JP2014209872A - Method of producing polypeptide or rna using pseudogene in escherichia coil - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、大腸菌においてポリペプチド又はRNAを生産する方法に関する。中でも特に、大腸菌のゲノムの偽遺伝子にポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインし、ポリペプチド又はRNAを生産する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a polypeptide or RNA in E. coli. In particular, the present invention relates to a method for producing a polypeptide or RNA by knocking in a DNA encoding a polypeptide or RNA into a pseudogene of the genome of E. coli.
大腸菌は世界で最も研究が進んでいる微生物の一つで、組換えタンパク質（ポリペプチド）を生産させるための宿主として頻繁に利用される。さらに、組換えタンパク質を発現させた大腸菌を用いて、有用物質生産を行うことも多くある。大腸菌を用いた有用物質生産では、糖を微生物に代謝させて生産することが一般的であるが、原材料たる糖は、安価であるなどの理由から、動植物から作られた再生可能な有機性資源、バイオマスに由来することが多い。 E. coli is one of the most studied microorganisms in the world and is frequently used as a host for producing recombinant proteins (polypeptides). In addition, useful substances are often produced using E. coli in which recombinant proteins are expressed. In the production of useful substances using Escherichia coli, it is common to produce sugar by metabolizing sugar to microorganisms. However, for the reason that sugar as a raw material is inexpensive, it is a renewable organic resource made from animals and plants. Often derived from biomass.
組換えタンパク質の発現のためには、発現させたい遺伝子の上流に適当なプロモーターを配した遺伝子カセット（プロモーター-標的遺伝子カセット）を作成し、それを何らかの方法で大腸菌に導入すれば良い。プロモーターは発現誘導剤の不要な構成型でも、何らかの刺激によって発現誘導される誘導型でもどちらでも良い。ただし、発現させたい遺伝子がコードするタンパク質が大腸菌にとって好ましくないことも多くあり、その場合、遺伝子組換え操作が著しく難しくなる。よって、誘導型プロモーターの方が操作性に優れていることが多く、一般的には好ましい。これまでに発現誘導に利用されている刺激としては、IPTG（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）添加（非特許文献１）、テトラサイクリン添加（非特許文献２）、熱ショック（非特許文献３）、低温ショック（非特許文献４）、アラビノース（非特許文献５）あるいはキシロース（非特許文献６）などの五単糖の添加が挙げられる。しかし、それぞれ以下のような欠点があることが知られていた。
１．IPTG、あるいはテトラサイクリン添加：共に価格が高いため、組換えタンパク質を発現させて、有用物質生産などに応用したい場合、コスト高につながる。
２．熱ショック、低温ショック：遺伝子組換えタンパク質を発現させて、有用物質生産などに応用したい場合、有用物質生産に至適温度があることが多く、熱ショック、低温ショックに必要な温度域と必ずしも一致するとは限らない。また、発現量がさほど高くない。
３．アラビノースあるいはキシロースなどの五単糖の添加：これら五単糖はバイオマス中に多く含まれることから安価に利用できるが、バイオマスに共存するブドウ糖によって遺伝子発現が炭素カタボライト抑制（後述、以下CCRと略す）を受ける。よって、ブドウ糖共存下では発現量が極端に下がることから、そのままでは利用が困難である。また、理想的条件下であっても、そもそも発現がさほど高くない。
In order to express the recombinant protein, a gene cassette (promoter-target gene cassette) in which an appropriate promoter is arranged upstream of the gene to be expressed is prepared and introduced into Escherichia coli by any method. The promoter may be a constitutive type that does not require an expression inducer, or an inducible type that is induced by some kind of stimulation. However, the protein encoded by the gene to be expressed is often unfavorable for E. coli, and in this case, the genetic recombination operation becomes extremely difficult. Therefore, inducible promoters are often superior in operability and are generally preferred. Examples of stimuli that have been used to induce expression so far include addition of IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) (Non-patent document 1), addition of tetracycline (Non-patent document 2), heat shock (non-patent document) Reference 3), addition of a pentose such as low temperature shock (Non-Patent Document 4), arabinose (Non-Patent Document 5) or xylose (Non-Patent Document 6) can be mentioned. However, it has been known that each has the following drawbacks.
1. Addition of IPTG or tetracycline: Both are expensive, so if you want to express the recombinant protein and apply it to the production of useful substances, the cost will be high.
2. Heat shock, low temperature shock: When expressing recombinant protein and applying it to useful substance production, etc., there is often an optimum temperature for the production of useful substance, and it is not necessarily the same as the temperature range required for heat shock and low temperature shock. Not always. Moreover, the expression level is not so high.
3. Addition of pentoses such as arabinose or xylose: Since these pentoses are contained in a large amount in biomass, they can be used at low cost. However, the expression of carbon catabolite is suppressed by glucose coexisting in biomass (hereinafter referred to as CCR). Receive. Therefore, since the expression level is extremely reduced in the presence of glucose, it is difficult to use as it is. Even under ideal conditions, the expression is not so high in the first place.
ここで、バイオマスの糖成分とCCRについて言及しておく。バイオマス由来の糖では、ブドウ糖、キシロース、アラビノースなど他種類の糖が混ざった、混合糖であることが一般的である（非特許文献７）。特に、リグノセルロース系バイオマスでは、ブドウ糖とキシロースを多く含む。しかし、大腸菌に混合糖を与えた場合、エネルギー効率の最も良いブドウ糖のみを選択的に消費し、ブドウ糖を消費し終えるまで、それ以外の糖の代謝をしないことがある。これは、CCRという分子機構が微生物に存在しているために起こる現象である（非特許文献８）。CCR機構では、ブドウ糖の存在下では、ブドウ糖以外の糖の消費に関与する遺伝子群が発現抑制される。例えば、大腸菌のlacZYAはラクトースの消費に必要な遺伝子オペロンで、それぞれβガラクトシダーゼ、βガラクトシドパーミアーゼ、ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼをコードしている。糖として、ブドウ糖とラクトースが培養液中に共存するとき、lacZYAの発現調節領域ではlacI遺伝子産物（ラクトースリプレッサー）およびcrp遺伝子産物（cAMP受容体タンパク質）が協調して、lacZYA mRNAが転写されないよう負に制御している。しかし、糖としてラクトースのみが培養液中に存在するときには、細胞内に取り込まれたラクトースが変化したアロラクトースによって、この負の制御は解除され、lacZYAのmRNAは盛んに転写される。これによって、ラクトースは大腸菌によって消費される。また、キシロース、アラビノースの消費に必要な遺伝子群も、これと同様な遺伝子発現調節を受けている（非特許文献９）。 Here, the sugar component and CCR of biomass are mentioned. Biomass-derived sugar is generally a mixed sugar in which other types of sugars such as glucose, xylose, and arabinose are mixed (Non-patent Document 7). In particular, lignocellulosic biomass contains a large amount of glucose and xylose. However, when mixed sugar is given to Escherichia coli, only the most energy-efficient glucose is selectively consumed, and other sugars may not be metabolized until the consumption of glucose is completed. This is a phenomenon that occurs because a molecular mechanism called CCR exists in microorganisms (Non-patent Document 8). In the CCR mechanism, the expression of genes involved in the consumption of sugars other than glucose is suppressed in the presence of glucose. For example, lacZYA of Escherichia coli is a gene operon required for lactose consumption and encodes β-galactosidase, β-galactoside permease, and galactoside acetyltransferase, respectively. As the sugar, when glucose and lactose coexist in the culture solution, lacI gene product (lactose repressor) is an expression regulatory region of lacZYA and crp gene products (cAMP receptor protein) in cooperation, so that lacZYA mRNA is not transferred Negative control. However, when only lactose is present in the culture medium as a sugar, this negative control is released by allolactose in which the lactose incorporated into the cells has changed, and the lacZYA mRNA is actively transcribed. Thereby, lactose is consumed by E. coli. Moreover, the gene group required for consumption of xylose and arabinose is also subjected to similar gene expression regulation (Non-patent Document 9).
なお、アラビノースを発現誘導に用いる方法に関して、araBADプロモーターを用いた遺伝子発現ではすでに、強力なT7プロモーター-T7RNAP系と組み合わせたものが発表されている（非特許文献５）。該文献においては、大腸菌B株のlacZYA遺伝子座位に、araBADプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットをノックインし、さらにptsG遺伝子を破壊した株を作成している。これによって、ブドウ糖存在下であってもアラビノース誘導的に、強力に目的遺伝子を発現させることができることを示した。しかし、この文献記載の方法には以下のような欠点がある。
１．リグノセルロース系バイオマスにアラビノースが含まれていないこともあり、リグノセルロース系バイオマスでは発現誘導できない可能性がある。なお、キシロースはアラビノースよりも一般的に豊富に存在する。
２．糖取り込みに関与するptsG遺伝子（ブドウ糖パーミアーゼをコード）を破壊しており、糖取り込み能が減少していることが予想される。よって、有用物質生産に供するには糖資化能が低すぎて、有用物質の生産性が下がる可能性がある。
３．発現させる遺伝子は依然として環状プラスミド上に存在しており、有用物質生産にはまだ不向きである。
Regarding the method of using arabinose for inducing expression, gene expression using the araBAD promoter has already been published in combination with a strong T7 promoter-T7RNAP system (Non-patent Document 5). In this document, an araBAD promoter-T7RNAP gene cassette is knocked in at the lacZYA gene locus of E. coli B strain, and a ptsG gene is further disrupted . As a result, it was shown that the target gene can be strongly expressed in an arabinose-inducible manner even in the presence of glucose. However, the method described in this document has the following drawbacks.
1. The lignocellulosic biomass may not contain arabinose, and there is a possibility that expression cannot be induced with lignocellulosic biomass. Xylose is generally present in abundant amounts more than arabinose.
2. The ptsG gene (encoding glucose permease) involved in sugar uptake is disrupted, and it is expected that the ability of sugar uptake is reduced. Therefore, the ability to assimilate the sugar is too low for use in the production of useful substances, and the productivity of useful substances may be reduced.
3. The gene to be expressed is still present on the circular plasmid and is still unsuitable for the production of useful substances.
有用物質生産を行いたい場合、どのように上記遺伝子カセットを大腸菌内に導入するかも、生産コストに直結することから重要となる。一般的に最も多く用いられるのは、環状プラスミドに上記遺伝子カセットをクローニングし、これを大腸菌に導入し、環状プラスミドのまま利用する方法である。しかし、環状プラスミドは遺伝的に不安定で、形質転換マーカーとなっている抗生物質を常時加えて、脱落しないようにする必要がある。しかし、抗生物質は価格が高いため、生産したい物質のコスト高につながる。そこで、大腸菌ゲノムに上記遺伝子カセットを導入（ノックインあるいはインテグレーションと呼ばれる）する方法も多く採られる。ノックインは、ファージ、トランスポゾン、attP-attB部位特異的組換えなどによって可能である。しかし、これらの方法では形質転換マーカーが残るなどして多重のノックインが困難、コピー数が1しかなく発現量が一般的に下がる（環状プラスミドは一般的に多コピー）、といった問題が生じる。宿主が天然に持つ相同組換え能を利用した、形質転換マーカーが残らないようなノックイン方法も知られてはいたが（非特許文献１０）、DNAをノックインすることのできる大腸菌ゲノム上の遺伝子座位が多く開発されておらず、多数遺伝子をノックインすることはできなかった。 When it is desired to produce useful substances, how the gene cassette is introduced into E. coli is important because it directly affects production costs. In general, the method most frequently used is a method in which the gene cassette is cloned into a circular plasmid, introduced into E. coli, and used as it is. However, circular plasmids are genetically unstable and it is necessary to always add antibiotics that are transformation markers so that they do not fall out. However, antibiotics are expensive, leading to high costs for the substances you want to produce. Therefore, there are many methods for introducing the gene cassette into the E. coli genome (called knock-in or integration). Knock-in can be achieved by phage, transposon, attP-attB site-specific recombination, or the like. However, in these methods, there are problems that multiple knock-ins are difficult due to the transformation marker remaining, and that the number of copies is only 1 and the expression level is generally reduced (circular plasmids are generally multi-copy). Although a knock-in method using a host's natural homologous recombination ability so that no transformation marker remains is known (Non-patent Document 10), a gene locus on the E. coli genome that can knock in DNA. Have not been developed, and many genes could not be knocked in.
以上のことから本発明者は、大腸菌の有用物質生産に有用な、バイオマスを用いた新しい遺伝子発現方法を開発することとした。 From the above, the present inventor decided to develop a new gene expression method using biomass which is useful for producing useful substances of Escherichia coli.
本発明者らは、大腸菌を用いてポリペプチド又はRNAを生産する方法において、IPTGなどの高価な発現誘導剤を用いず、さらに、ポリペプチド又はRNAをコードする標的遺伝子を環状プラスミドに乗せることなく行える方法について鋭意検討を行った。 In the method for producing a polypeptide or RNA using Escherichia coli, the present inventors do not use an expensive expression inducer such as IPTG, and further, do not place a target gene encoding the polypeptide or RNA on a circular plasmid. We have intensively studied how to do it.
まず、標的遺伝子をノックインする部位について検討を行った。ノックインすべき遺伝子座位については、大腸菌の生育速度や重要な代謝経路などに影響を及ぼさない遺伝子を多数選び、ここにマーカーを残さないようにしながら導入することを検討した。遺伝子座位の候補としては、ラクトース資化以外については大腸菌の増殖率や糖資化能に影響しないlacZYA遺伝子、ゲノム中に多数存在する偽遺伝子群が挙げられた。lacZYA遺伝子座位に異種遺伝子をノックインする方法は既知であるが（Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51:109-118）、偽遺伝子座位にノックインするアイデアは発表されていない。そこで、偽遺伝委座位にノックインする方法を検討した。候補となる偽遺伝子座位は、公知のものから選択し、形質転換マーカーを残さないノックインの方法としてラムダレッドとFLP-FRTリコンビナーゼを組合せた方法（Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51:109-118）や本発明者らが先に開発した方法（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）を採用した。 First, the site where the target gene was knocked in was examined. Regarding gene loci to be knocked in, we selected a number of genes that do not affect the growth rate of E. coli and important metabolic pathways, and considered introducing them without leaving any markers. The candidate gene loci included the lacZYA gene, which does not affect the growth rate and sugar utilization ability of E. coli except for lactose utilization, and a large number of pseudogene groups present in the genome. Although the method of knocking in a heterologous gene at the lacZYA locus is known (Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51: 109-118), the idea of knocking in at a pseudogene locus has not been published. Therefore, a method for knocking in the pseudogenetic locus was examined. Candidate pseudogene loci are selected from known ones, and lambda red and FLP-FRT recombinase are combined as a knock-in method that does not leave a transformation marker (Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51 : 109-118) and the method developed previously by the present inventors (Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44).
さらに、本発明者らは、バイオマスに含まれるキシロース又はアラビノースで誘導される発現系の開発について検討を行った。プロモーターは、xylF、araBADのプロモーターが、それぞれ、キシロース、アラビノース誘導性であることが知られている。ただし、上述のように、バイオマスに同時に含まれるブドウ糖が、xylF、araBADプロモーターからの遺伝子発現を抑制するので（CCR）、これを回避する策を講じる必要がある。本発明者はこれまでに、CCRが、mlcの優性点突然変異mlc * によって解除されることを明らかにしているので（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）、ゲノム上のmlcをmlc * に人為的に変更すれば良い。その方法は本発明者らが発表済みで（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）、任意の大腸菌株で実施可能である。これによって、ブドウ糖・キシロース共存下であっても（つまりバイオマスの存在する状況下で）、xylFプロモーターから発現誘導することができる。あるいは、ブドウ糖の取り込みから解糖の初期段階に関わる一連の遺伝子群ptsG、pgi、fbpのうちの1つの遺伝子破壊あるいは、crpの変異crp * によってもCCRは解除されることが知られているので、これらのどれかを用いても良い。 Furthermore, the present inventors examined the development of an expression system induced by xylose or arabinose contained in biomass. It is known that the promoters of xylF and araBAD are xylose and arabinose inducible, respectively. However, as described above, glucose contained in biomass simultaneously suppresses gene expression from the xylF and araBAD promoters (CCR), so it is necessary to take measures to avoid this. The present inventors have so far, CCR is, since it clear that is released by a dominant point mutation mlc * of mlc (Nakashima and Tamura J. Biosci Bioeng (2012) 114:.. 38-44), You can artificially change mlc on the genome to mlc * . The method has been published by the present inventors (Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44) and can be carried out with any Escherichia coli strain. Thus, expression can be induced from the xylF promoter even in the presence of glucose and xylose (that is, in the presence of biomass). Alternatively, it is known that CCR is also released by disruption of one of a series of genes ptsG , pgi , fbp involved in glucose uptake to early glycolysis, or crp mutation crp * Any of these may be used.
さらに、本発明者らはキシロース誘導性プロモーターやアラビノース誘導性プロモーターが強力なプロモーターではないことを鑑み、コピー数が1であっても、さらにはxylF、araBADが弱くとも、十分な遺伝子発現量を達成できるように、これらプロモーターを強力なT7プロモーター-T7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）系と組み合わせることについて検討を行った。T7プロモーターはtaatacgactcactataggg（配列番号４３）からなる配列で、大腸菌のRNAポリメラーゼによってはほどんど認識されないがT7ファージ由来のT7RNAPによって特異的に認識され、転写が開始される。ごく少量のT7RNAPで大量のRNAを転写できるとされており、転写速度も大腸菌のRNAポリメラーゼより8倍早い（Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:12250-12254）。 Furthermore, in view of the fact that xylose-inducible promoters and arabinose-inducible promoters are not strong promoters, the present inventors have a sufficient gene expression level even when the copy number is 1 and xylF and araBAD are weak. To achieve this, we investigated combining these promoters with the powerful T7 promoter- T7 RNA polymerase (T7RNAP) system. The T7 promoter is a sequence consisting of taatacgactcactataggg (SEQ ID NO: 43), which is hardly recognized by E. coli RNA polymerase, but is specifically recognized by T7 RNAP derived from T7 phage, and transcription is initiated. It is said that a large amount of RNA can be transcribed with a very small amount of T7RNAP, and the transcription rate is 8 times faster than that of E. coli RNA polymerase (Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 12250-12254 ).
上記の検討の結果、本発明者らは、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを大腸菌の偽遺伝子中にノックインすることを特徴とする方法を見出し、さらに、キシロース誘導性プロモーターをT7プロモーター-T7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）系と組み合わせること、並びに大腸菌のCCRを抑制することにより、効率的に、大量に、かつ低コストでポリペプチド又はRNAを生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of the above studies, the present inventors have found a method characterized in that a DNA encoding a polypeptide or RNA is knocked into a pseudogene of E. coli, and the xylose-inducible promoter is designated as T7 promoter- T7 RNA. By combining with a polymerase (T7RNAP) system and inhibiting CCR of Escherichia coli, it was found that a polypeptide or RNA can be efficiently produced in large quantities at low cost, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 大腸菌を用いてポリペプチド又はRNAを生産する方法であって、プロモーターと連結したポリペプチド又はRNAをコードするDNAを大腸菌のゲノム中の偽遺伝子にノックインして、ポリペプチド又はRNAを発現させることを含む方法。
[２] プロモーターがT7プロモーター、T3プロモーター及びSP6プロモーターからなる群から選択される、[１]の方法。
[３] 大腸菌のゲノム中の複数の偽遺伝子中に、複数のポリペプチド又はRNAをコードするDNAがノックインされる、[１]又は[２]の方法。
[４] 大腸菌のゲノム中の偽遺伝子中に、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAの複数コピーがノックインされる、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５] 大腸菌のゲノム中の偽遺伝子が、yabP、yafU、yafF、lfhA、lafU、ykfJ、prfH、ykfN、ykfL、insN、afuB、insX、yagB、ykgS、yagP、ykgT、ykgP、eaeH、ykgA、ykgQ、yaiX、ykiA、ylbH、ybbD、ylbI、ylbG、ylbE、xisD、exoD、peaD、renD、nmpC、aaaD、tfaD、ybcY、tfaX、ybeM、ybfG、ybfI、ybfO、ybfQ、ybfL、efeU、ymdE、oweE、aaaE、beeE、jayE、stfE、icdC、ycgH、ycgI、insZ、ycjV、ymjC、ydaW、rzpR、ydaY、ynaA、lomR、ttcC、ydbA、gapC、insP、rhsE、yncI、yddK、ydeT、yneL、yneO、ydfJ、nohQ、intK、ydfX、ydfE、intQ、arpB、yedN、intG、yedS、yeeL、yeeH、yoeG、yoeH、yeeP、yoeD、yoeF、yegZ、gatR、yehH、yehQ、mdtQ、yejO、yfaS、yfaH、yfcU、tfaS、yfdL、oweS、yfjV、ypjI、psaA、pinH、ypjC、ygeF、pbl、ygeK、ygeN、ygeO、ygeQ、yqfE、yghE、yghF、yghO、yghX、yqiG、agaW、agaA、yhcE、yrdF、yrdE、yhdW、yzgL、yrhC、yrhA、yhiL、yhiS、bcsQ、mokA、sokA、ysaC、ysaD、yibS、yibW、yibU、yicT、glvG、glvC、ilvG、yifN、yjbI、yjdQ、ytfA、cybC、intB、yjhD、yjhE、insO、insM、yjhV、yjhY、yjhZ、yjhR、yjiP、yjiT、yjiV、fhiA、glyG、insB、insD、mbhA、molR、phnE、rph、wbbL、yaiT、ybcD、ycdN、ychG、yciX、ydeU、yedN、ygaY、yghY、yhiK、yhjQ、yjgX、yjhW、ymjB、yncK、ynfP、yoeA、ypaA、ypdJ、ypjM、yqaC、ysdC、arpA、caiB、creD、cstA、dcuS、fimB、fucA、gatZ、gidB、gltL、hlyE、hybO、hyfC、insC、insK、mbhA、nfrB、tpr、waaT、xylG、yajB、ybeQ、ycfX、yciQ、yddE、ydhP、ydiM、ydjY、yfbL、yfdF、yfhD、yhfS、yhhl-3、yidP、yiiD、yjcC及びyjjMからなる群から選択される少なくとも１つの偽遺伝子である、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] 用いる大腸菌株がK-12株又はその派生株である、[５]の方法。
[７] 大腸菌のゲノム中の偽遺伝子が、ybeM又はyghXである、[５]又は[６]の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for producing a polypeptide or RNA using E. coli, wherein a polypeptide or RNA encoding a polypeptide or RNA linked to a promoter is knocked into a pseudogene in the genome of E. coli to express the polypeptide or RNA. A method comprising:
[2] The method according to [1], wherein the promoter is selected from the group consisting of T7 promoter, T3 promoter and SP6 promoter.
[3] The method according to [1] or [2], wherein DNAs encoding a plurality of polypeptides or RNAs are knocked into a plurality of pseudogenes in the genome of E. coli.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein a plurality of copies of DNA encoding a polypeptide or RNA are knocked into a pseudogene in the genome of E. coli.
[5] Pseudogenes in the genome of E. coli are yabP , yafU , yafF , lfhA , lafU , ykfJ , prfH , ykfN , ykfL , insN , afuB , insX , yagB , ykgS , yagP , ykgT , ykgT , ykgT , ykgP ykgQ, yaiX, ykiA, ylbH, ybbD, ylbI, ylbG, ylbE, xisD, exoD, peaD, renD, nmpC, aaaD, tfaD, ybcY, tfaX, ybeM, ybfG, ybfI, ybfO, ybfQ, ybfL, efeU, ymdE, oweE, aaaE, beeE, jayE, stfE, icdC, ycgH, ycgI, insZ, ycjV, ymjC, ydaW, rzpR, ydaY, ynaA, lomR, ttcC, ydbA, gapC, insP, rhsE, yncI, yddK, ydeT, yneL, yneO, ydfJ, nohQ, intK, ydfX, ydfE, intQ, arpB, yedN, intG, yedS, yeeL, yeeH, yoeG, yoeH, yeeP, yoeD, yoeF, yegZ, gatR, yehH, yehQ, mdtQ, yejO, yfaS, yfaH , yfcU , tfaS , yfdL , oweS , yfjV , ypjI , psaA , pinH , ypjC , ygeF , pbl , YgeK, ygeN, ygeO, ygeQ , yqfE, yghE, yghF, yghO, yghX, yqiG, agaW, agaA, yhcE, yrdF, yrdE, yhdW, yzgL, yrhC, yrhA, yhiL, yhiS, bcsQ, mokA, sokA, ysaC , ysaD, yibS, yibW, yibU , yicT, glvG, glvC, ilvG, yifN, yjbI, yjdQ, ytfA, cybC, intB, yjhD, yjhE, insO, insM, yjhV, yjhY, yjhZ, yjhR, yjiP, yjiT, yjiV , fhiA, glyG, insB, insD , mbhA, molR, phnE, rph, wbbL, yaiT, ybcD, ycdN, ychG, yciX, ydeU, yedN, ygaY, yghY, yhiK, yhjQ, yjgX, yjhW, ymjB, yncK, ynfP , yoeA, ypaA, ypdJ, ypjM , yqaC, ysdC, arpA, caiB, creD, cstA, dcuS, fimB, fucA, gatZ, gidB, gltL, hlyE, hybO, hyfC, insC, insK, mbhA, nfrB, tpr, waaT , xylG, yajB, ybeQ, ycfX , yciQ, yddE, ydhP, ydiM, ydjY, yfbL, yfdF yfhD, yhfS, yhhl-3, yidP, yiiD, at least one of pseudogenes is selected from the group consisting of yjcC and YjjM, any method of [1] to [4].
[6] The method of [5], wherein the Escherichia coli strain used is K-12 strain or a derivative thereof.
[7] The method according to [5] or [6], wherein the pseudogene in the genome of E. coli is ybeM or yghX .
[８] さらに、キシロース誘導性プロモーター若しくはアラビノース誘導性プロモーターとT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ若しくはSP6 RNAポリメラーゼを連結したDNAを大腸菌のゲノム中に導入し、キシロース又はアラビノースによりT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ若しくはSP6 RNAポリメラーゼの発現を誘導し、T7 RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ若しくはSP6 RNAポリメラーゼをポリペプチド又はRNAに連結したT7プロモーター、T3プロモーター又はSP6プロモーターに作動させることを含む、[２]〜[７]のいずれかの方法。
[９] T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ若しくはSP6 RNAポリメラーゼを連結したDNAを大腸菌のゲノム中のlacZYA遺伝子又は偽遺伝子中に導入する、[８]の方法。
[１０] プロモーターと連結したポリペプチド又はRNAをコードするDNAの両側に、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入しようとする偽遺伝子の部分DNA配列に相同性を有する相同組換え用アームとなるDNA断片を連結した、プロモーターと連結したポリペプチド又はRNAをコードするDNAを大腸菌のゲノム中の偽遺伝子中に導入するための遺伝子カセット。
[１１] プロモーターがT7プロモーター、T3プロモーター及びSP6プロモーターからなる群から選択される、[１０]の遺伝子カセット。
[１２] ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを複数コピー含む、[１０]又は[１１]の遺伝子カセット。
[8] Additionally, xylose inducible promoter or the arabinose inducible promoter and T7 RNA polymerase, T3 an RNA polymerase or SP6 DNA linked to RNA polymerase introduced into the genome of E. coli, xylose or T7 RNA polymerase by arabinose, T3 RNA polymerase Alternatively, the expression of SP6 RNA polymerase is induced, and T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase or SP6 RNA polymerase is operated on a T7 promoter, T3 promoter or SP6 promoter linked to a polypeptide or RNA [2] to [7 ] One of the methods.
[9] The method according to [8], wherein DNA ligated with T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, or SP6 RNA polymerase is introduced into a lacZYA gene or pseudogene in the genome of E. coli.
[10] Arms for homologous recombination that have homology to the partial DNA sequence of the pseudogene to be introduced into the DNA encoding the polypeptide or RNA on both sides of the DNA encoding the polypeptide or RNA linked to the promoter A gene cassette for introducing a DNA encoding a polypeptide or RNA linked to a promoter linked to a DNA fragment into a pseudogene in the genome of E. coli.
[11] The gene cassette according to [10], wherein the promoter is selected from the group consisting of T7 promoter, T3 promoter and SP6 promoter.
[12] The gene cassette according to [10] or [11], comprising a plurality of copies of DNA encoding a polypeptide or RNA.
[１３] 大腸菌のゲノム中の偽遺伝子が、yabP、yafU、yafF、lfhA、lafU、ykfJ、prfH、ykfN、ykfL、insN、afuB、insX、yagB、ykgS、yagP、ykgT、ykgP、eaeH、ykgA、ykgQ、yaiX、ykiA、ylbH、ybbD、ylbI、ylbG、ylbE、xisD、exoD、peaD、renD、nmpC、aaaD、tfaD、ybcY、tfaX、ybeM、ybfG、ybfI、ybfO、ybfQ、ybfL、efeU、ymdE、oweE、aaaE、beeE、jayE、stfE、icdC、ycgH、ycgI、insZ、ycjV、ymjC、ydaW、rzpR、ydaY、ynaA、lomR、ttcC、ydbA、gapC、insP、rhsE、yncI、yddK、ydeT、yneL、yneO、ydfJ、nohQ、intK、ydfX、ydfE、intQ、arpB、yedN、intG、yedS、yeeL、yeeH、yoeG、yoeH、yeeP、yoeD、yoeF、yegZ、gatR、yehH、yehQ、mdtQ、yejO、yfaS、yfaH、yfcU、tfaS、yfdL、oweS、yfjV、ypjI、psaA、pinH、ypjC、ygeF、pbl、ygeK、ygeN、ygeO、ygeQ、yqfE、yghE、yghF、yghO、yghX、yqiG、agaW、agaA、yhcE、yrdF、yrdE、yhdW、yzgL、yrhC、yrhA、yhiL、yhiS、bcsQ、mokA、sokA、ysaC、ysaD、yibS、yibW、yibU、yicT、glvG、glvC、ilvG、yifN、yjbI、yjdQ、ytfA、cybC、intB、yjhD、yjhE、insO、insM、yjhV、yjhY、yjhZ、yjhR、yjiP、yjiT、yjiV、fhiA、glyG、insB、insD、mbhA、molR、phnE、rph、wbbL、yaiT、ybcD、ycdN、ychG、yciX、ydeU、yedN、ygaY、yghY、yhiK、yhjQ、yjgX、yjhW、ymjB、yncK、ynfP、yoeA、ypaA、ypdJ、ypjM、yqaC、ysdC、arpA、caiB、creD、cstA、dcuS、fimB、fucA、gatZ、gidB、gltL、hlyE、hybO、hyfC、insC、insK、mbhA、nfrB、tpr、waaT、xylG、yajB、ybeQ、ycfX、yciQ、yddE、ydhP、ydiM、ydjY、yfbL、yfdF、yfhD、yhfS、yhhl-3、yidP、yiiD、yjcC及びyjjMからなる群から選択される少なくとも１つの偽遺伝子である、[１０]〜[１２]のいずれかの遺伝子カセット。
[１４] 大腸菌のゲノム中の偽遺伝子が、ybeM又はyghXである、[１３]の遺伝子カセット。
[１５] 用いる大腸菌株がK-12株又はその派生株である、[１３]又は[１４]の遺伝子カセット。
[１６] [１０]〜[１５]のいずれかの遺伝子カセットを含む、大腸菌のゲノム中の偽遺伝子中に、プロモーターと連結したポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入するためのターゲティングベクター。
[13] Pseudogenes in the genome of E. coli are yabP , yafU , yafF , lfhA , lafU , ykfJ , prfH , ykfN , ykfL , insN , afuB , insX , yagB , ykgS , yagP , ykgT , ykgT , ykgT , ykgT , ykgT ykgQ, yaiX, ykiA, ylbH, ybbD, ylbI, ylbG, ylbE, xisD, exoD, peaD, renD, nmpC, aaaD, tfaD, ybcY, tfaX, ybeM, ybfG, ybfI, ybfO, ybfQ, ybfL, efeU, ymdE, oweE, aaaE, beeE, jayE, stfE, icdC, ycgH, ycgI, insZ, ycjV, ymjC, ydaW, rzpR, ydaY, ynaA, lomR, ttcC, ydbA, gapC, insP, rhsE, yncI, yddK, ydeT, yneL, yneO, ydfJ, nohQ, intK, ydfX, ydfE, intQ, arpB, yedN, intG, yedS, yeeL, yeeH, yoeG, yoeH, yeeP, yoeD, yoeF, yegZ, gatR, yehH, yehQ, mdtQ, yejO, yfaS, yfaH , yfcU , tfaS , yfdL , oweS , yfjV , ypjI , psaA , pinH , ypjC , ygeF , pbl , YgeK, ygeN, ygeO, ygeQ , yqfE, yghE, yghF, yghO, yghX, yqiG, agaW, agaA, yhcE, yrdF, yrdE, yhdW, yzgL, yrhC, yrhA, yhiL, yhiS, bcsQ, mokA, sokA, ysaC , ysaD, yibS, yibW, yibU , yicT, glvG, glvC, ilvG, yifN, yjbI, yjdQ, ytfA, cybC, intB, yjhD, yjhE, insO, insM, yjhV, yjhY, yjhZ, yjhR, yjiP, yjiT, yjiV , fhiA, glyG, insB, insD , mbhA, molR, phnE, rph, wbbL, yaiT, ybcD, ycdN, ychG, yciX, ydeU, yedN, ygaY, yghY, yhiK, yhjQ, yjgX, yjhW, ymjB, yncK, ynfP , yoeA, ypaA, ypdJ, ypjM , yqaC, ysdC, arpA, caiB, creD, cstA, dcuS, fimB, fucA, gatZ, gidB, gltL, hlyE, hybO, hyfC, insC, insK, mbhA, nfrB, tpr, waaT , XylG , yajB , ybeQ , ycfX , yciQ , yddE , ydhP , ydiM , ydjY , yfbL , yfdF , yfhD , yhfS , Yhhl-3 , yidP , yiiD , yjcC and yjjM . The gene cassette according to any one of [10] to [12], which is at least one pseudogene selected from the group consisting of yjjC and yjjM .
[14] The gene cassette according to [13], wherein the pseudogene in the genome of E. coli is ybeM or yghX .
[15] The gene cassette according to [13] or [14], wherein the Escherichia coli strain to be used is a K-12 strain or a derivative thereof.
[16] A targeting vector for introducing a DNA encoding a polypeptide or RNA linked to a promoter into a pseudogene in the genome of E. coli comprising the gene cassette according to any one of [10] to [15].
実施例に示すように、本発明は、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを大腸菌の偽遺伝子中にノックインすることを特徴とする。環状プラスミドを用いないので、環状プラスミド維持のための抗生物質等の薬剤も必要がない。また、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインし得る偽遺伝子は大腸菌ゲノム中に多数存在するので、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを多数コピー大腸菌ゲノム中に導入することができる。さらに、本発明は、リグノセルロース系バイオマスに含まれるキシロース等で発現誘導される遺伝子発現系であり、キシロース等を利用してポリペプチド又はRNAを効率的に、大量に、かつ低コストで生産することができる。 As shown in the Examples, the present invention is characterized in that DNA encoding a polypeptide or RNA is knocked into a pseudogene of E. coli. Since a circular plasmid is not used, there is no need for drugs such as antibiotics for maintaining the circular plasmid. In addition, since many pseudogenes capable of knocking in a DNA encoding a polypeptide or RNA exist in the E. coli genome, a large number of copies of the DNA encoding the polypeptide or RNA can be introduced into the E. coli genome. Furthermore, the present invention is a gene expression system in which expression is induced by xylose or the like contained in lignocellulosic biomass, and efficiently produces a large amount of polypeptide or RNA at low cost using xylose or the like. be able to.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、大腸菌を用いてポリペプチド又はRNAをコードする外来遺伝子であるDNAを導入して該ポリペプチド又はRNAを生産する方法であり、発現用の環状プラスミドを用いずに大腸菌のゲノムの偽遺伝子（シュードジーン）中にポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入することを特徴とする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a method of producing a polypeptide or RNA by introducing DNA, which is a foreign gene encoding a polypeptide or RNA, using E. coli. It is characterized by introducing a DNA encoding a polypeptide or RNA into a gene (pseudogene).
また、本発明はキシロース誘導性プロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターを利用することにより、バイオマス中に多量に含まれるキシロース又はアラビノースで発現誘導される。この際、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAをT7プロモーター等の強力なプロモーターと連結しておき、キシロース又はアラビノースによりT7 RNAポリメラーゼが発現するようにする。こうすることにより、キシロース又はアラビノースによる誘導によってポリペプチド又はRNAを生産することができる。 Further, in the present invention, expression is induced in xylose or arabinose contained in a large amount in biomass by using a xylose-inducible promoter or arabinose-inducible promoter. At this time, the DNA encoding the polypeptide or RNA is linked to a strong promoter such as T7 promoter, and T7 RNA polymerase is expressed by xylose or arabinose. In this way, a polypeptide or RNA can be produced by induction with xylose or arabinose.
さらに、キシロースやアラビノースを発現誘導に用いる場合、グルコース等の他の糖が混在していると炭素カタボライト抑制（CCR)によりキシロースやアラビノースの代謝が抑制されるため、キシロースやアラビノースを利用できなくなってしまう。本発明においては、用いる大腸菌においてCCRを抑制し、キシロースやアラビノースを効率的に利用できるようにする。 Furthermore, when xylose or arabinose is used for expression induction, carbon catabolite suppression (CCR) suppresses metabolism of xylose and arabinose when other sugars such as glucose are mixed, so xylose and arabinose cannot be used. End up. In the present invention, CCR is suppressed in Escherichia coli to be used so that xylose and arabinose can be used efficiently.
（１）偽遺伝子へのポリペプチド又はRNAをコードするDNAの導入
本発明の方法により生産するポリペプチド又はRNAは限定されない。タンパク質としては、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、腫瘍壊死因子等の生理活性物質等が例示されるが、これらには限定されない。RNAとしては、特定の遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンスRNA、リボザイムなどの機能性RNAが例示されるが、これらには限定されない。本発明のおいては、これらのタンパク質やRNAをコードするDNAを大腸菌の偽遺伝子中にノックインにより導入すればよい。RNAとしてウイルスや細菌の遺伝子あるいは遺伝子組換えによって導入された外来遺伝子に相補的に結合し、該遺伝子の発現を抑制し得る配列を有するRNA等が挙げられる。RNAの塩基数は、限定されず、15〜500塩基の範囲で選択される。好ましくは15〜50、さらに好ましくは15〜45、さらに好ましくは15〜40、さらに好ましくは15〜35、さらに好ましくは15〜30塩基である。
(1) Introduction of DNA encoding polypeptide or RNA into pseudogene The polypeptide or RNA produced by the method of the present invention is not limited. Proteins include interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, α-interferon, β-interferon, γ-interferon, angiostatin, thrombospondin, endostatin, METH-1, METH-2, GM Examples include, but are not limited to, physiologically active substances such as -CSF, G-CSF, M-CSF, and tumor necrosis factor. Examples of RNA include, but are not limited to, functional RNAs such as antisense RNA and ribozyme for suppressing the expression of specific genes. In the present invention, DNAs encoding these proteins and RNAs may be introduced into E. coli pseudogenes by knock-in. Examples thereof include RNA having a sequence that can complementarily bind to a viral or bacterial gene or a foreign gene introduced by genetic recombination and suppress the expression of the gene. The number of bases of RNA is not limited and is selected in the range of 15 to 500 bases. Preferably it is 15-50, More preferably, it is 15-45, More preferably, it is 15-40, More preferably, it is 15-35, More preferably, it is 15-30 bases.
偽遺伝子とは、既知の正常遺伝子と塩基配列の上で高度の類似性があり、配列の相同性が明確に認められるのにもかかわらず、遺伝子としての機能を失っているDNAの領域をいう。偽遺伝子は元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。具体的には、ストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなりタンパク質の機能を失う場合、又は正常な転写に必要な調節配列が機能を失った場合等により偽遺伝子が出現する。元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独でそのまま偽遺伝子になったものもある。偽遺伝子として、遺伝子配列の特徴により３タイプの偽遺伝子が挙げられる。第１のタイプとして、mRNAからレトロトランスポゾンの逆転写酵素により合成されたDNAがゲノムに挿入されて偽遺伝子となるタイプが挙げられ、このタイプの偽遺伝子をプロセス型偽遺伝子と呼ぶ。第２のタイプとして、ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、そのコピーのうちの１部が突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子となるタイプが挙げられ、このタイプの偽遺伝子を重複偽遺伝子又は非プロセス型偽遺伝子と呼ぶ。第３のタイプとして、ゲノム内の遺伝子が、重複遺伝子がなく単独の遺伝子のまま機能を失うことにより偽遺伝子になるタイプが挙げられる。本発明においては、上記の３タイプのいずれの偽遺伝子も含まれる。 A pseudogene refers to a region of DNA that has a high degree of similarity in base sequence with a known normal gene, and has lost its function as a gene despite the fact that sequence homology is clearly recognized. . Pseudogenes are thought to have arisen as a result of mutations in sequences that have original functions. Specifically, a pseudogene appears when a stop codon occurs and the peptide chain of the protein is shortened to lose the function of the protein, or when a regulatory sequence necessary for normal transcription loses the function. In many cases, the original normal gene remains separately, but there are also cases in which the pseudogene alone is left alone. The pseudogene includes three types of pseudogenes depending on the characteristics of the gene sequence. The first type is a type in which DNA synthesized from mRNA by retrotransposon reverse transcriptase is inserted into the genome to become a pseudogene, and this type of pseudogene is referred to as a process-type pseudogene. As a second type, there is a type in which the original gene sequence is duplicated in the genome, and one part of the copy loses its function due to mutation or the like and becomes a pseudogene, and this type of pseudogene is duplicated. Called pseudogene or non-process pseudogene. As a third type, there is a type in which a gene in a genome becomes a pseudogene by losing its function as a single gene with no duplicate genes. In the present invention, any of the above three types of pseudogenes is included.
偽遺伝子は、遺伝子としての機能を失っているため、大腸菌のゲノム中の偽遺伝子中にポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインして偽遺伝子が分断等により破壊されても、大腸菌の生育や代謝には影響しないので、偽遺伝子中にノックインしたポリペプチド又はRNAをコードするDNAが発現し、ポリペプチド又はRNAを効率的に生産することができる。 Since the pseudogene has lost its function as a gene, even if the pseudogene in the pseudogene in the genome of E. coli is knocked-in into a DNA encoding a polypeptide or RNA, Since it does not affect metabolism, DNA encoding a polypeptide or RNA knocked into a pseudogene is expressed, and the polypeptide or RNA can be produced efficiently.
本発明で利用する大腸菌の株は限定されないが、研究や有用物資の生産に通常利用されているK-12株（NBRC 3301)及びB株（NBRC 13168)、あるいはこれらの株から派生した亜株を好適に用いることができる。K-12株及びB株並びにそれらの亜株として、MG1655株、W3110株、W2637株、W1485株、WG1株、58株、679株、MB408株、AG1株、Hfr3000株、5K株、H1443株、DP50株、W945株、PA309株、58-161株、P678株、HB101株（K-12株とB株のハイブリッド）、XL1-Blue株、XLOLR株、SURE株、YN2980株、AB311株、Hfr 3000 X74株、Cavalli Hfr株、W208株、AB284株、EMG2株、Y10株、WA704株、JC9387株、BB4株、BL21株、BM25.5株、BMH71-18mutS株、BW313株、C-Ia株、C600株、CJ236株、DH1株、DH5株、DH5α株、DH10B株、DP50supF株、ED8654株、ED8767株、ER1647株、ER2508株、HB101株、HMS174株、HST02株、HMS174株、HST02株、HST04 dam-/dcm-株、HST08 Premium株、JM83株、JM101株、JM105株、JM106株、JM107株、JM108株、JM109株、JM110株、K802株、K803株、LE392株、MC1061株、MV1184株、MN1193株、NovaBlue株、RR1株、TAP90株、TG1株、TG2株、TH2株、χ1776株、Y-1088株、Y-1099株、Y-1090株、REL606株等が挙げられる。これらのうち、MG1655株、W3110株、W2637株、W1485株、WG1株、58株、679株、MB408株、AG1株、Hfr3000株、5K株、H1443株、DP50株、W945株、PA309株、58-161株、P678株、HB101株（K-12株とB株のハイブリッド）、XL1-Blue株、XLOLR株、SURE株、YN2980株、AB311株、Hfr 3000 X74株、Cavalli Hfr株、W208株、AB284株、EMG2株、Y10株、WA704株、JC9387株等はK-12株由来の株としてよく利用されている株であり、REL606株及びBL21株等はB株由来の株としてよく利用されている株である。 The Escherichia coli strain used in the present invention is not limited, but K-12 strain (NBRC 3301) and B strain (NBRC 13168), which are usually used for research and production of useful materials, or sub-strains derived from these strains. Can be suitably used. K-12 strain and B strain and their sub-strains are MG1655, W3110, W2637, W1485, WG1, 58, 679, MB408, AG1, Hfr3000, 5K, H1443, DP50, W945, PA309, 58-161, P678, HB101 (K-12 and B hybrid), XL1-Blue, XLOLR, SURE, YN2980, AB311, Hfr 3000 X74, Cavalli Hfr, W208, AB284, EMG2, Y10, WA704, JC9387, BB4, BL21, BM25.5, BMH71-18mutS, BW313, C-Ia, C600 Ltd., CJ236 strain, DH1 strain, DH5 strain, DH5α strain, DH10B strain, DP50supF stock, ED8654 shares, ED8767 shares, ER1647 strain, ER2508 strain, HB101 strain, HMS174 shares, HST02 shares, HMS174 shares, HST02 shares, HST04 dam - / dcm - strain, HST08 Premium strain, JM83 strain, JM101 strain, JM105 strain, JM106 strain, JM107 strain, JM108 strain, JM109 strain, JM110 strain, K802 shares, K803 shares, LE392 strain, MC1061 strain, MV1184 shares, MN1193 shares , NovaBlue, RR1, TAP90, TG1, TG2, TH2, χ1776, Y-1088, Y-1099, Y-1090, REL6 06 shares. Of these, MG1655, W3110, W2637, W1485, WG1, 58, 679, MB408, AG1, Hfr3000, 5K, H1443, DP50, W945, PA309, 58 -161, P678, HB101 (K-12 and B hybrid), XL1-Blue, XLOLR, SURE, YN2980, AB311, Hfr 3000 X74, Cavalli Hfr, W208, AB284, EMG2, Y10, WA704, JC9387, etc. are often used as strains derived from K-12, and REL606, BL21, etc. are often used as strains derived from B. Is a stock.
大腸菌の偽遺伝子としては、データベースPec Profiling of E.coli Chromosome（http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp）、Kato and hashimoto, Mol. Syst. Biol. (2007）3:132、Homma et al., Gene (2002) 294:25-33やYoon et al., Genome Biology (2012), 13: R37等に記載の偽遺伝子から選択することができる。偽遺伝子として、例えば、Yoon et al., Genome Biology (2012), 13: R37において、大腸菌K-12 MG1655株及び大腸菌B REL606株のゲノムに存在すると報告されているybeM、yghX、agaW、arpA、arpB、caiB、creD、cstA、cybC、dcuS、fhiA、fimB、fucA、gapC、gatR、gatZ、gidB、gltL、glvG、hlyE、hybO、hyfC、icdC、ilvG、insB、insC、insD、insK、insM、insO、intG、intQ、lomR、mbhA、molR、nfrB、nmpC、pbl、phnE、pinH、rph、stfE、tfaD、tfaS、tpr、waaT、wbbL、xylG、yafF、yaiT、yaiX、yajB、ybcD、ybeQ、ybfL、ybfQ、ycdN、ycfX、ycgH、ychG、yciX、ycjV、ydbA、yddE、ydeU、ydhP、ydiM、ydjY、yedN、yedS、yeeL、yeeP、yegZ、yfaS、yfbL、yfdF、yfhD、ygaY、ygeN、yghE、yghY、yhcE、yhfS、yhhI-3、yhiK、yhjQ、yidP、yifN、yiiD、yjcC、yjgX、yjhD、yjhE、yjhR、yjhW、yjiP、yjiV、yjjM、ylbE、ymdE、ymjB、ymjC、yncK、ynfP、yoeA、ypaA、ypdJ、ypjM、yqaC、yrhC、ysdC、yzgL等が挙げられる。また、Homma et al., Gene (2002) 294:25-33において大腸菌K-12株のゲノムに存在すると報告されているeaeH、yfaH、yjbI、ykgA、yaiT、yaiU、ybcY、b1396、gapC_1、gapC_2、b1472、b1964、b1965、b1966、b1995、b1998、b2654、b2655、b2656、b2657、b2658、b3000、b2999、agaA、yhfO、yhfP、ilvG_1、yigL、yigW_1、yigW_2、b1720、b1721、b2228、b2227、glvC、glvB、b0263、b0499、ybfD、b1016、b1017、ydaW、b1458、b1459、b1568、b1980、b1979、molR_1、molR_2、molR_3、yehQ、yfcU、b2337、b2353、b2650、b2649、b2680、b2681、b2863、b2862、ygfQ、ygfR、ygiR、b3015、yhaN、yhaM、agaW、yhdR、yhdP、gntU_I、gntU_2、yhiL、yhiK、yhiS、yibJ、yidX、kup、yifN、b3776、yifN、b3776、yifM_1、yifM_2、yigE、b3814、trkH、b3915、b3914、yjbL、yjbM、phnE、b4103、ytfI、yjiP、yjiQ等が挙げられる。 E. coli pseudogenes include the database Pec Profiling of E.coli Chromosome (http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp), Kato and hashimoto, Mol. Syst. Biol. 2007) 3: 132, Homma et al., Gene (2002) 294: 25-33, Yoon et al., Genome Biology (2012), 13: R37 and the like. As pseudogenes, for example, in Yoon et al., Genome Biology (2012), 13: R37, ybeM , yghX , agaW , arpA , which are reported to exist in the genomes of E. coli K-12 MG1655 strain and E. coli B REL606 strain, arpB, caiB, creD, cstA, cybC, dcuS, fhiA, fimB, fucA, gapC, gatR, gatZ, gidB, gltL, glvG, hlyE, hybO, hyfC, icdC, ilvG, insB, insC, insD, insK, insM, insO, intG, intQ, lomR, mbhA, molR, nfrB, nmpC, pbl, phnE, pinH, rph, stfE, tfaD, tfaS, tpr, waaT, wbbL, xylG, yafF, yaiT, yaiX, yajB, ybcD, ybeQ, ybfL, ybfQ, ycdN, ycfX, ycgH, ychG, yciX, ycjV, ydbA, yddE, ydeU, ydhP, ydiM, ydjY, yedN, yedS, yeeL, yeeP, yegZ, yfaS, yfbL, yfdF, yfhD, ygaY, ygeN, yghE, yghY, yhcE, yhfS, yhhI-3, yhiK, yhjQ, yidP, yifN, yiiD, yjcC yjgX, yjhD, yjhE, yjhR, yjhW, yjiP, yjiV, yjjM, ylbE, ymdE, ymjB, ymjC, yncK, ynfP, yoeA, ypaA, ypdJ, ypjM, yqaC, yrhC, ysdC, yzgL and the like. In addition, eaeH , yfaH , yjbI , ykgA , yaiT , yaiU , ybcY , b1396 , gapC_1 , gapC_2 reported to exist in the genome of Escherichia coli K-12 strain in Homma et al., Gene (2002) 294: 25-33 , b1472, b1964, b1965, b1966 , b1995, b1998, b2654, b2655, b2656, b2657, b2658, b3000, b2999, agaA, yhfO, yhfP, ilvG_1, yigL, yigW_1, yigW_2, b1720, b1721, b2228, b2227, glvC , glvB, b0263, b0499, ybfD , b1016, b1017, ydaW, b1458, b1459, b1568, b1980, b1979, molR_1, molR_2, molR_3, yehQ, yfcU, b2337, b2353, b2650, b2649, b2680, b2681, b2863, b2862 , ygfQ, ygfR, ygiR, b3015 , yhaN, yhaM, agaW, yhdR, yhdP, gntU_I, gntU_2, yhiL, yhiK, yhiS, yibJ, yidX, kup, yifN, b3776, yifN, b3776, yifM_1, yifM_2, yigE, b3814 , TrkH , b3915 , b3914 , yjbL , yjbM , phn E , b4103 , ytfI , yjiP , yjiQ and the like.
さらに、データベースPec Profiling of E.coli Chromosome（http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp）に示されるK12株由来のMG1665株が有する偽遺伝子として、yabP、yafU、yafF、lfhA、lafU、ykfJ、prfH、ykfN、ykfL、insN、afuB、insX、yagB、ykgS、yagP、ykgT、ykgP、eaeH、ykgA、ykgQ、yaiX、ykiA、ylbH、ybbD、ylbI、ylbG、ylbE、xisD、exoD、peaD、renD、nmpC、aaaD、tfaD、ybcY、tfaX、ybeM、ybfG、ybfI、ybfO、ybfQ、ybfL、efeU、ymdE、oweE、aaaE、beeE、jayE、stfE、icdC、ycgH、ycgI、insZ、ycjV、ymjC、ydaW、rzpR、ydaY、ynaA、lomR、ttcC、ydbA、gapC、insP、rhsE、yncI、yddK、ydeT、yneL、yneO、ydfJ、nohQ、intK、ydfX、ydfE、intQ、arpB、yedN、intG、yedS、yeeL、yeeH、yoeG、yoeH、yeeP、yoeD、yoeF、yegZ、gatR、yehH、yehQ、mdtQ、yejO、yfaS、yfaH、yfcU、tfaS、yfdL、oweS、yfjV、ypjI、psaA、pinH、ypjC、ygeF、pbl、ygeK、ygeN、ygeO、ygeQ、yqfE、yghE、yghF、yghO、yghX、yqiG、agaW、agaA、yhcE、yrdF、yrdE、yhdW、yzgL、yrhC、yrhA、yhiL、yhiS、bcsQ、mokA、sokA、ysaC、ysaD、yibS、yibW、yibU、yicT、glvG、glvC、ilvG、yifN、yjbI、yjdQ、ytfA、cybC、intB、yjhD、yjhE、insO、insM、yjhV、yjhY、yjhZ、yjhR、yjiP、yjiT、yjiV等が挙げられる。 Furthermore, as a pseudogene possessed by the MG1665 strain derived from the K12 strain shown in the database Pec Profiling of E.coli Chromosome (http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp), yabP , yafU, yafF, lfhA, lafU, ykfJ, prfH, ykfN, ykfL, insN, afuB, insX, yagB, ykgS, yagP, ykgT, ykgP, eaeH, ykgA, ykgQ, yaiX, ykiA, ylbH, ybbD, ylbI, ylbG, ylbE, xisD, exoD, peaD, renD, nmpC, aaaD, tfaD, ybcY, tfaX, ybeM, ybfG, ybfI, ybfO, ybfQ, ybfL, efeU, ymdE, oweE, aaaE, beeE, jayE, stfE, icdC, ycgH, ycgI, insZ, ycjV, ymjC, ydaW, rzpR, ydaY, ynaA, lomR, ttcC, ydbA, gapC, insP, rhsE, yncI, yddK, ydeT, yneL, yneO, ydfJ, nohQ, intK, ydfX, ydfE, intQ, arpB , yedN , intG , yedS , yeeL , yeeH , yoeG , yoeH , yeeP , yoeD , yoeF , yegZ , gatR , yehH , yehQ, mdtQ, yejO, yfaS, yfaH, yfcU, tfaS, yfdL, oweS, yfjV, ypjI, psaA, pinH, ypjC, ygeF, pbl, ygeK, ygeN, ygeO, ygeQ, yqfE, yghE, yghF, yghO, yghX, yqiG, agaW, agaA, yhcE, yrdF, yrdE, yhdW, yzgL, yrhC, yrhA, yhiL, yhiS, bcsQ, mokA, sokA, ysaC, ysaD, yibS, yibW, yibU, yicT, glvG, glvC, ilvG, yifN, yjbI , yjdQ , ytfA , cybC , intB , yjhD , yjhE , insO , insM , yjhV , yjhY , yjhZ , yjhR , yjiP , yjiT , yjiV and the like.
上記のデータベースPec Profiling of E.coli Chromosome（http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp）に示されるK12株由来のMG1665株が有する偽遺伝子のリストを表１に示し、それぞれの偽遺伝子の配列を配列番号４５〜２００に示す。表１には、偽遺伝子の名称（Symbol）、大腸菌のゲノム中の偽遺伝子の存在する場所（ゲノム中の塩基番号でスタート塩基番号（Start（BP)）及びエンド塩基番号（END(BP))で示してある）、塩基長（Length)、プラス（＋）鎖上とマイナス鎖（−）上のどちらに存在するか（Dir)、並びに各々の偽遺伝子の塩基配列の配列表中の配列番号を示す。 A list of pseudogenes possessed by the MG1665 strain derived from the K12 strain shown in the database Pec Profiling of E.coli Chromosome (http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp) 1 and the sequences of the respective pseudogenes are shown in SEQ ID NOs: 45-200. Table 1 shows the name of the pseudogene (Symbol), the location of the pseudogene in the genome of E. coli (base number in the genome (Start (BP)) and end base number (END (BP)). ), Base length (Length), whether on the plus (+) strand or on the minus strand (-) (Dir), and the sequence number in the sequence listing of each pseudogene base sequence Indicates.
さらに、上記した偽遺伝子の中でも、大腸菌株としてMG1655等のK-12株又はその派生株を用いる場合、agaW、arpB、cybC、fhiA、gapC、gatR、glyG、icdC、ilvG、insB、insD、insM、insO、intG、lomR、mbhA、molR、nmpC、pbl、phnE、pinH、rph、stfE、tfaD、tfaS、wbbL、yafF、yaiT、yaiX、ybcD、ybeM、ybfL、ybfQ、ycdN、ycgH、ychG、yciX、ycjV、ydbA、ydeU、yedN、yedS、yeeL、yeeP、yegZ、yfaS、ygaY、ygeN、yghE、yghX、yghY、yhcE、yhiK、yhjQ、yifN、yjgX、yjhD、yjhE、yjhW、yjiP、yjiV、ylbE、ymdE、ymjB、ymjC、yncK、ynfP、yoeA、ypaA、ypdJ、ypjM、yqaC、yrhC及びysdCが好ましく、arpB、gapC、gatR、icdC、ilvG、insB、lomR、mbhA、molR、wbbL、yafF、yaiT、yaiX、ybeM、ybfQ、ycdN、ycgH、ychG、yciX、ycjV、ydbA、yedN、yedS、yeeL、yegZ、yfaS、yhcE、yjgX、yjhW、ylbE、ymjB、ymjC、yncK、ynfP、yoeA、ypaA、ypdJ、yrhC及びysdCがさらに好ましい。 Furthermore, among the pseudogene described above, when using a K-12 strain or a derivative thereof in MG1655 such as E. coli strains, agaW, arpB, cybC, fhiA , gapC, gatR, glyG, icdC, ilvG, insB, insD, insM , insO, intG, lomR, mbhA , molR, nmpC, pbl, phnE, pinH, rph, stfE, tfaD, tfaS, wbbL, yafF, yaiT, yaiX, ybcD, ybeM, ybfL, ybfQ, ycdN, ycgH, ychG, yciX , ycjV, ydbA, ydeU, yedN , yedS, yeeL, yeeP, yegZ, yfaS, ygaY, ygeN, yghE, yghX, yghY, yhcE, yhiK, yhjQ, yifN, yjgX, yjhD, yjhE, yjhW, yjiP, yjiV, ylbE , ymdE, ymjB, ymjC, yncK , ynfP, yoeA, ypaA, ypdJ, ypjM, yqaC, preferably yrhC and ysdC, arpB, gapC, gatR, icdC, ilvG, insB, lomR, mbhA, molR, wbbL, yafF, yaiT , yaiX, ybeM, ybfQ, ycdN , ycgH, ychG, yciX, ycjV, ydbA yedN, yedS, yeeL, yegZ, yfaS, yhcE, yjgX, yjhW, ylbE, ymjB, ymjC, yncK, ynfP, yoeA, ypaA, ypdJ, more preferably yrhC and YsdC.
また、大腸菌株としてREL606等のB株又はその派生株を用いる場合、arpA、caiB、creD、cstA、cybC、dcuS、fhiA、fimB、fucA、gatZ、gidB、gltL、hlyE、hybO、hyfC、insB、insC、insK、insO、intQ、mbhA、nfrB、nmpC、tpr、waaT、xylG、yajB、ybcD、ybeQ、ycfX、ycgH、yciQ、yciX、yddE、ydeU、ydhP、ydiM、ydjY、yeeL、yeeP、yfbL、yfdF、yfhD、yghE、yhfS、yhhl-3、yhjQ、yidP、yifN、yiiD、yjcC、yjgX、yjhD、yjhE、yjhR、yjjM、ymjC、yncK、ynfP、yoeA、yrhC及びyzgLが好ましく、arpA、caiB、creD、cstA、dcuS、fimB、fucA、gatZ、gidB、gltL、hlyE、hybO、hyfC、insC、insK、intQ、nfrB、nmpC、tpr、waaT、xylG、yajB、ybeQ、ycfX、yciQ、yddE、ydhP、ydiM、ydjY、yfbL、yfdF、yfhD、yhfS、yhhl-3、yidP、yiiD、yjcC、yjhR、yjjM及びyzgLがさらに好ましい。 In addition, when using a B strain such as REL606 or a derivative thereof as an E. coli strain, arpA , caiB , creD , cstA , cybC , dcuS , fhiA , fimB , fucA , gatZ , gidB , gltL , hlyE , hybO , hyfC , insB , insC, insK, insO, intQ, mbhA, nfrB, nmpC, tpr, waaT, xylG, yajB, ybcD, ybeQ, ycfX, ycgH, yciQ, yciX, yddE, ydeU, ydhP, ydiM, ydjY, yeeL, yeeP, yfbL, yfdF, yfhD, yghE, yhfS, yhhl-3, yhjQ, yidP, yifN, yiiD, yjcC, yjgX, yjhD, yjhE, yjhR, yjjM, ymjC, yncK, ynfP, yoeA, is yrhC and yzgL preferably, arpA, caiB, creD, cstA, dcuS, fimB, fucA, gatZ, gidB, gltL, hlyE, hybO, hyfC, insC, insK, intQ, nfrB, nmpC, tpr, waaT, xylG, yajB, ybeQ, ycfX, yciQ, yddE, ydhP, ydiM , ydjY , yfbL , yfdF , yfhD , yhfS , yhhl-3 , yidP , yiiD , yjcC , yjh R 1 , yjjM and yzgL are more preferred.
また、これらの偽遺伝子のうち、近傍に生育に必須の遺伝子が存在せず、さらにオペロンになっていないものが望ましい。 Further, among these pseudogenes, those that do not have genes essential for growth in the vicinity and are not operons are desirable.
後述の実施例においては、偽遺伝子ybeM及びyghXにポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインした例を示す。他の偽遺伝子に対しても同様の方法でポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインすることができ、また、偽遺伝子である以上、偽遺伝子が破壊されたとしても大腸菌の生育や代謝に影響を与えないので、いずれの偽遺伝子中にもポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインすることにより、ポリペプチド又はRNAを生産させることができる。すなわち、大腸菌のゲノム中に存在するあらゆる偽遺伝子を実施例で用いている偽遺伝子ybeM及びyghXと同様に、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入し、該ポリペプチド又はRNAを生産することができる。 In the examples described later, an example in which DNA encoding a polypeptide or RNA is knocked into pseudogenes ybeM and yghX is shown. It is possible to knock in DNA encoding a polypeptide or RNA to other pseudogenes in the same way, and even if the pseudogene is destroyed, it affects the growth and metabolism of E. coli. Therefore, the polypeptide or RNA can be produced by knocking in the DNA encoding the polypeptide or RNA into any pseudogene. That is, in the same manner as the pseudogenes ybeM and yghX used in the Examples, all pseudogenes existing in the genome of E. coli can be introduced by introducing DNA encoding a polypeptide or RNA to produce the polypeptide or RNA. it can.
大腸菌のゲノム中の偽遺伝子にポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入する場合、形質転換マーカーが大腸菌内に残らないように導入する。このような方法は限定されないが、例えば、相同組換え法を利用して、偽遺伝子中にポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインすることができる。この際、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAにプロモーターを作動可能に連結しておく。さらに、エンハンサー、ターミネーター、ポリA配列等の制御配列を含んでいてもよい。少なくともプロモーターとポリペプチド又はRNAをコードするDNAを含むDNA構築物を、プロモーター-ポリペプチド又はRNAをコードするDNAの遺伝子カセット又は発現カセットと呼び、該発現カセットを含む遺伝子導入用ターゲティングベクターを用いて導入することができる。ターゲティングベクター中のカセットの両側には、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入しようとする偽遺伝子の部分DNA配列に相同性を有する相同組換え用アームとなるDNA断片を連結しておき、該DNA断片に挟まれたDNAカセット部分をノックインする。上記の偽遺伝子の配列情報に基づいて、相同組換え用アームとして用い得るDNA断片を設計することができる。この際、導入しようとする発現カセットの配列を偽遺伝子の途中に偽遺伝子の配列が残った状態で偽遺伝子を分断するように導入してもよいし、偽遺伝子の配列を部分的に置換するように導入してもよい。本発明において、上記の相同組換え用アームとなるDNA断片を含む遺伝子カセットも発現カセットと呼ぶ。 When DNA encoding a polypeptide or RNA is introduced into a pseudogene in the genome of E. coli, it is introduced so that no transformation marker remains in E. coli. Although such a method is not limited, DNA which codes polypeptide or RNA can be knocked in into a pseudogene using a homologous recombination method, for example. At this time, a promoter is operably linked to DNA encoding the polypeptide or RNA. Furthermore, it may contain a control sequence such as an enhancer, terminator, poly A sequence and the like. A DNA construct containing at least a promoter and a DNA encoding a polypeptide or RNA is called a promoter-polypeptide or RNA-encoding DNA gene cassette or expression cassette and introduced using a gene introduction targeting vector containing the expression cassette can do. A DNA fragment serving as an arm for homologous recombination having homology to a partial DNA sequence of a pseudogene to be introduced with a DNA encoding a polypeptide or RNA is linked to both sides of the cassette in the targeting vector, Knock in the DNA cassette between the DNA fragments. A DNA fragment that can be used as an arm for homologous recombination can be designed based on the above-described pseudogene sequence information. At this time, the sequence of the expression cassette to be introduced may be introduced so as to break the pseudogene with the pseudogene sequence remaining in the middle of the pseudogene, or the pseudogene sequence is partially replaced. It may be introduced as follows. In the present invention, a gene cassette containing a DNA fragment that serves as the arm for homologous recombination is also referred to as an expression cassette.
用いるプロモーターは限定されず、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター等が用いられるが、強力なプロモーター活性を有し最も広く使われるT7プロモーターが好ましい。ただし、これらプロモーターがあまりにも強力で、細胞の増殖に悪影響を与えることがあることから（Temme et al., Nucleic acids Res. (2012) 40:8773-8781）、プロモーター配列に変異を導入したり（Ikeda et al., Nucleic acids Res. (1992) 20:2517-2524）、対応するポリメラーゼに変異を導入して（Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:12250-12254）、やや穏やかな発現をさせてもよい。 The promoter to be used is not limited, and T7 promoter, T3 promoter, SP6 promoter and the like are used, and the most widely used T7 promoter having strong promoter activity is preferable. However, since these promoters are too powerful and can adversely affect cell growth (Temme et al., Nucleic acids Res. (2012) 40: 8773-8781) (Ikeda et al., Nucleic acids Res. (1992) 20: 2517-2524) and introducing a mutation into the corresponding polymerase (Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 12250 -12254), a slightly mild expression may be allowed.
本発明は、前記発現カセットも該発現カセットを含むターゲティング用ベクターも包含する。 The present invention includes the expression cassette as well as a targeting vector containing the expression cassette.
本発明の発現カセットにおいては、発現させようとする有用物質をコードするDNAを挿入する部位は、マルチクローニングサイトとして存在してもよい。この場合、発現させようとする有用物質をコードするDNAをマルチクローニング部位（挿入部位）に制限酵素が認識する配列を利用して挿入すればよい。このように発現させようとする有用物質をコードするDNA自体が含まれておらず、該DNAを挿入する部分がマルチクローニング部位として含まれる発現カセットも本発明の発現カセットに含まれる。なお、発現させようとするDNAを標的DNAや目的DNAと呼び、タンパク質を標的タンパク質や目的タンパク質と呼ぶ場合もある。 In the expression cassette of the present invention, a site for inserting a DNA encoding a useful substance to be expressed may exist as a multiple cloning site. In this case, DNA encoding a useful substance to be expressed may be inserted into a multicloning site (insertion site) using a sequence recognized by a restriction enzyme. The expression cassette of the present invention also includes an expression cassette that does not include the DNA itself that encodes a useful substance to be expressed and includes a portion into which the DNA is inserted as a multicloning site. The DNA to be expressed may be referred to as target DNA or target DNA, and the protein may be referred to as target protein or target protein.
例えば、T7プロモーター、マルチクローニング部位及びターミネーターを含むDNAカセットとして、配列番号２８で表されるDNA配列を有するものが挙げられる。 For example, as a DNA cassette containing a T7 promoter, a multicloning site and a terminator, one having the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 28 can be mentioned.
有用物質をコードするDNAを大腸菌の偽遺伝子中にノックインする具体的な方法として、例えば、ラムダレッドとFLP-FRTリコンビナーゼを組合せた方法（Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51:109-118）や本発明者らが開発した方法（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）を挙げることができる。 As a specific method for knocking in DNA encoding a useful substance into a pseudogene of E. coli, for example, a method combining lambda red and FLP-FRT recombinase (Sukhija et al., Mol. Biotechnol. (2012) 51: 109 -118) and the method developed by the present inventors (Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44).
本発明において、大腸菌１細胞に導入するポリペプチド又はRNAをコードするDNAの種類数は限定されない。複数の種類のポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入した場合、同時に複数のポリペプチド又はRNAを生産することができる。例えば、１種類、２種類以上、３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、１０種類以上、１５種類以上又は２０種類以上のポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入することができる。また、各々のポリペプチド又はRNAをコードするDNAのコピー数も限定されず、１種類のDNAの導入コピー数が多ければ、多量のポリペプチド又はRNAを生産することができる。例えば、１コピー、２コピー以上、５コピー以上、１０コピー以上、２０コピー以上、３０コピー以上、４０コピー以上、５０コピー以上又は１００コピー以上のDNAを導入すればよい。 In the present invention, the number of types of DNA encoding a polypeptide or RNA introduced into one E. coli cell is not limited. When DNAs encoding a plurality of types of polypeptides or RNAs are introduced, a plurality of polypeptides or RNAs can be produced simultaneously. For example, 1 type, 2 types or more, 3 types or more, 4 types or more, 5 types or more, 6 types or more, 7 types or more, 8 types or more, 9 types or more, 10 types or more, 15 types or more or 20 types or more DNA encoding a peptide or RNA can be introduced. Further, the number of copies of DNA encoding each polypeptide or RNA is not limited, and a large amount of polypeptide or RNA can be produced if the number of introduced copies of one kind of DNA is large. For example, DNA of 1 copy, 2 copies or more, 5 copies or more, 10 copies or more, 20 copies or more, 30 copies or more, 40 copies or more, 50 copies or more or 100 copies or more may be introduced.
ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入する偽遺伝子の数も限定されず、大腸菌のゲノム中に存在するすべての偽遺伝子を利用することができ、例えば、異なるポリペプチド又はRNAをコードする複数のDNAを異なる偽遺伝子中に導入してもよいし、同じポリペプチド又はRNAをコードするDNAを異なる偽遺伝子中に導入して総コピー数を増やすこともできる。 The number of pseudogenes into which DNA encoding a polypeptide or RNA is introduced is not limited, and all pseudogenes present in the genome of E. coli can be used. For example, a plurality of pseudogenes encoding different polypeptides or RNAs can be used. DNA may be introduced into different pseudogenes, or DNA encoding the same polypeptide or RNA may be introduced into different pseudogenes to increase the total copy number.
１つの偽遺伝子中に複数種類のポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインする場合、あるいは１つの偽遺伝子中に複数コピーのポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインする場合、T7プロモーターは各DNAに連結してもよいし、再上流部に１つのT7プロモーターを連結してオペロンとしてもよい。 When knocking in DNA encoding multiple types of polypeptide or RNA in one pseudogene, or when knocking in DNA encoding multiple copies of polypeptide or RNA in one pseudogene, the T7 promoter It is also possible to link one T7 promoter to the re-upstream part to form an operon.
（２）キシロース又はアラビノースを用いてポリペプチド又はRNAの発現を誘導する生産系の確立
さらに本発明は、食料と競合しないリグノセルロース系バイオマスに含まれているキシロース、又はアラビノースでポリペプチド又はRNAの生産が誘導されることを特徴とする。キシロース又はアラビノースでポリペプチド又はRNAの生産を誘導するためには、キシロース誘導性のプロモーター又はアラビノース誘導性のプロモーターを用いればよい。キシロース誘導性のプロモーターとして、xylFプロモーター、xylAプロモーター、xylBプロモーター等が挙げられ、この中でもxylFプロモーターが好ましい。アラビノース誘導性プロモーターとして、araBADプロモーター、araBプロモーター等が挙げられ、この中でもaraBADプロモーターが好ましい。
(2) Establishment of production system for inducing expression of polypeptide or RNA using xylose or arabinose Further, the present invention provides xylose or arabinose containing polypeptide or RNA contained in lignocellulosic biomass that does not compete with food. Production is induced. In order to induce polypeptide or RNA production with xylose or arabinose, a xylose-inducible promoter or an arabinose-inducible promoter may be used. Examples of the xylose-inducible promoter include xylF promoter, xylA promoter, xylB promoter, etc. Among them, xylF promoter is preferable. Examples of the arabinose-inducible promoter include araBAD promoter and araB promoter, and among them, araBAD promoter is preferable.
ただし、キシロース誘導性のプロモーター及びアラビノース誘導性のプロモーターはプロモーター活性がそれほど強力ではないので、大腸菌のゲノム中の偽遺伝子に導入するポリペプチド又はRNAをコードするDNAのコピー数が少ない場合、ポリペプチド又はRNAを十分な量生産することができない。そこで、（１）の偽遺伝子へ導入するポリペプチド又はRNAをコードするDNAに連結した強力なプロモーターと組合せて発現させる。すなわち、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAに連結したプロモーターがT7プロモーターの場合、T7プロモーター-T7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）系と組み合わせればよい。また、プロモーターがT3プロモーターやSP6プロモーターの場合、T3プロモーター-T3 RNAポリメラーゼ系やSP6プロモーター-SP6 RNAポリメラーゼ系と組合せればよい。T7プロモーターはtaatacgactcactataggg（配列番号４３）からなる配列で、大腸菌のRNAポリメラーゼによっては、ほどんど認識されないがT7ファージ由来のT7RNAPによって特異的に認識され、転写が開始される。ごく少量のT7RNAPで大量のRNAを転写できるとされており、転写速度も大腸菌のRNAポリメラーゼより8倍早い（Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:12250-12254）。具体的には、キシロース誘導性プロモーター又はアラビノース誘導性のプロモーターの下流にT7プロモーターを認識するT7 RNAポリメラーゼをコードするDNAを機能し得るように連結する。キシロース誘導性プロモーター又はアラビノース誘導性のプロモーターとT7 RNAポリメラーゼを連結した構築物は、ベクターを用いて大腸菌のゲノムに導入すればよい。この際、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAを導入する偽遺伝子と異なる偽遺伝子中に導入してもよいし、大腸菌のlacZYA遺伝子中に導入してもよい。好ましくはlacZYA遺伝子に導入する。キシロース又はアラビノースの存在下で、キシロース誘導性プロモーター又はアラビノース誘導性のプロモーターとT7 RNAポリメラーゼをコードするDNAを連結した構築物とT7プロモーターとポリペプチド又はRNAをコードするDNAを連結した構築物を含む大腸菌を培養した場合、キシロース又はアラビノースにより、T7 RNAポリメラーゼが産生する。産生されたT7 RNAポリメラーゼがT7プロモーターを認識し結合することにより、T7プロモーターが作動し、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAが発現し、ポリペプチド又はRNAが産生される。 However, since the promoter activity of xylose-inducible promoter and arabinose-inducible promoter is not so strong, if the copy number of the polypeptide or RNA-encoding DNA to be introduced into the pseudogene in the genome of E. coli is small, the polypeptide Or a sufficient amount of RNA cannot be produced. Therefore, the gene is expressed in combination with a strong promoter linked to DNA encoding the polypeptide or RNA introduced into the pseudogene of (1). That is, when the promoter linked to the DNA encoding the polypeptide or RNA is the T7 promoter, it may be combined with the T7 promoter- T7 RNA polymerase (T7RNAP) system. When the promoter is a T3 promoter or SP6 promoter, it may be combined with a T3 promoter- T3 RNA polymerase system or an SP6 promoter- SP6 RNA polymerase system. The T7 promoter is a sequence consisting of taatacgactcactataggg (SEQ ID NO: 43). Although it is hardly recognized by E. coli RNA polymerase, it is specifically recognized by T7 RNAP derived from T7 phage, and transcription is initiated. It is said that a large amount of RNA can be transcribed with a very small amount of T7RNAP, and the transcription rate is 8 times faster than that of E. coli RNA polymerase (Makarova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 12250-12254 ). Specifically, the connecting manner can function DNA encoding T7 RNA polymerase recognizes the T7 promoter downstream of xylose inducible promoter or arabinose inducible promoter. A construct in which a xylose-inducible promoter or an arabinose-inducible promoter and T7 RNA polymerase are linked may be introduced into the genome of E. coli using a vector. At this time, it may be introduced into a pseudogene different from the pseudogene into which DNA encoding the polypeptide or RNA is introduced, or may be introduced into the lacZYA gene of E. coli. Preferably, it is introduced into the lacZYA gene. In the presence of xylose or arabinose, an Escherichia coli containing a construct in which a xylose-inducible promoter or an arabinose-inducible promoter and a DNA encoding a T7 RNA polymerase are linked and a construct in which a T7 promoter and a DNA encoding a polypeptide or RNA are linked. When cultured, T7 RNA polymerase is produced by xylose or arabinose. By The produced T7 RNA polymerase binds recognizes a T7 promoter, T7 promoter is activated, DNA encoding the polypeptide or RNA is expressed and the polypeptide or RNA is produced.
それでもなおキシロース誘導性プロモーター又はアラビノース誘導性のプロモーターの活性が低い場合には、これらプロモーターに変異を導入し、高活性型プロモーターを作成して用いても良い。例として、プロモーター中の-35配列と-10配列を、大腸菌プロモーターの共通配列であるTTGACAとTATAATにそれぞれ近づけることによって達成できる可能性が高い（De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21-25）。 If the activity of the xylose-inducible promoter or arabinose-inducible promoter is still low, mutations may be introduced into these promoters to create and use a highly active promoter. As an example, it is likely that this can be achieved by bringing the -35 and -10 sequences in the promoter closer to TTGACA and TATAAT, which are common sequences of the E. coli promoter, respectively (De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1983) 80: 21-25).
キシロース又はアラビノースを含むバイオマス中にグルコースが含まれる場合、炭素カタボライト抑制（CCR：carbon catabolite repression）によりxylF又はaraBADプロモーターからの遺伝子発現が抑制され、キシロースを利用できなくなる。CCRは、培地中にブドウ糖などの優先的に代謝される炭素源があるとそれを消費するまで、それ以外の炭素源の分解系の遺伝子発現を抑制する機構である。そこで、本発明でポリペプチド又はRNAを生産するために用いる大腸菌のCCRを抑制しておくことが望ましい。大腸菌のCCRの抑制は、例えば特開2013-005764号公報、Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44等の記載に従って達成することができる。具体的には、CCRの解除は、例えばMlc(making large colonies)タンパク質の過剰発現により行うことができる。Mlcタンパク質は、炭化水素代謝の調節因子として、いくつかの遺伝子やオペロンの発現を調節することが知られている44kDaのDNA結合タンパク質である（Hosono, K., et al., Biosci, Biotechnol. Biochem., 59, 256-261 (1995))。一例として、ptsG遺伝子の発現はMlcタンパク質によって負に制御されていることが知られている（Plumbridge, J. Curr. Opin. Microbiol. 5:187-193（2002））。Mlcタンパク質の過剰発現は、PtsGタンパク質の不足を引き起こし、CCRが解除される。Mlcタンパク質の過剰発現は、例えば、mlc遺伝子が導入されMlcを発現し得るベクターを大腸菌に導入することにより行うことができる。また、ゲノム上のmlcプロモーターDNAの塩基配列にmlcプロモーターが高活性型になるような変異（mlc *）を入れてもよい。このような変異として、例えば、mlcプロモーターの-10配列のcaccatからtattatへの変異が挙げられる。該変異は配列番号４４に示すmlcプロモーター配列の第３１番目のcのｔへの置換である。 When glucose is contained in biomass containing xylose or arabinose, gene expression from the xylF or araBAD promoter is suppressed by carbon catabolite repression (CCR), and xylose cannot be used. CCR is a mechanism that suppresses gene expression in the degradation system of other carbon sources until there is a preferentially metabolized carbon source such as glucose in the medium until it is consumed. Therefore, it is desirable to suppress CCR of Escherichia coli used for producing a polypeptide or RNA in the present invention. Inhibition of CCR of E. coli can be achieved, for example, as described in JP-A-2013-005764, Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44. Specifically, CCR can be released by, for example, overexpression of Mlc (making large colonies) protein. Mlc protein is a 44 kDa DNA-binding protein known to regulate the expression of several genes and operons as a regulator of hydrocarbon metabolism (Hosono, K., et al., Biosci, Biotechnol. Biochem., 59, 256-261 (1995)). As an example, it is known that the expression of the ptsG gene is negatively regulated by Mlc protein (Plumbridge, J. Curr. Opin. Microbiol. 5: 187-193 (2002)). Overexpression of Mlc protein causes PtsG protein deficiency and CCR is released. Overexpression of Mlc protein can be performed, for example, by introducing into Escherichia coli a vector into which mlc gene has been introduced and Mlc can be expressed. Further, a mutation ( mlc * ) that makes the mlc promoter highly active may be introduced into the base sequence of the mlc promoter DNA on the genome. Such mutations, for example, mutation to tattat from caccat -10 sequence of mlc promoter. This mutation is a substitution of the 31st c in the mlc promoter sequence shown in SEQ ID NO: 44 to t.
さらに、anmK、slyB、slyA、ydhI又はydhJ遺伝子の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの遺伝子の過剰発現によっても部分的な又は完全なCCRの解除を行うことができる。ここで、部分的な解除とは、不完全なCCRの解除をいう。ただし、このようなCCRの解除であっても、優先的に代謝される糖とそれ以外の糖を同時に利用することが可能になるので、有用である。本発明において、CCRの解除とは完全な解除だけでなく、部分的な解除も含む。上記５つの遺伝子のうち、特にslyA遺伝子の過剰発現が好ましい。これらの遺伝子の過剰発現は、これらの遺伝子が導入されこれらの遺伝子を発現し得るベクターを大腸菌に導入することにより行うことができる。あるいは、ブドウ糖の取り込みから解糖の初期段階に関わる一連の遺伝子群ptsG、pgi、fbpのうちの1つの遺伝子破壊あるいは、crpの変異crp * によってもCCRは解除されることが知られているので、これらのどれかを用いてもよい。これによって、ブドウ糖とキシロース若しくはアラビノースの共存下であっても（つまりバイオマスの存在する状況下で）、xylFプロモーター又はaraBADプロモーターから発現誘導することができる。 Furthermore, partial or complete CCR can also be released by overexpression of one, two, three, four or five genes of the anmK , slyB , slyA , ydhI or ydhJ genes. Here, partial release means incomplete CCR release. However, even such cancellation of CCR is useful because it is possible to simultaneously use sugars that are preferentially metabolized and other sugars. In the present invention, CCR cancellation includes not only complete cancellation but also partial cancellation. Of the above five genes, overexpression of the slyA gene is particularly preferable. Overexpression of these genes can be performed by introducing a vector into which these genes are introduced and capable of expressing these genes into E. coli. Alternatively, it is known that CCR is also released by disruption of one of a series of genes ptsG , pgi , fbp involved in glucose uptake to early glycolysis, or crp mutation crp * Any of these may be used. Thus, expression can be induced from the xylF promoter or the araBAD promoter even in the presence of glucose and xylose or arabinose (that is, in the presence of biomass).
大腸菌のゲノム上の偽遺伝子中にポリペプチド又はRNAをコードするDNAをノックインし、キシロース誘導性プロモーターをT7プロモーター-T7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）系と組み合わせ、さらに大腸菌のCCRを抑制することを含む、本発明の概念を図１に示す。図１においては、ポリペプチド又はRNAをコードするDNAとして、標的遺伝子A、標的遺伝子B及び標的遺伝子Cの３種類を用い、それぞれを大腸菌ゲノムの別々の偽遺伝子座位a、b及びcにノックインしてある。標的遺伝子A、B及びCはT7プロモーターと連結されている。また、xylFプロモーターと連結したT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が大腸菌ゲノムのlacZYA遺伝子座位に導入されている。キシロースを含むバイオマス存在下で図１に示す大腸菌を培養した場合、キシロースがxylFプロモーターに結合し、T7 RNAポリメラーゼが発現する。T7 RNAポリメラーゼは標的遺伝子に連結されたT7プロモーターに結合し、標的遺伝子が発現する。キシロースを含むバイオマス中にグルコースが存在する場合、mlc *変異等により炭素カタボライト抑制（CCR)を解除しておけばよい。 Including knocking in a DNA encoding a polypeptide or RNA into a pseudogene on the genome of E. coli, combining a xylose-inducible promoter with a T7 promoter- T7 RNA polymerase (T7RNAP) system, and further suppressing E. coli CCR, The concept of the present invention is shown in FIG. In FIG. 1, three types of genes, target gene A, target gene B, and target gene C, are used as DNAs encoding polypeptides or RNAs, and each is knocked in to separate pseudogene loci a, b, and c of the E. coli genome. It is. Target genes A, B and C are linked to the T7 promoter. In addition, a T7 RNA polymerase gene linked to the xylF promoter has been introduced into the lacZYA locus of the E. coli genome. When E. coli shown in FIG. 1 is cultured in the presence of biomass containing xylose, xylose binds to the xylF promoter and T7 RNA polymerase is expressed. T7 RNA polymerase binds to the T7 promoter linked to the target gene, and the target gene is expressed. When glucose is present in xylose-containing biomass, carbon catabolite suppression (CCR) may be canceled by mlc * mutation or the like.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕
実験手法
以下に記載の実施例において、大腸菌の培養、遺伝子組換え操作等は、本発明者らの論文および特許（Nakashima and Tamura, Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:136-148、Nakashima and Tamura, Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70:5557-5568、Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006）34:e138、Nakashima and Tamura, Nucleic Acids Res. (2009) 37:e103、特許第3793812号、特許3944577号）に基づいて行った。DNA断片の切断は、New England Biolab社の制限酵素を用いて行い、切断後はアガロースゲル電気泳動で分離し、必要なDNA断片のみを回収した。ゲルからのDNA断片回収はpromega社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemで行い、ライゲーション反応はタカラバイオ株式会社のDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を用いた。ライゲーション後の形質転換にはXL-1Blue大腸菌（recA1 endA1 gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacI q ZΔM15 Tn10]）を用い、方法は井上ら（Inoue et al., Gene (1990) 96:23-28）の方法に従った。PCR反応は東洋紡社製のKOD FX neo polymerase又はKOD plus neo polymeraseを用いた。オリゴヌクレオチドはオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成を委託した。特に断らない限り、タンパク質発現のための宿主とPCR反応のためのゲノムDNAには、野生型MG1655株（F- lambda- ilvG - rfb-50 rph-1）を用いた。特に断りがない限り、大腸菌の培養はLB（1(w/v)% Difco Bacto Tryptone、0.5(w/v)% Difco Yeast Extract、1(w/v)%塩化ナトリウム）を用いて37℃で行った。寒天培地による培養の場合、寒天濃度は1.6(w/v)%で、9 cm直径のプラスチックシャーレに入れたものを使った。また、環状プラスミドを含む大腸菌を培養する場合は対応する抗生物質を加えて行った。抗生物質の終濃度は、アンピシリン：50μg/mL、クロラムフェニコール：34μg/mL（原液は100%エタノールを溶媒として34 mg/mLの濃度で作成）、カナマイシン：20μg/mL、アプラマイシン：50μg/mLである。ブドウ糖、キシロース、アラビノースを培養液に加える場合は32(w/v)%の原液を作成しておき、それをザルトリウス社製ミニザルトフィルター0.22μM（商品コード16534K）で滅菌したものを用いた。
用いた主なプラスミドを表２に示す。
[Example 1]
Experimental Methods In the examples described below, the cultivation of E. coli, gene recombination operations, etc. were conducted according to the papers and patents of the present inventors (Nakashima and Tamura, Biotechnol. Bioeng. (2004) 86: 136-148, Nakashima and Tamura , Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 5557-5568, Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34: e138, Nakashima and Tamura, Nucleic Acids Res. (2009) 37: e103, Patent No. 3793712 No., Patent 3944577). The DNA fragments were cleaved using restriction enzymes from New England Biolab, and after cleaving, they were separated by agarose gel electrophoresis, and only the necessary DNA fragments were recovered. DNA fragments were recovered from the gel using Promega's Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, and ligation reaction was performed using a DNA Ligation Kit <Mighty Mix> from Takara Bio Inc. XL-1Blue E. coli ( recA1 endA1 gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac [F ' proAB lacI q ZΔM15 Tn10]) was used for transformation after ligation, and the method was Inoue et al., Gene (1990) 96: 23-28). For the PCR reaction, KOD FX neo polymerase or KOD plus neo polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used. Oligonucleotides were commissioned to Operon Biotechnology Co., Ltd. Unless otherwise stated, the genomic DNA for the host and PCR reactions for protein expression, wild type MG1655 strain (F - lambda - ilvG - rfb -50 rph-1) was used. Unless otherwise noted, E. coli culture was performed at 37 ° C using LB (1 (w / v)% Difco Bacto Tryptone, 0.5 (w / v)% Difco Yeast Extract, 1 (w / v)% sodium chloride). went. In the case of culturing with an agar medium, the agar concentration was 1.6 (w / v)%, and the one in a 9 cm diameter plastic petri dish was used. In addition, when culturing E. coli containing a circular plasmid, the corresponding antibiotic was added. The final concentrations of antibiotics are ampicillin: 50 μg / mL, chloramphenicol: 34 μg / mL (stock solution is prepared at a concentration of 34 mg / mL with 100% ethanol as solvent), kanamycin: 20 μg / mL, apramycin: 50 μg / mL. When adding glucose, xylose, and arabinose to the culture solution, a 32 (w / v)% stock solution was prepared and sterilized with a Sartorius mini-Salto filter 0.22 μM (product code 16534K). .
The main plasmids used are shown in Table 2.
〔実施例２〕
レポーター遺伝子mCherryによる、xylFプロモーターからの発現確認
まず、キシロースを用いた発現誘導系のベクター構築を行うこととした。xylFプロモーター配列を得るために、sSN1691R（aaactgcagtgcatgcgttaacgaacgcgatcgagctggtcaaaatagg：配列番号１）とsSN1692（ttccatggtgtagggccttctgtagttaga：配列番号２）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、MG1655株のゲノムを鋳型としてPCR反応を行った。得られた断片の末端をPstIとNcoIで処理し、pHN540u（Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006）34:e138）をPstIとNcoIで切断したベクターにライゲーションした。できたプラスミドにpHN1935と名付けた。
[Example 2]
Confirmation of expression from xylF promoter by reporter gene mCherry First, it was decided to construct a vector of an expression induction system using xylose. To obtain the xylF promoter sequence, two oligonucleotide primers of sSN1691R (aaactgcagtgcatgcgttaacgaacgcgatcgagctggtcaaaatagg: SEQ ID NO: 1) and sSN1692 (ttccatggtgtagggccttctgtagttaga: SEQ ID NO: 2) were prepared, and PCR reaction was performed using the genome of MG1655 strain as a template. The end of the resulting fragment was treated with Pst I and Nco I, pHN540u (Nakashima et al , Nucleic Acids Res (2006) 34:.. E138) was ligated to the cleaved vector with Pst I and Nco I. The resulting plasmid was named pHN1935.
xylFプロモーターの強度を知るためには、一般的によく知られたプロモーターとの対照実験をする必要がある。そこで、IPTG誘導型のtrcプロモーターを比較対象とした。IPTG誘導型発現ベクターpTrc99a（Amersham Biosciences社製）をSphIとEcoRIで切断して得られた1.5 kbの断片を、pHN540u（Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006）34:e138)の同一制限酵素部位にサブクローニングした。得られたプラスミドにpHN1032と名前をつけたが、これは、pHN1935と同じ形質転換マーカーのクロラムフェニコール耐性遺伝子（chl r ）と同じ自律複製起点のpACYC自律複製起点を持つ。pHN1032はさらに、IPTGによる発現制御のためにlacI q も保持している。 In order to know the strength of the xylF promoter, it is necessary to conduct a control experiment with a generally well-known promoter. Therefore, the IPTG inducible trc promoter was used as a comparison target. A 1.5 kb fragment obtained by cleaving the IPTG-inducible expression vector pTrc99a (Amersham Biosciences) with Sph I and Eco RI was obtained from pHN540u (Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34: e138). Subcloned into the same restriction enzyme site. The resulting plasmid was named pHN1032, which has the same autonomous replication origin pACYC autonomous replication origin as the chloramphenicol resistance gene ( chl r ), the same transformation marker as pHN1935. pHN1032 also retains lacI q for expression control by IPTG.
trcプロモーターとxylFプロモーターの強度と誘導性を知るために、赤色の蛍光を示すmCherryタンパク質をコードする遺伝子を人工合成した。配列は以下のとおりである。
atggttagcaaaggtgaagaggacaacatggcgattatcaaagagtttatgcgtttcaaggtgcacatggaaggctcggtaaatggtcacgaatttgagattgaaggtgagggcgagggtcgtccgtacgagggaacccagacggccaagctgaaagtgaccaaaggtggtccgctgccgttcgcgtgggacatcttgagcccgcagtttatgtacggctctaaagcgtacgtcaagcatccggcggacattccggactatctgaagctgagcttcccggaaggctttaagtgggagcgtgttatgaacttcgaagatggtggtgttgtcaccgtcacccaggatagcagcctgcaagatggcgaatttatctataaagtgaagctgcgtggcacgaattttccgtccgatggcccagttatgcagaagaaaacaatgggttgggaagcatccagcgagcgcatgtaccctgaggatggtgcactgaagggcgagatcaagcaacgcttgaaactgaaagatggcggtcactatgacgccgaggttaagacgacctataaggctaaaaagccggtgcaactgccgggtgcgtataatgtgaacatcaaactggacattacgagccataacgaggactacactattgtcgaacaatacgagcgcgcagaaggccgtcacagcaccggtggtatggacgagctgtacaaataa（配列番号３）
この配列を含むDNA断片をsSN1743（acccatggttagcaaaggtgaagaggacaa：配列番号４）とsSN1744（tgctcgagaaagcttcgaattcttatttgtacag：配列番号５）を用いてPCR増幅し、末端をNcoIとHindIIIで処理し、pHN1935とpHN1032の同一制限酵素部位にクローニングした。できたプラスミドにそれぞれ、pHN1990とpHN1982と名付けた。
In order to know the strength and inducibility of trc promoter and xylF promoter, a gene encoding mCherry protein showing red fluorescence was artificially synthesized. The sequence is as follows.
(SEQ ID NO: 3)
The DNA fragment containing this sequence sSN1743 (acccatggttagcaaaggtgaagaggacaa: SEQ ID NO: 4) and sSN1744 (tgctcgagaaagcttcgaattcttatttgtacag: SEQ ID NO: 5) was PCR amplified using to process ends with Nco I and Hin dIII, the pHN1935 the pHN1032 same restriction enzyme sites Cloned into. The resulting plasmids were named pHN1990 and pHN1982, respectively.
MG1655株をpHN1990とpHN1982でそれぞれ形質転換し、形質転換体を1 mLのLBで一晩前培養後、うち8.3μLを新しい5 mL LBにそれぞれ植菌した。pHN1990を持つMG1655株では同一のものを3つ、pHN1982を持つMG1655では2つ用意した。振とう培養を1.5時間行ったところで、pHN1990を持つMG1655には、3つのうちの１つにブドウ糖を終濃度1(w/v)%、別の1つにブドウ糖終濃度1%かつキシロース終濃度0.5(w/v)%、また別の1つにキシロース終濃度0.5(w/v)%になるように添加した。同様に、pHN1982を持つMG1655株には、2つのうち1つにブドウ糖を終濃度1(w/v)%、もう1つにIPTGを終濃度1 mMになるように入れた。そして、5つ全てにおいて、さらに4.5時間培養を継続した。培養後、培養液を遠心分離に供し、上清を捨てた。沈殿した菌体を500μLのPBS(0.14 M NaCl、2.7 mM KCl、10.1 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4)に懸濁し、そこに直径0.1 mmのガラスビーズ（安井機械社製）0.1 gを混合した。これを安井機械社製ビーズショッカーにかけ、菌体を破砕した後、20000×g、4℃、10分遠心することで上清を得た。これが粗タンパク質液となる。粗タンパク質液のうち、180μLを取り出し、Costar社製96 Well Flat Bottom Assay Plate（Black polystyrene）に入れ、mCherryの蛍光強度を測定した。測定は、SAFIRE（Tecan社製）とLS-PLATEmanager 2004 data analysis program（和光純薬工業株式会社）を用い、設定は以下のとおりであった：励起波長587 nm、蛍光波長610 nm、gain 100、Excitation bandwidth 12 nm、Emission bandwidth 12 nm、Number of flashes 10、Z-Position (Manual) 11020μm、Lag time 0μs、Integration time 40μs。蛍光強度を粗タンパク質液中の総タンパク質量当たりに換算するために、タンパク質量をバイオ・ラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬によって測定した。さらに、蛍光のバックグラウンドを計算上取り除くため、これと同一の操作を、MG1655株をpHN1032で形質転換したものを用いて並行して行った（培養はLBで、培養開始後1.5時間後にブドウ糖を終濃度1(w/v)%添加したもの）。タンパク質量あたりのmCherry蛍光強度を図2に示す。図２AはpHN1990形質転換体の結果を示し、図２BはpHN1982形質転換体の結果を示す。
The MG1655 strain was transformed with pHN1990 and pHN1982, respectively, and the transformant was pre-cultured overnight with 1 mL of LB, and then 8.3 μL was inoculated into a new 5 mL LB. Three identical MG1655 strains with pHN1990 and two MG1655 strains with pHN1982 were prepared. After 1.5 hours of shaking culture, MG1655 with pHN1990 has a final glucose concentration of 1 (w / v)% in one of the three, a final glucose concentration of 1% and a final xylose concentration in the other. 0.5 (w / v)% was added to another one so that the final concentration of xylose was 0.5 (w / v)%. Similarly, in the MG1655 strain having pHN1982, glucose was added to one of the two at a final concentration of 1 (w / v)%, and the other to IPTG at a final concentration of 1 mM. In all five, the culture was further continued for 4.5 hours. After culturing, the culture solution was centrifuged and the supernatant was discarded. The precipitated cells are suspended in 500 μL of PBS (0.14 M NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 ), and 0.1 mm diameter glass beads (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) 0.1 g was mixed. This was applied to a bead shocker manufactured by Yasui Machinery Co., Ltd., and the cells were crushed, and then centrifuged at 20000 × g, 4 ° C. for 10 minutes to obtain a supernatant. This becomes a crude protein solution. Of the crude protein solution, 180 μL was taken out and placed in a 96-well flat bottom assay plate (Black polystyrene) manufactured by Costar, and the fluorescence intensity of mCherry was measured. The measurement was performed using SAFIRE (Tecan) and LS-PLATEmanager 2004 data analysis program (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the settings were as follows: excitation wavelength 587 nm, fluorescence wavelength 610 nm, gain 100,
この結果から、trcプロモーターに比べてxylFプロモーターはずっと低い発現量しか達成できないことがわかった。ただし、xylFプロモーターの発現制御機構は予想通り機能しており、ブドウ糖単独存在下あるいはブドウ糖とキシロース共存下では発現が抑制されており、キシロース単独存在下のみで発現していた。 From this result, it was found that the expression level of the xylF promoter was much lower than that of the trc promoter. However, the expression control mechanism of the xylF promoter functions as expected, and its expression was suppressed in the presence of glucose alone or in the presence of glucose and xylose, and was expressed only in the presence of xylose alone.
〔実施例３〕
xylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットあるいは、T7プロモーターを含むベクターの構築
実施例２に記載したように、xylFプロモーターは、発現制御は容易にできても、発現量が低く実用的ではない。そこで、T7RNAPを用いた発現量増幅を行うことにした。まず、そのためのベクター作成を行った。
Example 3
xylF Promoter- Construction of T7RNAP Gene Cassette or Vector Containing T7 Promoter As described in Example 2, although the expression control of xylF promoter is easy, its expression level is low and it is not practical. Therefore, it was decided to perform expression level amplification using T7RNAP. First, we made a vector for that purpose.
lacZYA座位に遺伝子をノックインするベクターを作成するために、sSN1700（gctatgcattaactatccgctggatgaccagg：配列番号６）とsSN1701（tggtctagaaggcctctgcagcctggggtgcctaatgagtgagctaactc：配列番号７）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、野生型MG1655株のゲノムを鋳型としてPCR反応を行った。その際、sSN1701はその末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs社製）を用いてリン酸化しておいた。得られた断片の末端をNsiIで処理した。一方、sSN1702（tggctcgagggatccatgcatcagccgctacagtcaacagcaactgatgg：配列番号８）とsSN1703（tttacatgtctgaacagttccagtgccagct：配列番号９）の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、野生型MG1655株のゲノムを鋳型としてPCR反応を行った。得られた断片の末端をPciIで処理した。これら2つの断片とプラスミドベクターpHN1234（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）をPstIとNcoIで切断したものを同時にライゲーションした。できたプラスミドにpHN1931と名付けた。pHN1931を図3に示すが、このベクターのマルチプルクローニング部位に、標的遺伝子をクローニングすれば、lacZYA座位に標的遺伝子をノックインすることができる。 In order to create a vector that knocks in a gene at the lacZYA locus, two oligonucleotide primers sSN1700 (gctatgcattaactatccgctggatgaccagg: SEQ ID NO: 6) and sSN1701 (tggtctagaaggcctctgcagcctggggtgcctaatgagtgagctaactc: SEQ ID NO: 7) were used as template templates, and 655 wild type primers were used. PCR reaction was performed. At that time, the end of sSN1701 was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs). The end of the obtained fragment was treated with NsiI . On the other hand, two oligonucleotide primers, sSN1702 (tggctcgagggatccatgcatcagccgctacagtcaacagcaactgatgg: SEQ ID NO: 8) and sSN1703 (tttacatgtctgaacagttccagtgccagct: SEQ ID NO: 9) were prepared, and PCR reaction was performed using the genome of the wild type MG1655 strain as a template. The end of the obtained fragment was treated with Pci I. These two fragments and the plasmid vector pHN1234 (Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44) cut with Pst I and Nco I were ligated simultaneously. The resulting plasmid was named pHN1931. pHN1931 is shown in FIG. 3, and the target gene can be knocked in at the lacZYA locus by cloning the target gene into the multiple cloning site of this vector.
tetR配列を大腸菌ER2508株（New England BioLabs社より入手）のゲノムからPCRにて増幅した。その際のオリゴヌクレオチドプライマーはsSN1174（gttaacatgtctagattagataaaagtaaagtgatt：配列番号１０）とsSN1175（ctctgcagttaagacccactttcacatttaagt：配列番号１１)であった。増幅した断片を PstIで切断し、pHN540uをPstIとEcoRV で切断したベクターとライゲーションし、できたプラスミドにpHN1235と名前をつけた。テトラサイクリンプロモーター配列（Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. (1997) 25:1203-1210）を4つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Di Donatoらの方法（Di Donato et al., Anal. Biochem. (1993) 212:291-293）に従って人工的に合成した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、sSN1179（cagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatc：配列番号１２）、sSN1180（cctctttaatgaattcggtcagtgcgtcctgctgatgtgctcagtatct：配列番号１３）、sSN1181 （aaacgcgtccctatcagtgatagagattg：配列番号１４）、sSN1182（aaccatggtatatttctcctctttaatgaattcg：配列番号１５）であった。得られた断片の末端をMluIとNcoIで処理し、pHN1235をMluIとNcoIで切断したベクターとライゲーションした。これによって、pHN1240を得た。弱い構成的homプロモーター（Patek et al., J. Biotechnol. (2003) 104:325-334)を取得するため、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株のゲノムを鋳型とし、sSN1214（aaaacgcgtacattgaaaactaaaaagctg：配列番号１６）とsSN1215（gacggttctccaaaacaaaaagggtaccta：配列番号１７）をオリゴヌクレオチドプライマーとしてPCR反応を行った。得られた断片をMluIで切断し、pHN1240をMluIとHincIIで切断したベクターにライゲーションした。得られたプラスミドにpHN1271と名前をつけた。pHN1270（Nakashima and Tamura, Nucleic Acids Res. (2009) 37:e103）を鋳型、sSN1212（tctcgctagctttcttcagggccgacaatc：配列番号１８）とsSN1058（tttgctagcaggtcgtaaatcactgcataattc：配列番号１９）をオリゴヌクレオチドプライマーとしてPCR反応を行った。得られた断片をSpeIで切断した。一方、pHN1271を鋳型、sSN1175（ctctgcagttaagacccactttcacatttaagt：配列番号２０）とsSN1011（aaaggtaccgtggaggtaataattgacgatatga：配列番号２１）をオリゴヌクレオチドプライマーとしてPCR反応を行った。この際、sSN1011はその末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化しておいた。得られた断片をSpeIで切断し、前述の断片とライゲーションし、得られたプラスミドにpHN1377と名前をつけた。T7RNAP配列を大腸菌BL21(DE3)株（F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1ind1 sam7 nin5]))のゲノムからPCRにて増幅した。その際のオリゴヌクレオチドプライマーはsSN1062（ctccatggacacgattaacatcgctaagaacgacttc：配列番号２２）とsSN1063（aaactagttacgcgaacgcgaagtccgactctaag：配列番号２３)であった。増幅した断片を NcoIとSpeIで切断し、pHN1377をNcoIとSpeIで切断したものとライゲーションし、できたプラスミドにpHN1850と名前をつけた。xylFプロモーター配列を大腸菌MG1655株のゲノムからPCRにて増幅した。その際のオリゴヌクレオチドプライマーはsSN1691R（aaactgcagtgcatgcgttaacgaacgcgatcgagctggtcaaaatagg：配列番号２４）とsSN1692（ttccatggtgtagggccttctgtagttaga：配列番号２５)であった。増幅した断片をPstIとNcoIで切断し、pHN1850をPstIとNcoIで切断したものとライゲーションし、できたプラスミドにpHN1946と名前をつけた。xylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットを含む断片をpHN1946からPstIとSpeIで切り出し、pHN1931をNsiIとXbaIで切断したベクターにライゲーションした。できたプラスミドにpHN1950と名付けた。pHN1950はxylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットをlacZYA遺伝子領域配列に挟まれるようにして持つ。ベクターのマップを図4に示す。 The tetR sequence was amplified by PCR from the genome of E. coli ER2508 strain (obtained from New England BioLabs). The oligonucleotide primers at that time were sSN1174 (gttaacatgtctagattagataaaagtaaagtgatt: SEQ ID NO: 10) and sSN1175 (ctctgcagttaagacccactttcacatttaagt: SEQ ID NO: 11). The amplified fragment was cleaved with Pst I, pHN540u was ligated with a vector cleaved with Pst I and Eco RV, and the resulting plasmid was named pHN1235. The tetracycline promoter sequence (Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. (1997) 25: 1203-1210) was used in the method of Di Donato et al. (Di Donato et al., Anal. Biochem. (1993) using four oligonucleotide primers. 212: 291-293). Oligonucleotide primers used were sSN1179 (cagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatc: SEQ ID NO: 12), sSN1180 (cctctttaatgaattcggtcagtgctgt: SEQ ID NO: 13), sSN1181 (aaacgcgtccctgcattt The end of the resulting fragment was treated with Mlu I and Nco I, and ligated with the vector obtained by cutting the pHN1235 with Mlu I and Nco I. This gave pHN1240. In order to obtain a weak constitutive hom promoter (Patek et al., J. Biotechnol. (2003) 104: 325-334), using the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template, sSN1214 (aaaacgcgtacattgaaaactaaaaagctg: SEQ ID NO: 16) and sSN1215 ( PCR reaction was performed using gacggttctccaaaacaaaaagggtaccta (SEQ ID NO: 17) as an oligonucleotide primer. The resulting fragment was cut with Mlu I, and ligated into a vector by cutting the pHN1240 with Mlu I and Hin cII. The resulting plasmid was named pHN1271. PCR reaction was performed using pHN1270 (Nakashima and Tamura, Nucleic Acids Res. (2009) 37: e103) as a template and sSN1212 (tctcgctagctttcttcagggccgacaatc: SEQ ID NO: 18) and sSN1058 (tttgctagcaggtcgtaaatcactgcataattc: SEQ ID NO: 19) as oligonucleotide primers. The obtained fragment was cut with SpeI . On the other hand, PCR reaction was performed using pHN1271 as a template, sSN1175 (ctctgcagttaagacccactttcacatttaagt: SEQ ID NO: 20) and sSN1011 (aaaggtaccgtggaggtaataattgacgatatga: SEQ ID NO: 21) as oligonucleotide primers. At this time, the end of sSN1011 was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase. The obtained fragment was cleaved with Spe I, ligated with the above-mentioned fragment, and the obtained plasmid was named pHN1377. E. coli BL21 and T7RNAP sequence (DE3) strain (F - ompT gal dcm lon hsdSB (rB - mB -) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1ind1 sam7 nin5])) was amplified by PCR from the genome. The oligonucleotide primers at that time were sSN1062 (ctccatggacacgattaacatcgctaagaacgacttc: SEQ ID NO: 22) and sSN1063 (aaactagttacgcgaacgcgaagtccgactctaag: SEQ ID NO: 23). The amplified fragment was digested with Nco I and Spe I, and ligated to those obtained by cutting the pHN1377 with Nco I and Spe I, named and pHN1850 to be plasmid. The xylF promoter sequence was amplified by PCR from the genome of Escherichia coli MG1655 strain. The oligonucleotide primers at that time were sSN1691R (aaactgcagtgcatgcgttaacgaacgcgatcgagctggtcaaaatagg: SEQ ID NO: 24) and sSN1692 (ttccatggtgtagggccttctgtagttaga: SEQ ID NO: 25). The amplified fragment was digested with Pst I and Nco I, and ligated to those obtained by cutting the pHN1850 with Pst I and Nco I, named and pHN1946 to be plasmid. xylF promoter - a fragment containing the T7RNAP gene cassette from pHN1946 cut out with Pst I and Spe I, and ligated into a vector by cutting the pHN1931 with Nsi I and Xba I. The resulting plasmid was named pHN1950. pHN1950 has an xylF promoter- T7 RNAP gene cassette sandwiched between lacZYA gene region sequences. A vector map is shown in FIG.
pHN678（Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006）34:e138）を鋳型として、sSN1011（aaaggtaccgtggaggtaataattgacgatatga：配列番号２６）とsSN1173（ggggtacctgagcaaactggcctca：配列番号２７）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、PCR反応を行い、得られた断片の末端をKpnIで処理し自己ライゲーションした。できたプラスミドにpHN1932と名付けた。オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼し、以下の配列のDNA断片を合成した。
gctagcctgcagatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggttcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggccaccatcaccatcaccatatgggaattctacgtagcggccgcggatccaagcttagatctctcgagaactagtccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaaggtacc（配列番号２８）
この配列は、T7プロモーターとターミネーターを含み、さらにマルチクローニング部位を持つ。この配列を持つDNA断片をPstIとKpnIで切り出し、pHN1932の同サイトにクローニングした。できたプラスミドにpHN1944と名付けた。次いで、pHN678を鋳型として、sSN1726（cttctgcagaatgcatctgtcaaacatgagaattacaacttatatcg：配列番号２９）とsSN1079（cgactagtgcgtcgggtgatgctgccaact：配列番号３０）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、PCR反応を行い、得られた断片をPstIとNheIで消化し、pHN1944の同サイトにクローニングした。できたプラスミドにpHN1948と名付けた。pHN1948はT7プロモーターとターミネーターを含み、それらのあいだにマルチクローニング部位を持つT7発現ベクターである。ベクターのマップを図5に示す。
Using pHN678 (Nakashima et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34: e138) as a template, PCR reaction was performed with two oligonucleotide primers, sSN1011 (aaaggtaccgtggaggtaataattgacgatatga: SEQ ID NO: 26) and sSN1173 (ggggtacctgagcaaactggcctca: SEQ ID NO: 27). Then, the ends of the obtained fragments were treated with KpnI and self-ligated. The resulting plasmid was named pHN1932. We commissioned Operon Biotechnology Co., Ltd. to synthesize DNA fragments with the following sequences.
gctagcctgcagatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggttcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggccaccatcaccatcaccatatgggaattctacgtagcggccgcggatccaagcttagatctctcgagaactagtccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaaggtacc (SEQ ID NO: 28)
This sequence contains a T7 promoter and terminator, and has a multiple cloning site. A DNA fragment having this sequence was excised with Pst I and Kpn I and cloned into the same site of pHN1932. The resulting plasmid was named pHN1944. Next, using pHN678 as a template, PCR reaction was performed with two oligonucleotide primers sSN1726 (cttctgcagaatgcatctgtcaaacatgagaattacaacttatatcg: SEQ ID NO: 29) and sSN1079 (cgactagtgcgtcgggtgatgctgccaact: SEQ ID NO: 30), and the resulting fragment was digested with Pst I and Nhe I And cloned into the same site of pHN1944. The resulting plasmid was named pHN1948. pHN1948 is a T7 expression vector containing a T7 promoter and terminator with a multicloning site between them. A vector map is shown in FIG.
〔実施例４〕
lacZYA座位へのxylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットのノックイン
以下、pHN1950を用いて野生型MG1655株にxylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットを導入する過程を述べるが、これは、Emmersonらの発表した方法（Emmerson et al., Biol. Proced. Online (2006) 8:153-162）によるものである。pHN1950はpSC101自律複製起点をもつプラスミドであるが、一箇所の点突然変異（GenBank登録番号X01654の、5439番目の塩基がシトシンからチミンに変化）により、温度感受性のプラスミドとなっており（pSC101ts 自律複製起点）、37℃を超える温度で培養されると、環状プラスミドとして細胞内で維持されない（Armstrong et al., J. Mol. Biol. (1984) 175:331-347）。よって、37℃を超える温度では、pHN1950は脱落するか、相同組換えあるいは非相同組換えによって大腸菌のゲノム内に挿入されるかのどちらかとなる。相同組換えでゲノムに挿入されるのであれば、lacZYA座位に対する相同配列を持っていることから、かなりの高確率でこの座位にノックインされることなる。さらに、pHN1950はカウンター選択マーカーであるsacBをもつことから、スクロースの10(w/v)%入ったLB中で培養すると、xylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットのみをゲノム内に残して、それ以外の部分はゲノム内相同組換えによって脱落することになる。ただし、必ずしも想定通りに脱落するとは限らないので、コロニーPCR法などによって周辺の遺伝子構成を調べなくてはならない。
Example 4
Knock- in of the xylF promoter- T7RNAP gene cassette to the lacZYA locus The following describes the process of introducing the xylF promoter- T7RNAP gene cassette into the wild-type MG1655 strain using pHN1950. This method is described by Emmerson et al. , Biol. Proced. Online (2006) 8: 153-162). pHN1950 is a plasmid with pSC101 autonomous replication origin, but it is a temperature-sensitive plasmid due to a point mutation (GenBank accession number X01654, the 5439th base changed from cytosine to thymine) (pSC101 ts Autonomous replication origin), when cultured at temperatures above 37 ° C., it is not maintained intracellularly as a circular plasmid (Armstrong et al., J. Mol. Biol. (1984) 175: 331-347). Thus, at temperatures above 37 ° C, pHN1950 either drops off or is inserted into the E. coli genome by homologous or non-homologous recombination. But it might be inserted into the genome by homologous recombination, from having homologous sequences to the lacZYA locus will be being knocked to the locus at a fairly high probability. Furthermore, since pHN1950 has a counter selection marker, sacB , when cultured in LB containing 10% (w / v) of sucrose, only the xylF promoter- T7RNAP gene cassette remains in the genome and the rest Will be lost by homologous recombination within the genome. However, it does not necessarily drop out as expected, so the surrounding gene structure must be examined by colony PCR or the like.
まずMG1655株をpHN1950で形質転換し（ただし30℃培養）、形質転換体のコロニーを爪楊枝でLB寒天培地に塗布、42℃で培養した。純化するために、出てきたコロニーをもう一度爪楊枝でLB寒天培地に塗布し、37℃で培養した。出てきたコロニーを1 mLの液体LBで一晩30℃で培養し、爪楊枝の先をその培養液に浸し、スクロースの10%入ったLB寒天培地に塗布し、一晩30℃で培養した。出てきたコロニーをコロニーPCR法で、想定通りノックインされているかどうか確認した。できた株にMG1655XT7と名付けた。 First, the MG1655 strain was transformed with pHN1950 (30 ° C. culture), and a colony of the transformant was applied to an LB agar medium with a toothpick and cultured at 42 ° C. In order to purify, the colonies that emerged were once again applied to the LB agar medium with a toothpick and cultured at 37 ° C. The emerged colony was cultured overnight at 30 ° C. in 1 mL of liquid LB, the tip of the toothpick was immersed in the culture solution, applied to an LB agar medium containing 10% sucrose, and cultured at 30 ° C. overnight. The colonies that emerged were confirmed by the colony PCR method as to whether they were knocked in as expected. The resulting strain was named MG1655XT7.
〔実施例５〕
CCR解除とT7RNAPを用いた発現量増幅
まず、mCherry発現ベクターの作成を以下のように行った。pHN1982からmCherry遺伝子を含むDNA断片をNcoIとHindIIIで切り出し、pHN1948を同酵素で切断したベクター断片とライゲーションし、pHN1984を得た。
Example 5
CCR release and expression level amplification using T7RNAP First, an mCherry expression vector was constructed as follows. cut with Nco I and Hin dIII and DNA fragment containing the mCherry gene from PHN1982, and ligated with the vector fragment was cut with the same enzymes to PHN1948, to obtain a PHN1984.
CCRを解除された株を作成するために、以下の操作を行った。ゲノム上の野生型mlcとcrpをそれぞれmlc * とcrp * に変異させる方法は、本発明者らが発表済みである（Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114:38-44）。その方法によってMG1655の当該遺伝子を変異させた株を作成し、名称をそれぞれ、MG1655mlc*、MG1655crp*とした。さらに大腸菌では、解糖系の連続した初期3反応に関与するptsG、pgi、fbp遺伝子のいずれかを破壊することでもCCRを解除できることが知られている（Kimata et al., EMBO J. (2001) 20:3587-3595）。ここでは、MG1655株のpgiを破壊したMG1655Δpgiを作成した。作成方法を以下に示す。MG1655株ゲノムを鋳型、sSN1593（ttcctgcaggatctcaacaaacagcaggg：配列番号３１）とsSN1499（ctccatggcagcggtctgcgttggattgat：配列番号３２）をオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、pgi遺伝子5’領域をPCR増幅した。なお、このPCRに先立って、sSN1499はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端をリン酸化した。一方、MG1655株ゲノムを鋳型、sSN1594（ccacgatagctcgaccaatggtct：配列番号３３）とsSN1595（gaggatcccacagtgaattgcccagctctt：配列番号３４）をオリゴヌクレオチドプライマープライマーとして用いて、pgi遺伝子3’領域をPCR増幅した。増幅した両断片を前者はPstIで、後者はBamHIで消化し、pHN1234をPstIとBamHIで切断したベクター断片に同時にライゲーションした。得られたプラスミドにpHN1747と名前をつけた。pHN1747をMG1655に形質転換した後は、実施例４に記したものと全く同じ方法で操作しpgi破壊株を得た。 The following operations were performed to create a CCR-released strain. A method for mutating wild-type mlc and crp on the genome to mlc * and crp * has been published by the present inventors (Nakashima and Tamura J. Biosci. Bioeng. (2012) 114: 38-44). By this method, strains in which the gene of MG1655 was mutated were prepared and named MG1655mlc * and MG1655crp *, respectively. Furthermore, in E. coli, it is known that CCR can also be released by disrupting any of the ptsG , pgi , and fbp genes involved in the initial three consecutive glycolytic reactions (Kimata et al., EMBO J. (2001 ) 20: 3587-3595). Here, MG1655Δpgi was prepared by destroying the pgi of MG1655 strain. The creation method is shown below. The pgi gene 5 ′ region was PCR-amplified using the MG1655 strain genome as a template, sSN1593 (ttcctgcaggatctcaacaaacagcaggg: SEQ ID NO: 31) and sSN1499 (ctccatggcagcggtctgcgttggattgat: SEQ ID NO: 32) as oligonucleotide primers. Prior to this PCR, sSN1499 was phosphorylated at the 5 ′ end using T4 polynucleotide kinase. On the other hand, the pgi gene 3 ′ region was PCR amplified using the MG1655 strain genome as a template, sSN1594 (ccacgatagctcgaccaatggtct: SEQ ID NO: 33) and sSN1595 (gaggatcccacagtgaattgcccagctctt: SEQ ID NO: 34) as oligonucleotide primer primers. Both amplified fragments were digested with Pst I in the former and Bam HI in the latter, and pHN1234 was simultaneously ligated to the vector fragment digested with Pst I and Bam HI. The resulting plasmid was named pHN1747. After transforming pHN1747 to MG1655, a pgi- disrupted strain was obtained by operating in exactly the same manner as described in Example 4.
そして、MG1655mlc*、MG1655crp*、MG1655Δpgiの３株のlacZYA座位に、実施例４に記したものと全く同じ方法で、xylFプロモーター-T7RNAP遺伝子カセットのノックインを行った。できた株にそれぞれ、MG1655mlc*XT7、MG1655crp*XT7、MG1655ΔpgiXT7と名付けた。 Then, the xylF promoter- T7 RNAP gene cassette was knocked in at the lacZYA locus of three strains, MG1655mlc *, MG1655crp *, and MG1655Δpgi, in exactly the same manner as described in Example 4. The resulting strains were named MG1655mlc * XT7, MG1655crp * XT7, and MG1655ΔpgiXT7, respectively.
MG1655、MG1655XT7、MG1655mlc*XT7、MG1655crp*XT7、MG1655ΔpgiXT7をpHN1984で形質転換し、MG1655株は別にpHN1982でも形質転換した。形質転換体を1 mLのLBで一晩前培養後、うち8.3μLを新しい5 mL LBにそれぞれ植菌した。pHN1984を持つ各株では同一のものを3つ、pHN1982を持つMG1655は2つ用意した。振とう培養を1.5時間行ったところで、pHN1984を持つ各株には、3つのうち1つにブドウ糖を終濃度1%、別の1つにブドウ糖終濃度1(w/v)%かつキシロース終濃度0.5(w/v)%、また別の1つにキシロース終濃度0.5(w/v)%になるように添加した。同様に、pHN1982を持つMG1655には、2つのうち1つにブドウ糖を終濃度1(w/v)%、もう１つにIPTGを終濃度 1 mMになるように入れた。そして、全てをさらに4.5時間培養を継続した。培養後、培養液を180μLを取り出し、Costar社製96 Well Flat Bottom Assay Plate（Black polystyrene）に入れ、mCherryの蛍光強度を測定した。この実験では発現量が多かったため、実施例２とは異なり、細胞を破砕しなくてもmCherryの測定が可能であった。測定は、SAFIREとLS-PLATEmanager 2004 data analysis programを用い、設定は以下のとおりであった：励起波長587 nm、蛍光波長610 nm、gain 80、Excitation bandwidth 12 nm、Emission bandwidth 12 nm、Number of flashes 10、Z-Position (Manual) 11020μm、Lag time 0μs、Integration time 40μs。蛍光強度を培養液の濁度当たり（すなわち細胞数当たり）に換算するために、培養液の濁度をSAFIREとLS-PLATEmanager 2004 data analysis programで測定した。濁度測定は、培養液を5倍にLBで希釈したもの180μLをNunc社製96 Well Flat Bottom Assay Plate（商品コード269620）を用いて測定した。さらに、蛍光のバックグラウンドを計算上取り除くため、これと同一の操作を、MG1655株をpHN1032で形質転換したものを用いて並行して行った（培養はLBで、培養開始後1.5時間後にブドウ糖を終濃度1%添加したもの）。濁度あたりのmCherry蛍光強度を図6に示す。
MG1655, MG1655XT7, MG1655mlc * XT7, MG1655crp * XT7, and MG1655ΔpgiXT7 were transformed with pHN1984, and the MG1655 strain was also transformed with pHN1982. Transformants were pre-cultured overnight with 1 mL of LB, and 8.3 μL of each was inoculated into a new 5 mL LB. Each strain with pHN1984 prepared three identical strains, and two MG1655 with pHN1982. After 1.5 hours of shaking culture, each strain with pHN1984 had a final glucose concentration of 1% in one of the three, a final glucose concentration of 1 (w / v)% and a final xylose concentration in the other. 0.5 (w / v)% was added to another one so that the final concentration of xylose was 0.5 (w / v)%. Similarly, in MG1655 having pHN1982, glucose was added to one of two at a final concentration of 1 (w / v)%, and the other to IPTG at a final concentration of 1 mM. All of them were further cultured for 4.5 hours. After the culture, 180 μL of the culture solution was taken out and placed in a 96-well flat bottom assay plate (Black polystyrene) manufactured by Costar, and the fluorescence intensity of mCherry was measured. In this experiment, since the expression level was large, unlike Example 2, it was possible to measure mCherry without disrupting the cells. Measurement was performed using SAFIRE and LS-PLATEmanager 2004 data analysis program, and the settings were as follows: excitation wavelength 587 nm, fluorescence wavelength 610 nm, gain 80,
まず、MG1655株ではどの培養条件でもmCherryの発現がほとんど認められなかったことから、T7プロモーターからの発現がT7RNAPに依存していることがわかる。MG1655XT7ではキシロース単独存在下でもっとも高い発現が見られた。ただし、キシロース非存在下でも多くのmCherryの発現が確認されたことから、いわゆる「basal level」での発現が高いことが示唆された。MG1655mlc*XT7、MG1655crp*XT7、MG1655ΔpgiXT7では、すべての株で、ブドウ糖とキシロース共存下でも、キシロース単独存在下とほぼ同等の発現が認められた。また、trcプロモーターに比べてT7プロモーターは高い発現量を達成できることもわかった。よって、これら変異による、CCR機構解除と高発現が想定通りできたことが示され、キシロース、ひいてはリグノセルロース系バイオマスでの発現誘導が可能になった。 First, mCherry expression was hardly observed in any of the culture conditions in the MG1655 strain, indicating that the expression from the T7 promoter is dependent on T7RNAP. MG1655XT7 showed the highest expression in the presence of xylose alone. However, the expression of many mCherrys was confirmed even in the absence of xylose, suggesting that the expression at the so-called “basal level” is high. In MG1655mlc * XT7, MG1655crp * XT7, and MG1655ΔpgiXT7, almost the same expression as in the presence of xylose alone was observed in all strains even in the presence of glucose and xylose. It was also found that the T7 promoter can achieve a higher expression level than the trc promoter. Therefore, it was shown that the CCR mechanism was canceled and high expression was achieved as expected by these mutations, and expression induction was possible in xylose and by extension, lignocellulosic biomass.
〔実施例６〕
偽遺伝子座位へ遺伝子ノックインするためのベクター作成
実施例５までは、全て、発現させたい遺伝子（ここではmCherry）を環状プラスミドで供給してきた。しかし、有用物質生産に資する発現系を構築するためには、環状プラスミドは不適である。よって、発現させたい遺伝子を大腸菌ゲノムにノックインしなければならない。
Example 6
Preparation of a vector for gene knock-in to the pseudogene locus Up to Example 5, the gene to be expressed (here, mCherry) has been supplied as a circular plasmid. However, circular plasmids are not suitable for constructing an expression system that contributes to the production of useful substances. Therefore, the gene to be expressed must be knocked into the E. coli genome.
すでに述べたように、偽遺伝子は大腸菌ゲノム内に相当数存在するが、ここではMG1655株でのノックイン先の偽遺伝子として、ybeMとyghX遺伝子座位を選択した。これは、これらがモノシストロニックで、近傍に生育に必須な遺伝子が存在しないと予想されることが理由である。近傍の遺伝子に極力影響を与えずにノックインができると考えた。MG1655mlc*XT7、MG1655crp*XT7、MG1655ΔpgiXT7のybeMかyghXにT7プロモーター-発現させたい遺伝子のカセットをノックインすれば、全く環状プラスミドを用いずに遺伝子をキシロース誘導的に発現させることができる。しかも、発現は、ブドウ糖の存在下であっても起こる。 As already mentioned, there are a large number of pseudogenes in the E. coli genome. Here, the ybeM and yghX gene loci were selected as knockin target pseudogenes in the MG1655 strain. This is because these are monocistronic and it is expected that there are no genes essential for growth in the vicinity. We thought that knock-in was possible without affecting the neighboring genes as much as possible. MG1655mlc * XT7, MG1655crp * XT7, T7 promoter ybeM or yghX of MG1655derutapgiXT7 - if knocked cassette of a gene to be expressed, can be quite xylose inducibly expressing genes without using a circular plasmid. Moreover, expression occurs even in the presence of glucose.
MG1655株ゲノムを鋳型、sSN1704（cggatgcattactccggaagacggcagcaa：配列番号３５）とsSN1705（tggtctagaaggcctctgcagctgtgctgatttaaccgatagatctgca：配列番号３６）をオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、ybeM遺伝子5’領域をPCR増幅した。なお、このPCRに先立って、sSN1705はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端をリン酸化した。この断片の末端をNsiIで処理した。一方、MG1655株ゲノムを鋳型として、sSN1706（tggctcgagggatccatgcatttgccattcaggaatcacgccgtg：配列番号３７）とsSN1707（tccacatgtccgctcttcttaccacgccgat：配列番号３８）をプライマーとして用いて、ybeM遺伝子3’領域をPCR増幅した。この断片の末端ををPciIで処理した。上記両断片を、pHN1234をPstIとNcoIで切断したベクター断片に同時にライゲーションし、pHN1951を得た。pHN1951を図7に示すが、このベクターのマルチプルクローニング部位に、標的遺伝子をクローニングすれば、ybeM座位に標的遺伝子をノックインすることができる。 The ybeM gene 5 ′ region was PCR amplified using the MG1655 strain genome as a template and sSN1704 (cggatgcattactccggaagacggcagcaa: SEQ ID NO: 35) and sSN1705 (tggtctagaaggcctctgcagctgtgctgatttaaccgatagatctgca: SEQ ID NO: 36) as oligonucleotide primers. Prior to this PCR, sSN1705 was phosphorylated at the 5 ′ end using T4 polynucleotide kinase. The end of this fragment was treated with NsiI . On the other hand, using the MG1655 strain genome as a template, the ybeM gene 3 ′ region was PCR amplified using sSN1706 (tggctcgagggatccatgcatttgccattcaggaatcacgccgtg: SEQ ID NO: 37) and sSN1707 (tccacatgtccgctcttcttaccacgccgat: SEQ ID NO: 38) as primers. The end of this fragment was treated with Pci I. The two fragments were simultaneously ligated into a vector fragment obtained by cutting the pHN1234 with Pst I and Nco I, to give a PHN1951. pHN1951 is shown in FIG. 7, and the target gene can be knocked in at the ybeM locus by cloning the target gene into the multiple cloning site of this vector.
MG1655株ゲノムを鋳型、sSN1730（aagatgcatacgcttcaggctttggtcgaggc：配列番号３９）とsSN1731R（tggtctagaaggcctctgcagcaaatcaaacaacgctaatgccgtcatc：配列番号４０）をオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、yghX遺伝子5’領域をPCR増幅した。なお、このPCRに先立って、sSN1731RはT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端をリン酸化した。の断片の末端をNsiIで処理した。一方、MG1655ゲノムを鋳型として、sSN1732（tggctcgagggatccatgcatgagaatcgtggactgaatccgtatatc：配列番号４１）とsSN1733（tttacatgtcctttgccaggcaagatcggcg：配列番号４２）をプライマーとして用いて、yghX遺伝子3’領域をPCR増幅した。の断片の末端をPciIで処理した。増幅した両断片を、pHN1234をPstIとNcoIで切断したベクター断片に同時にライゲーションし、pHN1975を得た。pHN1975を図8に示すが、このベクターのマルチプルクローニング部位に、標的遺伝子をクローニングすれば、yghX座位に標的遺伝子をノックインすることができる。 The yghX gene 5 ′ region was PCR amplified using the MG1655 strain genome as a template, sSN1730 (aagatgcatacgcttcaggctttggtcgaggc: SEQ ID NO: 39) and sSN1731R (tggtctagaaggcctctgcagcaaatcaaacaacgctaatgccgtcatc: SEQ ID NO: 40). Prior to this PCR, sSN1731R was phosphorylated at the 5 ′ end using T4 polynucleotide kinase. The ends of these fragments were treated with NsiI . On the other hand, using the MG1655 genome as a template, the yghX gene 3 ′ region was PCR amplified using sSN1732 (tggctcgagggatccatgcatgagaatcgtggactgaatccgtatatc: SEQ ID NO: 41) and sSN1733 (tttacatgtcctttgccaggcaagatcggcg: SEQ ID NO: 42) as primers. The ends of the fragments were treated with Pci I. The amplified both fragments were simultaneously ligated into a vector fragment obtained by cutting the pHN1234 with Pst I and Nco I, to give a PHN1975. pHN1975 is shown in FIG. 8, and the target gene can be knocked in at the yghX locus by cloning the target gene into the multiple cloning site of this vector.
pHN1984からT7プロモーター-mCherry遺伝子カセットをNsiIとXhoIで切り出し、pHN1951をPstIとXhoIで切断したベクター断片にライゲーションした。できたプラスミドにpHN1997と名付けた。pHN1984からT7プロモーター-mCherry遺伝子カセットをNsiIとSpeIで切り出し、pHN1975をPstIとXbaIで切断したベクター断片にライゲーションした。できたプラスミドにpHN1998と名付けた。次いで、pHN1997あるいはpHN1998をMG1655mlc*XT7に導入した。その後は、実施例４に記したものと全く同じ方法で操作し、T7プロモーター-mCherry遺伝子カセットノックイン株を得た。それぞれ、MG1655mlc*XT7ybeMmChとMG1655mlc*XT7yghXmChと名付けた。 pHN1984 cut with Nsi I and Xho I and T7 promoter -mCherry gene cassette from and ligated to the cut vector fragment pHN1951 with Pst I and Xho I. The resulting plasmid was named pHN1997. pHN1984 cut with Nsi I and Spe I the T7 promoter -mCherry gene cassette from and ligated to the cut vector fragment pHN1975 with Pst I and Xba I. The resulting plasmid was named pHN1998. Subsequently, pHN1997 or pHN1998 was introduced into MG1655mlc * XT7. Thereafter, the T7 promoter-mCherry gene cassette knock-in strain was obtained by operating in exactly the same manner as described in Example 4. They were named MG1655mlc * XT7ybeMmCh and MG1655mlc * XT7yghXmCh, respectively.
MG1655mlc*XT7ybeMmChとMG1655mlc*XT7yghXmChを1 mLのLBで一晩前培養後、うち8.3μLを新しい5 mL LBにそれぞれ植菌した。どちらも同一のものを3つ用意した。振とう培養を1.5時間行ったところで、3つのうち１つにブドウ糖を終濃度1(w/v)%、別の１つにブドウ糖終濃度1(w/v)%かつキシロース終濃度0.5(w/v)%、また別の１つにキシロース終濃度0.5(w/v)%になるように添加した。そして、全てをさらに4.5時間培養を継続した。さらに、蛍光のバックグラウンドを計算上取り除くため、これと同一の操作を、MG1655mlc*XT7を用いて並行して行った（培養はLBで、培養開始後1.5時間後にブドウ糖を終濃度1%添加したもの）。濁度あたりのmCherry蛍光強度を図9に示す。 MG1655mlc * XT7ybeMmCh and MG1655mlc * XT7yghXmCh were pre-cultured overnight in 1 mL of LB, and 8.3 μL of each was inoculated into a new 5 mL LB. Both prepared the same three. After 1.5 hours of shaking culture, one of the three had a final glucose concentration of 1 (w / v)%, the other one had a final glucose concentration of 1 (w / v)% and a final xylose concentration of 0.5 (w / v)%, and another was added so that the final concentration of xylose was 0.5 (w / v)%. All of them were further cultured for 4.5 hours. Furthermore, in order to eliminate the background of fluorescence in calculation, the same operation was performed in parallel using MG1655mlc * XT7 (culture was LB, and glucose was added at a final concentration of 1% 1.5 hours after the start of the culture. thing). The mCherry fluorescence intensity per turbidity is shown in FIG.
この結果から、発現させたい遺伝子のカセット（この場合はT7プロモーター-mCherry遺伝子）をゲノム上の偽遺伝子座位にノックインしても、キシロース誘導的に、かつブドウ糖の影響を受けずに遺伝子発現させることができることがわかった。ただし、mCherry遺伝子のコピー数の影響だと想像されるが、環状プラスミドからmCherryを発現させた実験（図6）に比べると発現量が低かった。 From this result, even if the cassette of the gene to be expressed (in this case, the T7 promoter-mCherry gene) is knocked in to the pseudogene locus on the genome, the gene is expressed in a xylose-inducible manner and without being affected by glucose. I found out that However, although the effect is thought to be due to the copy number of the mCherry gene, the expression level was low compared to the experiment in which mCherry was expressed from a circular plasmid (FIG. 6).
本発明の方法により、大腸菌を用いて、プラスミド維持の必要もなく、さらに、バイオマス中のキシロースを発現誘導剤として利用し、安価な誘導型の有用物質生産システムにより有用物質を効率的に生産することができる。 By the method of the present invention, it is not necessary to maintain a plasmid using E. coli, and further, xylose in biomass is used as an expression inducer, and useful substances are efficiently produced by an inexpensive inducible useful substance production system. be able to.
配列番号１、２、４〜２７、２９〜４２ プライマー
配列番号３、２８ 合成
SEQ ID NO: 1, 2, 4 to 27, 29 to 42 Primer SEQ ID NO: 3, 28 Synthesis
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006081509A (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Tohoku Univ | Method for producing vector for neural circuit selective transfer of exogenote |
| JP2013005764A (en) * | 2011-06-24 | 2013-01-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | Method for producing organic substance from mixed sugar in escherichia coli |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006081509A (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Tohoku Univ | Method for producing vector for neural circuit selective transfer of exogenote |
| JP2013005764A (en) * | 2011-06-24 | 2013-01-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | Method for producing organic substance from mixed sugar in escherichia coli |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6016041877; ＳＵＫＨＩＪＡ Ｋ． ｅｔ ａｌ．: Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５１（２０１２）, ｐ．１０９-１１８ * |
| JPN6016041880; ＹＯＯＮ Ｓ．Ｈ． ｅｔ ａｌ: Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３： Ｒ３７ （２０１２）, ｐ．１-１３， Ｔａｂｌｅ Ｓ１ * |
| JPN6016041883; ＮＡＫＡＳＨＩＭＡ Ｎ． ｅｔ ａｌ: Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５６［Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｒ ２７］, ｐ．４３６-４４２ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111471636A (en) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 旖肽(上海)生物科技有限公司 | Genetically engineered bacterium for expressing human epidermal growth factor and application thereof |
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