JP2014212068A - Maldi mass spectrometry apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法によるイオン源を用いたＭＡＬＤＩ質量分析装置に関する。 The present invention relates to a MALDI mass spectrometer using an ion source based on a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method.
質量分析装置のイオン化法の一つとしてＭＡＬＤＩ法がよく知られている。ＭＡＬＤＩ法は、レーザ光を吸収しにくい試料やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい試料を分析するために、レーザ光を吸収し易く且つイオン化し易い物質をマトリクスとして試料に予め混合しておき、これにレーザ光を照射することで試料に含まれる化合物をイオン化する手法である。ＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析装置は、特に、分子量の大きな高分子化合物をあまり開裂させることなく分析することが可能であり、しかも検出感度が高いために微量分析にも好適であることから、近年、生命科学などの分野で広範に利用されている。 The MALDI method is well known as one of ionization methods for mass spectrometers. In the MALDI method, in order to analyze a sample that is difficult to absorb laser light or a sample that is easily damaged by laser light, such as protein, a material that easily absorbs laser light and is easily ionized is mixed with the sample as a matrix, This is a technique in which a compound contained in a sample is ionized by irradiating it with laser light. A mass spectrometer using a MALDI ion source is particularly suitable for microanalysis because it can analyze a polymer compound having a large molecular weight without cleaving so much and has high detection sensitivity. In recent years, it has been widely used in fields such as life science.
ＭＡＬＤＩ質量分析では、例えば、サンプルプレート（又はターゲットプレート）と呼ばれる金属製のプレート上に多数形成されているウェルと呼ばれる浅い椀状の凹部に、目的試料とマトリクスとが混合されたサンプル溶液が滴下され、それが乾化されることでサンプルが調製される（例えば特許文献１など参照）。或いは、凹部が全く無い上面平坦状のサンプルプレート上の規定位置にサンプル溶液が滴下され、それが乾化されることでサンプルが調製される場合もある。なお、本明細書では、凹部が全く無いサンプルプレート上でサンプル溶液が滴下される規定領域も、便宜上、ウェルと呼ぶこととする。即ち、ウェルとは、凹みの有る無しに拘わらず、サンプルプレート上でサンプルが調製される領域のことをいう。 In MALDI mass spectrometry, for example, a sample solution in which a target sample and a matrix are mixed is dropped into a shallow bowl-shaped recess called a well formed on a metal plate called a sample plate (or target plate). The sample is prepared by drying it (see, for example, Patent Document 1). Alternatively, a sample may be prepared by dripping a sample solution at a predetermined position on a flat sample plate having no recess at all and drying it. In the present specification, a defined region where a sample solution is dropped on a sample plate having no recess is also referred to as a well for convenience. That is, a well refers to a region where a sample is prepared on a sample plate regardless of whether there is a dent.
上面が平坦であるサンプルプレートが使用される場合はもちろんのこと、凹形状のウェルが形成されているサンプルプレートが使用される場合であっても、図５（ａ）に示すようにサンプルＳは上面視円形状のウェル１００の中心付近に形成されるとは限らず、図５（ｂ）に示すようにウェル１００内で中心からずれた位置に形成されることもよくある。また、サンプルＳ中の目的試料の分布は必ずしも均一ではないため、図５（ａ）に示すようにウェル１００の中心付近に同心円状にサンプルＳが形成されている場合であっても、そのサンプルＳが占める領域の中で測定に最も適した部位（以下「スイートスポット」という）が該サンプル領域の中心からずれている場合もある。 As shown in FIG. 5A, not only when a sample plate having a flat upper surface is used but also when a sample plate in which a concave well is formed is used, It is not necessarily formed in the vicinity of the center of the well 100 having a circular shape when viewed from above, and is often formed at a position shifted from the center in the well 100 as shown in FIG. Further, since the distribution of the target sample in the sample S is not necessarily uniform, even if the sample S is formed concentrically near the center of the well 100 as shown in FIG. In the region occupied by S, a site most suitable for measurement (hereinafter referred to as “sweet spot”) may be displaced from the center of the sample region.
ＭＡＬＤＩ質量分析において高感度で且つ高精度の分析を行うには、各サンプルのスイートスポットに対してレーザ光を照射し、それにより生成されたイオンを質量分析に供することが好ましい。しかしながら、上記理由により、サンプル毎にスイートスポットの位置のばらつきは大きく、また顕微鏡を通した目視観察によってスイートスポットがどこにあるのかを判別することも難しい。そこで、従来のＭＡＬＤＩ質量分析装置には、ラスタ（Raster）測定等と呼ばれる機能が搭載されている。 In order to perform highly sensitive and highly accurate analysis in MALDI mass spectrometry, it is preferable to irradiate the sweet spot of each sample with laser light and to use the ions generated thereby for mass spectrometry. However, for the above reasons, the variation in the position of the sweet spot for each sample is large, and it is difficult to determine where the sweet spot is by visual observation through a microscope. Therefore, a conventional MALDI mass spectrometer is equipped with a function called raster measurement or the like.
ラスタ測定とは、図６に示すように、１個のウェル１００中のサンプルＳ領域内で互いに異なる位置に予め設定した多数の測定点１０１のそれぞれにおいて規定回数のレーザ光照射を行って測定データを取得し、それら全ての測定データを積算することによって最終測定データを導出する測定手法である。１個のサンプル領域に対して複数の測定点１０１でそれぞれ測定を実行する際に、各測定点１０１に順次レーザ光を照射するべく、サンプルプレートを移動させる位置走査を行う。こうした位置走査の方式としてはＴＶラスタ（TV raster）方式や蛇行ラスタ（Serpentine raster）方式などが知られている。 In the raster measurement, as shown in FIG. 6, measurement data is obtained by irradiating a predetermined number of laser beams at each of a large number of measurement points 101 set in advance in different positions within the sample S region in one well 100. Is a measurement technique for deriving final measurement data by accumulating all the measurement data. When performing measurement at a plurality of measurement points 101 on one sample region, position scanning is performed to move the sample plate so that each measurement point 101 is sequentially irradiated with laser light. As such a position scanning method, a TV raster method, a serpentine raster method, and the like are known.
いずれにしてもラスタ測定を行うためには、１個のウェルに対して予めレーザ光照射の位置走査を行う対象のラスタ領域を設定する必要がある。当然のことながら、ウェル中でサンプルが存在しない部分にレーザ光を照射しても時間の無駄であることから、ラスタ領域を適切に設定することは効率的な測定を行う上で重要である。 In any case, in order to perform raster measurement, it is necessary to set a target raster region to be subjected to position scanning of laser light irradiation for one well in advance. As a matter of course, it is wasteful to irradiate a portion of the well where the sample does not exist with laser light, so that it is important to set the raster area appropriately for efficient measurement.
従来の装置では、サンプルが形成されたウェルの撮影画像をモニタ画面上に表示し、分析者がサンプルの存在する範囲を目視で判断し手動でラスタ領域を設定することができるようになっている。しかしながら、ウェルの一つ一つについて分析者がこうした作業を行うことは非常に面倒であり、作業効率も悪い。そこで、サンプルが形成されたウェルの撮影画像においてサンプルの占める領域を画像認識により自動的に抽出し、この抽出結果に基づいてラスタ領域を設定するような機能が搭載されている装置もある。例えば米国サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific）社が販売している装置にはこうした画像認識機能が搭載されている（非特許文献１参照）。また、特許文献２にもこうした機能が開示されている。 In a conventional apparatus, a photographed image of a well in which a sample is formed is displayed on a monitor screen, and an analyst can visually determine a range where the sample exists and manually set a raster area. . However, it is very troublesome for the analyst to perform such work for each well, and the work efficiency is also poor. Therefore, there is an apparatus equipped with a function for automatically extracting an area occupied by a sample in a captured image of a well in which the sample is formed by image recognition and setting a raster area based on the extraction result. For example, such an image recognition function is installed in an apparatus sold by Thermo Scientific in the US (see Non-Patent Document 1). Patent Document 2 also discloses such a function.
しかしながら、ＭＡＬＤＩ質量分析装置における従来の画像認識によるラスタ領域の設定には次のような問題がある。 However, the setting of a raster area by conventional image recognition in the MALDI mass spectrometer has the following problems.
即ち、画像認識によってサンプルが存在する領域を的確に抽出するには、サンプル結晶であるとみなせる画素の輝度やコントラストの閾値などを予め適切に設定しておく必要がある。ところが、そうした閾値の最適値はサンプルプレートの種類やマトリクスの種類などによって異なるため、それらに応じて上記閾値を個別に設定する必要があり、分析者にとっては煩雑で効率が悪かった。また、サンプルプレートの種類だけでなく、その表面の色や表面の凹凸（粗さ）などが異なるとプレート表面を撮影したときの輝度が異なるため、的確にサンプル領域を認識できるような閾値を設定すること自体がかなり困難であった。 That is, in order to accurately extract a region where a sample exists by image recognition, it is necessary to appropriately set in advance the brightness of a pixel that can be regarded as a sample crystal, a threshold value of contrast, and the like. However, the optimum threshold value varies depending on the type of the sample plate, the type of the matrix, and the like. Therefore, it is necessary to individually set the threshold value accordingly, which is complicated and inefficient for the analyst. In addition to the type of sample plate, if the surface color or surface roughness (roughness) is different, the brightness when the surface of the plate is photographed will be different, so a threshold is set so that the sample area can be recognized accurately. It was quite difficult to do.
さらにまた、サンプルの種類によっては、サンプル領域の端部又は中心に信号強度の高い部位が集中する場合があるが、画像認識だけではそうした情報は得られない。そのため、信号強度の低い部位から得られた質量分析データも積算されて最終測定データとされるため、これが最終測定データのＳ／Ｎの低下をもたらす上に、無駄な測定時間を発生させることにもなる。 Furthermore, depending on the type of sample, a portion having a high signal intensity may be concentrated at the end or center of the sample region, but such information cannot be obtained only by image recognition. For this reason, mass spectrometry data obtained from a portion having a low signal intensity is also integrated and used as final measurement data. This causes a decrease in S / N of the final measurement data, and also causes unnecessary measurement time. Also become.
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、サンプル領域を画像認識により抽出する際にその画像認識に必要な閾値などを分析者が設定する必要がなく、またマトリクスやサンプルプレートの種類が変更になった場合でも的確にサンプル領域を識別して測定を実行することができるＭＡＬＤＩ質量分析装置を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above problems, and its main purpose is that an analyst does not need to set a threshold necessary for image recognition when extracting a sample region by image recognition, It is another object of the present invention to provide a MALDI mass spectrometer capable of accurately identifying a sample region and executing measurement even when the type of a matrix or sample plate is changed.
上記課題を解決するために成された本発明は、サンプルプレート上に形成されたサンプルにレーザ光を照射して該サンプル中の成分をイオン化するマトリクス支援脱離レーザイオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源と、該イオン源により生成されたイオンを質量分析する質量分析部と、を具備するＭＡＬＤＩ質量分析装置において、
a)サンプルプレート上に形成された所定のサンプルを含む所定範囲を撮影して画像を取得する撮影部と、
b)該撮影部により得られた画像を構成する複数の画素の輝度値の情報を利用して、又は該輝度値の情報とその輝度値毎の出現度数の情報とを利用して、輝度値毎に満遍なくプリスキャン測定を実施する測定点を抽出するプリスキャン測定点抽出部と、
c)該プリスキャン測定点抽出部により抽出された複数の測定点について、それぞれレーザ光を照射し前記質量分析部により質量分析データを収集するプリスキャン測定実行制御部と、
d)前記輝度値毎に抽出された測定点に対して得られた質量分析データを用いて、その輝度値毎に、サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する可能性を示す期待値を算出する期待値算出部と、
e)該期待値算出部により求まる輝度値と期待値との関係から、サンプルが存在する又はサンプル中の試料成分が存在するとみなせる領域を識別するための輝度閾値を決定する閾値決定部と、
を備え、前記閾値決定部により決定された輝度閾値を利用して、サンプルを含む所定範囲の撮影画像から該サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する領域を識別することを特徴としている。
In order to solve the above problems, the present invention provides an ion source using a matrix-assisted desorption laser ionization (MALDI) method in which a sample formed on a sample plate is irradiated with laser light to ionize components in the sample. A MALDI mass spectrometer comprising: a mass analyzer that performs mass analysis of ions generated by the ion source;
a) a photographing unit for photographing a predetermined range including a predetermined sample formed on the sample plate and acquiring an image;
b) Using the luminance value information of a plurality of pixels constituting the image obtained by the photographing unit, or using the luminance value information and the appearance frequency information for each luminance value, A pre-scan measurement point extraction unit that extracts measurement points for pre-scan measurement uniformly every time;
c) a plurality of measurement points extracted by the pre-scan measurement point extraction unit, a pre-scan measurement execution control unit that irradiates a laser beam and collects mass analysis data by the mass analysis unit, and
d) using mass spectrometry data obtained for the measurement points extracted for each luminance value, an expectation indicating the possibility that a sample exists or a sample component in the sample exists for each luminance value. An expected value calculation unit for calculating a value;
e) a threshold value determination unit for determining a luminance threshold value for identifying a region in which a sample is present or a sample component in the sample can be regarded as present from the relationship between the luminance value obtained by the expected value calculation unit and the expected value;
And using the luminance threshold value determined by the threshold value determination unit, identifying a region where the sample exists or a sample component in the sample exists from a photographed image of a predetermined range including the sample. Yes.
上記質量分析部はイオンを質量電荷比に応じて分離する質量分離器を含むが、その質量分離器としては、飛行時間型質量分離器、イオントラップ、四重極マスフィルタなど、任意のものを用いることができる。 The mass spectrometer includes a mass separator that separates ions according to the mass-to-charge ratio. The mass separator may be any one such as a time-of-flight mass separator, ion trap, or quadrupole mass filter. Can be used.
またここで、サンプルプレート上のサンプルの形成方法は特に問わないが、広く用いられているのは目的試料とマトリクスとが混合されたサンプル溶液をプレート上にスポッティングして乾化させる方法である。 Here, the method of forming the sample on the sample plate is not particularly limited, but a widely used method is to dry the sample solution in which the target sample and the matrix are mixed by spotting on the plate.
本発明に係るＭＡＬＤＩ質量分析装置において、例えばＣＣＤカメラ等である撮影部はサンプルプレート上に形成された所定のサンプルを含む所定の範囲を撮影して画像を取得する。この「所定の範囲」は、サンプルの一部が欠けることのないように定められていればよい。得られた画像は微小な画素の集まりであるから、プリスキャン測定点抽出部は、その画像を構成する複数の画素の信号からそれぞれ輝度値を求め、採り得る輝度値の範囲を把握して輝度値毎に満遍なく、つまり輝度値の漏れがないようにプリスキャン測定を実施する測定点を抽出する。 In the MALDI mass spectrometer according to the present invention, an imaging unit such as a CCD camera, for example, captures a predetermined range including a predetermined sample formed on a sample plate and acquires an image. This “predetermined range” may be determined so that a part of the sample is not lost. Since the obtained image is a collection of minute pixels, the pre-scan measurement point extraction unit obtains luminance values from the signals of a plurality of pixels constituting the image, and grasps the range of luminance values that can be taken. The measurement points at which the pre-scan measurement is performed are extracted uniformly for each value, that is, so as not to leak the luminance value.
この測定点の抽出方法の一つとして、輝度値毎に抽出する測定点の数ｎを予め定めておき、一つの輝度値を示す多数の画素の中からｎ個の画素を任意に抽出するという作業を各輝度値について行うようにするとよい。ただし、或る輝度値を示す画素の数がｎに満たない場合もあるから、各輝度値の出現度数がｎ以下であるか否かをまず判断し、ｎ以下である場合にはその輝度値を示す画素全てをプリスキャン測定の測定点として抽出すればよい。
また測定点抽出の別の方法としては、輝度値と画素の出現数度数との関係を示す輝度値ヒストグラムを作成し、その出現度数に応じて各輝度値に対する測定点の数を決めるようにしてもよい。この場合には、或る輝度値を示す画素の数が極端に多いときにその輝度値に対する測定点の数を制限するように上限値を設定したり、逆に、或る輝度値を示す画素の数が極端に少ないときにはその輝度値を示す画素全てを測定点として抽出したりして、測定点の選択数のバランスが極端に悪くならないように適宜数を調整するとよい。
As one method of extracting the measurement points, the number n of measurement points to be extracted for each luminance value is determined in advance, and n pixels are arbitrarily extracted from a large number of pixels indicating one luminance value. The work should be performed for each luminance value. However, since the number of pixels indicating a certain luminance value may be less than n, it is first determined whether or not the appearance frequency of each luminance value is n or less. All the pixels indicating the above may be extracted as measurement points for the pre-scan measurement.
Another method for extracting measurement points is to create a luminance value histogram showing the relationship between the luminance value and the frequency of appearance of pixels, and determine the number of measurement points for each luminance value according to the frequency of appearance. Also good. In this case, when the number of pixels indicating a certain luminance value is extremely large, an upper limit value is set so as to limit the number of measurement points for the luminance value, or conversely, a pixel indicating a certain luminance value. When the number of pixels is extremely small, all the pixels indicating the luminance value may be extracted as measurement points, and the number may be adjusted as appropriate so that the balance of the number of measurement points selected does not become extremely bad.
次にプリスキャン測定実行制御部は、上述のように抽出された複数の測定点にそれぞれレーザ光を照射して質量分析部により質量分析データを収集する。例えばサンプルが存在しない部分に設定された測定点に対して質量分析を実行しても、発生するイオンは殆どない。これに対し、サンプルが存在する部分に設定された測定点に対して質量分析を実行すると、少なくともマトリクス由来のイオンが多く発生する。したがって、測定点がサンプル上にある場合とサンプル上でない場合とでは、質量分析結果が明確に異なる。そこでこのことを利用して、期待値算出部は、輝度値毎に抽出された測定点に対して得られた質量分析データを用い、その輝度値毎に、サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する可能性を示す期待値を算出する。 Next, the pre-scan measurement execution control unit irradiates each of the plurality of measurement points extracted as described above with laser light and collects mass analysis data by the mass analysis unit. For example, even if mass spectrometry is performed on a measurement point set in a portion where no sample exists, almost no ions are generated. On the other hand, when mass spectrometry is performed on a measurement point set in a portion where a sample exists, at least many ions derived from the matrix are generated. Therefore, the result of mass spectrometry is clearly different between when the measurement point is on the sample and when it is not on the sample. Therefore, using this, the expected value calculation unit uses the mass analysis data obtained for the measurement points extracted for each luminance value, and there is a sample for each luminance value or in the sample. An expected value indicating the possibility that the sample component exists is calculated.
具体的には、測定点がサンプル上にある場合とサンプル上でない場合とでは、検出されるイオンの量が明瞭に異なる。そこで期待値算出部は例えば、輝度値毎に抽出された測定点に対してそれぞれ得られた各マススペクトルデータの総イオン量をスコアとし、輝度値毎に複数の測定点におけるスコアの平均値を求めて、これをサンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する可能性を示す期待値とすればよい。 Specifically, the amount of ions detected is clearly different between when the measurement point is on the sample and when it is not on the sample. Therefore, for example, the expected value calculation unit uses the total ion amount of each mass spectrum data obtained for each measurement point extracted for each luminance value as a score, and calculates the average value of scores at a plurality of measurement points for each luminance value. What is necessary is just to obtain | require this and make this into the expected value which shows the possibility that the sample exists or the sample component in this sample exists.
上記のような期待値が大きいほど、サンプルが存在する又はサンプル中の試料成分が存在する可能性は高いといえる。そこで閾値決定部は、期待値算出部により求まる輝度値と期待値との関係から、例えば所定の許容値を超える期待値を示す輝度値やその範囲を求め、これを、サンプルが存在する又はサンプル中の試料成分が存在するとみなせる領域を識別するための輝度閾値として決定する。こうして本発明に係るＭＡＬＤＩ質量分析装置では、従来は分析者自身が設定する必要のあった輝度閾値が自動的に求まるから、この輝度閾値を利用して、サンプルを含む所定範囲の撮影画像から該サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する領域を識別することができる。 It can be said that the larger the expected value as described above, the higher the possibility that a sample exists or a sample component in the sample exists. Therefore, the threshold value determination unit obtains, for example, a luminance value indicating an expected value exceeding a predetermined allowable value or a range thereof from the relationship between the luminance value obtained by the expected value calculation unit and the expected value, and determines this as a sample or a sample. It is determined as a luminance threshold value for identifying a region in which it can be considered that a sample component is present. In this way, in the MALDI mass spectrometer according to the present invention, the brightness threshold value that has conventionally been required to be set by the analyst itself is automatically obtained. The region where the sample is present or the sample component in the sample is present can be identified.
なお、輝度値と期待値との関係は、サンプルプレートの種類が同一でマトリクスの種類も同一である場合に類似した傾向を示す。したがって、たとえ測定対象である試料が相違しても、サンプルプレートの種類が同一でマトリクスの種類も同一であれば、同じ輝度閾値を用いて充分に正確なサンプル領域の識別を行うことができる。
そこで、本発明に係るＭＡＬＤＩ質量分析装置の一実施態様として、
サンプルプレートの種類とマトリクスの種類の組み合わせに対応して前記閾値決定部により決定された輝度閾値をそれぞれ記憶しておく記憶部をさらに備え、
任意のサンプルの測定を行う際に、そのときに使用されるサンプルプレートの種類及びマトリクスの種類に対応した輝度閾値を前記記憶部から取得してサンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する領域を識別するために用いる構成とすることができる。
The relationship between the luminance value and the expected value shows a similar tendency when the sample plate type is the same and the matrix type is the same. Therefore, even if the sample to be measured is different, if the sample plate type is the same and the matrix type is the same, the sample area can be sufficiently accurately identified using the same luminance threshold.
Therefore, as one embodiment of the MALDI mass spectrometer according to the present invention,
A storage unit that stores the luminance threshold values determined by the threshold value determination unit corresponding to the combination of the type of sample plate and the type of matrix;
When measuring an arbitrary sample, the brightness threshold corresponding to the type of sample plate and matrix used at that time is obtained from the storage unit, and the sample exists or the sample component in the sample exists. It can be set as the structure used in order to identify the area | region to perform.
この構成によれば、予め使用が想定される様々なサンプルプレートとマトリクスとの組み合わせについて輝度閾値を求めておきさえすれば、分析者がどのようなサンプルプレート、どのようなマトリクスを使用しても、サンプル領域を自動的に的確に認識して無駄な測定が行われないようにラスタ測定のための領域を定めることができる。 According to this configuration, the analyst can use any sample plate and any matrix as long as the luminance threshold value is obtained in advance for combinations of various sample plates and matrices assumed to be used. The area for raster measurement can be determined so that the sample area is automatically recognized accurately and unnecessary measurement is not performed.
本発明に係るＭＡＬＤＩ質量分析装置によれば、サンプルが形成されているウェルやサンプルプレート自体を撮影した画像に対する画像認識によってサンプル領域を定める際に、従来は必要であった分析者自身による認識基準、つまりは輝度閾値の設定が不要になる。したがって、分析者の作業負担が軽減され、測定作業を効率化することができる。また、サンプルプレートの種類やマトリクスの種類が変更された場合でも、的確にサンプル領域を認識することができ、サンプルが存在しない部位を測定してしまうような無駄な測定をなくすことができる。 According to the MALDI mass spectrometer according to the present invention, when a sample region is determined by image recognition on an image obtained by photographing a well in which a sample is formed or the sample plate itself, a recognition criterion by an analyst himself that has been conventionally required. That is, it is not necessary to set the brightness threshold. Therefore, the work load on the analyst is reduced, and the measurement work can be made more efficient. Further, even when the type of the sample plate or the type of the matrix is changed, the sample region can be accurately recognized, and useless measurement that measures a site where no sample exists can be eliminated.
本発明に係るＭＡＬＤＩ質量分析装置の一実施例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳについて、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの概略構成図である。 MALDI-TOFMS, which is an embodiment of a MALDI mass spectrometer according to the present invention, will be described with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a MALDI-TOFMS according to the present embodiment.
イオンを生成するためのＭＡＬＤＩイオン源は、その上面にサンプルプレート１が載置される試料ステージ２と、レーザ光を発するレーザ照射部６と、該レーザ光を反射しつつサンプルプレート１上に形成されたサンプルＳに集光する反射鏡７と、を含む。このサンプルＳの観察像は反射鏡８を介してＣＣＤカメラ等の撮像部９に取り込まれ、撮像部９において再現されるサンプル観察像に対応した画像データが制御・処理部２０に入力される。 The MALDI ion source for generating ions is formed on the sample plate 1 while the sample stage 2 on which the sample plate 1 is placed, the laser irradiation unit 6 that emits laser light, and the laser light is reflected. And a reflecting mirror 7 for condensing the sample S. The observation image of the sample S is taken into the imaging unit 9 such as a CCD camera via the reflecting mirror 8, and image data corresponding to the sample observation image reproduced in the imaging unit 9 is input to the control / processing unit 20.
試料ステージ２はモータ等を含むステージ駆動部３により、図１中のＸ軸、Ｙ軸の二軸方向（サンプルプレート１のプレート面延展方向）にそれぞれ移動可能である。試料ステージ２と後述する質量分析部１０との間には、拡散するイオンを遮蔽するアパーチャ４と、イオンを質量分析部１０まで輸送するためのイオン輸送光学系としてのアインツェルレンズ５が配設されている。もちろん、アインツェルレンズ５以外の各種の構成のイオン輸送光学系を用いてもよい。 The sample stage 2 can be moved in the biaxial directions of the X axis and the Y axis in FIG. 1 (the plate surface extending direction of the sample plate 1) by a stage driving unit 3 including a motor or the like. Between the sample stage 2 and a mass analyzing unit 10 described later, an aperture 4 for shielding diffusing ions and an Einzel lens 5 as an ion transport optical system for transporting ions to the mass analyzing unit 10 are arranged. Has been. Of course, ion transport optical systems having various configurations other than the Einzel lens 5 may be used.
質量分析部１０は、電場の影響を受けずにイオンが自由に飛行する自由飛行空間１１と、直流電場の作用によってイオンを折返し飛行させる反射器１２と、を含むリフレクトロン型のＴＯＦＭＳであり、その飛行の終端にはイオン検出器１３が配設されている。このイオン検出器１３による検出信号は、図示しないアナログデジタル変換器でデジタルデータに変換されて制御・処理部２０へと入力される。制御・処理部２０は本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに特徴的な動作を実施するために、輝度閾値自動算出部２１、輝度閾値記憶部２２、サンプル領域認識部２３などの機能ブロックを有する。また、制御・処理部２０にはユーザインターフェイスである入力部２４や表示部２５が接続されており、予め決められた制御プログラムに従って、ステージ駆動部３、レーザ照射部６などの各部の動作を制御する機能も有する。 The mass spectrometer 10 is a reflectron type TOFMS including a free flight space 11 in which ions freely fly without being affected by an electric field, and a reflector 12 that makes the ions fly back by the action of a DC electric field. An ion detector 13 is disposed at the end of the flight. The detection signal from the ion detector 13 is converted into digital data by an analog-digital converter (not shown) and input to the control / processing unit 20. The control / processing unit 20 includes functional blocks such as a luminance threshold automatic calculation unit 21, a luminance threshold storage unit 22, and a sample region recognition unit 23 in order to perform operations characteristic of the MALDI-TOFMS of this embodiment. Further, an input unit 24 and a display unit 25 which are user interfaces are connected to the control / processing unit 20, and operations of each unit such as the stage drive unit 3 and the laser irradiation unit 6 are controlled according to a predetermined control program. It also has a function to
上述したように、サンプルプレート１の上面には多数のウェルが二次元的に配置されており、このウェルの１個１個にサンプル溶液（目的試料とマトリクスとの混合溶液）が滴下され、それが乾化されることで固形状のサンプルＳが各ウェル中に形成される。ただし、図５に示したように、サンプルＳはウェルの中心付近に形成されている場合もあれば、ウェルの中心からずれた位置に形成されている場合もある。サンプル領域認識部２３は、各ウェルにおいてサンプルＳが占める領域つまりサンプル領域を、撮像部９により取得された画像に基づいて自動的に認識するものである。従来、そうした画像認識によりサンプル領域を識別するためには、画像を構成する各画素の輝度を判定するための輝度閾値を分析者自身が設定する必要があった。それに対し、本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、輝度閾値自動算出部２１がサンプル領域認識のための輝度閾値を自動的に求める。 As described above, a large number of wells are two-dimensionally arranged on the upper surface of the sample plate 1, and a sample solution (mixed solution of a target sample and a matrix) is dropped into each well. Is dried to form a solid sample S in each well. However, as shown in FIG. 5, the sample S may be formed near the center of the well or may be formed at a position shifted from the center of the well. The sample area recognition unit 23 automatically recognizes the area occupied by the sample S in each well, that is, the sample area, based on the image acquired by the imaging unit 9. Conventionally, in order to identify a sample region by such image recognition, it has been necessary for the analyst himself to set a luminance threshold for determining the luminance of each pixel constituting the image. On the other hand, in the MALDI-TOFMS of this embodiment, the luminance threshold automatic calculation unit 21 automatically obtains the luminance threshold for sample region recognition.
以下、本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおいてサンプル領域認識のための輝度閾値を算出する際の動作及びデータ処理について、図２に示すフローチャートに従って詳述する。
輝度閾値を求める際には実際にサンプルを測定する必要があり、このときのサンプルとしては目的試料が含まれる目的サンプルを用いることも可能であるが、目的試料が浪費されることを避けるには、適宜のキャリブラント（較正用試料）を目的サンプルと同じマトリクスを用いて調製した較正用サンプルを使用するとよい。以下の説明では、この較正用サンプルを用いて輝度閾値を求める場合を例に挙げる。
Hereinafter, the operation and data processing when calculating the luminance threshold for sample area recognition in the MALDI-TOFMS of this embodiment will be described in detail with reference to the flowchart shown in FIG.
When obtaining the brightness threshold, it is necessary to actually measure the sample. As the sample at this time, it is possible to use a target sample including the target sample, but to avoid wasting the target sample. A calibration sample prepared by preparing an appropriate calibrant (calibration sample) using the same matrix as the target sample may be used. In the following description, a case where the luminance threshold value is obtained using this calibration sample is taken as an example.
分析者は、目的サンプルや較正用サンプルがそれぞれウェル中に形成されたサンプルプレート１を試料ステージ２上の所定位置にセットし、入力部２４において所定の操作を行う。この操作を受けて制御・処理部２０は、較正用サンプルが形成されているウェルが撮像部９による撮影可能位置に来るように、ステージ駆動部３を通して試料ステージ２を移動させる。目的のウェルが撮影可能位置に来ると、撮像部９は該ウェル全体の画像を取得し、その画像データを制御・処理部２０へと送る（ステップＳ１）。 The analyst sets the sample plate 1 in which the target sample and the calibration sample are respectively formed in the wells to a predetermined position on the sample stage 2 and performs a predetermined operation at the input unit 24. In response to this operation, the control / processing unit 20 moves the sample stage 2 through the stage driving unit 3 so that the well in which the calibration sample is formed comes to a position where the imaging unit 9 can shoot. When the target well comes to the imageable position, the imaging unit 9 acquires an image of the entire well and sends the image data to the control / processing unit 20 (step S1).
制御・処理部２０において輝度閾値自動算出部２１は、取得された画像を構成する画素毎に輝度値を求める。そして、求められた全ての画素の輝度値を用い、輝度値と画素の出現度数との関係を示す輝度値ヒストグラムを作成する（ステップＳ２）。この輝度値ヒストグラムは画像中に任意の輝度値を示す画素が何個存在するのかを表す。なお、当然のことながら、輝度値ヒストグラムを作成する際には、輝度値については或る中心値に対し所定の幅を持たせた輝度値範囲を設定し、該輝度値範囲に実測の輝度値が含まれる画素の数を計数して出現度数を求めるようにする。 In the control / processing unit 20, the luminance threshold value automatic calculation unit 21 obtains a luminance value for each pixel constituting the acquired image. Then, using the obtained luminance values of all the pixels, a luminance value histogram indicating the relationship between the luminance value and the frequency of appearance of the pixels is created (step S2). This luminance value histogram represents how many pixels having an arbitrary luminance value exist in the image. As a matter of course, when a luminance value histogram is created, a luminance value range having a predetermined width with respect to a certain center value is set for the luminance value, and an actually measured luminance value is set in the luminance value range. The number of pixels that contain is counted to obtain the appearance frequency.
二種類のサンプルプレート上のサンプルに対して実測された輝度値ヒストグラムを図３に示す。ここで、「C2 Plate」はサンプルプレートの表面を鏡面加工した高反射率プレートであり、一方、「No8 Plate」は一般的なステンレスプレートである。この図から、「C2 Plate」では輝度値：20から輝度値が増加するに従い度数はほぼ単調に減少しているのに対し、「No8 Plate」では輝度値：40付近に度数のピークが存在していることが分かる。このように、サンプルプレートの種類によって輝度値ヒストグラムには明らかな相違が生じる。但し、この輝度値ヒストグラムのみを見ても、サンプル領域とそうでない領域とを識別可能な輝度値の情報は得られない。 FIG. 3 shows luminance value histograms actually measured for samples on two types of sample plates. Here, “C2 Plate” is a high reflectivity plate obtained by mirror-finishing the surface of the sample plate, while “No8 Plate” is a general stainless steel plate. From this figure, the frequency decreases almost monotonously as the luminance value increases from 20 for the “C2 Plate”, whereas there is a frequency peak near the luminance value: 40 for the “No8 Plate”. I understand that Thus, a clear difference occurs in the luminance value histogram depending on the type of the sample plate. However, even if only the luminance value histogram is viewed, information on the luminance value that can distinguish the sample region from the non-existing region cannot be obtained.
続いて、輝度閾値自動算出部２１は、ステップＳ２で作成された輝度値ヒストグラムに基づいて、プリスキャン測定を実施する対象の測定点を、ウェル中で空間的にランダムに、且つ各輝度値について満遍なく抽出する（ステップＳ３）。プリスキャン測定は、輝度閾値を求めることのみを目的として、主として較正用サンプルが形成されているウェル中に定められた複数の測定点に対する測定を順次実施するものであって、そのときの測定点は目的サンプルに対する実際の測定を行う場合に比べて遙かに疎らである。 Subsequently, the luminance threshold value automatic calculation unit 21 spatially randomly selects the measurement points to be subjected to the pre-scan measurement based on the luminance value histogram created in step S2 for each luminance value. Extract evenly (step S3). The pre-scan measurement is for the purpose of obtaining the luminance threshold only, and sequentially performs measurement for a plurality of measurement points defined in the well in which the calibration sample is formed. Is much sparser than the actual measurement of the target sample.
具体的には、例えば次のようなアルゴリズムで以てプリスキャン測定の測定点を抽出することができる。
予め輝度値毎に抽出する測定点の数ｎを定めておく。例えばｎ＝10とする。このｎの値が大きいほど、最終的に求まる輝度閾値の信頼性は高まるものの、それだけ測定に時間が掛かるため、測定効率を低下させることになる。そこで、輝度閾値の信頼性と測定時間との兼ね合いで、予め適当な値を定めておくのが好ましい。そして、輝度値ヒストグラムが作成されたならば、輝度値の範囲が判明するから、その輝度値ヒストグラム中の輝度値毎にｎ個ずつ測定点を抽出する。例えば、或る輝度値の出現度数が100であるとすると、その中からｎ個だけ画素を選択して該画素の位置（アドレス）を測定点とする。このとき、サンプル上又はウェル中で或る部分に集中的に一つの輝度値に対する測定点が選択されてしまうと正確性を欠くので、できるだけ空間的に分散するように同一輝度値に対するｎ個の画素を選択するのが好ましい。
Specifically, for example, measurement points for prescan measurement can be extracted by the following algorithm.
The number n of measurement points to be extracted for each luminance value is determined in advance. For example, n = 10. As the value of n increases, the reliability of the finally obtained luminance threshold increases, but the measurement takes longer, and the measurement efficiency decreases. Therefore, it is preferable to determine an appropriate value in advance in consideration of the reliability of the luminance threshold and the measurement time. When the brightness value histogram is created, the range of brightness values is known, and therefore n measurement points are extracted for each brightness value in the brightness value histogram. For example, if the frequency of appearance of a certain luminance value is 100, only n pixels are selected from among them, and the position (address) of the pixel is set as a measurement point. At this time, if measurement points for one luminance value are selected intensively in a certain part on the sample or in the well, accuracy is lost. Therefore, n pieces of the same luminance value are distributed so as to be spatially dispersed as much as possible. It is preferable to select a pixel.
なお、画素の出現度数がｎに満たない輝度値がある場合には、その輝度値に対応している全ての画素を測定点として採用すればよい。即ち、輝度値ヒストグラム中の各輝度値について、その出現度数がｎ以下であるか否かをまず判定し、出現度数がｎ以下である輝度値については該輝度値に対応している全ての画素を測定点として採用する。一方、出現度数がｎを超えている輝度値については、該輝度値に対応している画素の中でｎ個の画素をランダムに選択して測定点として採用すればよい。 If there is a luminance value in which the frequency of appearance of pixels is less than n, all pixels corresponding to the luminance value may be adopted as measurement points. That is, for each luminance value in the luminance value histogram, it is first determined whether or not its appearance frequency is n or less. For luminance values whose appearance frequency is n or less, all pixels corresponding to the luminance value are determined. Is used as a measurement point. On the other hand, for a luminance value whose appearance frequency exceeds n, n pixels may be selected at random from the pixels corresponding to the luminance value and used as measurement points.
また、上記アルゴリズムとは異なり、輝度値毎に測定点を抽出する個数ｎを予め定めず、輝度値毎の画素の出現度数に応じて、例えば出現度数に比例した個数の測定点を抽出するようにしてもよい。一例としては、各輝度値の出現度数のｍ％、例えば１％を測定点とすることが考えられる。ただし、この場合、出現度数が極端に多い輝度値では測定点の数が多くなりすぎるので、抽出する測定点の数に上限を設定しておくとよい。また、逆に出現度数が少ない輝度値では測定点の数が少なくなりすぎる（例えば１以下となる）ので、出現度数が或る一定数以下である場合にはその輝度値に対応した全ての画素を測定点として採用する等の調整を加えるとよい。 Further, unlike the above algorithm, the number n of measurement points to be extracted for each luminance value is not determined in advance, and for example, the number of measurement points proportional to the appearance frequency is extracted according to the appearance frequency of the pixel for each luminance value. It may be. As an example, it can be considered that m%, for example, 1% of the frequency of appearance of each luminance value is used as a measurement point. However, in this case, since the number of measurement points is too large for a luminance value having an extremely high frequency of appearance, an upper limit may be set for the number of measurement points to be extracted. On the other hand, since the number of measurement points is too small (for example, 1 or less) at a luminance value with a small appearance frequency, all pixels corresponding to the luminance value when the appearance frequency is a certain number or less. Adjustments such as adopting as a measurement point should be added.
以上のようにしてプリスキャン測定の対象である測定点が決まったならば、制御・処理部２０は、較正用サンプルが形成されている上記ウェル中の測定点のうちの一つが測定可能位置に来るようにステージ駆動部３を通して試料ステージ２を移動させ（ステップＳ４）、プリスキャン測定を開始する（ステップＳ５）。即ち、レーザ照射部６を駆動してレーザ光をサンプル（又はウェル中のサンプルが存在しない部分）に照射し、質量分析部１０によりそのときに発生したイオンに対する質量分析を実行する。その質量分析により、マススペクトルデータが制御・処理部２０に入力されるので、輝度閾値自動算出部２１はその内部のメモリにマススペクトルデータを保存する（ステップＳ６）。 When the measurement point that is the target of the pre-scan measurement is determined as described above, the control / processing unit 20 determines that one of the measurement points in the well where the calibration sample is formed is at the measurable position. The sample stage 2 is moved through the stage driving unit 3 so as to come (step S4), and pre-scan measurement is started (step S5). That is, the laser irradiation unit 6 is driven to irradiate the sample with a laser beam (or a portion where no sample exists in the well), and the mass analysis unit 10 performs mass analysis on the ions generated at that time. Since mass spectrum data is input to the control / processing unit 20 by the mass analysis, the brightness threshold automatic calculation unit 21 stores the mass spectrum data in its internal memory (step S6).
或る一つの測定点に対する質量分析が終わると、抽出された全測定点の測定が終了したか否かが判定され（ステップＳ７）、未測定の測定点があれば、所定の順序に従って次の測定点が測定可能位置に来るようにステージ駆動部３を通して試料ステージ２を移動させ（ステップＳ８）、ステップＳ６へと戻る。したがって、ステップＳ６→Ｓ７→Ｓ８→Ｓ６→…という処理の繰り返しによって、ステップＳ３で抽出された全ての測定点に対する質量分析が実施され、各測定点に対するマススペクトルデータが収集される（ステップＳ７でＹｅｓ）。 When the mass spectrometry for one measurement point is completed, it is determined whether or not the measurement of all the extracted measurement points is completed (step S7). If there is an unmeasured measurement point, the next step is performed according to a predetermined order. The sample stage 2 is moved through the stage drive unit 3 so that the measurement point comes to the measurable position (step S8), and the process returns to step S6. Therefore, by repeating the process of steps S6 → S7 → S8 → S6 →..., Mass analysis is performed on all the measurement points extracted in step S3, and mass spectrum data for each measurement point is collected (in step S7). Yes).
次に輝度閾値自動算出部２１は、測定点毎にその点にサンプルが存在するか否かを評価するためのスコアとして、得られたマススペクトルデータ毎に総イオン量（イオン強度の加算値）を求める（ステップＳ９）。そして、輝度値毎に、対応する測定点について得られたスコアの平均値を求める。但し、単に平均値を計算すると、ノイズ等により異常値が含まれていたときにその影響が大きくなるため、例えばスコアの最大値と最小値とを除いて残りのスコアの平均値を計算する等の方法を採用するとよい。レーザ光がサンプルに照射されて質量分析が行われたときには、少なくともマトリクス結晶に由来するイオンが検出されるため、スコアは或る程度大きな値となる。これに対し、サンプルが存在しない部分にレーザ光が照射されたときには、つまりサンプルプレート１の表面に直接レーザ光が照射されたときには、殆どイオンが発生しないためスコアは極端に小さくなる。このため、スコアの値はその測定点にサンプルが存在しているか否かをかなり的確に反映してから、ここでは、輝度値毎に求まるスコアの平均値をその輝度値におけるサンプル存在確率（期待値）として利用する（ステップＳ１０）。 Next, the luminance threshold value automatic calculation unit 21 uses a total ion amount (added value of ion intensity) for each obtained mass spectrum data as a score for evaluating whether or not a sample exists at each measurement point. Is obtained (step S9). And the average value of the score obtained about the corresponding measurement point is calculated | required for every luminance value. However, if the average value is simply calculated, the effect increases when an abnormal value is included due to noise or the like. For example, the average value of the remaining scores is calculated excluding the maximum and minimum values of the score, etc. It is better to adopt this method. When mass analysis is performed by irradiating the sample with laser light, at least ions derived from the matrix crystal are detected, so that the score is somewhat large. On the other hand, when the laser beam is irradiated on the portion where the sample does not exist, that is, when the laser beam is directly irradiated on the surface of the sample plate 1, the score is extremely small because almost no ions are generated. For this reason, the score value reflects fairly accurately whether or not a sample is present at the measurement point, and here, the average value of the score obtained for each luminance value is calculated as the sample existence probability (expectation) for that luminance value. Value) (step S10).
そして、ステップＳ１０で求めた期待値を予め設定した許容値と比較し、期待値が許容値を超えている輝度値の範囲やその輝度値の境界値を輝度閾値として決定して、これを輝度閾値記憶部２２に保存する（ステップＳ１１）。ここで、許容値はユーザが設定可能としてもよいが、通常、装置メーカ側で予め決めておくことができる。 Then, the expected value obtained in step S10 is compared with a preset allowable value, a range of luminance values where the expected value exceeds the allowable value and a boundary value of the luminance value are determined as luminance threshold values, and this is determined as the luminance threshold value. It preserve | saves at the threshold value memory | storage part 22 (step S11). Here, the allowable value may be set by the user, but can usually be determined in advance by the device manufacturer.
図３には、上記輝度値ヒストグラムと共に、各輝度値に対応した測定点で実測されたマススペクトルデータに基づく総イオン量（つまりはスコア）も示している。この結果から、「C2 Plate」では輝度値：30において総イオン量が最大となり、輝度値が20〜80の範囲でしかイオンが検出されていないことが分かる。一方、「No8 Plate」では輝度値：100において総イオン量が最大となり、輝度値が40〜110の範囲でイオンが検出されていることが分かる。このように、サンプルプレートの種類によって高いスコアを示す輝度値が相違しており、イオンが検出される輝度値範囲も明らかに異なっている。このことから、スコア平均値である期待値に基づいて、サンプルが存在する領域としない領域とを識別するための輝度値の範囲、つまり輝度閾値を設定可能であることが分かる。図３の例では、例えば「C2 Plate」における輝度閾値を20〜80、「No8 Plate」における輝度閾値を40〜110と定めることができる。 FIG. 3 also shows the total ion amount (that is, the score) based on the mass spectrum data actually measured at the measurement point corresponding to each luminance value, together with the luminance value histogram. From this result, it can be seen that in the “C2 Plate”, the total amount of ions is maximized at a luminance value of 30, and ions are detected only in the luminance value range of 20-80. On the other hand, in “No8 Plate”, it can be seen that the total ion amount is maximum at a luminance value of 100, and ions are detected in the luminance value range of 40 to 110. Thus, the brightness value indicating a high score is different depending on the type of the sample plate, and the brightness value range in which ions are detected is also clearly different. From this, it can be seen that a luminance value range for distinguishing between a region where a sample exists and a region where a sample does not exist, that is, a luminance threshold value can be set based on an expected value which is a score average value. In the example of FIG. 3, for example, the luminance threshold value for “C2 Plate” can be set to 20 to 80, and the luminance threshold value for “No8 Plate” can be set to 40 to 110.
同一種類のサンプルプレート上で、同一種類のマトリクスが用いられたウェルでは、その輝度値ヒストグラム及び輝度値とスコアとの関係は同じ傾向を示す。そのため、或る一つのウェル及びその中に形成されたサンプルについて輝度閾値を求めておけば、その輝度閾値を、同一種類のサンプルプレート、同一種類のマトリクスが用いられる他のウェル及びサンプルについてサンプル領域を認識する際に利用することができる。そこで、例えば、上述したような手順による輝度閾値の算出に引き続いて、同じサンプルプレート上に形成された目的サンプルを測定するに際し、サンプル領域認識部２３では、その目的サンプルを撮像部９により撮影した画像を構成する各画素の輝度値を上記輝度閾値に照らして画素を選択し、その選択結果に応じて撮影画像を二値化することで、サンプル領域を示す画像を得ることができる。 In wells using the same type of matrix on the same type of sample plate, the luminance value histogram and the relationship between the luminance value and the score show the same tendency. Therefore, if a luminance threshold value is obtained for a certain well and a sample formed therein, the luminance threshold value is set for the sample region for other wells and samples using the same type of sample plate and the same type of matrix. Can be used when recognizing Therefore, for example, when measuring the target sample formed on the same sample plate following the calculation of the luminance threshold value according to the procedure as described above, the sample region recognition unit 23 takes the target sample with the imaging unit 9. An image showing a sample region can be obtained by selecting a pixel in light of the luminance threshold value of each pixel constituting the image and binarizing the captured image according to the selection result.
また、較正用サンプルと同じサンプルプレート上でなくても、同種のサンプルプレート、同種のマトリクスが用いられた別のサンプルを測定する際にも、サンプル領域認識部２３は、上記のようにして輝度閾値記憶部２２に保存されている輝度閾値を利用して、サンプル領域を認識することができる。 Even when the same kind of sample plate or another sample using the same kind of matrix is measured, the sample region recognition unit 23 does not have the luminance as described above even if it is not on the same sample plate as the calibration sample. The sample area can be recognized using the luminance threshold value stored in the threshold value storage unit 22.
また、予め各種のサンプルプレートと各種のマトリクスの組み合わせについてそれぞれ、上述した手法で輝度閾値を算出してデータベース化しておくことにより、実際にサンプルの測定を行う際には、そのときに使用されるサンプルプレートとマトリクスとに対応した輝度閾値をデータベースから引き出してサンプル領域の認識に用いることができる。 In addition, for each combination of various sample plates and various matrices, the brightness threshold value is calculated by the above-described method and stored in a database, so that it is used at the time of actual sample measurement. Luminance threshold values corresponding to the sample plate and matrix can be extracted from the database and used to recognize the sample area.
図４は、図３で説明した二種類のサンプルプレートを用いた場合のサンプルの撮影画像（左）と本実施例の手法により求まった輝度閾値を利用したサンプル領域認識結果（右）を示す写真である。ここでは、各サンプルプレートの最大スコアの20％に相当する値を許容値として輝度閾値を決めており、「C2 Plate」における輝度閾値は20〜80、「No8 Plate」における輝度閾値は70〜110である。図４中のサンプル領域認識結果では、これら輝度閾値の範囲内の輝度に対応する測定点を青点で着色して示しており、各サンプルプレートにおいてサンプル領域はほぼ正しく抽出されている。 FIG. 4 is a photograph showing a sample image (left) using the two types of sample plates described in FIG. 3 and a sample region recognition result (right) using the luminance threshold obtained by the method of this embodiment. It is. Here, the luminance threshold is determined with a value corresponding to 20% of the maximum score of each sample plate as an allowable value, the luminance threshold in the “C2 Plate” is 20 to 80, and the luminance threshold in the “No8 Plate” is 70 to 110. It is. In the sample area recognition result in FIG. 4, the measurement points corresponding to the luminance within the range of the luminance threshold are colored with blue dots, and the sample area is extracted almost correctly in each sample plate.
以上のように本実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによれば、分析者による輝度閾値の設定という面倒な作業を省きながら、任意のサンプルについて自動的にサンプル領域を的確に認識し、該サンプルが存在する範囲のみをラスタ測定して効率的にデータを収集することができる。 As described above, according to the MALDI-TOFMS according to the present embodiment, the sample area is automatically recognized accurately for an arbitrary sample while omitting the troublesome task of setting the luminance threshold by the analyst, and the sample exists. Data can be collected efficiently by raster measurement of only the area.
また、通常、マススペクトルにはマトリクス由来のイオンも観測されるが、マトリクス由来イオンの質量電荷比はほぼ既知であるから、上記ステップＳ９において総イオン量を算出する際にマトリクス由来イオンを除外するようにしてもよい。これにより、マトリクス以外の成分、つまりは試料成分由来イオンの総イオン量をスコアとすることができるから、単にサンプルが存在する領域ではなくサンプルの中で試料成分が多く存在する領域、即ちスイートスポットの領域を認識するための画素閾値を求めることもできる。 Usually, ions derived from the matrix are also observed in the mass spectrum, but since the mass-to-charge ratio of the matrix-derived ions is almost known, the matrix-derived ions are excluded when calculating the total ion amount in step S9. You may do it. As a result, since the total amount of ions other than the matrix, that is, the sample component-derived ions can be used as a score, the sample is not an area where the sample exists but an area where there are many sample components in the sample, that is, a sweet spot. A pixel threshold value for recognizing the region can also be obtained.
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。 It should be noted that the above embodiment is merely an example of the present invention, and it should be understood that modifications, additions, and modifications as appropriate within the spirit of the present invention are included in the scope of the claims of the present application.
１…サンプルプレート
２…試料ステージ
３…ステージ駆動部
４…アパーチャ
５…アインツェルレンズ
６…レーザ照射部
７、８…反射鏡
９…撮像部
１０…質量分析部
１１…自由飛行空間
１２…反射器
１３…イオン検出器
２０…制御・処理部
２１…輝度閾値自動算出部
２２…輝度閾値記憶部
２３…サンプル領域認識部
２４…入力部
２５…表示部
１００…ウェル
１０１…測定点
Ｓ…サンプル
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Sample plate 2 ... Sample stage 3 ... Stage drive part 4 ... Aperture 5 ... Einzel lens 6 ... Laser irradiation part 7, 8 ... Reflector 9 ... Imaging part 10 ... Mass analysis part 11 ... Free flight space 12 ... Reflector DESCRIPTION OF SYMBOLS 13 ... Ion detector 20 ... Control / processing part 21 ... Luminance threshold value automatic calculation part 22 ... Luminance threshold value memory | storage part 23 ... Sample area | region recognition part 24 ... Input part 25 ... Display part 100 ... Well 101 ... Measurement point S ... Sample
Claims (3)
a)サンプルプレート上に形成された所定のサンプルを含む所定範囲を撮影して画像を取得する撮影部と、
b)該撮影部により得られた画像を構成する複数の画素の輝度値の情報を利用して、又は該輝度値の情報とその輝度値毎の出現度数の情報とを利用して、輝度値毎に満遍なくプリスキャン測定を実施する測定点を抽出するプリスキャン測定点抽出部と、
c)該プリスキャン測定点抽出部により抽出された複数の測定点について、それぞれレーザ光を照射し前記質量分析部により質量分析データを収集するプリスキャン測定実行制御部と、
d)前記輝度値毎に抽出された測定点に対して得られた質量分析データを用いて、その輝度値毎に、サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する可能性を示す期待値を算出する期待値算出部と、
e)該期待値算出部により求まる輝度値と期待値との関係から、サンプルが存在する又はサンプル中の試料成分が存在するとみなせる領域を識別するための輝度閾値を決定する閾値決定部と、
を備え、前記閾値決定部により決定された輝度閾値を利用して、サンプルを含む所定範囲の撮影画像から該サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する領域を識別することを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析装置。 A sample formed on a sample plate is irradiated with laser light to ionize components in the sample, and an ion source based on a matrix-assisted desorption laser ionization (MALDI) method and ions generated by the ion source are subjected to mass spectrometry. A MALDI mass spectrometer comprising: a mass analyzer;
a) a photographing unit for photographing a predetermined range including a predetermined sample formed on the sample plate and acquiring an image;
b) Using the luminance value information of a plurality of pixels constituting the image obtained by the photographing unit, or using the luminance value information and the appearance frequency information for each luminance value, A pre-scan measurement point extraction unit that extracts measurement points for pre-scan measurement uniformly every time;
c) a plurality of measurement points extracted by the pre-scan measurement point extraction unit, a pre-scan measurement execution control unit that irradiates a laser beam and collects mass analysis data by the mass analysis unit, and
d) using mass spectrometry data obtained for the measurement points extracted for each luminance value, an expectation indicating the possibility that a sample exists or a sample component in the sample exists for each luminance value. An expected value calculation unit for calculating a value;
e) a threshold value determination unit for determining a luminance threshold value for identifying a region in which a sample is present or a sample component in the sample can be regarded as present from the relationship between the luminance value obtained by the expected value calculation unit and the expected value;
And using the luminance threshold value determined by the threshold value determination unit, identifying a region where the sample exists or a sample component in the sample exists from a photographed image of a predetermined range including the sample, MALDI mass spectrometer.
前記期待値算出部は、前記輝度値毎に抽出された測定点に対してそれぞれ得られた各マススペクトルデータの総イオン量をスコアとし、輝度値毎に複数の測定点における前記スコアの平均値を求めて前記期待値とすることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析装置。 The MALDI mass spectrometer according to claim 1,
The expected value calculation unit uses a total ion amount of each mass spectrum data obtained for each measurement point extracted for each luminance value as a score, and an average value of the scores at a plurality of measurement points for each luminance value MALDI mass spectrometer characterized in that the expected value is obtained.
サンプルプレートの種類とマトリクスの種類の組み合わせに対応して前記閾値決定部により決定された輝度閾値をそれぞれ記憶しておく記憶部をさらに備え、
任意のサンプルの測定を行う際に、そのときに使用されるサンプルプレートの種類及びマトリクスの種類に対応した輝度閾値を前記記憶部から取得して、サンプルが存在する又は該サンプル中の試料成分が存在する領域を識別するために用いることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析装置。 The MALDI mass spectrometer according to claim 1 or 2,
A storage unit that stores the luminance threshold values determined by the threshold value determination unit corresponding to the combination of the type of sample plate and the type of matrix;
When measuring an arbitrary sample, a luminance threshold value corresponding to the type of sample plate and the type of matrix used at that time is acquired from the storage unit, and the sample exists or the sample component in the sample is determined. A MALDI mass spectrometer characterized by being used for identifying an existing region.
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