JP2014167587A - Sample observation method and sample observation device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標本観察方法及び標本観察装置に関するものである。 The present invention relates to a specimen observation method and a specimen observation apparatus.
標本を平行光束で照明すると、標本からは、非回折光（以下、０次回折光という）と回折光が生じる。顕微鏡では、標本の像は、０次回折光と回折光の合成によって形成される。 When the specimen is illuminated with a parallel light beam, non-diffracted light (hereinafter referred to as zero-order diffracted light) and diffracted light are generated from the specimen. In a microscope, an image of a specimen is formed by combining zero-order diffracted light and diffracted light.
像面における複素振幅Ｅは、例えば、以下の式で表される。
Ｅ＝Ａ1ｅ-iφ1(r)ｅiωt＋Ａ2ｅ-iφ2(r)ｅiωt
ここで、
Ａ1は０次回折光の振幅、
Ａ2は回折光の振幅、
φ1(r)は０次回折光の位相、
φ2(r)は回折光の位相、
である。
The complex amplitude E in the image plane is expressed by the following equation, for example.
E = A 1 e -iφ1 (r ) e iωt + A 2 e -iφ2 (r) e iωt
here,
A 1 is the amplitude of the 0th-order diffracted light,
A 2 is the amplitude of the diffracted light,
φ1 (r) is the phase of the 0th order diffracted light,
φ2 (r) is the phase of the diffracted light,
It is.
像面では光の強度が観測されるため、像面における光の強度Ｉは以下の式で表される。
Ｉ＝｜Ｅ｜2＝Ａ1 2＋Ａ2 2＋２Ａ1Ａ2cosψ
ここで、
ψは位相差であって、ψ＝φ1(r)−φ2(r)、
である。
Since the light intensity is observed on the image plane, the light intensity I on the image plane is expressed by the following equation.
I = | E | 2 = A 1 2 + A 2 2 + 2A 1 A 2 cosψ
here,
ψ is a phase difference, and ψ = φ1 (r) −φ2 (r),
It is.
上述のように、標本の像（光学像）の形成には、０次回折光と回折光が必要である。そこで、以下の説明では、０次回折光と１次回折光とによって、標本の像（光学像）が形成されるものとする。１次回折光の位相は０次回折光の位相に対してπ／２遅れているので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、合焦位置で、無色透明な標本、例えば、細胞を観察しようとしても、明視野観察では細胞の像はほとんど観察できない。 As described above, 0th-order diffracted light and diffracted light are required to form a sample image (optical image). Therefore, in the following description, it is assumed that an image (optical image) of the sample is formed by the 0th-order diffracted light and the 1st-order diffracted light. Since the phase of the 1st-order diffracted light is delayed by π / 2 with respect to the phase of the 0th-order diffracted light, ψ = 0 − (− π / 2) = π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information. As a result, even if an attempt is made to observe a colorless and transparent specimen, for example, a cell, at the in-focus position, an image of the cell can hardly be observed in bright field observation.
無色透明な標本を観察する方法として、位相差観察がある。位相差観察では、位相差顕微鏡が用いられる。この位相差顕微鏡については、様々な提案がされている。その１つに、広い観察範囲で像（位相差像）を観察するために、結像光学系の合焦位置からずらした位置で標本を観察する顕微鏡がある（特許文献１）。特許文献１に開示された顕微鏡は、部分開口と波面導入手段を備えている。部分開口は照明光学系の略瞳位置に配置され、波面導入手段は結像光学系の瞳位置に配置されている。そして、波面導入手段は、結像光学系の瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入するようになっている。 There is phase difference observation as a method of observing a colorless and transparent specimen. In phase contrast observation, a phase contrast microscope is used. Various proposals have been made for this phase contrast microscope. One of them is a microscope for observing a specimen at a position shifted from the in-focus position of the imaging optical system in order to observe an image (phase difference image) in a wide observation range (Patent Document 1). The microscope disclosed in Patent Document 1 includes a partial opening and a wavefront introduction unit. The partial aperture is disposed at a substantially pupil position of the illumination optical system, and the wavefront introducing means is disposed at the pupil position of the imaging optical system. The wavefront introducing means introduces a wavefront whose size changes according to the diameter of the pupil of the imaging optical system.
標本の位置を結像光学系の合焦位置からずらすと、０次回折光と回折光との間に光路長差（位相差）が発生する。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ≠０になるので、位相情報をコントラスト情報として得られる。ただし、Ａ1 2の値は、２Ａ1Ａ2cosψの値に比べると非常に大きい。そこで、特許文献１の顕微鏡では、結像光学系の瞳位置に波面導入手段、すなわち吸収膜を配置してＡ1の値を小さくしている。 When the position of the sample is shifted from the in-focus position of the imaging optical system, an optical path length difference (phase difference) is generated between the 0th-order diffracted light and the diffracted light. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ ≠ 0, phase information can be obtained as contrast information. However, the value of A 1 2 is very large compared to the value of 2A 1 A 2 cosψ. Therefore, in the microscope of Patent Document 1, the wavefront introducing means to the pupil position of the imaging optical system, i.e. by placing the absorbing film has a smaller value for A 1.
特許文献１の顕微鏡では、結像光学系に波面導入手段が配置されている。よって、明視野観察の状態になっているとは言えない。例えば、標本を、無色透明な標本から明暗のある標本に入れ替える。この状態で明視野観察を行うと、標本の像は波面導入手段の影響を受けてしまう。例えば、波面導入手段が吸収膜だと、標本の像が暗くなる。そのため、明暗のある標本を明視野で観察するためには、波面導入手段を光路から取り出す必要がある。特に、波面導入手段が顕微鏡対物レンズ内に設けられている場合は、顕微鏡対物レンズを交換する必要がある。 In the microscope of Patent Document 1, wavefront introducing means is arranged in the imaging optical system. Therefore, it cannot be said that it is in the state of bright field observation. For example, the specimen is replaced from a colorless and transparent specimen to a bright and dark specimen. When bright field observation is performed in this state, the sample image is affected by the wavefront introducing means. For example, if the wavefront introducing means is an absorbing film, the sample image becomes dark. Therefore, in order to observe a bright and dark sample in a bright field, it is necessary to take out the wavefront introducing means from the optical path. In particular, when the wavefront introducing means is provided in the microscope objective lens, it is necessary to replace the microscope objective lens.
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a specimen observation method and a specimen observation apparatus capable of observing a colorless and transparent specimen, for example, a cell while being in a bright field observation state. .
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、該所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていることを特徴とする。 In order to solve the above-described problems and achieve the object, the sample observation method of the present invention has an acquisition step of acquiring an electronic image of the sample, and a subtraction step of subtracting a direct current component from the signal of the electronic image. The acquisition step is performed in a bright field observation state, and the electronic image in the subtraction step is an image acquired in a predetermined state, and in the predetermined state, at least the position of the specimen and the imaging optical system are combined. The focal position is different.
また、本発明の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の標本観察方法を行うことを特徴とする。 The specimen observation apparatus of the present invention includes a light source, an illumination optical system, an imaging optical system, an imaging apparatus, and an image processing apparatus. The illumination optical system uses illumination light from the light source as a specimen. The imaging optical system is arranged so that light from the specimen is incident and forms an optical image of the specimen, the imaging device is arranged at the position of the optical image, and the image processing apparatus The specimen observation method described above is performed.
本発明によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a specimen observation method and a specimen observation apparatus that can observe a colorless and transparent specimen, for example, a cell while in a bright field observation state.
本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。 Effects of the embodiment according to an aspect of the present invention will be described. It should be noted that, when the operational effects of the present embodiment are specifically described, a specific example will be shown and described. However, those exemplified aspects are only a part of the aspects included in the present invention, and there are many variations in the aspects. Therefore, the present invention is not limited to the illustrated embodiment.
実施形態の標本観察方法及び標本観察装置について説明する。以下の各実施形態の標本観察方法及び標本観察装置は、明視野観察の状態で用いられるものである。本実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本の像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域は、標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は結像光の波長帯域と照明光の波長帯域とは一致している。 The specimen observation method and specimen observation apparatus of the embodiment will be described. The specimen observation method and specimen observation apparatus of the following embodiments are used in a bright field observation state. In the bright field observation in the present embodiment, unlike the fluorescence observation, a fluorescence mirror unit including an excitation filter, a dichroic mirror, and an absorption filter is not used. Therefore, in the bright field observation state, when the sample is colorless and transparent, the wavelength band of the light that forms the image of the sample (hereinafter referred to as “imaging light”) is the light that illuminates the sample (hereinafter, as appropriate) Or a part of the wavelength band of the imaging light and the wavelength band of the illumination light.
また、本実施形態における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。よって、標本の一点から出た光についてみると、明視野観察の状態では、照明光学系における光の波面の変化と結像光学系における波面の変化はいずれもレンズのみで生じる。 Further, in the bright field observation in the present embodiment, a phase film in phase difference observation and a differential interference prism in differential interference observation are not used. Therefore, regarding the light emitted from one point of the sample, in the bright field observation state, the change in the wavefront of the light in the illumination optical system and the change in the wavefront in the imaging optical system both occur only with the lens.
また、本実施形態における明視野観察では、標本から来る光束の一部を減光するような減光フィルタは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本から標本の像までの間で、結像光に強度変化は生じない（ただし、レンズに起因する強度変化は除く）。 Further, in the bright field observation in the present embodiment, a neutral density filter that attenuates a part of the light beam coming from the specimen is not used. Therefore, in the bright field observation state, the intensity of the imaging light does not change between the specimen and the specimen image (except for the intensity change caused by the lens).
第１実施形態の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていることを特徴とする。 The sample observation method according to the first embodiment includes an acquisition step of acquiring an electronic image of a sample, and a subtraction step of subtracting a direct current component from the signal of the electronic image, and the acquisition step is performed in a bright field observation state. The electronic image in the subtraction step is an image acquired in a predetermined state, and at least the position of the sample and the in-focus position of the imaging optical system are different in the predetermined state.
第１実施形態の標本観察方法について、図１を用いて説明する。図１は、第１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 The sample observation method of the first embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a flowchart of the sample observation method according to the first embodiment.
第１実施形態の標本観察方法は、取得ステップＳ１０と、減算ステップＳ２０とを有する。これにより、第１実施形態の標本観察方法では、明瞭な電子画像が得られる。 The sample observation method of the first embodiment includes an acquisition step S10 and a subtraction step S20. Thereby, a clear electronic image is obtained in the sample observation method of the first embodiment.
第１実施形態の標本観察方法では、まず、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０では、標本の電子画像（以下、適宜、「電子画像」という）の取得が行われる。標本の像（光学像）は、結像光学系によって形成される。電子画像の取得では、この像をＣＣＤやＣＭＯＳのような撮像素子で撮像する。撮像によって、標本の像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。なお、標本の像は明視野観察の状態で形成されているので、電子画像の取得も明視野観察の状態で行われる。 In the sample observation method of the first embodiment, first, acquisition step S10 is executed. In the acquisition step S10, an electronic image of the specimen (hereinafter referred to as “electronic image” as appropriate) is acquired. The sample image (optical image) is formed by an imaging optical system. In acquiring an electronic image, this image is captured by an image sensor such as a CCD or CMOS. The image of the specimen is converted into an electronic image (digital data) by imaging. Since the specimen image is formed in the bright field observation state, the electronic image is also acquired in the bright field observation state.
取得ステップＳ１０が終わると、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。減算ステップＳ２０における電子画像は、所定の状態で取得された画像である。この所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置（以下、適宜、「合焦位置」という）とが異なっている。 When the acquisition step S10 ends, a subtraction step S20 is executed. In the subtraction step S20, a DC component (bias component) is subtracted from the electronic image signal. The electronic image in the subtraction step S20 is an image acquired in a predetermined state. In this predetermined state, at least the position of the sample is different from the focus position of the imaging optical system (hereinafter referred to as “focus position” as appropriate).
標本の位置と結像光学系の合焦位置とを異ならせるには、例えば、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させれば良い。また、まず合焦位置に標本の位置を一致させ、その後、合焦位置から離れる方向に標本を移動させても良い。あるいは、合焦位置が予め分かっている場合、合焦位置からずれた位置を予め決めておくことができるので、その位置まで標本を移動させれば良い。 In order to make the position of the specimen different from the in-focus position of the imaging optical system, for example, the specimen may be moved by eye measurement to a position that seems to be deviated from the in-focus position. Alternatively, the position of the sample may be first matched with the focus position, and then the sample may be moved in a direction away from the focus position. Alternatively, when the in-focus position is known in advance, a position deviated from the in-focus position can be determined in advance, and the sample may be moved to that position.
減算ステップＳ２０における電子画像は、少なくとも、標本の位置と合焦位置とが異なっているときの画像である。よって、電子画像の取得時には、標本の位置と合焦位置とが異なっている状態、すなわち、標本の位置が合焦位置からずれている状態が含まれる。 The electronic image in the subtraction step S20 is an image at least when the position of the specimen and the focus position are different. Therefore, when the electronic image is acquired, a state where the position of the sample is different from the in-focus position, that is, a state where the position of the sample is shifted from the in-focus position is included.
ここで、標本が格子状の位相物体の場合、標本を照明すると、標本から０次回折光と回折光が出てくる。標本の位置が合焦位置からずれている状態では、０次回折光と回折光との間に波面収差の差（光路長差）が発生する。この点ついて、図２〜図９を使って説明する。なお、回折光として１次回折光を用いて説明する。また、結像光学系の収差は無収差であるとする。また、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、すなわち、標本の位置の合焦位置からのずれ量を、適宜、ずれ量ΔＺという。 Here, when the sample is a lattice-like phase object, when the sample is illuminated, zero-order diffracted light and diffracted light are emitted from the sample. In a state where the position of the sample is deviated from the in-focus position, a wavefront aberration difference (optical path length difference) occurs between the 0th-order diffracted light and the diffracted light. This point will be described with reference to FIGS. The description will be made using first-order diffracted light as diffracted light. Further, it is assumed that the aberration of the imaging optical system is no aberration. Also, the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the specimen, that is, the amount of deviation from the in-focus position of the specimen is appropriately referred to as a deviation amount ΔZ.
図２は、標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、図２（ａ）は、合焦状態のときの図、図２（ｂ）は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。図３は、合焦状態のときの標本の電子画像である。図４は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの標本の電子画像である。図５は、標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、図５（ａ）は、合焦状態のときの図、図５（ｂ）は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。図６は、合焦状態のときの標本の電子画像である。図７は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの標本の電子画像である。なお、図３、４、６及び７は、いずれも減算ステップＳ２０が実行された後の画像である。また、図３、４、６及び７における標本は細胞である。 2A and 2B are diagrams showing the relationship between the position of the sample and the in-focus position, and the amount of wavefront aberration. FIG. 2A is a diagram in the in-focus state, and FIG. It is a figure at the time of a focus state (deviation amount ΔZ = 10 μm). FIG. 3 is an electronic image of the specimen in the focused state. FIG. 4 is an electronic image of the specimen in the out-of-focus state (deviation amount ΔZ = 10 μm). FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the position of the specimen and the in-focus position, and the amount of wavefront aberration. FIG. 5 (a) is a diagram in the in-focus state, and FIG. It is a figure at the time of a focus state (deviation amount ΔZ = 20 μm). FIG. 6 is an electronic image of the specimen in the focused state. FIG. 7 is an electronic image of the sample in the out-of-focus state (deviation amount ΔZ = 20 μm). 3, 4, 6 and 7 are images after the subtraction step S20 has been executed. The specimens in FIGS. 3, 4, 6 and 7 are cells.
また、合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置と一致した状態のことであって、非合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置からずれた状態のことである。また、ずれの方向は、図２（ｂ）と図５（ｂ）のいずれにおいても上方向（結像光学系３１に近づく方向）である。 Further, the in-focus state is a state in which the position of the sample S coincides with the in-focus position, and the out-of-focus state is a state in which the position of the sample S is deviated from the in-focus position. The direction of deviation is the upward direction (the direction approaching the imaging optical system 31) in both FIG. 2B and FIG. 5B.
また、標本Ｓについては、図２と図５で空間周波数が異なっている。図２と図５では、標本Ｓは、いずれも格子状の位相物体である。ただし、図２における標本Ｓでは、空間周波数が高い（位相の凹凸の周期が短い）。一方、図５における標本Ｓでは、図２の標本Ｓよりも空間周波数が低い（位相の凹凸の周期が図２の標本Ｓよりも長い）。 Further, the spatial frequency of the sample S is different between FIG. 2 and FIG. In FIGS. 2 and 5, the sample S is a lattice-like phase object. However, the sample S in FIG. 2 has a high spatial frequency (a short period of phase irregularities). On the other hand, the sample S in FIG. 5 has a lower spatial frequency than the sample S in FIG. 2 (the period of the phase irregularities is longer than that of the sample S in FIG. 2).
また、グラフは瞳位置での波面収差の量を表している。グラフの縦軸は波面収差量（単位は波長）、横軸は瞳面（瞳面上）の中心からの距離を表している。瞳面の中心からの距離は規格化されているので、無名数となっている。横軸の数値０は瞳面の中心位置、数値１は瞳面の最も外側の位置を表している。 The graph represents the amount of wavefront aberration at the pupil position. The vertical axis of the graph represents the amount of wavefront aberration (unit is wavelength), and the horizontal axis represents the distance from the center of the pupil plane (on the pupil plane). Since the distance from the center of the pupil plane is standardized, it is an unknown number. The numerical value 0 on the horizontal axis represents the center position of the pupil plane, and the numerical value 1 represents the outermost position of the pupil plane.
図２（ａ）に示すように、光軸上の一点から出た光には、光線ＬCと光線ＬPとが含まれている。光線ＬCは光軸上を進む光線である。ここで、光線ＬCと瞳面の交点は、瞳面の中心位置に一致している。一方、光線ＬPは、光軸ＡＸに対して所定の角度で結像光学系３１に入射する光線である。ここで、光線ＬPと瞳面の交点は、瞳面の中心から所定の距離だけ離れた位置になっている。 As shown in FIG. 2A, the light emitted from one point on the optical axis includes the light beam L C and the light beam L P. The light beam L C is a light beam traveling on the optical axis. Here, the intersection of the light beam L C and the pupil plane coincides with the center position of the pupil plane. On the other hand, the light beam L P is a light beam that enters the imaging optical system 31 at a predetermined angle with respect to the optical axis AX. Here, the intersection of light rays L P and the pupil plane is adapted to position a predetermined distance away from the center of the pupil plane.
標本Ｓを照明光（平行光束）で照明すると、標本Ｓから０次回折光と１次回折光が出てくる。ここで、標本Ｓと光軸が交わる点（光軸上の一点）に着目すると、０次回折光は回折されないので、この点から出た０次回折光は光軸上を進んで瞳の中心に到達する。よって、０次回折光は光線ＬCとみなすことができる。一方、１次回折光は所定の方向に回折されるので、この点から出た１次回折光は光軸に対して所定の角度で結像光学系３１に入射する。結像光学系３１に入射した１次回折光は、瞳面の中心から離れた位置に到達する。よって、１次回折光は光線ＬPとみなすことができる。 When the sample S is illuminated with illumination light (parallel light flux), 0th-order diffracted light and 1st-order diffracted light are emitted from the sample S. Here, paying attention to the point where the sample S and the optical axis intersect (one point on the optical axis), the 0th-order diffracted light is not diffracted, so that the 0th-order diffracted light that travels from this point travels on the optical axis and reaches the center of the pupil To do. Therefore, the 0th-order diffracted light can be regarded as the light beam L C. On the other hand, since the first-order diffracted light is diffracted in a predetermined direction, the first-order diffracted light emitted from this point enters the imaging optical system 31 at a predetermined angle with respect to the optical axis. The first-order diffracted light that has entered the imaging optical system 31 reaches a position away from the center of the pupil plane. Therefore, the first-order diffracted light can be regarded as the light beam L P.
まず、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合について説明する。合焦状態では、標本Ｓの位置ＰSは合焦位置ＰFと一致している。この状態では、図２（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量は０になっている。これは、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０であることを示している。波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量に相当するので、合焦時は、０次回折光と１次回折光のいずれにおいても、位相に変化は生じない。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ／２遅れたままなので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、電子画像はコントラストが無い画像になる。 First, a case where the sample S has a high spatial frequency will be described. In the focused state, the position P S of the sample S coincides with the focused position P F. In this state, as shown in the graph of FIG. 2A, the wavefront aberration amount is 0 at any position on the pupil plane. This indicates that both the amount of wavefront aberration in the 0th-order diffracted light and the amount of wavefront aberration in the 1st-order diffracted light are zero. Since the value obtained by multiplying the amount of wavefront aberration by (2π / λ) corresponds to the phase amount, there is no change in the phase in either the 0th-order diffracted light or the 1st-order diffracted light during focusing. Since the phase of the 1st-order diffracted light remains delayed by π / 2 with respect to the phase of the 0th-order diffracted light, ψ = 0 − (− π / 2) = π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information. As a result, the electronic image has no contrast.
ただし、実際の結像光学系には軸上色収差が残存している。そのため、白色光で標本Ｓを照明すると、波長よっては標本Ｓの位置ＰSと合焦位置ＰFとが一致しなくなる。この場合、結像光には、１次回折光に波面収差量が加わった波長の光が含まれる。そのため、本来であれば、電子画像はコントラストが無い画像になるが、実際には、図３に示すように、電子画像はコントラストを若干持った画像になる。 However, axial chromatic aberration remains in the actual imaging optical system. Accordingly, when illuminating the specimen S with white light, depending wavelength position P S and the focus position P F of the specimen S does not coincide. In this case, the imaging light includes light having a wavelength obtained by adding a wavefront aberration amount to the first-order diffracted light. Therefore, originally, the electronic image is an image having no contrast, but actually, as shown in FIG. 3, the electronic image is an image having a slight contrast.
一方、非合焦状態では、標本の位置ＰSは合焦位置ＰFからずれている。図２（ｂ）では、標本Ｓの位置ＰSが合焦位置ＰFよりも上方向（結像光学系３１に近づく方向）にずれている。この状態では、図２（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、波面収差は参照波面に対する実際の波面のずれで、このずれは位相のずれになる。そのため、波面収差が発生している範囲内に、１次回折光の位置があると、１次回折光の位相は、本来持っている位相に波面収差量が加わったものになる。このように、標本Ｓの位置ＰSを合焦位置ＰFからずらすことで、１次回折光の位相を変化させられる。 On the other hand, in the out-of-focus state, the sample position P S is deviated from the focus position P F. In FIG. 2B, the position P S of the sample S is shifted upward (in the direction approaching the imaging optical system 31) from the focus position P F. In this state, as shown in the graph of FIG. 2B, the wavefront aberration amount is 0 at the center of the pupil plane, but wavefront aberration occurs at a position away from the center of the pupil plane. Here, the wavefront aberration is a shift of the actual wavefront with respect to the reference wavefront, and this shift is a phase shift. For this reason, if the position of the first-order diffracted light is within the range where the wavefront aberration is generated, the phase of the first-order diffracted light is obtained by adding the amount of wavefront aberration to the original phase. In this way, the phase of the first-order diffracted light can be changed by shifting the position P S of the sample S from the focus position P F.
図２（ｂ）のグラフに示すように、位置ＰWにおける波面収差量は−λ／４である。そこで、瞳面での１次回折光の位置が位置ＰWと一致するように、合焦位置ＰFからのずれ量ΔＺを調整する。言い換えると、瞳面における１次回折光の位置において波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整する。図２（ｂ）では、ずれ量ΔＺを１０μｍにすることで、瞳面での１次回折光の位置を位置ＰWに一致させている。 As shown in the graph of FIG. 2B, the amount of wavefront aberration at the position P W is −λ / 4. Therefore, as the first-order diffracted light position in the pupil plane coincides with the position P W, adjusts the shift amount ΔZ from the focus position P F. In other words, the shift amount ΔZ is adjusted so that the wavefront aberration amount becomes −λ / 4 at the position of the first-order diffracted light on the pupil plane. In FIG. 2B, the position of the first-order diffracted light on the pupil plane is matched with the position P W by setting the shift amount ΔZ to 10 μm.
このようにすることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。上述のように、波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量であるので、非合焦時は、０次回折光については位相に変化は生じないが、１次回折光については位相に変化が生じる。具体的には、１次回折光では、もともとの位相の遅れπ／２に加えて、更に位相がλ／４×（２π／λ）＝π／２遅れる。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ遅れた状態になるので、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。その結果、図４に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、この電子画像を、例えば、表示装置に表示すれば、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 By doing so, the wavefront aberration amount in the first-order diffracted light can be set to −λ / 4 while the wavefront aberration amount in the zero-order diffracted light remains zero. As described above, since the value obtained by multiplying the amount of wavefront aberration by (2π / λ) is the phase amount, the phase does not change for the 0th-order diffracted light when out of focus, but the phase for the 1st-order diffracted light. Changes. Specifically, in the first-order diffracted light, in addition to the original phase delay π / 2, the phase is further delayed by λ / 4 × (2π / λ) = π / 2. Since the phase of the first-order diffracted light is in a state delayed by π with respect to the phase of the zero-order diffracted light, ψ = 0 − (− π) = π. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ ≠ 0, phase information is obtained as contrast information. As a result, as shown in FIG. 4, the electronic image becomes an image with clear contrast. Therefore, if this electronic image is displayed on a display device, for example, the observer can clearly observe the sample S (image of the sample S).
次に、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合について説明する。合焦状態では、標本Ｓの位置ＰSは合焦位置ＰFと一致している。この状態では、図５（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量は０になっている。これは、図２（ａ）と同じである。そのため、電子画像はコントラストが無い画像になる。ただし、上述の理由により、図６に示すように、電子画像は、コントラストを若干持った画像になる。 Next, a case where the sample S has a low spatial frequency will be described. In the focused state, the position P S of the sample S coincides with the focused position P F. In this state, as shown in the graph of FIG. 5A, the wavefront aberration amount is 0 at any position on the pupil plane. This is the same as FIG. Therefore, the electronic image is an image without contrast. However, for the reason described above, as shown in FIG. 6, the electronic image is an image having a slight contrast.
一方、非合焦状態では、図５（ｂ）に示すように、標本Ｓの位置ＰSが合焦位置ＰFよりも上方向（結像光学系に近づく方向）にずれている。この状態では、図５（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、図５における標本Ｓの構造は、図２における標本Ｓの構造と異なる。 On the other hand, in the non-focus state, as shown in FIG. 5 (b), the position P S of the specimen S is deviated upward (direction toward the imaging optical system) than the focus position P F. In this state, as shown in the graph of FIG. 5B, the wavefront aberration amount is 0 at the center of the pupil plane, but wavefront aberration occurs at a position away from the center of the pupil plane. Here, the structure of the sample S in FIG. 5 is different from the structure of the sample S in FIG.
この場合、１次回折光の回折角は、図５（ｂ）と図２（ｂ）とで異なる。図５（ｂ）における回折角は、図２（ｂ）に比べて小さくなる。そのため、瞳面における１次回折光の位置も、図５（ｂ）と図２（ｂ）とで異なる。図５（ｂ）のグラフに示すように、波面収差量が−λ／４となる位置はＰW’となる。位置ＰW’は、図２の位置ＰWに比べて瞳面の中心に近い位置になっている。 In this case, the diffraction angle of the first-order diffracted light is different between FIG. 5B and FIG. The diffraction angle in FIG. 5B is smaller than that in FIG. For this reason, the position of the first-order diffracted light on the pupil plane is also different between FIG. 5B and FIG. As shown in the graph of FIG. 5B, the position where the wavefront aberration amount is −λ / 4 is P W ′. The position P W ′ is closer to the center of the pupil plane than the position P W in FIG.
上述のように、位置ＰW’における波面収差量は−λ／４である。そこで、瞳面での１次回折光の位置が位置ＰW’と一致するように、ずれ量ΔＺを調整する。言い換えると、瞳面における１次回折光の位置において波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整する。図５（ｂ）では、ずれ量ΔＺを２０μｍにすることで、瞳面での１次回折光の位置を位置ＰW’に一致させている。 As described above, the amount of wavefront aberration at the position P W ′ is −λ / 4. Therefore, the shift amount ΔZ is adjusted so that the position of the first-order diffracted light on the pupil plane coincides with the position P W ′. In other words, the shift amount ΔZ is adjusted so that the wavefront aberration amount becomes −λ / 4 at the position of the first-order diffracted light on the pupil plane. In FIG. 5B, the position of the first-order diffracted light on the pupil plane is matched with the position P W ′ by setting the shift amount ΔZ to 20 μm.
このようにすると、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。これは、図２（ｂ）と同じである。そのため、図７に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 In this way, the wavefront aberration amount in the first-order diffracted light can be set to −λ / 4 while the wavefront aberration amount in the zero-order diffracted light remains zero. This is the same as FIG. Therefore, as shown in FIG. 7, the electronic image becomes an image having clear contrast. Therefore, the observer can clearly observe the sample S (image of the sample S).
図２（ｂ）や図５（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が−λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は逆位相の関係になる。逆位相の関係では、０次回折光と１次回折光は弱め合うことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。これは、位相差観察におけるダークコントラストに相当する。 In FIG. 2B and FIG. 5B, the amount of wavefront aberration in the first-order diffracted light is −λ / 4. In this case, the phase of the 0th-order diffracted light and the phase of the 1st-order diffracted light have an inverse phase relationship. In the antiphase relationship, the 0th-order diffracted light and the 1st-order diffracted light are weakened. Therefore, in the electronic image, the specimen S becomes darker than the background. This corresponds to dark contrast in phase difference observation.
また、回折光の回折角は、標本Ｓが持っている空間周波数によって異なる。例えば、標本Ｓを格子状の位相物体とした場合、格子の間隔が広いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が低いということになる。一方、格子の間隔が狭いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が高いということになる。ここで、格子の間隔が広いほど回折角は小さく、格子の間隔が狭いほど回折角は大きくなる。よって、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合回折角は小さく、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合回折角は大きくなる。 Further, the diffraction angle of the diffracted light varies depending on the spatial frequency of the sample S. For example, when the sample S is a lattice-like phase object, a large interval between the lattices means that the sample S has a low spatial frequency. On the other hand, a narrow lattice interval means that the sample S has a high spatial frequency. Here, the wider the grating interval, the smaller the diffraction angle, and the narrower the grating interval, the larger the diffraction angle. Therefore, when the sample S has a low spatial frequency, the diffraction angle is small, and when the sample S has a high spatial frequency, the diffraction angle is large.
細胞には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そのため、標本Ｓが細胞の場合、波面収差量が−λ／４となる位置を、どの空間周波数における１次回折光の位置と一致させるかで、標本の像の見え方が変わってくる。 Cells contain structures with various spatial frequencies. Therefore, when the sample S is a cell, the appearance of the image of the sample changes depending on which spatial frequency the position of the first-order diffracted light coincides with the position where the amount of wavefront aberration is −λ / 4.
高い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整すると（調整１）、電子画像では、空間周波数の高い部分が明瞭になる。一方、低い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整すると（調整２）、電子画像では、空間周波数の低い部分が明瞭になる。 When the shift amount ΔZ is adjusted so that the wavefront aberration amount becomes −λ / 4 at the position of the first-order diffracted light at a high spatial frequency (Adjustment 1), a high spatial frequency portion becomes clear in the electronic image. On the other hand, when the shift amount ΔZ is adjusted so that the wavefront aberration amount becomes −λ / 4 at the position of the first-order diffracted light at the low spatial frequency (Adjustment 2), the low spatial frequency portion becomes clear in the electronic image.
図４は調整１による電子画像で、図７は調整２による電子画像である。なお、標本は同じである。図４の電子画像と図７の電子画像を比べると、図４の電子画像では細胞の外周（空間周波数が高い部分）が明瞭になっているのに対して、図７の電子画像では細胞の内側（空間周波数が低い部分）が明瞭になっていることがわかる。 FIG. 4 is an electronic image by adjustment 1, and FIG. 7 is an electronic image by adjustment 2. The specimen is the same. Comparing the electronic image of FIG. 4 with the electronic image of FIG. 7, the electronic image of FIG. 4 clearly shows the outer periphery of the cell (part with high spatial frequency), whereas the electronic image of FIG. It can be seen that the inside (the portion with the low spatial frequency) is clear.
また、ずれの方向は下方向（結像光学系３１から離れる方向）であっても良い。その様子を図８と図９に示す。なお、図８と図９の詳細な説明は、図２と図５と同様であるので省略する。 Further, the direction of deviation may be a downward direction (a direction away from the imaging optical system 31). This is shown in FIGS. 8 and FIG. 9 is the same as FIG. 2 and FIG.
図８は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。図９は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。 FIG. 8 is a diagram showing the relationship between the position of the sample and the in-focus position, and the amount of wavefront aberration. FIG. 8A is a diagram in the in-focus state, and FIG. 8B is the out-of-focus state (deviation amount ΔZ = 10 μm). 9A and 9B are diagrams showing the relationship between the position of the sample and the in-focus position, and the amount of wavefront aberration. FIG. 9A is a diagram in the in-focus state, and FIG. 9B is the out-of-focus state (deviation amount ΔZ = 20 μm).
図８（ｂ）や図９（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は同位相の関係になる。同位相の関係では、０次回折光と１次回折光は強め合うことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。これは、位相差観察におけるブライトコントラストに相当する。 In FIG. 8B and FIG. 9B, the amount of wavefront aberration in the first-order diffracted light is + λ / 4. In this case, the phase of the 0th-order diffracted light and the phase of the 1st-order diffracted light have the same phase relationship. In the same phase relationship, the 0th-order diffracted light and the 1st-order diffracted light strengthen each other. Therefore, in the electronic image, the specimen S becomes brighter than the background. This corresponds to bright contrast in phase difference observation.
また、電子画像は示さないが、１次回折光の回折角は、図８（ｂ）の方が図９（ｂ）に比べて大きい。よって、図８（ｂ）の電子画像では細胞の外周（空間周波数が高い部分）が明瞭になるのに対して、図９（ｂ）の電子画像では細胞の内側（空間周波数が低い部分）が明瞭になる。 Although the electronic image is not shown, the diffraction angle of the first-order diffracted light is larger in FIG. 8B than in FIG. 9B. Therefore, in the electronic image of FIG. 8B, the outer periphery of the cell (part where the spatial frequency is high) becomes clear, whereas in the electronic image of FIG. 9B, the inside of the cell (part where the spatial frequency is low) is shown. Become clear.
なお、本実施形態の観察方法では、ずれ量ΔＺはそれほど大きくない。この場合、合焦位置に対して標本Ｓの位置をずらしても、結像光学系３１に対する１次回折光の入射位置はほとんど変化しない。そのため、瞳面での１次回折光の位置も、ほとんど変化しないものとみなせる。よって、標本Ｓの位置を移動させるだけで、１次回折光に追加される波面収差量が−λ／４となるようにできる。 In the observation method of the present embodiment, the shift amount ΔZ is not so large. In this case, even if the position of the sample S is shifted from the in-focus position, the incident position of the first-order diffracted light with respect to the imaging optical system 31 hardly changes. Therefore, it can be considered that the position of the first-order diffracted light on the pupil plane hardly changes. Therefore, only by moving the position of the sample S, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light can be set to −λ / 4.
取得ステップＳ１０が終わると、続いて減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。 When the acquisition step S10 ends, the subtraction step S20 is subsequently executed. In the subtraction step S20, a DC component (bias component) is subtracted from the electronic image signal.
上述のように、取得ステップＳ１０では、標本の位置と合焦位置とが異なっている。そのため、２Ａ1Ａ2cosψ≠０になる。この場合、像面における光の強度Ｉは以下のようになる。
Ｉ＝Ａ1 2＋Ａ2 2＋２Ａ1Ａ2cosψ
As described above, in the acquisition step S10, the position of the sample and the in-focus position are different. Therefore, 2A 1 A 2 cosψ ≠ 0. In this case, the light intensity I on the image plane is as follows.
I = A 1 2 + A 2 2 + 2A 1 A 2 cosψ
ここで、Ａ1 2＋Ａ2 2は標本の像における直流成分（バイアス成分）、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分（バイアス成分）を表している。このうち、０次回折光の振幅Ａ1 2は、非常に大きな値を持つ。そこで、減算ステップＳ２０で、Ａ1 2の値を小さくする。このようにすることで、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値を相対的に大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 Here, A 1 2 + A 2 2 represents a DC component (bias component) in the sample image, that is, a DC component (bias component) in the signal of the electronic image. Among them, 0 amplitude A 1 2 of the diffracted light has a very large value. Therefore, in the subtraction step S20, decreasing the value of A 1 2. In this way, the value of 2A 1 A 2 cos ψ can be relatively increased with respect to the value of A 1 2 + A 2 2 . As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
以上のように、第１実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を明瞭に観察できる。 As described above, according to the sample observation method of the first embodiment, it is possible to clearly observe a colorless and transparent sample while in a bright field observation state.
第２実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に比較ステップを有し、取得ステップを少なくとも３回行い、先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、比較ステップで比較し、所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、取得ステップから比較ステップまでを繰り返し行うものである。 The specimen observation method of the second embodiment has a comparison step after the subtraction step, performs the acquisition step at least three times, compares the electronic image acquired earlier and the electronic image acquired later, in the comparison step, Until an electronic image satisfying a predetermined condition is obtained, the acquisition step to the comparison step are repeated.
第２実施形態の標本観察方法について、図１０と図１１を用いて説明する。図１０（ａ）は、第２実施形態の標本観察方法の簡単なフローチャート、図１０（ｂ）は、標本と結像光学系の間隔と、コントラストの関係を示すグラフである。また、図１１は、第２実施形態の標本観察方法の詳細なフローチャートである。 A specimen observation method according to the second embodiment will be described with reference to FIGS. 10 and 11. FIG. 10A is a simple flowchart of the specimen observation method of the second embodiment, and FIG. 10B is a graph showing the relationship between the distance between the specimen and the imaging optical system and the contrast. FIG. 11 is a detailed flowchart of the sample observation method of the second embodiment.
第２実施形態の標本観察方法は、図１０（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、比較ステップＳ３０−１を有する。比較ステップＳ３０−１は減算ステップＳ２０よりも後に実行される。また、取得ステップＳ１０は少なくとも３回行い、先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、比較ステップＳ３０−１で比較する。更に、所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、取得ステップＳ１０から比較ステップＳ３０−１までを繰り返し行う。これにより、第２実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が自動的に得られる。 As shown in FIG. 10A, the sample observation method of the second embodiment further includes a comparison step S30-1 in addition to the acquisition step S10 and the subtraction step S20. The comparison step S30-1 is executed after the subtraction step S20. Moreover, acquisition step S10 is performed at least three times, and the electronic image acquired earlier and the electronic image acquired later are compared in comparison step S30-1. Furthermore, the acquisition step S10 to the comparison step S30-1 are repeated until an electronic image that satisfies a predetermined condition is obtained. Thereby, in the sample observation method of the second embodiment, a clearer electronic image is automatically obtained.
電子画像における画質を評価するものに、コントラストがある。このコントラストは、図１０（ｂ）に示すように、標本Ｓと結像光学系３１の間隔（以下、適宜、「間隔Ｄ」という）によって変化する。間隔Ｄが広い状態から狭まるにつれて、区間Ｘ１ではコントラストは徐々に上昇し、その後、区間Ｘ２ではコントラストは徐々に低下する。続いて、区間Ｘ３ではコントラストは徐々に上昇し、区間Ｘ４ではコントラストは徐々に低下する。 Contrast is one that evaluates image quality in electronic images. As shown in FIG. 10B, this contrast varies depending on the interval between the specimen S and the imaging optical system 31 (hereinafter, referred to as “interval D” as appropriate). As the interval D decreases from a wide state, the contrast gradually increases in the section X1, and thereafter the contrast gradually decreases in the section X2. Subsequently, the contrast gradually increases in the section X3, and the contrast gradually decreases in the section X4.
そこで、画質の高い電子画像を取得するには、間隔Ｄをコントラストが大きいときの間隔にすれば良い。すなわち、間隔Ｄを、区間Ｘ１と区間Ｘ２の境界部分の間隔（以下、適宜、「間隔ＤＭ１」という）、あるは、区間Ｘ３と区間Ｘ４の境界部分の間隔（以下、適宜、「間隔ＤＭ２」という）にすれば良い。 Therefore, in order to acquire a high-quality electronic image, the interval D may be set to an interval when the contrast is large. That is, the interval D is defined as the interval between the boundary portions of the sections X1 and X2 (hereinafter referred to as “interval DM1” as appropriate) or the interval between the boundaries of the sections X3 and X4 (hereinafter referred to as “interval DM2” as appropriate). To do so).
しかしながら、図１０（ｂ）に示すコントラストの曲線では、コントラストの値によっては、同じコントラストになる間隔Ｄが、区間Ｘ１〜区間Ｘ４のそれぞれの区間内に存在する。そのため、最初に電子画像を取得したときの間隔（以下、適宜、「間隔Ｄ１」という）が、区間Ｘ１〜区間Ｘ４のうちの、どの区間内に存在するかを特定する必要がある。 However, in the contrast curve shown in FIG. 10B, depending on the contrast value, there are intervals D in which the same contrast is obtained in each of the sections X1 to X4. Therefore, it is necessary to specify in which of the sections X1 to X4 the interval when the electronic image is first acquired (hereinafter referred to as “interval D1” as appropriate) exists.
また、最初に取得した電子画像のコントラストが低い場合、コントラストが大きくなるようにする必要がある。しかしながら、間隔Ｄを広い状態から狭くしていった場合、区間Ｘ１と区間Ｘ３ではコントラストは徐々に上昇し、逆に、区間Ｘ２と区間Ｘ４ではコントラストは徐々に低下する。そのため、コントラストを大きくするために、間隔Ｄを広げるようにするのか、狭めるようにするのかを特定する必要がある。 Moreover, when the contrast of the electronic image acquired initially is low, it is necessary to increase the contrast. However, when the interval D is reduced from a wide state, the contrast gradually increases in the sections X1 and X3, and conversely, the contrast gradually decreases in the sections X2 and X4. Therefore, in order to increase the contrast, it is necessary to specify whether the interval D is widened or narrowed.
そこで、比較ステップＳ３０−１では、これらの点を考慮した比較が行われる。第２実施形態の標本観察方法について、図１１を用いてより詳しく説明する。 Therefore, in the comparison step S30-1, a comparison considering these points is performed. The sample observation method of the second embodiment will be described in more detail with reference to FIG.
まず、取得回数を計測するために、変数ｎに０が設定される（Ｓ３００）。続いて、取得ステップＳ１０（１回目）と減算ステップＳ２０が実行される。なお、この取得ステップＳ１０では、間隔Ｄ１で電子画像の取得が行われる。 First, in order to measure the number of acquisitions, 0 is set to the variable n (S300). Subsequently, an acquisition step S10 (first time) and a subtraction step S20 are executed. In this acquisition step S10, an electronic image is acquired at the interval D1.
続いて、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１）。ここでは、変数ｎの値が０なので、Ｓ３０１の判断結果はＹＥＳとなる。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３０２）、取得した電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３０３）。そして、標本Ｓと結像光学系３１の間隔（間隔Ｄ）が所定量だけ広げられる（Ｓ３０４）。なお、所定量は、予め設定されているものとする。 Subsequently, the number of acquisitions is determined (S301). Here, since the value of the variable n is 0, the determination result in S301 is YES. Therefore, 1 is added to the variable n (S302), and the acquired electronic image is stored in the storage unit 1 (S303). Then, the interval (distance D) between the sample S and the imaging optical system 31 is increased by a predetermined amount (S304). Note that the predetermined amount is set in advance.
Ｓ３０４が終了すると、再び、取得ステップＳ１０（２回目）が実行される。このとき、間隔Ｄが間隔Ｄ１よりも広がった状態で、電子画像の取得が行われる。その後、減算ステップＳ２０が実行され、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１、Ｓ３０５）。ここでは、変数ｎの値が１になっているので、Ｓ３０１の判断結果はＮＯ、Ｓ３０５の判断結果はＹＥＳになる。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３０６）、取得した電子画像が記憶部２に保存される（Ｓ３０７）。 When S304 ends, acquisition step S10 (second time) is executed again. At this time, an electronic image is acquired in a state where the interval D is wider than the interval D1. Thereafter, a subtraction step S20 is executed, and the number of acquisitions is determined (S301, S305). Here, since the value of the variable n is 1, the determination result in S301 is NO, and the determination result in S305 is YES. Therefore, 1 is added to the variable n (S306), and the acquired electronic image is stored in the storage unit 2 (S307).
続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる（Ｓ３０８）。ここで、判断結果がＹＥＳの場合、すなわち、
記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、区間Ｘ１内又は区間Ｘ３内に間隔Ｄ１が存在している。
Subsequently, the contrast of the electronic image in the storage unit 1 and the electronic image in the storage unit 2 is compared (S308). Here, if the determination result is YES, that is,
When the contrast of the electronic image in the storage unit 1> the contrast of the electronic image in the storage unit 2, the interval D1 exists in the section X1 or the section X3.
区間Ｘ１内又は区間Ｘ３内に間隔Ｄ１が存在している場合、コントラストを大きくするためには、間隔Ｄを狭くすれば良い。そこで、間隔Ｄを狭くする指定が行われる（Ｓ３０９）。なお、フローチャートには示していないが、Ｓ３０９では、間隔Ｄを所定量だけ狭める処理も行われる。このときの所定量は、Ｓ３０４での所定量と同じであっても、異なっていても良い。 When the interval D1 exists in the section X1 or the section X3, the interval D may be narrowed in order to increase the contrast. Therefore, a designation to narrow the interval D is made (S309). Although not shown in the flowchart, in S309, a process of narrowing the interval D by a predetermined amount is also performed. The predetermined amount at this time may be the same as or different from the predetermined amount in S304.
一方、判断結果がＮＯ場合、すなわち、
記憶部１の電子画像のコントラスト＜記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、区間Ｘ２内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している。
On the other hand, if the determination result is NO, that is,
When the contrast of the electronic image in the storage unit 1 <the contrast of the electronic image in the storage unit 2, the interval D <b> 1 exists in the section X <b> 2 or the section X <b> 4.
区間Ｘ２内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合、コントラストを大きくするためには、間隔Ｄを広くすれば良い。そこで、間隔Ｄを広くする指定が行われる（Ｓ３１０）。なお、フローチャートには示していないが、Ｓ３１０では、間隔Ｄを所定量だけ広げる処理も行われる。このときの所定量は、Ｓ３０４での所定量と同じであっても、異なっていても良い。更に、記憶部２に保存していた電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３１１）。この記憶部１には、先に取得した電子画像が保存されていることになる。 When the interval D1 exists in the section X2 or the section X4, the interval D may be widened in order to increase the contrast. Therefore, designation is made to widen the interval D (S310). Although not shown in the flowchart, in S310, processing for expanding the interval D by a predetermined amount is also performed. The predetermined amount at this time may be the same as or different from the predetermined amount in S304. Further, the electronic image stored in the storage unit 2 is stored in the storage unit 1 (S311). The storage unit 1 stores an electronic image acquired in advance.
ここで、比較ステップＳ３０−１には、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理が含まれているが、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理は１回だけ行えば良い。よって、取得ステップＳ１０から比較ステップＳ３０−１までを繰り返し行ったとしても、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理は繰り返し行われない。 Here, although the processing from S301 to S311 is included in the comparison step S30-1, the processing from S301 to S311 may be performed only once. Therefore, even if the acquisition step S10 to the comparison step S30-1 are repeated, the processing from S301 to S311 is not repeated.
Ｓ３０９またはＳ３１１が終了すると、再び、取得ステップＳ１０（３回目）が実行される。このとき、間隔Ｄが所定量だけ広がった状態又は狭まった状態で、電子画像の取得が行われる。その後、減算ステップＳ２０が実行され、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１、Ｓ３０５）。ここでは、変数ｎが３になっているので、Ｓ３０１の判断結果はＮＯ、Ｓ３０５の判断結果もＮＯになる。そして、取得した電子画像が記憶部２に保存される（Ｓ３１２）。この記憶部２には、後に取得した電子画像が保存されていることになる。 When S309 or S311 ends, acquisition step S10 (third time) is executed again. At this time, an electronic image is acquired in a state where the interval D is widened or narrowed by a predetermined amount. Thereafter, a subtraction step S20 is executed, and the number of acquisitions is determined (S301, S305). Here, since the variable n is 3, the determination result in S301 is NO, and the determination result in S305 is also NO. Then, the acquired electronic image is stored in the storage unit 2 (S312). This storage unit 2 stores an electronic image acquired later.
続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる（Ｓ３１３）。ここで、この比較では、所定の条件として、
記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
を用いる。また、記憶部１には、常にコントラストの高い電子画像が保存されている。
Subsequently, the contrast of the electronic image in the storage unit 1 and the electronic image in the storage unit 2 is compared (S313). Here, in this comparison, as a predetermined condition,
The contrast of the electronic image in the storage unit 1> the contrast of the electronic image in the storage unit 2 is used. The storage unit 1 always stores an electronic image with high contrast.
判断結果がＹＥＳの場合、すなわち、
記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、所定の条件が満足されたことになる。これは、十分にコントラストの高い電子画像が得られたことを示しているので、比較を終了する。
If the determination result is YES, that is,
When the contrast of the electronic image in the storage unit 1> the contrast of the electronic image in the storage unit 2, a predetermined condition is satisfied. Since this indicates that an electronic image having a sufficiently high contrast is obtained, the comparison is terminated.
一方、判断結果がＮＯ場合、すなわち、
記憶部１の電子画像のコントラスト＜記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、所定の条件が満足されていないことになる。これは、取得した電子画像のコントラストが十分に高いとは言えないことを意味している。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３１４）、取得した電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３１５）。
On the other hand, if the determination result is NO, that is,
If the contrast of the electronic image in the storage unit 1 <the contrast of the electronic image in the storage unit 2, the predetermined condition is not satisfied. This means that the acquired electronic image cannot be said to have a sufficiently high contrast. Therefore, 1 is added to the variable n (S314), and the acquired electronic image is stored in the storage unit 1 (S315).
更に、指定された間隔変化に従って、間隔Ｄが所定量だけ変化される（Ｓ３１６）。指定された間隔変化とは、間隔Ｄを狭くする変化（Ｓ３０９で指定）や間隔Ｄを広くする変化（Ｓ３１０で指定）のことである。 Further, according to the designated interval change, the interval D is changed by a predetermined amount (S316). The designated interval change is a change that narrows the interval D (designated in S309) or a change that widens the interval D (designated in S310).
Ｓ３１６の終了後、再び、取得ステップＳ１０が実行される。これ以降の処理は、Ｓ３１３における判断結果がＹＥＳになるまで繰り返し行われる。判断結果がＹＥＳになると比較を終了する。 After the end of S316, acquisition step S10 is executed again. The subsequent processing is repeated until the determination result in S313 is YES. When the determination result is YES, the comparison is terminated.
このように、第２実施形態の標本観察方法では、Ｓ３１３における判断結果がＹＥＳとなるまで繰り返し処理を行う。この繰り返し処理を行うことで、十分にコントラストの高い電子画像が自動的に得られる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 Thus, in the sample observation method of the second embodiment, the process is repeated until the determination result in S313 is YES. By repeating this process, an electronic image having a sufficiently high contrast is automatically obtained. As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
なお、Ｓ３１３では、所定の条件を、
記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
とした。しかしながら、以下のように、２つの電子画像のコントラストの差が許容値Ｅよりも小さくなることを、所定の条件にしても良い。
｜記憶部１の電子画像のコントラスト−記憶部２の電子画像のコントラスト｜＜Ｅ
In S313, the predetermined condition is
The contrast of the electronic image in the storage unit 1 was set to be greater than the contrast of the electronic image in the storage unit 2. However, the predetermined condition may be that the difference in contrast between the two electronic images is smaller than the allowable value E as follows.
| Contrast of electronic image in storage unit 1−Contrast of electronic image in storage unit 2 | <E
また、図１１のフローチャートでは、区間Ｘ１内又は区間Ｘ２内に間隔Ｄ１が存在している場合、最終的に取得される電子画像は間隔ＤＭ１の画像になる。一方、区間Ｘ３内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合、最終的に取得される電子画像は間隔ＤＭ２の画像になる。 In the flowchart of FIG. 11, when the interval D1 exists in the section X1 or the section X2, the electronic image finally acquired is an image of the interval DM1. On the other hand, when the interval D1 exists in the section X3 or the section X4, the finally acquired electronic image is an image of the interval DM2.
しかしながら、別の処理を加えて、区間Ｘ１内又は区間Ｘ２内に間隔Ｄ１が存在している場合であっても、間隔ＤＭ２での電子画像が得られるようにしても良い。同様に、区間Ｘ３内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合であっても、間隔ＤＭ１での電子画像が得られるようにしても良い。この場合、処理の途中で、標本Ｓの位置と結像光学系３１の合焦位置とが一致した状態になるが、この状態になったとしても、取得ステップＳ１０は実行される。なお、別の処理については、説明を省略する。 However, another process may be added to obtain an electronic image at the interval DM2 even when the interval D1 exists in the section X1 or the section X2. Similarly, an electronic image at the interval DM1 may be obtained even when the interval D1 exists in the section X3 or the section X4. In this case, in the middle of the process, the position of the sample S and the in-focus position of the imaging optical system 31 coincide with each other. Even in this state, the acquisition step S10 is executed. Note that description of other processes is omitted.
以上のように、第２実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the specimen observation method of the second embodiment, it is possible to observe a clear and colorless specimen more clearly in the bright field observation state.
第３実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、増幅ステップでは、減算ステップ後の電子画像の信号を増幅するものである。 The specimen observation method of the third embodiment has an amplification step after the subtraction step, and the amplification step amplifies the electronic image signal after the subtraction step.
第３実施形態の標本観察方法について、図１２（ａ）を用いて説明する。図１２（ａ）は、第３実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 A sample observation method according to the third embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 12A is a flowchart of the sample observation method of the third embodiment.
第３実施形態の標本観察方法は、図１２（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、増幅ステップＳ３０−２を有する。これにより、第３実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。 As shown in FIG. 12A, the sample observation method of the third embodiment further includes an amplification step S30-2 in addition to the acquisition step S10 and the subtraction step S20. Thereby, a clearer electronic image is obtained in the sample observation method of the third embodiment.
上述のように、Ａ1 2＋Ａ2 2は標本の像の直流成分、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分を表している。減算ステップＳ２０では、Ａ1 2の値を小さくすることで、２Ａ1Ａ2cosψの値をＡ1 2＋Ａ2 2の値に対して相対的に大きくしている。 As described above, A 1 2 + A 2 2 represents the DC component of the sample image, that is, the DC component of the electronic image signal. In subtraction step S20, by reducing the value of A 1 2, they have relatively large values of 2A 1 A 2 cos against A 1 2 + A 2 2 values.
これに対して、第３実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０の終了後に、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ1Ａ2cosψの値を大きくしている（増幅している）。このようにすることで、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 On the other hand, in the sample observation method of the third embodiment, the amplification step S30-2 is executed after the acquisition step S10 and the subtraction step S20 are completed. In the amplification step S30-2, the value of 2A 1 A 2 cos ψ is increased (amplified). In this way, the value of 2A 1 A 2 cos ψ can be made relatively larger than the value of A 1 2 + A 2 2 . As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
なお、増幅ステップＳ３０−２を、第２実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、増幅ステップＳ３０−２は、比較ステップＳ３０−１よりも前に実行される。 In addition, you may use amplification step S30-2 for the sample observation method of 2nd Embodiment. In this case, the amplification step S30-2 is executed before the comparison step S30-1.
以上のように、第３実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the specimen observation method of the third embodiment, it is possible to observe a clear and colorless specimen more clearly in the bright field observation state.
第４実施形態の標本観察方法は、電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、変換ステップは、減算ステップよりも前に行われ、逆変換ステップは、少なくとも減算ステップよりも後に行われるものである。 The specimen observation method according to the fourth embodiment includes a transform step for performing a Fourier transform on a signal of an electronic image, and an inverse transform step for performing an inverse Fourier transform. The transform step is performed before the subtract step, The conversion step is performed at least after the subtraction step.
第４実施形態の標本観察方法について、図１２（ｂ）と図１３を用いて説明する。図１２（ｂ）は、第４実施形態の標本観察方法のフローチャートである。図１３は、各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。 A specimen observation method according to the fourth embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 12B is a flowchart of the sample observation method of the fourth embodiment. FIG. 13 is a diagram showing the magnitude at each spatial frequency, where (a) shows a state before execution of the subtraction step, and (b) shows a state after execution of the subtraction step.
第４実施形態の標本観察方法は、図１２（ｂ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３とを有する。これにより、第４実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が簡単に得られる。 As shown in FIG. 12B, the specimen observation method of the fourth embodiment further includes a conversion step S15-1 and an inverse conversion step S30-3 in addition to the acquisition step S10 and the subtraction step S20. Thereby, in the specimen observation method of the fourth embodiment, a clearer electronic image can be easily obtained.
上述のように、減算ステップＳ２０では、Ａ1 2の値を小さくすることで、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値を相対的に大きくしている。ここで、周波数空間で減算ステップＳ２０が実行されると、減算を効率的に行える。 As described above, in the subtraction step S20, by reducing the value of A 1 2, they have relatively large values of 2A 1 A 2 cos against A 1 2 + A 2 2 values. Here, when the subtraction step S20 is executed in the frequency space, the subtraction can be performed efficiently.
減算ステップＳ２０における減算について、図１３を用いて説明する。上述のように、細胞のような標本には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そこで、標本Ｓの像の明るさを空間周波数ごとに分離できれば、空間周波数ごとに減算が行える。 The subtraction in the subtraction step S20 will be described with reference to FIG. As described above, a specimen such as a cell includes structures having various spatial frequencies. Therefore, if the brightness of the image of the sample S can be separated for each spatial frequency, subtraction can be performed for each spatial frequency.
そこで、第４実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の終了後に、変換ステップＳ１５−１が実行される。変換ステップＳ１５−１では、電子画像の信号をフーリエ変換する。その結果、図１３（ａ）に示すように、空間周波数ごとに、その大きさ（縦軸、明るさに相当）が分離される。図１３（ａ）では、横軸の数値は空間周波数を示しており、空間周波数が０では、その大きさは１００で、空間周波数が１では、その大きさは３０になっている。 Therefore, in the specimen observation method of the fourth embodiment, the conversion step S15-1 is executed after the acquisition step S10 is completed. In the conversion step S15-1, the signal of the electronic image is Fourier transformed. As a result, as shown in FIG. 13A, the size (vertical axis, corresponding to brightness) is separated for each spatial frequency. In FIG. 13A, the numerical value on the horizontal axis represents the spatial frequency. When the spatial frequency is 0, the magnitude is 100, and when the spatial frequency is 1, the magnitude is 30.
ここで、空間周波数の値（横軸の数値）は、回折光の次数と対応している。そのため、空間周波数０では、その大きさ（縦軸の数値）は０次回折光の明るさに対応する。同様に、空間周波数１では、その大きさは１次回折光の明るさに対応する。そこで、変換ステップＳ１５−１の終了後に、減算ステップＳ２０が実行される。この減算ステップＳ２０では、空間周波数０での大きさを小さくしている。例えば、図１３（ｂ）に示すように、空間周波数０での大きさを、１００から５０に半減させている。これは、Ａ1 2の値を小さくすることに相当する。このようにすることで、０次光の明るさを小さくできる。 Here, the value of the spatial frequency (the numerical value on the horizontal axis) corresponds to the order of the diffracted light. Therefore, at a spatial frequency of 0, the magnitude (the numerical value on the vertical axis) corresponds to the brightness of the 0th-order diffracted light. Similarly, at the spatial frequency 1, the magnitude corresponds to the brightness of the first-order diffracted light. Therefore, the subtraction step S20 is executed after the conversion step S15-1 is completed. In this subtraction step S20, the magnitude at the spatial frequency 0 is reduced. For example, as shown in FIG. 13B, the size at the spatial frequency 0 is halved from 100 to 50. This corresponds to decreasing the value of A 1 2 . By doing in this way, the brightness of 0th-order light can be made small.
続いて、逆変換ステップＳ３０−３が実行される。逆変換ステップＳ３０−３では、逆フーリエ変換を行う。これにより、電子画像の信号を得ることができる。なお、減算ステップＳ２０によって、０次光の明るさ、すなわち、Ａ1 2の値が小さくなっている。そのため、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 Subsequently, the inverse conversion step S30-3 is executed. In inverse transform step S30-3, inverse Fourier transform is performed. Thereby, an electronic image signal can be obtained. Incidentally, by the subtraction step S20, 0 order light brightness, i.e., the value of A 1 2 is smaller. Therefore, the value of 2A 1 A 2 cos ψ can be made relatively larger than the value of A 1 2 + A 2 2 . As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
なお、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３を、第２実施形態の標本観察方法や第３実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、変換ステップＳ１５−１は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。また、逆変換ステップＳ３０−３は、減算ステップＳ２０よりも後に実行される。 Note that the conversion step S15-1 and the inverse conversion step S30-3 may be used in the sample observation method of the second embodiment and the sample observation method of the third embodiment. In this case, the conversion step S15-1 is executed before the subtraction step S20. Further, the inverse conversion step S30-3 is executed after the subtraction step S20.
以上のように、第４実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the specimen observation method of the fourth embodiment, a clear and colorless specimen can be observed more clearly while in the bright field observation state.
第５実施形態の標本観察方法は、事前取得ステップと、規格化ステップと、を有し、事前取得ステップでは、標本が無い状態で電子画像を取得し、規格化ステップでは、電子画像で標本の電子画像を規格化し、減算ステップの前に、規格化ステップを行うものである。 The specimen observation method of the fifth embodiment includes a pre-acquisition step and a normalization step. In the pre-acquisition step, an electronic image is obtained in the absence of the specimen. The electronic image is normalized, and the normalization step is performed before the subtraction step.
第５実施形態の標本観察方法について、図１４を用いて説明する。図１４は第５実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 A specimen observation method according to the fifth embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 14 is a flowchart of the sample observation method of the fifth embodiment.
第５実施形態の標本観察方法は、図１４に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２とを有する。これにより、第５実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。 As shown in FIG. 14, the sample observation method of the fifth embodiment further includes a pre-acquisition step S00 and a normalization step S15-2 in addition to the acquisition step S10 and the subtraction step S20. Thereby, in the sample observation method of the fifth embodiment, a clearer electronic image can be obtained.
なお、図１４では、減算ステップＳ２０の後に、増幅ステップＳ３０−２が備わっているが、この増幅ステップＳ３０−２は必須ではない。 In FIG. 14, an amplification step S30-2 is provided after the subtraction step S20, but this amplification step S30-2 is not essential.
標本Ｓの像の明るさは、照明光学系による影響や結像光学系による影響を受けることがある。例えば、照明光学系や結像光学系を光が通過することで、通過後の光の明るさにむらが生じる。この場合、照明光学系や結像光学系による明るさのむらのために、標本Ｓの像にも明るさにむらが生じる。この明るさのむらは電子画像の画質を低下させるので、除去することが好ましい。 The brightness of the image of the sample S may be affected by the illumination optical system or the imaging optical system. For example, when light passes through an illumination optical system or an imaging optical system, unevenness in the brightness of the light after passing occurs. In this case, due to uneven brightness due to the illumination optical system and the imaging optical system, unevenness in brightness also occurs in the image of the specimen S. This uneven brightness is preferably removed because it reduces the image quality of the electronic image.
そこで、第５実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の実行に先立って、事前取得ステップＳ００が実行される。事前取得ステップＳ００では、標本Ｓが無い状態で電子画像Ａの取得が行われる。このとき、電子画像Ａは、明るさのむらのみの画像になる。 Therefore, in the specimen observation method of the fifth embodiment, prior acquisition step S00 is executed prior to execution of acquisition step S10. In the pre-acquisition step S00, the electronic image A is acquired without the specimen S. At this time, the electronic image A is an image having only uneven brightness.
続いて、取得ステップＳ１０が実行され、標本Ｓの電子画像Ｂの取得が行われる。この電子画像Ｂは、標本Ｓの像に、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが加わった画像になる。そこで、規格化ステップＳ１５−２が実行される。規格化ステップＳ１５−２では、電子画像Ａで電子画像Ｂを規格化する。すなわち、以下の演算、
電子画像Ｂ／電子画像Ａ
を規格化ステップＳ１５−２において行う。これにより、電子画像Ｂにおける明るさのむらが、電子画像Ａにおける明るさのむらでキャンセルされる。そのため、規格化後の電子画像は、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが低減された画像になる。
Subsequently, an acquisition step S10 is executed, and an electronic image B of the sample S is acquired. The electronic image B is an image obtained by adding unevenness of brightness to the image of the specimen S to the illumination optical system or the imaging optical system. Therefore, normalization step S15-2 is executed. In the standardization step S15-2, the electronic image B is standardized with the electronic image A. That is, the following operation:
Electronic image B / Electronic image A
Is performed in the normalization step S15-2. Thereby, the uneven brightness in the electronic image B is canceled by the uneven brightness in the electronic image A. Therefore, the normalized electronic image is an image in which unevenness in brightness due to the illumination optical system and the imaging optical system is reduced.
規格化ステップＳ１５−２の終了後、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、規格化後の電子画像においてＡ1 2の値を小さくし、これにより、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値を相対的に大きくする。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 Subsequent to the normalization step S15-2, the subtraction step S20 is executed. In the subtraction step S20, the value of A 1 2 is reduced in the normalized electronic image, and thereby the value of 2A 1 A 2 cos ψ is relatively increased with respect to the value of A 1 2 + A 2 2 . As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
なお、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２を、第２実施形態の標本観察方法から第４実施形態の標本観察方法までのいずれに用いても良い。この場合、事前取得ステップＳ００は、取得ステップＳ１０よりも前に実行される。また、規格化ステップＳ１５−２は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。 Note that the pre-acquisition step S00 and the normalization step S15-2 may be used for any of the specimen observation method of the second embodiment to the specimen observation method of the fourth embodiment. In this case, the advance acquisition step S00 is executed before the acquisition step S10. Further, the normalization step S15-2 is executed before the subtraction step S20.
以上のように、第５実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the specimen observation method of the fifth embodiment, it is possible to observe a clear and colorless specimen more clearly in the bright field observation state.
第６実施形態の標本観察方法は、結像光学系の合焦位置に対して標本の位置を複数回変化させ、変化させた標本の位置で、取得ステップと減算ステップが行われ、これにより、減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、生成した複数の電子画像を加算するものである。 In the specimen observation method of the sixth embodiment, the position of the specimen is changed a plurality of times with respect to the in-focus position of the imaging optical system, and the acquisition step and the subtraction step are performed at the changed specimen position. A plurality of electronic images after execution of the subtraction step are generated, and the generated plurality of electronic images are added.
第６実施形態の標本観察方法によれば、電子画像の生成の際に、低い周波数空間から高い空間周波数までの各々の周波数空間でコントラストが高くなっている画像が使われる。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 According to the sample observation method of the sixth embodiment, when generating an electronic image, an image having a high contrast in each frequency space from a low frequency space to a high spatial frequency is used. Therefore, the generated electronic image has a high contrast at any spatial frequency. As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
以上のように、第６実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the sample observation method of the sixth embodiment, it is possible to clearly observe a colorless and transparent sample in a bright field observation state.
第７実施形態の標本観察方法は、加算の前に、複数の電子画像の各々について、電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、抽出した部分を使って加算を行うものである。 In the sample observation method of the seventh embodiment, before addition, for each of a plurality of electronic images, a portion having the highest contrast is extracted from the electronic images, and addition is performed using the extracted portions.
第７実施形態の標本観察方法によれば、加算によって電子画像を生成する時に、各周波数空間でコントラストが最も高くなっている部分のみが使われている。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが非常に高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 According to the specimen observation method of the seventh embodiment, when an electronic image is generated by addition, only the portion having the highest contrast in each frequency space is used. Therefore, the generated electronic image has a very high contrast at any spatial frequency. As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
以上のように、第７実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the sample observation method of the seventh embodiment, a clear and colorless sample can be observed more clearly while in the bright field observation state.
第８実施形態の標本観察方法では、標本の位置の変化は、所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われるものである。 In the sample observation method of the eighth embodiment, the change in the position of the sample is performed in the state where the sign of the wavefront aberration amount in the predetermined state is the same.
上述のように、１次回折光における波面収差量が−λ／４になると、電子画像はダークコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。一方、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になると、電子画像はブライトコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。 As described above, when the amount of wavefront aberration in the first-order diffracted light becomes −λ / 4, the electronic image becomes a dark contrast image. That is, in the electronic image, the sample S is darker than the background. On the other hand, when the wavefront aberration amount in the first-order diffracted light becomes + λ / 4, the electronic image becomes a bright contrast image. That is, in the electronic image, the specimen S becomes brighter than the background.
そこで、加算によって電子画像を生成する時は、波面収差量の符号が同じ状態の画像を用いるのが良い。このようにすることで、生成した電子画像を、ダークコントラストのみに基づく画像、あるいは、ブライトコントラストのみに基づく画像にできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 Therefore, when generating an electronic image by addition, it is preferable to use an image having the same sign of the amount of wavefront aberration. In this way, the generated electronic image can be an image based only on dark contrast or an image based only on bright contrast. As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
以上のように、第８実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the specimen observation method of the eighth embodiment, a clear and colorless specimen can be observed more clearly while in the bright field observation state.
本実施形態の標本観察装置について説明する。本実施形態の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の実施形態の標本観察方法を行うことを特徴とする。 The sample observation device of this embodiment will be described. The sample observation device of this embodiment includes a light source, an illumination optical system, an imaging optical system, an imaging device, and an image processing device, and the illumination optical system irradiates the sample with illumination light from the light source. The imaging optical system is arranged so that light from the specimen is incident thereon and forms an optical image of the specimen, the imaging device is arranged at the position of the optical image, and the image processing apparatus is The specimen observation method according to the above-described embodiment is performed.
第１実施形態の標本観察装置の構成を図１５に示す。標本観察装置１は、正立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１は、本体部１０と、照明部２０と、観察部３０と、画像処理装置４０と、を備える。ここで、照明部２０と観察部３０とは、本体部１０に取り付けられている。また、本体部１０と画像処理装置４０とは、有線または無線で接続されている。 The configuration of the sample observation device of the first embodiment is shown in FIG. The sample observation apparatus 1 is an observation system using an upright microscope. The sample observation device 1 includes a main body unit 10, an illumination unit 20, an observation unit 30, and an image processing device 40. Here, the illumination unit 20 and the observation unit 30 are attached to the main body unit 10. The main body 10 and the image processing apparatus 40 are connected by wire or wirelessly.
なお、標本観察装置１は、表示装置５０を備えていても良い。表示装置５０は、有線または無線で画像処理装置４０に接続されている。 Note that the sample observation device 1 may include a display device 50. The display device 50 is connected to the image processing device 40 by wire or wireless.
本体部１０はステージ１１を有する。ステージ１１は保持部材である。このステージ１１には、標本Ｓが載置される。標本Ｓの移動はステージに取り付けられた操作ノブ（不図示）や焦準ノブ（不図示）で行われる。操作ノブの操作により、光軸と垂直な面内で、標本Ｓが移動する。焦準ノブの操作により、光軸に沿って標本Ｓが移動する。 The main body 10 has a stage 11. The stage 11 is a holding member. A specimen S is placed on the stage 11. The specimen S is moved by an operation knob (not shown) or a focusing knob (not shown) attached to the stage. By operating the operation knob, the sample S moves in a plane perpendicular to the optical axis. The sample S moves along the optical axis by operating the focusing knob.
照明部２０は、光源２１と照明光学系２２とを有する。照明光学系２２は、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４とを有する。なお、図１５に示すように、照明光学系２２は、レンズ２５と、ミラー２６と、レンズ２７とを備えていても良い。図１５では、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４はステージ１１に保持されている。照明光学系２２は、光源２１からステージ１１までの間の光路中に配置されている。 The illumination unit 20 includes a light source 21 and an illumination optical system 22. The illumination optical system 22 includes a condenser lens 23 and an aperture stop 24. As shown in FIG. 15, the illumination optical system 22 may include a lens 25, a mirror 26, and a lens 27. In FIG. 15, the condenser lens 23 and the aperture stop 24 are held on the stage 11. The illumination optical system 22 is disposed in the optical path from the light source 21 to the stage 11.
観察部３０は、結像光学系３１と撮像装置３２とを有する。なお、観察部３０は、レボルバ３３と観察鏡筒３４とを備えていても良い。結像光学系３１は、顕微鏡対物レンズ３５と撮像レンズ３６とを有する。なお、図１５に示すように、結像光学系３１は、結像レンズ３７とプリズム３８とを備えていても良い。結像光学系３１は、ステージ１１から撮像装置３２までの間の光路中に配置されている。撮像装置３２は撮像素子３９を有する。 The observation unit 30 includes an imaging optical system 31 and an imaging device 32. Note that the observation unit 30 may include a revolver 33 and an observation barrel 34. The imaging optical system 31 includes a microscope objective lens 35 and an imaging lens 36. As shown in FIG. 15, the imaging optical system 31 may include an imaging lens 37 and a prism 38. The imaging optical system 31 is disposed in the optical path from the stage 11 to the imaging device 32. The imaging device 32 has an imaging element 39.
標本観察装置１では、照明部２０は、ステージ１１を挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１では、標本Ｓは透過照明で照明される。 In the specimen observation device 1, the illumination unit 20 is disposed on the side facing the observation unit 30 with the stage 11 interposed therebetween. Therefore, in the sample observation device 1, the sample S is illuminated with transmitted illumination.
光源２１から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって、標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がない場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。 Illumination light is emitted from the light source 21. The illumination light passes through the illumination optical system 22 and reaches the stage 11. The specimen S is illuminated by this illumination light. The light from the sample S is collected by the imaging optical system 31, thereby forming an image (optical image) of the sample S at the condensing position. When there is no prism 38 in the optical path of the imaging optical system 31, an image of the sample S is picked up by the image pickup device 39 of the image pickup device 32.
撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を観察できる。 By imaging, the image of the sample S is converted into an electronic image (digital data). The electronic image is sent to the image processing device 40. Various processes are performed in the image processing apparatus 40. Here, when the sample observation device 1 includes the display device 50, the electronic image is displayed on the display device 50. The observer can observe the sample S (image of the sample S) by looking at the electronic image displayed on the display device 50.
撮像装置３２は、自動利得制御を行う回路を備えていても良い。このようにすると、撮像した電子画像の明るさ（コントラスト）を一定にできる。なお、自動利得制御を行う回路は、画像処理装置４０が備えていても良い。 The imaging device 32 may include a circuit that performs automatic gain control. In this way, the brightness (contrast) of the captured electronic image can be made constant. Note that the image processing device 40 may include a circuit that performs automatic gain control.
なお、結像光学系３１の光路中に、プリズム３８を挿入することもできる。このようにすることで、標本Ｓからの光は、観察鏡筒３４の接眼レンズに導かれる。観察者は、接眼レンズを介して、標本Ｓの光学像を観察できる。 Note that a prism 38 can be inserted into the optical path of the imaging optical system 31. In this way, the light from the specimen S is guided to the eyepiece lens of the observation barrel 34. The observer can observe the optical image of the specimen S through the eyepiece.
標本観察装置１を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第１実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１として、白色光源を用いる。 A procedure for carrying out the sample observation method of the embodiment using the sample observation device 1 will be described. Here, the sample observation method of the first embodiment will be described as an example. A white light source is used as the light source 21.
まず、観察者は、照明光学系２２と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。そして、観察者は、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させる。これにより、明視野観察の状態で、なお且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態になる。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。 First, the observer sets the illumination optical system 22 and the imaging optical system 31 to a bright field observation state. Subsequently, the observer places the sample S on the stage 11. Then, the observer moves the sample by eye measurement to a position that seems to be shifted from the in-focus position. As a result, in the bright field observation state, the position of the sample S and the in-focus position are different. Subsequently, the image processing apparatus 40 is operated. These operations may be performed in any order.
画像処理装置４０が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。 Since the image processing apparatus 40 is activated, an image of the specimen S can be taken, and thus the acquisition step S10 is executed. An electronic image is acquired by executing the acquisition step S10. The electronic image acquired in the acquisition step S10 is stored in a temporary storage unit (not shown) in the image processing device 40.
続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ1 2の値を小さくすることで、２Ａ1Ａ2cosψの値がＡ1 2＋Ａ2 2の値に対して相対的に大きくなる。減算ステップＳ２０の実行結果は、例えば、表示装置５０に表示される。 Subsequently, a subtraction step S20 is executed. In subtraction step S20, by reducing the value of A 1 2, the value of 2A 1 A 2 cos increases relative to A 1 2 + A 2 2 values. The execution result of the subtraction step S20 is displayed on the display device 50, for example.
上述のように、標本Ｓの位置の設定は目測で行われている。この場合、標本Ｓの位置と合焦位置とが大きく異なっている可能性が高いので、標本Ｓの像は大きくぼけている。そのため、標本Ｓの像が撮像されても、観察者は表示装置５０で電子画像を観察できない。 As described above, the position of the sample S is set by eye measurement. In this case, since there is a high possibility that the position of the sample S and the in-focus position are significantly different, the image of the sample S is greatly blurred. Therefore, even if an image of the sample S is captured, the observer cannot observe an electronic image on the display device 50.
そこで、観察者は焦準ノブを操作して、標本Ｓを合焦位置に向けて移動させる。標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５から大きく離れている場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５に近づく方向にステージ１１を移動させれば良い。一方、標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５に非常に近い場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５から離れる方向にステージ１１を移動させれば良い。 Therefore, the observer operates the focusing knob to move the sample S toward the in-focus position. When the position of the specimen S is far away from the microscope objective lens 35, the observer may move the stage 11 in a direction in which the specimen S approaches the microscope objective lens 35. On the other hand, when the position of the specimen S is very close to the microscope objective lens 35, the observer may move the stage 11 in a direction in which the specimen S moves away from the microscope objective lens 35.
標本Ｓを移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置５０で電子画像を見ながら標本Ｓを光軸に沿って移動させ、コントラストの良い電子画像が得られた時点で標本Ｓの移動を終わる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 While the sample S is moved, imaging is always performed. Therefore, the acquisition step S10 and the subtraction step S20 are always executed. Therefore, the observer moves the specimen S along the optical axis while viewing the electronic image on the display device 50, and ends the movement of the specimen S when an electronic image with good contrast is obtained. As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
なお、本体部１０は、モータ１２を備えていても良い。図１５では、モータ１２はステージ１１に接続されている。モータ１２によって、ステージ１１を光軸に沿って移動させることで、標本Ｓの移動ができる。 The main body 10 may include a motor 12. In FIG. 15, the motor 12 is connected to the stage 11. The sample S can be moved by moving the stage 11 along the optical axis by the motor 12.
以上のように、第１実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the sample observation device of the first embodiment, it is possible to observe a colorless and transparent sample while in a bright field observation state.
第２実施形態の標本観察装置の構成を図１６に示す。標本観察装置１’は、倒立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。 The configuration of the sample observation device of the second embodiment is shown in FIG. The sample observation apparatus 1 'is an observation system using an inverted microscope. The same members as those in the specimen observation apparatus 1 are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
標本観察装置１’では、標本観察装置１と同じように、照明部２０は、ステージ１１が挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１’においても、標本Ｓを透過照明で照明できる。ただし、標本観察装置１’は、照明部２０とは別に、照明部２０’も備えている。照明部２０’は、観察部３０と同じ側に配置されている。よって、標本観察装置１’では、照明部２０’を用いて標本Ｓを落射照明で照明できる。 In the specimen observation device 1 ′, as in the specimen observation device 1, the illumination unit 20 is disposed on the side facing the observation unit 30 with the stage 11 interposed therebetween. Therefore, the specimen S can be illuminated with transmitted illumination also in the specimen observation apparatus 1 '. However, the specimen observation apparatus 1 ′ includes an illumination unit 20 ′ in addition to the illumination unit 20. The illumination unit 20 ′ is disposed on the same side as the observation unit 30. Therefore, in the specimen observation apparatus 1 ′, the specimen S can be illuminated with epi-illumination using the illumination unit 20 ′.
照明部２０’は、光源２１’と照明光学系２２’とを有する。照明光学系２２’は、コンデンサレンズと開口絞りとを有する。ここで、照明光学系２２’では、顕微鏡対物レンズ３５を介して照明が行われる。よって、顕微鏡対物レンズ３５がコンデンサレンズに相当する。なお、開口絞りは図示を省略している。また、図１６に示すように、照明光学系２２’は、レンズ２５’と、ハーフミラーＨＭと、レンズ２７’とを備えていても良い。照明光学系２２’は、光源２１’からステージ１１までの間の光路中に配置されている。また、ハーフミラーＨＭと顕微鏡対物レンズ３３は、照明光学系２２’を構成すると共に、結像光学系３１を構成している。 The illumination unit 20 'includes a light source 21' and an illumination optical system 22 '. The illumination optical system 22 'has a condenser lens and an aperture stop. Here, in the illumination optical system 22 ′, illumination is performed via the microscope objective lens 35. Therefore, the microscope objective lens 35 corresponds to a condenser lens. The aperture stop is not shown. Further, as shown in FIG. 16, the illumination optical system 22 'may include a lens 25', a half mirror HM, and a lens 27 '. The illumination optical system 22 ′ is disposed in the optical path between the light source 21 ′ and the stage 11. Further, the half mirror HM and the microscope objective lens 33 constitute an illumination optical system 22 ′ and an imaging optical system 31.
結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。また、結像光学系３１の光路外にプリズム３８を移動させることで、標本Ｓの光を観察鏡筒３４の接眼レンズに導くことができる。この場合、標本Ｓの光は、ミラーＭによって観察鏡筒３４に向けて反射される。 When the prism 38 is in the optical path of the imaging optical system 31, an image of the sample S is picked up by the image pickup device 39 of the image pickup device 32. Further, by moving the prism 38 out of the optical path of the imaging optical system 31, the light of the sample S can be guided to the eyepiece lens of the observation barrel 34. In this case, the light of the sample S is reflected by the mirror M toward the observation barrel 34.
また、標本観察装置１’では、モータ１２がレボルバ３３に接続されている。よって、標本観察装置１’では、モータ１２によって、レボルバ３３が光軸に沿って移動する。レボルバ３３が光軸に沿って移動することで、顕微鏡対物レンズ３５（結像光学系３１）が光軸に沿って移動する。これにより、標本Ｓの位置と合焦位置とを異なる状態にできる。 In the specimen observation apparatus 1 ′, the motor 12 is connected to the revolver 33. Therefore, in the sample observation device 1 ′, the revolver 33 is moved along the optical axis by the motor 12. As the revolver 33 moves along the optical axis, the microscope objective lens 35 (imaging optical system 31) moves along the optical axis. Thereby, the position of the sample S and the focus position can be made different.
標本観察装置１’では、標本Ｓは透過照明か落射照明で照明できる。落射照明について説明する。落射照明では、光源２１’から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２’を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。 In the specimen observation apparatus 1 ′, the specimen S can be illuminated with transmitted illumination or epi-illumination. The epi-illumination will be described. In the epi-illumination, illumination light is emitted from the light source 21 '. The illumination light passes through the illumination optical system 22 ′ and reaches the stage 11. The specimen S is illuminated by this illumination light. The light from the sample S is collected by the imaging optical system 31, thereby forming an image (optical image) of the sample S at the condensing position. When the prism 38 is in the optical path of the imaging optical system 31, an image of the sample S is picked up by the image pickup device 39 of the image pickup device 32.
撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 By imaging, the image of the sample S is converted into an electronic image (digital data). The electronic image is sent to the image processing device 40. Various processes are performed in the image processing apparatus 40. Here, when the sample observation device 1 includes the display device 50, the electronic image is displayed on the display device 50. By observing the electronic image displayed on the display device 50, the observer can clearly observe the sample S (image of the sample S).
標本観察装置１’を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第２実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１’として、白色光源を用いる。 A procedure for carrying out the sample observation method of the embodiment using the sample observation device 1 ′ will be described. Here, the sample observation method of the second embodiment will be described as an example. A white light source is used as the light source 21 '.
まず、観察者は、照明光学系２２’と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。そして、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。 First, the observer sets the illumination optical system 22 'and the imaging optical system 31 to a bright field observation state. Then, the observer places the sample S on the stage 11. Subsequently, the image processing apparatus 40 is operated. These operations may be performed in any order.
観察者は、観察開始の情報を画像処理装置４０に入力する。ここで、画像処理装置４０に、合焦位置からのずれ量の情報が予め記憶されているとする。画像処理装置４０はレボルバ３３（顕微鏡対物レンズ３５）の現在の位置と合焦位置からのずれ量との情報に基づいて、移動量を算出する。算出した結果に基づいて、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。送信された信号に基づいて、モータ１２はレボルバ３３を移動させ、標本Ｓの位置が、合焦位置からずれた状態にする。このようにすることで、標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態にできる。 The observer inputs observation start information to the image processing device 40. Here, it is assumed that information on the amount of deviation from the in-focus position is stored in the image processing apparatus 40 in advance. The image processing device 40 calculates the amount of movement based on information on the current position of the revolver 33 (microscope objective lens 35) and the amount of deviation from the in-focus position. Based on the calculated result, the image processing apparatus 40 transmits a drive signal to the motor 12. Based on the transmitted signal, the motor 12 moves the revolver 33 so that the position of the sample S is shifted from the in-focus position. By doing so, the position of the sample S and the in-focus position can be made different.
明視野観察の状態、且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態になったところで、取得ステップＳ１０（１回目）が実行される。これにより、電子画像の取得が行われる。取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０の終了後、電子画像は画像処理装置４０内の記憶部１（不図示）に保存される。なお、記憶部１に保存した電子画像は、例えば、表示装置５０に表示される。 When the bright field observation state and the position of the sample S are different from the in-focus position, the acquisition step S10 (first time) is executed. Thereby, acquisition of an electronic image is performed. The acquired electronic image is stored in a temporary storage unit (not shown) in the image processing apparatus 40. Subsequently, a subtraction step S20 is executed. After completion of the subtraction step S20, the electronic image is stored in the storage unit 1 (not shown) in the image processing device 40. The electronic image stored in the storage unit 1 is displayed on the display device 50, for example.
減算ステップＳ２０の終了後、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。このときの駆動信号は、間隔Ｄ（標本Ｓと顕微鏡対物レンズ３５の間隔）を所定量だけ広げる信号である。この信号に従って、顕微鏡対物レンズ３５がステージ１１から遠ざかるように、モータ１２はレボルバ３３を移動させる。 After completion of the subtraction step S20, the image processing apparatus 40 transmits a drive signal to the motor 12. The drive signal at this time is a signal that widens the interval D (the interval between the specimen S and the microscope objective lens 35) by a predetermined amount. In accordance with this signal, the motor 12 moves the revolver 33 so that the microscope objective lens 35 moves away from the stage 11.
顕微鏡対物レンズ３５が所定量だけ移動すると、取得ステップＳ１０（２回目）と減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０の終了後、電子画像は画像処理装置４０内の記憶部２（不図示）に保存される。 When the microscope objective lens 35 is moved by a predetermined amount, an acquisition step S10 (second time) and a subtraction step S20 are executed. After completion of the subtraction step S20, the electronic image is stored in the storage unit 2 (not shown) in the image processing device 40.
続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる。判断結果がＹＥＳの場合、間隔Ｄを狭くする指定が行われる。一方、判断結果がＮＯ場合、間隔Ｄを広くする指定が行われると共に、記憶部２に保存していた電子画像が記憶部１に保存される。 Subsequently, the contrast of the electronic image in the storage unit 1 and the electronic image in the storage unit 2 is compared. When the determination result is YES, designation to narrow the interval D is performed. On the other hand, when the determination result is NO, designation to widen the interval D is performed, and the electronic image stored in the storage unit 2 is stored in the storage unit 1.
間隔Ｄに関する指定が終了すると、取得ステップＳ１０（３回目）と減算ステップＳ２０が実行される。続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる。そして、所定の条件を満足するまで、取得ステップＳ１０から比較ステップ３０−１までが繰り返し行われる。 When the designation regarding the interval D is completed, an acquisition step S10 (third time) and a subtraction step S20 are executed. Subsequently, the contrast of the electronic image in the storage unit 1 and the electronic image in the storage unit 2 is compared. Then, the acquisition step S10 to the comparison step 30-1 are repeatedly performed until a predetermined condition is satisfied.
所定の条件を満足すると、全ての処理が終了する。これにより、十分にコントラストの高い電子画像が自動的に得られる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 When the predetermined condition is satisfied, all the processes are finished. Thereby, an electronic image having a sufficiently high contrast is automatically obtained. As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
以上のように、第２実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the sample observation device of the second embodiment, it is possible to observe a clear and colorless sample more clearly in the bright field observation state.
第３実施形態の標本観察装置の構成を図１７に示す。図１７（ａ）は、観察装置の概略構成を示す図、図１７（ｂ）は、光学系の構成を示す図である。 The configuration of the sample observation device of the third embodiment is shown in FIG. FIG. 17A is a diagram illustrating a schematic configuration of the observation apparatus, and FIG. 17B is a diagram illustrating a configuration of the optical system.
標本観察装置３００は、電子内視鏡を用いた観察システムである。標本観察装置３００は、電子内視鏡１００と画像処理装置２００とから構成されている。電子内視鏡１００は、スコープ部１００ａと接続コード部１００ｂとを備えている。また、画像処理装置２００には、表示ユニット２０４が接続されている。 The sample observation apparatus 300 is an observation system using an electronic endoscope. The specimen observation apparatus 300 is composed of an electronic endoscope 100 and an image processing apparatus 200. The electronic endoscope 100 includes a scope unit 100a and a connection cord unit 100b. A display unit 204 is connected to the image processing apparatus 200.
スコープ部１００ａは、操作部１４０と挿入部１４１に大別される。挿入部１４１は、細長で患者の体腔内へ挿入可能になっている。また、挿入部１４１は、可撓性を有する部材で構成されている。観察者は、操作部１４０に設けられているアングルノブ等により、諸操作を行うことができる。 The scope unit 100 a is roughly divided into an operation unit 140 and an insertion unit 141. The insertion portion 141 is elongated and can be inserted into the body cavity of the patient. Moreover, the insertion part 141 is comprised with the member which has flexibility. The observer can perform various operations using an angle knob or the like provided in the operation unit 140.
また、操作部１４０からは、接続コード部１００ｂが延設されている。接続コード部１００ｂは、ユニバーサルコード１５０を備えている。ユニバーサルコード１５０は、コネクタ２５０を介して画像処理装置２００に接続されている。 Further, the connection cord portion 100b is extended from the operation portion 140. The connection cord part 100 b includes a universal cord 150. The universal cord 150 is connected to the image processing apparatus 200 via the connector 250.
ユニバーサルコード１５０は、各種の信号等の送受信に用いられる。各種の信号としては、電源電圧信号及びＣＣＤ駆動信号等がある。これらの信号は、電源装置やビデオプロセッサからスコープ部１００ａに送信される。また、各種の信号として映像信号がある。この信号は、スコープ部１００ａからビデオプロセッサに送信される。なお、画像処理装置２００内のビデオプロセッサには、図示しないＶＴＲデッキ、ビデオプリンタ等の周辺機器が接続可能である。ビデオプロセッサは、スコープ部１００ａからの映像信号に対して信号処理を施す。映像信号に基づいて、表示ユニット２０４の表示画面上に内視鏡画像が表示される。 The universal code 150 is used for transmission / reception of various signals. Examples of various signals include a power supply voltage signal and a CCD drive signal. These signals are transmitted from the power supply device or the video processor to the scope unit 100a. There are video signals as various signals. This signal is transmitted from the scope unit 100a to the video processor. Note that peripheral devices such as a VTR deck and a video printer (not shown) can be connected to the video processor in the image processing apparatus 200. The video processor performs signal processing on the video signal from the scope unit 100a. An endoscopic image is displayed on the display screen of the display unit 204 based on the video signal.
挿入部１４１の先端部１４２には、光学系が配置されている。ここで、電子内視鏡１００は拡大内視鏡である。そのため、光学系は、標本Ｓの拡大像を形成するようになっている。内視鏡における観察対象としては、体内の組織がある。以下の説明では、体内の組織も標本Ｓに含まれるものとする。 An optical system is disposed at the distal end portion 142 of the insertion portion 141. Here, the electronic endoscope 100 is a magnifying endoscope. Therefore, the optical system forms an enlarged image of the specimen S. An observation target in the endoscope includes a tissue in the body. In the following description, it is assumed that the tissue in the body is also included in the specimen S.
照明部は、光源と照明光学系とを有する。光源からの光は光ファイバ４０１から出射する。照明光学系は、レンズ４０２と、ミラー４０３と、レンズ４０４と、ハーフプリズム４０５と、対物レンズ４０６とを備える。観察部は、結像光学系と撮像装置とを有する。結像光学系は、対物レンズ４０６と、ハーフプリズム４０５と、結像レンズ４０７とを有する。撮像装置は撮像素子４０８を有する。この光学系では、標本Ｓは落射照明で照明される。 The illumination unit includes a light source and an illumination optical system. Light from the light source is emitted from the optical fiber 401. The illumination optical system includes a lens 402, a mirror 403, a lens 404, a half prism 405, and an objective lens 406. The observation unit includes an imaging optical system and an imaging device. The imaging optical system includes an objective lens 406, a half prism 405, and an imaging lens 407. The imaging device has an imaging element 408. In this optical system, the specimen S is illuminated with epi-illumination.
標本観察装置３００を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第３実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源として、白色光源を用いる。 A procedure for carrying out the sample observation method of the embodiment using the sample observation device 300 will be described. Here, the sample observation method of the third embodiment will be described as an example. A white light source is used as the light source.
まず、観察者は、照明光学系と結像光学系を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、合焦位置からずれた位置だと思われる位置まで、目測で挿入部１４１を移動させる。そして、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。 First, the observer sets the illumination optical system and the imaging optical system to a bright field observation state. Subsequently, the observer moves the insertion unit 141 by eye measurement to a position that is considered to be a position shifted from the in-focus position. Then, the image processing device 40 is activated. These operations may be performed in any order.
画像処理装置４０が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。 Since the image processing apparatus 40 is activated, an image of the specimen S can be taken, and thus the acquisition step S10 is executed. An electronic image is acquired by executing the acquisition step S10. The electronic image acquired in the acquisition step S10 is stored in a temporary storage unit (not shown) in the image processing device 40.
続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ1 2の値を小さくすることで、２Ａ1Ａ2cosψの値がＡ1 2＋Ａ2 2の値に対して相対的に大きくなる。 Subsequently, a subtraction step S20 is executed. In subtraction step S20, by reducing the value of A 1 2, the value of 2A 1 A 2 cos increases relative to A 1 2 + A 2 2 values.
減算ステップＳ２０の終了後、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ1Ａ2cosψの値を大きくする（増幅する）。これにより、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値が相対的により大きくなる。増幅ステップＳ３０−２の実行結果は、例えば、表示装置５０に表示される。 After completion of the subtraction step S20, an amplification step S30-2 is executed. In the amplification step S30-2, the value of 2A 1 A 2 cos ψ is increased (amplified). As a result, the value of 2A 1 A 2 cos ψ becomes relatively larger than the value of A 1 2 + A 2 2 . The execution result of the amplification step S30-2 is displayed on the display device 50, for example.
挿入部１４１を移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０、減算ステップＳ２０及び増幅ステップＳ３０−２も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置５０で電子画像を見ながら挿入部１４１を移動させ、コントラストの良い電子画像が得られた時点で挿入部１４１の移動を終わる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 Imaging is always performed while the insertion unit 141 is moved. Therefore, the acquisition step S10, the subtraction step S20, and the amplification step S30-2 are always executed. Therefore, the observer moves the insertion unit 141 while viewing the electronic image on the display device 50, and ends the movement of the insertion unit 141 when an electronic image with good contrast is obtained. As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
なお、対物レンズ４０６、結像レンズ４０７及び撮像素子４０８の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させても良い。これらの移動には、例えば、マイクロアクチュエータ（不図示）やボイスコイルモータ（不図示）を用いれば良い。このようにすれば、ずれ量ΔＺの調整を細かにできる。よって、挿入部１４１の移動は、ある程度のコントラストを持つ電子画像が取得できたところまでで済む。 Note that at least one of the objective lens 406, the imaging lens 407, and the imaging element 408 may be moved along the optical axis. For these movements, for example, a microactuator (not shown) or a voice coil motor (not shown) may be used. In this way, it is possible to finely adjust the shift amount ΔZ. Therefore, the insertion unit 141 can be moved only until an electronic image having a certain degree of contrast can be acquired.
以上のように、第３実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 As described above, according to the sample observation device of the third embodiment, it is possible to observe a clear and colorless sample more clearly in the bright field observation state.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
０．０１＜ＮＡill／ＮＡob＜１ （１）
ここで、
ＮＡillは、照明光学系の標本側の開口数、
ＮＡobは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
In the sample observation device of each of the embodiments described above, it is preferable that the following conditional expression (1) is satisfied.
0.01 <NA ill / NA ob <1 (1)
here,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
条件式（１）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 By satisfying conditional expression (1), a clear and colorless specimen can be observed more clearly while in the bright field observation state.
条件式（１）の下限値を下回ると、照明光学系の標本側の開口数が小さくなりすぎる。この場合、照明光の光量不足や、照明むらが大きくなる。また、電子画像において、カバーガラスの汚れやゴミが目立つようになる。 If the lower limit of conditional expression (1) is not reached, the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system becomes too small. In this case, the amount of illumination light is insufficient and uneven illumination is increased. In addition, dirt and dust on the cover glass become noticeable in the electronic image.
条件式（１）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めから入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。この点について、図１８を用いて説明する。 If the upper limit of conditional expression (1) is exceeded, the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system becomes too large. In this case, the illumination light incident obliquely with respect to the optical axis increases. This makes it difficult to obtain an electronic image with good contrast. This point will be described with reference to FIG.
図１８は、照明光の入射方向と回折光の回折方向の関係、及び波面収差量を示す図であって、図１８（ａ）は、照明光の入射方向が光軸と平行である場合、図１８（ｂ）は照明光の入射方向と光軸との角度が小さい場合、図１８（ｃ）は照明光の入射方向と光軸との角度が大きい場合を示す図である。 FIG. 18 is a diagram showing the relationship between the incident direction of illumination light and the diffraction direction of diffracted light, and the amount of wavefront aberration. FIG. 18A shows the case where the incident direction of illumination light is parallel to the optical axis. FIG. 18B shows a case where the angle between the incident direction of the illumination light and the optical axis is small, and FIG. 18C shows a case where the angle between the incident direction of the illumination light and the optical axis is large.
標本Ｓから生じる回折光は、照明光の標本Ｓへの入射方向に依存する。図１８（ａ）に示すように、照明光Ｌillの入射方向が光軸と平行である場合、０次回折光Ｌ0は、光軸上を進んで瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ+1は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。また、−１次回折光Ｌ-1は光軸に対して−θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。 Diffracted light generated from the specimen S depends on the incident direction of the illumination light to the specimen S. As shown in FIG. 18A, when the incident direction of the illumination light L ill is parallel to the optical axis, the 0th-order diffracted light L 0 travels on the optical axis and reaches the pupil position. On the other hand, the + 1st order diffracted light L + 1 is incident on the imaging optical system at an angle of + θ with respect to the optical axis, and reaches the pupil position. Further, the −1st order diffracted light L −1 is incident on the imaging optical system at an angle of −θ with respect to the optical axis, and reaches the pupil position.
上述のように、標本Ｓの位置と合焦位置がずれていると波面収差が生じる。この波面収差は、瞳面の中心に対して対称に発生する。そのため、図１８（ａ）の場合、０次回折光Ｌ0に加わる波面収差量は０であるが、＋１次回折光Ｌ+1と−１次回折光Ｌ-1には、所定量の波面収差が加わることになる。 As described above, wavefront aberration occurs when the position of the sample S is out of focus. This wavefront aberration occurs symmetrically with respect to the center of the pupil plane. Therefore, in the case of FIG. 18 (a), the amount of wavefront aberration applied to the 0th-order diffracted light L0 is 0, but a predetermined amount of wavefront aberration is applied to the + 1st-order diffracted light L + 1 and -1st-order diffracted light L- 1. It will be.
ここで、＋１次回折光Ｌ+1の回折方向と−１次回折光Ｌ-1の回折方向は、光軸を挟んで対称になっており、波面収差も、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、＋１次回折光Ｌ+1に加わる波面収差量と、−１次回折光Ｌ-1に加わる波面収差量は同じになる。 Here, the diffracting direction of the + 1st order diffracted light L + 1 and the diffracting direction of the −1st order diffracted light L− 1 are symmetric with respect to the optical axis, and the wavefront aberration is also relative to the center (optical axis) of the pupil plane. Are occurring symmetrically. Therefore, the wavefront aberration amount applied to the + 1-order diffracted light L +1, wavefront aberration amount applied to the -1st-order diffracted light L -1 is the same.
図１８（ａ）では、０次回折光Ｌ0には光軸上を進むので、０次回折光Ｌ0に加わる波面収差量は０である。＋１次回折光Ｌ+1と−１次回折光Ｌ-1には、共に−λ／４の波面収差量が加わる。 In FIG. 18A, since the 0th-order diffracted light L 0 travels on the optical axis, the amount of wavefront aberration added to the 0th-order diffracted light L 0 is zero. A wavefront aberration amount of −λ / 4 is added to both the + 1st order diffracted light L + 1 and the −1st order diffracted light L− 1 .
その結果、０次回折光Ｌ0の位相に変化は生じない。一方、＋１次回折光Ｌ+1の位相と−１次回折光Ｌ-1の位相は、もともとの遅れπ／２に対してπ／２が更に加わるので、遅れは合計でπになる。すると、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。また、コントラストは、いわゆるダークコントラストになる。−１次回折光Ｌ-1については、＋１次回折光Ｌ+1と同じである。 As a result, no change occurs in the phase of the 0th-order diffracted light L0. On the other hand, the phase of the + 1st-order diffracted light L + 1 and the phase of the -1st-order diffracted light L- 1 are further added by π / 2 with respect to the original delay π / 2, so that the total delay is π. Then, ψ = 0 − (− π) = π. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ ≠ 0, phase information is obtained as contrast information. Further, the contrast becomes a so-called dark contrast. The −1st order diffracted light L −1 is the same as the + 1st order diffracted light L +1 .
次に、図１８（ｂ）に示すように、照明光Ｌillの入射方向と光軸との角度が小さい場合（角度がθの場合）、０次回折光Ｌ0は、照明光Ｌillの入射方向と同じ方向に進む。よって、０次回折光Ｌ0は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ+1は、所定の方向よりも更に外側（光軸から離れる方向）に回折される。よって、＋１次回折光Ｌ+1は、光軸に対して＋２θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。また、−１次回折光Ｌ-1も回折されるが、−１次回折光Ｌ-1は光軸上を進んで瞳位置に到達する。 Next, as shown in FIG. 18B, when the angle between the incident direction of the illumination light L ill and the optical axis is small (when the angle is θ), the 0th-order diffracted light L 0 is incident on the illumination light L ill . Proceed in the same direction as the direction. Therefore, the 0th-order diffracted light L 0 enters the imaging optical system at an angle of + θ with respect to the optical axis and reaches the pupil position. On the other hand, the + 1st order diffracted light L + 1 is diffracted further outward (in a direction away from the optical axis) than a predetermined direction. Thus, the + 1st-order diffracted light L +1, and at an angle with respect to the optical axis + 2 [Theta] enters the imaging optical system and reaches the pupil position. Further, although the −1st order diffracted light L −1 is also diffracted, the −1st order diffracted light L −1 travels on the optical axis and reaches the pupil position.
ここで、＋１次回折光Ｌ+1の回折方向と−１次回折光Ｌ-1の回折方向は、光軸を挟んで非対称になっているが、波面収差は、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、０次回折光Ｌ0に加わる波面収差量、＋１次回折光Ｌ+1に加わる波面収差量及び−１次回折光Ｌ-1に加わる波面収差量は、それぞれ異なる。 Here, the diffracting direction of the + 1st order diffracted light L + 1 and the diffracting direction of the −1st order diffracted light L− 1 are asymmetric with respect to the optical axis, but the wavefront aberration is at the center (optical axis) of the pupil plane. It occurs symmetrically. Therefore, zero-order wavefront aberration amount applied to the diffracted light L 0, + 1 wavefront aberration amount is applied to the wavefront aberration amount and -1 order diffracted light L -1 applied to the order diffracted light L +1, different from each other.
図１８（ｂ）では、０次回折光Ｌ0には−λ／４の波面収差量が加わり、＋１次回折光Ｌ+1には−３λ／４の波面収差量が加わる。一方、−１次回折光Ｌ-1は光軸上を進むので、−１次回折光Ｌ-1に加わる波面収差量は０になる。 In FIG. 18 (b), 0-order the diffracted light L 0 applied wavefront aberration amount of -λ / 4, + 1 wavefront aberration amount of -3λ / 4 is applied to the order diffracted light L +1. On the other hand, since the −1st order diffracted light L −1 travels on the optical axis, the amount of wavefront aberration applied to the −1st order diffracted light L −1 becomes zero.
その結果、０次回折光Ｌ0の位相はπ／２遅れる。一方、＋１次回折光Ｌ+1の位相は、もともとの遅れπ／２に対して３π／２が更に加わるので、遅れは合計で２πになる。すると、ψ＝−π／２−（−２π）＝３π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。一方、−１次回折光Ｌ+1については、加わる波面収差量が０なので、−１次回折光Ｌ+1の位相は、もともとの遅れπ／２だけになる。すると、ψ＝−λ／２−（−λ／２）＝０となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。また、コントラストは、いわゆるブライトコントラストになる。 As a result, the phase of the 0th-order diffracted light L 0 is delayed by π / 2. Meanwhile, the phase of the + 1-order diffracted light L +1, since the original 3 [pi] / 2 is further added relative delay [pi / 2, delay becomes 2π in total. Then, ψ = −π / 2 − (− 2π) = 3π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information. On the other hand, with respect to the −1st order diffracted light L + 1 , since the amount of wavefront aberration applied is 0, the phase of the −1st order diffracted light L + 1 is only the original delay π / 2. Then, ψ = −λ / 2 − (− λ / 2) = 0. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ ≠ 0, phase information is obtained as contrast information. Further, the contrast is a so-called bright contrast.
次に、図１８（ｃ）に示すように、照明光Ｌillの入射方向と光軸との角度が大きい場合（角度が２θの場合）、０次回折光Ｌ0は、照明光Ｌillの入射方向と同じ方向に進む。よって、０次回折光Ｌ0は光軸に対して＋２θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ+1は、結像光学系の有効口径よりも外側に回折される。よって、＋１次回折光Ｌ+1は瞳位置に到達しない。また、−１次回折光Ｌ-1は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。 Then, (when the angle of 2 [Theta]) as shown in FIG. 18 (c), when the angle is large between incident direction and the optical axis of the illumination light L ill, 0-order diffracted light L 0 is the incident illumination light L ill Proceed in the same direction as the direction. Therefore, the 0th-order diffracted light L 0 enters the imaging optical system at an angle of + 2θ with respect to the optical axis and reaches the pupil position. On the other hand, the + 1st order diffracted light L + 1 is diffracted outside the effective aperture of the imaging optical system. Therefore, + 1-order diffracted light L +1 does not reach the pupil position. Further, the −1st order diffracted light L −1 is incident on the imaging optical system at an angle of + θ with respect to the optical axis, and reaches the pupil position.
ここで、＋１次回折光Ｌ+1の回折方向と−１次回折光Ｌ-1の回折方向は、光軸を挟んで非対称になっているが、波面収差は、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、０次回折光Ｌ0に加わる生じる波面収差量と、−１次回折光Ｌ-1に加わる生じる波面収差量は異なる。 Here, the diffracting direction of the + 1st order diffracted light L + 1 and the diffracting direction of the −1st order diffracted light L− 1 are asymmetric with respect to the optical axis, but the wavefront aberration is at the center (optical axis) of the pupil plane. It occurs symmetrically. Therefore, 0 and wavefront aberration amount generated join order diffracted light L 0, the wavefront aberration amount generated applied to the -1st-order diffracted light L -1 is different.
図１８（ｃ）では、０次回折光Ｌ0には−３λ／４の波面収差量が加わり、−１次回折光Ｌ-1には、−λ／４の波面収差量が加わる。 In FIG. 18C, a wavefront aberration amount of −3λ / 4 is added to the 0th-order diffracted light L 0, and a wavefront aberration amount of −λ / 4 is added to the −1st-order diffracted light L− 1 .
その結果、０次回折光Ｌ0の位相は３π／２遅れる。一方、−１次回折光Ｌ+1の位相は、もともとの遅れπ／２に対して更にπ／２が加わるので、遅れは合計でπになる。すると、ψ＝−３π／２−（−π）＝−π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。 As a result, the phase of the 0th-order diffracted light L 0 is delayed by 3π / 2. On the other hand, since the phase of the −1st order diffracted light L + 1 is further added with π / 2 with respect to the original delay π / 2, the delay becomes π in total. Then, ψ = −3π / 2 − (− π) = − π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information.
照明光学系の標本側の開口数が小さい場合、照明光Ｌillの入射方向は光軸と平行な方向になる。すなわち、図１８（ａ）に示す状態になる。よって、光軸上の点の像は、いわゆるダークコントラストの状態で観察できる。ところが、照明光学系の標本側の開口数が大きくなるにしたがって、図１８（ｂ）や図１８（ｃ）に示すように、入射方向が光軸と交差する照明光Ｌillが加わってくる。 When the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system is small, the incident direction of the illumination light Lill is parallel to the optical axis. That is, the state shown in FIG. Therefore, an image of a point on the optical axis can be observed in a so-called dark contrast state. However, as the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system increases, illumination light Lill whose incident direction intersects the optical axis is added, as shown in FIGS. 18B and 18C .
そうすると、光軸上の点の像は、ダークコントラストの像に、ブライトコントラストの像が加わったものになる。そのため、像のコントラストが低下することになる。このように、照明光学系の標本側の開口数が大きくなると、コントラストの低下につながる光が増えてしまうことになる。 Then, the image of the point on the optical axis is obtained by adding a bright contrast image to a dark contrast image. As a result, the contrast of the image is lowered. As described above, when the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system increases, the light that leads to a decrease in contrast increases.
なお、条件式（１）に代えて、下記の条件式（１’）を満足すると良い。
０．０２＜ＮＡill／ＮＡob＜０．９ （１’）
さらに、条件式（１）に代えて、以下の条件式（１”）を満足するとなお良い。
０．０３＜ＮＡill／ＮＡob＜０．８ （１”）
In addition, it is preferable to satisfy the following conditional expression (1 ′) instead of conditional expression (1).
0.02 <NA ill / NA ob <0.9 (1 ′)
Furthermore, it is better to satisfy the following conditional expression (1 ″) instead of conditional expression (1).
0.03 <NA ill / NA ob <0.8 (1 ”)
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（２）を満足することが好ましい。
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡob 2＜３０μｍ （２）
ここで、
ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
ＮＡobは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
In the sample observation device of each of the embodiments described above, it is preferable that the following conditional expression (2) is satisfied.
0.1 μm <ΔZ × NA ob 2 <30 μm (2)
here,
ΔZ is the difference between the focusing position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
条件式（２）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 By satisfying conditional expression (2), a clear and colorless sample can be observed more clearly while in the bright field observation state.
条件式（２）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。 If the lower limit of conditional expression (2) is not reached, the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the sample becomes too small. In this case, the amount of wavefront aberration added to the diffracted light is reduced. In particular, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light is smaller than λ / 4. This makes it difficult to obtain an electronic image with good contrast.
条件式（２）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。 If the upper limit value of conditional expression (2) is exceeded, the difference between the focusing position of the imaging optical system and the position of the sample becomes too large. In this case, the amount of wavefront aberration added to the diffracted light increases. In particular, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light becomes larger than λ / 4. In addition, the optical image is greatly blurred. As a result, it is difficult to obtain an electronic image with high resolution.
なお、条件式（２）に代えて、下記の条件式（２’）を満足すると良い。
０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡob 2＜２５μｍ （２’）
さらに、条件式（２）に代えて、以下の条件式（２”）を満足するとなお良い。
０．３μｍ＜ΔＺ×ＮＡob 2＜２０μｍ （２”）
It should be noted that the following conditional expression (2 ′) is preferably satisfied instead of conditional expression (2).
0.2 μm <ΔZ × NA ob 2 <25 μm (2 ′)
Furthermore, it is better to satisfy the following conditional expression (2 ″) instead of conditional expression (2).
0.3 μm <ΔZ × NA ob 2 <20 μm (2 ″)
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（３）を満足することが好ましい。
０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡill＜１０μｍ （３）
ここで、
ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
ＮＡillは、照明光学系の標本側の開口数、
である。
In the sample observation device of each of the embodiments described above, it is preferable that the following conditional expression (3) is satisfied.
0.05 μm <ΔZ × NA ill <10 μm (3)
here,
ΔZ is the difference between the focusing position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
It is.
条件式（３）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。 By satisfying conditional expression (3), a clear and colorless sample can be observed more clearly while in the bright field observation state.
条件式（３）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。 If the lower limit value of conditional expression (3) is not reached, the difference between the focusing position of the imaging optical system and the position of the sample becomes too small. In this case, the amount of wavefront aberration added to the diffracted light is reduced. In particular, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light is smaller than λ / 4. This makes it difficult to obtain an electronic image with good contrast.
条件式（３）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。また、条件式（３）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めに入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。 If the upper limit value of conditional expression (3) is exceeded, the difference between the focusing position of the imaging optical system and the position of the sample becomes too large. In this case, the amount of wavefront aberration added to the diffracted light increases. In particular, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light becomes larger than λ / 4. In addition, the optical image is greatly blurred. As a result, it is difficult to obtain an electronic image with high resolution. If the upper limit of conditional expression (3) is exceeded, the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system becomes too large. In this case, the illumination light incident obliquely with respect to the optical axis increases. This makes it difficult to obtain an electronic image with good contrast.
なお、条件式（３）に代えて、下記の条件式（３’）を満足すると良い。
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡill＜８μｍ （３’）
さらに、条件式（３）に代えて、以下の条件式（３”）を満足するとなお良い。
０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡill＜６μｍ （３”）
In addition, it is preferable to satisfy the following conditional expression (3 ′) instead of conditional expression (3).
0.1 μm <ΔZ × NA ill <8 μm (3 ′)
Furthermore, it is better to satisfy the following conditional expression (3 ″) instead of conditional expression (3).
0.2 μm <ΔZ × NA ill <6 μm (3 ″)
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、コンデンサレンズと開口絞りを有することが好ましい。 In the specimen observation devices of the above-described embodiments, it is preferable that the illumination optical system has a condenser lens and an aperture stop.
このようにすることで、対物レンズの光学性能にあわせて、照明光学系の標本側の開口数を適切な値に設定できる。そのため、コントラストの良い電子画像が得られる。 In this way, the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system can be set to an appropriate value in accordance with the optical performance of the objective lens. Therefore, an electronic image with good contrast can be obtained.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、ケーラー照明光学系であることが好ましい。 In the specimen observation devices of the above-described embodiments, the illumination optical system is preferably a Koehler illumination optical system.
このようにすることで、標本をむら無く照明できる。そのため、上述の標本観察方法における処理（画像処理）を簡素にできる。 In this way, the specimen can be illuminated evenly. Therefore, the processing (image processing) in the specimen observation method described above can be simplified.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、テレセントリック光学系であることが好ましい。 In the specimen observation devices of the above-described embodiments, the illumination optical system is preferably a telecentric optical system.
このようにすることで、観察範囲の全域において、コントラストの良い電子画像が得られる。 In this way, an electronic image with good contrast can be obtained over the entire observation range.
図１９は、照明光学系がテレセントリック光学系である様子を示す図である。照明光学系は、コンデンサレンズ６２と、開口絞り６０とを有する。コンデンサレンズ６２の前側焦点面６１に、開口絞り６０が配置されている。そのため、開口絞り６０の中心から出射した軸上光束（実線で示す線）はコンデンサレンズ６２で平行光束に変換され、標本の位置６３に到達する。一方、開口絞り６０の周辺から出射した軸外光束（破線で示す線）もコンデンサレンズ６２で平行光束に変換され、標本の位置６３に到達する。ここで、照明光学系がテレセントリック光学系になっているので、軸外光束では、その主光線が光軸と平行になるようにコンデンサレンズに入射する。 FIG. 19 is a diagram illustrating a state in which the illumination optical system is a telecentric optical system. The illumination optical system includes a condenser lens 62 and an aperture stop 60. An aperture stop 60 is disposed on the front focal plane 61 of the condenser lens 62. Therefore, the axial light beam (line indicated by the solid line) emitted from the center of the aperture stop 60 is converted into a parallel light beam by the condenser lens 62 and reaches the position 63 of the sample. On the other hand, an off-axis light beam (line indicated by a broken line) emitted from the periphery of the aperture stop 60 is also converted into a parallel light beam by the condenser lens 62 and reaches the position 63 of the sample. Here, since the illumination optical system is a telecentric optical system, the principal ray of the off-axis light beam enters the condenser lens so as to be parallel to the optical axis.
図１９に示すように、開口絞り６０の中心を通る光束は光軸と平行になって標本の位置に到達する。標本は光軸と平行光束で照明され、標本からは０次回折光と１次回折光が出てくる。このうち、０次回折光は光軸と平行に進む。一方、＋１次回折光と−１次回折光は光軸から離れる方向に進む。 As shown in FIG. 19, the light beam passing through the center of the aperture stop 60 is parallel to the optical axis and reaches the position of the sample. The specimen is illuminated with a light beam parallel to the optical axis, and zero-order diffracted light and first-order diffracted light are emitted from the specimen. Of these, the 0th-order diffracted light travels parallel to the optical axis. On the other hand, the + 1st order diffracted light and the −1st order diffracted light travel in directions away from the optical axis.
また、＋１次回折光と−１次回折光は、光軸に対して対称になって進む。この場合、＋１次回折光に加わる波面収差量と−１次回折光に加わる波面収差量は、共に等しくなる。０次回折光と＋１次回折光が弱め合えば、０次回折光と−１次回折光も弱め合う。逆に、０次回折光と＋１次回折光が強め合えば、０次回折光と−１次回折光も強め合う。そのため、観察範囲の全域において、コントラストの良い電子画像が得られる。 Further, the + 1st order diffracted light and the −1st order diffracted light travel symmetrically with respect to the optical axis. In this case, the amount of wavefront aberration added to the + 1st order diffracted light and the amount of wavefront aberration added to the −1st order diffracted light are both equal. If the 0th order diffracted light and the + 1st order diffracted light are weakened, the 0th order diffracted light and the −1st order diffracted light are also weakened. Conversely, if the 0th order diffracted light and the + 1st order diffracted light are intensified, the 0th order diffracted light and the −1st order diffracted light are also intensified. Therefore, an electronic image with good contrast can be obtained over the entire observation range.
また、上述の各実施形態の標本観察装置は、波長選択手段を有することが好ましい。あるいは、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光が単色光であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the sample observation device of each of the above-described embodiments has a wavelength selection unit. Alternatively, in the sample observation device of each of the above-described embodiments, it is preferable that the illumination light is monochromatic light.
このようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。特に、軸上色収差の発生量が大きい結像光学系を用いても、コントラストの良い電子画像が得られる。 By doing so, an electronic image with good contrast can be obtained. In particular, even when an imaging optical system that generates a large amount of axial chromatic aberration is used, an electronic image with good contrast can be obtained.
結像光学系の収差は少ないほど良い。本実施形態の標本観察装置（標本観察方法）では、特に、軸上色収差について良好に補正されていることが望ましい。軸上色収差色の発生量が大きいと、波長によって波面収差の発生量が異なってくる。例えば、白色光で標本を照明した場合、１次回折光に加わる波面収差量が、ある波長の光では１／４λで、別の波長の光では−１／４λになる可能性がある。 The smaller the aberration of the imaging optical system, the better. In the sample observation apparatus (specimen observation method) of the present embodiment, it is desirable that axial chromatic aberration be corrected particularly well. When the amount of axial chromatic aberration color generation is large, the amount of wavefront aberration generation varies depending on the wavelength. For example, when a sample is illuminated with white light, the amount of wavefront aberration added to the first-order diffracted light may be 1 / 4λ for light of a certain wavelength and −1 / 4λ for light of another wavelength.
この場合、ある波長の光では、ダークコントラストの像になるのに対して、別の波長の光では、ブライトコントラストの像になる。そのため、白色光全体でみると、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。 In this case, a light with a certain wavelength results in a dark contrast image, whereas a light with a different wavelength results in a bright contrast image. For this reason, it is difficult to obtain an electronic image with good contrast when viewed with white light as a whole.
そこで、標本観察装置が波長選択手段を有すると、コントラストの低下を抑制できる。標本観察装置が波長選択手段を持つことで、波長による波面収差の発生量のばらつきが無くなる。そのため、コントラストの良い電子画像が得られる。特に、軸上色収差が大きい結像光学系を用いる場合、波長選択手段を有すると、コントラストの良い電子画像が得られる。照明光が単色光の場合も同様である。 Therefore, when the sample observation device has wavelength selection means, it is possible to suppress a decrease in contrast. Since the sample observation apparatus has the wavelength selection means, the variation in the amount of wavefront aberration generated due to the wavelength is eliminated. Therefore, an electronic image with good contrast can be obtained. In particular, when an imaging optical system having a large axial chromatic aberration is used, an electronic image with good contrast can be obtained by having wavelength selection means. The same applies when the illumination light is monochromatic light.
上述のように、本実施形態における明視野観察の状態では、標本が無色透明な標本の場合、照明光と結像光は共通の波長の光を有していれば良い。そこで、標本観察装置１（図１５）では、照明光学系２０の光路中に、光学フィルタＦＬ（波長選択手段）が配置できるようになっている。また、標本観察装置１’（図１６）では、結像光学系３１の光路中に、光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’を交互に配置できるようになっている。なお、標本観察装置３００（図１７）では、光学フィルタＦＬは図示してないが、標本観察装置１や標本観察装置１’と同様にできる。 As described above, in the bright field observation state according to the present embodiment, when the sample is a colorless and transparent sample, the illumination light and the imaging light may have light of a common wavelength. Therefore, in the specimen observation apparatus 1 (FIG. 15), an optical filter FL (wavelength selection means) can be arranged in the optical path of the illumination optical system 20. In the specimen observation apparatus 1 ′ (FIG. 16), the optical filter FL and the optical filter FL ′ can be alternately arranged in the optical path of the imaging optical system 31. In the specimen observation apparatus 300 (FIG. 17), the optical filter FL is not shown, but can be the same as the specimen observation apparatus 1 and the specimen observation apparatus 1 '.
なお、光学フィルタＦＬは、移動可能にしておいても良い。また、光学フィルタＦＬの数は１枚に限られない。分光透過率特性がそれぞれ異なる光学フィルタＦＬを複数枚用意しておき、１枚又は複数枚を光路中に配置するようにしても良い。 The optical filter FL may be movable. Further, the number of optical filters FL is not limited to one. A plurality of optical filters FL having different spectral transmittance characteristics may be prepared, and one or a plurality of optical filters may be arranged in the optical path.
また、光学フィルタＦＬを配置する場所は、照明光学系と結像光学系のどちらか一方、又はその両方にすれば良い。また、撮像装置に光学フィルタＦＬを配置しても良い。撮像素子が光学フィルタを有している場合は、この光学フィルタを用いれば良い。 The place where the optical filter FL is disposed may be either the illumination optical system or the imaging optical system, or both. Further, the optical filter FL may be disposed in the imaging device. If the image sensor has an optical filter, this optical filter may be used.
また、光学フィルタＦＬが、長波長の光を透過させる特性を有する場合、この光学フィルタＦＬを用いれば、細胞に与えるダメージを低減できる。一方、光学フィルタＦＬが、短波長の光を透過させる特性を有する場合、この光学フィルタＦＬを用いれば、解像度の高い電子画像が得られる。 In addition, when the optical filter FL has a characteristic of transmitting light having a long wavelength, damage to cells can be reduced by using the optical filter FL. On the other hand, when the optical filter FL has a characteristic of transmitting light with a short wavelength, an electronic image with high resolution can be obtained by using the optical filter FL.
また、光源自体を、波長帯域が狭い光を発するものにしても良い。このようにすれば、光学系の光路中に光学フィルタを配置しなくても良くなる。また、光源は複数用いても良い。 Further, the light source itself may emit light having a narrow wavelength band. In this way, it is not necessary to arrange an optical filter in the optical path of the optical system. A plurality of light sources may be used.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系はテレセントリック光学系であることが好ましい。 In the sample observation devices of the above-described embodiments, the imaging optical system is preferably a telecentric optical system.
このようにすることで、観察範囲のどこにおいても、０次回折光の角度を略同じにできる。そのため、観察範囲のどこにおいても、コントラストの良い電子画像が得られる。 In this way, the angle of the 0th-order diffracted light can be made substantially the same anywhere in the observation range. Therefore, an electronic image with good contrast can be obtained anywhere in the observation range.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系は開口絞りを有することが好ましい。また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系は対物レンズを有し、開口絞りは対物レンズに設けられていることが好ましい。 In the sample observation devices of the above-described embodiments, the imaging optical system preferably has an aperture stop. In the specimen observation devices of the above-described embodiments, it is preferable that the imaging optical system has an objective lens and the aperture stop is provided in the objective lens.
このようにすることで、標本に応じてコントラストの良い画像が得られる。 By doing in this way, an image with good contrast can be obtained according to the specimen.
顕微鏡対物レンズを用いて説明する。図２０は、開口数（ＮＡ）がそれぞれ異なる２つの顕微鏡対物レンズにおける波面収差の様子を示す図である。図２０において、実線で示す曲線と破線で示す曲線は、共に開口数と波面収差量の関係を示している。実線は、開口数が大きい顕微鏡対物レンズ（以下、適宜、「対物レンズＯＢ1」という）における波面収差量を示している。一方、破線は、開口数が小さい顕微鏡対物レンズ（以下、適宜、「対物レンズＯＢ2」という）における波面収差量を示している。 A description will be given using a microscope objective lens. FIG. 20 is a diagram illustrating a state of wavefront aberration in two microscope objective lenses having different numerical apertures (NA). In FIG. 20, the curve indicated by the solid line and the curve indicated by the broken line both indicate the relationship between the numerical aperture and the amount of wavefront aberration. The solid line indicates the amount of wavefront aberration in a microscope objective lens having a large numerical aperture (hereinafter referred to as “objective lens OB 1 ” as appropriate). On the other hand, the broken line indicates the amount of wavefront aberration in a microscope objective lens having a small numerical aperture (hereinafter referred to as “objective lens OB 2 ” as appropriate).
対物レンズＯＢ1と対物レンズＯＢ2では、共に開口数が０．２となる位置で波面収差量が−λ／４になっている。そこで、１次回折光の位置を開口数が０．２となる位置に一致させるようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。 In both the objective lens OB 1 and the objective lens OB 2 , the wavefront aberration amount is −λ / 4 at a position where the numerical aperture is 0.2. Therefore, an electronic image with good contrast can be obtained by matching the position of the first-order diffracted light with the position where the numerical aperture is 0.2.
しかしながら、対物レンズＯＢ2の開口数に比べて、対物レンズＯＢ1は開口数が大きい。そのため、対物レンズＯＢ1には、１次回折光よりも高次の回折光が入射する。ここで、高次の回折光にも波面収差量が加わる。そのため、波面収差量の大きさによっては、０次回折光と高次の回折光が弱めあったり強めあったりする。その結果、対物レンズＯＢ1では、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。 However, the objective lens OB 1 has a larger numerical aperture than the numerical aperture of the objective lens OB 2 . Therefore, higher-order diffracted light is incident on the objective lens OB 1 than the first-order diffracted light. Here, the amount of wavefront aberration is also added to higher-order diffracted light. For this reason, depending on the magnitude of the amount of wavefront aberration, the 0th-order diffracted light and the higher-order diffracted light may be weakened or strengthened. As a result, it becomes difficult for the objective lens OB 1 to obtain an electronic image with good contrast.
そこで、対物レンズＯＢ1に開口絞りを設けることで、対物レンズＯＢ1の開口数を制限できる。すなわち、対物レンズＯＢ1の開口数を対物レンズＯＢ2の開口数と同じ程度にできる。その結果、コントラストの良い電子画像が得られる。 Therefore, by providing the aperture stop to the objective lens OB 1, you can limit the numerical aperture of the objective lens OB 1. That is, the numerical aperture of the objective lens OB 1 can be made the same as the numerical aperture of the objective lens OB 2 . As a result, an electronic image with good contrast can be obtained.
なお、顕微鏡対物レンズから撮像装置までの間で開口数を制限できるのであれば、開口絞りを配置する位置はどこでも良い。よって、結像光学系に開口絞りを持たせても良い。また、対物レンズとしては、顕微鏡対物レンズの他に、例えば、内視鏡対物レンズがある。 In addition, as long as the numerical aperture can be limited between the microscope objective lens and the imaging apparatus, the position where the aperture stop is disposed may be anywhere. Therefore, the imaging optical system may have an aperture stop. In addition to the microscope objective lens, for example, there is an endoscope objective lens as the objective lens.
また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（４）を満足することが好ましい。
０．５＜λ／（Ｐ×ＮＡim）＜２０ （４）
ここで、
λは、撮像素子に入射する光の波長、
Ｐは、撮像装置における撮像素子の画素ピッチ、
ＮＡimは、結像光学系の撮像装置側の開口数、
である。
なお、ＮＡimは、結像光学系の標本側の開口数を結像光学系の投影倍率で割った値になる。
In the sample observation device of each of the embodiments described above, it is preferable that the following conditional expression (4) is satisfied.
0.5 <λ / (P × NA im ) <20 (4)
here,
λ is the wavelength of light incident on the image sensor,
P is the pixel pitch of the image sensor in the imaging device,
NA im is the numerical aperture on the imaging device side of the imaging optical system,
It is.
NA im is a value obtained by dividing the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system by the projection magnification of the imaging optical system.
条件式（４）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。また、解像度の高い電子画像が得られる。 By satisfying conditional expression (4), a clear and colorless specimen can be observed more clearly while in the bright field observation state. In addition, an electronic image with high resolution can be obtained.
条件式（４）の下限値を下回ると、撮像素子におけるナイキスト周波数が、結像光学系（例えば、対物レンズ）のカットオフ周波数を大幅に下回る。そのため、電子画像の画質が悪くなる。条件式（４）の上限値を上回ると、結像光学系の分解能に比べて、撮像素子の画素が小さくなりすぎる。すなわち、電子画像は、画素数が必要以上に多い画像になる。そのため、電子画像の取扱いが困難になる。 If the lower limit value of conditional expression (4) is not reached, the Nyquist frequency in the image sensor is significantly lower than the cutoff frequency of the imaging optical system (for example, objective lens). Therefore, the image quality of the electronic image is deteriorated. If the upper limit of conditional expression (4) is exceeded, the pixels of the image sensor become too small compared to the resolution of the imaging optical system. That is, the electronic image is an image having more pixels than necessary. This makes it difficult to handle electronic images.
また、上述の各実施形態の標本観察装置は、駆動機構を有し、駆動機構は、保持部材、撮像装置及び結像光学系の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させることが好ましい。 In addition, the sample observation device of each of the embodiments described above preferably includes a drive mechanism, and the drive mechanism moves at least one of the holding member, the imaging device, and the imaging optical system along the optical axis.
このようにすることで、電子画像を容易に取得できる。特に、結像光学系や撮像素子を移動させると良い。結像光学系や撮像素子を移動させると、標本Ｓを静止状態にできる。そのため、標本が、非常にやわらかい構造を有している場合や、観察対象が液体中に浮遊しているような場合であっても、標本の状態を変化させることなく（形状の変形や液体中の位置を変化させることなく）電子画像が取得できる。 By doing in this way, an electronic image can be acquired easily. In particular, it is preferable to move the imaging optical system and the image sensor. When the imaging optical system and the image sensor are moved, the specimen S can be made stationary. Therefore, even when the specimen has a very soft structure or when the observation target is suspended in the liquid, the specimen state is not changed (in the form of deformation or in the liquid). An electronic image can be acquired (without changing the position).
なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。 The present invention can take various modifications without departing from the spirit of the present invention.
以上のように、本発明は、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置に適している。 As described above, the present invention is suitable for a specimen observation method and a specimen observation apparatus capable of observing a colorless and transparent specimen, for example, a cell while in a bright field observation state.
ＡＸ 光軸
ＦＬ 光学フィルタ
ＨＭ ハーフミラー
Ｌill 照明光
ＬC 光線（０次回折光）
ＬP 光線（１次回折光）
Ｌ0 ０次回折光
Ｌ-1 −１次回折光
Ｌ+1 ＋１次回折光
Ｍ ミラー
ＯＢ1、ＯＢ2 対物レンズ
ＰS 標本Ｓの位置
ＰF 結像光学系の合焦位置
Ｓ 標本
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４ 区間
１、１’ 標本観察装置
１０ 本体部
１１ ステージ
１２ モータ
２０、２０’ 照明部
２１、２１’ 光源
２２、２２’ 照明光学系
２３ コンデンサレンズ
２４ 開口絞り
２５、２５’ レンズ
２６ ミラー
２７、２７’ レンズ
３０ 観察部
３１ 結像光学系
３２ 撮像装置
３３ レボルバ
３４ 観察鏡筒
３５ 顕微鏡対物レンズ
３６ 撮像レンズ
３７ 結像レンズ
３８ プリズム
３９ 撮像素子
４０ 画像処理装置
５０ 表示装置
１００ 電子内視鏡
１００ａ スコープ部
１００ｂ 接続コード部
１４０ 操作部
１４１ 挿入部
１４２ 先端部
１５０ ユニバーサルコード
２００ 画像処理装置
２０４ 表示ユニット
２５０ コネクタ
３００ 標本観察装置
４０１ 光ファイバ
４０２、４０４ レンズ
４０３ ミラー
４０５ ハーフプリズム
４０６ 対物レンズ
４０７ 結像レンズ
４０８ 撮像素子
AX Optical axis FL Optical filter HM Half mirror L ill Illumination light L C light (0th order diffracted light)
L P beam (first-order diffracted light)
L 0 0-order diffracted light L -1 -1 order diffracted light L +1 +1 order diffracted beam M mirror OB 1, OB 2 objective lens P S sampling focus position S sample position P F imaging optical system of the S X1, X2, X3 , X4 section 1, 1 ′ specimen observation device 10 body part 11 stage 12 motor 20, 20 ′ illumination part 21, 21 ′ light source 22, 22 ′ illumination optical system 23 condenser lens 24 aperture stop 25, 25 ′ lens 26 mirror 27, 27 'lens 30 observation unit 31 imaging optical system 32 imaging device 33 revolver 34 observation barrel 35 microscope objective lens 36 imaging lens 37 imaging lens 38 prism 39 imaging element 40 image processing device 50 display device 100 electronic endoscope 100a scope Part 100b connection cord part 140 operation part 141 insertion part 142 tip part 150 universal code 200 image processing Location 204 Display unit 250 Connector 300 specimen observation apparatus 401 optical fiber 402, 404 lens 403 mirrors 405 a half prism 406 objective lens 407 imaging lens 408 imaging element
Claims (23)
前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
前記取得ステップは明視野観察の状態で行われ、
前記減算ステップにおける前記電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、
該所定の状態では、少なくとも、前記標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていることを特徴とする標本観察方法。 An acquisition step of acquiring an electronic image of the specimen;
Subtracting a direct current component from the signal of the electronic image,
The acquisition step is performed in a bright field observation state,
The electronic image in the subtraction step is an image acquired in a predetermined state,
A specimen observation method, wherein at least the position of the specimen and the in-focus position of the imaging optical system are different in the predetermined state.
前記取得ステップを少なくとも３回行い、
先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、前記比較ステップで比較し、
所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、前記取得ステップから前記比較ステップまでを繰り返し行うことを特徴とする請求項１に記載の標本観察方法。 A comparison step after the subtraction step;
Performing the obtaining step at least three times;
The electronic image acquired earlier and the electronic image acquired later are compared in the comparison step,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the steps from the acquisition step to the comparison step are repeated until an electronic image satisfying a predetermined condition is obtained.
前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項１または２に記載の標本観察方法。 An amplification step after the subtraction step;
3. The specimen observation method according to claim 1, wherein in the amplification step, a signal of the electronic image after the subtraction step is amplified.
逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、
前記変換ステップは、前記減算ステップよりも前に行われ、
前記逆変換ステップは、少なくとも前記減算ステップよりも後に行われることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の標本観察方法。 A transforming step of Fourier transforming the signal of the electronic image;
An inverse transform step for performing an inverse Fourier transform,
The conversion step is performed before the subtraction step,
The specimen observation method according to any one of claims 1 to 3, wherein the inverse conversion step is performed at least after the subtraction step.
規格化ステップと、を有し、
前記事前取得ステップでは、前記標本が無い状態で電子画像を取得し、
前記規格化ステップでは、該電子画像で前記標本の電子画像を規格化し、
前記減算ステップの前に、前記規格化ステップを行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の標本観察方法。 A pre-acquisition step;
A normalization step, and
In the pre-acquisition step, an electronic image is acquired without the specimen,
In the normalization step, the electronic image of the specimen is normalized with the electronic image,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the normalization step is performed before the subtraction step.
変化させた前記標本の位置で、前記取得ステップと前記減算ステップが行われ、
これにより、前記減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、
生成した前記複数の電子画像を加算することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の標本観察方法。 Changing the position of the sample multiple times with respect to the in-focus position of the imaging optical system;
The acquisition step and the subtraction step are performed at the changed position of the sample,
Thereby, a plurality of electronic images after performing the subtraction step are generated,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the plurality of generated electronic images are added.
前記抽出した部分を使って前記加算を行うことを特徴とする請求項６に記載の標本観察方法。 Before the addition, for each of the plurality of electronic images, extract the portion of the electronic image having the highest contrast,
The sample observation method according to claim 6, wherein the addition is performed using the extracted portion.
前記照明光学系は、前記光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
前記結像光学系は、前記標本からの光が入射するように配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
前記撮像装置は前記光学像の位置に配置され、
前記画像処理装置は、請求項１から８のいずれか一項に記載の標本観察方法を行うことを特徴とする標本観察装置。 A light source, an illumination optical system, an imaging optical system, an imaging device, and an image processing device;
The illumination optical system is arranged to irradiate the specimen with illumination light from the light source,
The imaging optical system is arranged so that light from the specimen is incident thereon, and forms an optical image of the specimen.
The imaging device is disposed at the position of the optical image,
The specimen observation apparatus characterized by performing the specimen observation method according to any one of claims 1 to 8.
前記表示装置は、前記画像処理装置からの出力信号を表示することを特徴とする請求項９に記載の標本観察装置。 Having a display device;
The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the display device displays an output signal from the image processing device.
０．０１＜ＮＡill／ＮＡob＜１ （１）
ここで、
ＮＡillは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
ＮＡobは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9 or 10, wherein the following conditional expression (1) is satisfied.
0.01 <NA ill / NA ob <1 (1)
here,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡob 2＜３０μｍ （２）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡobは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the following conditional expression (2) is satisfied.
0.1 μm <ΔZ × NA ob 2 <30 μm (2)
here,
ΔZ is the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡill＜１０μｍ （３）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡillは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the following conditional expression (3) is satisfied.
0.05 μm <ΔZ × NA ill <10 μm (3)
here,
ΔZ is the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
It is.
前記開口絞りは前記対物レンズに設けられていることを特徴とする請求項２０に記載の標本観察装置。 The imaging optical system has an objective lens,
21. The specimen observation apparatus according to claim 20, wherein the aperture stop is provided in the objective lens.
０．５＜λ／（Ｐ×ＮＡim）＜２０ （４）
ここで、
λは、前記撮像装置における撮像素子に入射する光の波長、
Ｐは、前記撮像装置における撮像素子の画素ピッチ、
ＮＡimは、前記結像光学系の前記撮像装置側の開口数、
である。 The sample observation device according to any one of claims 9 to 21, wherein the following conditional expression (4) is satisfied.
0.5 <λ / (P × NA im ) <20 (4)
here,
λ is the wavelength of light incident on the image sensor in the imaging device,
P is the pixel pitch of the image sensor in the imaging device,
NA im is the numerical aperture on the imaging device side of the imaging optical system,
It is.
前記駆動機構は、前記保持部材、前記撮像装置及び前記結像光学系の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させることを特徴とする請求項９から２２のいずれか一項に記載の標本観察装置。 Having a drive mechanism,
The specimen according to any one of claims 9 to 22, wherein the driving mechanism moves at least one of the holding member, the imaging device, and the imaging optical system along an optical axis. Observation device.
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