drug sensitivity test device and cultured in the apparatus to identify existing bacteria and evaluate drug sensitivity. Here, the blood culture test apparatus and the identification / drug sensitivity test apparatus are used independently. Bacteria are identified from the measurement results of the identification test device of the identification / drug sensitivity test apparatus, and the sensitivity of the bacteria to the antibiotic is determined from the measurement results of the drug sensitivity test device.

以上が、細菌検査における一般的な検査の流れである。前述したように、敗血症・菌血症においては患者が重篤な状態になることを防ぐために、細菌の種の同定や、抗生物質に対する感受性を迅速に測定することが求められている。そこで、血液培養検査において、時間がかかるコロニー育成の培養工程を省略するための研究が盛んに行われている。例えば、血液培養を行わずに、検体から直接核酸抽出を行い、その後ＰＣＲを行って、細菌の種の同定を行なう方法等が開発されている。しかし、この場合は核酸抽出の段階で細菌を破壊するため、顕微鏡で細菌の形状を観察することができない。したがって、同定結果が得られるまでは、細菌が球菌であるか又は桿菌であるか、あるいはグラム陽性菌であるか又はグラム陰性菌であるかを知ることはできない。つまり、血液検体において細菌の形状を観察したり、グラム判定を行なうためには血液培養を行うしかないのが現状である。 The above is a general inspection flow in the bacterial inspection. As described above, in sepsis and bacteremia, in order to prevent a patient from becoming serious, identification of bacterial species and rapid measurement of sensitivity to antibiotics are required. Therefore, research for omitting the time-consuming culture process for colony growth in blood culture tests has been actively conducted. For example, a method has been developed in which a nucleic acid is extracted directly from a specimen without performing blood culture, followed by PCR to identify bacterial species. However, in this case, since the bacteria are destroyed at the stage of nucleic acid extraction, the shape of the bacteria cannot be observed with a microscope. Therefore, until an identification result is obtained, it is not possible to know whether the bacterium is a cocci or a gonococcus, a gram positive bacterium, or a gram negative bacterium. That is, at present, the only way to observe the shape of bacteria in a blood sample or to perform gram determination is to perform blood culture.

血液検体において血液培養の工程が必要な理由は、上述のように、血液は細菌が元々存在しない無菌検体であり、重篤な敗血症患者でもその菌濃度は１０ＣＦＵ／ｍＬ程度と非常に小さいためである。また、血液中に存在する赤血球や白血球の濃度はそれぞれ１０^９個／ｍＬ、１０^７個／ｍＬ程度であって細菌の濃度よりも高く、血液培養によって細菌を増殖させないと赤血球や白血球が邪魔をして細菌を顕微鏡で観察できないことも血液培養が必要な理由である。 The reason why a blood culture process is necessary for a blood sample is that, as described above, blood is a sterile sample that does not originally contain bacteria, and even in severe septic patients, its bacterial concentration is as low as about 10 CFU / mL. is there. The concentration of red blood cells and white blood cells present in the blood, each ¹⁰⁹ cells / mL, 10 ⁷ cells / mL of about a was higher than the concentration of bacteria, unless grown bacteria by blood culture erythrocytes and leukocytes interferes The fact that bacteria cannot be observed with a microscope is another reason why blood culture is necessary.

細菌の観察において邪魔となる血球を破壊する方法として、界面活性剤を作用させて細胞を溶解させる手段が知られている。界面活性剤は、細胞から核酸やタンパク質を抽出する際に良く用いられる試薬である。この方法では、親水性のヘッド部分と疎水性のテール部分からなるリン脂質から構成される細胞膜の二重層に、界面活性剤が入り込むことによって二重層の流動性が増加し、細胞の内圧に耐えられなくなって細胞膜が溶解する。細胞膜を構成しているリン脂質は親水性のヘッド部分と疎水性のテール部分を持つ構造をしており、界面活性剤もリン脂質と同様に親水性ヘッド部分と疎水性のテール部分を持つ構造を有しているものが多い。 As a method for destroying blood cells that are obstructive in the observation of bacteria, a means for lysing cells by the action of a surfactant is known. A surfactant is a reagent often used for extracting nucleic acids and proteins from cells. In this method, the fluidity of the bilayer increases due to the surfactant entering the bilayer of the cell membrane composed of a phospholipid consisting of a hydrophilic head portion and a hydrophobic tail portion, and can withstand the internal pressure of the cell. It becomes impossible to dissolve the cell membrane. The phospholipid constituting the cell membrane has a structure with a hydrophilic head portion and a hydrophobic tail portion, and the surfactant has a structure with a hydrophilic head portion and a hydrophobic tail portion as well as the phospholipid. Many have

血球の代表的な成分である赤血球は、水等の低張液と混合すると浸透圧によってバーストし、細胞質が流出したゴーストセルになる。しかし、ゴーストセルにはまだ細胞膜が残っているため細菌を顕微鏡で観察するには邪魔となる。界面活性剤の濃度を高くすれば細胞膜が残らないように細胞をばらばらに破壊できると考えられるが、その場合には細菌の細胞膜も破壊されてしまうリスクがある。つまり、血球成分だけを選択的に破壊することは、従来の界面活性剤では困難であった。 Red blood cells, which are typical components of blood cells, burst with osmotic pressure when mixed with a hypotonic solution such as water, and become ghost cells from which the cytoplasm has flowed out. However, since the cell membrane still remains in the ghost cell, it becomes an obstacle to observe the bacteria with a microscope. If the concentration of the surfactant is increased, it is considered that the cells can be broken apart so that the cell membrane does not remain, but in this case, there is a risk that the bacterial cell membrane is also destroyed. That is, it was difficult to selectively destroy only the blood cell component with a conventional surfactant.

これに対し、（特許文献１）には、試料中の赤血球の細胞膜を部分的に溶解するための試薬であって、前記赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ_２Ｏであり、マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解する赤血球膜部分溶解試薬が開示されている。具体的には、第一及び第二の界面活性剤として、トリメチルステアリルアンモニウムクロライドとラウリルトリメチルアンモニウムクロライドが使用され、いずれも疎水性部分として鎖状炭化水素基を有するものである。しかし、上記の従来技術は、実際には血球成分だけを選択的に破壊することが困難であり、処理後に細菌の生育数が減少するといった問題があった。 On the other hand, Patent Document 1 discloses a reagent for partially lysing the cell membrane of red blood cells in a sample, which is a first surfactant having a predetermined dissolving power for the cell membrane of red blood cells. And a second surfactant having a weaker dissolving power than the first surfactant, the pH is 5 to 7, the osmotic pressure is 200 to 300 mOsm / kg · H ₂ O, and the malaria parasite is treated with erythrocytes An erythrocyte membrane partial lysis reagent is disclosed that partially lyses the cell membrane of erythrocytes so that the fluorescent dye can permeate while held inside. Specifically, trimethyl stearyl ammonium chloride and lauryl trimethyl ammonium chloride are used as the first and second surfactants, both of which have a chain hydrocarbon group as a hydrophobic portion. However, the above prior art has a problem in that it is actually difficult to selectively destroy only the blood cell component, and the number of bacterial growth decreases after the treatment.

特開２００６−３０４７７４号公報JP 2006-304774 A

敗血症や菌血症では、細菌濃度が１〜１０ＣＦＵ／ｍＬ程度と希薄である。したがって、血液検体から培養を行わずに細菌を顕微鏡観察するには、１ｍＬ以上の血液検体から血球を破壊した上で観察することが必要である。そこで本発明では、１ｍＬ以上の血液検体において、血球破壊処理を選択的かつ簡便に行うことができる血球破壊方法、並びにその方法に使用する試薬及び細菌検査装置を提供することを目的とする。 In sepsis and bacteremia, the bacterial concentration is as low as about 1 to 10 CFU / mL. Therefore, in order to microscopically observe bacteria without culturing from a blood sample, it is necessary to observe the blood cells after destroying them from 1 mL or more of the blood sample. Therefore, an object of the present invention is to provide a blood cell destruction method capable of selectively and simply performing a blood cell destruction treatment on a blood sample of 1 mL or more, and a reagent and a bacteria test apparatus used in the method.

上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意研究を行った結果、親水性のヘッド部分と疎水性のテール部分とを有し、テール部分が長鎖アルキル基等の鎖状炭化水素である陰イオン性の界面活性剤と、ステロイド核等の環状炭化水素を有する界面活性剤とを組み合わせて用いることにより、血球を選択的に破壊できることを見出し、発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research. As a result, they have a hydrophilic head portion and a hydrophobic tail portion, and the tail portion is a chain hydrocarbon such as a long-chain alkyl group. The inventors have found that blood cells can be selectively destroyed by using an anionic surfactant in combination with a surfactant having a cyclic hydrocarbon such as a steroid nucleus, and the invention has been completed.

すなわち、本発明の血球破壊試薬は、親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が鎖状炭化水素である少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤と、親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が環状炭化水素を有する少なくとも１種の界面活性剤と、を含むことを特徴とする。 That is, the blood cell disruption reagent of the present invention comprises at least one anionic surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part is a chain hydrocarbon, a hydrophilic part and a hydrophobic part. And a hydrophobic part comprising at least one surfactant having a cyclic hydrocarbon.

本発明の試薬を用いると、血液検体中に含まれる血球成分の細胞膜を構成している二重層を流動化させて、血球成分を選択的に破壊できる。一方、血液検体中に含まれる細菌は本発明の試薬によって破壊されない。この結果、検体中の細菌の顕微鏡観察を実施することが可能となる。また、本発明により血球成分の選択的な破壊方法が提供される。さらに、血球成分の破壊処理を自動的に実施する細菌検査装置が提供される。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。 When the reagent of the present invention is used, the blood cell component can be selectively destroyed by fluidizing the double layer constituting the cell membrane of the blood cell component contained in the blood sample. On the other hand, bacteria contained in the blood sample are not destroyed by the reagent of the present invention. As a result, microscopic observation of bacteria in the specimen can be performed. The present invention also provides a method for selectively destroying blood cell components. Furthermore, a bacteria test apparatus that automatically performs a blood cell component destruction process is provided. Problems, configurations, and effects other than those described above will be clarified by the following description of embodiments.

本発明に係る細菌検査装置の一実施形態を示す概略図である。It is the schematic which shows one Embodiment of the bacteria test apparatus which concerns on this invention. 本発明による血球破壊処理工程を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the blood cell destruction processing process by this invention. 本発明による血球破壊処理を行う前に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope before performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright field image, (b) is a differential interference image. 水により５分間処理した後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）が明視野画像、（ｂ）が微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after processing for 5 minutes, Comprising: (a) is a bright field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 本発明による血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。It is the result of having observed the blood diluted with the microscope after performing the blood cell destruction process by this invention, Comprising: (a) is a bright-field image, (b) is a differential interference image. 比較例として、疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤のみによって血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。As a comparative example, the result of observing blood diluted with a microscope after a blood cell destruction treatment using only a surfactant having a hydrophobic portion having a cyclic hydrocarbon, (a) is a bright field image, (b) is It is a differential interference image. 比較例として、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤のみによって血球破壊処理を行った後に顕微鏡で希釈した血液を観察した結果であって、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。As a comparative example, it was the result of observing blood diluted with a microscope after performing blood cell destruction treatment only with an anionic surfactant whose hydrophobic portion is a chain hydrocarbon, and (a) is a bright field image, (B) is a differential interference image.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明の血球破壊試薬は、親水性部分及び疎水性部分を有し、その疎水性部分が鎖状炭化水素である少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤と、親水性部分及び疎水性部分を有し、その疎水性部分が環状炭化水素を有する少なくとも１種の界面活性剤とを含むことを特徴とする。 The blood cell disruption reagent of the present invention comprises at least one anionic surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, the hydrophobic part being a chain hydrocarbon, and a hydrophilic part and a hydrophobic part. And having at least one surfactant having a hydrophobic portion having a cyclic hydrocarbon.

疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤としては、長鎖アルキル基等の鎖状炭化水素基を有する界面活性剤であって、脂肪酸塩等のカルボン酸型、スルホン酸型、及び硫酸エステル型等の各種界面活性剤を用いることができる。鎖状炭化水素からなる疎水性部分の炭素数は、特に限定されるものではないが、３〜２０程度であることが好ましく、６〜１８の範囲が特に好ましい。より具体的には、カルボン酸型の界面活性剤では７〜１７、スルホン酸型の界面活性剤では６〜１８、硫酸エステル型の界面活性剤では１２〜１７の範囲であると特に好ましい。そのような陰イオン性界面活性剤の例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、もしくはラウリル硫酸ナトリウム）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等を挙げることができる。本発明においては、これらの陰イオン性界面活性剤のうち、いずれか１種を用いても良いし、２種以上を併用しても良い。 The anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon is a surfactant having a chain hydrocarbon group such as a long chain alkyl group, which is a carboxylic acid type such as a fatty acid salt, a sulfonic acid type , And various surfactants such as sulfate ester type can be used. The number of carbon atoms in the hydrophobic portion composed of chain hydrocarbons is not particularly limited, but is preferably about 3 to 20, and particularly preferably in the range of 6 to 18. More specifically, it is particularly preferably 7 to 17 for carboxylic acid type surfactants, 6 to 18 for sulfonic acid type surfactants, and 12 to 17 for sulfate type surfactants. Examples of such anionic surfactants include sodium dodecyl sulfate (SDS or sodium lauryl sulfate), lithium dodecyl sulfate (LDS), and sodium N-lauroyl sarcosine. In the present invention, any one of these anionic surfactants may be used, or two or more thereof may be used in combination.

一方、疎水性部分に鎖状炭化水素基を有する界面活性剤であっても、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）や臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤は、細菌が死滅するため本発明には適さない。 On the other hand, even if it is a surfactant having a chain hydrocarbon group in a hydrophobic part, a cationic surfactant such as cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) or hexadecyltrimethylammonium bromide kills bacteria. Therefore, it is not suitable for the present invention.

そして、上記陰イオン性界面活性剤と組み合わせて用いる、疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤としては、構造中にステロイド核等の環状炭化水素を有する化合物が適用可能である。具体例として、サポニン、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）等を挙げることができる。本発明においては、これらの環状炭化水素を有する界面活性剤のうち、いずれか１種を用いても良いし、２種以上を併用しても良い。 A compound having a cyclic hydrocarbon such as a steroid nucleus in the structure is applicable as the surfactant having a hydrophobic moiety having a cyclic hydrocarbon used in combination with the anionic surfactant. Specific examples include saponin, sodium cholate, sodium deoxycholate, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-colamidopropyl) dimethyl. Ammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO). In the present invention, any one of these cyclic hydrocarbon-containing surfactants may be used, or two or more thereof may be used in combination.

上記の、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤は、細胞膜の二重層を構成しているリン脂質部分に入り込んで細胞膜を溶解させる。リン脂質は血球の細胞膜だけでなく、細菌の細胞膜にも存在するため、この陰イオン性界面活性剤の濃度を高くすると血球成分だけでなく細菌も破壊する恐れがある。一方、ステロイド核等の環状炭化水素を有する界面活性剤は、コレステロールと相互作用して細胞膜を流動化させる。コレステロールは血球成分にだけ存在するため、環状炭化水素を有する界面活性剤は細菌には作用しない。しかし、環状炭化水素を有する界面活性剤だけを用いても血球の細胞膜をばらばらに破壊することはできないため、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤を低濃度で組み合わせて用いることにより、細菌の生育に影響を与えないような濃度で血球の細胞膜を選択的に破壊することが可能になる。 The anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon enters the phospholipid part constituting the double layer of the cell membrane and dissolves the cell membrane. Since phospholipids are present not only in the cell membrane of blood cells but also in the cell membrane of bacteria, if the concentration of this anionic surfactant is increased, not only blood cell components but also bacteria may be destroyed. On the other hand, a surfactant having a cyclic hydrocarbon such as a steroid nucleus interacts with cholesterol and fluidizes the cell membrane. Since cholesterol exists only in blood cell components, surfactants with cyclic hydrocarbons do not act on bacteria. However, even if only a surfactant having a cyclic hydrocarbon is used, the cell membrane of blood cells cannot be broken apart, so an anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon is combined at a low concentration. By using it, it becomes possible to selectively destroy the cell membrane of blood cells at a concentration that does not affect the growth of bacteria.

なお、「細菌の生育に影響を与えない」という表現は、細菌を緩衝溶液に懸濁して懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な寒天培地上に展開して培養を行い、生育してきたコロニーの数から懸濁液中に含まれている細菌濃度を算出した場合に、その細菌濃度の変動が１桁以内であることを意味している。 The expression “does not affect the growth of bacteria” means that a suspension is prepared by suspending bacteria in a buffer solution, and the suspension is spread on an appropriate agar medium and cultured. This means that when the concentration of bacteria contained in the suspension is calculated from the number of colonies that have occurred, the variation in the concentration of bacteria is within one digit.

次に、本発明の血球破壊方法、及びそれを実施するための細菌検査装置について説明する。
図１に、本発明に係る細菌検査装置の一実施形態を示す。図１に示すように、本発明の細菌検査装置は、載置台１１と、採血管４２等の複数の検体容器を収容できる検体容器ラック１２と、複数のディスポーザブルピペットチップ４３を収容したチップラック１３と、複数の試薬ボトル４４を収納可能な試薬ボトルラック１４と、複数のチューブ４５を収容可能なチューブラック１５と、廃棄物を捨てるための廃棄物用容器１６と、載置台１１の一面に対向してノズルが移動自在に取り付けられ、ノズルの移動及び位置決め等を制御するための駆動制御装置及びポンプを備えたノズル機構１８と、ノズルの目標位置を駆動制御装置に指示したり、血球破壊の処理条件や生物学的試料に関する情報その他の各種情報を入力するためのコンピュータ２０を備えている。検体容器ラック１２は、従来用いられている外径１０ｍｍ程度、長さ１００ｍｍ程度の採血管４２を複数配置できるもの、チップラック１３は、従来用いられている外形３〜７ｍｍ程度、長さ２５〜８０ｍｍ程度のディスポーザブルピペットチップ４３が上向きに複数本配置できるもの、試薬ボトルラック１４は、従来用いられている外形７〜３０ｍｍ程度、長さ３０〜２００ｍｍ程度の試薬ボトル４４を上向きの状態で複数本配置できるもの、チューブラック１５は、従来用いられている外形１０ｍｍ程度、長さ５０〜１００ｍｍ程度のチューブ４５を上向きの状態で複数本配置できるものである。ノズル機構１８は、ＸＹＺステージによって、ノズルをＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させることでき、ノズルの先端はディスポーザブルピペットチップ４３が装着できる形状をしている。検体容器ラック１２、試薬ボトルラック１４及びチューブラック１５は、図示しないが温度調節機構を備えており、採血管４２、試薬ボトル４４及びチューブ４５をそれぞれ適切な温度で保管することが可能である。また、ノズル機構１８に設けられているポンプは、ディスポーザブルピペットチップ４３の内部に血液検体や試薬等の液体を吸引したり、吐出したりすることが可能である。 Next, the blood cell destruction method of the present invention and the bacteria testing apparatus for carrying out the method will be described.
FIG. 1 shows an embodiment of a bacterial test apparatus according to the present invention. As shown in FIG. 1, the bacterial test apparatus of the present invention includes a mounting table 11, a sample container rack 12 that can store a plurality of sample containers such as a blood collection tube 42, and a chip rack 13 that stores a plurality of disposable pipette tips 43. And a reagent bottle rack 14 that can store a plurality of reagent bottles 44, a tube rack 15 that can store a plurality of tubes 45, a waste container 16 for throwing away waste, and one surface of the mounting table 11. The nozzle is movably mounted, the nozzle mechanism 18 having a drive control device and a pump for controlling the movement and positioning of the nozzle, and the target position of the nozzle is instructed to the drive control device, and blood cell destruction A computer 20 is provided for inputting processing conditions and information on biological samples and other various information. The sample container rack 12 can be provided with a plurality of conventionally used blood collection tubes 42 having an outer diameter of about 10 mm and a length of about 100 mm, and the tip rack 13 has a conventionally used outer shape of about 3 to 7 mm and a length of 25 to 25 mm. A plurality of disposable pipette tips 43 of about 80 mm can be arranged upward, and the reagent bottle rack 14 has a plurality of reagent bottles 44 having an external shape of about 7 to 30 mm and a length of about 30 to 200 mm that are conventionally used. The tube rack 15 that can be arranged can arrange a plurality of conventionally used tubes 45 having an outer shape of about 10 mm and a length of about 50 to 100 mm in an upward state. The nozzle mechanism 18 can move the nozzle in the X, Y, and Z directions by an XYZ stage, and the tip of the nozzle has a shape to which the disposable pipette tip 43 can be attached. Although not shown, the sample container rack 12, the reagent bottle rack 14 and the tube rack 15 are provided with a temperature adjustment mechanism, and can store the blood collection tube 42, the reagent bottle 44 and the tube 45 at appropriate temperatures. Further, the pump provided in the nozzle mechanism 18 can suck or discharge a liquid such as a blood sample or a reagent into the disposable pipette tip 43.

図２に、上記の細菌検査装置を用いて血球破壊処理を行う際の手順を示す。まず、ステップ１１において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によりチップラック１３の上方に移動し、Ｚステージ動作によって下降してディスポーザブルピペットチップ４３をノズルの先端に装着する。ノズルの先端の外径はディスポーザブルピペットチップ４３の内径よりもわずかに大きくなるように設計されており、ノズルを上方からディスポーザブルピペットチップ４３に押し込むことによって接続を行う。次に、ステップ１２において、ノズルがＸＹＺステージ動作によって、上昇した後に試薬ラック１４の上方に移動し、その後下降してディスポーザブルピペットチップ４３の先端を血球破壊試薬に浸しノズル機構１８に接続されているポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４３内部に血球破壊試薬を吸引する。続いて、ステップ１３において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によってチューブ４５の上方に移動し、ポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４３内部に吸引した血球破壊試薬をチューブ４５の内部に導入する。次に、ステップ１４において、ＸＹＺステージの動作によりノズル機構１８のノズルを移動させてノズルの先端からディスポーザブルピペットチップ４３を脱離させる。 In FIG. 2, the procedure at the time of performing a blood cell destruction process using said bacteria test | inspection apparatus is shown. First, in step 11, the nozzle of the nozzle mechanism 18 moves above the tip rack 13 by the XYZ stage operation and descends by the Z stage operation to attach the disposable pipette tip 43 to the tip of the nozzle. The outer diameter of the tip of the nozzle is designed to be slightly larger than the inner diameter of the disposable pipette tip 43, and the connection is made by pushing the nozzle into the disposable pipette tip 43 from above. Next, in step 12, the nozzle is moved up by the XYZ stage operation and then moved above the reagent rack 14, and then lowered to immerse the tip of the disposable pipette tip 43 in the blood cell destroying reagent and connected to the nozzle mechanism 18. The pump is operated to suck the blood cell disrupting reagent into the disposable pipette tip 43. Subsequently, in step 13, the nozzle of the nozzle mechanism 18 is moved above the tube 45 by the XYZ stage operation, and the pump is operated to introduce the blood cell destruction reagent sucked into the disposable pipette tip 43 into the tube 45. Next, in step 14, the disposable pipette tip 43 is detached from the tip of the nozzle by moving the nozzle of the nozzle mechanism 18 by the operation of the XYZ stage.

次に、ステップ１５において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によりチップラック１３の上方に移動し、その後Ｚステージ動作によって下降してディスポーザブルピペットチップ４３をノズルの先端に装着する。次に、ステップ１６において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によって上昇した後、検体容器ラック１２の上方に移動し、その後下降してディスポーザブルピペットチップ４３の先端を検体に浸しノズル機構１８に接続されているポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４３内部に検体を吸引する。その後、ステップ１７において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によってチューブ４５の上方に移動し、ポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４３内部に吸引した検体をチューブ４５の内部に導入する。ポンプを動作させてチューブ４５内で検体と血球破壊試薬を混合させる。続いて、ステップ１８において、ＸＹＺステージの動作によりノズル機構１８のノズルを移動させてノズルの先端からディスポーザブルピペットチップ４３を脱離させる。 Next, in step 15, the nozzle of the nozzle mechanism 18 moves above the tip rack 13 by the XYZ stage operation, and then descends by the Z stage operation to attach the disposable pipette tip 43 to the tip of the nozzle. Next, in step 16, after the nozzle of the nozzle mechanism 18 is raised by the XYZ stage operation, the nozzle mechanism 18 moves above the specimen container rack 12, and then descends so that the tip of the disposable pipette tip 43 is immersed in the specimen and connected to the nozzle mechanism 18. The pump is operated to suck the sample into the disposable pipette tip 43. Thereafter, in step 17, the nozzle of the nozzle mechanism 18 is moved above the tube 45 by the XYZ stage operation, and the pump is operated to introduce the sample sucked into the disposable pipette tip 43 into the tube 45. The pump is operated to mix the specimen and the blood cell destruction reagent in the tube 45. Subsequently, in Step 18, the disposable pipette tip 43 is detached from the tip of the nozzle by moving the nozzle of the nozzle mechanism 18 by the operation of the XYZ stage.

次に、ステップ１９において、ノズル機構１８のノズルがＸＹＺステージ動作によりチップラック１３の上方に移動し、その後Ｚステージ動作によって下降してディスポーザブルピペットチップ４３をノズルの先端に装着する。次に、ステップ２０において、ノズル機構１８のノズルがチューブ４５の上方に移動し、その後に下降してディスポーザブルピペットチップ４３の先端をチューブ４５内の検体と血球破壊試薬の混合物に浸し、ノズル機構１８に接続されているポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４３内部に混合物を吸引する。さらにノズル機構１８のノズルをＸＹＺステージ動作によって別のチューブ４５の上方に移動し、ポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ４５内部に吸引した検体と血球破壊試薬の混合物を別のチューブ４５に回収する。次に、ステップ２１において、ＸＹＺステージ動作によりノズル機構１８のノズルを移動させてノズルの先端からディスポーザブルピペットチップ４３を脱離させる。 Next, in step 19, the nozzle of the nozzle mechanism 18 moves above the tip rack 13 by the XYZ stage operation, and then descends by the Z stage operation to attach the disposable pipette tip 43 to the tip of the nozzle. Next, in step 20, the nozzle of the nozzle mechanism 18 moves above the tube 45, and then descends so that the tip of the disposable pipette tip 43 is immersed in the mixture of the specimen and blood cell disrupting reagent in the tube 45. The pump connected to is operated to suck the mixture into the disposable pipette tip 43. Further, the nozzle of the nozzle mechanism 18 is moved above another tube 45 by the XYZ stage operation, and the pump is operated to collect the mixture of the specimen and the blood cell disrupting reagent sucked into the disposable pipette tip 45 in another tube 45. Next, in step 21, the disposable pipette tip 43 is detached from the tip of the nozzle by moving the nozzle of the nozzle mechanism 18 by the XYZ stage operation.

この後、さらに別の検体を処理する場合には、図２の手順の最初に戻り、ノズルの先端に新たなディスポーザブルピペットチップ４３を装着する。こうして、血球成分の破壊処理を自動的に実施することができる。図２のフローチャートでは、チューブに最初に血球破壊試薬を導入し、その後に検体を導入する例を示した。試薬及び検体をチューブに導入する順番はこれに限定されるものではなく、複数種類の界面活性剤を同時にではなく順番に導入したり、検体を試薬より先に導入しても良い。あるいは、試薬は予めチューブ内に分注されていても良い。 Thereafter, when another sample is to be processed, the procedure returns to the beginning of the procedure of FIG. 2, and a new disposable pipette tip 43 is attached to the tip of the nozzle. In this way, the blood cell component destruction process can be automatically performed. In the flowchart of FIG. 2, an example is shown in which a blood cell disruption reagent is first introduced into a tube and then a specimen is introduced. The order in which the reagent and specimen are introduced into the tube is not limited to this, and a plurality of types of surfactants may be introduced in order rather than simultaneously, or the specimen may be introduced prior to the reagent. Alternatively, the reagent may be dispensed in advance in the tube.

検体をチューブ４５に回収した後の工程は、従来の細菌検査の工程と同じである。つまり、細菌の同定を行ったり、細菌の形状を顕微鏡観察する等、様々な処理を実施することができる。具体的には、チューブ４５に吐出された血液検体と血球破壊試薬の混合物から核酸を抽出してＰＣＲ検査を行っても良いし、スライドグラス上に混合物を塗布してグラム染色等を実施して顕微鏡観察を行っても良い。 The process after the sample is collected in the tube 45 is the same as the process of the conventional bacteria test. That is, various processes such as identification of bacteria and observation of the shape of bacteria with a microscope can be performed. Specifically, nucleic acid may be extracted from a mixture of blood sample and blood cell destruction reagent discharged to the tube 45 and PCR may be performed, or the mixture may be applied to a slide glass and subjected to Gram staining or the like. Microscopic observation may be performed.

なお、細菌検査では検体ごとのコンタミネーションを避けるために検査に使用する器具はディスポーザブルにすることが望ましい。ピペットチップやチューブは検体ごとに取り替え、使用済みのものは廃棄物用容器１６に廃棄される。 In bacterial testing, it is desirable to make the instrument used for testing disposable so as to avoid contamination for each specimen. Pipette tips and tubes are replaced for each specimen, and used ones are discarded in the waste container 16.

血球破壊試薬と血液検体とを混合して血球を破壊するに際し、界面活性剤の濃度は、界面活性剤や細菌の種類等に応じて適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、特に、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤の濃度は、試薬と血液検体との混合物を基準として、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ：Critical Micelle Concentration）を大きく超えないように留意する。臨界ミセル濃度とは、界面活性剤の分子が水溶液中で熱力学的に安定な状態となるために、外側に親水基、内側に疎水基を向けた状態で互いに会合したミセルを形成する最低濃度のことである。例えば、ＳＤＳの臨界ミセル濃度は６ｍＭ〜８ｍＭ（０．１７重量％〜０．２３重量％）である。界面活性剤は、ミセルを形成する臨界ミセル濃度以上で、リン脂質に入り込んで細胞を溶解させる作用が強くなることが知られている。例えば、細胞溶解実験等では１重量％のＳＤＳ溶液等が用いられる。しかし、１重量％程度の濃度のＳＤＳで処理を行うことは、黄色ブドウ球菌等の生育に影響が見られるため、血球だけを選択的に破壊し、細菌の生育に影響を及ぼさないようにするという本発明の目的には適していない。一般的に、高濃度の界面活性剤で処理すると細胞溶解が起こり、血球を破壊しやすくなるが、その一方で細菌も溶解あるいは死滅する恐れがあり、界面活性剤の濃度を単純に増加させることでは血球を選択的に破壊することは困難である。一方、ＳＤＳの濃度を０．１重量％程度にまで低くすると、ＳＤＳ単独では血球を破壊することができなくなってしまう。つまり、界面活性剤の濃度がある程度高くないと血球を破壊することができなくなる。本発明では、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤と、疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤とを組み合わせることにより、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤の濃度を抑制して細菌の生育に影響を与えないようにしつつ、血球のみを選択的に破壊するものである。 When destroying blood cells by mixing a blood cell disruption reagent and a blood sample, the concentration of the surfactant can be appropriately set according to the type of surfactant or bacteria, and is not particularly limited. In particular, the concentration of the anionic surfactant whose hydrophobic portion is a chain hydrocarbon should not greatly exceed the critical micelle concentration (CMC: Critical Micelle Concentration) based on the mixture of the reagent and the blood sample. pay attention to. The critical micelle concentration is the lowest concentration that forms micelles associated with each other with the hydrophilic group on the outside and the hydrophobic group on the inside so that the surfactant molecules are thermodynamically stable in an aqueous solution. That is. For example, the critical micelle concentration of SDS is 6 mM to 8 mM (0.17 wt% to 0.23 wt%). It is known that the surfactant has a stronger action of entering the phospholipid and lysing the cells at a critical micelle concentration or higher that forms micelles. For example, in a cell lysis experiment or the like, a 1% by weight SDS solution or the like is used. However, since treatment with SDS at a concentration of about 1% by weight affects the growth of Staphylococcus aureus and the like, only blood cells are selectively destroyed so that the growth of bacteria is not affected. This is not suitable for the purpose of the present invention. In general, treatment with high concentrations of surfactants may cause cell lysis and destroy blood cells, while bacteria may also lyse or die, and simply increase the concentration of surfactant. Thus, it is difficult to selectively destroy blood cells. On the other hand, if the concentration of SDS is lowered to about 0.1% by weight, SDS alone cannot destroy blood cells. That is, blood cells cannot be destroyed unless the surfactant concentration is high to some extent. In the present invention, by combining an anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon and a surfactant whose hydrophobic part has a cyclic hydrocarbon, an anionic surfactant such as SDS can be used. Only blood cells are selectively destroyed while suppressing the concentration so as not to affect the growth of bacteria.

具体的には、陰イオン性界面活性剤としてＳＤＳもしくはＬＤＳ又はその両方を用いる場合は、その合計した濃度が血液検体との混合物中０．０５重量％以上０．５重量％以下の範囲内であれば細菌の生育に影響を与えず、環状炭化水素を有する界面活性剤と組み合わせることで血球の破壊が可能である。また、陰イオン性界面活性剤としてＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを用いる場合は、その濃度が血液検体との混合物中０．２重量％以上１．０重量％以下の範囲内であれば細菌の生育に影響を与えず、環状炭化水素を有する界面活性剤と組み合わせることで血球の破壊が可能である。 Specifically, when SDS or LDS or both are used as the anionic surfactant, the total concentration is within the range of 0.05 wt% to 0.5 wt% in the mixture with the blood sample. If there is any, it does not affect the growth of bacteria, and blood cells can be destroyed by combining with a surfactant having a cyclic hydrocarbon. Further, when N-lauroyl sarcosine sodium is used as an anionic surfactant, the growth of bacteria can be achieved if the concentration is within the range of 0.2 wt% to 1.0 wt% in the mixture with the blood sample. The blood cells can be destroyed by combining with a surfactant having a cyclic hydrocarbon without affecting.

環状炭化水素を有する界面活性剤としてサポニンを用いる場合は、その濃度は血液検体との混合物中０．５重量％以上５．０重量％以下とすることが好ましく、コール酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナトリウム又はその両方を用いる場合は、その濃度は血液検体との混合物中０．５重量％以上２．０重量％以下とすることが好ましく、ＣＨＡＰＳもしくはＣＨＡＰＳＯ又はその両方を用いる場合は、その濃度は血液検体との混合物中０．２重量％以上１．０重量％以下とすることが好ましい。濃度が上記範囲内であると、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤と組み合わせることで血球の選択的な破壊が可能となる。 When saponin is used as a surfactant having a cyclic hydrocarbon, the concentration is preferably 0.5% by weight or more and 5.0% by weight or less in a mixture with a blood sample. Sodium cholate or sodium deoxycholate When both are used, the concentration is preferably 0.5% by weight or more and 2.0% by weight or less in the mixture with the blood sample. When CHAPS or CHAPSO or both are used, the concentration is blood. The content is preferably 0.2% by weight or more and 1.0% by weight or less in the mixture with the specimen. When the concentration is within the above range, blood cells can be selectively destroyed by combining with an anionic surfactant whose hydrophobic portion is a chain hydrocarbon.

次に、実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example and a comparative example demonstrate this invention further in detail, this invention is not limited to these.

（参考例１）
血球破壊処理を行う前の血液を、生理食塩水で２０００倍に希釈し、倍率４０倍の対物レンズと倍率１０倍の接眼レンズを用いて光学顕微鏡により観察した。その結果を図３に示す。図３中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は（ａ）の画像と同じ位置を観察した微分干渉画像である。（ｂ）の微分干渉画像では透過光の光路差を利用して染色をしていないサンプルに対しても陰影をつけ立体的な画像として観察ができるため、（ａ）で観察された直径７．５ｕｍ程度の赤血球と同じ位置に立体的に赤血球を確認することができた。 (Reference Example 1)
The blood before the blood cell destruction treatment was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope using an objective lens with a magnification of 40 times and an eyepiece with a magnification of 10 times. The result is shown in FIG. In FIG. 3, (a) is a bright-field image, and (b) is a differential interference image obtained by observing the same position as the image of (a). In the differential interference image of (b), a sample that is not stained using the optical path difference of transmitted light can be shaded and observed as a three-dimensional image. Red blood cells could be confirmed three-dimensionally at the same position as about 5 μm of red blood cells.

（参考例２）
次に、血液と水を１：１９（容量比）の割合で混合し、その後、参考例１と同様に生理食塩水で希釈を行って光学顕微鏡で観察した。その結果を図４に示す。図４中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図４に示すように、水で処理することにより、血球が溶血して、細胞の内容物が流出しているゴーストセルが観察された。これらのゴーストセルが観察される状態では、細菌がゴーストセルに隠れてしまい、顕微鏡でうまく観察できない可能性がある。そのため、本発明の血球破壊試薬により赤血球をばらばらに破壊することが望ましい。 (Reference Example 2)
Next, blood and water were mixed at a ratio of 1:19 (volume ratio), and then diluted with physiological saline in the same manner as in Reference Example 1 and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 4, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 4, a ghost cell in which blood cells were hemolyzed and the contents of the cells flowed out was observed by treatment with water. In a state where these ghost cells are observed, bacteria may be hidden in the ghost cells and cannot be observed well with a microscope. Therefore, it is desirable to break apart red blood cells with the blood cell disruption reagent of the present invention.

（実施例１）
血液を、０．１重量％ＳＤＳと２重量％サポニンにより、室温で１５分間処理し、血球を破壊した。サポニンは膜透過剤として知られており、細胞膜の流動性を増加させて標識物質等を細胞膜内に導入し細胞内染色を行う際に従来用いられている試薬である。なお、上記の濃度は、界面活性剤の水溶液（血球破壊試薬）と血液検体との混合物全体を１００重量％としたときの濃度である（以下同じ）。処理した後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図５に示す。図５中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図５に示すように、処理によって血球が破壊され、血小板が確認された。血小板は大きさがおよそ１μｍ〜４μｍであり、核を持たない。このため細菌の観察の邪魔にならず、染色等で識別可能である。 Example 1
The blood was treated with 0.1 wt% SDS and 2 wt% saponin for 15 minutes at room temperature to destroy blood cells. Saponin is known as a membrane permeabilizing agent, and is a reagent that is conventionally used for increasing intracellular cell membrane fluidity and introducing a labeling substance or the like into the cell membrane for intracellular staining. The above concentration is the concentration when the entire mixture of the surfactant aqueous solution (blood cell disruption reagent) and the blood sample is 100% by weight (hereinafter the same). After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 5, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 5, blood cells were destroyed by the treatment, and platelets were confirmed. Platelets are approximately 1 to 4 μm in size and have no nuclei. Therefore, it can be identified by staining or the like without disturbing the observation of bacteria.

（実施例２）
血液と、０．２重量％ＳＤＳ及び２重量％サポニンを混合した血球破壊試薬とを体積比１：１９で混合し、５分間処理した。処理の間、チューブラックを２０℃に設定し、温度を一定とした。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図６に示す。図６中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図６に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 (Example 2)
Blood and a blood cell disruption reagent mixed with 0.2 wt% SDS and 2 wt% saponin were mixed at a volume ratio of 1:19 and treated for 5 minutes. During processing, the tube rack was set to 20 ° C. and the temperature was constant. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 6, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 6, it was confirmed that blood cells were destroyed.

（実施例３）
ＳＤＳ及びサポニンを同時ではなく、血液に対して最初に２重量％のサポニンを加えて５分間処理を行った後、０．２重量％のＳＤＳを加えてさらに５分間処理を行った。処理の間、チューブラックを２０℃に設定し、温度を一定とした。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図７に示す。図７中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図７に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 Example 3
SDS and saponin were not simultaneously, but 2% by weight of saponin was first added to the blood and treated for 5 minutes, then 0.2% by weight of SDS was added and further treated for 5 minutes. During processing, the tube rack was set to 20 ° C. and the temperature was constant. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 7, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 7, it was confirmed that blood cells were destroyed.

なお、実施例２及び３では、図示しないが温度を１０℃〜３０℃に設定しても同様の結果が得られた。このことから、血球破壊処理を行う際の温度は１０℃〜３０℃の温度範囲が好ましいことが分かった。３７℃以上に温度を上げるとタンパク質が変性して凝集しやすくなる恐れがあるため、特に１５〜２５℃程度の室温付近の温度で処理を行うことが望ましい。また、実施例２及び３の結果から、血液に対して２種類の界面活性剤を混合した状態で処理しても良いし、２種類の界面活性剤を１種類ずつ順番に加えても良いことが分かった。 In Examples 2 and 3, although not shown, the same result was obtained even when the temperature was set to 10 ° C to 30 ° C. From this, it was found that the temperature during the blood cell destruction treatment is preferably in the temperature range of 10 ° C to 30 ° C. When the temperature is raised to 37 ° C. or higher, the protein may be denatured and easily aggregated. Therefore, it is particularly desirable to perform the treatment at a temperature around room temperature of about 15 to 25 ° C. Moreover, from the results of Examples 2 and 3, it may be processed in a state where two kinds of surfactants are mixed with blood, or two kinds of surfactants may be added one by one in order. I understood.

（実施例４）
次に、３種類の界面活性剤を混合した血球破壊試薬により処理を行った例を示す。 Example 4
Next, an example in which treatment is performed with a blood cell disruption reagent in which three kinds of surfactants are mixed is shown.

予めチューブに分注した０．０５重量％ＳＤＳ、０．２５重量％ラウロイルサルコシンナトリウム及び２重量％サポニンを混合した血球破壊試薬に対して、血液を体積比１９：１で混合し、２０℃で１５分間処理を行った。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図８に示す。図８中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図８に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 Blood was mixed at a volume ratio of 19: 1 to a blood cell disruption reagent mixed with 0.05% by weight SDS, 0.25% by weight sodium lauroyl sarcosine and 2% by weight saponin previously dispensed into a tube at 20 ° C. The treatment was performed for 15 minutes. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 8, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 8, it was confirmed that blood cells were destroyed.

（実施例５）
予めチューブに分注した０．５重量％ラウロイルサルコシンナトリウム、０．１１重量％ＣＨＡＰＳＯ及び０．２５重量％デオキシコール酸ナトリウムを混合した血球破壊試薬に対して、血液を体積比１９：１で混合し、２０℃で１５分間処理を行った。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図９に示す。図９中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図９に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 (Example 5)
Blood was mixed at a volume ratio of 19: 1 to a blood cell disruption reagent mixed with 0.5% by weight sodium lauroylsarcosine sodium, 0.11% by weight CHAPSO and 0.25% by weight sodium deoxycholate previously dispensed into a tube. And treated at 20 ° C. for 15 minutes. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 9, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 9, it was confirmed that blood cells were destroyed.

実施例４及び５の結果から、疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤、及び疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤をそれぞれ複数種類用いた場合であっても、血球破壊が可能であることが明らかとなった。また、試薬を先にチューブに分注しておき、そこに検体である血液を加えて処理を行っても良いことが分かった。 From the results of Examples 4 and 5, even when anionic surfactants whose hydrophobic portions are chain hydrocarbons and surfactants whose hydrophobic portions have cyclic hydrocarbons are used, respectively. It was revealed that blood cell destruction was possible. Further, it has been found that the reagent may be dispensed into a tube first, and blood as the sample may be added thereto for the treatment.

（実施例６）
予めチューブに分注した血液に対して、１重量％ラウロイルサルコシンナトリウム及び０．４５重量ＣＨＡＰＳを混合した血球破壊試薬を体積比１：１９（血液：試薬）で混合し、室温で１５分間処理を行った。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図１０に示す。図１０中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図１０に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 (Example 6)
A blood cell disruption reagent mixed with 1% by weight sodium lauroyl sarcosine and 0.45% CHAPS is mixed at a volume ratio of 1:19 (blood: reagent) to blood previously dispensed into a tube, and treated at room temperature for 15 minutes. went. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 10, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 10, it was confirmed that blood cells were destroyed.

（実施例７）
予めチューブに分注した血液に対して、１重量％ラウロイルサルコシンナトリウム及び１重量％コール酸ナトリウムを混合した血球破壊試薬を体積比１：１９（血液：試薬）で混合し、室温で１５分間処理を行った。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図１１に示す。図１１中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図１１に示すように、血球が破壊されていることが確認された。 (Example 7)
A blood cell disruption reagent mixed with 1% by weight sodium lauroyl sarcosine and 1% by weight sodium cholate is mixed at a volume ratio of 1:19 (blood: reagent) and treated at room temperature for 15 minutes. Went. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 11, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 11, it was confirmed that blood cells were destroyed.

実施例６及び７の結果から、血液を先にチューブに分注しておき、そこに試薬を加えて処理を行っても良いことが分かった。 From the results of Examples 6 and 7, it was found that blood may be dispensed into a tube first, and a reagent may be added thereto for processing.

（比較例１）
血液と、０．９重量％ＣＨＡＰＳのみからなる試薬とを混合し、２０℃で３０分間処理した。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図１２に示す。図１２中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図１２に示すように、血球が溶血して、細胞の内容物が流出しているゴーストセルが観察され、血球をばらばらに破壊することはできなかった。 (Comparative Example 1)
Blood and a reagent consisting only of 0.9 wt% CHAPS were mixed and treated at 20 ° C. for 30 minutes. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 12, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 12, a ghost cell in which the blood cells were hemolyzed and the contents of the cells were flowing out was observed, and the blood cells could not be broken apart.

（比較例２）
血液と、０．１重量％ＳＤＳのみからなる試薬とを混合し、２５℃で３０分間処理した。処理後、生理食塩水で２０００倍に希釈し、光学顕微鏡により観察した。その結果を図１３に示す。図１３中、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は微分干渉画像である。図１３に示すように、細胞の内容物が流出したゴーストセルが観察され、血球をばらばらに破壊することはできなかった。 (Comparative Example 2)
Blood and a reagent consisting only of 0.1 wt% SDS were mixed and treated at 25 ° C. for 30 minutes. After the treatment, it was diluted 2000 times with physiological saline and observed with an optical microscope. The result is shown in FIG. In FIG. 13, (a) is a bright field image and (b) is a differential interference image. As shown in FIG. 13, ghost cells from which the contents of the cells flowed out were observed, and the blood cells could not be broken apart.

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。 In addition, this invention is not limited to above-described embodiment, Various modifications are included. For example, with respect to a part of the configuration of the embodiment, it is possible to add, delete, or replace another configuration.

１１載置台
１２検体容器ラック
１３チップラック
１４試薬ボトルラック
１５チューブラック
１６廃棄物用容器
１８ノズル機構
２０コンピュータ
４２採血管
４３ディスポーザブルピペットチップ
４４試薬ボトル
４５チューブ 11 Mounting Table 12 Sample Container Rack 13 Tip Rack 14 Reagent Bottle Rack 15 Tube Rack 16 Waste Container 18 Nozzle Mechanism 20 Computer 42 Blood Collection Tube 43 Disposable Pipette Tip 44 Reagent Bottle 45 Tube

Claims

血球を破壊する試薬であって、
親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が鎖状炭化水素である少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤と、
親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が環状炭化水素を有する少なくとも１種の界面活性剤と、
を含む前記試薬。 A reagent that destroys blood cells,
At least one anionic surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part is a chain hydrocarbon;
At least one surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part comprises a cyclic hydrocarbon;
Said reagent.

疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選択される１種以上である請求項１に記載の血球破壊試薬。 The blood cell according to claim 1, wherein the anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon is one or more selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate, lithium dodecyl sulfate and sodium N-lauroyl sarcosine. Breaking reagent.

疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤が、サポニン、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート及び３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナートからなる群から選択される１種以上である請求項１に記載の血球破壊試薬。 Surfactants with a hydrophobic moiety having a cyclic hydrocarbon are saponin, sodium cholate, sodium deoxycholate, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate and 3-[( The blood cell disruption reagent according to claim 1, wherein the reagent is one or more selected from the group consisting of (3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate.

血球を破壊する方法であって、
親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が鎖状炭化水素である少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤と、
親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が環状炭化水素を有する少なくとも１種の界面活性剤と、
血液検体と、
を混合することにより、血球を破壊する工程を含む前記方法。 A method of destroying blood cells,
At least one anionic surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part is a chain hydrocarbon;
At least one surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part comprises a cyclic hydrocarbon;
A blood sample,
The method comprising the step of destroying blood cells by mixing.

疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選択される１種以上である請求項４に記載の血球破壊方法。 The blood cell according to claim 4, wherein the anionic surfactant whose hydrophobic part is a chain hydrocarbon is at least one selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate, lithium dodecyl sulfate and sodium N-lauroyl sarcosine. Destruction method.

疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤が、サポニン、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート及び３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナートからなる群から選択される１種以上である請求項４に記載の血球破壊方法。 Surfactants with a hydrophobic moiety having a cyclic hydrocarbon are saponin, sodium cholate, sodium deoxycholate, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate and 3-[( The method of destroying blood cells according to claim 4, wherein the method is one or more selected from the group consisting of 3-coramidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate.

疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムもしくはドデシル硫酸リチウム又はその両方であり、前記陰イオン性界面活性剤の濃度が、血液検体との混合物中０．０５重量％以上０．５重量％以下である請求項５に記載の血球破壊方法。 The anionic surfactant whose hydrophobic portion is a chain hydrocarbon is sodium dodecyl sulfate or lithium dodecyl sulfate, or both, and the concentration of the anionic surfactant is 0. 0 in the mixture with the blood sample. The method for destroying blood cells according to claim 5, wherein the method is from 05% by weight to 0.5% by weight.

疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤が、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムであり、前記陰イオン性界面活性剤の濃度が、血液検体との混合物中０．２重量％以上１．０重量％以下である請求項５に記載の血球破壊方法。 The anionic surfactant whose hydrophobic portion is a chain hydrocarbon is N-lauroyl sarcosine sodium, and the concentration of the anionic surfactant is 0.2% by weight or more in a mixture with a blood sample 1 The blood cell destruction method according to claim 5, which is 0.0% by weight or less.

疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤が、サポニンであり、前記界面活性剤の濃度が、血液検体との混合物中０．５重量％以上５．０重量％以下である請求項６に記載の血球破壊方法。 The surfactant having a hydrophobic moiety having a cyclic hydrocarbon is saponin, and the concentration of the surfactant is 0.5% by weight or more and 5.0% by weight or less in a mixture with a blood sample. The blood cell destruction method as described.

疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤が、コール酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナトリウム又はその両方であり、前記界面活性剤の濃度が、血液検体との混合物中０．５重量％以上２．０重量％以下である請求項６に記載の血球破壊方法。 The surfactant having a cyclic moiety having a cyclic hydrocarbon is sodium cholate or sodium deoxycholate, or both, and the concentration of the surfactant is 0.5% by weight or more in the mixture with the blood sample. The blood cell destruction method according to claim 6, wherein the blood cell destruction method is 0% by weight or less.

疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナートもしくは３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート又はその両方であり、前記界面活性剤の濃度が、血液検体との混合物中０．２重量％以上１．０重量％以下である請求項６に記載の血球破壊方法。 A surfactant having a hydrophobic moiety having a cyclic hydrocarbon is 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate or 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio]- The blood cell according to claim 6, wherein the blood cell is 2-hydroxy-1-propanesulfonate or both, and the concentration of the surfactant is 0.2 wt% or more and 1.0 wt% or less in the mixture with the blood sample. Destruction method.

血液中の細菌を検査する細菌検査装置であって、
血液検体が入った検体容器を収容可能な検体容器ラックと、
親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が鎖状炭化水素である少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤、並びに親水性部分及び疎水性部分を有し、前記疎水性部分が環状炭化水素を有する少なくとも１種の界面活性剤を含む血球破壊試薬が入った試薬ボトルを収容可能な試薬ボトルラックと、
前記検体容器及び前記試薬ボトルのそれぞれから、血液検体及び血球破壊試薬を吸引し、別途設けられたチューブ内に吐出するためのノズル機構と、
を備える前記細菌検査装置。 A bacteria testing device for testing bacteria in blood,
A sample container rack that can accommodate a sample container containing a blood sample;
At least one anionic surfactant having a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part is a chain hydrocarbon, and a hydrophilic part and a hydrophobic part, wherein the hydrophobic part is A reagent bottle rack capable of accommodating a reagent bottle containing a blood cell disruption reagent containing at least one surfactant having a cyclic hydrocarbon;
A nozzle mechanism for aspirating a blood sample and a blood cell disrupting reagent from each of the sample container and the reagent bottle and discharging them into a separately provided tube;
The bacteria testing apparatus comprising: