JP2014206393A - Ｍｍｐ−３の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ＥＤＴＡを含む試料中のＭＭＰ−３濃度を正確に測定するための免疫測定方法、免疫測定試薬及び免疫測定キットを提供することを課題とする。
【解決手段】ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下での抗体の反応性を指標とすることで、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下の反応性が同等のモノクロ−ナル抗体を特別に選別できることを見出し、本発明を完成するに至った。このように選別されたＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するモノクロ−ナル抗体同士を組み合わせることによって、ＥＤＴＡを含む試料中でも測定値が低値化することなく、正確にＭＭＰ−３濃度を測定できることを見出した。
【選択図】なし
【解決手段】ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下での抗体の反応性を指標とすることで、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下の反応性が同等のモノクロ−ナル抗体を特別に選別できることを見出し、本発明を完成するに至った。このように選別されたＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するモノクロ−ナル抗体同士を組み合わせることによって、ＥＤＴＡを含む試料中でも測定値が低値化することなく、正確にＭＭＰ−３濃度を測定できることを見出した。
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒトＭＭＰ−３と特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等のヒトＭＭＰ−３に対する反応性を有するモノクロ−ナル抗体を使用するＭＭＰ−３の測定方法及び該測定方法に用いられる測定試薬・測定試薬キットに関する。また、前記モノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記モノクローナル抗体の製造方法に関する。
ＭＭＰ−３（マトリクスメタロプロテイナ−ゼ３）は滑膜細胞や軟骨細胞で産生され、その特異的基質が軟骨を構成するプロテオグリカンであること、他のＭＭＰｓを活性化する作用も有することから、関節リウマチ（ＲＡ）罹患時の関節組織破壊において中心的な役割を担っている酵素として知られている。
一般に慢性関節リウマチの病態の進展に伴い、滑膜は炎症反応を起こして増殖する。ＭＭＰ−３は滑膜の増殖に伴い滑膜表層細胞で産生されて関節液中に貯留し、血管やリンパ管を経由して血中に移行すると考えられている。このことから、血中ＭＭＰ−３濃度は関節リウマチの診断補助や治療効果、疾患活動性、関節破壊の指標として、その臨床的有用性が広く知られている。ヒトＭＭＰ−３測定試薬、測定試薬キットとして、以下の非特許文献に示すような試薬が知られている。
一般に慢性関節リウマチの病態の進展に伴い、滑膜は炎症反応を起こして増殖する。ＭＭＰ−３は滑膜の増殖に伴い滑膜表層細胞で産生されて関節液中に貯留し、血管やリンパ管を経由して血中に移行すると考えられている。このことから、血中ＭＭＰ−３濃度は関節リウマチの診断補助や治療効果、疾患活動性、関節破壊の指標として、その臨床的有用性が広く知られている。ヒトＭＭＰ−３測定試薬、測定試薬キットとして、以下の非特許文献に示すような試薬が知られている。
非特許文献１−４に示す試薬及びキットでは、ＥＤＴＡ血漿では検出されるべきＭＭＰ−３濃度に対して、検出されるＭＭＰ−３濃度が低値化するため、ＥＤＴＡ血漿の使用は推奨しないと記載されている。さらに、非特許文献５では、非特許文献４記載のキットを用いて、各種採血管由来の試料測定値についての検討を実施し、ＥＤＴＡを用いた場合にＭＭＰ−３測定値が低値化したという実験報告がなされている。
また、非特許文献６に示すキットでは、正常検体を測定したデ−タが記載されているが、８項に記載されているように、ＥＤＴＡ血漿測定値はその他検体種と比較すると、測定値が低値化する傾向にあることが明示されている。
このように、ＥＤＴＡ血漿中のＭＭＰ−３濃度測定値の正確性に言及している例はこれまではなかった。しかしながら、慢性関節リウマチの診断補助や治療効果判定、疾患活動性、関節破壊の指標としてＭＭＰ−３を用いるには、正確な測定値が得られることが極めて重要であり、そして検体の種類を問わずに正確な測定値が得られる臨床検査薬は極めて有用である。
また、非特許文献６に示すキットでは、正常検体を測定したデ−タが記載されているが、８項に記載されているように、ＥＤＴＡ血漿測定値はその他検体種と比較すると、測定値が低値化する傾向にあることが明示されている。
このように、ＥＤＴＡ血漿中のＭＭＰ−３濃度測定値の正確性に言及している例はこれまではなかった。しかしながら、慢性関節リウマチの診断補助や治療効果判定、疾患活動性、関節破壊の指標としてＭＭＰ−３を用いるには、正確な測定値が得られることが極めて重要であり、そして検体の種類を問わずに正確な測定値が得られる臨床検査薬は極めて有用である。
パナクリアＭＭＰ−３プレ−ト添付文書 （第一ファインケミカル）
パナクリアＭＭＰ−３ラテックス添付文書 （第一ファインケミカル）
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ＫＡＣ１５４１添付文書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ ＭＭＰ−３ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＤＭＰ３００） （Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）
Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４：４ (２００８) Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １,２,３,７,８,ａｎｄ ９
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｔｒａｃｋ ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍ （ＲＰＮ２６１３）Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｂｏｏｋｌｅｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ２６１，Ｎｏ３０（１９８６）Ａ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ＨｕｍａｎＲｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ｓｙｎａｖｉａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｈａｔＤｉｇｅｓｔｓ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ ＭａｔｒｉｘＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
本発明は、ヒトＭＭＰ−３と特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等のヒトＭＭＰ−３に対する反応性を有することを特徴とする抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体、該モノクロ−ナル抗体に由来する機能性断片、さらに該モノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マを提供することを課題とする。
また、本発明は、ＥＤＴＡを含む試料中のＭＭＰ−３濃度を正確に測定するための免疫測定方法、免疫測定試薬及び免疫測定キットを提供することを課題とする。
また、本発明は、ＥＤＴＡを含む試料中のＭＭＰ−３濃度を正確に測定するための免疫測定方法、免疫測定試薬及び免疫測定キットを提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、ヒトＭＭＰ−３に対するモノクロ−ナル抗体の選別において、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下での抗体の反応性を指標とすることで、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下の反応性が同等のモノクロ−ナル抗体を特別に選別できることを見出し、本発明を完成するに至った。このようにして得られたモノクロ−ナル抗体は、ＥＤＴＡ共存下での反応性に着目したことがなかった従来の方法では特別に選別されることはなかった。
また、本発明者らは、上記で選別されたＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するモノクロ−ナル抗体同士を組み合わせることによって、ＥＤＴＡを含む試料中でも測定値が低値化することなく、正確にＭＭＰ−３濃度を測定できることを見出した。したがって、本発明の別の目的は、抗原抗体反応を利用した免疫測定方法において、ＥＤＴＡ共存下でも強い反応性を有する抗体同士を組み合わせることにより、ＥＤＴＡを含む試料中でもＭＭＰ−３濃度を正確に得られることを特徴とする免疫測定方法、測定試薬及び測定キットに関する。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
<１>試料中のＭＭＰ−３を測定する方法であって、
ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体と試料中のＭＭＰ−３を接触させる工程を含む、測定方法。
<２>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体が、２種以上の抗体である、前記<１>に記載の測定方法。
<３>２種以上の抗体が、ＭＭＰ−３に対する認識部位が互いに異なる抗体である、前記<２>に記載の測定方法。
<４>２種以上の抗体が、以下の（１）及び（２）を満たす抗体である、前記<２>又は<３>に記載の測定方法。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上
<５>２種以上の抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）からなる群より選ばれるハイブリド−マにより産生されるものである、前記<２>〜<４>のいずれか一項に記載の測定方法。
<６>試料がＥＤＴＡを含むものである、前記<１>〜<５>のいずれか一項に記載の測定方法。
<７>前記<１>〜<６>のいずれか一項に記載の測定方法に用いられる、試料中のＭＭＰ−３を測定する測定試薬および測定試薬キット。
<８>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有することを特徴とする抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
<９>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等のヒトＭＭＰ−３との反応性が以下の（１）及び（２）を満たすことを特徴とする前記<８>記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上
<１０>以下の工程を含む方法によって選択された前記<８>又は<９>に記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
工程１：ＭＭＰ−３を免疫源として、非ヒト動物に免疫する工程
工程２：ＭＭＰ−３に対する反応性が高い抗体を産生する免疫担当細胞を選択する工程
工程３：工程２で選択した免疫担当細胞を使用してハイブリドーマを取得する工程
工程４：工程３で取得したハイブリドーマを使用して抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を取得する工程
工程５：前記工程２〜４のいずれか一工程において、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれの条件におけるヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程
<１１>寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）であるハイブリド−マにより産生される、モノクロ−ナル抗体。
<１２>前記<８>〜<１１>のいずれかに記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体に由来するＦａｂ部位を含む、モノクロ−ナル抗体断片。
<１３>前記<８>又は<９>に記載のモノクロ−ナル抗体を産生することを特徴とするハイブリド−マ。
<１４>ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）である前記<８>又は<９>に記載のハイブリド−マ。
<１５>以下の工程を含む前記<８>又は<９>に記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を製造する方法。
工程１）ヒトＭＭＰ−３を免疫源として、抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリド−マを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリド−マが産生する抗体を、ヒトＭＭＰ−３と接触させて、反応性が強い抗体を産生するハイブリド−マを選択し、このハイブリド−マが産生する抗体を取得する工程
工程３）工程２で取得した抗体について、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれのヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程
また、本発明者らは、上記で選別されたＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するモノクロ−ナル抗体同士を組み合わせることによって、ＥＤＴＡを含む試料中でも測定値が低値化することなく、正確にＭＭＰ−３濃度を測定できることを見出した。したがって、本発明の別の目的は、抗原抗体反応を利用した免疫測定方法において、ＥＤＴＡ共存下でも強い反応性を有する抗体同士を組み合わせることにより、ＥＤＴＡを含む試料中でもＭＭＰ−３濃度を正確に得られることを特徴とする免疫測定方法、測定試薬及び測定キットに関する。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
<１>試料中のＭＭＰ−３を測定する方法であって、
ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体と試料中のＭＭＰ−３を接触させる工程を含む、測定方法。
<２>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体が、２種以上の抗体である、前記<１>に記載の測定方法。
<３>２種以上の抗体が、ＭＭＰ−３に対する認識部位が互いに異なる抗体である、前記<２>に記載の測定方法。
<４>２種以上の抗体が、以下の（１）及び（２）を満たす抗体である、前記<２>又は<３>に記載の測定方法。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上
<５>２種以上の抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）からなる群より選ばれるハイブリド−マにより産生されるものである、前記<２>〜<４>のいずれか一項に記載の測定方法。
<６>試料がＥＤＴＡを含むものである、前記<１>〜<５>のいずれか一項に記載の測定方法。
<７>前記<１>〜<６>のいずれか一項に記載の測定方法に用いられる、試料中のＭＭＰ−３を測定する測定試薬および測定試薬キット。
<８>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有することを特徴とする抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
<９>ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等のヒトＭＭＰ−３との反応性が以下の（１）及び（２）を満たすことを特徴とする前記<８>記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上
<１０>以下の工程を含む方法によって選択された前記<８>又は<９>に記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
工程１：ＭＭＰ−３を免疫源として、非ヒト動物に免疫する工程
工程２：ＭＭＰ−３に対する反応性が高い抗体を産生する免疫担当細胞を選択する工程
工程３：工程２で選択した免疫担当細胞を使用してハイブリドーマを取得する工程
工程４：工程３で取得したハイブリドーマを使用して抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を取得する工程
工程５：前記工程２〜４のいずれか一工程において、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれの条件におけるヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程
<１１>寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）であるハイブリド−マにより産生される、モノクロ−ナル抗体。
<１２>前記<８>〜<１１>のいずれかに記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体に由来するＦａｂ部位を含む、モノクロ−ナル抗体断片。
<１３>前記<８>又は<９>に記載のモノクロ−ナル抗体を産生することを特徴とするハイブリド−マ。
<１４>ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）である前記<８>又は<９>に記載のハイブリド−マ。
<１５>以下の工程を含む前記<８>又は<９>に記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を製造する方法。
工程１）ヒトＭＭＰ−３を免疫源として、抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリド−マを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリド−マが産生する抗体を、ヒトＭＭＰ−３と接触させて、反応性が強い抗体を産生するハイブリド−マを選択し、このハイブリド−マが産生する抗体を取得する工程
工程３）工程２で取得した抗体について、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれのヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程
本発明のＥＤＴＡ共存下でも非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を用いることで、ＥＤＴＡを含む試料中のＭＭＰ−３濃度を正確に測定できる免疫測定試薬及び測定キットが提供可能になった。また、本発明のモノクロ−ナル抗体の選択方法は、ＥＤＴＡ非共存下とＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性を指標に選択されるため、高精度に目的とするモノクロ−ナル抗体を得ることができ、効率的である。本発明の免疫測定試薬及びキットを用いることで、ＥＤＴＡ血漿中のＭＭＰ−３濃度も正確に測定することができ、検体種を選ばないことから、慢性関節リウマチの臨床検査薬として用いるのに好適である。
（抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体）
本発明の抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体は、ヒトＭＭＰ−３と特異的に反応する抗体である。抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を得るにあたって、ヒトＭＭＰ−３と抗原抗体反応を起こすことを指標とした選別はなされてきたが、ＥＤＴＡ共存下での反応性に注目した選別は例がなく、ＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する本抗体はまったく新規である。
ここで、ＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するとは、ＥＤＴＡ存在下でヒトＭＭＰ−３と反応させた場合と、ＥＤＴＡを存在させずにヒトＭＭＰ−３と反応させた場合とで、反応性が同等であることをいい、反応性の指標としては、抗体のアフィニティ−の強さを示す反応平衡定数（ＫＤ値）、ヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが挙げられる。また、固相抗体に対するヒトＭＭＰ−３との結合量、あるいは、抗体を結合させた担体の凝集度合いなどにより示すこともできる。
また、本発明の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体で反応性が同等である抗体とは、ＫＤ値とＲｍａｘを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう。
１）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数ＫＤ値が、ＥＤＴＡ非共存下での反応平衡定数ＫＤ値に対して２００％未満
また、Ｒｍａｘを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう。
２）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して７０％以上
また、固相抗体に対するヒトＭＭＰ−３との結合量を吸光度として測定した場合、以下の特長をもつ抗体をいう
３）ＥＤＴＡ共存下における吸光度がＥＤＴＡ非共存下での吸光度に対して８０〜１２０％。
抗体を結合させた担体同士の凝集度合いを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう
４）抗体を結合させた担体同士が凝集反応を起こすことによって凝集する反応性が、ＥＤＴＡ存在下における凝集シグナルがＥＤＴＡ非存在下における凝集シグナルに対して８０-１２０％。
なお、本発明の抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を作製する技術に関して特に制限はないが、マウスハイブリド−マを作製する方法が一般的である。また、本発明の抗ヒトＭＭＰ−３抗体調製後の遺伝子操作技術による構造改変や修飾に関して、該モノクロ−ナル抗体のヒトＭＭＰ−３抗体のヒトＭＭＰ−３との反応特性を大きく損なわない限り特に制限はない。
本発明の抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体は、ヒトＭＭＰ−３と特異的に反応する抗体である。抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を得るにあたって、ヒトＭＭＰ−３と抗原抗体反応を起こすことを指標とした選別はなされてきたが、ＥＤＴＡ共存下での反応性に注目した選別は例がなく、ＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する本抗体はまったく新規である。
ここで、ＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有するとは、ＥＤＴＡ存在下でヒトＭＭＰ−３と反応させた場合と、ＥＤＴＡを存在させずにヒトＭＭＰ−３と反応させた場合とで、反応性が同等であることをいい、反応性の指標としては、抗体のアフィニティ−の強さを示す反応平衡定数（ＫＤ値）、ヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが挙げられる。また、固相抗体に対するヒトＭＭＰ−３との結合量、あるいは、抗体を結合させた担体の凝集度合いなどにより示すこともできる。
また、本発明の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体で反応性が同等である抗体とは、ＫＤ値とＲｍａｘを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう。
１）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数ＫＤ値が、ＥＤＴＡ非共存下での反応平衡定数ＫＤ値に対して２００％未満
また、Ｒｍａｘを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう。
２）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して７０％以上
また、固相抗体に対するヒトＭＭＰ−３との結合量を吸光度として測定した場合、以下の特長をもつ抗体をいう
３）ＥＤＴＡ共存下における吸光度がＥＤＴＡ非共存下での吸光度に対して８０〜１２０％。
抗体を結合させた担体同士の凝集度合いを指標とした場合、以下の特徴をもつ抗体をいう
４）抗体を結合させた担体同士が凝集反応を起こすことによって凝集する反応性が、ＥＤＴＡ存在下における凝集シグナルがＥＤＴＡ非存在下における凝集シグナルに対して８０-１２０％。
なお、本発明の抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を作製する技術に関して特に制限はないが、マウスハイブリド−マを作製する方法が一般的である。また、本発明の抗ヒトＭＭＰ−３抗体調製後の遺伝子操作技術による構造改変や修飾に関して、該モノクロ−ナル抗体のヒトＭＭＰ−３抗体のヒトＭＭＰ−３との反応特性を大きく損なわない限り特に制限はない。
このような本発明の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体の具体例としてはＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）であるハイブリド−マにより産生される、モノクロ−ナル抗体が挙げられる。
（モノクロ−ナル抗体断片）
本発明には酵素的消化によって得られる該モノクロ−ナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片や遺伝子組み換えによって作製される該モノクロ−ナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片にかかわらず、該モノクロ−ナル抗体に由来するＦａｂ部分を含む機能性断片を有するものであれば利用できる。従って、本発明の機能性断片の「機能性」の意味は、具体的にはヒトＭＭＰ−３との結合能を有することをいう。
本発明には酵素的消化によって得られる該モノクロ−ナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片や遺伝子組み換えによって作製される該モノクロ−ナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片にかかわらず、該モノクロ−ナル抗体に由来するＦａｂ部分を含む機能性断片を有するものであれば利用できる。従って、本発明の機能性断片の「機能性」の意味は、具体的にはヒトＭＭＰ−３との結合能を有することをいう。
（測定対象試料）
本発明で述べるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）としては、一般に抗凝固剤として採血管に添加、塗布等され広く用いられている、ナトリウム塩やリチウム塩を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫測定方法で測定可能な試料としては、従来法で測定できなかったＥＤＴＡを含有する試料、より具体的には抗凝固剤にＥＤＴＡを用いて採血されたＥＤＴＡ血漿だけでなく、血液、血清、血漿、尿、関節液などの生体試料も測定可能である。
本発明で述べるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）としては、一般に抗凝固剤として採血管に添加、塗布等され広く用いられている、ナトリウム塩やリチウム塩を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫測定方法で測定可能な試料としては、従来法で測定できなかったＥＤＴＡを含有する試料、より具体的には抗凝固剤にＥＤＴＡを用いて採血されたＥＤＴＡ血漿だけでなく、血液、血清、血漿、尿、関節液などの生体試料も測定可能である。
（ハイブリド−マ）
本発明の抗ヒトＭＭＰ−３抗体を産生するために用いるハイブリド−マはヒトＭＭＰ−３と特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下で高い反応性を有する抗ＭＭＰ−３抗体を産生できるハイブリド−マであれはいずれでもよく、本発明の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体は以下の工程１）−４）を経て製造される。
工程１）精製ヒトＭＭＰ−３を免疫源として、抗ヒトＭＭＰ−３抗体産生ハイブリド−マを取得する工程
工程２）工程１）で取得したハイブリド−マが産生する抗体の中から、ＭＭＰ−３に対する反応性の高い抗体を選択する工程
工程３）工程２で取得した抗体について、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれのヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程。
工程４）工程３）で選択されたハイブリド−マを取得する工程
このような選択工程を経て得られた抗体は、ＭＭＰ−３に特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する。
前記工程で選択された抗体として、例えばＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）が産生する抗体が挙げられる。
本発明の抗ヒトＭＭＰ−３抗体を産生するために用いるハイブリド−マはヒトＭＭＰ−３と特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下で高い反応性を有する抗ＭＭＰ−３抗体を産生できるハイブリド−マであれはいずれでもよく、本発明の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体は以下の工程１）−４）を経て製造される。
工程１）精製ヒトＭＭＰ−３を免疫源として、抗ヒトＭＭＰ−３抗体産生ハイブリド−マを取得する工程
工程２）工程１）で取得したハイブリド−マが産生する抗体の中から、ＭＭＰ−３に対する反応性の高い抗体を選択する工程
工程３）工程２で取得した抗体について、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれのヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程。
工程４）工程３）で選択されたハイブリド−マを取得する工程
このような選択工程を経て得られた抗体は、ＭＭＰ−３に特異的に反応し、かつＥＤＴＡ共存下でもＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する。
前記工程で選択された抗体として、例えばＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）が産生する抗体が挙げられる。
（用途）
本発明のＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を用いれば、試料中のＥＤＴＡの有無にかかわらず、ＭＭＰ−３濃度を正確に測定することが可能になる。
ＭＭＰファミリーは活性中心に亜鉛を配位し、構造の安定化にはカルシウムを必要とすることが知られている。ＭＭＰ−３にも４か所のカルシウム結合部位が存在し、カルシウムやＥＤＴＡが酵素活性に影響をおよぼすことが報告されている（非特許文献７）。これらの事実から、ＥＤＴＡの影響を受けない抗ＭＭＰ-３抗体を作成することは不可能であると考えられており、実際にＥＤＴＡの影響を受けない免疫測定系は存在しなかった。
一価の抗原であるＭＭＰ−３を、抗原抗体反応を用いたサンドイッチ法で定量するには少なくとも２種類の抗体を用いる必要があり、いずれか一方がＥＤＴＡの影響を受けやすかった場合、測定系としてもＥＤＴＡの影響を受けてしまう。ＥＤＴＡ共存下と、ＥＤＴＡ非共存下のヒトＭＭＰ−３に対する抗体の反応性を評価する本発明によって、ＥＤＴＡ共存下でも非共存化でも同等の反応性を有する抗体を効率よく選別できるようになり、ＥＤＴＡ共存下で非共存化と同等の反応性を有する少なくとも２種類のクロ−ンのみを用いた測定系の構築が可能となった。このようにして、ＥＤＴＡの影響を受けない免疫測定系を構築するに至った。
また本抗体を用いた免疫測定試薬では、ＥＤＴＡ含有試料中のＭＭＰ−３濃度、たとえばＥＤＴＡ血漿も正確に測定することが可能となり、検体種を選ばないことから、慢性関節リウマチの臨床検査薬として用いるのに好適である。
本発明のＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を用いれば、試料中のＥＤＴＡの有無にかかわらず、ＭＭＰ−３濃度を正確に測定することが可能になる。
ＭＭＰファミリーは活性中心に亜鉛を配位し、構造の安定化にはカルシウムを必要とすることが知られている。ＭＭＰ−３にも４か所のカルシウム結合部位が存在し、カルシウムやＥＤＴＡが酵素活性に影響をおよぼすことが報告されている（非特許文献７）。これらの事実から、ＥＤＴＡの影響を受けない抗ＭＭＰ-３抗体を作成することは不可能であると考えられており、実際にＥＤＴＡの影響を受けない免疫測定系は存在しなかった。
一価の抗原であるＭＭＰ−３を、抗原抗体反応を用いたサンドイッチ法で定量するには少なくとも２種類の抗体を用いる必要があり、いずれか一方がＥＤＴＡの影響を受けやすかった場合、測定系としてもＥＤＴＡの影響を受けてしまう。ＥＤＴＡ共存下と、ＥＤＴＡ非共存下のヒトＭＭＰ−３に対する抗体の反応性を評価する本発明によって、ＥＤＴＡ共存下でも非共存化でも同等の反応性を有する抗体を効率よく選別できるようになり、ＥＤＴＡ共存下で非共存化と同等の反応性を有する少なくとも２種類のクロ−ンのみを用いた測定系の構築が可能となった。このようにして、ＥＤＴＡの影響を受けない免疫測定系を構築するに至った。
また本抗体を用いた免疫測定試薬では、ＥＤＴＡ含有試料中のＭＭＰ−３濃度、たとえばＥＤＴＡ血漿も正確に測定することが可能となり、検体種を選ばないことから、慢性関節リウマチの臨床検査薬として用いるのに好適である。
以下、抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体の作製方法、該モノクロ−ナル抗体のなかからＥＤＴＡの共存下でも非共存下でも同等の反応性を有する抗体の探索方法、及び、該抗体同士を組み合わせての免疫学的測定方法の例を挙げて本発明の一部を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔比較例１〕
市販のヒトＭＭＰ−３測定キットを用いて、同一の健常人ドナ−より採取した血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿についてＭＭＰ−３濃度を測定した（表１）。
使用したキットを以下に示す。
〈1〉Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｆｏｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔｅｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３
（ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｃ）
〈2〉Ｂｌｕｅ Ｇｅｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ ＳＴ−１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ
（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）
〈3〉パナクリアＭＭＰ−３プレ−ト（第一ファインケミカル株式会社）
市販のヒトＭＭＰ−３測定キットを用いて、同一の健常人ドナ−より採取した血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿についてＭＭＰ−３濃度を測定した（表１）。
使用したキットを以下に示す。
〈1〉Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｆｏｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔｅｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３
（ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｃ）
〈2〉Ｂｌｕｅ Ｇｅｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ ＳＴ−１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ
（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）
〈3〉パナクリアＭＭＰ−３プレ−ト（第一ファインケミカル株式会社）
一方キット〈2〉の測定原理は競合法であり、抗体の反応性が低下すると、測定値が高値化すると考えられる。
以上のことから、いずれのキットを用いても、ＥＤＴＡ血漿の値を正確に測定することはできないものと考えられた。
〔比較例２〕既存試薬に使用している抗体での影響評価）
比較例１で測定値が低値化した試薬のうち、キット〈3〉パナクリアＭＭＰ−３プレ−ト（第一ファインケミカル）の製品キットを用いて、試薬中に用いられている固相抗体と標識抗体それぞれのＥＤＴＡ共存下での反応性を以下の方法で検証した。
１）固相抗体への影響評価
ＥＤＴＡ０ｍＭ ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、製品キット中の緩衝液で（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３ｍＭ ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、終濃度３ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３０ｍＭ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、終濃度３０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
上記サンプルを測定して得られた測定波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）について、下式に基づいてＥＤＴＡ無添加に対するＥＤＴＡ共存下での反応性（％）を算出し、抗体反応性を評価した（表２）。
ＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）
＝ＥＤＴＡ共存下でのＯＤ４５０ ÷ ＥＤＴＡ非共存下でのＯＤ４５０ × １００
ＥＤＴＡ共存下での反応性が非共存化での反応性に対して８０％以上となった場合、同等と判断し、それ以下の場合はＥＤＴＡの影響を受けて反応性が低下すると判断した。
比較例１で測定値が低値化した試薬のうち、キット〈3〉パナクリアＭＭＰ−３プレ−ト（第一ファインケミカル）の製品キットを用いて、試薬中に用いられている固相抗体と標識抗体それぞれのＥＤＴＡ共存下での反応性を以下の方法で検証した。
１）固相抗体への影響評価
ＥＤＴＡ０ｍＭ ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、製品キット中の緩衝液で（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３ｍＭ ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、終濃度３ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３０ｍＭ：ＭＭＰ−３濃度既知試料を、終濃度３０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて（５０、１００、２００ｎg/mL）に希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
上記サンプルを測定して得られた測定波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）について、下式に基づいてＥＤＴＡ無添加に対するＥＤＴＡ共存下での反応性（％）を算出し、抗体反応性を評価した（表２）。
ＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）
＝ＥＤＴＡ共存下でのＯＤ４５０ ÷ ＥＤＴＡ非共存下でのＯＤ４５０ × １００
ＥＤＴＡ共存下での反応性が非共存化での反応性に対して８０％以上となった場合、同等と判断し、それ以下の場合はＥＤＴＡの影響を受けて反応性が低下すると判断した。
測定試料にはＭＭＰ−３濃度既知試料（５０、１００、２００ｎg/mL）を用い、製品キットの二次抗体を以下の手順で調製した以外は製品キットの添付資料記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ０ｍＭ ：酵素標識抗体液を、製品キット中の緩衝液で希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３ｍＭ ：酵素標識抗体液を、終濃度３ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
ＥＤＴＡ３０ｍＭ：酵素標識抗体液を、終濃度３０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した製品キット中の緩衝液を用いて希釈し、そのほかの工程は添付文書記載の方法に従った。
上記二次抗体溶液を用いて測定して得られた測定波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）について、下式に基づいてＥＤＴＡ無添加に対するＥＤＴＡ共存下での反応性（％）を算出し、抗体反応性を評価した（表３）。
ＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）
＝ＥＤＴＡ共存下でのＯＤ４５０ ÷ ＥＤＴＡ非共存下でのＯＤ４５０ × １００
ＥＤＴＡ共存下での反応性が非共存化での反応性に対して８０％以上となった場合、同等と判断し、それ以下の場合はＥＤＴＡの影響を受けて反応性が低下すると判断した。
（評価例１ ＭＭＰ−３抗体の樹立）
１．抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの作製
ａ．材料
・ヒトＭＭＰ−３:正常ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ，理研ＲＣＢ，＃ＲＣＢ０２２ ２の培養上清より精製
・フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４−０９５４１
・ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
・ＲＰＭＩ１６４０, ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０−０３６
・Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ Ｉ ＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ
・ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ）：ＳＩＧＭＡ,Ｐ７３０６
・ＨＡＴ 培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
・９６穴プレート：ＮＵＮＣ,１６７００８
・ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社 製，１０３０−０５
１．抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの作製
ａ．材料
・ヒトＭＭＰ−３:正常ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ，理研ＲＣＢ，＃ＲＣＢ０２２ ２の培養上清より精製
・フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４−０９５４１
・ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
・ＲＰＭＩ１６４０, ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０−０３６
・Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ Ｉ ＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ
・ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ）：ＳＩＧＭＡ,Ｐ７３０６
・ＨＡＴ 培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
・９６穴プレート：ＮＵＮＣ,１６７００８
・ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社 製，１０３０−０５
ｂ．方法
（動物への免疫）
ヒトＭＭＰ−３とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、オスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔もしくはフットパットに１匹あたり３０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で２〜７回、該エマルジョンの注射を繰り返した。マウス眼底静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（動物への免疫）
ヒトＭＭＰ−３とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、オスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔もしくはフットパットに１匹あたり３０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で２〜７回、該エマルジョンの注射を繰り返した。マウス眼底静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（抗体価の確認（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法））
上述のマウス抗血清中の抗ＭＭＰ−３抗体の存在を、ヒトＭＭＰ−３を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
先ず、１μｇ／ｍＬになるようヒトＭＭＰ−３を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解してＭＭＰ−３溶解液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）３００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）３００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
前記各ウェルをＢＳＡ−ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０倍から１００倍に希釈したマウス抗血清５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の高かったマウスから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
上述のマウス抗血清中の抗ＭＭＰ−３抗体の存在を、ヒトＭＭＰ−３を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
先ず、１μｇ／ｍＬになるようヒトＭＭＰ−３を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解してＭＭＰ−３溶解液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）３００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）３００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
前記各ウェルをＢＳＡ−ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０倍から１００倍に希釈したマウス抗血清５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の高かったマウスから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
（細胞融合）
前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で６対１の割合で混合し、ＰＥＧを添加して細胞融合させた。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ2にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で６対１の割合で混合し、ＰＥＧを添加して細胞融合させた。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ2にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
（２）ハイブリドーマの選別
（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法での選別）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、マウス抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法での選別）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、マウス抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
（競合ＥＬＩＳＡ法での選別）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、ヒトＭＭＰ−３を共存させて、競合ＥＬＩＳＡ法を行った。
測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
上述の２種類の選別方法でともに抗ＭＭＰ−３抗体産生株として選択されたハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、ヒトＭＭＰ−３を共存させて、競合ＥＬＩＳＡ法を行った。
測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
上述の２種類の選別方法でともに抗ＭＭＰ−３抗体産生株として選択されたハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。
（３）モノクローナル抗体の精製
単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の２種類のＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウェルを選別し、最終的に２６種の抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。
各細胞の約１０5個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析して、２６種の抗体を得た。
単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の２種類のＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウェルを選別し、最終的に２６種の抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。
各細胞の約１０5個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析して、２６種の抗体を得た。
（４）抗体の組み合わせの評価
上記２６種クロ−ンのなかから、さらに以下の方法で、各抗体の組み合わせを評価した。
各クロ−ンの抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を、２μｇ/ｍＬになるようＰＢＳに希釈してＭＭＰ−３抗体液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレ−トの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴ１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
ＢＳＡ−ＰＢＳＴにて１００ｎｇ/ｍＬに希釈した抗原５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、あらかじめビオチン標識した各モノクロ−ナル抗体をＰＢＳＴで１．５μｇ/ｍＬに希釈し、５０μＬ前記各ウェルに分注して、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。このなかからＯＤ４９２が０．５以上となる組み合わせが可能な１0抗体を選別した。このとき吸光度を認めた組み合わせを表４に示す。
なお、各組み合わせについて、ＯＤ４９２が０．２以上：＋、０．５以上：＋＋、１．０以上：＋＋＋と判定した。
上記２６種クロ−ンのなかから、さらに以下の方法で、各抗体の組み合わせを評価した。
各クロ−ンの抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を、２μｇ/ｍＬになるようＰＢＳに希釈してＭＭＰ−３抗体液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレ−トの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴ１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
ＢＳＡ−ＰＢＳＴにて１００ｎｇ/ｍＬに希釈した抗原５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、あらかじめビオチン標識した各モノクロ−ナル抗体をＰＢＳＴで１．５μｇ/ｍＬに希釈し、５０μＬ前記各ウェルに分注して、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。このなかからＯＤ４９２が０．５以上となる組み合わせが可能な１0抗体を選別した。このとき吸光度を認めた組み合わせを表４に示す。
なお、各組み合わせについて、ＯＤ４９２が０．２以上：＋、０．５以上：＋＋、１．０以上：＋＋＋と判定した。
（評価例２ ＥＤＴＡ共存下でも非共存下と同等の反応性を有する抗体の選別（２次抗体に市販ポリクロ−ナル抗体を用いた評価））
２μｇ／ｍＬになるよう各クロ−ンの抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を、ＰＢＳに希釈してＭＭＰ−３抗体液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレ−トの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴ ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴ１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
４０００ｎｇ/ｍＬの抗原液をＢＳＡ−ＰＢＳＴ、あるいは３ｍＭＥＤＴＡを含むＢＳＡ−ＰＢＳＴで４００ｎｇ/ｍＬに希釈した抗原５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２μｇ/ｍＬに調製したウサギ抗ＭＭＰ−３ポリクロ−ナル抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｓｃ６８３９−Ｒ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
３０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ)−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ＃１７２−１０１９）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度ＯＤ４９２を測定した。
得られたＯＤ４９２から、下式に基づいてＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）を算出した。
ＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）
＝ＥＤＴＡ共存下でのＯＤ４９２ ÷ ＥＤＴＡ非共存下でのＯＤ４９２ × １００
ＥＤＴＡ非共存下に対して８０〜１２０％の反応性の高い反応性を有したクロ−ンは＋、８０％以下と反応性が低かったクロ−ンは−と判定した（表５）。このなかでクロ−ン８２２１６、８２２４５に関してはＥＤＴＡ非共存下でも反応性を確認することができなかった。これらの抗体は市販のウサギポリクローナル抗体と抗原との反応性を妨害している可能性が考えられたため、該抗体を含め引き続き本発明のモノクローナル抗体同士を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＥＤＴＡの影響を評価した
２μｇ／ｍＬになるよう各クロ−ンの抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を、ＰＢＳに希釈してＭＭＰ−３抗体液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレ−トの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴ ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴ１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
４０００ｎｇ/ｍＬの抗原液をＢＳＡ−ＰＢＳＴ、あるいは３ｍＭＥＤＴＡを含むＢＳＡ−ＰＢＳＴで４００ｎｇ/ｍＬに希釈した抗原５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２μｇ/ｍＬに調製したウサギ抗ＭＭＰ−３ポリクロ−ナル抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｓｃ６８３９−Ｒ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
３０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ)−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ＃１７２−１０１９）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度ＯＤ４９２を測定した。
得られたＯＤ４９２から、下式に基づいてＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）を算出した。
ＥＤＴＡ共存下での抗体の反応性（％）
＝ＥＤＴＡ共存下でのＯＤ４９２ ÷ ＥＤＴＡ非共存下でのＯＤ４９２ × １００
ＥＤＴＡ非共存下に対して８０〜１２０％の反応性の高い反応性を有したクロ−ンは＋、８０％以下と反応性が低かったクロ−ンは−と判定した（表５）。このなかでクロ−ン８２２１６、８２２４５に関してはＥＤＴＡ非共存下でも反応性を確認することができなかった。これらの抗体は市販のウサギポリクローナル抗体と抗原との反応性を妨害している可能性が考えられたため、該抗体を含め引き続き本発明のモノクローナル抗体同士を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＥＤＴＡの影響を評価した
（評価例３ ＥＤＴＡ共存下でも非共存下と同等の反応性を有する抗体の選別（二次抗体にモノクローナル抗体を用いた評価））
） 固相状態でのＥＤＴＡの影響評価 一次スクリ−ニング〈2〉
上記（評価例２）において、反応性を認めなかった抗体については、評価例１で示す、各モノクロ−ナル抗体同士の事前検討で、サンドイッチＥＬＩＳＡが成立した組み合わせの抗体を用いて再評価した。
具体的な方法としては、評価例２で用いたウサギ抗ＭＭＰ−３ポリクロ−ナル抗体を、評価クロ−ンとサンドイッチが形成できるクロ−ン（ここでは８２２０８、８２２１１、８２２１３を使用した）に置き換えた以外は、（評価例２）と同様にした。
８２２１６、８２２４５はいずれもＥＤＴＡ共存下で非共存下と同等の反応性を有することを確認した。
） 固相状態でのＥＤＴＡの影響評価 一次スクリ−ニング〈2〉
上記（評価例２）において、反応性を認めなかった抗体については、評価例１で示す、各モノクロ−ナル抗体同士の事前検討で、サンドイッチＥＬＩＳＡが成立した組み合わせの抗体を用いて再評価した。
具体的な方法としては、評価例２で用いたウサギ抗ＭＭＰ−３ポリクロ−ナル抗体を、評価クロ−ンとサンドイッチが形成できるクロ−ン（ここでは８２２０８、８２２１１、８２２１３を使用した）に置き換えた以外は、（評価例２）と同様にした。
８２２１６、８２２４５はいずれもＥＤＴＡ共存下で非共存下と同等の反応性を有することを確認した。
〔実施例、比較例〕
以上の評価結果に基づき、サンドイッチが成立し、かつＥＤＴＡの影響を受けにくい抗体同士を組み合わせて、同一の健常人ドナ−から採取した血清、血漿（ヘパリン、ＥＤＴＡ）ペア検体を測定した。血清検体の測定値と、血漿検体の測定値から、次式に基づいて
対血清測定値比（％）を算出した。なお、測定値比（％）が８０％〜１２０％の場合に測定が正確と判定した。
比較例１ ８２２１２抗体と８２２１６抗体の組み合わせでは、対血清の測定値比（％）が２６．８−７１．３％と、いずれの検体でも血漿測定値が低値化していることがわかる。一方実施例１−６で示すように、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存化で反応性が同等の抗体同士を組み合わせた場合、対血清の測定値比は８０〜１２０％となり、血漿検体が正確に測定できていることがわかった。
以上のことから、評価例１−４で評価した方法で、ＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗体を選別し、このクロ−ンを組み合わせた測定系を用いることで、ＥＤＴＡ含有試料でも正確に測定値が得られることが確認できた。
以上の評価結果に基づき、サンドイッチが成立し、かつＥＤＴＡの影響を受けにくい抗体同士を組み合わせて、同一の健常人ドナ−から採取した血清、血漿（ヘパリン、ＥＤＴＡ）ペア検体を測定した。血清検体の測定値と、血漿検体の測定値から、次式に基づいて
対血清測定値比（％）を算出した。なお、測定値比（％）が８０％〜１２０％の場合に測定が正確と判定した。
比較例１ ８２２１２抗体と８２２１６抗体の組み合わせでは、対血清の測定値比（％）が２６．８−７１．３％と、いずれの検体でも血漿測定値が低値化していることがわかる。一方実施例１−６で示すように、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存化で反応性が同等の抗体同士を組み合わせた場合、対血清の測定値比は８０〜１２０％となり、血漿検体が正確に測定できていることがわかった。
以上のことから、評価例１−４で評価した方法で、ＥＤＴＡ共存下でＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗体を選別し、このクロ−ンを組み合わせた測定系を用いることで、ＥＤＴＡ含有試料でも正確に測定値が得られることが確認できた。
（評価例４） ＢＩＡ法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた生体分子間相互作用の解析
上記実施例及び比較例に用いた抗体について、生体分子間相互作用解析法をもちいて、ＥＤＴＡ共存下及び非共存下での、各モノクロ−ナル抗体とＭＭＰ−３抗原とのアフィニティについて評価した
測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔの推奨プロトコ−ルに従って、抗ヒトＩｇＧ抗体をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に固定化し、測定に使用した。
１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるＨＢＳ緩衝液、あるいは３ｍＭ ＥＤＴＡを含むＨＢＳ緩衝液をランニングバッファ−として、以下の方法で抗体のＫＤ値を算出した。まず、ＨＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した各モノクロ−ナル抗体マイクロ流路系に流し、固定化した抗ＩｇＧ抗体にキャプチャ−させた。
引き続きランニングバッファ−で０、２．５、５μｇ／ｍＬに調製したＭＭＰ−３抗原をマイクロ流路系に流し、抗ＭＭＰ−３抗体にキャプチャ−させた。このときの表面プラズモン共鳴ＲＵを測定、結合測定定数ｋａ、Ｒｍａｘを測定した。引き続き、ランニングバッファ−のみを流し、キャプチャ−させた抗原をしばらく遊離させ、解離速度定数ｋｄ値を算出した。描かれたセンサ−グラムの形状から、抗体−抗原の解離定数ＫＤ値を次式に基づき算出した。
ＫＤ ＝ ｋｄ / ｋａ
なお、このｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ＲｍａｘはＢｉａｃｏｒｅＴ１００にて自動算出される。この際、必要となるＭＭＰ−３の分子量については、潜在型ＭＭＰ−３の分子量５７，０００に設定した。その後再生バッファ−を流して、チップを再生し、チップは繰り返し使用した。
このようにしてえられた、ＥＤＴＡ非共存下とＥＤＴＡ共存下でのそれぞれのＫＤとＲｍａｘから、次式の通り、ＥＤＴＡ共存下での非共存下に対する割合を算出した。
ＥＤＴＡ共存下での非共存下に対する割合 ％
＝各ＥＤＴＡ濃度での値÷ＥＤＴＡ非共存下での値×１００
抗体のアフィニティ−の強さを示すＫＤ値と、抗原の結合量を示すＲｍａｘの、ＥＤＴＡ無添加に対するＥＤＴＡ添加時の割合がそれぞれ２００％未満、６５％以上のとき、その抗体はＥＤＴＡ共存下で同等の反応性を示すと判断した。結果を表８に示す。
上記実施例及び比較例に用いた抗体について、生体分子間相互作用解析法をもちいて、ＥＤＴＡ共存下及び非共存下での、各モノクロ−ナル抗体とＭＭＰ−３抗原とのアフィニティについて評価した
測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔの推奨プロトコ−ルに従って、抗ヒトＩｇＧ抗体をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に固定化し、測定に使用した。
１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるＨＢＳ緩衝液、あるいは３ｍＭ ＥＤＴＡを含むＨＢＳ緩衝液をランニングバッファ−として、以下の方法で抗体のＫＤ値を算出した。まず、ＨＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した各モノクロ−ナル抗体マイクロ流路系に流し、固定化した抗ＩｇＧ抗体にキャプチャ−させた。
引き続きランニングバッファ−で０、２．５、５μｇ／ｍＬに調製したＭＭＰ−３抗原をマイクロ流路系に流し、抗ＭＭＰ−３抗体にキャプチャ−させた。このときの表面プラズモン共鳴ＲＵを測定、結合測定定数ｋａ、Ｒｍａｘを測定した。引き続き、ランニングバッファ−のみを流し、キャプチャ−させた抗原をしばらく遊離させ、解離速度定数ｋｄ値を算出した。描かれたセンサ−グラムの形状から、抗体−抗原の解離定数ＫＤ値を次式に基づき算出した。
ＫＤ ＝ ｋｄ / ｋａ
なお、このｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ＲｍａｘはＢｉａｃｏｒｅＴ１００にて自動算出される。この際、必要となるＭＭＰ−３の分子量については、潜在型ＭＭＰ−３の分子量５７，０００に設定した。その後再生バッファ−を流して、チップを再生し、チップは繰り返し使用した。
このようにしてえられた、ＥＤＴＡ非共存下とＥＤＴＡ共存下でのそれぞれのＫＤとＲｍａｘから、次式の通り、ＥＤＴＡ共存下での非共存下に対する割合を算出した。
ＥＤＴＡ共存下での非共存下に対する割合 ％
＝各ＥＤＴＡ濃度での値÷ＥＤＴＡ非共存下での値×１００
抗体のアフィニティ−の強さを示すＫＤ値と、抗原の結合量を示すＲｍａｘの、ＥＤＴＡ無添加に対するＥＤＴＡ添加時の割合がそれぞれ２００％未満、６５％以上のとき、その抗体はＥＤＴＡ共存下で同等の反応性を示すと判断した。結果を表８に示す。
１）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数ＫＤ値が、ＥＤＴＡ非共存下での反応平衡定数ＫＤ値に対して２００％未満。
２）ＥＤＴＡ共存下での、ヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲmaxが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上。
と特徴付けられることを確認した。
本発明のモノクロ−ナル抗体は、ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３と反応性を指標に選択されるため、ＥＤＴＡ含有試料中でも正確にＭＭＰ−３濃度を定量することが可能となる。
また、本発明のモノクロ−ナル抗体により、ＥＤＴＡ含有試料、たとえばＥＤＴＡ血漿中のＭＭＰ−３濃度を正確に定量するヒトＭＭＰ−３の免疫凝集測定試薬及び測定キットを提供する。
本発明のモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬、測定キットでは、１試薬で血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿のＭＭＰ−３濃度を正確に測定することができるようになり、慢性関節リウマチの臨床診断薬としてより正確なＭＭＰ−３測定値を提供することが可能となる。
また、本発明のモノクロ−ナル抗体により、ＥＤＴＡ含有試料、たとえばＥＤＴＡ血漿中のＭＭＰ−３濃度を正確に定量するヒトＭＭＰ−３の免疫凝集測定試薬及び測定キットを提供する。
本発明のモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬、測定キットでは、１試薬で血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿のＭＭＰ−３濃度を正確に測定することができるようになり、慢性関節リウマチの臨床診断薬としてより正確なＭＭＰ−３測定値を提供することが可能となる。
［寄託生物材料への言及］
（１）８２２０８抗体を産生するハイブリドーマ８２２０８
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２４年１月２７日（２０１２年１月２７日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）
（２）８２２１１抗体を産生するハイブリドーマ８２２１１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）
（３）８２２１３抗体を産生するハイブリドーマ８２２１３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）
（４）８２２１６抗体を産生するハイブリドーマ８２２１６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年４月２７日（２０１０年４月２７日）（原寄託日）
平成２４年５月２５日（２０１２年５月２５日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）
（５）８２２４５抗体を産生するハイブリドーマ８２２４５
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）
（１）８２２０８抗体を産生するハイブリドーマ８２２０８
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２４年１月２７日（２０１２年１月２７日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）
（２）８２２１１抗体を産生するハイブリドーマ８２２１１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）
（３）８２２１３抗体を産生するハイブリドーマ８２２１３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）
（４）８２２１６抗体を産生するハイブリドーマ８２２１６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年４月２７日（２０１０年４月２７日）（原寄託日）
平成２４年５月２５日（２０１２年５月２５日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）
（５）８２２４５抗体を産生するハイブリドーマ８２２４５
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２３年６月１６日（２０１１年６月１６日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）
Claims (15)
- 試料中のＭＭＰ−３を測定する方法であって、
ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体と試料中のＭＭＰ−３を接触させる工程を含む、測定方法。 - ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有する抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体が、２種以上の抗体である、請求項１に記載の測定方法。
- ２種以上の抗体が、ＭＭＰ−３に対する認識部位が互いに異なる抗体である、請求項２に記載の測定方法。
- ２種以上の抗体が、以下の（１）及び（２）を満たす抗体である、請求項２又は３に記載の測定方法。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上 - ２種以上の抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）からなる群より選ばれるハイブリド−マにより産生されるものである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
- 試料がＥＤＴＡを含むものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法に用いられる、試料中のＭＭＰ−３を測定する測定試薬および測定試薬キット。
- ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等の反応性を有することを特徴とする抗ヒトＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
- ＥＤＴＡ共存下においてＥＤＴＡ非共存下と同等のヒトＭＭＰ−３との反応性が以下の（１）及び（２）を満たすことを特徴とする請求項８記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
（１）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との反応平衡定数（ＫＤ値）が、ＥＤＴＡ非共存下におけるＫＤ値に対して２００％未満
（２）ＥＤＴＡ共存下におけるヒトＭＭＰ−３との結合量を示すＲｍａｘが、ＥＤＴＡ非共存下でのＲｍａｘに対して６５％以上 - 以下の工程を含む方法によって選択された請求項８又は９に記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体。
工程１：ＭＭＰ−３を免疫源として、非ヒト動物に免疫する工程
工程２：ＭＭＰ−３に対する反応性が高い抗体を産生する免疫担当細胞を選択する工程
工程３：工程２で選択した免疫担当細胞を使用してハイブリドーマを取得する工程
工程４：工程３で取得したハイブリドーマを使用して抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を取得する工程。
工程５：前記工程２〜４のいずれか一工程において、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれの条件におけるヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程 - 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）であるハイブリド−マにより産生される、モノクロ−ナル抗体。
- 請求項８〜１１のいずれかに記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体に由来するＦａｂ部位を含む、モノクロ−ナル抗体断片。
- 請求項８又は９に記載のモノクロ−ナル抗体を産生することを特徴とするハイブリド−マ
- ＦＥＲＭ Ｐ−２２２１９（８２２０８）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３１（８２２１１）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３２（８２２１３）、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８６（８２２１６）、ＦＥＲＭ Ｐ−２２１３３（８２２４５）である請求項８又は９記載のハイブリド−マ。
- 以下の工程を含む請求項８又は９記載の抗ＭＭＰ−３モノクロ−ナル抗体を製造する方法。
工程１）ヒトＭＭＰ−３を免疫源として、抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリド−マを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリド−マが産生する抗体を、ヒトＭＭＰ−３と接触させて、反応性が強い抗体を産生するハイブリド−マを選択し、このハイブリド−マが産生する抗体を取得する工程
工程３）工程２で取得した抗体について、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下それぞれのヒトＭＭＰ−３に対する反応性を評価し、ＥＤＴＡ共存下とＥＤＴＡ非共存下で反応性が同等のクローンを選択する工程
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| JPH02167097A (ja) * | 1989-09-20 | 1990-06-27 | Kowa Co | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ並びに該モノクローナル抗体を利用するトロンビン結合性物質の精製法及び測定法 |
| US20030032164A1 (en) * | 2000-05-22 | 2003-02-13 | Timothy Wood | Novel matrix metalloproteinases |
| JP2007528868A (ja) * | 2003-08-14 | 2007-10-18 | ワイス | 抗ルイスｙ抗イディオタイプ抗体およびその使用 |
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| WO2012115221A1 (ja) * | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 心筋トロポニンの測定法 |
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Patent Citations (5)
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