JP2014103867A

JP2014103867A - Hyperthermophilic duplex-specific nuclease

Info

Publication number: JP2014103867A
Application number: JP2012257763A
Authority: JP
Inventors: Yuzo Hirakawa; 雄三平川; Isao Oiso; 勲大磯
Original assignee: Nishikawa Rubber Co Ltd
Current assignee: Nishikawa Rubber Co Ltd
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2014-06-09

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a hyperthermophilic duplex-specific nuclease (DSN) and a method for cleaving nucleic acid using it.SOLUTION: Provided are a protein derived from Coenobitidae having duplex-specific nuclease activity, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, and a transformant or transductant including the vector. Also provided is a method for obtaining a protein having duplex-specific nuclease activity characterized by culturing the transformant or transductant in a culture medium, and collecting the protein having duplex-specific nuclease activity from the culture. Also provided are a method for cleaving nucleic acid by using the protein having duplex-specific nuclease activity, and a method for detecting RNA using the protein, and a reagent kit containing the protein.

Description

本発明は、超好熱性二本鎖特異的核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ：以下、ＤＳＮとも記載する）活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規なＤＳＮ活性を有するタンパク質、および該タンパク質の製造方法に関する。また該タンパク質を用いる核酸の切断方法および該タンパク質を用いるＲＮＡ検出方法、並びに該タンパク質を含む試薬キットに関する。 The present invention relates to a protein having a hyperthermophilic double-strand specific nuclease (duplex-specific nuclease: hereinafter also referred to as DSN) activity and a gene encoding the protein. The present invention also relates to a novel protein having a DSN activity that can be easily produced using a recombinant protein expression technique, and a method for producing the protein. The present invention also relates to a method for cleaving nucleic acid using the protein, a method for detecting RNA using the protein, and a reagent kit containing the protein.

これまでいくつかの甲殻類、特にエビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）の消化腺または肝膵臓中に、ＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）活性を示すヌクレアーゼが見出されている。その中のいくつかは、二本鎖核酸に高度に特異的なＤＮａｓｅ活性を示すことから、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＳＮ）と呼ばれている。 So far, nucleases exhibiting DNase (DNA-degrading enzyme) activity have been found in digestive glands or hepatopancreas of several crustaceans, especially Decapoda (Decapoda) such as shrimp and crab. Some of them are called double-stranded specific nucleases (DSNs) because they exhibit DNase activity highly specific to double-stranded nucleic acids.

１．Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
エビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）由来のヌクレアーゼは、最初にクダヒゲエビ科のＳｏｌｅｎｏｃｅｒａｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）から肝膵臓由来ＤＮａｓｅとして精製された（非特許文献１）。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、ウシ肝膵臓由来ＤＮａｓｅよりも大きな分子量（約４４ｋＤａ）を持っていた。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは糖鎖を持たないことが確認され、その分子量が大きいのはポリペプチド鎖が長いためであると考えられた。 1. Solenocera melantho DNase
Nucleases derived from Decapoda (decapoda) such as shrimps and crabs were first purified as hepatopancreas-derived DNase from Solenocera melantho (Namididae) (Non-patent Document 1). Namida tiger shrimp DNase had a higher molecular weight (about 44 kDa) than DNase derived from bovine hepatopancreas. It was confirmed that Namida tiger shrimp DNase had no sugar chain, and the molecular weight was large because the polypeptide chain was long.

ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、金属イオン要求性と至適活性ｐＨはウシ膵臓由来ＤＮａｓｅとよく似ており、ＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）活性は示さなかった。またナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、トリプシン消化に対する耐性を持つことが示された。アミノ酸組成の解析結果から、ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは３６のＣｙｓ残基による１８のジスルフィド結合によって高度に分子内架橋されていることが示された。 Namididae shrimp DNase was similar to bovine pancreatic DNase in metal ion requirement and optimum activity pH, and did not show RNase (RNA-degrading enzyme) activity. Also, it was shown that Namikuda shrimp DNase has resistance to trypsin digestion. The analysis results of amino acid composition showed that Namida tiger shrimp DNase was highly intramolecularly cross-linked by 18 disulfide bonds with 36 Cys residues.

２．Ｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
クルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献２）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献３）。クルマエビヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ活性に加えて、低いレベルのＲＮａｓｅ活性を示した。アミノ酸配列の相同性から、クルマエビヌクレアーゼは、ウシＤＮＡ分解酵素Ｉ様タンパク質（ｂｏｖｉｎｅＤＮａｓｅ−Ｉ−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）よりむしろ霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼに代表されるＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼ（ＤＲＮＳＮ）のファミリーに属することが示された。 2. Penaeus japonicus (Kuruma prawn) DNase
A similar nuclease was purified from the hepatopancreas of Penaeus japonicus (Non-patent document 2), and the cDNA sequence was revealed (Non-patent document 3). Shrimp nuclease showed low levels of RNase activity in addition to DNase activity. Due to amino acid sequence homology, prawn nuclease is a DNA / RNA non-specific endonuclease (DRNSN) typified by Serratia marcescens nuclease rather than bovine DNase-I-like protein. ) Family.

クルマエビヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０２アミノ酸残基あり、３８１残基の成熟酵素と２１残基の推定シグナルペプチドから成る。クルマエビヌクレアーゼは、１１のＣｙｓ残基を持っており、それらのうちの１０のＣｙｓ残基が５つの分子内ジスルフィド結合を形成し、残る１つのＣｙｓ残基は、分子量５００〜７００Ｄａと推定されるチオール化合物に結合していた。Ｗａｎｇらは大腸菌中でクローンしたヌクレアーゼ遺伝子を発現させたが、発現したタンパク質はヌクレアーゼ活性を示さなかった（非特許文献３）。 The amino acid sequence of the prawn nuclease has 402 amino acid residues and consists of a 381 residue mature enzyme and a 21 residue putative signal peptide. The prawn nuclease has 11 Cys residues, of which 10 Cys residues form 5 intramolecular disulfide bonds, and the remaining 1 Cys residue is estimated to have a molecular weight of 500-700 Da Bound to the thiol compound. Wang et al. Expressed a cloned nuclease gene in E. coli, but the expressed protein did not show nuclease activity (Non-patent Document 3).

３．Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
タラバガニ科Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献４）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献５）。タラバガニヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０７アミノ酸残基あり、３８０残基の成熟酵素と２７残基の推定シグナルペプチドから成り、クルマエビヌクレアーゼの配列と６４％の同一性を有していた。 3. Paralythodes camtchaticus (king crab) DSN
A similar nuclease was purified from the liver and pancreas of the king crab family Paralithodes camtschaticus (Non-patent Document 4), and its cDNA sequence was revealed (Non-patent Document 5). The amino acid sequence of the red king crab nuclease has 407 amino acid residues, which consists of a mature enzyme of 380 residues and a putative signal peptide of 27 residues, and has 64% identity with the sequence of the cari shrimp nuclease.

タラバガニヌクレアーゼ配列もまたＤＲＮＳＮに共通するＮＵＣドメインを有していたが、精製酵素のキャラクタリゼーションの結果、驚くべきことに、タラバガニヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡ基質に強い切断選択性を示し、一本鎖ＤＮＡにはほとんど活性を示さなかった。またタラバガニヌクレアーゼはＲＮＡ基質に対してほとんど切断活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖においては、その中のＤＮＡ分子のみを効率良く切断した。またミスマッチを含む短い二本鎖ＤＮＡに対してほとんど切断活性を示さなかった。ここにタラバガニヌクレアーゼの特徴的な基質特異性が明らかにされ、この酵素は“ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ”（ＤＳＮ）と呼ばれた（非特許文献５、非特許文献６）。 Although the king crab nuclease sequence also had a NUC domain common to DRNSN, as a result of the characterization of the purified enzyme, the king crab nuclease surprisingly showed strong cleavage selectivity for double stranded DNA substrates and was single stranded. The DNA showed little activity. In addition, king crab nuclease showed almost no cleavage activity for RNA substrates, and in the DNA-RNA hybrid duplex, only the DNA molecules therein were efficiently cleaved. Further, it showed almost no cleavage activity against short double-stranded DNA containing mismatches. Here, the characteristic substrate specificity of red king crab nuclease was clarified, and this enzyme was called “duplex-specific nuclease” (DSN) (Non-patent Documents 5 and 6).

Ｓｈａｇｉｎらは、タラバガニＤＳＮのｃＤＮＡをクローンし、推定シグナルペプチドを除いた成熟タラバガニＤＳＮを、Ｎ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として大腸菌中で発現させたが、組換えタンパク質は酵素活性を有していなかった（非特許文献５）。Ａｎｉｓｉｍｏｖａらは、大腸菌内で組換えＤＳＮ分子が凝集した封入体から、変性、リフォールディングおよび活性化を含む一連の手順を通じて、可溶性で酵素活性を有する組換えタラバガニＤＳＮを精製することに成功している（非特許文献７）。 Shagin et al. Cloned the king crab DSN cDNA and expressed mature king crab DSN, excluding the putative signal peptide, in E. coli as an N-terminal His-tag fusion protein, but the recombinant protein has no enzymatic activity. (Non-Patent Document 5). Anisimova et al. Succeeded in purifying soluble king crab DSN with soluble and enzymatic activity from inclusion bodies in which recombinant DSN molecules were aggregated in E. coli through a series of procedures including denaturation, refolding and activation. (Non-Patent Document 7).

また、本発明者らは以前に、タラバガニＤＳＮ遺伝子を単離し、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて、シグナルペプチド配列を有する該ＤＳＮ遺伝子から、組換えタラバガニＤＳＮの発現を行った。この結果、リフォールディングの必要のない可溶性の組換えタラバガニＤＳＮを発現および精製することに成功し、得られた組換えＤＳＮは天然由来のＤＳＮと同様の二本鎖特異的ヌクレアーゼ活性を示した（非特許文献８）。 In addition, the present inventors previously isolated a king crab DSN gene and expressed a recombinant king crab DSN from the DSN gene having a signal peptide sequence using a baculovirus-insect cell expression system. As a result, it succeeded in expressing and purifying soluble recombinant king crab DSN that does not require refolding, and the obtained recombinant DSN showed double-strand specific nuclease activity similar to that of naturally occurring DSN ( Non-patent document 8).

４．Ｐａｎｄａｌｕｓｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ＤＳＮ
タラバエビ科のＰａｎｄａｌｕｓｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）の消化腺から精製されたヌクレアーゼもまた二本鎖ＤＮＡ基質に対する切断選択性を有し、一本鎖ＤＮＡはほとんど分解しないことが示された（特許文献１）。このホッコクアカエビＤＳＮは、耐熱性を有するタラバガニＤＳＮとは対照的に、至適活性温度が２５℃であり、７０℃、３０分間または９４℃、２分間の加熱で失活する易熱性の酵素である。 4). Pandalus borealis DSN
Nuclease purified from the digestive gland of the kingfish shrimp Pandalus borealis has also been shown to have cleavage selectivity for double-stranded DNA substrates, with little degradation of single-stranded DNA (Patent Document 1). In contrast to heat-resistant king crab DSN, this pink shrimp DSN has an optimum activity temperature of 25 ° C. and is a heat-resistant enzyme that is inactivated by heating at 70 ° C., 30 minutes or 94 ° C. for 2 minutes. .

前記易熱性を利用したホッコクアカエビＤＳＮの用途として、ＰＣＲ産物のキャリーオーバーコンタミネーションの除去方法が開示されている（特許文献１）。ＮｉｌｓｅｎらによってホッコクアカエビＤＳＮをコードするｃＤＮＡが単離され、それによってアミノ酸配列も明らかにされている（非特許文献９）。 A method for removing carry-over contamination of PCR products has been disclosed as a use of the pink shrimp DSN utilizing the heat resistance (Patent Document 1). Nilsen et al. Isolated a cDNA encoding the pink shrimp DSN, and its amino acid sequence has also been revealed (Non-patent Document 9).

５．Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
本発明者らは以前に、クモガニ科のＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）遺伝子を単離しバキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて、組換えズワイガニＤＳＮの発現を行った。ズワイガニＤＳＮは、クルマエビＤＮａｓｅに対して塩基配列レベルで６４％、アミノ酸配列レベルで５９％の同一性を示し、タラバガニＤＳＮに対しては、塩基配列レベルで６６％、アミノ酸配列レベルで６１％の同一性を示した。しかしながら、精製した組換えズワイガニＤＳＮはクルマエビＤＮａｓｅよりむしろ、タラバガニＤＳＮと同様の二本鎖特異的ＤＮＡ切断活性を示し、至適活性温度６０℃を示す耐熱性を備えていた（特許文献３〜５、非特許文献１０、非特許文献１１）。 5. Chionoecets opilio (snow crab) DSN
The present inventors previously isolated the Chionoecetes opilio gene of the spider crab family and expressed the recombinant snow crab DSN using a baculovirus-insect cell expression system. Snow crab DSN shows 64% identity at the nucleotide sequence level and 59% amino acid sequence level with the prawn DNase, and 66% at the nucleotide sequence level and 61% identity at the amino acid sequence level with red crab DSN Showed sex. However, the purified recombinant snow crab DSN has a double-strand specific DNA cleavage activity similar to that of the red king crab DNase rather than the shrimp DNase, and has heat resistance with an optimal activity temperature of 60 ° C. (Patent Documents 3 to 5) Non-patent document 10, Non-patent document 11).

６．その他のＤＳＮホモログ
タラバガニＤＳＮのアミノ酸配列と相同性のあるＤＳＮホモログが、いくつかのＤｅｃａｐｏｄａで見つかっている。Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇらはクルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ（ブラックタイガーエビ）肝膵臓からＤＳＮホモログをコードするｃＤＮＡを単離した。その予測アミノ酸配列は、クルマエビヌクレアーゼの配列と８９％の同一性を有していた（非特許文献１２）。 6). Other DSN homologs DSN homologues that are homologous to the amino acid sequence of king crab DSN have been found in several Decapoda. Molthathong et al. Isolated a cDNA encoding a DSN homolog from the hepatopancreas of Penaeus monodon (Black Tiger Shrimp). The predicted amino acid sequence had 89% identity with the sequence of the carp shrimp nuclease (Non-patent Document 12).

その他のＤＳＮホモログ配列として、クルマエビ科Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ（パシフィックホワイトシュリンプまたはバナメイエビ）由来ＤＮａｓｅＩのｍＲＮＡ［ＧｅｎＢａｎｋＦＪ５４８９２５］、スナガニ科Ａｍｐｈｉｕｃａｃｒａｓｓｉｐｅｓ（別名Ｕｃａｃｒａｓｓｉｐｅｓ、ベニシオマネキ）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋＤＱ８６２５４０］およびＰａｌａｅｍｏｎｉｄａｅｓｐ．（テナガエビ科の一種）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋＤＱ８６２５３８］がＧｅｎＢａｎｋ配列データベース中に見出される。タラバガニＤＳＮとその他のＤＳＮホモログを、進化系統樹的な解析から新規なヌクレアーゼのファミリーとして分類する提案もなされた（非特許文献１３）。 Other DSN homologue sequences include DNase I mRNA [GenBank FJ54889] from the shrimp family Litopenaaeus vannamei (Pacific white shrimp or banamei shrimp); . An mRNA sequence [GenBank DQ862538] derived from (a kind of lobster family) is found in the GenBank sequence database. A proposal has been made to classify king crab DSN and other DSN homologs as a family of novel nucleases based on evolutionary phylogenetic analysis (Non-patent Document 13).

しかしながら、これらのＤＳＮホモログ配列は、いずれもタンパク質の単離および酵素活性についての報告はなく、実際にヌクレアーゼ活性を有するタンパク質として翻訳されているのか否か、また翻訳産物がタラバガニＤＳＮのような二本鎖特異的な核酸切断活性を有するかどうか、さらには耐熱性を有するかどうかということは、現在のところ不明である。 However, none of these DSN homolog sequences have been reported on protein isolation and enzyme activity, whether they are actually translated as a protein having nuclease activity, and whether the translation product is similar to that of king crab DSN. Whether it has a strand-specific nucleic acid cleavage activity, or whether it has heat resistance, is unclear at present.

さらにワタリガニ科Ｐｏｒｔｕｎｕｓｐｅｌａｇｉｃｕｓ（タイワンガザミ）由来のＤＳＮのｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋＪＦ２７６４２６］がデータベース上で開示されており、その配列はタラバガニやズワイガニのＤＳＮと一定の相同性を持っている。しかしながらタイワンガザミＤＳＮのｍＲＮＡと言われるこの配列の翻訳産物の酵素が、実際に二本鎖特異的な基質切断活性を示すという証拠は現在のところ開示されていない。 Furthermore, the mRNA sequence [GenBank JF276426] of DSN derived from the crab family Portunus pelagicus (Genban JF276426) is disclosed on the database, and the sequence has a certain homology with the king crab and snow crab DSN. However, there is currently no disclosure that the enzyme of the translation product of this sequence, which is referred to as the mRNA of Thai crab DSN, actually exhibits double-strand specific substrate cleavage activity.

総括すると、Ｄｅｃａｐｏｄａ由来のＤＳＮ、ＤＳＮ様ヌクレアーゼおよびＤＳＮホモログの中で、実際に二本鎖特異的ヌクレアーゼ活性が示されているのは、タラバガニＤＳＮ、ズワイガニＤＳＮ、およびホッコクアカエビＤＳＮの３種類である。タラバガニＤＳＮとズワイガニＤＳＮは至適活性温度が６０℃前後で耐熱性があるのに対して、ホッコクアカエビＤＳＮは至適温度が２５℃の易熱性酵素である。 In summary, among the Decapoda-derived DSN, DSN-like nuclease, and DSN homologue, double-strand-specific nuclease activity is actually shown in three types: red crab DSN, snow crab DSN, and pink shrimp DSN. King crab DSN and snow crab DSN are heat-resistant at an optimum activity temperature of around 60 ° C, while pink shrimp DSN is a heat-resistant enzyme with an optimum temperature of 25 ° C.

タラバガニＤＳＮは、核酸分子の切断に特徴的な選択性を持つことと、耐熱性があり高温で活性を有するという特徴から、分子生物学分野における様々な応用が示されている。例えば、ＳＮＰ解析（非特許文献５、特許文献２）、ｃＤＮＡライブラリのノーマライゼーション（非特許文献１４）、サブトラクション法（非特許文献１５）およびテロメアの一本鎖オーバーハング長の解析（非特許文献１６）などが開示されている。このような背景のもと、ＤＳＮの二本鎖選択性をより広い範囲で利用可能とするため、より耐熱性の高いＤＳＮが求められていた。 The king crab DSN has been shown various applications in the field of molecular biology because of its characteristic selectivity for cleavage of nucleic acid molecules and its characteristics of heat resistance and activity at high temperatures. For example, SNP analysis (Non-patent Documents 5 and 2), normalization of cDNA library (Non-patent Document 14), subtraction method (Non-patent Document 15), and analysis of single-strand overhang length of telomere (Non-patent Document 16) ) Etc. are disclosed. Under such background, in order to make it possible to use the double-stranded selectivity of DSN in a wider range, a DSN having higher heat resistance has been demanded.

国際公開第９９／０７８８７号International Publication No. 99/07878 国際公開第０３／０４８３７８号International Publication No. 03/048378 特開２０１０−０８１９３４号公報JP 2010-081934 A 欧州特許第２１６１３３１号明細書European Patent No. 2161331 米国特許第２０１０００９２９７６号明細書US Patent No. 201000092976

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本発明は、従来のＤＳＮよりも耐熱性の高い、新規なＤＳＮ遺伝子および酵素を提供することを主たる課題とする。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規な超好熱性ＤＳＮ、およびその製造方法を提供することを課題とする。 The main object of the present invention is to provide a novel DSN gene and enzyme having higher heat resistance than conventional DSN. It is another object of the present invention to provide a novel hyperthermophilic DSN that can be easily produced using recombinant protein expression technology, and a method for producing the same.

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属するＣｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓中にＤＳＮ様ポリペプチド配列をコードしているｍＲＮＡが発現していることを見出し、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ肝膵臓由来ＴｏｔａｌＲＮＡ中の、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを単離し、該遺伝子が実際にＤＳＮ活性を示すことのできるタンパク質をコードしていることを明らかにした。さらに当該タンパク質が既知のＤＳＮを大きく上回る耐熱性を示すことを見出し、また当該タンパク質を組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造する方法を見出して、上記課題を解決しうる発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has shown that mRNA encoding a DSN-like polypeptide sequence is expressed in the liver pancreas of Coenobita purpurus belonging to Coenobiidae. Heading, C.I. A cDNA was isolated from the mRNA in purpureus hepatopancreas-derived total RNA, and it was revealed that the gene actually encodes a protein capable of exhibiting DSN activity. Furthermore, the inventors have found that the protein exhibits a heat resistance far exceeding known DSN, and found a method for easily producing the protein using a recombinant protein expression technique, thereby completing an invention capable of solving the above problems. It came.

すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２２番目のグリシンまでを除いたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。
２．少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲で二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する、前項１に記載のタンパク質。
３．２０℃から８０℃までの温度範囲のうち、少なくとも８０℃以上で最も高い二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する前項２に記載のタンパク質。
４．８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示す前項３に記載のタンパク質。
５．無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上である前項１〜４のいずれか１に記載のタンパク質。
６．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．１〜４．２である前項１〜５のいずれか１に記載のタンパク質。
７．オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来である、前項１〜６のいずれか１に記載のタンパク質。
８．コエノビータプルプレウス（Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）由来である前項１〜７のいずれか１に記載のタンパク質。
９．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
１０．以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）前項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）前項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
１１．ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を有する前項１０に記載の遺伝子。
１２．前項１０または１１に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。
１３．前項１２に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。
１４．前項１３に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。
１５．昆虫細胞内で二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする前項１４に記載の方法。
１６．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。
１７．一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する前項１６に記載の方法。
１８．ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する前項１６に記載の方法。
１９．二本鎖特異的な核酸の切断方法であって、４０℃以上の条件下で反応させる前項１６〜１８のいずれか１に記載の方法。
２０．６０℃以上の条件下で反応させる前項１９に記載の方法。
２１．以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）前項１〜５のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
２２．特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、前項２１に記載の方法。
２３．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。 That is, the present invention is as follows.
1. Any one of the following proteins (a) to (c);
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) a protein comprising an amino acid sequence excluding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the N-terminal to the 22nd glycine;
(C) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, deleted, inserted or substituted in the amino acid sequence of (a) or (b), and having a double-strand-specific nucleolytic activity.
2. 2. The protein according to item 1 above, having heat resistance capable of exhibiting a double-strand specific nucleolytic activity in a temperature range of at least 20 ° C. to 80 ° C.
3. The protein according to item 2 above, which has a heat resistance capable of exhibiting the highest double-strand-specific nucleolytic activity at least at 80 ° C. or higher in a temperature range from 20 ° C. to 80 ° C.
4. The protein according to item 3, wherein the activity at 70 ° C. is 70% or more of the maximum activity in the range from 75 ° C. to 80 ° C.
5. 5. The protein according to any one of items 1 to 4, wherein the residual activity after heat treatment at 70 ° C. for 30 minutes in the presence of an inorganic salt is 60% or more.
6). 6. The protein according to any one of items 1 to 5 above, having a molecular weight of 42,000 to 46,000 and an isoelectric point of 4.1 to 4.2 as determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
7). 7. The protein according to any one of the preceding items 1 to 6, which is derived from an organism belonging to the family Coenobiidae.
8). 8. The protein according to any one of 1 to 7 above, which is derived from Coenovita purpureus.
9. 9. A gene encoding the protein according to any one of 1 to 8 above.
10. A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence according to item 1,
(B) Hybridizing under stringent conditions with DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence described in the preceding item 1 or DNA having a base sequence complementary to the DNA, and double-strand specific nucleic acid degradation DNA encoding a protein having activity.
11. 11. The gene according to item 10 above, wherein the DNA has the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
12 12. A recombinant vector comprising the gene according to 10 or 11 above.
13. 13. A transformant or transductant comprising the recombinant vector according to item 12 above.
14 The transformant or transductant according to item 13 above is cultured in a medium, and a protein having double-strand-specific nucleolytic activity is collected from the culture. A method for producing a protein.
15. 15. The method according to item 14 above, wherein a protein having double-strand specific nucleolytic activity is expressed in insect cells.
16. 16. A method for cleaving a nucleic acid using the protein according to any one of items 1 to 8 or the protein having a double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to item 14 or 15.
17. The method according to item 16 above, wherein the double-stranded DNA is preferentially degraded over the single-stranded DNA in a system in which the single-stranded DNA and the double-stranded DNA coexist.
18. The method according to item 16 above, wherein the DNA strand in the DNA-RNA hybrid duplex is preferentially degraded.
19. 19. The method according to any one of the above items 16 to 18, wherein the method is a double-strand-specific nucleic acid cleavage method, wherein the reaction is performed under conditions of 40 ° C. or higher.
20. The method according to item 19 above, wherein the reaction is carried out at 60 ° C. or higher.
21. An RNA detection method comprising the following steps (i) to (iii):
(I) forming a DNA-RNA hybrid chain;
(Ii) DNA formed in step (i), the protein according to any one of items 1 to 5 or the protein having a double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to item 14 or 15 A step of degrading DNA in the RNA hybrid strand;
(Iii) A step of detecting the presence of RNA by detecting DNA degradation in step (ii).
22. An RNA detection method for detecting RNA having a specific nucleotide sequence, wherein a DNA-RNA hybrid chain of probe DNA containing RNA to be detected in step (i) and a nucleotide sequence complementary to the RNA is formed. The method according to item 21 above.
23. 16. A reagent kit comprising at least one of the protein according to any one of items 1 to 8 or the protein having a double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to item 14 or 15.

本発明により、ＤＳＮ活性を有し、従来のＤＳＮおよびＤＳＮホモログよりも高い超好熱性を有する新規なタンパク質（以下、本発明のＤＳＮ、ヤドカリＤＳＮとも記載する）、当該超好熱性タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、当該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、および該タンパク質の製造方法が提供される。また本発明により、該タンパク質を用いる核酸の切断方法および該タンパク質を用いるＲＮＡ検出方法、並びに該タンパク質を含む試薬キットが提供される。本発明のＤＳＮは、核酸分子の分析、検出、分解、合成および改変などを含む様々な検査技術、診断技術並びに遺伝子工学技術に利用することが可能である。 According to the present invention, a novel protein (hereinafter also referred to as DSN of the present invention, hermit crab DSN) having a DSN activity and having a hyperthermophilicity higher than that of conventional DSN and DSN homologues, encodes the hyperthermophilic protein Provided are a gene, a recombinant DNA containing the gene, a transformant or transductant containing the recombinant DNA, and a method for producing the protein. The present invention also provides a nucleic acid cleavage method using the protein, an RNA detection method using the protein, and a reagent kit containing the protein. The DSN of the present invention can be used in various testing techniques, diagnostic techniques, and genetic engineering techniques including analysis, detection, degradation, synthesis and modification of nucleic acid molecules.

本発明のＤＳＮは、少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲でその活性を示すことができ、前記温度範囲内では８０℃で最も高い活性を示すことのできる超好熱性を有する。このような高い耐熱性を持つ酵素は，熱水噴出口などの極限環境に住む好熱性細菌由来のものは知られているが、高等生物由来のヌクレアーゼとしては他に類を見ない、極めて珍しい酵素である。本発明の酵素によれば、従来、使用温度に制限のあったＤＳＮの各種用途について、幅広い温度の選択が可能となる。 The DSN of the present invention can exhibit its activity in a temperature range of at least 20 ° C. to 80 ° C., and has super thermophilicity that can exhibit the highest activity at 80 ° C. within the temperature range. Such enzymes with high heat resistance are known to be derived from thermophilic bacteria living in extreme environments such as hot water jets, but they are unparalleled as nucleases derived from higher organisms. It is an enzyme. According to the enzyme of the present invention, it is possible to select a wide range of temperatures for various uses of DSN that have been conventionally limited in use temperature.

ヤドカリＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示した図である。It is the figure which showed the outline | summary of the cloning of the partial sequence and full-length sequence of a hermit crab DSN gene. ヤドカリＤＳＮと、クルマエビＤＮａｓｅ、ズワイガニＤＳＮおよび、タラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントの図である。It is a figure of the multiple alignment which shows the comparison of the amino acid sequence of a hermit crab DSN, a prawn DNase, a snow crab DSN, and a king crab DSN. ヤドカリＤＳＮの精製過程の各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。It is the figure which showed SDS-PAGE of each fraction of the purification process of the hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮの二本鎖特異的核酸切断活性を示す図である。It is a figure which shows the double-strand specific nucleic acid cleavage activity of the hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの至適活性温度を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the optimal activation temperature of a hermit crab DSN. 様々な温度条件下におけるヤドカリＤＳＮの２本鎖特異性を示す図である。It is a figure which shows the double strand specificity of the hermit crab DSN under various temperature conditions. （ａ）〜（ｃ）は、ヤドカリＤＳＮの熱処理後の残存活性を示した図である。(A)-(c) is the figure which showed the residual activity after heat processing of the hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨを示す図である。It is a figure which shows the optimal pH of a hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性を示す図である。It is a figure which shows the magnesium ion requirement of a hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性を示す図である。It is a figure which shows the RNA degradation activity of the hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the decomposition activity of the DNA-RNA hybrid chain | strand of a hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解を表す模式図である。It is a schematic diagram showing decomposition | disassembly of the DNA-RNA hybrid chain | strand of a hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの一本鎖ＤＮＡ分解能を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the single-strand DNA resolution of the hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the detection of sequence-specific RNA using the hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出の模式図である。It is a schematic diagram of the detection of sequence-specific RNA using a hermit crab DSN. ヤドカリＤＳＮの１塩基のミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡに対する分解能を示す図である。It is a figure which shows the resolution | decomposability with respect to double stranded DNA containing the 1 base mismatch of the hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the circular dichroism (CD) spectrum of a hermit crab DSN. （ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの熱による構造変化をＣＤによって測定した図である。(A) And (b) is the figure which measured the structural change by the heat | fever of the hermit crab DSN by CD.

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてＤＳＮ（二本鎖特異的核酸分解酵素）とは、ＤＳＮ活性（二本鎖特異的核酸分解酵素活性）を示す能力を有する酵素のことをいい、該ＤＳＮ活性とは、二本鎖核酸中に存在するデオキシリボ核酸を優先的に切断または分解する活性のことをいう。 The present invention is described in detail below.
In the present invention, DSN (double-strand-specific nucleolytic enzyme) refers to an enzyme having the ability to exhibit DSN activity (double-strand-specific nucleolytic enzyme activity). The activity that preferentially cleaves or degrades deoxyribonucleic acid present in nucleic acids.

前記二本鎖核酸には、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖および部分的な一本鎖構造と部分的な二本鎖構造を有する核酸分子の中の二本鎖部分が含まれる。該部分的な一本鎖構造としては、例えば、塩基のミスマッチ、バルジ構造、ループ構造、フラップ構造および偽Ｙ構造（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などが挙げられる。 The double-stranded nucleic acid includes a DNA-DNA duplex, a DNA-RNA duplex, and a double-stranded portion in a nucleic acid molecule having a partial single-stranded structure and a partial double-stranded structure. It is. Examples of the partial single-stranded structure include a base mismatch, a bulge structure, a loop structure, a flap structure, and a pseudo-Y structure (pseudo-Y structure).

ＤＳＮ活性の１つの例は、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する活性である。また別のＤＳＮ活性の１つの例は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する活性である。 One example of the DSN activity is an activity of preferentially degrading double-stranded DNA over single-stranded DNA in a system in which single-stranded DNA and double-stranded DNA coexist. Another example of DSN activity is activity that preferentially degrades DNA strands in DNA-RNA hybrid duplexes.

また別のＤＳＮ活性の１つの例は、完全な塩基対を形成している二本鎖核酸およびミスマッチを含む二本鎖核酸が存在する系で、完全な塩基対を形成している二本鎖核酸部分を優先的に分解する活性である。 Another example of the DSN activity is a system in which a double-stranded nucleic acid forming a complete base pair and a double-stranded nucleic acid containing a mismatch are present, and a double-stranded forming a complete base pair. This activity preferentially degrades the nucleic acid moiety.

ＤＳＮ活性は、例えばＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）で測定可能である。また、ＤＳＮ活性は、例えば、核酸を基質として精製酵素を３７℃で３０分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、基質のバンドの有無および濃淡を比較することによっても検出可能である。 The DSN activity can be measured, for example, by the Kunitz method (Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, 349-362, 1950). The DSN activity can also be detected by, for example, reacting a purified enzyme with a nucleic acid as a substrate at 37 ° C. for 30 minutes, performing agarose gel electrophoresis, and comparing the presence or absence and density of the substrate band.

本発明のＤＳＮは、少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲でＤＳＮ活性を示すことが好ましく、より好ましくは前記温度範囲内では少なくとも８０℃以上で、さらに好ましくは８０℃で最も高い活性を示すことのできる超好熱性を有する。また、本発明のＤＳＮは、８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示すことが好ましい。 The DSN of the present invention preferably exhibits a DSN activity at a temperature range of at least 20 ° C. to 80 ° C., more preferably at least 80 ° C. or more, and most preferably at 80 ° C. within the temperature range. Super thermophilicity that can be. The DSN of the present invention preferably exhibits an activity of 70% or more of the maximum activity in the range from 75 ° C. to 80 ° C., assuming that the activity at 80 ° C. is the maximum activity.

例えば、本願実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、約２０℃から約８０℃の範囲で６０Ｕ／ｍｌ〜３２００００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解活性を示すことが好ましい。 For example, when the activity of the purified enzyme is measured by the activity measurement method using bovine thymus-derived DNA shown in the Examples of the present application, DNA degradation of 60 U / ml to 320,000 U / ml in a range of about 20 ° C. to about 80 ° C. It is preferable to show activity.

本発明のＤＳＮは、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来であることが好ましく、より好ましくは、Ｂｉｒｇｕｓ（ビルグス）属とＣｏｅｎｏｂｉｔａ（コエノビータ）属由来のＤＳＮである。オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物としては例えば、Ｂｉｒｇｕｓｌａｔｒｏ、Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｂｒｅｖｉｍａｎｕｓ、Ｃ．ｃａｒｎｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃａｖｉｐｅｓ、Ｃ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ、Ｃ．ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ、Ｃ．ｌｏｎｇｉｔａｒｓｉｓ、Ｃ．ｏｌｉｖｉｅｒｉ、Ｃ．ｐｅｒｌａｔｕｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｒｕｇｏｓｕｓ、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｃ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｒｕｇｏｓｕｓ、Ｃ．ｓｃａｅｖｏｌａ、Ｃ．ｓｐｉｎｏｓｕｓ、Ｃ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｏｍｐｔａおよびＣ．ｌａｅｖｉｕｓｃｕｌａなどが挙げられる。 The DSN of the present invention is preferably derived from an organism belonging to the family Coenobiidae, and more preferably a DSN derived from the genus Birgus and Coenobita. Examples of the organisms belonging to the family Coenobiidae include Birgus latro, Coenobivitabrevimanus, C.I. carnescens, C.I. cavipes, C.I. crypeatus, C.I. compressors, C.I. longitalsis, C.I. olivieri, C.I. perlatus, C.I. pseudorugosus, C.I. purpureus, C.I. rubescens, C.I. rugosus, C.I. scaevola, C.I. spinosus, C.I. variabilis, C.I. violascens, C.I. compta and C.I. laeviuscula and the like.

これらの中でも、好ましくはＢｉｒｇｕｓｌａｔｒｏ（ヤシガニ）、Ｃ．ｂｒｅｖｉｍａｎｕｓ（オオナキオカヤドカリ）、Ｃ．ｃａｖｉｐｅｓ（オカヤドカリ）、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ムラサキオカヤドカリ）、Ｃ．ｒｕｇｏｓｕｓ（ナキオカヤドカリ）またはＣ．ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ（コムラサキオカヤドカリ）であり、より好ましくはＣ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓである。 Among these, Birgus latro (coconut crab), C.I. brevimanus, C.I. Cavipes (Crayfish), C.I. purpureus, C.I. rugosus or C.I. violascens, more preferably C.I. purpureus.

本発明のＤＳＮは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列領域（Ｎ末端から第２２番目のグリシンまで）を除いた配列、あるいは前記アミノ酸配列のいずれかから１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質である。 The DSN of the present invention comprises one or several amino acids from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a sequence obtained by removing the signal sequence region (from the N-terminal to the 22nd glycine) from the amino acid sequence, or the amino acid sequence. A protein comprising an amino acid sequence in which is added, deleted, inserted or substituted.

ここで、１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をいう。 Here, the amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are added, deleted, inserted or substituted is at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, compared to the reference sequence. More preferably it refers to an amino acid sequence having at least 90%, most preferably at least 95% amino acid sequence identity.

本発明のＤＳＮのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、４２，０００〜４６，０００であることが好ましい。また、本発明のＤＳＮの等電点は４．１〜４．２であることが好ましい。 The molecular weight of the DSN of the present invention by SDS polyacrylamide gel electrophoresis is preferably 42,000-46,000. Moreover, it is preferable that the isoelectric point of DSN of this invention is 4.1-4.2.

さらにまた、本発明のＤＳＮは、二価の金属イオン、例えば、Ｍｇ^２＋イオン存在下において好適なＤＳＮ活性を示すことが好ましい。例えば、後述する実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、Ｍｇ^２＋イオンを使用した場合は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で活性を示すことが好ましく、さらには１０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲で３０％〜１００％の相対活性を示すことがより好ましい。 Furthermore, the DSN of the present invention preferably exhibits a suitable DSN activity in the presence of a divalent metal ion, for example, Mg ²⁺ ion. For example, when the activity of the purified enzyme is measured by the activity measurement method using bovine thymus-derived DNA shown in Examples described later, when Mg ²⁺ ions are used, the activity should be in the range of 1 mM to 100 mM. It is more preferable that it exhibits a relative activity of 30% to 100% in the range of 10 mM to 70 mM.

また本発明のＤＳＮと二価の金属イオンの共存は、本発明のＤＳＮの耐熱性にも寄与している。その影響は金属イオンの種類と濃度にもよるが、後述する実施例８および実施例１６に示した条件の場合では、Ｍｇ^２＋イオン非存在下の本発明のＤＳＮの耐熱性は、Ｍｇ^２＋イオン共存下の場合と比較して約７〜１０℃ほど低下した。 The coexistence of the DSN of the present invention and a divalent metal ion also contributes to the heat resistance of the DSN of the present invention. Its effect depends on the kind and concentration of metal ions, in the case of the conditions shown in Examples 8 and 16 below, the heat resistance of the DSN of the present invention the Mg ²⁺ ion absence, Mg ²⁺ ions It decreased about 7-10 degreeC compared with the case of coexistence.

本発明のＤＳＮは、無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上であることが好ましく、７５℃１０分間加熱処理後の残存活性が３０％以上であることがより好ましく、８０℃５分間加熱処理後の残存活性が１０％以上であることがさらに好ましい。 In the DSN of the present invention, the residual activity after heat treatment at 70 ° C. for 30 minutes in the presence of an inorganic salt is preferably 60% or more, and the residual activity after heat treatment at 75 ° C. for 10 minutes is more than 30%. Preferably, the residual activity after heat treatment at 80 ° C. for 5 minutes is more preferably 10% or more.

本発明のＤＳＮの好ましい形態の１つは、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）の生物の肝膵臓から精製された酵素であり、例えばＣｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓から精製された酵素である。 One preferred form of the DSN of the present invention is an enzyme purified from the hepatopancreas of a Coenobitidae organism, for example, an enzyme purified from the hepatopancreas of Coenobitita purureus.

Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓中に超好熱性ＤＳＮを発現しているという本発明の開示に基づき、当業者はオカヤドカリ科の生物の肝膵臓から、一般的な生化学的方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、濃縮および透析等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、本発明のＤＳＮを単離精製することができる。 Based on the present disclosure that hyperthermophilic DSN is expressed in the hepatopancreas of Coenobita purpureus, one of ordinary skill in the art can obtain general biochemical methods, such as gel filtration chromatography, from the liver pancreas of the hermit crab family. In addition, the DSN of the present invention can be isolated and purified by using ion exchange chromatography, affinity chromatography, centrifugation, concentration, dialysis and the like alone or in appropriate combination.

また、当業者は開示された類似の肝膵臓由来酵素の精製方法、例えば、ナミクダヒゲエビ肝膵臓からのＤＮａｓｅの精製方法（非特許文献１）、タラバガニ肝膵臓からのＤＳＮの精製方法（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、およびホッコクアカエビ肝膵臓からのＤＳＮの精製方法（非特許文献９）、並びにこれらに準ずる方法およびこれらを改変した方法によって精製することもできる。 Further, those skilled in the art have disclosed similar methods for purifying enzymes derived from hepatic pancreas, for example, methods for purifying DNase from lobster hepatic pancreas (Non-patent Document 1), methods for purifying DSN from king crab hepatic pancreas (Non-patent Document 4) , Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6), and a method for purifying DSN from Arctic shrimp hepatopancreas (Non-Patent Document 9), a method according to these, and a modified method thereof.

本発明のＤＳＮは、前記のごとく天然の生体由来材料から、単離および精製してもよいが、本発明のＤＳＮをコードする遺伝子を用いて、組換えタンパク質として調製してもよい。 The DSN of the present invention may be isolated and purified from the natural biological material as described above, but may be prepared as a recombinant protein using the gene encoding the DSN of the present invention.

本発明のＤＳＮをコードする遺伝子は、配列表の配列番号１または配列番号３に示される塩基配列に基づき、当業者に公知のクローニング手法等によって調製される。例えば、該遺伝子は、Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓ肝膵臓由来のＴｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡとして調製することができる。また、例えば、該遺伝子は開示された配列に基づき後述する実施例３に記載の方法によって調製される。 The gene encoding the DSN of the present invention is prepared by cloning techniques known to those skilled in the art based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. For example, the gene can be prepared as cDNA from Total RNA derived from Coenobita purpureus hepatopancreas. Further, for example, the gene is prepared by the method described in Example 3 described later based on the disclosed sequence.

また、前記のＤＳＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明のＤＳＮをコードする遺伝子に含まれる。また、該ＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤＳＮ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。 In addition, DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of the DSN is also included in the gene encoding the DSN of the present invention. Further, the DNA of the present invention also includes DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA or a DNA comprising a sequence complementary to the DNA and encodes a protein having a DSN activity.

また、配列番号２に記載のＤＳＮまたは該ＤＳＮからシグナル配列領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から第２２番目のグリシンまで）を除いたＤＳＮをコードする塩基配列を有するＤＮＡにおいて、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列であって、かつＤＳＮ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明の遺伝子に含まれる。 In addition, in the DNA having the nucleotide sequence encoding the DSN described in SEQ ID NO: 2 or the DSN excluding the signal sequence region (from the N-terminal to the 22nd glycine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) from the DSN, A DNA having a base sequence in which one or a plurality of bases are added, deleted or substituted and having a base sequence encoding a protein having a DSN activity is also included in the gene of the present invention.

ここで、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の塩基配列同一性を有する塩基配列をいう。 Here, the base sequence to which one or a plurality of bases are added, deleted or substituted is at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, still more preferably compared to the reference sequence. Refers to a base sequence having at least 90%, most preferably at least 95% base sequence identity.

ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。 Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, highly homologous nucleic acids, for example, DNAs having homology of 70% or more, preferably 80% or more hybridize, Examples include conditions under which nucleic acids having lower homology do not hybridize.

例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍｌニシン***ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。 Examples include the conditions described in Molecular cloning a laboratory manual, 2nd edition (Sambrook et al., 1989). That is, in a solution containing 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / ml herring sperm DNA Examples of the conditions include a constant temperature at 65 ° C. for 8 to 16 hours together with the probe and hybridization.

また、生物由来材料からＤＳＮ遺伝子を調製する方法の他に、確定したＤＳＮの塩基配列情報を基に、有機合成法および酵素合成法並びにそれらを適宜組み合わせた方法により、直接的に所望するＤＳＮ遺伝子を合成することもできる。 In addition to the method of preparing a DSN gene from a biological material, the desired DSN gene can be directly selected by an organic synthesis method, an enzyme synthesis method, and a method appropriately combining them based on the determined nucleotide sequence information of the DSN. Can also be synthesized.

本発明の組換え体ＤＮＡは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡ等が挙げられる。 The recombinant DNA of the present invention can be obtained by linking (inserting) the gene of the present invention to an appropriate vector. The vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.

プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０およびｐＴＰ５等）および酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４およびＹＣｐ５０等）などが挙げられる。 Examples of plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (for example, pBR322, pBR325, pUC8, pUC9, pUC118, pUC119, pET (manufactured by Novagen), pGEX (manufactured by Amersham Biosciences), pQE (manufactured by QIAGEN) and pMAL. New England Biolabs), plasmids derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110 and pTP5), and plasmids derived from yeast (for example, YEp13, YEp24, and YCp50).

ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。さらに、例えば、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター並びにバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。 Examples of the phage DNA include λ phage. Furthermore, for example, animal virus vectors such as retrovirus and vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.

ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製された本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーおよびリボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。 In order to insert the gene of the present invention into a vector, for example, the purified DNA containing the gene of the present invention is cleaved with a suitable restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA. A method of linking to is adopted. In addition to a promoter and the gene of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like can be linked to the vector.

選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。本発明の遺伝子には、後で本発明のＤＳＮの精製および検出を容易にするために、または発現したＤＳＮが細胞内で不溶化してしまうのを防ぐために、ＧＳＴタグまたはヒスチジンタグなどのタグ配列等をコードする配列を付加してもよい（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０，５２３−５３３，２００３）。 Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like. The gene of the present invention includes a tag sequence such as a GST tag or a histidine tag to facilitate later purification and detection of the DSN of the present invention or to prevent the expressed DSN from becoming insoluble in cells. Or the like (eg, Terpe, K., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60, 523-533, 2003).

本発明の形質転換体および形質導入体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで用いる宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。 The transformant and transductant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. The host used here is not particularly limited as long as it can express the gene of the present invention.

例えば、エッシェリヒア属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等）、シュードモナス属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ等）、バチルス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ等）およびリゾビウム属（例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ等）などに属する細菌、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ等の酵母、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞等の動物細胞並びにヨトウガ細胞（例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１等）およびカイコ細胞（例えば、ＢｍＮ４等）などの昆虫細胞が挙げられる。 For example, Escherichia (eg, Escherichia coli, etc.), Pseudomonas (eg, Pseudomonas putida, etc.), Bacillus (eg, Bacillus subtilis, etc.) and Rhizobium (eg, Rhizobium meliloti, etc.) Examples include yeast such as pombe, animal cells such as COS cells and CHO cells, and insect cells such as sugar beet cells (for example, Sf9 and Sf21) and silkworm cells (for example, BmN4).

本発明の形質転換体および形質導入体が得られたならば、その培養物から本発明のＤＳＮを採取するには、当業者が通常行う酵素採取手段を用いることができる。本発明のＤＳＮが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより当該酵素を抽出できる。 Once the transformant and transductant of the present invention are obtained, enzyme collecting means commonly used by those skilled in the art can be used to collect the DSN of the present invention from the culture. When the DSN of the present invention is produced in cells or cells, the enzyme can be extracted by disrupting the cells or cells.

例えば、常法により菌体または細胞を超音波破砕処理および磨砕処理などする方法、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて該酵素を抽出する方法、並びにトルエン等の存在下で振盪または放置して自己消化を行なわせ該酵素を菌体または細胞外に排出させるなどの方法で菌体内または細胞内から該酵素を抽出することができる。 For example, a method of ultrasonically crushing and grinding cells or cells by a conventional method, a method of extracting the enzyme using a lytic enzyme such as lysozyme, and shaking or leaving in the presence of toluene etc. The enzyme can be extracted from inside or inside the cell by a method such as digestion and discharge of the enzyme outside the cell or cell.

前記のごとくして得られた本発明のＤＳＮを含む調製物から、さらに本発明のＤＳＮを精製し、精製酵素標品を得る場合には、当業者がタンパク質の単離精製に用いる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、前記酵素溶液から本発明のＤＳＮを単離精製することができる。 When the DSN of the present invention is further purified from the preparation containing the DSN of the present invention obtained as described above to obtain a purified enzyme preparation, those skilled in the art can use the general methods used for protein isolation and purification. The DSN of the present invention can be isolated and purified from the enzyme solution by using a biochemical method such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like alone or in appropriate combination.

本発明のＤＳＮに、ＧＳＴタグまたはヒスチジンタグなどのタグ配列等を付加して発現させた場合、このような付加配列は、当該酵素の精製途中または精製後に、当業者が通常行う適当な酵素処理等によって取り除いてもよいし、付加配列によって本発明のＤＳＮの活性が損なわれない場合はそのままでもよい。 When the DSN of the present invention is expressed by adding a tag sequence such as a GST tag or a histidine tag to the DSN of the present invention, such an added sequence is usually subjected to an appropriate enzyme treatment performed by those skilled in the art during or after purification of the enzyme. Etc., or may be left as is if the activity of the DSN of the present invention is not impaired by the additional sequence.

ナミクダヒゲエビ肝膵臓由来ＤＮａｓｅおよびウシ膵臓由来ＤＮａｓｅはトリプシン消化に対する耐性を示し（非特許文献１）、タラバガニ肝膵臓由来ＤＳＮはプロテイナーゼＫ消化に対する耐性を示すことが知られていた（非特許文献６）。 It has been known that Namase lobster hepatopancreas-derived DNase and bovine pancreas-derived DNase have resistance to trypsin digestion (Non-patent document 1), and king crab liver-pancreas-derived DSN exhibits resistance to proteinase K digestion (Non-patent document 6).

一方、本発明者らは、本発明のオカヤドカリ科由来ＤＳＮが、プロテイナーゼＫ消化に対して耐性を示すことを見出した。本開示により、当業者は、プロテイナーゼＫによって目的外のタンパク質の大部分を消化せしめ、所望する本発明のＤＳＮは分解されないような条件で処理することによって、本発明の酵素の精製を簡便に行うことが可能である。そのような精製手順を含む本発明のＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。 On the other hand, the present inventors have found that the crab-family crab-derived DSN of the present invention is resistant to proteinase K digestion. According to the present disclosure, those skilled in the art can easily purify the enzyme of the present invention by digesting the majority of the protein of interest with proteinase K and treating it under conditions such that the desired DSN of the present invention is not degraded. It is possible. One example of a preferred embodiment of the method for producing a DSN of the present invention including such a purification procedure will be described in more detail in the examples herein.

本発明のＤＳＮは、開示したアミノ酸配列から理解できるように、高度にシステイン残基を有しており、このことから分子内に複数のジスルフィド架橋が形成されることが推察される。一般的に、高度な分子内ジスルフィドネットワークを有するタンパク質は、大腸菌などの原核生物を宿主として成功裏に組換えタンパク質を得るのが困難な場合がしばしばあることは、当業者の知るところである。大腸菌内で発現させた目的タンパク質が、不溶化した封入体として得られる場合には、封入体の可溶化およびリフォールディング等の手順を経て、可溶性で酵素活性のある目的タンパク質を再生することができる［例えば、Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），７１，５１３−５１９（２００６）（非特許文献７）］。 As can be understood from the disclosed amino acid sequence, the DSN of the present invention has a high cysteine residue, and it is presumed that a plurality of disulfide bridges are formed in the molecule. In general, it is known to those skilled in the art that proteins having a high degree of intramolecular disulfide network are often difficult to successfully obtain recombinant proteins using prokaryotes such as E. coli as hosts. When the target protein expressed in E. coli is obtained as an insolubilized inclusion body, the soluble and enzymatically active target protein can be regenerated through procedures such as solubilization and refolding of the inclusion body [ For example, Anisimova, V .; E. Et al., Biochemistry (Mosc), 71, 513-519 (2006) (Non-patent Document 7)].

本発明のＤＳＮを組換えタンパク質として調製する方法の好ましい実施形態の１つの例は、真核生物細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、好ましい１つの例は昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、例えば、組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させるバキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系（例えば、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．らの文献、“ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５年およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．らの文献、“ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９４年）を用いる方法が挙げられる。バキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系を用いる本発明のＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。 One example of a preferred embodiment of a method for preparing the DSN of the present invention as a recombinant protein is a method of expressing a target protein in a eukaryotic cell, and one preferred example is expressing a target protein in an insect cell. For example, a baculovirus-insect cell recombinant protein expression system for expressing a target protein in an insect cell infected with a recombinant baculovirus (for example, Shuler, ML, et al., “Baculovirus Expression Systems”). and Biopesticides ", John Wiley and Sons, New York, 1995 and O'Reilly, DR, et al.," Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory M. nual ", Oxford University Press, New York, and a method of using the 1994). One example of a preferred embodiment of the method for producing a DSN of the present invention using a baculovirus-insect cell recombinant protein expression system will be described in more detail in the examples of the present specification.

本発明のＤＳＮを用いることで、当該酵素を用いた核酸の切断方法が提供される。当該方法によれば、二本鎖特異的に核酸を切断することができる。より詳しくは、当該方法によれば、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解することができる。また、当該方法によれば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解することができる。本発明のＤＳＮを用いて二本鎖特異的に核酸を切断する場合、好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の範囲の条件下で反応を行うことが好ましい。 By using the DSN of the present invention, a method for cleaving a nucleic acid using the enzyme is provided. According to this method, a nucleic acid can be cleaved specifically in a double strand. More specifically, according to this method, double-stranded DNA can be preferentially degraded over single-stranded DNA in a system in which single-stranded DNA and double-stranded DNA coexist. Moreover, according to this method, the DNA strand in the DNA-RNA hybrid duplex can be preferentially degraded. When the nucleic acid is cleaved in a double-strand-specific manner using the DSN of the present invention, the reaction is preferably performed at a temperature in the range of 40 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher, and preferably 80 ° C. or lower. preferable.

本発明のＤＳＮを用いる核酸の切断方法における、反応液組成および反応条件は、当業者が目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本明細書の実施例に記載の反応液組成および反応条件並びにそれらを改変したものが使用できるが、これらに限定されるものではない。 The reaction solution composition and reaction conditions in the method for cleaving nucleic acid using the DSN of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. For example, the reaction solution composition and reaction conditions described in the Examples of the present specification and modified versions thereof can be used, but are not limited thereto.

上述のごとく、本発明のＤＳＮは好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の範囲で好ましく使用することができるが、使用できる反応温度はこの範囲に限られるものではない。後述する実施例１５はミスマッチ塩基を識別する目的で、３０℃で反応を行った例である。当業者は目的に応じて様々な温度条件下で使用することができる。例えば、本発明のＤＳＮを、一定温度条件下、ある範囲の温度変化が伴う条件下、および所定のまたはプログラムされた温度サイクリング条件下などで使用して、本発明の核酸の切断方法を実施することができる。 As described above, the DSN of the present invention can be preferably used in the range of preferably 40 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher, and preferably 80 ° C. or lower, but the reaction temperature that can be used is limited to this range. It is not a thing. Example 15 described later is an example in which a reaction was performed at 30 ° C. for the purpose of identifying a mismatched base. A person skilled in the art can use various temperature conditions depending on the purpose. For example, the nucleic acid of the present invention is cleaved using the DSN of the present invention under constant temperature conditions, conditions with a range of temperature changes, and predetermined or programmed temperature cycling conditions. be able to.

本発明のＤＳＮを用いることで、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法が提供される；
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）本発明のＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
工程（ｉ）において、検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させることにより、特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出することができる。 By using the DSN of the present invention, an RNA detection method including the following steps (i) to (iii) is provided;
(I) forming a DNA-RNA hybrid chain;
(Ii) a step of degrading DNA in the DNA-RNA hybrid chain formed in step (i) with the DSN of the present invention;
(Iii) A step of detecting the presence of RNA by detecting DNA degradation in step (ii).
In step (i), an RNA having a specific nucleotide sequence can be detected by forming a DNA-RNA hybrid strand of the RNA to be detected and a probe DNA having a nucleotide sequence complementary to the RNA.

以下、各工程について説明する。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程
この工程は、ＲＮＡと該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとのハイブリッド鎖を形成させる工程である。ここで「ハイブリッド」とは、ＲＮＡとＤＮＡとの相補的結合の結果物をいう。 Hereinafter, each step will be described.
(I) Step of forming a DNA-RNA hybrid strand This step is a step of forming a hybrid strand of RNA and DNA having a nucleotide sequence complementary to the RNA. Here, “hybrid” refers to the result of complementary binding between RNA and DNA.

ＲＮＡとしては、全体が天然型のＲＮＡである場合のほか、ＲＮＡをその一部に含む核酸および非天然型のヌクレオチドを含むＲＮＡなどが挙げられる。また、本発明の方法によればＲＮＡの断片も検出可能である。 Examples of the RNA include a case where the whole is a natural RNA, a nucleic acid containing RNA as a part thereof, and an RNA containing a non-natural nucleotide. Further, according to the method of the present invention, RNA fragments can also be detected.

ＲＮＡは溶液中に存在していてもよく、固体状態であってもよい。また、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイと呼ばれる固相担体上に相補的結合により固定されている状態でもよい。溶液の場合には、溶媒としては水または緩衝液が好ましく、水の他に水と混和しうる溶媒を適宜混合して用いるのが好ましい。 RNA may be present in solution or in a solid state. Further, for example, it may be in a state of being fixed by complementary binding on a solid phase carrier called a DNA chip or a DNA array. In the case of a solution, the solvent is preferably water or a buffer solution, and it is preferable to use a solvent miscible with water in addition to water.

水と混和して用いる溶媒の例としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびスルホランなどが挙げられる。固体状態の場合には、検出対象となるＲＮＡは他の物質と混合状態であってもよく、複数種のＲＮＡの混合物であってもよい。 Examples of the solvent used by mixing with water include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, glycerin, ethylene glycol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, acetonitrile, and sulfolane. In the solid state, the RNA to be detected may be in a mixed state with other substances, or may be a mixture of a plurality of types of RNA.

固相担体上にＲＮＡが固定されている場合、該固相担体としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリメチルメタクリレート等のポリマー並びにシリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維およびメンブレンフィルター等の多孔質物質が拳げられる。 When RNA is immobilized on a solid phase carrier, examples of the solid phase carrier include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, and polymethyl methacrylate. Polymers such as silicon, activated carbon, porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven catch, non-woven fabric, paper reduction, short fiber, and membrane filter are fisted.

また、固相担体はビーズ状になったものおよびアクリルアミドゲルのようにゲル状のものであってもよい。また、ＲＮＡが単に固相担体上に物理的に密着されていてもよく、固相担体上から一部固相担体内に浸透した形態であってもよい。また、ＲＮＡが完全に固相担体に浸透した形態であってもよく、共有結合で化学的に固相担体に結合されていてもよい。 The solid phase carrier may be in the form of beads or in the form of a gel such as acrylamide gel. Alternatively, RNA may be simply in close physical contact with the solid phase carrier, or may be in a form that partially penetrates into the solid phase carrier from the solid phase carrier. Alternatively, the RNA may completely penetrate the solid support, or may be covalently bound to the solid support chemically.

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡとしては、例えば、化学的に合成したＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などによって酵素学的に合成したＤＮＡ並びに生物由来試料から抽出またはクローン化したＤＮＡが挙げられる。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡは、特定のＲＮＡのヌクレオチド配列を検出する場合、該ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡであることが好ましい。 Examples of DNA that forms a DNA-RNA hybrid chain include chemically synthesized DNA, DNA enzymatically synthesized by DNA polymerase and reverse transcriptase, and DNA extracted or cloned from a biological sample. . In addition, when detecting the nucleotide sequence of a specific RNA, the DNA that forms the DNA-RNA hybrid chain is preferably a probe DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the RNA.

また、該プローブＤＮＡは標識物質を結合するものであることが好ましい。標識物質としては、例えば、クエンチャー（例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ、ＴＡＭＲＡ（登録商標）およびＭＧＢなど）およびレポーター色素（例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＥＴおよびＨＥＸなど）等の蛍光色素、ビオチン並びに放射性同位体元素が挙げられる。 The probe DNA preferably binds a labeling substance. Examples of the labeling substance include fluorescent dyes such as quenchers (for example, Eclipse® Dark Quencher, TAMRA®, and MGB) and reporter dyes (for example, FAM, ROX, TET, and HEX), biotin And radioisotope elements.

また他の標識としては、例えば、直接は検出できないが標識物質と特異的に結合する物質（例えばアビジンなど）との反応によって間接的に検出可能となるような物質、例えば、ハプテンおよび抗体などが挙げられる。当該ＤＮＡは、１５〜３００ヌクレオチド、好ましくは１５〜６０ヌクレオチドを含有することが好ましい。 Examples of other labels include substances that cannot be directly detected but can be indirectly detected by reaction with a substance that specifically binds to the labeling substance (for example, avidin), such as haptens and antibodies. Can be mentioned. The DNA preferably contains 15 to 300 nucleotides, preferably 15 to 60 nucleotides.

（ｉｉ）本発明のＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程
この工程は、本発明のＤＳＮを用いて二本鎖特異的に核酸を切断することにより、工程（ｉ）で形成された一本のＲＮＡ鎖および一本のＤＮＡ鎖からなるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程である。工程（ｉｉ）は、好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の条件下で反応を行うことが好ましい。 (Ii) Step of degrading DNA in the DNA-RNA hybrid strand formed in step (i) with the DSN of the present invention This step cleaves nucleic acid in a double-strand-specific manner using the DSN of the present invention. This is a step of degrading the DNA in the DNA-RNA hybrid strand composed of one RNA strand and one DNA strand formed in step (i). In step (ii), the reaction is preferably performed at a temperature of 40 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher, and preferably 80 ° C. or lower.

（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
この工程は、工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程である。ＤＮＡの分解は、例えば、次の方法により検出することができる。工程（ｉ）においてＤＮＡの５’末端をレポーターの蛍光色素、３’末端をクエンチャーの蛍光色素で標識したプローブＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる。 (Iii) A step of detecting the presence of RNA by detecting DNA degradation in step (ii).
This step is a step of detecting the presence of RNA by detecting the degradation of DNA in step (ii). DNA degradation can be detected, for example, by the following method. In step (i), a DNA-RNA hybrid chain is formed using a probe DNA in which the 5 ′ end of the DNA is labeled with a reporter fluorescent dye and the 3 ′ end is labeled with a quencher fluorescent dye.

その後、本発明のＤＳＮでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中にＤＮＡを分解することにより、プローブＤＮＡに結合しているリポーターの蛍光色素とクエンチャーの蛍光色素が離れ離れになり、リポーターの蛍光色素が検出されるようになる。すなわち、検体中にＲＮＡが存在すれば、リポーターの蛍光色素が検出される。 Thereafter, the DNA of the present invention is decomposed into the DNA-RNA hybrid strand, whereby the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye are separated from each other, and the reporter fluorescent dye is detected. Become so. That is, if RNA is present in the sample, the fluorescent dye of the reporter is detected.

また、例えば、平板ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動およびマススペクトル分析などの当業者に公知の様々な核酸の分析手法によっても検出が可能である。例えば、本発明のＤＳＮ酵素を添加する場合と添加しない場合との電気泳動パターンを比較することによりＤＮＡの分解を検出することも可能である。 The detection can also be performed by various nucleic acid analysis techniques known to those skilled in the art, such as slab gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, and mass spectrum analysis. For example, it is also possible to detect DNA degradation by comparing electrophoresis patterns with and without the addition of the DSN enzyme of the present invention.

本発明のＤＳＮを含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、標識物質、緩衝液および塩など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。当該試薬キットは、本発明の二本鎖特異的な核酸の切断方法およびＲＮＡの検出方法に使用可能である。 A reagent kit comprising the DSN of the present invention is also encompassed within the scope of the present invention. The reagent kit can contain substances required for carrying out the measurement, such as labeling substances, buffers and salts. Furthermore, substances such as stabilizers and / or preservatives may be included. The reagent kit can be used in the double-strand-specific nucleic acid cleavage method and RNA detection method of the present invention.

以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお本発明は下記の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to the following examples.

［実施例１］
ヤドカリ肝膵臓由来ｃＤＮＡの調製
本発明者らは、ヤドカリの肝膵臓中にＤＳＮが発現していることを見出し、その遺伝子を単離および同定する目的で、まず以下の方法で肝膵臓由来１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを調製した。 [Example 1]
Preparation of Hermit Crab Liver Pancreas-Derived cDNA The present inventors have found that DSN is expressed in the hermit pancreas of hermit crab, and for the purpose of isolating and identifying the gene, first, the 1st strand derived from the liver pancreas is obtained by the following method. cDNA was prepared.

（１）ヤドカリからの肝膵臓の採取
Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓの生体を購入し、解剖して肝膵臓を採取した。採取した肝膵臓、約１００ｍｇを直ちに１．２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に浸漬し、４℃で１６時間保存した。浸漬した肝膵臓をピンセットで取り出し、新しいエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。 (1) Collection of hepatopancreas from hermit crab The living body of Coenobita purpureus was purchased and dissected to collect hepatopancreas. About 100 mg of the collected hepatopancreas was immediately immersed in 1.2 ml of RNAlater (QIAGEN) and stored at 4 ° C. for 16 hours. The soaked hepatopancreas was removed with tweezers, placed in a new Eppendorf tube and stored at −80 ° C. until use.

（２）ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出
−８０℃で保存したヤドカリの肝膵臓から、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。３０ｍｇの肝膵臓から、６０μｇのＴｏｔａｌＲＮＡが得られた。 (2) Extraction of total RNA Total RNA was extracted from the hermit pancreas of hermit crab stored at -80 ° C using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN). The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit. From 30 mg of the hepatopancreas, 60 μg of total RNA was obtained.

（３）１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの作製
以下に示す逆転写反応により、１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した。反応は３’ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を使用して行った。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌＲＮＡ１μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌＲＮＡ、１μｌのプライマーＡＰ（配列番号４）（１０μＭ）および、１０．５μｌのＲＮａｓｅＦｒｅｅＨ_２Ｏを混合し、７０℃で１０分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。
配列番号４：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’ (3) Preparation of 1st strand cDNA 1st strand cDNA was synthesized by the reverse transcription reaction shown below. The reaction was carried out using the reagents attached to 3 ′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (manufactured by Invitrogen). Total RNA 1 μg (0.5 μl) extracted from hermit crab hepatopancreas was used as a template. 0.5 μl of total RNA, 1 μl of primer AP (SEQ ID NO: 4) (10 μM) and 10.5 μl of RNase Free H ₂ O were mixed, heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes, and then rapidly cooled on ice.
SEQ ID NO: 5'-ggccacgcgtcgacttagacttttttttttttttttttt-3 '

熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で２分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＲｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。 To the mixed solution (12 μl) after the heat treatment, 2 μl of a 10-fold concentration buffer solution (10 × PCR buffer) was added as a reaction buffer solution. dNTPs were added to a final concentration of 0.5 mM, MgCl ₂ was added to a final concentration of 2.5 mM, and DTT was 10 mM, respectively, and incubated at 42 ° C. for 2 minutes. As a reverse transcriptase, 200 U of SuperScriptTMII Rverse Transcriptase was added to prepare a reaction solution (total amount 20 μl).

反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。反応液を氷上で冷却して、ＲＮａｓｅＨ２．０Ｕを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。この溶液を１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ溶液とした。サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。 The reaction solution was incubated at 42 ° C. for 50 minutes and then incubated at 70 ° C. for 15 minutes to complete the reverse transcription reaction. The reaction was cooled on ice, 2.0 U RNase H was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. This solution was used as a 1st strand cDNA solution. As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used.

［実施例２］
ヤドカリＤＳＮ遺伝子の塩基配列の決定
実施例１の方法で調製したヤドカリ肝膵臓由来１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを鋳型として用い、まずＤＳＮ遺伝子の内部配列を取得した後、得られた内部配列を元に３’領域配列を決定し、次に５’領域配列を決定し、最終的にヤドカリＤＳＮ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列決定に至った（配列番号３）。 [Example 2]
Determination of the base sequence of the hermit crab DSN gene Using the herb crab hepatopancreas-derived 1st strand cDNA prepared by the method of Example 1 as a template, first the internal sequence of the DSN gene was obtained, and then the 3 ′ region based on the obtained internal sequence The sequence was determined, and then the 5 'region sequence was determined. Finally, the nucleotide sequence of the full-length cDNA of the hermit crab DSN gene was determined (SEQ ID NO: 3).

図１はヤドカリＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示す図であり、用いたプライマーの位置の模式図とそれぞれのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を示す（レーンＭ；ＤＮＡサイズマーカー、レーン６；プライマーＭ＾ＧＳＰ６−２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＩ；プライマーＭｉ１およびＭｉ２によるＰＣＲ増幅産物、レーン３’；プライマーＭｉ１およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーン５’；プライマーＹ５Ｒ２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＦ；プライマーＹＷＰＦ１およびＹＷＰＲ１のＰＣＲ増幅産物）。 FIG. 1 is a diagram showing an outline of cloning of a partial sequence and a full-length sequence of a hermit crab DSN gene, showing a schematic diagram of the positions of the primers used and an agarose gel electrophoresis image of each PCR amplification product (lane M; DNA size) Marker, lane 6; PCR amplification product with primers M ^ GSP6-2 and AUAP, lane I; PCR amplification product with primers Mi1 and Mi2, lane 3 '; PCR amplification product with primers Mi1 and AUAP, lane 5'; primer Y5R2 and PCR amplification product by AUAP, lane F; PCR amplification products of primers YWPF1 and YWPR1).

（１）ヤドカリ遺伝子の内部配列の取得
種々の甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間でよく保存されている領域を参考にして、プライマーＭＧＳＰ６（配列番号５）、ＭＧＳＰ６−２（配列番号６）、Ｍｉ１（配列番号７）、Ｍｉ２（配列番号８）を作製した。
配列番号５：５’−ｇｃｃａａｃａｔｔｇｃｃｇｃｃａａｇｇａ−３’
配列番号６：５’−ｇｃｃａａｇｇａｃａｔｃｇａｇａｃｃｔｃ−３’
配列番号７：５’−ｔｔｃａａｇａｃｃｔｃｃａｃｃｇｇｇｔｔｃｔｔｃａ−３’
配列番号８：５’−ｔｇｃｃａｔｔａｔｔｇａａｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｔｇ−３’ (1) Acquisition of internal sequence of hermit crab gene With reference to regions well conserved among nuclease genes derived from various crustaceans, primers MGSP6 (SEQ ID NO: 5), MGSP6-2 (SEQ ID NO: 6), Mi1 ( SEQ ID NO: 7) and Mi2 (SEQ ID NO: 8) were prepared.
SEQ ID NO: 5: 5'-gccaactattgccgccagaagga-3 '
SEQ ID NO: 6: 5'-gccagaggacactgagacctc-3 '
SEQ ID NO: 7: 5'-ttcaagacctccaccggggttcttca-3 '
SEQ ID NO: 8: 5′-tgccattattgaagggcctgccactg-3 ′

以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を増幅した。１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａＴａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。 The internal sequence of the hermit crab DSN gene was amplified by the following PCR. 2 μl of 1st strand cDNA was added as a template to the reaction solution (total volume 50 μl). As a DNA polymerase, 2.5 U of TaKaRa Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the reaction solution.

反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６（配列番号５）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
配列番号９：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃ−３’ As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer (10 × PCR buffer) was added. As primers, MGSP6 (SEQ ID NO: 5) and AUAP (SEQ ID NO: 9) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.2 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM, and MgCl ₂ was added to the final concentration of 1.5 mM.
SEQ ID NO: 9: 5′-ggccacgcgtcgacttagac-3 ′

サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ａ〉を得た。 As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used. A heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was performed once, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 60 seconds, 45 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes was repeated 35 times to obtain an amplification product <A>.

次に、増幅産物〈Ａ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａＴａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６−２（配列番号６）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。 Next, the amplification product <A> was diluted 100 times with sterilized ultrapure water, and nested PCR was performed using this diluted solution as a template. 2 μl of the diluted solution was added as a template to the reaction solution (total amount: 50 μl). As a DNA polymerase, 2.5 U of TaKaRa Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer (10 × PCR buffer) was added. As primers, MGSP6-2 (SEQ ID NO: 6) and AUAP (SEQ ID NO: 9) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.2 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM, and MgCl ₂ was added to the final concentration of 1.5 mM.

９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｂ〉を得た。増幅産物〈Ｂ〉を、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの確認をした結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示すように、特異的な増幅産物は観察されなかった［図１（ａ）レーン６］。 A heat treatment was carried out once at 94 ° C. for 2 minutes, and subsequently, a temperature cycle of 94 ° C. for 60 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 3 minutes was repeated 35 times to obtain an amplification product . The amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis and the band was confirmed. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1 (a), no specific amplification product was observed [FIG. 1 (a) lane 6].

そこで、増幅産物〈Ｂ〉を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。増幅産物〈Ｂ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈した。この希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍｉ１（配列番号７）およびＭｉ２（配列番号８）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）に示すように、約２５０ｂｐの位置にバンドが観察された［図１（ｂ）レーンＩ］。 Therefore, PCR was further performed using the amplification product as a template. The amplification product was diluted 100 times with sterile ultrapure water. 2 μl of this diluted solution was added as a template to the reaction solution (total amount 50 μl). As a DNA polymerase, 1.0 U of KOD plus (Toyobo Co., Ltd.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer solution (10 × KOD-PCR buffer) attached to the KOD plus product was added. As primers, Mi1 (SEQ ID NO: 7) and Mi2 (SEQ ID NO: 8) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.3 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM each, and MgSO ₄ was added so that the final concentration was 1.5 mM. A heat treatment for 2 minutes at 94 ° C. was performed once, and then a temperature cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 90 seconds was repeated 35 times. The result of agarose gel electrophoresis of the amplified product is shown in FIG. As shown in FIG. 1 (b), a band was observed at a position of about 250 bp [FIG. 1 (b) lane I].

このバンドを、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を決定した。 This band was collected from an agarose gel using MinElute Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), purified, and eluted with 20 μl of sterilized ultrapure water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit. The obtained amplification product was inserted into the pUC118 vector according to a conventional method. The base sequence in the obtained recombinant DNA was decoded by a DNA sequencer. The internal sequence of the hermit crab DSN gene was determined as described above.

（２）ヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域配列の取得
取得したヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を解析したところ、Ｍｉ１（配列番号７）周辺領域とヤドカリＤＳＮ遺伝子間で高い相同性が確認されたので、Ｍｉ１（配列番号７）を用いてヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域配列の取得を行った。以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の３’領域配列を増幅した。 (2) Acquisition of hermit crab DSN gene 3 ′ region sequence When the internal sequence of the acquired hermit crab DSN gene was analyzed, high homology was confirmed between the peripheral region of Mi1 (SEQ ID NO: 7) and the hermit crab DSN gene. The hermit crab DSN gene 3 ′ region sequence was obtained using SEQ ID NO: 7). The 3 ′ region sequence of the hermit crab DSN gene was amplified by the following PCR.

実施例２（１）の増幅産物〈Ｂ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈した溶液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａＴａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍｉ１（配列番号７）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。 2 μl of a solution obtained by diluting the amplification product of Example 2 (1) 100-fold with sterilized ultrapure water was added as a template to the reaction solution (total amount 50 μl). As a DNA polymerase, 2.5 U of TaKaRa Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer (10 × PCR buffer) was added. As primers, Mi1 (SEQ ID NO: 7) and AUAP (SEQ ID NO: 9) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.2 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM, and MgCl ₂ was added to the final concentration of 1.5 mM.

サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。 As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used. A heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was performed once, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 60 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes was repeated 35 times.

増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約７００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｃ）レーン３’］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。 The amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 700 bp PCR amplified product [FIG. 1 (c) lane 3 ′] was recovered from the agarose gel using MinElute Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), purified, and sterilized. Elution was performed with 10 μl of pure water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit.

得られた産物をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＲｅａｇｅｎｔＳｅｔ〈ＢｌｕｎｔＥｎｄ〉（タカラバイオ社製）を用いて、当該キットに添付のｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域の塩基配列を決定した。 The obtained product was inserted into the pUC118 vector attached to the kit using Mighty Cloning Reagent Set <Blunt End> (manufactured by Takara Bio Inc.). The procedure for this operation was in accordance with the specifications attached to the kit. The base sequence in the obtained recombinant DNA was decoded by a DNA sequencer. The base sequence of the hermit crab DSN gene 3 'region was determined as described above.

（３）ヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域配列の取得
以下に示す５’ＲＡＣＥ法により、ヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を解読した。反応は５’ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を用いて行った。取得したヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列をもとに、Ｙ５ＲＴ（配列番号１０）、Ｙ５Ｒ１（配列番号１１）、Ｙ５Ｒ２（配列番号１２）を作製した。
配列番号１０：５’−ｇｃｇｔｔｇａｔｇａａｇｔａｇｔａｇｇｔｇｇｃｇｔ−３’
配列番号１１：５’−ｔｇｃｔｃｇｇｃｃａｃｔｇｔｃａｃｇａａｇｔｃｔ−３’
配列番号１２：５’−ｔｇｇｔｇｇｔｃｇｇｇｇｔｃａａｔｇａｔｇｇｔ−３’ (3) Acquisition of hermit crab DSN gene 5 ′ region sequence The base sequence of the hermit crab DSN gene 5 ′ region was decoded by the 5 ′ RACE method shown below. The reaction was carried out using the reagents attached to 5 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (manufactured by Invitrogen). Based on the acquired internal sequence of the hermit crab DSN gene, Y5RT (SEQ ID NO: 10), Y5R1 (SEQ ID NO: 11), and Y5R2 (SEQ ID NO: 12) were prepared.
SEQ ID NO: 10: 5′-gcgttgatagagtagtaggtggcgt-3 ′
SEQ ID NO: 11: 5′-tgctcggccactgtcacgaagctct-3 ′
SEQ ID NO: 12: 5′-tggtgggtcgggggtatgatggt-3 ′

以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌＲＮＡ１μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌＲＮＡ、２．５μｌのプライマーＹ５ＲＴ（配列番号１０）（１μＭ）および、１２．５μｌのＲＮａｓｅＦｒｅｅＨ_２Ｏを混合し、７０℃で１０分間インキュベート後、氷上で急冷した。 CDNA was synthesized by the reverse transcription reaction shown below. Total RNA 1 μg (0.5 μl) extracted from hermit crab hepatopancreas was used as a template. 0.5 μl of Total RNA, 2.5 μl of primer Y5RT (SEQ ID NO: 10) (1 μM) and 12.5 μl of RNase Free H ₂ O were mixed, incubated at 70 ° C. for 10 minutes, and then rapidly cooled on ice.

熱処理後の混合液（１５．５μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．４ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で１分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＲｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して、反応液（全量２５μｌ）を調製した。 As a reaction buffer, 2 μl of a 10-fold concentration buffer solution (10 × PCR buffer) was added to the mixed solution (15.5 μl) after the heat treatment. dNTP was added to a final concentration of 0.4 mM, MgCl ₂ was added to a final concentration of 2.5 mM, and DTT was adjusted to 10 mM, and incubated at 42 ° C. for 1 minute. 200 U of SuperScript ™ II Reverse Transcriptase was added as a reverse transcriptase to prepare a reaction solution (total amount: 25 μl).

反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この反応液に、ＲＮａｓｅｍｉｘ１μｌを添加し３７℃で３０分間インキュベート後、該キットに添付のＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該キットに付属の仕様書に従った。 The reaction solution was incubated at 42 ° C. for 50 minutes and then incubated at 70 ° C. for 15 minutes to complete the reverse transcription reaction. To this reaction solution, 1 μl of RNase mix was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. N. A. P. The synthesized cDNA was purified using a column and eluted with 50 μl of sterile ultrapure water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the kit.

次に、ＴｄＴ−ｔａｉｌｉｎｇ反応を行った。Ｏｌｉｇｏ−ｄＣ付加酵素として、該キットに付属のＴｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を使用した。Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ精製ｃＤＮＡ１０μｌ、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ｔａｉｌｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ、ｄＣＴＰは終濃度が０．２ｍＭになるように添加して、混合液（全量２４μｌ）を調製した。 Next, TdT-tailing reaction was performed. As the oligo-dC addition enzyme, Terminal deoxynucleotidyl transfer (TdT) attached to the kit was used. S. N. A. 10 μl of P-purified cDNA, 5 μl of 5 × concentration buffer (5 × tailing buffer) was added as a reaction buffer, and dCTP was added to a final concentration of 0.2 mM to prepare a mixed solution (total amount: 24 μl). .

この混合液を９４℃で３分間インキュベートし、氷上で急冷した。ＴｄＴを１μｌ添加して反応液（全量２５μｌ）を調製し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、６５℃で１０分間インキュベートして、ＴｄＴを不活性化した。この溶液をｄＣ−ｔａｉｌｅｄｃＤＮＡ溶液とした。 This mixture was incubated at 94 ° C. for 3 minutes and quenched on ice. A reaction solution (total amount: 25 μl) was prepared by adding 1 μl of TdT, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 10 minutes to inactivate TdT. This solution was used as a dC-tailed cDNA solution.

以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の５’領域の配列を増幅した。ｄＣ−ｔａｉｌｅｄｃＤＮＡ５μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａＴａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｙ５Ｒ１（配列番号１１）およびＡＡＰ（配列番号１３）をそれぞれ終濃度０．４μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。配列番号１３において、「ｉ」は、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）であることを示す。
配列番号１３：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃｇｇｇｉｉｇｇｇｉｉｇｇｇｉｉｇ−３’ The sequence of the 5 ′ region of the hermit crab DSN gene was amplified by the following PCR. 5 μl of dC-tailed cDNA was added as a template to the reaction solution (total volume 50 μl). As a DNA polymerase, 2.5 U of TaKaRa Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer (10 × PCR buffer) was added. As primers, Y5R1 (SEQ ID NO: 11) and AAP (SEQ ID NO: 13) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.4 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM, and MgCl ₂ was added to the final concentration of 1.5 mM. In SEQ ID NO: 13, “i” indicates deoxyinosine.
SEQ ID NO: 13: 5′-ggccacgcgtcgacttagacggggiigggigigig-3 ′

サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｄ〉を得た。 As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used. A heat treatment was carried out once at 94 ° C. for 2 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 60 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes was repeated 35 times to obtain an amplification product <D>.

次に、増幅産物〈Ｄ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａＴａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｙ５Ｒ２（配列番号１２）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。 Next, the amplification product <D> was diluted 100 times with sterilized ultrapure water, and nested PCR was performed using this diluted solution as a template. 2 μl of the diluted solution was added as a template to the reaction solution (total amount: 50 μl). As a DNA polymerase, 2.5 U of TaKaRa Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer (10 × PCR buffer) was added. As primers, Y5R2 (SEQ ID NO: 12) and AUAP (SEQ ID NO: 9) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.2 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM, and MgCl ₂ was added to the final concentration of 1.5 mM.

９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約８００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｄ）レーン５’］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。 A heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was performed once, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 60 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes was repeated 35 times. The amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 800 bp PCR amplified product [FIG. 1 (d) lane 5 ′] was recovered from the agarose gel using MinElute Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), purified, and purified by sterilization. Elution was performed with 10 μl of pure water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit.

得られた産物をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＲｅａｇｅｎｔＳｅｔ〈ＢｌｕｎｔＥｎｄ〉（タカラバイオ社製）を用いて、該キットに添付のｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。 The obtained product was inserted into the pUC118 vector attached to the kit using Mighty Cloning Reagent Set <Blunt End> (manufactured by Takara Bio Inc.). The procedure for this operation was in accordance with the specifications attached to the kit. The base sequence in the obtained recombinant DNA was decoded by a DNA sequencer.

以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を決定した。このようにして最終的にヤドカリＤＳＮ遺伝子の全長ｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）が得られた。該配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号１のＤＳＮ遺伝子を有していた。 The base sequence of the hermit crab DSN gene 5 'region was determined as described above. Thus, the base sequence (SEQ ID NO: 3) of the full-length mRNA of the hermit crab DSN gene was finally obtained. The sequence had the DSN gene of SEQ ID NO: 1 encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

［実施例３］
ヤドカリＤＳＮ全長遺伝子のクローニング
実施例２によってヤドカリＤＳＮのｍＲＮＡの塩基配列からｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）を決定した我々は、この配列に基づきプライマーＹＷＰＦ１（配列番号１４）およびＹＷＰＲ１（配列番号１５）を設計し、これによってヤドカリＤＳＮ全長遺伝子（配列番号１）をクローンした。全長遺伝子の電気泳動像を図１（ｅ）に示す。
配列番号１４：５’−ｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｔｇｇａａｇａａａｇｇｔｇｔ−３’
配列番号１５：５’−ｔｇｔｇｃａｔｔａｇｔｃｇｇｔｃａｇｇａｇａｔｃａ−３’ [Example 3]
Cloning of hermit crab DSN full-length gene We determined the base sequence of cDNA (SEQ ID NO: 3) from the base sequence of hermit crab DSN according to Example 2, and based on this sequence, primers YWPF1 (SEQ ID NO: 14) and YWPR1 (SEQ ID NO: 15) ) Was designed to clone the hermit crab DSN full-length gene (SEQ ID NO: 1). An electrophoretic image of the full-length gene is shown in FIG.
SEQ ID NO: 14: 5′-ctgctgtgagggtggagaagaaggtgt-3 ′
SEQ ID NO: 15: 5′-tgtgcattagcgggtgaggata-3 ′

逆転写およびＰＣＲ反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いて行った。まず以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌＲＮＡ１μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌＲＮＡ、５μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（配列番号１６）（１０μＭ）および、６．５μｌのＲＮａｓｅＦｒｅｅＨ_２Ｏを混合し、６５℃で５分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ＲＴｂｕｆｆｅｒ）を４μｌ添加した。ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓを２μｌ、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（東洋紡社製）を１μｌ、それぞれ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。
配列番号１６：５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’ Reverse transcription and PCR reaction were performed using RiverTra-Plus-TM (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). First, cDNA was synthesized by the reverse transcription reaction shown below. Total RNA 1 μg (0.5 μl) extracted from hermit crab hepatopancreas was used as a template. 0.5 μl Total RNA, 5 μl Oligo (dT) 20 primer (SEQ ID NO: 16) (10 μM) and 6.5 μl RNase Free H ₂ O were mixed, heat-treated at 65 ° C. for 5 minutes, and then on ice Quenched quickly. As a reaction buffer, 4 μl of a 5-fold concentration buffer solution (5 × RT buffer) was added to the mixed solution (12 μl) after the heat treatment. 1 μl of RNase Inhibitor, 2 μl of 10 mM dNTPs, and 1 μl of ReverseTra Ace (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reverse transcriptase were respectively added to prepare a reaction solution (total amount 20 μl).
SEQ ID NO: 16: 5'-tttttttttttttttttttt-3 '

反応液を４２℃で２０分間インキュベート後、９９℃で５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この溶液を逆転写ｃＤＮＡ溶液とした。この逆転写ｃＤＮＡ２μｌを鋳型として、反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。 The reaction solution was incubated at 42 ° C. for 20 minutes and then incubated at 99 ° C. for 5 minutes to complete the reverse transcription reaction. This solution was used as a reverse transcription cDNA solution. Using 2 μl of this reverse transcription cDNA as a template, it was added to the reaction solution (total volume 50 μl). As a DNA polymerase, 1.0 U of KOD plus (Toyobo Co., Ltd.) was added to the reaction solution.

反応緩衝液として、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーＹＷＰＦ１（配列番号１４）およびＹＷＰＲ１（配列番号１５）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。 As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer solution (10 × PCR buffer) attached to the RiverTra-Plus-TM product was added. Primers YWPF1 (SEQ ID NO: 14) and YWPR1 (SEQ ID NO: 15) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.3 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM each, and MgSO ₄ was added so that the final concentration was 1.5 mM. As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used.

９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約１３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｅ）レーンＦ］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中（以下ｐＵＣ１１８ＹＤＳＮと呼ぶ）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ全長遺伝子をクローンし、その全配列を確認した。 A heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was performed once, and then a temperature cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 90 seconds was repeated 35 times. The amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 1300 bp PCR amplified product [Fig. 1 (e) lane F] was recovered from the agarose gel using MinElute Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), purified, and sterilized ultrapure. Elute with 20 μl of water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit. The obtained amplification product was inserted into the pUC118 vector according to a conventional method. The base sequence in the obtained recombinant DNA (hereinafter referred to as pUC118 YDSN) was decoded by a DNA sequencer. The hermit crab DSN full-length gene was cloned as described above, and its entire sequence was confirmed.

単離されたヤドカリＤＳＮｃＤＮＡのコード領域は、１２１２塩基からなる配列であり（配列番号１）、４０３アミノ酸の配列からなるポリペプチドをコードしていた（配列番号２）。ヤドカリＤＳＮは、ズワイガニＤＳＮ（非特許文献１０）に対して塩基配列レベルで６６％、アミノ酸配列レベルで６０％の同一性を示し、タラバガニＤＳＮ（非特許文献８）に対しては、塩基配列レベルで７５％、アミノ酸配列レベルで７３％の同一性を示した。 The coding region of the isolated hermit crab DSN cDNA was a sequence consisting of 1212 bases (SEQ ID NO: 1) and encoded a polypeptide consisting of a sequence of 403 amino acids (SEQ ID NO: 2). Hermit crab DSN shows 66% identity at the base sequence level and 60% at the amino acid sequence level with snow crab DSN (Non-patent Document 10), and at the base sequence level with king crab DSN (Non-Patent Document 8). Showed 75% identity and 73% identity at the amino acid sequence level.

ヤドカリＤＳＮとズワイガニＤＳＮ、クルマエビＤＮａｓｅおよびタラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントを図２に示す。図２中、ＫｕｒｕｍａはクルマエビＤＮａｓｅ、ＴａｒａｂａはタラバガニＤＳＮ、ＺｕｗａｉはズワイガニＤＳＮ、ＹａｄｏｋａｒｉはヤドカリＤＳＮのアミノ酸配列を示す。４つの配列の間で一致するアミノ酸を四角で囲んで示した。シグナルペプチド切断部位を縦二重線（‖）で示す。 A multiple alignment showing a comparison of the amino acid sequences of hermit crab DSN, snow crab DSN, tiger shrimp DNase and king crab DSN is shown in FIG. In FIG. 2, Kuruma is the prawn DNase, Taraba is the red crab DSN, Zuwai is the snow crab DSN, and Yadokari is the hermit crab DSN amino acid sequence. Amino acids that match between the four sequences are boxed. The signal peptide cleavage site is indicated by a vertical double line (‖).

シグナルペプチド切断部位は、ヤドカリＤＳＮおよびタラバガニＤＳＮについてはＳｉｇｎａｌＰ３．０ソフトウェア（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０，７８３−９５，２００４年）による予測切断部位であり、ズワイガニＤＳＮについては組換えタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析の結果（非特許文献１０）、クルマエビＤＮａｓｅについてはＷａｎｇらの実験によって明らかにされた切断部位（非特許文献３）である。 The signal peptide cleavage site is the predicted cleavage site by SignalP 3.0 software (Bendtsen et al., J. Mol. Biol., 340, 783-95, 2004) for hermit crab and king crab DSN, and paired for snow crab DSN As a result of N-terminal amino acid sequence analysis of the recombination protein (Non-patent Document 10), the prawn DNase is a cleavage site (Non-patent Document 3) clarified by the experiment of Wang et al.

ＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼファミリーのＮＵＣ保存ドメインの活性部位に相当する位置のアミノ酸残基を斜線で示した。配列中のＣｙｓ残基を灰色で示した。ヤドカリＤＳＮはＮ末端から２２アミノ酸の推定シグナル配列を有しており、全長ポリペプチドの計算分子量は４４．３ｋＤａ、予測等電点は４．２、予測成熟ポリペプチドの計算分子量は４１．８ｋＤａ、予測等電点は４．１であった。ヤドカリＤＳＮには、タラバガニＤＳＮとの間で保存された位置にある１０のＣｙｓ残基を有していた。 Amino acid residues at positions corresponding to the active site of the NUC conserved domain of the DNA / RNA non-specific endonuclease family are indicated by hatching. Cys residues in the sequence are shown in gray. Hermit crab DSN has a predicted signal sequence of 22 amino acids from the N-terminus, the calculated molecular weight of the full-length polypeptide is 44.3 kDa, the predicted isoelectric point is 4.2, the calculated molecular weight of the predicted mature polypeptide is 41.8 kDa, The predicted isoelectric point was 4.1. The hermit crab DSN had 10 Cys residues in a conserved position with the king crab DSN.

［実施例４］
組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製
実施例３によって単離されたヤドカリＤＳＮｃＤＮＡを用い、バキュロウイルス−昆虫細胞系による組換えＤＳＮ酵素の発現と精製を行った。 [Example 4]
Expression and Purification of Recombinant Hermit Crab DSN The hermit crab DSN cDNA isolated according to Example 3 was used for expression and purification of recombinant DSN enzyme by baculovirus-insect cell system.

（１）組換えバキュロウイルスの作製
以下に示すＰＣＲにより、ヤドカリＤＳＮｃＤＮＡを増幅させた。ヤドカリＤＳＮｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するために、プライマーＹＥＰＦ（配列番号１７）およびＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）を作製した。ヤドカリＤＳＮをＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として発現させるために、ＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）の５’末端側に、６×ヒスチジンをコードする塩基配列を付加した。
配列番号１７：５’−ａａｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｇｃｇａｃｇｔｃｇａｇｔａａｔ−３’
配列番号１８：５’−ｃｃｇａａｔｔｃｔｃａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｇａｇａｔｃａａｃｇｔ−３’ (1) Preparation of recombinant baculovirus Hermit crab DSN cDNA was amplified by PCR shown below. In order to insert the hermit crab DSN cDNA into the insect cell expression vector pVL1393, primers YEPF (SEQ ID NO: 17) and YEPR-His (SEQ ID NO: 18) were prepared. In order to express the hermit crab DSN as a C-terminal His-tag fusion protein, a base sequence encoding 6 × histidine was added to the 5 ′ end side of EYPR-His (SEQ ID NO: 18).
SEQ ID NO: 17: 5′-aaggatccatggagcgacgtcgagatat-3 ′
SEQ ID NO: 18: 5′-ccgaattctcaatgatgatgatgatgatgagtggtcgtcaggagagacacagt-3 ′

実施例３で作製したｐＵＣ１１８ＹＤＳＮ８ｎｇを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＹＥＰＦ（配列番号１７）およびＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。 8 ng of pUC118 YDSN prepared in Example 3 was added as a template to the reaction solution (total amount 50 μl). As a DNA polymerase, 1.0 U of KOD plus (Toyobo Co., Ltd.) was added to the reaction solution. As a reaction buffer, 5 μl of a 10-fold concentration buffer solution (10 × KOD-PCR buffer) attached to the KOD plus product was added. As primers, YEPF (SEQ ID NO: 17) and YEPR-His (SEQ ID NO: 18) were added to the reaction solution to a final concentration of 0.3 μM. dNTP was added to the reaction solution so that the final concentration was 0.2 mM each, and MgSO ₄ was added so that the final concentration was 1.5 mM.

サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。 As the thermal cycler, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by Perkin Elmer) was used. A heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was performed once, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 15 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 90 seconds was repeated 35 times.

増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約１３００ｂｐの位置にバンドが確認された。このＰＣＲ増幅産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。精製した増幅産物を、ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社製）を用いて消化後、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。制限酵素で消化した増幅産物を常法に従って、ｐＶＬ１３９３ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ（以下ｐＶＬ１３９３ＹＤＳＮ−Ｈｉｓと呼ぶ）中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読し、配列番号１と一致することを確認した。 When the amplified product was confirmed by agarose gel electrophoresis, a band was confirmed at a position of about 1300 bp. This PCR amplification product was purified using MinElute PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and eluted with 50 μl of sterilized ultrapure water. The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit. The purified amplification product was digested with EcoRI (Nippon Gene) and BamHI (Nippon Gene), purified with MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) and eluted with 20 μl of sterilized ultrapure water. The amplified product digested with the restriction enzyme was inserted into the pVL1393 vector according to a conventional method. The base sequence in the obtained recombinant DNA (hereinafter referred to as pVL1393 YDSN-His) was decoded by a DNA sequencer and confirmed to match SEQ ID NO: 1.

作製したｐＶＬ１３９３ＹＤＳＮ−Ｈｉｓ１．２μｇ、ＳａｐｐｈｉｒｅＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＤＮＡ（Ｏｒｂｉｇｅｎ社製）０．１μｇおよびＧｒａｃｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ，ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を混合して溶液Ａ（全量１００μｌ）を調製した。また、Ｇｒａｃｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ，ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ９２μｌとセルフェクチンＩＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）８μｌを混合して溶液Ｂを調製した。溶液Ａと溶液Ｂを混合して溶液Ｃを調製し、室温で３０分間静置した。 The prepared pVL1393 YDSN-His 1.2 μg, Sapphire Baculovirus DNA (Orbigen) 0.1 μg and Grace's medium, unsupplemented (Invitrogen) were mixed to prepare Solution A (total amount 100 μl). Further, Grace's medium, 92 μl of unsupplemented and 8 μl of cellfectin II reagent (manufactured by Invitrogen) were mixed to prepare solution B. Solution A and solution B were mixed to prepare solution C, which was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.

φ６０ｍｍｄｉｓｈに０．４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量４ｍｌ）で準備したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶液Ｃを添加し、２８℃で５時間インキュベートした。培地のみを除去し、新しいＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２ｍｌを添加して、２８℃で５日間インキュベートした。 Solution C was added to Sf9 cells derived from Spodoptera frugiperda (manufactured by Invitrogen) prepared at 0.4 × 10 ⁶ cells / ml (total volume: 4 ml) in a φ60 mm dish, and incubated at 28 ° C. for 5 hours. Only the medium was removed, and 2 ml of fresh Sf-900 II SFM (manufactured by Invitrogen) was added and incubated at 28 ° C. for 5 days.

ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を１ｓｔ組換えウイルス液とした。次に、組換えウイルスの感染力価を増加させるために、以下の操作を行った。１ｓｔ組換えウイルス液５００μｌを、０．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１５ｍｌ）で組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を２ｎｄ組換えウイルス液とした。 The virus-infected culture medium was centrifuged at 2,500 × rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. This supernatant was used as a 1st recombinant virus solution. Next, in order to increase the infectious titer of the recombinant virus, the following operation was performed. 500 μl of the 1st recombinant virus solution was added to Sf9 cells prepared in a tissue culture flask (manufactured by Nunc) at 0.5 × 10 ⁶ cells / ml (total volume: 15 ml), and incubated at 28 ° C. for 5 days. The virus-infected culture medium was centrifuged at 2,500 × rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. This supernatant was used as a 2nd recombinant virus solution.

次に、作製した２ｎｄ組換えウイルス液１ｍｌを、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を３ｒｄ組換えウイルス液とした。 Next, 1 ml of the prepared 2nd recombinant virus solution was added to Sf9 cells prepared in a conical flask with a vent cap (manufactured by Corning) at 1.0 × 10 ⁶ cells / ml (total volume 50 ml), and shaken at 28 ° C. The incubation was continued for 4 days. The virus-infected culture medium was centrifuged at 2,500 × rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. This supernatant was used as a 3rd recombinant virus solution.

（２）組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製
以下の手順に従い組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製を行った。作製した３ｒｄ組換えウイルス２ｍｌを、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１００ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、１８℃で振とうしながら、７日間インキュベーションした。同様の条件で、さらに１本の該フラスコ（計２００ｍｌ）で感染を行った。ウイルス感染培養液（全量２００ｍｌ）を７，０００×ｇで５分間遠心分離した。 (2) Expression and purification of recombinant hermit crab DSN Expression and purification of recombinant hermit crab DSN were performed according to the following procedure. 2 ml of the prepared 3rd recombinant virus was added to Sf9 cells prepared in an Erlenmeyer flask with a vent cap (manufactured by Corning) at 1.0 × 10 ⁶ cells / ml (100 ml in total volume) and shaken at 18 ° C. Incubated for 7 days. Under the same conditions, infection was further carried out with one flask (total 200 ml). The virus-infected culture medium (total volume 200 ml) was centrifuged at 7,000 × g for 5 minutes.

沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）２０ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静置した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、１０，０００ｇ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清中に含まれる昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質を分解した。 The precipitated cells were suspended in 20 ml of buffer A (20 mM NaH ₂ PO ₄ (pH 7.4), 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, 10% glycerol) and allowed to stand on ice for 1 hour. This suspension was subjected to ultrasonic crushing treatment, and then centrifuged at 10,000 g × 20 minutes to recover the supernatant. Proteinase K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the resulting supernatant to a final concentration of 10 μg / ml, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and derived from insect cells and baculovirus derived from the supernatant. Protein was degraded.

この処理液を１０，０００ｇ×２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清から、ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ヤドカリＤＳＮを精製した。クロマトグラフィーシステムはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅ１０Ｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。カラムの平衡化およびサンプル添加後のカラムの洗浄には緩衝液Ａを使用した。カラムに吸着したヤドカリＤＳＮの溶出は、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）を用いたリニアグラジエントによって行った。 This treatment solution was centrifuged at 10,000 g × 20 minutes, and the supernatant was collected. Hermit crab DSN was purified from the obtained supernatant using a HisTrap HP column (manufactured by GE Healthcare). As a chromatography system, AKTAexplore 10S (manufactured by GE Healthcare) was used. Buffer A was used for column equilibration and column washing after sample addition. Hermit crab DSN adsorbed on the column was eluted by a linear gradient using buffer A and buffer B (20 mM NaH ₂ PO ₄ (pH 7.4), 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, 10% glycerol).

精製各段階の画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図３に示す。図３中、各レーンは次のサンプルを示す：レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；組換えウイルス感染昆虫細胞培養上清、レーン２；細胞破砕上清、レーン３；細胞破砕沈殿、レーン４；プロテイナーゼＫ処理上清、レーン５；プロテイナーゼＫ処理沈殿、レーン６；ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム非吸着画分、レーン７；カラム洗浄画分、レーン８；溶出画分。この結果、ヤドカリＤＳＮの予測分子量に一致する単一のタンパク質バンドが観察されることを確認した（図３レーン８）。ヤドカリＤＳＮと考えられるバンドを矢印で示す。 SDS-PAGE was performed on the fractions at each purification stage. The result is shown in FIG. In FIG. 3, each lane shows the following sample: Lane M; molecular weight marker, Lane 1; recombinant virus-infected insect cell culture supernatant, Lane 2; cell disruption supernatant, Lane 3; cell disruption precipitation, Lane 4; Proteinase K-treated supernatant, lane 5; proteinase K-treated precipitate, lane 6; HisTrap HP column non-adsorbed fraction, lane 7; column wash fraction, lane 8; elution fraction. As a result, it was confirmed that a single protein band corresponding to the predicted molecular weight of the hermit crab DSN was observed (FIG. 3 lane 8). A band considered to be a hermit crab DSN is indicated by an arrow.

溶出画分をＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、等量のグリセロール（和光純薬工業社製）を添加し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール溶液として保存した。以上のような精製操作により、２００ｍｌの組換えウイルス感染培養液から、約１７０μｇの高純度酵素が得られた。 The elution fraction was subjected to buffer exchange with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) using PD-10 (manufactured by GE Healthcare), an equal amount of glycerol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and 25 mM Tris was added. -Stored as HCl (pH 7.0), 50% glycerol solution. By the purification operation as described above, about 170 μg of high-purity enzyme was obtained from 200 ml of the recombinant virus-infected culture solution.

［実施例５］
ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
（１）ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ分解活性
実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素のＤＮＡ分解活性を測定した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ、Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 [Example 5]
Double-strand specific nucleic acid cleavage activity of hermit crab DSN (1) DNA degradation activity of hermit crab DSN The DNA degradation activity of the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 was measured. Bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate. The activity was measured according to the Kunitz method (Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, 349-362, 1950). The reaction substrate solution was prepared by adding bovine thymus-derived DNA to a final concentration of 40 μg / ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl ₂ .

調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、４０℃で平衡化した。精製酵素１０μｌを添加し、すばやく攪拌した後に、波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素活性を１Ｕとした。この結果、精製酵素の活性は２６３１Ｕ／ｍｌであることが示された。 The prepared reaction substrate solution (990 μl) was added to the quartz cell and equilibrated at 40 ° C. After adding 10 μl of purified enzyme and stirring rapidly, absorbance at a wavelength of 260 nm was measured every 5 seconds. The enzyme activity that increases the absorbance at a wavelength of 260 nm per minute by 0.001 was defined as 1 U. As a result, the activity of the purified enzyme was shown to be 2631 U / ml.

（２）ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的切断活性を評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡ（タカラバイオ社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、λＤＮＡとＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 (2) Double-strand specific nucleic acid cleavage activity of hermit crab DSN The double-strand specific cleavage activity of hermit crab DSN was evaluated. ΛDNA (Nippon Gene) was used as a double-stranded DNA substrate, and M13 mp18 single strand DNA (Takara Bio) was used as a single-stranded DNA substrate. The substrate solution was prepared by adding λDNA and M13 mp18 single strand DNA to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 21 μg / ml and 10 μg / ml, respectively.

基質溶液９μｌに、実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素原液、または、該酵素溶液をＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール）で２．５、５、１０、２０、４０、８０倍希釈したサンプルを、それぞれ１μｌを添加して反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。 The stock solution of the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 or 9 μl of the substrate solution was diluted with Dilution Buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.0), 50% glycerol) to 2.5, 5, 10, 20 , 40, and 80-fold diluted samples were added to each to prepare a reaction solution. Separately, a sample to which 1 μl of Dilution Buffer was added instead of the enzyme was prepared as a negative control.

調製した反応液を６０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図４に示す。 The prepared reaction solution was incubated at 60 ° C. for 3 minutes. After completion of the reaction, 10 μl of the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, stained with SYBR Green II (manufactured by Takara Bio Inc.), and then compared with the presence or absence and density of each substrate band under UV irradiation. The electrophoresis image is shown in FIG.

図４中、レーンＭはλ／ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、各レーンの数値は酵素の希釈倍率を示す。レーンＤＢは陰性コントロールのＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示す。また図４中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。 In FIG. 4, lane M is a λ / Hind III digest DNA size marker (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the numerical value in each lane indicates the dilution ratio of the enzyme. Lane DB shows a sample to which a negative control Dilution Buffer was added. In FIG. 4, the white arrow indicates the position of λDNA, and the black arrow indicates the position of the intact molecular weight of M13 DNA.

図４に示すように、酵素を添加したすべての反応液で、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、１本鎖ＤＮＡ基質であるＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、酵素の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加した場合（図４レーンＤＢ）では、両方の基質が分解されなかった。 As shown in FIG. 4, only λDNA (open arrow), which is a double-stranded DNA substrate, is degraded in all reaction solutions to which an enzyme has been added, and M13 mp18 single strand DNA (black arrow), which is a single-stranded DNA substrate. ) Was not decomposed. On the other hand, when Dilution Buffer was added instead of the enzyme (FIG. 4, lane DB), both substrates were not decomposed.

このことから、ヤドカリＤＳＮは１本鎖ＤＮＡにはほとんど作用せず、２本鎖ＤＮＡのみを特異的に分解することが示された。また、２本鎖ＤＮＡの分解の度合いは、酵素希釈倍率に依存していた。このことは、反応系への酵素の添加量をコントロールすることで、２本鎖ＤＮＡの分解度合いをコントロールすることができることを示している。 From this, it was shown that hermit crab DSN hardly acts on single-stranded DNA and specifically degrades only double-stranded DNA. In addition, the degree of degradation of the double-stranded DNA was dependent on the enzyme dilution factor. This indicates that the degree of degradation of double-stranded DNA can be controlled by controlling the amount of enzyme added to the reaction system.

［実施例６］
ヤドカリＤＳＮの至適活性温度
ヤドカリＤＳＮの様々な温度におけるＤＮＡ分解活性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。反応基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 [Example 6]
Optimum activity temperature of hermit crab DSN The DNA degradation activity of hermit crab DSN at various temperatures was evaluated by the following method. Bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate. The reaction substrate solution was prepared by adding bovine thymus-derived DNA to a final concentration of 40 μg / ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl ₂ .

調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２０℃〜８０℃の範囲の各活性測定温度で平衡化した。活性測定には、溶液の蒸発を防ぐために蓋付きの石英セルを使用した。波長２６０ｎｍの吸光度の値が安定した後、実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素を１０μｌ添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に３分間測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。 The prepared reaction substrate solution (990 μl) was added to the quartz cell and equilibrated at each activity measurement temperature in the range of 20 ° C. to 80 ° C. For activity measurement, a quartz cell with a lid was used to prevent evaporation of the solution. After the absorbance value at a wavelength of 260 nm was stabilized, 10 μl of the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 was added and rapidly stirred. Absorbance at a wavelength of 260 nm was measured every 5 seconds for 3 minutes. The activity of 1 U was defined as the amount of enzyme that increases the absorbance at a wavelength of 260 nm per minute by 0.001.

測定結果を図５に示す。図５は、各温度において（ａ）測定された活性（Ｕ／ｍｌ）および（ｂ）相対活性（％）のグラフを示す。この結果から、ヤドカリＤＳＮの至適活性温度は約８０℃以上であることが示された。８０℃を越える温度では、基質であるウシ胸腺由来のＤＮＡの融解が始まるため正確に酵素活性を測定できなかった。８０℃（３２２０３３Ｕ／ｍｌ）でのヤドカリＤＳＮの活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示すことが分かった。 The measurement results are shown in FIG. FIG. 5 shows a graph of (a) measured activity (U / ml) and (b) relative activity (%) at each temperature. From this result, it was shown that the optimal activity temperature of the hermit crab DSN is about 80 ° C. or higher. At temperatures exceeding 80 ° C., melting of the DNA derived from the bovine thymus, which is the substrate, could not be accurately measured. When the activity of the hermit crab DSN at 80 ° C. (322033 U / ml) was regarded as the maximum activity, it was found that 70% or more of the maximum activity was exhibited in the range from 75 ° C. to 80 ° C.

一方、ヤドカリＤＳＮは、２０℃（６８Ｕ／ｍｌ）から４０℃（２６３１Ｕ／ｍｌ）までの範囲では、最大活性の１％以下の活性しか示さなかった。ヤドカリＤＳＮは室温付近の温度では、最小限の活性しか示さないが、少なくとも８０℃以上で最も高い活性を示す超好熱性酵素であった。 On the other hand, hermit crab DSN showed only 1% or less of the maximum activity in the range from 20 ° C. (68 U / ml) to 40 ° C. (2631 U / ml). Hermit crab DSN is a hyperthermophilic enzyme that exhibits minimal activity at temperatures near room temperature, but exhibits the highest activity at least above 80 ° C.

［実施例７］
様々な温度条件下におけるヤドカリＤＳＮの２本鎖特異性
ヤドカリＤＳＮの２本鎖選択性に対する反応温度の影響を評価した。１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡ（タカラバイオ社製）を、２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、λＤＮＡとＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。基質溶液９μｌにＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒで２５倍希釈したヤドカリＤＳＮ精製酵素１μｌ（０．１Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。 [Example 7]
Double-strand specificity of hermit crab DSN under various temperature conditions The effect of reaction temperature on the double-strand selectivity of hermit crab DSN was evaluated. M13 mp18 single strand DNA (Takara Bio) was used as the single-stranded DNA substrate, and λDNA (Nippon Gene) was used as the double-stranded DNA substrate. The substrate solution was prepared by adding λDNA and M13 mp18 single strand DNA to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 21 μg / ml and 10 μg / ml, respectively. A reaction solution was prepared by adding 1 μl (0.1 U) of a hermit crab DSN purified enzyme diluted 25-fold with a dilution buffer to 9 μl of a substrate solution. Separately, a sample to which 1 μl of Dilution Buffer was added instead of the enzyme was prepared as a negative control.

調製した反応液を３０、４０、５０、６０、７０℃の各温度で、３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。 The prepared reaction solution was incubated at each temperature of 30, 40, 50, 60, and 70 ° C. for 3 minutes. After completion of the reaction, 10 μl of the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, stained with SYBR Green II (manufactured by Takara Bio Inc.), and then compared with the presence or absence and density of each substrate band under UV irradiation.

得られた電気泳動像を図６に示す。図６中、レーンＭはλ／ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーンＹはヤドカリＤＳＮ添加サンプルを、レーンＢは酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示し、その上に反応温度を示した。 The obtained electrophoresis image is shown in FIG. In FIG. 6, lane M is a λ / Hind III digest DNA size marker (manufactured by Toyobo), lane Y is a hermit crab DSN-added sample, lane B is a sample to which a dilution buffer is added instead of an enzyme, The reaction temperature was indicated.

また図６中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。この結果、試験したいずれの温度においても、１本鎖ＤＮＡのバンドの消失は認められなかった。一方、２本鎖ＤＮＡのバンドは、反応温度４０、５０、６０、７０℃において、ほぼ完全に消失した。３０℃の場合は、ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ分解活性が低く、３分の反応時間では完全に分解されなかったと考えられる。 In FIG. 6, the white arrow indicates the position of λDNA and the black arrow indicates the position of the intact molecular weight of M13 DNA. As a result, no disappearance of the single-stranded DNA band was observed at any of the temperatures tested. On the other hand, the double-stranded DNA band disappeared almost completely at reaction temperatures of 40, 50, 60, and 70 ° C. In the case of 30 ° C., the hermit crab DSN has a low DNA degrading activity, and it is considered that it was not completely degraded in a reaction time of 3 minutes.

図６に示す結果から、ヤドカリＤＳＮは３０℃から７０℃の広い温度範囲において、１本鎖ＤＮＡを分解する活性が極めて低いか、分解活性を持たないこと、および該酵素が２本鎖ＤＮＡに対して非常に高い選択性を有することがわかった。さらに、ヤドカリＤＳＮが４０℃以上の温度で、より高い２本鎖核酸選択性を有し、また７０℃でさらに高い２本鎖核酸選択性を有することがわかった。 From the results shown in FIG. 6, the hermit crab DSN has a very low activity or no activity in degrading single-stranded DNA in a wide temperature range from 30 ° C. to 70 ° C. It was found to have very high selectivity for it. Furthermore, it was found that the hermit crab DSN has a higher double-stranded nucleic acid selectivity at a temperature of 40 ° C. or higher and a higher double-stranded nucleic acid selectivity at 70 ° C.

［実施例８］
ヤドカリＤＳＮの耐熱性
ヤドカリＤＳＮは、マグネシウム存在下では高い耐熱性を示すが、マグネシウムが存在しない条件下では、その耐熱性が減弱するという性質を持つ。この性質を評価するために以下の実験を実施した。 [Example 8]
Hermit crab DSN heat resistance Hermit crab DSN has high heat resistance in the presence of magnesium, but has the property that its heat resistance is reduced in the absence of magnesium. The following experiment was conducted to evaluate this property.

（１）熱処理後の残存活性
ヤドカリＤＳＮのマグネシウム存在下での熱安定性を以下の方法で評価した。はじめに、ヤドカリＤＳＮを含まない反応基質溶液を調製した。反応基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）が終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 (1) Residual activity after heat treatment The thermal stability of the hermit crab DSN in the presence of magnesium was evaluated by the following method. First, a reaction substrate solution containing no hermit crab DSN was prepared. The reaction substrate solution was prepared by adding bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl ₂ to a final concentration of 40 μg / ml.

調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、４０℃で平衡化した。次に実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素に１００ｍＭＭｇＣｌ_２を添加して、終濃度が１４ｍＭとなるよう調製し、基質ＤＮＡが存在しない条件下で、５０℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃の各温度で、５、１０、１５、２０、３０分間インキュベーションした後、その１０μｌを取り、前記の反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌し、活性測定を行った。 The prepared reaction substrate solution (990 μl) was added to the quartz cell and equilibrated at 40 ° C. Next, 100 mM MgCl ₂ was added to the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 to prepare a final concentration of 14 mM. Under conditions where no substrate DNA was present, 50 ° C., 60 ° C., 65 ° C., After incubation at 70 ° C., 75 ° C., and 80 ° C. for 5, 10, 15, 20, and 30 minutes, 10 μl of the sample was taken, added to the reaction substrate solution, rapidly stirred, and the activity was measured. .

活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。 The activity was measured according to the Kunitz method (Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, 349-362, 1950). Absorbance at a wavelength of 260 nm was measured every 5 seconds. The activity of 1 U was defined as the amount of enzyme that increases the absorbance at a wavelength of 260 nm per minute by 0.001.

熱処理前の活性に対する、熱処理後の相対活性（％）の変化を図７（ａ）に示す。図７（ａ）に示すように、５０℃、６０℃、および６５℃の各温度で処理した酵素は、３０分経過後でも、熱処理前と同等の活性を保持していた。７０℃で処理した酵素は、３０分経過後でも、熱処理前の６０％以上の活性を保持していた。７５℃で処理した酵素は、１０分経過後に熱処理前の約３０％の活性となった。８０℃で処理した酵素は、５分経過後に約１０％まで減少した。 FIG. 7A shows the change in relative activity (%) after heat treatment relative to the activity before heat treatment. As shown in FIG. 7 (a), the enzyme treated at 50 ° C., 60 ° C., and 65 ° C. retained the same activity as before the heat treatment even after 30 minutes. The enzyme treated at 70 ° C. retained 60% or more of the activity before heat treatment even after 30 minutes. The enzyme treated at 75 ° C became about 30% active before heat treatment after 10 minutes. The enzyme treated at 80 ° C. decreased to about 10% after 5 minutes.

この結果は、ヤドカリＤＳＮが、マグネシウム存在下で少なくとも７０℃までの温度では、３０分間の加熱に耐えて約６０％の活性を保持できる耐熱性を有することを示す。また、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下では、７５℃および８０℃でもＤＮＡ分解活性を保持していることが示された。この結果は、実施例６のヤドカリＤＳＮが８０℃以上の温度でも数分間であれば、酵素活性を保持し、最大活性を発揮できるという結果と一致し、ヤドカリＤＳＮがこれまでに報告されたＤＳＮと比較して、高い耐熱性を有することを示している。 This result indicates that the hermit crab DSN has heat resistance that can withstand heating for 30 minutes and retain about 60% activity at temperatures up to at least 70 ° C. in the presence of magnesium. In addition, hermit crab DSN was shown to retain DNA degradation activity even at 75 ° C. and 80 ° C. in the presence of magnesium. This result is consistent with the result that the hermit crab DSN of Example 6 can retain the enzyme activity and exhibit the maximum activity if the hermit crab DSN is at a temperature of 80 ° C. or more for several minutes, and the hermit crab DSN has been reported so far. It has shown that it has high heat resistance compared with.

マグネシウムが存在しない条件で、同様の実験を行った場合の結果を図７（ｂ）に示す。図７（ｂ）に示すように、６０℃で処理した酵素は３０分経過後でも熱処理前の約８０％の活性を保持していたが、６５℃で処理した酵素は、３０分経過後では約２０％の活性しか残存しなかった。さらに７０℃以上の温度での処理では、５分経過後には、約１０％の活性しか残存しなかった。 FIG. 7 (b) shows the result when a similar experiment is performed under the condition that magnesium is not present. As shown in FIG. 7B, the enzyme treated at 60 ° C. retained about 80% of the activity even after 30 minutes, but the enzyme treated at 65 ° C. Only about 20% activity remained. Further, in the treatment at a temperature of 70 ° C. or higher, only about 10% of the activity remained after 5 minutes.

マグネシウム存在条件下では、７０℃での熱処理では、５分経過後では約９０％、３０分経過後でも６０％以上の高い残存活性を保持していたことから、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で耐熱性が顕著に向上する酵素であることが示された。 Under the presence of magnesium, heat treatment at 70 ° C. maintained a high residual activity of about 90% after 5 minutes and 60% or more after 30 minutes, and hermit crab DSN was heat resistant in the presence of magnesium. It was shown to be an enzyme with significantly improved sex.

（２）７０℃での熱処理後の残存活性
ヤドカリＤＳＮに７０℃で熱処理を加えた場合の熱安定性を以下の方法で評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、λＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール）と１００ｍＭＭｇＣｌ_２により、１４ｍＭＭｇＣｌ_２を含むヤドカリＤＳＮ精製酵素（０．０５Ｕ／μｌ）を調製した。 (2) Residual activity after heat treatment at 70 ° C. Thermal stability when hermit crab DSN was heat treated at 70 ° C. was evaluated by the following method. ΛDNA (manufactured by Nippon Gene) was used as a double-stranded DNA substrate. The substrate solution was prepared by adding λDNA to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl ₂ so that the final concentration was 21 μg / ml. Dilution Buffer (25mM Tris-HCl ( pH7.0), 50% glycerol) by a 100 mM MgCl _2, was prepared Yadokari DSN purified enzyme (0.05 U / [mu] l) containing 14 mM MgCl _2.

陰性コントロールとして、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒと滅菌ミリＱ水により、ＭｇＣｌ_２を含まないヤドカリＤＳＮ精製酵素（０．０５Ｕ／μｌ）も調製した。各酵素液１０μｌを、７０℃で１５分間熱処理した後、氷上で保存した。基質溶液９μｌに７０℃で１５分間熱処理した各酵素１μｌ（０．０５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。陽性コントロールとして熱処理していない酵素１μｌ（０．０５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。 As a negative control, a hermit crab DSN purified enzyme (0.05 U / μl) containing no MgCl ₂ was also prepared using Dilution Buffer and sterile Milli-Q water. 10 μl of each enzyme solution was heat-treated at 70 ° C. for 15 minutes and then stored on ice. 1 μl (0.05 U) of each enzyme heat-treated at 70 ° C. for 15 minutes was added to 9 μl of the substrate solution to prepare a reaction solution. As a positive control, 1 μl (0.05 U) of an enzyme that was not heat-treated was added to prepare a reaction solution.

調製した反応液を７０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図７（ｃ）に示す。 The prepared reaction solution was incubated at 70 ° C. for 3 minutes. After completion of the reaction, 10 μl of the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, stained with SYBR Green II (manufactured by Takara Bio Inc.), and then compared with the presence or absence of the substrate band and the density under UV irradiation. The electrophoresis image is shown in FIG.

図７（ｃ）中、レーンＭはλ／ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーン１、２は、マグネシウムを含む酵素液を７０℃で熱処理した後にＤＮＡ分解反応に供した結果を、レーン３は、マグネシウムを含む酵素液を熱処理せずにＤＮＡ分解反応に供した結果を示す。レーン４、５は、マグネシウムを含まない酵素液を７０℃で熱処理した後にＤＮＡ分解反応に供した結果を、レーン６は、マグネシウムを含まない酵素液を熱処理せずにＤＮＡ分解反応に供した結果を示す。レーンＤＢは酵素液の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示す。また図７（ｃ）中、白抜き矢印はλＤＮＡの無傷の分子量の位置を示す。 In FIG. 7C, lane M is a λ / Hind III digest DNA size marker (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and lanes 1 and 2 are the results of subjecting the enzyme solution containing magnesium to a DNA degradation reaction after heat treatment at 70 ° C. Lane 3 shows the result of subjecting the enzyme solution containing magnesium to a DNA degradation reaction without heat treatment. Lanes 4 and 5 show the result of subjecting the enzyme solution not containing magnesium to a DNA degradation reaction after heat treatment at 70 ° C., and Lane 6 shows the result of subjecting the enzyme solution not containing magnesium to a DNA degradation reaction without heat treatment. Indicates. Lane DB shows the sample which added Dilution Buffer instead of the enzyme solution. In FIG. 7C, the white arrow indicates the position of the intact molecular weight of λDNA.

図７（ｃ）に示すように、レーン１、２のマグネシウム存在下で、７０℃で熱処理したヤドカリ精製酵素は、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡを、ほぼ完全に分解した。λＤＮＡの分解度合いはレーン３、６の熱処理していないヤドカリ精製酵素と同等レベルと考えられるので、ヤドカリ精製酵素はマグネシウム存在下では、７０℃での熱処理でほとんど失活しないと考えられる。 As shown in FIG. 7C, the hermit crab purified enzyme heat-treated at 70 ° C. in the presence of magnesium in lanes 1 and 2 almost completely degraded λDNA, which is a double-stranded DNA substrate. Since the degree of degradation of λDNA is considered to be the same level as that of the uncured hermit crab purified enzyme in Lanes 3 and 6, it is considered that the hermit crab purified enzyme is hardly inactivated by heat treatment at 70 ° C. in the presence of magnesium.

一方、レーン４、５のマグネシウム非存在下で、熱処理したヤドカリ精製酵素は、λＤＮＡをわずかに分解したが大部分が残存していた。この結果は前述の実験（１）で得られた、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で、７０℃で１５分間の熱処理で約８０％の活性を保持し、マグネシウム非存在下では、７０℃の熱処理でほぼ失活するという結果と合致する。 On the other hand, the hermit crab purified enzyme that had been heat-treated in the absence of magnesium in lanes 4 and 5 slightly degraded λDNA, but most remained. This result was obtained in the above-mentioned experiment (1). Hermit crab DSN retained about 80% of the activity by heat treatment at 70 ° C. for 15 minutes in the presence of magnesium, and by heat treatment at 70 ° C. in the absence of magnesium. This is consistent with the result of almost inactivation.

［実施例９］
ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨ
ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨを以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。 [Example 9]
Optimum pH of hermit crab DSN
The optimum pH of the hermit crab DSN was evaluated by the following method. Bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate. The activity was measured according to the Kunitz method (Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, 349-362, 1950).

各ｐＨの反応基質溶液は、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５の場合は、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍＡｃｅｔａｔｅを、ｐＨ６、ｐＨ６．５の場合は、５０ｍＭＭｅｓ−ＮａＯＨを、ｐＨ７、ｐＨ７．５の場合は５０ｍＭＨＥＰＥＳを、ｐＨ８、ｐＨ８．５、ｐＨ９の場合は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを、ｐＨ９．５、ｐＨ１０の場合は、５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨを用いて調製し、これらの各溶液にＭｇＣｌ_２を１４ｍＭおよびウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 The reaction substrate solution at each pH is 50 mM sodium acetate for pH 3.5, pH 4, pH 4.5, pH 5, pH 5.5, 50 mM Mes-NaOH for pH 6, pH 6.5, pH 7, pH 7 In the case of .5, 50 mM HEPES is prepared using 50 mM Tris-HCl in the case of pH 8, pH 8.5, pH 9, and in the case of pH 9.5 and pH 10, using 50 mM Glycine-NaOH. MgCl ₂ was prepared by adding 14 mM and bovine thymus-derived DNA to a final concentration of 40 μg / ml.

調製した各ｐＨの反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、５０℃で平衡化した。実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。 The prepared reaction substrate solution (990 μl) at each pH was added to the quartz cell and equilibrated at 50 ° C. 10 μl of the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 was added to the reaction substrate solution and rapidly stirred. Absorbance at a wavelength of 260 nm was measured every 5 seconds. The activity of 1 U was defined as the amount of enzyme that increases the absorbance at a wavelength of 260 nm per minute by 0.001.

最大の活性が得られたｐＨの反応液の活性を１００％とした場合の相対活性を図８に示す。図８に示すように、ヤドカリＤＳＮがｐＨ６で最大の活性があることを示している。 FIG. 8 shows the relative activity when the activity of the reaction solution at the pH at which the maximum activity was obtained is 100%. As shown in FIG. 8, the hermit crab DSN shows maximum activity at pH 6.

［実施例１０］
ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性
ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。 [Example 10]
Hermit crab DSN's magnesium ion requirement The hermit crab DSN's magnesium ion requirement was evaluated by the following method. Bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate. The activity was measured according to the Kunitz method (Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, 349-362, 1950).

反応基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に、ＭｇＣｌ_２をそれぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ添加し、この溶液にウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 The reaction substrate solution was 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and MgCl ₂ was 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 respectively. , 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, and this solution was prepared by adding bovine thymus-derived DNA to a final concentration of 40 μg / ml.

調製した各反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、７０℃で平衡化した。実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。 Each prepared reaction substrate solution (990 μl) was added to a quartz cell and equilibrated at 70 ° C. 10 μl of the hermit crab DSN purified enzyme obtained in Example 4 was added to the reaction substrate solution and rapidly stirred. Absorbance at a wavelength of 260 nm was measured every 5 seconds. The activity of 1 U was defined as the amount of enzyme that increases the absorbance at a wavelength of 260 nm per minute by 0.001.

最大の活性が得られた基質溶液の活性を１００％とした場合の相対活性を図９に示す。図９に示すように、ヤドカリＤＳＮは、ＭｇＣｌ_２を５０ｍＭ含む反応液で最大の活性を示し、１０ｍＭから１００ｍＭの広い範囲のマグネシウムイオン濃度で最大活性の３０％以上の高い活性を示した。 FIG. 9 shows the relative activity when the activity of the substrate solution from which the maximum activity was obtained was taken as 100%. As shown in FIG. 9, hermit crab DSN showed the maximum activity in a reaction solution containing 50 mM MgCl ₂ , and showed a high activity of 30% or more of the maximum activity in a wide range of magnesium ion concentrations from 10 mM to 100 mM.

［実施例１１］
ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性
ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性を評価した。ＲＮＡ基質として昆虫細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いた。５×１０^６個のＳｆ９細胞から、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。 [Example 11]
Hermit Crab DSN RNA Degrading Activity Hermit Crab DSN RNA Degrading Activity was evaluated. Insect cell-derived total RNA was used as the RNA substrate. Total RNA was extracted from 5 × 10 ⁶ Sf9 cells using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN). The procedure of the purification operation was in accordance with the specifications attached to the purification kit.

５×１０^６個のＳｆ９細胞から、５．４μｇのＴｏｔａｌＲＮＡが得られた。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、ＲＮＡ基質として上記で調製した昆虫細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いた。基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、λＤＮＡとＴｏｔａｌＲＮＡを、終濃度がそれぞれ５．２５μｇ／ｍｌと１８μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。 5.4 μg of total RNA was obtained from 5 × 10 ⁶ Sf9 cells. ΛDNA (manufactured by Nippon Gene) was used as a double-stranded DNA substrate, and insect cell-derived total RNA prepared above was used as an RNA substrate. The substrate solution was prepared by adding λDNA and Total RNA to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 5.25 μg / ml and 18 μg / ml, respectively.

基質溶液９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素１μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロール、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を１μｌ（５Ｕ）添加したサンプルを陽性コントロール、および、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＴ１の混合液であるＲＮａｓｅｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ添加したサンプルを陽性コントロールとして調製した。 The reaction solution was prepared by adding 1 μl (2.6 U) of the hermit crab DSN purified enzyme to 9 μl of the substrate solution. Separately, instead of enzyme, a sample to which 1 μl of Dilution Buffer is added is a negative control, a sample to which 1 μl (5 U) of DNase I (Takara Bio) is added is a positive control, and a mixed solution of RNase H and RNase T1 A sample to which 1 μl of RNase mix (manufactured by Invitrogen) was added was prepared as a positive control.

調製した各反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。 Each prepared reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, 10 μl of the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, stained with SYBR Green II (manufactured by Takara Bio Inc.), and then compared with the presence or absence and density of each substrate band under UV irradiation.

その電気泳動像を図１０に示す。図１０中、レーンＭはλ／ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーン１はＲＮａｓｅｍｉｘ、レーン２はヤドカリＤＳＮ精製酵素、レーン３はＤＮａｓｅＩ、レーン４はＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加した反応液である。 The electrophoresis image is shown in FIG. In FIG. 10, lane M is a λ / Hind III digest DNA size marker (Toyobo Co., Ltd.), lane 1 is RNase mix, lane 2 is a hermit crab DSN purified enzyme, lane 3 is DNase I, and lane 4 is a dilution buffer. It is a liquid.

図１０に示すように、ヤドカリＤＳＮ精製酵素を添加した反応液（図１０レーン２）では、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、ＴｏｔａｌＲＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、該精製酵素の代わりにＲＮａｓｅｍｉｘを添加した場合（図１０レーン１）では、ＴｏｔａｌＲＮＡ（黒矢印）のみが分解され、２本鎖ＤＮＡ基質であるλ ＤＮＡ（白抜き矢印）は分解されなかった。 As shown in FIG. 10, in the reaction solution to which the hermit crab DSN purified enzyme was added (FIG. 10, lane 2), only the double-stranded DNA substrate λDNA (open arrow) was degraded, and the total RNA (black arrow) was degraded. Was not. On the other hand, when RNase mix is added instead of the purified enzyme (FIG. 10, lane 1), only Total RNA (black arrow) is degraded, and λ DNA (open arrow), which is a double-stranded DNA substrate, is degraded. There wasn't.

ヤドカリＤＳＮ精製酵素の代わりにＤＮａｓｅＩを添加した場合（図１０レーン３）は２本鎖ＤＮＡ基質であるλ ＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、ＴｏｔａｌＲＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。また、酵素の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加した場合（図１０レーン４）では、両方の基質が分解されなかった。これらのことから、ヤドカリＤＳＮは、ＲＮＡを分解せず、２本鎖ＤＮＡを特異的に分解することが示された。 When DNase I was added instead of the hermit crab DSN purified enzyme (FIG. 10, lane 3), only the double-stranded DNA substrate λ DNA (open arrow) was degraded, and total RNA (black arrow) was not degraded. . Moreover, when Dilution Buffer was added instead of the enzyme (FIG. 10, lane 4), both substrates were not decomposed. These facts indicate that hermit crab DSN does not degrade RNA but specifically degrades double-stranded DNA.

［実施例１２］
ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性
ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を評価した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、ＲＮＡ鎖としてＰｏｌｙＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）を、ＤＮＡ鎖として５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号１９）を用いた。
配列番号１９：５’−ＦＡＭ−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−Ｑ−３’ [Example 12]
Degradation activity of hermit crab DSN-RNA hybrid strand The degradation activity of the hermit crab DSN-RNA hybrid strand was evaluated. In order to prepare a DNA-RNA hybrid chain, Poly A (manufactured by Roche) was used as the RNA chain, 5 ′ end was used as the DNA chain, FAM 3 ′ end was modified with Eclipse Dark Quencher (Q) (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 19) was used.
SEQ ID NO: 19: 5′-FAM-tttttttttttttttttttttttt-Q-3 ′

基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、ＰｏｌｙＡとＤＮＡプローブを、終濃度がそれぞれ１２．５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。別に、ＤＮＡプローブを単独で添加した基質溶液も調製した。 The substrate solution was prepared by adding Poly A and DNA probe to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 12.5 nmol / ml and 0.5 nmol / ml, respectively. . Separately, a substrate solution to which the DNA probe was added alone was also prepared.

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、基質溶液を室温で３０分間放置し、ハイブリダイゼーションを行った。次に、該基質溶液１９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素１μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。 In order to prepare a DNA-RNA hybrid chain, the substrate solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes for hybridization. Next, 1 μl (2.6 U) of a hermit crab DSN purified enzyme was added to 19 μl of the substrate solution to prepare a reaction solution.

別に、酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。調製した反応液を３７℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｃｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。 Separately, a sample to which 1 μl of Dilution Buffer was added instead of the enzyme was prepared as a negative control. The prepared reaction solution was incubated at 37 ° C., the fluorescence value was measured every 30 seconds, and the measurement was performed up to 50 minutes. The fluorescence value was measured using a DNA Engine Opticon System (manufactured by MJ Research).

測定結果を図１１（ａ）に、反応開始２０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きを図１１（ｂ）に示す。図１１（ａ）および（ｂ）に示すように、ＰｏｌｙＡ、ＤＮＡプローブおよびヤドカリＤＳＮ（ＹＤＳＮ）を添加したサンプルは、反応開始直後から急激に相対蛍光強度（ＲＦＵ）値が増加した。一方、ＹＤＳＮを添加していないサンプル、および、ＹＤＳＮとＤＮＡプローブのみを添加したサンプルのＲＦＵ値の増加量は、ＰｏｌｙＡ、ＤＮＡプローブおよびＹＤＳＮを添加したサンプルと比較して、顕著に少なかった。 FIG. 11 (a) shows the measurement results, and FIG. 11 (b) shows the slope of the increase in relative fluorescence intensity (RFU) value up to 20 minutes after the start of the reaction. As shown in FIGS. 11 (a) and 11 (b), the sample to which Poly A, DNA probe and hermit crab DSN (YDSN) were added increased the relative fluorescence intensity (RFU) value immediately after the start of the reaction. On the other hand, the amount of increase in the RFU value of the sample to which YDSN was not added and the sample to which only YDSN and DNA probe were added were significantly smaller than those of the sample to which Poly A, DNA probe and YDSN were added.

この結果から、ＰｏｌｙＡとＤＮＡプローブがＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成できる条件下で、ヤドカリＤＳＮが、該ハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を分解して蛍光の増加をもたらしたことがわかった。本反応の模式図を図１２に示す。 From this result, it was found that under conditions where Poly A and a DNA probe can form a DNA-RNA hybrid chain, hermit crab DSN degraded the DNA chain in the hybrid chain and caused an increase in fluorescence. A schematic diagram of this reaction is shown in FIG.

また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成することのできない条件下、すなわち反応中にＲＮＡが存在しない場合は、ＤＮＡプローブは１本鎖の状態にあり、ヤドカリＤＳＮによってほんど分解されないことも示された。従って、ヤドカリＤＳＮが１本鎖ＤＮＡに対しては、ほとんど分解活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を特異的に分解することが示された。 It was also shown that under conditions where DNA-RNA hybrid strands cannot be formed, that is, when no RNA is present during the reaction, the DNA probe is in a single-stranded state and is hardly degraded by the hermit crab DSN. . Therefore, it was shown that the hermit crab DSN hardly decomposes against single-stranded DNA and specifically degrades the DNA strand in the DNA-RNA hybrid strand.

［実施例１３］
ヤドカリＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解活性
ヤドカリＤＳＮの１本鎖ＤＮＡの分解活性を評価した。１本鎖ＤＮＡとして５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号１９）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。 [Example 13]
Hermit Crab DSN Single-Strand DNA Degradation Activity Hermit Crab DSN Single-Strand DNA Degradation Activity was evaluated. As a single-stranded DNA, an oligo DNA (SEQ ID NO: 19) in which the 5 ′ end was modified with FAM and the 3 ′ end was modified with Eclipse Dark Quencher (Q) was used. The substrate solution was prepared by adding to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentration was 0.5 nmol / ml.

次に、該基質溶液１９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素１μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロール、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を１μｌ（５Ｕ）添加したサンプルを陽性コントロールとして調製した。 Next, 1 μl (2.6 U) of a hermit crab DSN purified enzyme was added to 19 μl of the substrate solution to prepare a reaction solution. Separately, instead of the enzyme, a sample to which 1 μl of Dilution Buffer was added was prepared as a negative control, and a sample to which 1 μl (5 U) of DNase I (Takara Bio) was added was prepared as a positive control.

調製した反応液を３７℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｃｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。 The prepared reaction solution was incubated at 37 ° C., the fluorescence value was measured every 30 seconds, and the measurement was performed up to 50 minutes. The fluorescence value was measured using a DNA Engine Opticon System (manufactured by MJ Research).

測定結果を図１３（ａ）に、反応開始５０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きを図１３（ｂ）に示す。図１３（ａ）および（ｂ）に示すように、ＤＮＡプローブおよびヤドカリＤＳＮ（ＹＤＳＮ）を添加したサンプルの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値は全く増加しなかった。陽性コントロールとしてＤＮａｓｅＩを添加したサンプルは、反応開始直後から急激にＲＦＵ値が増加した。一方、陰性コントロールとしてＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加したサンプルは、ＹＤＳＮ添加サンプルと同様にＲＦＵ値は全く増加しなかった。 The measurement results are shown in FIG. 13 (a), and the slope of the increase in relative fluorescence intensity (RFU) value up to 50 minutes from the start of the reaction is shown in FIG. 13 (b). As shown in FIGS. 13A and 13B, the relative fluorescence intensity (RFU) value of the sample to which the DNA probe and the hermit crab DSN (YDSN) were added did not increase at all. In the sample to which DNase I was added as a positive control, the RFU value increased rapidly immediately after the start of the reaction. On the other hand, the sample added with Dilution Buffer as a negative control did not increase the RFU value at all like the YDSN-added sample.

この結果から、核酸選択性を持たないＤＮａｓｅＩは１本鎖ＤＮＡを分解するのに対して、２本鎖ＤＮＡを特異的に分解する酵素であるヤドカリＤＳＮは、１本鎖ＤＮＡを全く分解しないことが示された。 From this result, DNase I, which does not have nucleic acid selectivity, degrades single-stranded DNA, whereas hermit crab DSN, an enzyme that specifically degrades double-stranded DNA, does not degrade single-stranded DNA at all. It was shown that.

［実施例１４］
ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出
ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出方法を評価した。実施例１２では、ヤドカリＤＳＮは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を特異的に分解することが示された。また、実施例１３では、ヤドカリＤＳＮが１本鎖のＤＮＡを全く分解しないことが示された。これらのことから、図１２に示した反応が、ＰｏｌｙＡ以外の任意のヌクレオチド配列をもつＲＮＡについても、進行すると推測される。 [Example 14]
Detection of sequence-specific RNA using hermit crab DSN A method of detecting sequence-specific RNA using hermit crab DSN was evaluated. In Example 12, hermit crab DSN was shown to specifically degrade the DNA strand in the DNA-RNA hybrid strand. Moreover, in Example 13, it was shown that the hermit crab DSN does not degrade single-stranded DNA at all. From these facts, it is presumed that the reaction shown in FIG. 12 proceeds also for RNA having an arbitrary nucleotide sequence other than Poly A.

検出対象のＲＮＡとしてＴａｒｇｅｔ４１８−４４４（配列番号２０）を、検出用のＤＮＡプローブとして５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２１）を用いた。なお、配列表の配列番号２０で示される塩基配列において、「ｔ」は「ｕ（ウラシル）」を示す。
配列番号２０：５’−ｇｇｇａｇｇａａｇｇｇａｇｕａａａｇｕｕａａｕａｃｃｕ−３’
配列番号２１：５’−ＦＡＭ−ｇｇｔａｔｔａａｃｔｔｔａｃｔｃｃｃｔｔｃｃ−Ｑ−３’ Target 418-444 (SEQ ID NO: 20) was used as the RNA to be detected, and oligo DNA (SEQ ID NO: 21) in which the 5 'end was modified with FAM and the 3' end with Eclipse Dark Quencher (Q) was used as the detection DNA probe. . In the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing, “t” represents “u (uracil)”.
SEQ ID NO: 20: 5′-gggaggaagggagauaaguauaaccu-3 ′
SEQ ID NO: 21: 5′-FAM-ggttattattttaccccttcc-Q-3 ′

基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２、１０％ポリエチレングリコール６０００（和光純薬工業社製）に、ＤＮＡプローブを、終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。該基質溶液１８μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素１μｌ（２．６Ｕ）、および、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を終濃度がそれぞれ、５、４、３、２、１ｐｍｏｌ／ｍｌになるように添加して、反応液を調製した。Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４の代わりに滅菌超純水を添加したサンプルを陰性コントロールとした。 The substrate solution was added to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 14 mM MgCl ₂ , 10% polyethylene glycol 6000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so that the final concentration was 0.5 nmol / ml. Prepared. Prepare a reaction solution by adding 1 μl (2.6 U) of hermit crab DSN purified enzyme and Target 418-444 to 18 μl of the substrate solution to a final concentration of 5, 4, 3, 2, 1 pmol / ml, respectively. did. A sample to which sterile ultrapure water was added instead of Target 418-444 was used as a negative control.

調製した反応液を５４℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｃｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。 The prepared reaction solution was incubated at 54 ° C., the fluorescence value was measured every 30 seconds, and the measurement was performed up to 50 minutes. The fluorescence value was measured using a DNA Engine Opticon System (manufactured by MJ Research).

測定結果を図１４（ａ）に示し、各Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４濃度の反応開始３０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きをプロットした結果を図１４（ｂ）に示す。図１４（ａ）に示すように、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を添加した反応液は、相対蛍光強度（ＲＦＵ）値が時間の経過とともに徐々に増加した。Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４の代わりに滅菌超純水を添加した反応液のＲＦＵ値の増加量は、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を添加した反応液と比較して顕著に少なかった。また、図１４（ｂ）に示すように、ＲＦＵ値の増加の傾きとＴａｒｇｅｔ４１８−４４４濃度は、正比例しており、高い相関関係があることがわかった。 The measurement results are shown in FIG. 14 (a), and the results of plotting the slope of the increase in relative fluorescence intensity (RFU) value for each Target 418-444 concentration up to 30 minutes from the start of the reaction are shown in FIG. 14 (b). As shown in FIG. 14A, in the reaction solution to which Target 418-444 was added, the relative fluorescence intensity (RFU) value gradually increased with time. The amount of increase in the RFU value of the reaction solution in which sterilized ultrapure water was added instead of Target 418-444 was significantly smaller than that in the reaction solution to which Target 418-444 was added. Moreover, as shown in FIG.14 (b), it turned out that the inclination of the increase of RFU value and Target418-444 density | concentration are directly proportional and have a high correlation.

この結果から、ヤドカリＤＳＮと検出対象ＲＮＡに相補的なプローブＤＮＡを用いれば、ヌクレオチド配列特異的にＲＮＡを検出できることがわかった。本反応の模式図を図１５に示す。また、本実施例では、ＴａｒｇｅｔＲＮＡ量とＲＦＵ増加量間に、高い相関があることから、該検出方法は配列特異性だけでなく、定量性もあることを示している。 From this result, it was found that RNA can be detected in a nucleotide sequence-specific manner by using a probe DNA complementary to the hermit crab DSN and the RNA to be detected. A schematic diagram of this reaction is shown in FIG. Further, in this example, since there is a high correlation between the amount of Target RNA and the amount of increase in RFU, this indicates that the detection method has not only sequence specificity but also quantification.

［実施例１５］
ヤドカリＤＳＮのミスマッチ塩基の認識
ヤドカリＤＳＮのミスマッチ塩基の認識能を評価した。完全マッチ２本鎖ＤＮＡ溶液を調製するために、完全マッチＤＮＡ（配列番号２２）および、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２３）を用いた。
配列番号２２：５’−ａｇａａｔｔａｃｃｃ−３’
配列番号２３：５’−ＦＡＭ−ａｇｔｇａｇｇｇｔａａｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ−Ｑ−３’ [Example 15]
Recognition of mismatch bases of hermit crab DSN The ability to recognize mismatch bases of hermit crab DSN was evaluated. In order to prepare a perfect match double-stranded DNA solution, a perfect match DNA (SEQ ID NO: 22) and an oligo DNA (SEQ ID NO: 23) modified at the 5 ′ end with FAM and at the 3 ′ end with Eclipse Dark Quencher (Q) were prepared. Using.
SEQ ID NO: 22: 5'-agaattaccc-3 '
SEQ ID NO: 23: 5′-FAM-agtgagggtataattctctctctc-Q-3 ′

完全マッチＤＮＡ基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、これらのＤＮＡを終濃度がそれぞれ５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。次に、ミスマッチ２本鎖ＤＮＡ溶液を調製するために、ミスマッチＤＮＡ（配列番号２４）および、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２３）を用いた。
配列番号２４：５’−ａｇａａｇｔａｃｃｃ−３’ A perfect match DNA substrate solution was prepared by adding these DNAs to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 5 nmol / ml and 0.5 nmol / ml, respectively. Next, in order to prepare a mismatched double-stranded DNA solution, a mismatch DNA (SEQ ID NO: 24) and an oligo DNA (SEQ ID NO: 23) in which the 5 ′ end is modified with FAM and the 3 ′ end is modified with Eclipse Dark Quencher (Q) Was used.
SEQ ID NO: 24: 5′-agaagtacccc-3 ′

ミスマッチＤＮＡ基質溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭＭｇＣｌ_２に、これらのＤＮＡを終濃度がそれぞれ５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。別に、ＤＮＡプローブを単独で添加した基質溶液も調製した。調製した各基質溶液を８５℃で３分間熱処理後、室温で３０分間放置した。各基質溶液１８μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素２μｌ（５．２Ｕ）を添加して、反応液を調製した。 A mismatch DNA substrate solution was prepared by adding these DNAs to 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 14 mM MgCl _{2 so} that the final concentrations were 5 nmol / ml and 0.5 nmol / ml, respectively. Separately, a substrate solution to which the DNA probe was added alone was also prepared. Each prepared substrate solution was heat-treated at 85 ° C. for 3 minutes and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. A reaction solution was prepared by adding 2 μl (5.2 U) of a hermit crab DSN purified enzyme to 18 μl of each substrate solution.

調製した反応液を３０℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｃｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。各反応液の反応開始２０分後の相対蛍光強度（ＲＦＵ）値を図１６に示す。図１６に示すように、完全マッチＤＮＡ反応液のＲＦＵ値は、ミスマッチＤＮＡ反応液、およびＤＮＡプローブのみの反応液よりも顕著に高い値であった。 The prepared reaction solution was incubated at 30 ° C., the fluorescence value was measured every 30 seconds, and the measurement was performed up to 50 minutes. The fluorescence value was measured using a DNA Engine Opticon System (manufactured by MJ Research). FIG. 16 shows the relative fluorescence intensity (RFU) value 20 minutes after the start of the reaction of each reaction solution. As shown in FIG. 16, the RFU value of the perfect match DNA reaction solution was significantly higher than the mismatch DNA reaction solution and the reaction solution containing only the DNA probe.

この結果から、ヤドカリＤＳＮは配列が完全に相補的な２本鎖ＤＮＡは分解するが、１塩基のミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡは分解しにくいことが示された。よって、ヤドカリＤＳＮは１塩基のミスマッチを認識してＤＮＡを切断する酵素であると考えられる。 From this result, it was shown that hermit crab DSN degrades double-stranded DNA whose sequence is completely complementary, but double-stranded DNA containing a single base mismatch is difficult to degrade. Thus, hermit crab DSN is considered to be an enzyme that recognizes a single base mismatch and cleaves DNA.

ヤドカリＤＳＮが１塩基の違いを認識可能であることにより、実施例１４で示した、ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出方法の精度はより高くなると考えられる。また、ヤドカリＤＳＮの耐熱性を利用して、反応温度を任意の塩基配列の核酸のハイブリダイゼーションに適した温度に設定することで、さらに検出精度を上げることができると思われる。 Since the hermit crab DSN can recognize a difference of one base, it is considered that the accuracy of the sequence-specific RNA detection method using the hermit crab DSN shown in Example 14 is higher. In addition, it seems that detection accuracy can be further improved by setting the reaction temperature to a temperature suitable for hybridization of nucleic acids having an arbitrary base sequence by utilizing the heat resistance of the hermit crab DSN.

［実施例１６］
円二色性（ＣＤ）測定による解析
円二色性（ＣＤ）測定によって、ヤドカリＤＳＮの高次構造の変化からその耐熱性を分析した。測定には円二色性測定装置Ｊ−７１５（日本分光製）を使用した。バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，５０ｖ／ｖ％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中に０．１ｍｇ／ｍＬのヤドカリＤＳＮを含む溶液を測定試料とし、波長２００ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＣＤスペクトルを一定温度で測定した。その結果を図１７（ａ）に示す。 [Example 16]
Analysis by Circular Dichroism (CD) Measurement The circular dichroism (CD) measurement was performed to analyze the heat resistance from the change in the higher order structure of the hermit crab DSN. For the measurement, a circular dichroism measuring apparatus J-715 (manufactured by JASCO) was used. Using a solution containing 0.1 mg / mL hermit crab DSN in a buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.0, 50 v / v% Glycerol) as a measurement sample, a CD spectrum in the wavelength range of 200 nm to 250 nm was measured at a constant temperature. . The result is shown in FIG.

また、バッファー中に０．１ｍｇ／ｍＬのヤドカリＤＳＮに加え、１４ｍＭＭｇＣｌ_２を含む溶液を測定試料とし、同様に測定を行った結果を図１７（ｂ）に示す。図１７（ａ）および（ｂ）中、Ｎは温度２５℃で測定したスペクトル、Ｄは同試料を温度９５℃に上昇させた後に測定したスペクトル、Ｒは同試料を再び温度２５℃に冷却した後に測定したスペクトルである。 FIG. 17 (b) shows the results of measurement performed in the same manner using a solution containing 14 mM MgCl ₂ in addition to 0.1 mg / mL hermit crab DSN in the buffer. 17A and 17B, N is a spectrum measured at a temperature of 25 ° C., D is a spectrum measured after raising the sample to a temperature of 95 ° C., and R is a sample again cooled to a temperature of 25 ° C. It is a spectrum measured later.

図１７（ａ）および（ｂ）に示すように、ヤドカリＤＳＮは２５℃ではαヘリックス含量の高い高次構造を持っていることが分かった（スペクトルＮ）。試料中のマグネシウムの存在の有無によってスペクトルに若干の差異が見られるが、いずれの場合も温度に対するピークシフトについてはおおむね類似の傾向を示した。変性状態（９５℃）のスペクトル（スペクトルＤ）は、典型的なランダムコイルのスペクトルを示さず、むしろβシート構造が支配的であることを示唆した。また、この変性は不可逆で、再び酵素を２５℃に冷却しても、βシート支配的なスペクトルを示した（スペクトルＲ）。 As shown in FIGS. 17 (a) and (b), it was found that the hermit crab DSN had a higher order structure with a high α-helix content at 25 ° C. (spectrum N). Although there is a slight difference in the spectrum depending on the presence or absence of magnesium in the sample, the peak shifts with respect to temperature generally showed similar trends. The denaturing state (95 ° C.) spectrum (Spectrum D) did not show the spectrum of a typical random coil, but rather suggested that the β-sheet structure was dominant. Further, this denaturation was irreversible, and even when the enzyme was cooled again to 25 ° C., a β-sheet dominant spectrum was shown (spectrum R).

次に、測定波長を２２２ｎｍに固定し、温度を２５℃から９５℃まで上昇させた場合のＣＤ値の変化を測定した結果を図１８（ａ）に示す。測定は、バッファー中にヤドカリＤＳＮのみを含む試料（Ｎ）、ヤドカリＤＳＮと１４ｍＭＭｇＣｌ_２を含む試料（Ｍ）、ヤドカリＤＳＮと２本鎖ＤＮＡを含む試料（ｄｓ）について行った。 Next, FIG. 18A shows the result of measuring the change in CD value when the measurement wavelength is fixed at 222 nm and the temperature is raised from 25 ° C. to 95 ° C. Measurement sample containing only Yadokari DSN in the buffer (N), the sample containing Yadokari DSN and 14 mM MgCl ₂ (M), was performed on the sample (ds) comprising Yadokari DSN and double-stranded DNA.

図１８（ａ）に示すように、マグネシウムを含まない試料（Ｎ）とマグネシウムを含む試料（Ｍ）を比較すると、マグネシウム不在下の酵素は約６５℃から変性が始まり，約７８〜８０℃付近で変性を終えた。その変性中点は約７１℃であった。 As shown in FIG. 18 (a), when the sample containing no magnesium (N) and the sample containing magnesium (M) are compared, the enzyme in the absence of magnesium begins to denature at about 65 ° C., and is about 78-80 ° C. At the end of denaturation. The denaturation midpoint was about 71 ° C.

一方、１４ｍＭＭｇＣｌ_２存在下の酵素は、約７１℃から変性が始まり，約８５℃で変性を終えた。その変性中点は約７８℃であった。すなわち、１４ｍＭマグネシウムの存在によって酵素の熱安定性は約７℃ほど向上していることが観測された。 On the other hand, the denaturation of the enzyme in the presence of 14 mM MgCl ₂ started at about 71 ° C. and finished at about 85 ° C. The denaturation midpoint was about 78 ° C. That is, it was observed that the presence of 14 mM magnesium improved the thermal stability of the enzyme by about 7 ° C.

このことから、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で熱に対する構造安定性が顕著に向上する酵素であることが示された。本実施例では、酵素の高次構造の変化から、マグネシウムが酵素の熱安定性を向上させることを示したが、この結果は、実施例８で酵素活性の変化に基づいてマグネシウムの効果を調べた結果（図７）とほぼ合致する。 From this, it was shown that hermit crab DSN is an enzyme whose structural stability to heat is significantly improved in the presence of magnesium. In this example, it was shown from the change in the higher-order structure of the enzyme that magnesium improves the thermal stability of the enzyme. This result was obtained by examining the effect of magnesium in Example 8 based on the change in the enzyme activity. Almost coincides with the result (FIG. 7).

２本鎖ＤＮＡ共存下のヤドカリＤＳＮのＣＤ測定には、牛胸腺由来ＤＮＡ（和光純薬製）を使用し、試料中のＤＮＡ濃度は０．７５ｍｇ／ｍＬとした。この試料中にマグネシウムは含まない。また、ベースラインを取るためバッファー中に同じ濃度のＤＮＡのみを含む試料についても同様にＣＤ測定を行った。そして、２本鎖ＤＮＡとヤドカリＤＳＮを含む試料のＣＤ測定値から、２本鎖ＤＮＡのみを含む試料のＣＤ測定値を差し引いた差ＣＤを図１８（ｂ）に示す（ｄｓ）。 For CD measurement of hermit crab DSN in the presence of double-stranded DNA, bovine thymus-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used, and the DNA concentration in the sample was 0.75 mg / mL. This sample does not contain magnesium. In addition, CD measurement was similarly performed on a sample containing only the same concentration of DNA in the buffer in order to obtain a baseline. FIG. 18B shows a difference CD obtained by subtracting the CD measurement value of the sample containing only the double-stranded DNA from the CD measurement value of the sample containing the double-stranded DNA and the hermit crab DSN (ds).

図１８（ｂ）に示すように、、酵素のみの熱変性曲線（Ｎ）と、２本鎖ＤＮＡ共存下の酵素の熱変性曲線（ｄｓ）とを比較すると、酵素のみの場合に約７１℃であった変性中点が、２本鎖ＤＮＡ共存下では約７８℃へと移動していることが観測される。このことから２本鎖ＤＮＡの存在によってもヤドカリＤＳＮの熱安定性が向上していることが示唆された。 As shown in FIG. 18 (b), when the heat denaturation curve (N) of the enzyme alone and the heat denaturation curve (ds) of the enzyme in the presence of double-stranded DNA are compared, it is about 71 ° C. in the case of the enzyme alone. It was observed that the denatured midpoint was moved to about 78 ° C. in the presence of double-stranded DNA. This suggests that the presence of double-stranded DNA improves the thermal stability of the hermit crab DSN.

配列表フリ−テキストSequence listing free text

配列番号１：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ遺伝子の塩基配列
配列番号２：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅのアミノ酸配列
配列番号３：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅｃＤＮＡの塩基配列
配列番号４：３’−ＲＡＣＥ法に用いたアダプタープライマーの塩基配列（ＡＰ）
配列番号５：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（ＭＧＳＰ６）
配列番号６：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（ＭＧＳＰ６−２）
配列番号７：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（Ｍｉ１）
配列番号８：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（Ｍｉ２）
配列番号９：ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドユニバーサルアンプリフィケーションプライマーの塩基配列
（ＡＵＡＰ）
配列番号１０：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５ＲＴ）
配列番号１１：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５Ｒ１）
配列番号１２：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５Ｒ２）
配列番号１３：５’−ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドアンカープライマーの塩基配列（ＡＡＰ）
配列番号１４：配列番号３を基にしたプライマーの塩基配列（ＹＷＰＦ１）
配列番号１５：配列番号３を基にしたプライマーの塩基配列（ＹＷＰＲ１）
配列番号１６：Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー
配列番号１７：配列番号３のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列（ＹＥＰＦ）
配列番号１８：配列番号３のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列（ＹＥＰＲ−Ｈｉｓ） SEQ ID NO: 1: Base sequence of Coenobita purpurus duplex-specific nuclease gene SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of Coenobita purpurus duplex-specific nuclease sequence 3: Coenobipurase Base sequence (AP) of adapter primer used for
SEQ ID NO: 5: Primer base sequence (MGSP6) based on a region conserved among crustacean-derived nuclease genes
SEQ ID NO: 6: Primer base sequence (MGSP6-2) based on a region conserved among crustacean-derived nuclease genes
SEQ ID NO: 7: Primer base sequence based on a region conserved among crustacean nuclease genes (Mi1)
SEQ ID NO: 8: Primer base sequence based on a region conserved among crustacean-derived nuclease genes (Mi2)
SEQ ID NO: 9: Base sequence (AUAP) of the bridged universal amplification primer used in the RACE method
SEQ ID NO: 10: Primer base sequence based on the hermit crab DSN gene internal sequence (Y5RT)
SEQ ID NO: 11: Primer base sequence based on the hermit crab DSN gene internal sequence (Y5R1)
SEQ ID NO: 12: Primer base sequence based on the hermit crab DSN gene internal sequence (Y5R2)
SEQ ID NO: 13: Base sequence (AAP) of the bridged anchor primer used in the 5′-RACE method
SEQ ID NO: 14: Primer base sequence (YWPF1) based on SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 15: Primer base sequence (YWPR1) based on SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 16: Oligo (dT) 20 primer SEQ ID NO: 17: Primer base sequence for inserting the cDNA of SEQ ID NO: 3 into insect cell expression vector pVL1393 (YEPF)
SEQ ID NO: 18: Primer sequence for inserting the cDNA of SEQ ID NO: 3 into insect cell expression vector pVL1393 (YEPR-His)

Claims

以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２２番目のグリシンまでを除いたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。 Any one of the following proteins (a) to (c);
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) a protein comprising an amino acid sequence excluding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the N-terminal to the 22nd glycine;
(C) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, deleted, inserted or substituted in the amino acid sequence of (a) or (b), and having a double-strand-specific nucleolytic activity.

少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲で二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する、請求項１に記載のタンパク質。 The protein according to claim 1, which has heat resistance capable of exhibiting a double-strand specific nucleolytic activity in a temperature range of at least 20 ° C to 80 ° C.

２０℃から８０℃までの温度範囲のうち、少なくとも８０℃以上で最も高い二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する請求項２に記載のタンパク質。 The protein according to claim 2, having a heat resistance capable of exhibiting the highest double-strand-specific nucleolytic activity at least at 80 ° C or higher in a temperature range from 20 ° C to 80 ° C.

８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示す請求項３に記載のタンパク質。 The protein according to claim 3, which exhibits an activity of 70% or more of the maximum activity in the range from 75 ° C to 80 ° C when the activity at 80 ° C is regarded as the maximum activity.

無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the residual activity after heat treatment at 70 ° C for 30 minutes in the presence of an inorganic salt is 60% or more.

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．１〜４．２である請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 5, which has a molecular weight of 42,000 to 46,000 as determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and an isoelectric point of 4.1 to 4.2.

オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is derived from an organism belonging to the family Coenobiidae.

コエノビータプルプレウス（Ｃｏｅｎｏｂｉｔａｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）由来である請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 7, which is derived from Coenovita purpureus.

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。 The gene which codes the protein of any one of Claims 1-8.

以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）請求項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence according to claim 1,
(B) a double-stranded specific nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence encoding the amino acid sequence according to claim 1 or a DNA having a base sequence complementary to the DNA. DNA encoding a protein having degradation activity.

ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を有する請求項１０に記載の遺伝子。 The gene according to claim 10, wherein the DNA has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1.

請求項１０または１１に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。 A recombinant vector comprising the gene according to claim 10 or 11.

請求項１２に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。 A transformant or transductant comprising the recombinant vector according to claim 12.

請求項１３に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。 A transformant or a transductant according to claim 13 is cultured in a medium, and a protein having a double strand-specific nucleolytic activity is collected from the culture. A method for producing a protein having the same.

昆虫細胞内で二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 15. The method according to claim 14, wherein a protein having double-strand specific nucleolytic activity is expressed in insect cells.

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。 A method for cleaving a nucleic acid using the protein according to any one of claims 1 to 8, or a protein having a double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to claim 14 or 15.

一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する請求項１６に記載の方法。 The method according to claim 16, wherein the double-stranded DNA is preferentially degraded over the single-stranded DNA in a system in which the single-stranded DNA and the double-stranded DNA coexist.

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する請求項１６に記載の方法。 The method according to claim 16, wherein the DNA strand in the DNA-RNA hybrid duplex is preferentially degraded.

二本鎖特異的な核酸の切断方法であって、４０℃以上の条件下で反応させる請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 18, wherein the method is a double-strand-specific nucleic acid cleavage method, wherein the reaction is carried out under conditions of 40 ° C or higher.

６０℃以上の条件下で反応させる請求項１９に記載の方法。 The process according to claim 19, wherein the reaction is carried out under conditions of 60 ° C or higher.

以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。 An RNA detection method comprising the following steps (i) to (iii):
(I) forming a DNA-RNA hybrid chain;
(Ii) the protein according to any one of claims 1 to 5 or the protein having a double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to claim 14 or 15, formed in step (i) Decomposing DNA in the prepared DNA-RNA hybrid strand,
(Iii) A step of detecting the presence of RNA by detecting DNA degradation in step (ii).

特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、請求項２１に記載の方法。 An RNA detection method for detecting RNA having a specific nucleotide sequence, wherein a DNA-RNA hybrid chain of probe DNA containing RNA to be detected in step (i) and a nucleotide sequence complementary to the RNA is formed. The method of claim 21.

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。 A reagent kit comprising at least one of the protein according to any one of claims 1 to 8 or the protein having double-strand-specific nucleolytic activity produced by the method according to claim 14 or 15.