JP2014147396A - Il−7薬物原料、組成物、製造及び使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129)及び3−6(Cys47−Cys141)を含む、精製された又は単離されたIL−7コンホーマー。哺乳動物IL−7をコードする最適化されたヌクレオチド配列、組換え発現ベクター及び該ポリペプチドを製造する。
【選択図】なし
Description
B及びTリンパ球は免疫応答の一次エフェクター細胞である。両細胞クラスは、各クラスの分化における識別可能な工程を表す前駆細胞(progenitor又はprecursor cells)を経由して哺乳動物骨髄における造血幹細胞から最終的に誘導されるものと考えられる。成熟T細胞は、多分、Tリンパ球発生の初期工程で骨髄から胸腺に移行する前駆細胞から、主として胸腺で発生する。IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、インターフェロンγ、BSF−2、ニューロロイキン(neuroleukin)、トランスフォーミング増殖因子β及びIL−7を含む多数の因子が成熟した末梢B及びT細胞に対して活性である(EP0314415)。
本発明の第1の目的は、下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129);3−6(Cys47−Cys141)を含む精製されたIL−7コンホーマーに関する。更に下記に開示されたとおり、IL−7コンホーマーは好ましくはヒト組換えIL−7コンホーマーであり、そしてグリコシル化されていてもよく又はグリコシル化されていなくてもよい。
a)IL−7ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
b)上記したIL−7コンホーマーを精製する、
ことを含む。
本発明は、下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129);3−6(Cys47−Cys141)を含む精製されたIL−7コンホーマー、該IL−7コンホーマーを含む薬物原料及び製薬学的組成物、並びにそれらの製造方法及び治療的使用に関する。更に下記に開示されるとおり、IL−7コンホーマーは好ましくはヒト組換えIL−7コンホーマーでありそしてグリコシル化されていても良くそしてグリコシル化されていなくてもよい。ヒト組換えIL−7コンホーマーはグリコシル化されているのが好ましい。
本発明の第一の目的は、下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129);3−6(Cys47−Cys141)を含む精製された又は単離されたIL−7コンホーマーにある。
が可能であり、その中でも1−6;2−5;3−4又は1−4;2−5;3−6又は1−4;2−6;3−5又は1−5;2−4;3−6、に加えて、連続的架橋(contiguous bridges)を含む種々の他のコンホーマーが可能である。
本発明は、所望される生成物として上記したIL−7コンホーマーを含む薬物原料であって、IL−7生成物関連物質及び生成物関連不純物を実質的に含まない薬物原料にも関する。
本発明の他の観点は、上記組成物、特に上記IL−7コンホーマー及び薬物原料をその製薬学的使用のために十分な量及び品質において製造するための適当な構築物及び方法を提供することである。
i)IL−7遺伝子又はコード配列を含有するサンプルを提供し、
ii)該サンプルを、最適化された配列、特に位置49における機能的第2開始コドンを欠いた配列を生成するプライマーの対と接触させ、そして
iii)最適化されたIL−7核酸を生成又は増幅する、
ことを含む方法も提供する。
対1:配列番号5及び配列番号6、
対2:配列番号7及び配列番号6、及び
対3:配列番号8及び配列番号6。
a)IL−7ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
b)上記したIL−7コンホーマーを精製する、
ことを含む。
i)該サンプルを処理して該IL−7ポリペプチドの完全な変性を引起し、
ii)場合により工程i)で得られた変性されたポリペプチドを精製し、そして
iii)ポリペプチドをリフォールディングする、
ことを含む。
は好ましくはデキストラン硫酸又はヘパリンであり、そしてマトリックスはセファロース、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製でよく使用される他のタイプのものである。好ましいマトリックスはヘパリンセファロースである。この方法は、更に所望のIL−7コンホーマーを溶離する追加の工程を含むことができる。
精製工程b)は、医薬関連物質、例えば、他のコンホーマー、脱アミド化形態、タンパク質の二量体、DNA、内毒素等を含む残留不純物を除去するために、1つ又はそれより多くの精製工程、例えば、ろ過又は限外ろ過工程、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等を含むことができる。クロマトグラフィー工程は、フロースルー方式(flow through mode)、捕集方式(capture mode)又は流線形方式(streamline mode)で達成することができる。
a)組換え原核生物宿主細胞により産生されたIL−7ポリペプチドを含むサンプルを提供し、
a′)該サンプルを処理して該IL−7ポリペプチドの完全な変性を引起し、
a″)場合により工程a″)で得られた変性されたポリペプチドを精製し、
a″′)ポリペプチドをリフォールディングし、そして
b)ポリペプチドを精製して上記したコンホーマーを生成させる、
工程を含む方法に関する。
a)組換え真核生物宿主細胞により産生されたサンプルであって、リフォールディングされたIL−7ポリペプチドを含むサンプルを提供し、そして
b)生成物関連物質又は不純物を除去するために1つ又はそれより多くの精製工程を実施する、
工程を含む方法に関する。
実施例A.最適化されたヒト(h)及びサル(s)IL−7コードヌクレオチド配列の構築及び発現
A1.大腸菌発現(E.coli JM101)
1.1.ヒトIL−7コードヌクレオチド配列の構築
ヒトIL−7コードcDNA配列を、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有する下記の特異的オリゴヌクレオチドプライマー:
−配列番号:5:IL75′
5′ATTCCATATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGC3′
NdeI
−配列番号:6:IL73′
5′AGCCGGATCCTTATCAGTGTTCTTTAGTGCCCATCA3′
BamHI
を使用してヒト胎盤cDNA(BioChain Inc)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Mullis et al.; 1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350)により増幅した。
−配列番号:7:mutlL75′
5′TAGGGAATTCCATATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAG
Ndel
ATGGCAAACAATACGAGTCCGTTCTG3′
−配列番号:6:IL73′
5′AGCCGGATCCTTATCAGTGTTCTTTAGTGCCCATCA3′
BamHI
を使用して部位特異的突然変異誘発PCRにより行った。
配列番号:9:ptac1
5′ATCGAGATCTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT3′
BgIII
配列番号:10:ptac2
5′ATCGTCTAGAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG
XbaI
3′
を使用してtacプモーターを最初に増幅した。
配列番号:11:ptacプロモータープライマー
5′TTCGTGTCGCTCAAGGCGCA3′
を使用する配列決定分析により正しいDNA配列が確認された。
1.2 サルIL−7コードヌクレオチド配列の構築
a)5′領域を含むサルIL−7cDNAの増幅及び配列決定
サル(アカゲザル(Macaca Mulatta Rheusus monkey))IL−7コードcDNA配列は、PCR増幅(Mullis et al.; 1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350)を使用してアカゲザル腎臓cDNA(BioChain Inc)から得られた。基本的ストラテジーは、ヒトIL−7cDNAを増幅するのに使用した特定のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号5:IL75′及び配列番号6:IL73′)によるPCRによりサルIL−7cDNAを増幅することであった。ゲル電気泳動で1つのバンドが現れた(図6参照)。非対称PCRs及び配列決定はサルIL−7配列を得ることを可能とする。ヒト及びサルIL−7DNA及びアミノ酸配列間の配列相同分析は、それぞれ、DNA(図4参照)配列で98.1%の相同性−同一性、及びアミノ酸(図5参照)配列で96.6%の相同性−同一性を示した。
ヒトIL−7配列と同様に、サルIL−7コードDNA配列は、「ATG」開始コドンの後の位置49に、大腸菌における第2開始コドンとして挙動することができる第2推定「ATG」を与える。何故ならば、この第2「ATG」は、「擬シャイン・ダルガノ」配列(リボソーム結合配列)により先行されるからである。r−sIL−7のアミノ末端トランケーションされた形態(amino-terminal truncated form)の生成の可能性を回避するために、「SD様」配列のヌクレオチドのいくらかを然変異させ(得られるコードされたr−sIL−7アミノ酸配列を修飾することなく)、それにより大腸菌細胞中での発現のための1つ又はそれより多くの好ましいコドン(1つ又は複数)が含有する改良されたメチオニル−IL−7コードDNA配列を生成させた。
対象:天然IL−7ペプチドシグナルに5′端部で連結されたIL−7cDNA断片のcDNAの一部を増幅する試みにおけるプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトIL−7コードcDNA配列を、ヒト胎盤cDNA(BioChain Inc)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Mullis et al.; 1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350)により増幅した。
−配列番号8:PSIL75′
5′GCAAGCTTGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTAT
HindIII Kozak配列
ATCTTTGGAC3′
−配列番号6:IL−73′
5′AGCCGGATCCTTATCAGTGTTCTTTAGTGCCCATCA3′
BamHI
ヒトIL−7コードcDNA配列を制限エンドヌクレアーゼHindIII及びBamHIによる消化によりpcDNA−hPSIL−7から単離した。得られる「hPSIL−7 cDNA」断片をアガロースゲルで精製し、そして同じ酵素で加水分解されたpcDNA4/TO(Invitrogen)に挿入した。ライゲーション生成物をTOP10F′コンピテント細胞(Invitrogen)中に形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、ベクターに保有された抗生物質(アンピシリン)耐性マーカー遺伝子に基づいていた。ポジティブクローンからのプラスミドDNAを培養された細胞から単離し、制限マッピングによりチェックし、そしてユニバーサルCMVフォーワードプライマー及びBGHリバースプライマーを使用する配列決定分析により確認した。
EcoRVとMluI制限部位間の問題のcDNA(その天然のペプチドシグナルに連結されたIL−7cDNA)を増幅する試みにおいてプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトIL−7コードcDNA配列を、pcDNA−hPSIL−7からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Mullis et al.; 1987; Methods in Enzymology; 155: 335-350)により増幅した。
−配列番号14:PSIL7EcoRV5′
5′AGATATCAATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTA3′
EcoRV
−配列番号15:PSIL7MluI3′
−配列番号16:pCMV5
5′CACTTGAGTGACAATGAC3′
−配列番号17:pSV40polyA
5′TCACTGCATTCTAGTTGT3′
ヒトIL−7コードcDNA配列を制限エンドヌクレアーゼHindIII及びBamHIによる消化によりpcDNA−hPSIL−7から単離した。得られる「hPSIL−7 cDNA」断片をアガロースゲルで精製し、そしてHindIII及びBamHI 制限部位で消化されたpBudCE4.1ベクター(Invitrogen)に、pCMVプロモーターの下流で挿入した。
−配列番号14:BclXL5′NotI
5′TAGCGGCCGCATGTCTCAGAGCAACCGG3′
NotI
−配列番号15:BclXL3′BstBI
5′ACTTCGAATCATTTCCGACTGAAGAGTG3′
BstBI
組換え(ヒト又はサル)IL−7の産生のための醗酵を、実施例A1に記載の発現プラスミドptac−hIL−7又はptac−slL7optで形質転換された大腸菌JM101宿主株を使用して80リットルの醗酵槽(New Brunswick)で行った。
最善の安定なポジティブクローンを、実施例A2における如く、いくつかの培地スクリーニングにより血清なしの懸濁培養に適合させて、高い細胞密度培養における生産性及び増殖のために最適化されたクローンを産生させた。灌流システムを備えた3リットルのバイオリアクター中で細胞培養を行った。細胞を10百万/mlの濃度に増殖させた。反応器を約3L/日の連続灌流速度で10日間操作した。組換えタンパク質を含有するおおよそ30Lの血清なしの培養培地を発生させそしてr−hIL−7の精製のための出発物質として使用した。
収穫された細胞を、実施例Bにおける如く、トリス20mM/EDTA10mM緩衝液(pH8)中に懸濁させそして4℃で45分間16900gで遠心した。2回引き続く洗浄/遠心サイクルの後、封入体画分を回収した。
実施例Cで報告された発現系HEK−293−pcDNA−hPSIL−7の増殖により発生した粗細胞培養流体を、従来の方法又はストリームラインイオン交換法を使用して処理した。
ジエチルアミノエチル(DEAE)の拡大した床に移し、次いでIEX及びHICの組み合わせに移す。仕上げ工程はろ過及び濃縮を含むことができる。従来の方法では、ろ過と濃縮[マイクロフィルトレーション(0.45μm)限外ろ過/ダイアフィルトレーション]工程の組み合わせを使用して粗細胞培養流体を清澄化して生成物を単離した。得られるタンパク質溶液を、種々の組み合わせにおけるイオン交換組み合わせ及びヘパリン.セファロース[ファスト.フロー(Pharmacia)カラム]にローディングして生成物を精製した。
1つの電荷を有するタンパク質の平均質量(M+H)+。測定は17518.4Daの理論値に対して17517.6Daの分子量を与えた。
大腸菌中で発現され(実施例A1)、実施例Dにおける如く精製されそして特徴付けされた哺乳動物(ヒト及びサル)IL−7をアッセイしそしてCBA/C57BLマウスからの骨髄細胞由来の細胞系、プレB細胞系PB1(DSMZ, Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Brawnschweig, Germany)と名づけられたIL−7依存性細胞系の増殖を刺激するそれらの能力についてマウスIL−7(R&D System)と比較した。
ヒト組換えIL−7は、サルのモデルに対して異種でありそして組換えヒトIL−7コンホーマー(上記した如き)に対する中和抗体を誘発することができる。これらの抗体は、in vivoで抑制剤として機能することができそして薬物原料の免疫抑制治療効果に寄与することができる。これに基づいて、純粋な(本発明に記載の)r−hIL−7又はr−sIL−7又は次の実施例に記載された「不純物を含んだ」("impure")r−sIL−7で処理された動物の血清及び血漿において抗IL−7抗体を調べた。
ELISAストリッププレートを0.75μg/mlのツイーンを含有するブロッキング緩衝液中に希釈されたr−IL−7(ヒト又はサル)でコーティングした。4℃で一夜インキュベーションした後、プレートの飽和を室温で1時間ブロッキング緩衝液で行った。すべての溶液を除去しそしてプレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、プレートをアッセイに使用する用意をした。
次いで、吸光度を492nmで読み取った。
組換え(ヒト又はサル)IL−7をニトロセルロース又はPVDF膜に移した。次いで膜を処理された動物の血清(1/100又は1/200の希釈率)インキュベーションし、又はポジティブコントロールについては抗IL−7抗体(抗ヒトIL−7抗体:AB207 NA、R&R System)とインキュベーションした。溶液を除去した後、膜を洗浄しそして二次抗体:抗サルIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(SIGMA A1929)と、又はポジティブコントロールについては抗ヤギIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(SIGMA A4187)とインキュベーションした。次いで、BCIP/NBT(SIGMA)を使用して顕色(revelation)を行った。
大腸菌中で発現され(実施例A1)、実施例Dにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えIL−7(ヒト及びサル)及び「不純物を含んだ」r−sIL−7(実施例Gで定義された)を正常な霊長類におけるin vivo生物学的活性について試験した。この霊長類モデルは、薬物原料のa)長期活性及び分子変異体及び/又は医薬生成物関連不純物で汚染された同じ薬物原料の免疫原性を試験するための唯一の可能なモデルであった。げっ歯類で同じ効果を試験しても結論は出ないであろう。何故ならば、第一に、げっ歯類配列は霊長類配列に比べて重要な欠失を示し、第二に、げっ歯類においては、IL−7はB細胞に対して強いリンパ球生成効果を有し、これはT細胞リンパ球生成効果をマスクしやすい又はこの効果の明らかに特徴的な分析を妨害しやすいからである。この理由で、ヒトにおける免疫原性製剤の非倫理的な試験を回避しながら、霊長類における効果を証明するために、我々はサルIL−7をクローニングし、発現しそして精製しそしてそれをサルにおいて試験しなければならなかった。
● グループ1のサルはプラシボ(IL−7希釈剤)を受け取った。
● グループ2のサルは、皮下注射により一日1回投与される150μg/kgの用量で4週間r−hIL−7(本発明に記載の)を受け取った。
● グループ3のサルは、皮下注射により一日1回投与される150μg/kgの用量で4週間r−sIL−7(本発明に記載の)を受け取った。
● グループ4のサルは、150μg/kgの用量レベルで「不純物を含んだ」s−rIL−7の1日1回の皮下投与を4週間受け取った。
すべての動物を6週間:4週間の処理期間及び2週間の可逆性期間にわたり調べた。
大腸菌中で発現され(実施例A1)、実施例Dにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えサルIL−7及び「不純物を含んだ」r−sIL−7(実施例Gで定義された)を免疫抑制された霊長類における中又は長期間in vivo生物学的活性について試験した。若いアカゲザルを3つのグループ(1〜3)において調べた。各グループは3匹の動物を含んでいた。
サルは下記の治療方式を受けた:
●グループ1はプラシボ(IL−7希釈剤)を受け取った。
●グループ2は、皮下注射により一日1回投与される70μg/kgの用量で、r−sIL−7(本発明に記載の)を、照射後14日目に開始して4週間受け取った。
● グループ3は、70μg/kgの用量レベルで「不純物を含んだ」r−sIL−7の1日1回の皮下投与を、照射後14日目に開始して4週間受け取った。
大腸菌中で発現され(実施例A1)、実施例Dにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えヒトIL−7(r−hIL−7)を、薬力学的パラメーター及び正常なシノモルグスサルにおける総リンパ球数値に対するin vivo生物学的活性について試験した。
−末梢血中のリンパ球数値、CD3+T細胞、CD4+及びCD8+サブセットの明らかな減少が6時間という早期にそして72時間まで観察された。細胞数値は注射の約96時間後ベースラインの値に戻った。末梢リンパ球数値のこの低下はTリンパ球の血液からリンパ組織に向けての初期IL−7誘発輸送(early IL-7 induced trafficking)と合致している。
−末梢リンパ球によるIL−7受容体α鎖(CD127)発現の著しいしかし一過性の減少が注射の後48時間の期間観察され、これはIL−7の一回の投与に応答するIL−7受容体のダウンモジュレーションを反映する。CD127発現は48時間に再び現れ始め、注射の96時間後ベースラインの値に向けて戻った。
−細胞増殖のマーカーであるKi67発現の遅延したしかし有意な増加が注射後72/96時間までCD4+及びCD8+細胞の両方で観察された。
−アポトーシス抑制のマーカーであるBcl−2の遅延した増加が観察され、IL−7活性に関与していることが証明された。
大腸菌中で発現され(実施例A1)、実施例Dにおける如く精製されそして特徴付けされた組換えIL−7(ヒト及びサル)及び「不純物を含んだ」r−sIL−7(実施例Gで定義された)を正常な霊長類におけるin vivo生物学的活性について試験した。この霊長類モデルは、薬物原料のa)長期活性及び分子変異体及び/又は医薬生成物関連不純物で汚染された同じ薬物原料の免疫原性を試験するための唯一の可能なモデルであった。げっ歯類で同じ効果を試験しても結論は出ないであろう。何故ならば、第一に、げっ歯類配列は霊長類配列に比べて重要な欠失を示し、第二に、げっ歯類においては、IL−7はB細胞に対して強いリンパ球生成効果を有し、これはT細胞リンパ球生成効果をマスクしやすい又はこの効果の明らかに特徴的な分析を妨害しやすいからである。この理由で、ヒトにおける免疫原性製剤の非倫理的な試験を回避しながら、霊長類における効果を証明するために、我々はサルIL−7をクローニングし、発現しそして精製しそしてそれをサルにおいて試験しなければならなかった。
Claims (55)
- 下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129)及び3−6(Cys47−Cys141)を含む、精製された又は単離されたIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが組換えヒトIL−7コンホーマーである、請求項1に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが配列番号2又は4のアミノ酸配列を含む請求項2に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが組換えサルIL−7コンホーマーである請求項1に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーがグリコシル化されていない、請求項1〜5のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーがグリコシル化されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーがヘテロ二量体として肝細胞成長因子に会合している、請求項1〜7のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが、ペプチドヒンジ領域によってIgG重鎖のFc部分に機能的に付着しており、該IgGがヒトIgG1又はIgG4である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマー。
- 該IL−7コンホーマーが、ヒト血清アルブミン(HSA)又はHSAの一部に融合タンパク質として機能的に会合している、請求項1〜7のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマー。
- 所望の生成物として、請求項1〜9のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマーを含み、IL−7分子変異体又は生成物関連不純物を実質的に含まない、IL−7薬物原料。
- 所望の生成物として請求項1〜7のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマーを含み、IL−7分子変異体又は生成物関連不純物を実質的に含まないIL−7薬物原料であって、該薬物原料中のIL−7の総量が少なくとも98重量%、好ましくは少なくとも99.5重量%であるIL−7薬物原料。
- 有効量の請求項11又は12に記載の薬物原料及び1種又はそれより多くの製薬学的に適合性の担体を含む、製薬学的組成物。
- 製薬学的に適合性の担体がスクロース、トレハロース及びアミノ酸から選ばれる、請求項13に記載の製薬学的組成物。
- 製薬学的に適合性の担体が適当な緩衝液中に含有されて等張性溶液を形成する、請求項14に記載の製薬学的組成物。
- 該適当な緩衝液が5〜7.5、好ましくは6〜7、更に好ましくは6.5のpH範囲を有する、請求項13〜15のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- 該適当な緩衝液がクエン酸ナトリウム緩衝液及び酢酸アンモニウム緩衝液から選ばれる有機塩である、請求項16に記載の製薬学的組成物。
- 該組成物が凍結乾燥された形態である、請求項13に記載の製薬学的組成物。
- 該組成物がタンパク質(好ましくはヒト血清アルブミン)及び/又は界面活性剤(好ましくはツイーン80)を含む、請求項13に記載の製薬学的組成物。
- 組み合わせて使用するため、別々に使用するため又は順次に使用するための、造血細胞成長因子、サイトカイン、抗原及びアジュバントから選ばれた免疫刺激剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項13〜19のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- 該造血細胞成長因子が幹細胞因子(SCF)、特に溶解性形態のSCF、G−CSF、GM−CSF、Flt−3リガンド、IL−15及びIL−2から選ばれる、請求項20に記載の製薬学的組成物。
- サイトカインがγインターフェロン、IL−2、IL−12、RANTES、B7−1、MIP−2及びMIP−1αから選ばれる、請求項20に記載の製薬学的組成物。
- 該抗原が、合成又は天然ペプチド、組み換えタンパク質、殺されたか、不活性化されたか又は弱毒化された病原生成物、脂質、これらの一部及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項20〜22のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- 該抗原がHIV、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バールウイルス、1型又は2型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、デングウイルス、A、B、C又はE型肝炎ウイルス、合胞体呼吸ウイルス(syncytium respiratory virus)、ヒトパピローマウイルス、結核菌、トキソプラズマ及びクラミジア由来の抗原から選ばれる請求項23に記載の製薬学的組成物。
- 該アジュバントが抗原の免疫原性を促進するか又は増加させそしてTh1型免疫応答を誘発することができる任意の物質、混合物、溶質又は組成物、例えば、CpG、QS21、ISCOM及びモノホスホリル脂質Aから選ばれる、請求項20〜24のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- BもしくはTリンパ球発生及び増殖の予防的もしくは治療的刺激のため、包括的もしくは特異的免疫再構成の増強のため、又は液性もしくは細胞性免疫応答の増強のためにヒト患者に投与するための、請求項13〜25のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- 免疫不全患者の日和見感染を防止するか又は減少させるための、請求項13〜25のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- ヒト患者において、リンパ球新生刺激を延長するため及び/又は特異的免疫応答を生じさせるため及び/又は特異的免疫応答のレパートリーを広げるための、請求項13〜25のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。
- ヒト患者が免疫不全患者、がん患者、移植片を受けている患者、ウイルス又は寄生虫に感染した患者、高齢患者又は低いCD4数値を有するすべての患者である請求項26、27又は28に記載の製薬学的組成物。
- 薬物原料の有効量が約3〜300μg/kg/日、好ましくは10〜100μg/kg/日
でありそして特に一日に一回から、一週二回又は三回、一週一回まで投与される、請求項13〜29のいずれか一項に記載の製薬学的組成物。 - IL−7ポリペプチドをコードする核酸分子であって、変更されたシャイン・ダルガノ様配列を含む、核酸分子。
- 配列番号1、3、12、16、18、20又は22から選ばれる配列を含む、核酸分子。
- 請求項31又は32に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項31又は32に記載の核酸又は請求項33に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 該組換え宿主細胞がヒト細胞又はバクテリア細胞である、請求項34に記載の組換え宿主細胞。
- エシェリシア・コリ又はバチルス・ブレビスである、請求項35に記載の組換え宿主細胞。
- チャイニーズ.ハムスター卵巣(CHO)、HEK−293細胞系又はヒト間質細胞系又は上皮細胞系である、請求項35に記載の組換え宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のIL−7コンホーマーと特異的に免疫反応性の抗体。
- 請求項11及び12のいずれか一項に記載のIL−7薬物原料を製造する方法であって、
a)IL−7ポリペプチドを含むサンプルを提供すること、
b)下記の3つのジスルフィド架橋:Cys:1−4(Cys2−Cys92);2−5(Cys34−Cys129)及び3−6(Cys47−Cys141)を含むIL−7コンホーマーを精製してIL−7薬物原料を生成させること、及び
c)場合により、該薬物原料において、該特定のIL−7コンホーマーを測定又は定量すること
を含む方法。 - 該サンプルがIL−7ポリペプチドを産生する組み換え原核生物又は真核生物宿主細胞から得られる、請求項39に記載の方法。
- 該サンプルがIL−7ポリペプチドをコードする原核生物宿主細胞の培養物であり(又は由来のものであり)そして更に、工程b)の前に、
i)該サンプルを処理して該IL−7ポリペプチドの完全な変性を引き起すこと、
ii)場合により工程i)で得られる変性されたポリペプチドを精製すること、及び
iii)ポリペプチドをリフォールディングすること、
を含む、請求項40に記載の方法。 - 工程i)が変性剤緩衝液中に封入体を溶解することを含む、請求項41に記載の方法。
- 工程ii)を、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換又は逆相クロマトグラフィーにより行う、請求項41又は42に記載の方法。
- HICブチルを使用して該疎水性クロマトグラフィーを実施する、請求項42に記載の方法。
- 工程ii)を6〜9、好ましくは7〜8.5の両端を含めた範囲内にあるpHで行う、請求項41〜44のいずれかの方法。
- 該精製工程bがアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、41〜45のいずれかの方法。
- 該アフィニティークロマトグラフィーを硫酸化多糖類のカラムで行う、請求項46に記載の方法。
- 硫酸化多糖類がデキストラン硫酸又はヘパリンである、請求項47に記載の方法。
- IL−7コンホーマーが、薬物原料において、質量分析法、赤外分光法、NMRによって、円偏光二色性を決定することによって、該IL−7コンホーマーに対して生じた特異的モノクローナル抗体に対するアフィニティーを測定すること又はヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより特徴付けられ、そしてIL−7受容体に対する該IL−7コンホーマーのELISA、バイオアッセイ又はアフィニティーにより、及び単離されたコンホーマーに適用される場合にはタンパク質定量のいかなる方法によっても測定され又は定量される、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。
- IL−7含有調製物における請求項1〜9のいずれか一つに記載のIL−7コンホーマーの存在及び/又は相対的量を決定することを含む、IL−7含有調製物を制御する方法。
- IL−7薬物原料又は製薬学的組成物を製造する方法であって、(i)IL−7ポリペプチドをコードする組換え宿主細胞を培養し、(ii)該組換えポリペプチドを単離してIL−7薬物原料を生成させ、そして(iii)場合により、該IL−7薬物原料をコンディショニングして治療又はワクチン用途に適当な製薬学的組成物を生成させることを含み、更に該薬物原料又は製薬学的組成物において、請求項1〜9のいずれか一項に定義されたIL−7コンホーマーの量及び/又は品質を同定し、特徴付け又は測定する工程を含み、そして更に好ましくは、活性成分として該IL−7コンホーマーを約95%より多く、好ましくは98%より多く含む薬物原料又は製薬学的組成物を選ぶ工程を含む、方法。
- 組換え宿主細胞によるIL−7発現が誘導性であるか、調節されるか又は一過性であり、それにより細胞培養段階とIL−7発現段階を引き離すことができる、請求項40又は51に記載の方法。
- 該IL−7コンホーマーの量及び/又は品質が、トリプシン消化を伴う又は伴わない質量分析関連法、円偏光二色性、NMR、ジスルフィド架橋のための特異的モノクローナル抗体分析及び/又はコンホメーション特徴付けにより決定される、請求項51又は52に記載の方法。
- 長期のリンパ球生成刺激を誘発し及び/又は免疫応答を増幅するための製薬学的組成物の製造のための請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法により得られる、IL−7薬物原料の使用。
- 免疫不全に関連した疾患を防止又は処置するための製薬学的組成物の製造のための請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法により得られるIL−7薬物原料の使用。
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