JP2014129338A - Hand-foot syndrome therapeutic composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、手足症候群（ｈａｎｄ−ｆｏｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を治療または予防するための組成物に関する。 The present invention relates to a composition for treating or preventing hand-foot syndrome.
手足症候群は、抗癌剤等の化学療法薬の投与に起因して発症する皮膚疾患である。一般的な症状は、手のひらおよび足の裏の限定された範囲に現れ、チクチクするような感覚異状から、多くの場合に疼痛、発疹、紅斑を伴う。何ら対処をしない場合は重症化して、患者のＱＯＬの低下に伴って原因薬剤による治療継続が難しくなるなど、本来の治療に支障をきたす場合も少なくない。 Hand-foot syndrome is a skin disease that develops due to administration of chemotherapeutic drugs such as anticancer drugs. Common symptoms appear in a limited area on the palms and soles and are often accompanied by pain, rash, erythema due to tingling sensations. If no measures are taken, there are many cases where the original treatment is hindered, such as the severity of the disease and the difficulty in continuing treatment with the causative agent as the patient's QOL decreases.
手足症候群の治療方法として、手足の安静；保湿を目的とした尿素軟膏；ヘパリン類似物質製剤またはビタミン含有軟膏などの外用剤を用いた局所治療；全身療法としてプロドニゾロンやデキサメタゾン、または塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）の内服（非特許文献１）などが提案されているが、これらはいずれも対処療法であり、手足症候群の根治を図るものではない。 Treatment of hand-foot syndrome includes rest of limbs; urea ointment for moisturizing; topical treatment using topical agents such as heparin-like substance preparations or vitamin-containing ointments; prodonisolone or dexamethasone or pyridoxine hydrochloride (vitamin B6 as systemic therapy) ) (Non-patent Document 1) and the like have been proposed, but these are coping therapy and do not attempt to cure hand-foot syndrome.
現在までに、手足症候群の発症メカニズムとして、皮膚基底細胞の増殖能の阻害、血管からの抗癌剤漏出（特許文献１）、エクリン汗腺からの抗癌剤分泌（非特許文献２）などがその原因の一つである可能性も示されているが、抗癌剤とその発症との因果関係は不明である。 To date, inhibition of the proliferation of skin basal cells, leakage of anticancer drugs from blood vessels (Patent Document 1), secretion of anticancer drugs from eccrine sweat glands (Non-Patent Document 2) are one of the causes of hand-foot syndrome. However, the causal relationship between anticancer drugs and their development is unknown.
多くの抗癌剤はＤＮＡ損傷を引き起こし、癌細胞のアポトーシスを誘導する。癌のアポトーシスは、抗癌剤によって直接的または間接的に生じた活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；以下、「ＲＯＳ」とも称する）によって誘導されることが報告されている（非特許文献３〜８）。さらに、ＲＯＳによる酸化損傷は、ヒト全骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞およびＨＬ−６０由来カタラーゼ過剰発現ＨＰ１００細胞を用いた実験において、銅（ＩＩ）イオンの存在下で増幅されたことが報告されている（非特許文献６および９）。 Many anticancer agents cause DNA damage and induce apoptosis of cancer cells. It has been reported that apoptosis of cancer is induced by reactive oxygen species (hereinafter also referred to as “ROS”) generated directly or indirectly by an anticancer agent (Non-Patent Documents 3 to 8). Furthermore, oxidative damage caused by ROS was amplified in the presence of copper (II) ions in experiments using human whole myeloid leukemia cell line HL-60 cells and HL-60-derived catalase-overexpressing HP100 cells. Have been reported (Non-Patent Documents 6 and 9).
上記のとおり、原因薬剤の継続や患者のＱＯＬ向上などの点で重大な手足症候群の治療または予防ニーズの存在にも関わらず、その発症機序は不明であり、有効な対処法が存在しない状況にある。そこで本発明は、手足症候群の治療または予防に有効な新規組成物を提供することを目的とする。 As described above, despite the presence of treatment or prevention needs for hand-foot syndrome, which is significant in terms of continuation of the causative agent and improvement in patient QOL, the onset mechanism is unknown, and there is no effective countermeasure It is in. Then, an object of this invention is to provide the novel composition effective in the treatment or prevention of hand-foot syndrome.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、抗癌剤等の化学療法剤の投与に伴って発生するＲＯＳが、手足症候群の炎症症状の発現に密接に関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have been closely involved in the development of inflammatory symptoms of hand-foot syndrome due to the occurrence of ROS accompanying the administration of chemotherapeutic agents such as anticancer agents. As a result, the present invention has been completed.
したがって、本発明は以下の特徴を包含する。 Accordingly, the present invention includes the following features.
（１）活性酸素を捕捉または除去する物質を有効成分とする、手足症候群を治療または予防するための組成物。 (1) A composition for treating or preventing hand-foot syndrome, comprising a substance that captures or removes active oxygen as an active ingredient.
（２）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸若しくはその誘導体、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロール若しくはその誘導体、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシン、またはフィトケミカルから選択される少なくとも１種である前記（１）記載の組成物。 (2) Substances that capture or remove active oxygen are superoxide dismutase, bilirubin, glutathione peroxidase, peroxidase, catalase, ascorbic acid or derivatives thereof, cysteine, glutathione, linoleic acid, tocopherol or derivatives thereof, α-carotene, β- The composition according to (1), which is at least one selected from carotenes, flavonoids, uric acid, thioredoxin, or phytochemicals.
（３）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを標的とするものであることを特徴とする、前記（１）記載の組成物。 (3) The composition as described in (1) above, wherein the substance that captures or removes active oxygen targets a superoxide anion.
（４）活性酸素を捕捉または除去する物質として、少なくともスーパーオキシドジスムターゼを含んでいることを特徴とする、前記（１）記載の組成物。 (4) The composition according to (1) above, which contains at least superoxide dismutase as a substance that captures or removes active oxygen.
（５）手足症候群はドキソルビシンのリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか記載の組成物。 (5) The composition according to any one of (1) to (4), wherein hand-foot syndrome is caused by administration of a liposomal preparation of doxorubicin.
（６）皮膚外用剤である、前記（１）〜（５）のいずれか記載の組成物。 (6) The composition according to any one of (1) to (5), wherein the composition is an external preparation for skin.
（７）皮膚外用医薬品である、前記（６）記載の組成物。 (7) The composition according to (6), wherein the composition is a skin external medicine.
（６）皮膚外用剤である、前記（１）〜（５）のいずれか記載の組成物。 (6) The composition according to any one of (1) to (5), wherein the composition is an external preparation for skin.
（７）皮膚外用医薬品である、前記（６）記載の組成物。 (7) The composition according to (6), wherein the composition is a skin external medicine.
（８）手足症候群の治療剤または予防剤を製造するための、活性酸素を捕捉または除去する物質の使用。 (8) Use of a substance that captures or removes active oxygen to produce a therapeutic or prophylactic agent for hand-foot syndrome.
（９）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸もしくはその誘導体、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロールもしくはその誘導体、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシン、またはフィトケミカルから選択される少なくとも１種である前記（８）記載の使用。 (9) Substances that capture or remove active oxygen are superoxide dismutase, bilirubin, glutathione peroxidase, peroxidase, catalase, ascorbic acid or derivatives thereof, cysteine, glutathione, linoleic acid, tocopherol or derivatives thereof, α-carotene, β- The use according to (8) above, which is at least one selected from carotene, flavonoids, uric acid, thioredoxin, or phytochemical.
（１０）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを標的とするものであることを特徴とする、前記（８）記載の使用。 (10) The use according to (8) above, wherein the substance that captures or removes active oxygen targets a superoxide anion.
（１１）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼである前記（８）記載の使用。 (11) The use according to (8) above, wherein the substance that captures or removes active oxygen is superoxide dismutase.
（１２）手足症候群はリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、前記（８）〜（１１）のいずれか記載の使用。 (12) The use according to any one of (8) to (11) above, wherein the limb syndrome is caused by administration of a liposomal preparation.
本発明によれば、手足症候群の治療または予防に有効な新規組成物が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel composition effective in the treatment or prevention of hand-foot syndrome is provided.
本発明は、手足症候群を治療または予防するための組成物（以下、「本発明の組成物」とも称する。）に関する。本発明において、治療または予防の対象となる手足症候群は、化学療法薬（特に抗癌剤）の投与に起因して手足指先、手掌、足底などの四肢末端に発症する皮膚症状（しびれ、皮膚知覚過敏、色素沈着、発赤、熱感、紅斑、水疱、むくみ、角化、ひび割れ、爪の変形・色素沈着などを含むがこれに限られない）をいう。また、手足症候群は、手掌・足底発赤知覚不全症候群、脚端紅斑、化学療法薬誘導性脚端紅斑、手掌・足底紅斑、手足皮膚反応としても知られているが、本発明における手足症候群という用語はこれらを全て含むものである。 The present invention relates to a composition for treating or preventing hand-foot syndrome (hereinafter also referred to as “the composition of the present invention”). In the present invention, the limb syndrome to be treated or prevented is a skin symptom (numbness, hypersensitivity of the skin) that develops at the extremities of limbs, palms, soles, etc. due to administration of a chemotherapeutic agent (especially anticancer agent). , Pigmentation, redness, heat sensation, erythema, blistering, swelling, keratinization, cracking, nail deformation / pigmentation, etc.). In addition, hand-foot syndrome is also known as palm-plantar redness perception deficiency syndrome, leg erythema, chemotherapeutic drug-induced erythema, palm-plantar erythema, hand-foot skin reaction in the present invention. The term includes all of these.
また、手足症候群の発症原因となりうる化学療法薬として、結腸直腸癌および乳癌の治療に使用されるフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤（例えばカペシタビン）；悪性固形腫瘍に対して使用されるアントラサイクリン；再発性卵巣癌に対して使用されるＰＥＧ改変型リポソームドキソルビシン製剤（ＰＥＧＬ−ＤＯＸ）；広範な癌に対して使用されるドセタキセル；腎癌に対して使用される分子標的薬であるソラフェニブやスニチニブなど、多数の薬剤が知られているが、本発明における手足症候群は、その発症原因となる薬剤によって制限されるものではなく、任意の薬剤を原因とするものを対象とする。一実施態様においては、手足症候群は、ドキソルビシンのリポソーム化製剤の投与に起因する手足症候群である。 In addition, chemotherapeutic drugs that can cause limb syndrome include fluorinated pyrimidine antitumor agents (eg, capecitabine) used to treat colorectal cancer and breast cancer; anthracyclines used for malignant solid tumors; PEG-modified liposomal doxorubicin formulation (PEGL-DOX) used for primary ovarian cancer; docetaxel used for a wide range of cancers; molecular targets such as sorafenib and sunitinib used for renal cancer, Although a large number of drugs are known, the hand-foot syndrome in the present invention is not limited by the drug that causes its onset, but targets any drug. In one embodiment, the limb syndrome is limb syndrome resulting from administration of a liposomal formulation of doxorubicin.
本発明は、抗癌剤等の化学療法薬の投与に起因する手足症候群の症状に、化学療法薬との相互作用によって発生するＲＯＳが関与していることを見出したことを基礎とするものである。したがって本発明の組成物は、活性酸素を捕捉または除去する物質を有効成分として含むことを特徴とする。 The present invention is based on the finding that ROS generated by interaction with a chemotherapeutic drug is involved in the symptoms of hand-foot syndrome caused by administration of a chemotherapeutic drug such as an anticancer drug. Therefore, the composition of the present invention is characterized by containing a substance that captures or removes active oxygen as an active ingredient.
ＲＯＳには、一般的に、酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、および一重項酸素（１Ｏ２）の４種が含まれるが、本発明においては、その少なくとも１種、２種、３種、そして４種の全てを標的とするように、有効成分を選択または組み合わせることができる。したがって、本発明において「活性酸素（ＲＯＳ）を捕捉または除去する物質」とは、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、および一重項酸素（１Ｏ２）のうちの少なくとも１種を捕捉または除去の標的とする物質（例えば抗酸化剤）をいう。 The ROS, generally, superoxide anion generated by the one-electron reduction of oxygen molecules (O 2-), hydrogen peroxide (H 2 O 2), hydroxyl radical (· OH), and singlet oxygen (1 O 2 In the present invention, active ingredients can be selected or combined to target at least one, two, three, and all four of them. Therefore, in the present invention, “a substance that captures or removes active oxygen (ROS)” means a superoxide anion (O 2− ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), a hydroxy radical (.OH), and a singlet. A substance (for example, an antioxidant) that targets at least one of oxygen ( 1 O 2 ) to be captured or removed.
活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素のいずれか１種を捕捉または除去することができ、かつ、人体に有害作用を生じない限り、天然由来であっても合成由来であってもよい。本発明の一実施態様においては、活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを捕捉または除去の標的とする物質である。 A substance that captures or removes active oxygen is a natural substance as long as it can capture or remove any one of superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxy radical, and singlet oxygen and does not cause harmful effects on the human body. It may be of origin or synthetic origin. In one embodiment of the invention, the substance that captures or removes active oxygen is a substance that targets the superoxide anion for capture or removal.
スーパーオキサイドアニオンを捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、アスコルビン酸またはその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）などが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。 Substances that can capture or remove superoxide anions include, but are not limited to, superoxide dismutase, bilirubin, ascorbic acid or derivatives thereof (ascorbyl 6-stearate, ascorbyl 6-palmitate, 2, Ascorbyl 6-dipalmitate, Ascorbyl 2,3,5,6-tetrahexyldecanoate, potassium (ascorbyl / tocopheryl) phosphate, disodium ascorbate-2-sulfate, sodium ascorbate, magnesium ascorbate-2-phosphate , Sodium ascorbate-2-phosphate, ascorbyl-2-glucoside, etc.) are known, and the composition of the present invention can contain at least one of these as an active ingredient.
過酸化水素を捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸またはその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）、ビタミンＥコハク酸エステルなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。 Examples of substances capable of capturing or removing hydrogen peroxide include, but are not limited to, glutathione peroxidase, peroxidase, catalase, ascorbic acid or derivatives thereof (ascorbyl 6-stearate, ascorbyl 6-palmitate, 2 Ascorbyl 2,6-dipalmitate, ascorbyl 2,3,5,6-tetrahexyldecanoate, potassium (ascorbyl / tocopheryl) phosphate, disodium ascorbate-2-sulfate, sodium ascorbate, ascorbate-2-phosphate Magnesium, ascorbic acid-2-sodium phosphate, ascorbyl-2-glucoside, etc.), vitamin E succinate and the like are known, and the composition of the present invention can contain at least one of these as an active ingredient.
ヒドロキシラジカルを捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロールまたはその誘導体（α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ビタミンEコハク酸エステルなど）、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシンなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。 Substances that can scavenge or remove hydroxy radicals include, but are not limited to, cysteine, glutathione, linoleic acid, tocopherol or derivatives thereof (α-tocopherol, tocopherol acetate, vitamin E succinate, etc.), α-carotene, β-carotene, flavonoids, uric acid, thioredoxin and the like are known, and the composition of the present invention can contain at least one of them as an active ingredient.
一重項酸素を捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、アスコルビン酸およびその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）、トコフェロールおよびその誘導体（α−トコフェロール、酢酸トコフェロールなど）、β−カロテン、リボフラビン、尿酸、チオレドキシンなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。 Examples of substances capable of capturing or removing singlet oxygen include, but are not limited to, ascorbic acid and its derivatives (ascorbyl 6-stearate, ascorbyl 6-palmitate, ascorbyl 2,6-dipalmitate). 2,3,5,6-tetrahexyldecanoic acid ascorbyl, (ascorbyl / tocopheryl) potassium phosphate, ascorbic acid-2-sodium sulfate, sodium ascorbate, ascorbic acid-2-magnesium phosphate, ascorbic acid-2- Sodium phosphate, ascorbyl-2-glucoside, etc.), tocopherol and its derivatives (α-tocopherol, tocopherol acetate, etc.), β-carotene, riboflavin, uric acid, thioredoxin, etc. are known, and the composition of the present invention is those At least Can also contain 1 type as an active ingredient.
また上記の他、本発明の組成物は、有効成分として高い抗酸化作用が知られている物質、例えばα−リポ酸、コエンザイムＱ１０、キサントフィル類（アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチンなど）、カロテノイド（αカロテン、βカロテン、リコペンなど）、ポリフェノール（クロロゲン酸、エラグ酸、リグナン、セサミン、クルクミン、クマリン、オレオカンタール、オレウロペイン、レスベラトロールなど）、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、フェルラ酸、カフェ酸、５−（ジエチルホスホノ）−５−メチル−１−ピロリンＮ−オキシド、フラボノイド（フラバノン、フラボン、カルコン、カテキン、没食子酸エピガロカテキン、フラバノノール、オーロン、フラバン−３４−ジオール（ロイコアントシアン）、イソフラボン、アントシアニン、タンニン、ルチンなど）、植物抽出物（ビワ葉エキス、籐茶エキス、エイジツエキス、ローズマリーエキスなど）、マンガンＮ，Ｎ’−ビス（サリチリジエン）エチレンジアミンクロライド、（ａｃｅｔａｔｏ−κＯ）［［２，２−［１，２’−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌｂｉｓ［（ｎｉｔｒｉｌｏ−κＮ）ｍｅｔｈｙｌｉｄｙｎｅ］］ｂｉｓ［３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌａｔｏ−κＯ］］（２−）］−ｍａｎｇａｎｅｓｅ、２，６−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−［［（１−エチル）アミノ］メチル］フェノール塩酸塩、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン、ＳＯＤミメティック化合物（マンガン（III）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロライド、マンガン（III）テトラキス（１−メチル−２−ピリジル）ポルフィリン、マンガン（III）メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−２−ピリジル）ポルフィリンペンタクロライドなど）、７−ヒドロキシフラボン−マンガン複合体、ノルジヒドログアヤレチン酸、２１−（４−（２，６ Ｄｉ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−ｐｒｅｇｎａ−１，４，９（１１）−ｔｒｉｅｎｅ−３，２０−ｄｉｏｎｅ，（Ｚ）−２−Ｂｕｔｅｎｅｄｉｏｎａｔｅ、（−）−２−（（４−（２，６−Ｄｉ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，３，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｏｌ， ２ＨＣｌ、フィトケミカル（アントシアニン、イソフラボン、セサミノール、クルクミン、スルフォラハン、メチルシステインスルホキシド、アリシン、ルテイン、リコペン、リモネン、フィトステロール、βグルカン、サポニン、カプサイシン、ジンゲロールなど）を含んでもよい。 In addition to the above, the composition of the present invention is a substance having a high antioxidant action as an active ingredient, such as α-lipoic acid, coenzyme Q10, xanthophylls (astaxanthin, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin, fucoxanthin, Anthaxanthin, violaxanthin, etc.), carotenoids (eg, α-carotene, β-carotene, lycopene), polyphenols (chlorogenic acid, ellagic acid, lignan, sesamin, curcumin, coumarin, oleocanthal, oleuropein, resveratrol, etc.), butylhydroxyanisole , Butylhydroxytoluene, sodium erythorbate, propyl gallate, ferulic acid, caffeic acid, 5- (diethylphosphono) -5-methyl-1-pyrroline N-oxide, flavonoids (flavanones, flavo , Chalcone, catechin, epigallocatechin gallate, flavonol, aurone, flavan-34-diol (leucoanthocyan), isoflavone, anthocyanin, tannin, rutin, etc., plant extract (biwa leaf extract, rattan tea extract, age extract, Rosemary extract, etc.), manganese N, N′-bis (salicylidene) ethylenediamine chloride, (aceto-κO) [[2,2- [1,2′-ethanedibis [(nitrilo-κN) methylidyne]] bis [3 5-dimethylphenolato-κO]] (2-)]-manganese, 2,6-bis (1,1-dimethylethyl) -4-[[(1-ethyl) amino] methyl] phenol hydrochloride, 3-methyl- 1-phenyl- -Pyrazolone, SOD mimetic compound (manganese (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride, manganese (III) tetrakis (1-methyl-2-pyridyl) porphyrin, manganese (III) meso-tetrakis (N-methyl-2) -Pyridyl) porphyrin pentachloride), 7-hydroxyflavone-manganese complex, nordihydroguaiaretic acid, 21- (4- (2,6 Di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl) -1-piperazinyl)- pregna-1,4,9 (11) -triene-3,20-dione, (Z) -2-Butenedionate, (-)-2-((4- (2,6-Di-1-pyrrolidinyl-4- pyrimidinyl) -1-pip razinyl) methyl) -3,4-dihydro-2,3,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-6-ol, 2HCl, phytochemical (anthocyanin, isoflavone, sesaminol, curcumin, sulforahan, methylcysteine sulfoxide , Allicin, lutein, lycopene, limonene, phytosterol, β-glucan, saponin, capsaicin, gingerol, and the like.
本発明において、標的とするＲＯＳの種類に依らず、上述したＲＯＳを捕捉または除去することができる物質のうち、１種〜複数種を選択して本発明の組成物を調製することができる。 In the present invention, the composition of the present invention can be prepared by selecting one or more of the above-mentioned substances capable of capturing or removing ROS regardless of the type of ROS targeted.
本発明において、組成物の投与ルートおよび剤型は、手足症候群の治療または予防効果が発揮される限り特に制限されないが、手足症候群の発症原因となることが既に知られている化学療法薬の投与を予定している対象、手足症候群の発症原因となった化学療法薬の投与を継続している対象への適用に際しては、化学療法剤の効果を損なわないようにすることが好ましい。すなわち、上記のとおり、癌のアポトーシスは、抗癌剤によって直接的または間接的に生じた活性酸素（以下、「ＲＯＳ」とも称する）によって誘導されることが報告されており（Ｈｉｒａｏｋａ Ｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前掲；Ｔａｄａ−Ｏｉｋａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）前掲；Ｖａｒｂｉｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２００１）前掲；Ｍｕｒａｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００４）前掲；Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）前掲；Ｇｅｗｉｒｔｚ．Ｄ．Ａ．，（１９９９）前掲）、抗癌剤によるそのような本来的役割に鑑みれば、ＲＯＳの全身性の除去は化学療法薬の有効性を著しく減じる可能性があるからである。 In the present invention, the administration route and dosage form of the composition are not particularly limited as long as the effect of treating or preventing hand-foot syndrome is exerted, but administration of a chemotherapeutic agent already known to cause onset of hand-foot syndrome It is preferable that the effect of the chemotherapeutic agent is not impaired when it is applied to a subject who is scheduled to be treated, and a subject who is continuing to administer the chemotherapeutic agent that causes the onset of hand-foot syndrome. That is, as described above, it has been reported that apoptosis of cancer is induced by active oxygen (hereinafter also referred to as “ROS”) directly or indirectly generated by an anticancer agent (Hiraoka W et al., ( 1998) supra; Tada-Oikawa S et al., (1999) supra; Varbiro G et al., (2001) supra; Murata M et al., (2004) supra; Sadzuka Y et al., (2005) supra; Gewirt.D.A., (1999) supra), in view of such an inherent role by anticancer agents, systemic removal of ROS may significantly reduce the effectiveness of chemotherapeutic drugs.
したがって、本発明の組成物は、一実施態様において、ＲＯＳを捕捉または除去する物質を、手足症候群病変部位に局所的に送達する剤形、例えば皮膚外用剤の形態とすることができる。そのような皮膚外用剤は、例えば皮膚外用医薬品として提供することができる。 Therefore, the composition of the present invention can be in one embodiment in the form of a dosage form that locally delivers a substance that captures or removes ROS to the site of hand-foot syndrome lesions, such as a topical skin preparation. Such an external preparation for skin can be provided, for example, as an external preparation for skin.
本発明の皮膚外用医薬品において、ＲＯＳを捕捉または除去する物質の配合量は、効果的に手脚症候群の症状を改善することができ、かつ、他の有害な副作用を生じない範囲であれば特に制限されないが、例えば０．００１〜３０（ｗ／ｗ）％、好ましくは０．０１〜１０（ｗ／ｗ）％、例えば５（ｗ／ｗ）％とすることができる。 In the external preparation for skin of the present invention, the amount of a substance that captures or removes ROS is particularly limited as long as it can effectively improve symptoms of hand-limb syndrome and does not cause other harmful side effects. Although not, for example, 0.001 to 30 (w / w)%, preferably 0.01 to 10 (w / w)%, for example, 5 (w / w)% can be used.
本発明の皮膚外用医薬品には、有効成分の他、皮膚外用剤に一般的に用いられる成分、例えば、これに限定されるものではないが、水、界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤）、液体または固体油脂、ロウ、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル油、シリコーン油、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルション、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、酸化防止剤、香料等を適宜配合し、目的とする製品形態に応じて常法に従って製造することができる。 The skin external preparation of the present invention includes active ingredients and components generally used for skin external preparations such as, but not limited to, water, surfactants (anionic surfactants, cationic interfaces). Activators, amphoteric surfactants or nonionic surfactants), liquid or solid oils, waxes, hydrocarbon oils, higher fatty acids, higher alcohols, ester oils, silicone oils, thickeners, film agents, UV absorbers, metals Ion sequestering agents, lower alcohols, sugars, amino acids, organic amines, polymer emulsions, pH adjusters, skin nutrients, antioxidants, fragrances, etc. are appropriately blended and manufactured according to conventional methods according to the target product form. be able to.
本発明の皮膚外用医薬品の形態は特に制限されず、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、液剤、ローション剤、エアゾール剤、パップ剤、化粧用シート剤などの形態で提供することができる。 The form of the external preparation for skin of the present invention is not particularly limited, and can be provided in the form of an ointment, gel, cream, liquid, lotion, aerosol, poultice, cosmetic sheet and the like.
本発明の皮膚外用医薬品は、単剤で使用してもよいし、手足症候群の治療に用いられる他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。そのような薬剤として、例えば、保湿剤、抗生物質、ステロイド外用剤、ステロイド内服薬、非ステロイド性消炎鎮痛剤等が挙げられる。 The external preparation for skin of the present invention may be used alone or in combination with other drugs used for the treatment of hand-foot syndrome. Examples of such drugs include humectants, antibiotics, topical steroids, oral steroids, non-steroidal anti-inflammatory analgesics and the like.
本発明の皮膚外用医薬品は、化学療法薬の投与に起因して手足症候群を発症している患者の他、化学療法薬の投与を予定している癌患者に対して予防的に使用してもよい。 The topical pharmaceutical preparation of the present invention can be used prophylactically for cancer patients who are scheduled to receive a chemotherapeutic drug in addition to patients who develop hand-foot syndrome due to the administration of the chemotherapeutic drug. Good.
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
１．手足症候群発症モデルの作製
薬剤の種類に応じた手足症候群の発症頻度については次のような報告がある：ＰＥＧＬ−ＤＯＸ（最高で約７８％）；カペシタビン（５１〜７８％）；ソラフェニブ（約５５％）（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｌａｂｏｕｒ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ，２０１０）。そこで手足症候群発症モデルの作製のために、発症頻度の最も高いＰＥＧＬ−ＤＯＸを採用することとした。
1. Creation of a hand-foot syndrome onset model The frequency of hand-foot syndrome depending on the type of drug is reported as follows: PEGL-DOX (up to about 78%); capecitabine (51-78%); sorafenib (about 55) %) (Ministry of Health, Labour and Welfare, 2010). Therefore, in order to prepare a hand-foot syndrome onset model, PEGL-DOX having the highest onset frequency was adopted.
（１）ＰＥＧＬ−ＤＯＸ（ドキソルビシンＰＥＧ化リポソーム製剤）の調製
粒子径を統一するためのフィルターによる分割および作製後の平均粒子径の確認を行わなかったこと以外は、既報（Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ．，２００５、前掲）に従ってＰＥＧ化リポソーム製剤を作製した。
(1) Preparation of PEGL-DOX (Doxorubicin PEGylated Liposome Formulation) Previously reported (Sadzuka Y., 2005), except that the particle size was not divided by a filter and the average particle size after production was not confirmed. A PEGylated liposome preparation was prepared according to the above).
すなわち、Ｌ−α−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ＤＬ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＥＧ修飾レシチン；ＤＳＰＧ）およびレシチン（それぞれ日油株式会社製）を、メタノールおよびクロロホルムを１：４に混合した溶媒に溶解し、３５℃の温浴中でロータリーエバポレーターにて溶媒を除去し、ナスフラスコ面に薄膜を形成した。フラスコ内にＤＯＸ水溶液（２０％水溶液；日本化薬株式会社製）とソルビトール／乳酸溶液を添加し、６０℃の温浴中で１５分撹拌した。その後超音波照射を３分間実施し０．２ｗ／ｖ％のＰＥＧＬ−ＤＯＸ溶液を得た。 That is, L-α-distearoylphosphatidyl-DL-glycerol (PEG-modified lecithin; DSPG) and lecithin (manufactured by NOF Corporation, respectively) were dissolved in a solvent in which methanol and chloroform were mixed 1: 4 in a 35 ° C. warm bath. The solvent was removed with a rotary evaporator, and a thin film was formed on the eggplant flask surface. A DOX aqueous solution (20% aqueous solution; manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.) and a sorbitol / lactic acid solution were added to the flask and stirred in a 60 ° C. warm bath for 15 minutes. Thereafter, ultrasonic irradiation was performed for 3 minutes to obtain a 0.2 w / v% PEGL-DOX solution.
（２）手足症候群モデルの作製
（２−１）ＰＥＧＬ−ＤＯＸの尾静注モデル
高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）または低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＧＬ−ＤＯＸ溶液を、日本ＳＬＣ株式会社より購入した７週齢の雌ＳＤラットに単回または反復投与（３日に１回投与を３回）した（尾静注）。
(2) Preparation of hand-foot syndrome model (2-1) Intravenous tail model of PEGL-DOX A high dose (10 mg / kg) or low dose (5 mg / kg) PEGL-DOX solution was purchased from Japan SLC Co., Ltd. Seven-week-old female SD rats were administered once or repeatedly (once every 3 days for 3 times) (tail vein injection).
単回投与群では、ＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与直後から前肢掌、肢底、耳介、鼻先に発赤が出現したが、生じた発赤は一過性で５〜１０分で消失した。一方、ＰＥＧＬ−ＤＯＸの反復投与群では５ｍｇ／ｋｇの低用量で四肢末梢部の炎症所見が観察され、高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）ではその傾向が顕著であった（図１）。 In the single administration group, redness appeared on the palms of the forelimbs, limbs, ears, and nose immediately after the administration of PEGL-DOX, but the resulting redness was transient and disappeared in 5-10 minutes. On the other hand, in the repeated administration group of PEGL-DOX, inflammatory findings in the peripheral part of the limbs were observed at a low dose of 5 mg / kg, and the tendency was remarkable at a high dose (10 mg / kg) (FIG. 1).
また反復投与群では、手足に障害が生じることが観察されたが、全身の皮膚への影響は顕著ではなく若干の乾燥状態が観察されたのみであった。これはヒトにＤｏｘｉｌ（登録商標）を投与した際に観察される症状に酷似していた（Ｇｅｗｉｒｔｚ．Ｄ．Ａ．，１９９９、前掲）。したがって、ＰＥＧＬ−ＤＯＸの投与により、前肢掌および後肢足底に手足症候群が発症したと判断した。 In the repeated administration group, it was observed that the limbs were damaged, but the effect on the skin of the whole body was not significant, and only a slight dry state was observed. This was very similar to the symptoms observed when Doxil® was administered to humans (Gewirtz DA, 1999, supra). Therefore, it was judged that PEGL-DOX administration caused limb syndrome in the forelimb palm and hindlimb sole.
（２−２）ドキソルビシンの局所注射モデル
ＰＥＧＬ−ＤＯＸ尾静注による場合、重篤な手足症候群を惹起するためには比較的高濃度のＰＥＧＬ−ＤＯＸの投与が必要であるため、手足症候群の症状を発症する前に動物が死亡してしまうという問題があった。そこで、ドキソルビシンをラットの肢底部に皮内投与することによる手足症候群の惹起を試みた。
０．０８％に調製したドキソルビシン生理食塩水溶液を、日本ＳＬＣ株式会社より購入した８週齢の雌ＳＤラットの前肢および後肢足底部に４０μｌずつ皮内投与したところ、投与後２日でラット足底部および甲に炎症性の発赤や腫脹、落屑など、手足症候群の症状と酷似する所見が観察された。
そこで、本モデルを手足症候群発症の第２のモデルとして使用した。
(2-2) Local injection model of doxorubicin In the case of intravenous injection of PEGL-DOX, since it is necessary to administer a relatively high concentration of PEGL-DOX in order to cause severe limb syndrome, symptoms of limb syndrome There was a problem that animals died before the onset. Therefore, we attempted to induce hand-foot syndrome by intradermal administration of doxorubicin to the limb bottom of rats.
A physiological saline solution of doxorubicin prepared at 0.08% was administered intradermally to the forelimbs and hind limbs of 8-week-old female SD rats purchased from Japan SLC Co., respectively. In addition, findings similar to those of hand-foot syndrome, such as inflammatory redness, swelling, and desquamation, were observed.
Therefore, this model was used as a second model for the development of hand-foot syndrome.
２．手足症候群モデルラットの病理解析
手足症候群発症部位の病理解析を行うために、上記（２−１）に従って手足症候群が発症した高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットから採取した皮膚組織を組織学的に評価した。組織学的評価は、Ｈ&Ｅ染色、ピクロシリウスレッド染色およびＴＵＮＥＬ染色を用い、それぞれ無投与コントロール群と比較することにより行った。
2. Pathological Analysis of Hand-foot Syndrome Model Rat In order to perform pathological analysis of the hand-foot syndrome onset site, skin tissue collected from a high-dose (10 mg / kg) PEGL-DOX repeated administration rat that developed hand-foot syndrome according to (2-1) above was used. Histologically evaluated. Histological evaluation was performed by using H & E staining, Picrosirius red staining, and TUNEL staining, respectively, and comparing with the non-administration control group.
（１）ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ&Ｅ）染色
ホルマリン固定してパラフィン包埋した皮膚組織を４μｍの厚さで切片を作製した。脱パラフィンした後、再水和し、Ｈ&Ｅ染色を行い、前肢手掌および後肢足底部の組織像を光学顕微鏡にて観察を行った。
(1) Hematoxylin and eosin (H & E) staining Formalin-fixed and paraffin-embedded skin tissue was sliced to a thickness of 4 μm. After deparaffinization, rehydration was performed, H & E staining was performed, and tissue images of the palm of the forelimb and the sole of the hindlimb were observed with an optical microscope.
（２）ピクロシリウスレッド染色
真皮の膠原線維の様子を詳細に観察するため、ピクロシリウスレッド染色を行い、偏光顕微鏡にて観察を行った。
(2) Picrosirius Red Staining In order to observe the state of collagen fibers in the dermis in detail, picrosirius red staining was performed and observed with a polarizing microscope.
（３）ＴＵＮＥＬ染色
アポトーシスを検出するためにＴＵＮＥＬ染色を行った。ＤｅａｄＥｎｄＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ株式会社製）を使用してＴＵＮＥＬ染色し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。
(3) TUNEL staining To detect apoptosis, TUNEL staining was performed. The sample was stained with TUNEL using a DeadEnd ™ Fluorometric TUNEL system kit (manufactured by Promega Corporation) and observed with a fluorescence microscope.
結果を図２に示す。高用量ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットの肢底部皮膚のＨ&Ｅ染色では、無投与コントロール群に比較して、顆粒層が菲薄化または消失し、基底層から有棘層にかけて細胞数が減少し、細胞間は粗な配列を呈しており、表皮層の菲薄化が顕著であった（図２ａ）。一方、真皮層の線維芽細胞は正常状態とほぼ同等であった。 The results are shown in FIG. In the H & E staining of the skin of the limbs of the high-dose PEGL-DOX repeated administration rats, the granule layer was thinned or disappeared, and the number of cells decreased from the basal layer to the spiny layer compared with the non-administration control group. Had a rough arrangement, and the skin layer was markedly thinned (FIG. 2a). On the other hand, the dermal fibroblasts were almost equivalent to the normal state.
図２ｂにピクロシリウスレッド染色（コラーゲン線維の染色）結果を示す。赤く高輝度で観察される程太いコラーゲン線維束が多く、黄色〜緑で低輝度になるほど配列の乱れもしくは断裂状態を示す。図２ｂから明らかな通り、ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットでは真皮層のコラーゲン線維の配列が乱れ、線維の断裂が顕著であった。 FIG. 2b shows the results of picrosirius red staining (collagen fiber staining). The thicker the collagen fiber bundles are, the more red the color is observed with high luminance. The lower the luminance is yellow to green, the more disordered the array or the broken state. As is apparent from FIG. 2b, in the PEDL-DOX repeated administration rat, the collagen fiber arrangement in the dermis layer was disturbed, and the fiber was severed.
図２ｃにＴＵＮＥＬ染色結果を示す。緑色はアポトーシスが誘導されている細胞を示している。ＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与モデルでは、表皮基底細胞のアポトーシスが誘導されていた。 FIG. 2c shows the result of TUNEL staining. Green indicates cells in which apoptosis is induced. In the PEGL-DOX administration model, apoptosis of epidermal basal cells was induced.
以上の結果は、手足症候群発症部位においては、表皮層の細胞減少に伴う菲薄化、真皮層のコラーゲン破壊、表皮基底細胞のアポトーシスが認められることを示しており、その結果、炎症症状が引き起こされていると考えられる。 The above results indicate that at the onset of hand-foot syndrome, thinning due to cell loss of the epidermis, collagen destruction of the dermis, and apoptosis of epidermal basal cells are observed, resulting in inflammatory symptoms. It is thought that.
３．手足症候群発症原因の解析
（１）ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン分析
手足症候群が発症する原因を解明するために、上記（２−１）に従うＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与後の後肢の皮膚組織を採取し、発現しているサイトカインおよびケモカインを測定した。採取した皮膚組織をホモジナイズした後、遠心して上清を回収しＲａｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）にて検出を行った。
3. Analysis of the cause of hand-foot syndrome (1) In vivo cytokine analysis In order to elucidate the cause of hand-foot syndrome, the skin tissue of the hind limb after administration of PEGL-DOX according to (2-1) above is collected and expressed Cytokines and chemokines were measured. After the collected skin tissue was homogenized, the supernatant was collected by centrifugation and detected by Rat Cytokine Antibody Array (manufactured by RayBiotech).
その結果を図３に示す。ケモカインであるＣＩＮＣ３やＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅの発現およびＩＬファミリーの産生抑制に働くＩＬ−１０産生が顕著で、同時に炎症系サイトカインであるＩＬ−１βやＩＬ−６の発現亢進も確認された。 The result is shown in FIG. The expression of chemokines such as CINC3 and Fractalkine and the production of IL-10 that act to suppress the production of the IL family were remarkable, and at the same time, increased expression of IL-1β and IL-6, which are inflammatory cytokines, was also confirmed.
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン分析
ＤＯＸによる皮膚組織内細胞への影響を確認するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験をさらに実施した。表皮層および真皮層への影響を比較するために、それぞれＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト由来株化細胞；神戸大学医学部より受領）と正常ヒト真皮線維芽細胞であるＮＨＤＦ（倉敷紡績株式会社製）とを用いた。具体的には、各培養細胞にＤＯＸ（１．５μＭ）を添加して２４時間培養した後、培地中のサイトカインをＬｕｍｉｎｅｘ２００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（図４ａ）またはＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）（図４ｂ）にて検出を行った。検出対象のサイトカインは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生が亢進していたケモカインであるＩＬ−８、ＧＲＯ（いずれもラットＣＩＮＣ３に相当する）およびＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、並びに炎症性サイトカインＩＬ−１およびＩＬ−６とした。
(2) In Vitro Cytokine Analysis In order to confirm the influence of DOX on cells in the skin tissue, in vitro experiments were further performed. In order to compare the effects on the epidermis and dermis, HaCaT cells (human keratinocyte-derived cell lines; received from Kobe University School of Medicine) and normal human dermal fibroblasts NHDF (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) Using. Specifically, after adding DOX (1.5 μM) to each cultured cell and culturing for 24 hours, the cytokine in the medium was changed to Luminex200 system (manufactured by Millipore) (FIG. 4a) or Human Cytokine Antibody Array (manufactured by RayBiotech). ) (FIG. 4b). The cytokines to be detected were IL-8, GRO (all corresponding to rat CINC3) and Fractalkine, and inflammatory cytokines IL-1 and IL-6, which were chemokines whose production was enhanced in vivo.
また、サイトカイン産生量への活性酸素（ＲＯＳ）の関与を評価するために、銅（ＩＩ）イオンとして塩化銅（ＩＩ）（和光純薬社製）を培地にさらに添加した系においても同様の実験を行った。 In addition, in order to evaluate the involvement of active oxygen (ROS) in cytokine production, a similar experiment was conducted in a system in which copper (II) chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was further added to the medium as copper (II) ions. Went.
結果を図４に示す。ＨａＣａＴにおいて、ＤＯＸ １．５μＭの存在だけでは、３種のケモカイン産生は増加しなかった（図４ａ）。一方、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオン共存下（５０および３７５μＭ）では、各ケモカインの産生量は増加し、ＧＲＯおよびＩＬ−８は、Ｃｕ（ＩＩ）イオン濃度が高いほどその産生量は増加した。一方、ＮＨＤＦにおいては、ＤＯＸ添加やＣｕ（ＩＩ）イオン共存による変化はほとんどなく、むしろＤＯＸ存在下で各種ケモカイン産生量は抑制される傾向が観察された。 The results are shown in FIG. In HaCaT, the presence of DOX 1.5 μM alone did not increase the production of the three chemokines (FIG. 4a). On the other hand, in the presence of DOX and copper (II) ions (50 and 375 μM), the production amount of each chemokine increased, and the production amounts of GRO and IL-8 increased as the Cu (II) ion concentration increased. On the other hand, in NHDF, there was almost no change due to the addition of DOX or the coexistence of Cu (II) ions. Rather, various chemokine productions were observed to be suppressed in the presence of DOX.
炎症性サイトカインについても、ＤＯＸおよび／または銅（ＩＩ）イオンによる影響は細胞種によって変化した（図４ｂ）。ＨａＣａＴ細胞はＤＯＸの存在下ではＩＬ−１αおよびＩＬ−６の産生を増加し、その産生はＤＯＸ存在下でＣｕ（ＩＩ）イオンの添加によってさらに増強された。ＩＬ−１βの産生は高濃度の銅（ＩＩ）イオンとＤＯＸの併存下で上昇した。対照的に、ＮＨＤＦ細胞はＤＯＸのみの場合には考慮すべき反応を示さなかったが、銅（ＩＩ）イオンの併存下ではＩＬ−１βの産生増加を刺激した。 Also for inflammatory cytokines, the effects of DOX and / or copper (II) ions varied with cell types (FIG. 4b). HaCaT cells increased IL-1α and IL-6 production in the presence of DOX, which was further enhanced by the addition of Cu (II) ions in the presence of DOX. IL-1β production increased in the presence of high concentrations of copper (II) ions and DOX. In contrast, NHDF cells did not respond to DOX alone, but stimulated increased production of IL-1β in the presence of copper (II) ions.
以上のとおり、ＤＯＸが表皮細胞においてケモカインＩＬ−８、ＧＲＯおよびＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αの産生を増強し、真皮細胞においてＩＬ−１βの産生を増強すること、並びにこの産生増強は銅（ＩＩ）イオン依存的に認められることが示された。これらの結果は、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオン共存下で産生が増強されるＲＯＳが、これらのサイトカインの産生増強に関与している可能性を示唆している。 As described above, DOX enhances the production of chemokines IL-8, GRO and Fractalkine, inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and IL-1α in epidermal cells, and enhances the production of IL-1β in dermal cells As well as this production enhancement, it was shown to be dependent on copper (II) ions. These results suggest that ROS whose production is enhanced in the presence of DOX and copper (II) ions may be involved in enhancing production of these cytokines.
（３）ＤＯＸ毒性評価試験
ＤＯＸの毒性評価のために、培養細胞ＨａＣａＴとＮＨＤＦ（前掲）を使用した毒性評価試験を行った。すなわち、培地に１．５μＭ ＤＯＸを添加し、２４時間後の生細胞の割合をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＣＣＫ８）（ＤＯＪＩＮＤＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を使用して測定した。銅（ＩＩ）イオン共存下の毒性試験は、１．５μＭのＤＯＸを含む培地に、５０μＭまたは３７５μＭの塩化銅（和光純薬社製）を添加した。
(3) DOX toxicity evaluation test For toxicity evaluation of DOX, a toxicity evaluation test using cultured cells HaCaT and NHDF (supra) was conducted. That is, 1.5 μM DOX was added to the medium, and the percentage of living cells after 24 hours was measured using Cell Counting kit-8 (CCK8) (manufactured by DOJINDO LABORATORIES). In the toxicity test in the presence of copper (II) ions, 50 μM or 375 μM copper chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a medium containing 1.5 μM DOX.
また、ＤＯＸによる皮膚組織破壊とＲＯＳの関与を調べるために、１．５μＭ ＤＯＸ、５０μＭ塩化銅（ＩＩ）および１００μｇ／ｍｌ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＨａＣａＴ培養培地に添加して、１２時間後の生存率を測定した。 In addition, in order to examine the involvement of ROS and skin tissue destruction by DOX, 1.5 μM DOX, 50 μM copper (II) chloride and 100 μg / ml superoxide dismutase (SOD) (manufactured by Sigma Aldrich) were added to the HaCaT culture medium. The survival rate after 12 hours was measured.
ＤＯＸを添加しなかった場合には、ＨａＣａＴ細胞の生存率は５０μＭ塩化銅（ＩＩ）添加時に約２０％低下したが、高濃度の３７５μＭを添加した場合でも同程度であった。ＤＯＸの存在下では、細胞の生存率は銅（ＩＩ）イオン濃度の増加に伴って急速に低下した（図５）。これは、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオンが共存することによるＲＯＳの産生促進が、細胞の生存率を低下させたことを示唆している。一方、ＮＨＤＦ細胞はＤＯＸおよび銅（ＩＩ）イオンの組み合わせによる生存率への顕著な影響は認められなかった。ＨａＣａＴとＮＨＤＦの間において、ＲＯＳによる細胞障害に差が見られたことは、手足症候群モデル動物の皮膚組織像とよく相関していた。 In the case where DOX was not added, the survival rate of HaCaT cells was reduced by about 20% when 50 μM copper (II) chloride was added, but it was similar even when a high concentration of 375 μM was added. In the presence of DOX, cell viability decreased rapidly with increasing copper (II) ion concentration (FIG. 5). This suggests that the promotion of ROS production due to the coexistence of DOX and copper (II) ions reduced the cell viability. On the other hand, NHDF cells did not have a significant effect on the survival rate by the combination of DOX and copper (II) ions. The difference in the cell damage caused by ROS between HaCaT and NHDF correlated well with the skin tissue image of the hand-foot syndrome model animal.
また、ＲＯＳを捕捉することが知られているＳＯＤの添加は、ＨａＣａＴ細胞の生存率を改善した（図６）。 Moreover, the addition of SOD, which is known to capture ROS, improved HaCaT cell viability (FIG. 6).
以上の結果から、手足症候群の病態は、抗癌剤と皮膚内に存在する銅（ＩＩ）イオンとの相互作用により発生したＲＯＳが、表皮細胞におけるケモカインおよび炎症性サイトカイン類の産生を促進し、その結果、血管拡張、発赤、熱感が現れ、血管透過性が亢進し膨張する手足症候群の炎症症状が発現されることが示された。 From the above results, ROS generated by the interaction between anticancer drugs and copper (II) ions present in the skin promotes the production of chemokines and inflammatory cytokines in the epidermal cells. In addition, vasodilation, redness, and hot sensation appeared, and it was shown that inflammatory symptoms of hand-foot syndrome, in which vascular permeability increases and swells, are expressed.
一方、ＨａＣａＴを用いた細胞毒性試験において、ＳＯＤの添加によって、細胞生存率の改善が認められたことから、ＲＯＳを捕捉または除去する成分が、手足症候群の治療または予防に有効であることが示された。 On the other hand, in the cytotoxicity test using HaCaT, the addition of SOD showed improvement in cell viability, indicating that the component that captures or removes ROS is effective for the treatment or prevention of hand-foot syndrome. It was done.
４．手足症候群の発症抑制試験
本試験には、上記（２−２）ドキソルビシンの局所注射による手足症候群発症動物モデルを用いた。
１％スーパーオキシドジスムターゼ生理食塩水溶液（ＳＯＤ）を、８週齢の雌ＳＤラット前肢および後肢足底部に４０μｌずつ皮内投与した。陰性対照としてＳＯＤを含まない生理食塩水のみの投与群も用意した。ＳＯＤ投与２４時間後、０．０８％ドキソルビシンを同じ部位に皮内投与した。ＳＯＤまたは生理食塩水、およびドキソルビシンの投与はそれぞれ１回のみとし、手足症候群の発症とその経過を１７日間観察した。観察最終日に前肢・後肢の掌および甲の皮膚を採取してホルマリン固定し、パラフィン包埋を行って組織切片を作製した。Ｈ&Ｅ染色を行って、肢皮膚の状態を観察した。表皮の厚さは、画像処理ソフトウェアＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ４．８（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）によって計測し、群間の比較はＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔによる統計処理を行った。
4). Onset suppression test of hand-foot syndrome In this test, the animal model of onset of hand-foot syndrome by local injection of (2-2) doxorubicin was used.
A 1% superoxide dismutase saline solution (SOD) was intradermally administered to the forelimbs and hind limbs of 8-week-old female SD rats by 40 μl. As a negative control, an administration group of only saline containing no SOD was also prepared. Twenty-four hours after SOD administration, 0.08% doxorubicin was administered intradermally at the same site. SOD or physiological saline and doxorubicin were administered only once, and the onset of limb syndrome and its course were observed for 17 days. On the last day of observation, the skin of the palms and back of the forelimbs and hind limbs were collected and fixed in formalin, and embedded in paraffin to prepare tissue sections. H & E staining was performed to observe the condition of the limb skin. The thickness of the epidermis was measured by image processing software Axio Vision 4.8 (manufactured by Carl Zeiss), and comparison between groups was performed statistical processing by Welch's t test.
０．０８％ドキソルビシンをラット足底部に投与することで足底部に炎症性の発赤や腫脹、落屑などの手足症候群でみられる症状が、ＳＯＤ投与群および生理食塩水投与群において異なる程度で観察された。陰性対照の生理食塩水投与群（ｎ＝２、（前肢ｎ＝４、後肢ｎ＝４））に比較して、１％ＳＯＤ投与群（ｎ＝２、（前肢ｎ＝４、後肢ｎ＝４））は発赤や腫脹の程度はやや弱く、正常状態への回復が早いことが観察された。生理食塩水投与群では、前肢甲にも発赤や腫脹が確認された。これに対し、１％ＳＯＤ投与群では前肢甲における諸症状は著しく軽減された。 When 0.08% doxorubicin is administered to the sole of the rat, symptoms of hand-foot syndrome such as inflammatory redness, swelling, and desquamation are observed at different levels in the SOD administration group and the physiological saline administration group. It was. Compared to the negative control physiological saline-administered group (n = 2, (front limb n = 4, hind limb n = 4)), the 1% SOD administration group (n = 2, (fore limb n = 4, hind limb n = 4) In the case of)), the degree of redness and swelling was slightly weak, and it was observed that recovery to normal state was quick. In the physiological saline administration group, redness and swelling were also confirmed in the forelimb instep. In contrast, in the 1% SOD administration group, various symptoms in the forelimb instep were remarkably reduced.
Ｈ&Ｅ染色による前肢甲の皮膚組織像を観察したところ、陰性対照の生理食塩水投与群は炎症性の表皮肥厚が観察された（図７ａ〜ｃ）。１％ＳＯＤ投与群は有意に炎症性の表皮肥厚を抑制しており、その程度はわずかであった（図７ｄ〜ｆ）。表皮の厚さを染色組織像６０〜８０か所で測定したところ、１％ＳＯＤ投与群において有意な抑制効果が認められた（ｐ<０．００１）（図８）。 When the skin tissue image of the forelimb instep by H & E staining was observed, inflammatory epidermis thickening was observed in the negative saline control group (FIGS. 7a to 7c). The 1% SOD administration group significantly suppressed inflammatory epidermal thickening, and the degree thereof was slight (FIGS. 7d to f). When the thickness of the epidermis was measured at 60 to 80 stained tissue images, a significant inhibitory effect was observed in the 1% SOD administration group (p <0.001) (FIG. 8).
このように、ＲＯＳを捕捉または除去することが可能な抗酸化剤を事前に投与しておくことで、手足症候群の発症またはその症状を効果的に低減することができた。したがって、ＲＯＳを捕捉または除去する物質は、手足症候群の治療または予防に有用であることが示された。 As described above, by pre-administering an antioxidant capable of capturing or removing ROS, it was possible to effectively reduce the onset of limb syndrome or its symptoms. Therefore, substances that capture or remove ROS have been shown to be useful in the treatment or prevention of hand-foot syndrome.
本発明によれば、手足症候群の治療または予防に有用な組成物が提供される。本発明の組成物は、手足症候群の患者向けの皮膚外用剤、例えば手足症候群治療用医薬品として提供される点で産業上の利用可能性を有している。 According to the present invention, a composition useful for the treatment or prevention of hand-foot syndrome is provided. The composition of the present invention has industrial applicability in that it is provided as a skin external preparation for patients with hand-foot syndrome, for example, a pharmaceutical product for treating hand-foot syndrome.
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