JP2014093958A - Antibody capable of specifically recognizing transferrin receptor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はヒトＴｆＲ抗原に特異的に反応する抗ＴｆＲ抗体に関する。さらに本発明は、抗ＴｆＲ抗体を含む医薬組成物、特に悪性腫瘍の治療に関わる医薬組成物に関する。 The present invention relates to anti-TfR antibodies that specifically react with human TfR antigens. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an anti-TfR antibody, particularly a pharmaceutical composition relating to the treatment of malignant tumors.
がんは、日本における死亡原因の第一位を占め、高齢化に伴って患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。従来の化学療法や、放射線療法など、がん細胞を殺すと同時に、正常細胞にもダメージを与え、強い副作用を引き起こしている問題点がある。これを解決するために、がん細胞に特異的に発現する分子を標的として薬剤を設計し、治療を行う分子標的治療が盛んに研究されている。この分子標的がん治療薬の中、抗体薬は半減期が長く、副作用が少ないなどメリットがあるため大変注目を浴びる。開発の成功例として、ＣＤ２０を標的としたキメラ抗体リツキサン（非特許文献１）や、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたヒト化抗体ハーセプチン（非特許文献２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的としたヒト化抗体アバスチンなど挙げられる。これらの抗体ががんを対象疾患として使用されており、その治療効果が認められている。 Cancer occupies the top cause of death in Japan, and the number of patients has been increasing year by year with the aging of the population, and the development of highly effective and safe drugs and treatment methods is strongly desired. There are problems such as conventional chemotherapy and radiation therapy that kill cancer cells and at the same time damage normal cells, causing strong side effects. In order to solve this problem, molecular targeted therapy for designing and treating drugs targeting molecules specifically expressed in cancer cells has been actively studied. Among these molecular targeted cancer therapeutics, antibody drugs are of great interest because of their merits such as a long half-life and fewer side effects. As examples of successful development, targeting chimeric antibody Rituxan (Non-patent Document 1) targeting CD20, humanized antibody Herceptin (Non-patent Document 2) targeting Her2 / neu, and vascular endothelial growth factor (VEGF) as targets And humanized antibody Avastin. These antibodies have been used as cancer target diseases, and their therapeutic effects have been recognized.
治療薬としての抗体の使用は、非標識と標識抗体に分けられる。非標識抗体の作用メカニズムは、（１）免疫系細胞や分子を関与する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）（非特許文献３）また補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）（非特許文献４）、（２）標的分子により細胞内生存や増殖と関わるシグナルの阻害、（３）アポトーシスの誘導、（４）サイトカインの分泌調節などと考えられる。それぞれのメカニズムの組み合わせにより腫瘍細胞を死亡させたり増殖を停止させたりして、治療効果を発揮する。標識抗体は、抗体に放射線物質や、毒素、酵素、また薬剤など細胞傷害物質とリンカーさせ、抗体の特異性を利用し、がん組織だけにこれらの物質を送達し、治療効果の向上と副作用の低減を図る。 The use of antibodies as therapeutic agents is divided into unlabeled and labeled antibodies. The mechanism of action of unlabeled antibodies is as follows: (1) Antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC) involving immune system cells and molecules (Non-patent document 3) and complement-dependent cytotoxic activity (CDC) (Non-patent document 4) ), (2) inhibition of signals related to intracellular survival and proliferation by the target molecule, (3) induction of apoptosis, and (4) regulation of cytokine secretion. The combination of each mechanism exerts a therapeutic effect by killing tumor cells or stopping proliferation. Labeled antibodies link antibodies with cytotoxic substances such as radioactive substances, toxins, enzymes, and drugs, and use the specificity of antibodies to deliver these substances only to cancerous tissues, improving therapeutic effects and side effects. To reduce
トランスフェリンレセプター(ＴｆＲ)は,トランスフェリン(Ｔｆ)と結合した鉄を細胞内に取り込むための細胞膜構造として、最初網状赤血球上にあると同定された（非特許文献５）。以後、胎盤の栄養膜細胞(非特許文献１０から１２)や、活性化されたリンパ球（非特許文献１２）、更にさまざまな腫瘍細胞などに発現していることが分かった。たとえば、乳がん（非特許文献６）、前立腺がん（非特許文献７）、肺がん（非特許文献８）、膵臓がん（非特許文献９）、大腸がん（非特許文献３０，３１）、胃がん（非特許文献３１）、膀胱癌（非特許文献３２，３３）、肝癌（非特許文献３４）、子宮頸がん（非特許文献３５）、脳腫瘍（非特許文献３６）、慢性リンパ性白血病（非特許文献３７，３８）、非ホジキンリンパ腫（非特許文献３８，３９）、成人T 細胞白血病（非特許文献４０）においてトランスフェリンレセプターの高い発現を報告されていた。また、ＴｆＲは様々な癌細胞表面に高発現し、正常細胞における発現が低いため、古くからがん治療の分子標的と認識された（非特許文献１３から１６、特許文献１、２）。しかしながら、今まで開発された抗ヒトＴｆＲ抗体はすべて動物由来の抗体であった。一般にヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献１７から２０）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速めたりをし（非特許文献１８、２１及び２２）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献２３及び２４）。実際にあるマウス抗ヒトＴｆＲ抗体によりフェーズ１臨床試験を行われ、ＨＡＭＡの産生が観察され、顕著な治療効果を見られなかった（非特許文献２５）。 Transferrin receptor (TfR) was first identified on reticulocytes as a cell membrane structure for taking up iron bound to transferrin (Tf) into cells (Non-patent Document 5). Since then, it has been found that it is expressed in placental trophoblast cells (Non-Patent Documents 10 to 12), activated lymphocytes (Non-Patent Document 12), and various tumor cells. For example, breast cancer (non-patent document 6), prostate cancer (non-patent document 7), lung cancer (non-patent document 8), pancreatic cancer (non-patent document 9), colon cancer (non-patent documents 30, 31), Gastric cancer (Non-patent document 31), Bladder cancer (Non-patent document 32, 33), Liver cancer (Non-patent document 34), Cervical cancer (Non-patent document 35), Brain tumor (Non-patent document 36), Chronic lymphocytic leukemia (Non-patent documents 37 and 38), Non-Hodgkin lymphoma (non-patent documents 38 and 39), and adult T-cell leukemia (non-patent document 40) have been reported to have high expression of transferrin receptor. In addition, TfR is highly expressed on the surface of various cancer cells and has low expression in normal cells, so it has long been recognized as a molecular target for cancer treatment (Non-patent Documents 13 to 16, Patent Documents 1 and 2). However, all of the anti-human TfR antibodies developed so far have been animal-derived antibodies. In general, when an antibody from a non-human animal, for example, a mouse antibody is administered to a human, it is recognized as a foreign substance, and a human antibody against the mouse antibody (Human Anti Mouse Antibody: hereinafter referred to as HAMA) is induced in the human body. It is known that HAMA reacts with the administered mouse antibody to cause side effects (Non-Patent Documents 17 to 20), or accelerate the disappearance of the administered mouse antibody from the body (Non-Patent Documents 18, 21, and 22). It is known that the therapeutic effect of mouse antibodies is reduced (Non-patent Documents 23 and 24). A phase 1 clinical trial was actually conducted with a mouse anti-human TfR antibody, and HAMA production was observed, and no significant therapeutic effect was observed (Non-patent Document 25).
このような問題を回避するためにキメラ抗体が開発された（特許文献３及び４）。キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点はマウス抗体の特徴は保持するが、ヒトＦｃを持つためヒト補体または細胞傷害活性を刺激することができる。しかし、このようなキメラ抗体も依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわちＨＡＣＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ− Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）応答を惹起する（非特許文献２６）。さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（特許文献５及び６）。ＣＤＲ移植技術を使用してマウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及び定常領域からなる抗体、すなわち「ヒト化抗体」が産生されている（非特許文献２７）。しかしながら、このようなヒト化抗体でも人に対して免疫原性があり、ＨＡＨＡ（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）反応を引き起こす（非特許文献２８、２９）。従って、臨床応用において、より安全有効な免疫原性を持たない抗体治療薬を望まれている。 Chimeric antibodies have been developed to avoid such problems (Patent Documents 3 and 4). A chimeric antibody comprises a portion of an antibody from two or more species, such as a murine antibody variable region and a human antibody constant region. The advantage of such a chimeric antibody retains the characteristics of a mouse antibody, but has human Fc and can stimulate human complement or cytotoxic activity. However, such a chimeric antibody still elicits a “human anti-chimeric antibody”, that is, a HACA (Human Anti-Chimera Antibody) response (Non-patent Document 26). Furthermore, recombinant antibodies have been developed in which only part of the substituted antibody is a complementarity determining region (ie, “CDR”) (Patent Documents 5 and 6). An antibody consisting of mouse CDR, human variable region framework and constant region, that is, a “humanized antibody” has been produced using CDR grafting technology (Non-patent Document 27). However, even such a humanized antibody is immunogenic to humans and causes a HAHA (Human anti-Human Antibody) reaction (Non-patent Documents 28 and 29). Accordingly, there is a need for antibody therapeutics that do not have safer and more effective immunogenicity in clinical applications.
ところで、抗体創薬においては、細胞膜表面に存在する「インタクトな状態の」標的癌抗原を認識する抗体を取得することが不可欠といえるが、標的癌抗原が膜タンパク質であるという理由から、既知の癌抗原に対する抗体であってもその取得には困難が伴っていた。このような問題点を解消すべく、本発明者らはこれまでに1000億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、それを利用した癌細胞及び組織の細胞膜表面に存在するタンパク質（細胞表面抗原）に対する抗体の網羅的取得法を確立した。（特許文献７〜９）。 By the way, in antibody drug discovery, it is indispensable to obtain an antibody that recognizes an “intact” target cancer antigen existing on the cell membrane surface. However, since the target cancer antigen is a membrane protein, It was difficult to obtain even antibodies against cancer antigens. In order to solve such problems, the present inventors have created a huge human antibody library consisting of 100 billion independent clones so far, and present it on the cell membrane surface of cancer cells and tissues. We established a comprehensive method for obtaining antibodies against proteins (cell surface antigens). (Patent Documents 7 to 9).
本発明は、ヒトＴｆＲを特異的に認識し、ＴｆＲ高発現しているがん細胞の生存や増殖を阻害する、かつヒトに対し免疫原性ない完全なヒト抗ヒトＴｆＲ抗体を提供することを解決すべき課題とした。また、これらの抗体の製造方法および抗体を用いるがんなどの疾患の治療薬を提供することを目的とする。 The present invention provides a complete human anti-human TfR antibody that specifically recognizes human TfR, inhibits the survival and proliferation of cancer cells that highly express TfR, and is not immunogenic to humans. It was a problem to be solved. Another object of the present invention is to provide a method for producing these antibodies and a therapeutic agent for diseases such as cancer using the antibodies.
上述のように、ＴｆＲを標的とした抗体は抗腫瘍剤として開発されたが、動物由来の抗体であるため、ＨＡＭＡの産生や、薬効の不足などにより開発成功に至らなかった。そこで、本発明者らは、独自の抗体作成方法を鋭意に研究し、ヒト抗体ライブラリーファージ Ｄｉｓｐｌａｙにより癌細胞膜上にあるＴｆＲと反応するファージ抗体（ｓｃＦｖ抗体）を取得した。これらの抗体遺伝子配列の解析により、抗体のＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有することを見出した。 更にこれらのｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ化し、完全なヒトＩｇＧ抗体を作製した。これらのＩｇＧ抗体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ, ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を検討した。その結果、抗体が強い抗腫瘍効果を持つことを分かった。以上のことより、これらの抗体を利用しいろいろなＴｆＲ高発現しているがん治療に有用性を示し、本発明を完成させた。 As described above, an antibody targeting TfR was developed as an antitumor agent. However, since it is an animal-derived antibody, it has not been successfully developed due to production of HAMA, lack of drug efficacy, and the like. Therefore, the present inventors have intensively studied an original antibody production method, and obtained a phage antibody (scFv antibody) that reacts with TfR on the cancer cell membrane by a human antibody library phage Display. By analyzing these antibody gene sequences, it was found that the CDR of the antibody has a novel amino acid sequence. Furthermore, these scFv antibodies were converted to IgG to produce fully human IgG antibodies. Using these IgG antibodies, the antitumor effect was examined in vitro and in vivo. As a result, it was found that the antibody has a strong antitumor effect. From the above, the present invention was completed by showing the usefulness for treating various cancers with high TfR expression using these antibodies.
即ち、本発明によれば、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列を含む、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。 That is, according to the present invention, the heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), the heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), and the heavy chain third complementarity determining region (VH CDR3), respectively. An antibody that specifically reacts with human TfR, comprising any one of amino acid sequences 1 to 3, 7 to 9, 13 to 15, 19 to 21, 25 to 27 is provided.
本発明によればさらに、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列を含み、軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列を含む、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。 Further according to the present invention, each of SEQ ID NO: 1 as heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), and heavy chain third complementarity determining region (VH CDR3), respectively. -3, 7-9, 13-15, 19-21, 25-27, and includes a light chain first complementarity determining region (VL CDR1), a light chain second complementarity determining region (VL CDR2), human TfR comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4-6, 10-12, 16-18, 22-24, 28-30 as the light chain third complementarity determining region (VL CDR3), Antibodies that react specifically are provided.
本発明によればさらに、下記（１）から（５）から選択される、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。
（１）配列番号１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（３）配列番号１３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（４）配列番号１９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号２４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（５）配列番号２５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号３０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
The present invention further provides an antibody that specifically reacts with human TfR selected from the following (1) to (5).
(1) Heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 1, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 2, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 3 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 4, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 5 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of six light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(2) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 7, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 8, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 9 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 10, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 11 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 12 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(3) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 13, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 14, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 15 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 16, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 17 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 18 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(4) SEQ ID NO: 19 heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), SEQ ID NO: 20 heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), SEQ ID NO: 21 heavy chain third complementarity determining region ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 22, light chain second complementarity determining region (VL CDR2) of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 24 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(5) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 25, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 26, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 27 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 28, light chain second complementarity determining region (VL CDR2) of SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 30 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
本発明によればさらに、配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、活性が上記（１）から（５）の何れかに記載の抗体と同等である、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。 According to the present invention, in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-3, 7-9, 13-15, 19-21, 25-27, one or several amino acids are deleted, added, substituted and An antibody that specifically reacts with human TfR is provided that is inserted and / or has an activity equivalent to that of the antibody according to any one of (1) to (5) above.
好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
好ましくは、本発明の抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ab')2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である。
Preferably, the antibody of the present invention is a human antibody or a humanized antibody.
Preferably, the antibody of the present invention comprises Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain antibody (scFv), dimerized V region (Diabody), disulfide stabilized V region (dsFv) and CDR. It is an antibody fragment selected from the group consisting of peptides comprising.
本発明によれば、上記した本発明の抗体をコードするＤＮＡが提供される。
本発明によれば、上記した本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。
本発明によれば、上記した本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の形質転換株を培地に培養し、培養物中に本発明の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。
According to the present invention, DNA encoding the above-described antibody of the present invention is provided.
According to the present invention, a recombinant vector containing the above-described DNA of the present invention is provided.
According to the present invention, there is provided a transformant obtained by introducing the above-described recombinant vector of the present invention into a host cell.
According to the present invention, the above-described transformant of the present invention is cultured in a medium, the antibody of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the antibody is collected from the culture. A method is provided.
本発明によれば、上記した本発明の抗体を有する医薬組成物が提供される。
本発明によれば、抗体に細胞傷害性物質が結合している上記医薬組成物が提供される。
好ましくは、細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である。
好ましくは、本発明の医薬組成物は抗がん剤として使用される。
According to the present invention, a pharmaceutical composition having the above-described antibody of the present invention is provided.
According to the present invention, there is provided the above pharmaceutical composition in which a cytotoxic substance is bound to an antibody.
Preferably, the cytotoxic substance is a drug, toxin or radioactive substance.
Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention is used as an anticancer agent.
好ましくは、がんが、固形がんまた血液がんである。
好ましくは、固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである。
好ましくは、血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である。
更に好ましくは、血液がんが成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。
Preferably, the cancer is solid cancer or blood cancer.
Preferably, the solid cancer is lung cancer, colon cancer, stomach cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, breast cancer, head and neck cancer. , Skin cancer.
Preferably, the blood cancer is leukemia, lymphoma or myeloma.
More preferably, the blood cancer is adult T cell leukemia (ATL).
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がんを抑制又は治療する方法が提供される。
本発明によればさらに、医薬組成物又は抗がん剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
The present invention further provides a method for suppressing or treating cancer, comprising administering the above-described antibody of the present invention to a subject.
The present invention further provides use of the above-described antibody of the present invention for the production of a pharmaceutical composition or an anticancer agent.
本発明の抗体は、ヒトＴｆＲと特異的に認識し、ＴｆＲ発現しているがん細胞の生存や増殖を阻害する完全なヒト抗体である。ヒト抗体はヒトに投与する際、抗体の抗原性が回避され、ＨＡＨＡが産生されないので、より副作用が少ない高い抗腫瘍作用を発揮できる。即ち、本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体は、抗がん剤として有用である。 The antibody of the present invention is a complete human antibody that specifically recognizes human TfR and inhibits the survival and proliferation of cancer cells expressing TfR. When human antibodies are administered to humans, the antigenicity of the antibodies is avoided and HAHA is not produced, so that it can exhibit a high antitumor action with fewer side effects. That is, the anti-human TfR antibody of the present invention is useful as an anticancer agent.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
Next, the present invention will be described in more detail.
Definitions and General Techniques Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. In general, the nomenclature and techniques used for cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, protein and nucleic acid chemistry, and hybridization described herein are well known in the art. And is usually used.
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。 The methods and techniques of the present invention are generally described in various general and more specific references cited and discussed throughout this specification, according to conventional methods well known in the art, unless otherwise indicated. Carry out as it is.
ＴｆＲ
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は人三番染色体にコードされる７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号１２５)。このタンパクはＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のＴｆＲは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてヒトＴｆＲを意味する。
TfR
Human transferrin receptor (TfR) is a single transmembrane protein composed of 760 amino acids encoded by human chromosome 3 (SEQ ID NO: 125). This protein, also known as the CD71 antigen, is involved in cellular iron uptake and is thought to be involved in cell proliferation. The TfR of the present invention is not particularly limited in terms of structure, but includes monomers, multimers, intact forms expressed in cell membranes, solubilized forms formed in extracellular regions, truncated forms, gene mutations and It means human TfR, including mutation form due to deficiency and the like, and form subjected to post-translational modification due to phosphorylation and the like.
反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
React and Reactive In this specification, “react” and “reactivity” mean the same unless otherwise indicated. That is, the antibody recognizes the antigen. This antigen may be intact TfR expressed in the cell membrane, truncated form, or solubilized form. Moreover, TfR which maintained the three-dimensional structure may be sufficient, and modified TfR may be sufficient. As a means for examining the reactivity, a flow cytometer (FACS), an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a Western-blot, a fluorescence micromeasurement technique (FMAT), surface plasmon resonance (BIAcore), immunostaining, immunoprecipitation, etc. Can be mentioned.
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＴｆＲ抗体（通常最終濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。 The antibody used in the flow cytometer may be a fluorescent substance such as FITC, an antibody labeled with biotin, or an unlabeled antibody. A fluorescently labeled avidin, a fluorescently labeled anti-human immunoglobulin antibody, or the like is used depending on whether or not the antibody used is labeled. Reactivity is evaluated by adding a sufficient amount of anti-TfR antibody (usually 0.01 to 10 μg / mL final concentration) to the sample and comparing the reactivity with the negative control antibody and the positive control antibody. Can do.
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）。
Antibody In the present specification, the following abbreviations (in parentheses) are used in accordance with the convention as necessary.
Heavy chain (H chain), light chain (L chain), heavy chain variable region (VH), light chain variable region (VL), complementarity determining region (CDR), first complementarity determining region (CDR1), second Complementarity determining region (CDR2), third complementarity determining region (CDR3) first complementarity determining region (VH CDR1) of heavy chain, second complementarity determining region of heavy chain (VH CDR2), third of heavy chain Complementarity determining region (VH CDR3) light chain first complementarity determining region (VL CDR1), light chain second complementarity determining region (VL CDR2), light chain third complementarity determining region (VL CDR3).
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。 As used herein, the term “antibody” is synonymous with immunoglobulin and should be understood as commonly known in the art. Specifically, the term antibody is not limited by any particular method of making an antibody. For example, the term antibody includes, but is not limited to, recombinant antibodies, monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies.
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。 As used herein, the term “human antibody” means any antibody in which the variable region and constant region sequences are human sequences. The term has a sequence derived from a human gene, but has been altered, for example, to reduce possible immunogenicity, increase affinity, remove cysteines that can cause undesirable folding, etc. Includes antibodies. The term also encompasses such antibodies produced recombinantly in non-human cells that can be glycosylated that are not characteristic of human cells. These antibodies can be prepared in various forms.
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。 As used herein, the term “humanized antibody” refers to an antibody derived from a non-human, in which amino acid residues characteristic of an antibody sequence of a non-human species are replaced with residues found at corresponding positions in the human antibody. Has been. This “humanization” process is thought to reduce the immunogenicity of the resulting antibody in humans. It will be appreciated that non-human derived antibodies can be humanized using techniques well known in the art. For example, Winter et al., Immunol. Today 14: 43-46 (1993). The antibodies of interest can be engineered by recombinant DNA technology that replaces CH1, CH2, CH3, the hinge domain, and / or the framework domain with the corresponding human sequences. For example, WO 92/02190, and US Pat. Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, and Reference may be made to 5,777,085. As used herein, the term “humanized antibody” includes within its meaning chimeric human antibodies and CDR-grafted antibodies.
本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。 The sequence of the framework region (FR) in the variable region of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it does not substantially affect the specific binding to the corresponding antigen. Although the FR region of a human antibody is preferably used, the FR region of an animal species other than human (for example, mouse or rat) can also be used.
本明細書において、「ファージ抗体」という用語は、ファージにより産生されたｓｃＦｖ抗体を意味する。つまり、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体断片である。この断片は、Ｌｉｎｋｅｒとしてのアミノ酸以外、タグとしてのアミノ酸配列を含むことでもよい。 As used herein, the term “phage antibody” means an scFv antibody produced by a phage. That is, an antibody fragment containing VH and VL amino acid sequences. This fragment may contain an amino acid sequence as a tag in addition to the amino acid as Linker.
本発明の抗体の一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。 In one embodiment of the antibody of the present invention, a constant region is included in addition to the variable region (for example, an IgG type antibody). The sequence of the constant region is not particularly limited. For example, a known human antibody constant region can be used. The heavy chain constant region (CH) of the human antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and more preferably hIgG1, which belongs to the hIgG class, Any of the subclasses such as hIgG2, hIgG3, and hIgG4 can be used. The light chain constant region (CL) may be any as long as it belongs to hIg, and those of κ class or λ class can be used. Moreover, the constant region of animal species other than humans (for example, mouse and rat) can also be used.
本発明の抗体に用いられるＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列は、由来となる元のＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列をそのまま用いてもよいし、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／または挿入して異なるアミノ酸配列にして用いてもよい。 As the FR or constant region amino acid sequence used in the antibody of the present invention, the original FR or constant region amino acid sequence from which it is derived may be used as it is, or one or several (for example, 1 to 8, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2 amino acids may be deleted, added, substituted and / or inserted into different amino acid sequences.
本発明において、「活性が請求項に記載の抗体と同等である」とは、ヒトＴｆＲへの結合活性および／または抗腫瘍活性が同等であることを意味する。結合活性としては、抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。抗腫瘍活性としては、腫瘍細胞の増殖また生存を阻害する活性を意味する。この腫瘍細胞の増殖また生存の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、また、ｉｎ ｖｉｖｏでもよい。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の数が減少させる活性、腫瘍細胞の数の増加を阻害する活性、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす活性、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など。ｉｎ ｖｉｖｏでは腫瘍重量または体積を減少させる活性、腫瘍重量または体積の増加を抑制させる活性、他薬剤による腫瘍重量または体積の減少を促進させる活性、腫瘍細胞による個体死亡を抑制する活性等が挙げられる。 In the present invention, “the activity is equivalent to that of the claimed antibody” means that the binding activity to human TfR and / or the antitumor activity is equivalent. Binding activity means recognizing an antigen. This antigen may be intact TfR expressed in the cell membrane, truncated form, or solubilized form. Moreover, TfR which maintained the three-dimensional structure may be sufficient, and modified TfR may be sufficient. For example, as means for examining the binding activity, a flow cytometer (FACS), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western-blot, fluorescence micromeasurement technique (FMAT) surface plasmon resonance (BIAcore) and the like can be mentioned. By antitumor activity is meant the activity that inhibits the growth or survival of tumor cells. This inhibition of tumor cell growth or survival may be in vitro or in vivo. For example, the activity of reducing the number of tumor cells in vitro, the activity of inhibiting the increase of the number of tumor cells, the activity of causing cell death of tumor cells, the antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC: Anti-dependent cellular cytotoxicity), Complement-dependent cytotoxicity (CDC: Complement-dependent cytotoxicity). In vivo activity includes activity to reduce tumor weight or volume, activity to suppress increase in tumor weight or volume, activity to promote reduction in tumor weight or volume by other drugs, activity to suppress individual death due to tumor cells, etc. .
Ｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。 Examples of in vivo animal models include xenograft models in which cultured cancer cell lines derived from human cancer tissue are transplanted into immunodeficient mice such as nude mice, and syngeneic strains in which cultured mouse cancer cell lines are transplanted into wild-type mice having a normal immune system. Examples include transplantation models.
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。 A xenograft model can be prepared by transplanting human cancer cell lines to various sites such as subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, etc. of immunodeficient mice such as nude mice.
本発明において、「同等」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。 In the present invention, “equivalent” does not necessarily have the same level of activity, and the activity may be enhanced, or the activity may be decreased as long as it has activity. Examples of antibodies with decreased activity include, for example, 30% or more activity, preferably 50% or more activity, more preferably 80% or more activity, and still more preferably 90% or more activity compared to the original antibody. Particularly preferred is an antibody having an activity of 95% or more.
上述の抗体は、ＴｆＲに対する同等な結合活性を有する、あるいは、同等な抗腫瘍活性を有する限り、可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、ＴｆＲに対する結合活性、および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M１３ vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. １２,9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 8２, 488-492）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。 As long as the above-mentioned antibody has equivalent binding activity to TfR or equivalent antitumor activity, one or more amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence of the variable region (CDR sequence and / or FR sequence). , May be added and / or inserted. In the amino acid sequence, one or several (for example, 1 to 8, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2) amino acids are deleted, added, substituted and / or Alternatively, as a method well known to those skilled in the art for preparing an amino acid sequence of an antibody that has been inserted and has an activity of binding to TfR and / or antitumor activity, a method of introducing a mutation into a protein is known. ing. For example, a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anDNAkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW , Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res. 12,9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci US A. 82, 488-492) An amino acid of an antibody having binding activity and / or antitumor activity against TfR By introducing an appropriate mutation in sequence, it is possible to prepare antibodies functionally equivalent variants with binding activity and / or anti-tumor activity against TfR.
このように、可変領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ＴｆＲに対する結合活性および／また抗腫瘍活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。 Thus, in the variable region, one or several amino acids are mutated, and antibodies having binding activity to TfR and / or antitumor activity are also included in the antibody of the present invention.
本発明の抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。本発明における抗体の好ましい様態の一つとして、ヒト抗体である。 The antibody of the present invention is not limited in its origin, and may be an antibody derived from any animal such as a human antibody, a mouse antibody, or a rat antibody. Moreover, a chimerized antibody, a humanized antibody, etc. may be sufficient. One preferred embodiment of the antibody in the present invention is a human antibody.
本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。 The antibody of the present invention may vary in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc., depending on the antibody-producing cell, host or purification method described below. As long as the obtained antibody has an activity equivalent to that of the antibody of the present invention, it is included in the present invention. For example, the present invention includes a case where the amino acid sequence described in the present invention is modified after translation. Furthermore, post-translational modifications to sites other than known post-translational modifications are also included in the present invention as long as they have an activity equivalent to that of the antibody of the present invention. In addition, when the antibody of the present invention is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original antibody amino acid sequence. The antibody of the present invention also includes such an antibody. Post-translational modifications to sites other than known post-translational modifications are also included in the present invention as long as they have activity equivalent to that of the antibody of the present invention.
抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
Production of antibody (1) scFv reacting with antigen by phage display library
Obtaining the antibodies of the invention can be prepared according to several methods known in the art. For example, phage display technology can be used to provide a library containing a repertoire of antibodies with varying affinities for TfR. These libraries can then be screened to identify and isolate antibodies to TfR. Preferably, the phage library is a scFv phage display library generated using human VL and VH cDNA prepared from mRNA isolated from human B cells. Methods for preparing and screening such libraries are known in the art. Genetic material is recovered from a phage clone showing reactivity that was screened using human TfR as an antigen. By analyzing the gene of the selected phage, it is possible to determine the VH and VL DNA sequences encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen. A human antibody can be obtained by converting the scFv into IgG using this scFv sequence.
（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。
(2) IgG conversion of scFv (production of human antibody)
An H chain or L chain expression vector is prepared and expressed in a host cell, and a human antibody is obtained by collecting and purifying the secreted supernatant. In addition, human antibodies can be obtained by expressing VH and VL in the same vector (tandem type). These methods are well known and can be referred to WO92 / 01047, WO92 / 20791, WO93 / 06213, WO93 / 11236, W093 / 19172, WO95 / 01438, WO95 / 15388, WO97 / 10354, and the like.
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。 Specifically, a full-length heavy chain gene can be obtained by ligating DNA encoding VH with other DNA molecules encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3). The sequence of the human heavy chain constant region gene is known in the art (see, eg, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and Human. Services, NIH Publication No. 91-3242), DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but most preferably is an IgG1 or IgG2 constant region. The IgG1 constant region sequence may be any of a variety of alleles or allotypes known to occur between different individuals, such as Gm (1), Gm (2), Gm (3), and Gm (17). These allotypes correspond to naturally occurring amino acid substitutions in the IgG1 constant region.
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。 A full-length L chain gene (as well as a Fab light chain gene) can be obtained by ligating DNA encoding VL with another DNA molecule encoding light chain constant region CL. The sequence of the human light chain constant region gene is known in the art (see, eg, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and. Human Services, NIH Publication No. 91-3242), DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The light chain constant region may be a kappa or lambda constant region. The kappa constant region can be any of a variety of alleles known to occur between different individuals, such as Inv (1), Inv (2), and Inv (3). The λ constant region may be derived from any of the three λ genes.
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。 By inserting the DNA encoding the H chain or L chain obtained as described above into an expression vector, an expression vector is prepared, expressed in a host cell, and a human antibody is obtained by collecting and purifying the secreted supernatant. To do. Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus and tobacco mosaic virus, cosmids, YACs, EBV-derived episomes, and the like. The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used. The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into separate vectors, or both genes can be inserted into the same expression vector. The antibody gene is inserted into the expression vector by standard methods (eg, ligation of complementary restriction sites on the antibody gene fragment and vector, or blunt end ligation if no restriction sites are present).
好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。 A convenient vector is a functionally complete human CH or CL with appropriate restriction sites engineered to allow any VH or VL sequence to be easily inserted and expressed as described above. It encodes an immunoglobulin sequence. In such vectors, splicing usually occurs between the splice donor site in the inserted J region and the splice acceptor site preceding the human C domain, and also in the splice region present in the human CH exon. Polyadenylation and transcription termination occur at natural chromosomal sites downstream of the coding region. The recombinant expression vector can also encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from a host cell. The antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the immunoglobulin chain. The signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide derived from a non-immunoglobulin protein).
本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。 In addition to the antibody gene and control sequences, the antibody expression vector of the present invention may have additional sequences such as a sequence that controls replication of the vector in the host cell (for example, an origin of replication) and a selectable marker gene. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced. For example, usually a selectable marker gene confers resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dehydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification), the neomycin phosphotransferase gene (for G418 selection), and the glutamate synthase gene.
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９９(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。 A host cell is transformed with the antibody gene expression vector produced by the above method. The host cell may be any cell capable of producing the antibody of the present invention, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but animal cells are preferred. As animal cells, Chinese hamster ovary cells CHO / dhfr (−) cells CHO / DG44 cells, monkey-derived cells COS cells (A. Wright & SL Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402 (1998)), SP2 / O cells (Mouse myeloma) (K. Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-5199 (1996), RP Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502 (1990)) and the like. For transformation, the lipofectin method (RWMalone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6007 (1989), PLFelgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413 ( 1987), electroporation method, calcium phosphate method (FL Graham & AJ van der Eb, Virology 52, 456-467 (1973)), DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。 After culturing the transformant, the human antibody is separated from the transformant cells or from the culture solution. For separation and purification of antibodies, methods such as centrifugation, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and the like can be used in appropriate combination.
抗体断片
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
Antibody fragment An antibody fragment can be prepared based on the antibody of the present invention or based on the sequence information of the gene encoding the antibody of the present invention. Antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, and dsFv antibodies.
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。 Fab is a fragment having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by digesting IgG with papain in the presence of cysteine and consisting of an L chain, an H chain variable region, and an H chain fragment consisting of a part of the CH1 domain and hinge region. is there. In the present invention, the antibody can be obtained by digesting with papain. Alternatively, Fab can be prepared from a transformant obtained by incorporating a part of the H chain of the antibody and DNA encoding the L chain into an appropriate vector and transforming using the vector.
Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')2のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。 Fab ′ is a fragment having a molecular weight of about 50,000 obtained by cleaving a disulfide bond between the H chains of F (ab ′) 2 described later. In the present invention, the antibody is obtained by digesting with pepsin and cleaving disulfide bonds using a reducing agent. Similarly to Fab, it can also be prepared by genetic engineering using DNA encoding Fab ′.
Ｆ(ａｂ')2は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')2をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。 F (ab ′) 2 is a fragment (Fab ′) that is obtained by pepsin digestion of IgG and is composed of an L chain, an H chain variable region, and an H chain fragment consisting of the CH1 domain and a part of the hinge part. Is a fragment having a molecular weight of about 100,000 linked by a disulfide bond. In the present invention, the antibody is obtained by pepsin digestion. Similarly to Fab, it can also be prepared by genetic engineering using DNA encoding F (ab ′) 2 .
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）3などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。 scFv is an antibody fragment in which an Fv comprising an H chain variable region and an L chain variable region is made into a single chain by linking the C terminus of one chain and the other N terminus with an appropriate peptide linker. As the peptide linker, for example, (GGGGGS) 3 having high flexibility can be used. For example, a DNA encoding the scFv antibody is constructed using DNA encoding the H chain variable region and L chain variable region of the above antibody and DNA encoding a peptide linker, and this is incorporated into an appropriate vector, and the vector is used. ScFv can be prepared from the transformant transformed as described above.
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。 dsFv is an Fv fragment in which a Cys residue is introduced at an appropriate position in the H chain variable region and the L chain variable region, and the H chain variable region and the L chain variable region are stabilized by disulfide bonds. The position of Cys residue introduction in each chain can be determined based on the three-dimensional structure predicted by molecular modeling. In the present invention, for example, the three-dimensional structure is predicted from the amino acid sequences of the H chain variable region and the L chain variable region of the above antibody, and DNAs encoding the H chain variable region and L chain variable region into which mutations are introduced are constructed based on the prediction. Then, this is incorporated into an appropriate vector, and dsFv can be prepared from a transformant transformed with the vector.
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。 The antibody fragments can also be multimerized by linking scFv antibody, dcFv antibody, etc. using an appropriate linker, or by fusing streptavidin.
医薬組成物
本発明によれば、本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としてはがんの治療であるが、これに限らない。ＴｆＲの高発現によるがん以外の疾患でも本発明の範囲以内である。更に好ましい実施形態としてがんは、固形癌（例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど）、または血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）である。本発明の他の好ましい実施形態では、がんは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。
Pharmaceutical Composition According to the present invention, a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention is provided. One embodiment of the present invention is cancer treatment, but is not limited thereto. Diseases other than cancer due to high expression of TfR are also within the scope of the present invention. In a more preferred embodiment, the cancer is solid cancer (eg, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer). Breast cancer, head and neck cancer, skin cancer, etc.) or blood cancer (eg leukemia, lymphoma, myeloma, etc.). In another preferred embodiment of the invention, the cancer is adult T cell leukemia (ATL).
本発明の医薬組成物の一態様として、本発明の抗体が有効成分として利用される。これは、抗体の細胞増殖抑制活性、細胞死誘導活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などを利用し、抗腫瘍効果を発揮する。抗体が、以上の活性を一つだけを持つことでもよいし、また複数の活性を同時に持つことでもよい。つまり、ｎａｋｅｄ抗体が医薬組成物の有効成分である。 As one aspect of the pharmaceutical composition of the present invention, the antibody of the present invention is used as an active ingredient. This exerts an antitumor effect by utilizing the cell growth inhibitory activity, cell death inducing activity, ADCC activity, CDC activity and the like of the antibody. The antibody may have only one of the above activities or may have a plurality of activities simultaneously. That is, the naked antibody is an active ingredient of the pharmaceutical composition.
もう一つの態様では、本発明の抗体はがん治療薬としてがん組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、がん細胞に傷害をもたらす物質を結合させた抗体を投与することにより、がん部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。 In another embodiment, the antibody of the present invention can be used in a missile therapy that specifically targets cancer tissue as a cancer therapeutic agent. That is, it is a therapeutic method intended to reduce the therapeutic effect and side effects by administering an antibody combined with a substance that causes damage to cancer cells to cause a specific migration to the cancerous part.
がん細胞に傷害する物質は、薬剤、毒素又は放射線物質などの細胞障害性物質を挙げられる。細胞障害性物質と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００４ Ｊｕｌ １;１０(１３):４５３８-４９。
抗体に結合させる薬剤は、がん細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができる。例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
Examples of the substance that damages cancer cells include cytotoxic substances such as drugs, toxins, and radiation substances. The binding between the cytotoxic substance and the antibody can be performed by a method known to those skilled in the art (Clin Cancer Res. 2004 Jul 1; 10 (13): 4538-49.
As the drug to be bound to the antibody, a known substance that causes damage to cancer cells can be used. Examples include duocarmycin, duocarmycin analogs and inducers, CC-1065, duocarmycin analogs based on CBI, duocarmycin analogs based on MCBI, and duos based on CCBI. Carmycin analog, doxorubicin, doxorubicin conjugate, morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, dolastatin, dressstatin-10, combretastatin, calicheamicin, maytansine, maytansine analog, DM1, DM2, DM3, DM4 , DMI, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMA) ), 5-benzoylvaleric acid AE ester (AEVB), tubulin, disorazole, epothilone, paclitaxel, docetaxel, SN-38, topotecan, lysoxine, echinomycin, colchicine, vinblastine, vindesine, estramustine, semadotine, eluterobin , Methotrexate, methotterin, dichloromethotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, cytosine arabinoside, melphalan, leurosin, lureocidine, actinomycin, daunorubicin, daunorubicin conjugate, mitomycin C, mitomycin A, carminomycin, amino Pterin, thalisomycin, podophyllotoxin, podophyllotoxin derivatives, etoposide, etoposide phosphate, Nkurisuchin, taxol, taxotere retinoic acid, butyric acid, N 8 - can be exemplified acetyl spermidine and camptothecin like, but is not limited thereto.
抗体と薬剤の結合には、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。 The antibody and drug may be bound directly via a linking group or the like possessed by themselves, or indirectly via a linker or other substance.
薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。 Examples of the linking group when the drug is directly bonded include a disulfide bond using an SH group and a bond via maleimide. For example, the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are bonded by a disulfide bond. There is also a method via maleimide. Another method is to introduce cysteine into the antibody by genetic engineering.
抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。 It is also possible to bind the antibody and the drug indirectly via another substance (linker). The linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody or drug or both. Examples of functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, pyridinyl groups, and the like.
リンカーの例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン-フェニルアラニン(ａｌａ-ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。 Examples of linkers include N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) (LC -SMCC), κ-maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), γ-maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimide Benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- (α-maleimidoacetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- (β-maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N-succin Midyl 4- (p-maleimidophenyl) -butyrate (SMPB), and N- (p-maleimidophenyl) isocyanate (PMPI), 6-maleimidocaproyl (MC), maleimidopropanoyl (MP), p-aminobenzyloxy Carboxyl (PAB), N-succinimidyl 4 (2-pyridylthio) pentanoate (SPP), N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB), and the like, but are not limited thereto. Absent. In addition, this linker may be a peptide linker such as valine-citrulline (Val-Cit) or alanine-phenylalanine (ala-phe), or the linkers listed above may be used in appropriate combination. good.
薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。 Regarding the method of binding a drug to an antibody, for example, Cancer Research; 68 (22) 9280 (2008), Nature Biotechnology; 26 (8) 925 (2008), Bio Conjugate Chemistry; 19, 1673 (2008), Cancer Research; 68 (15) It can be carried out according to the method described in 6300 (2008) or JP-T-2008-516896.
毒素としては、抗体に毒素を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。毒素として、たとえば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。 Examples of the toxin include so-called immunotoxins in which a toxin is chemically or genetically engineered to an antibody. Examples of the toxin include diphtheria toxin A chain, Pseudomonas endotoxin, ricin chain; sugar-free ricin A chain Gelonin, Saporin and the like.
利用する放射性物質は、当業者に公知の物質を用いることができるが。例えばイットリウム９０（90Ｙ）、レニウム１８６（186Ｒｅ）、レニウム１８８（188Ｒｅ）、銅６７（67Ｃｕ）、鉄５９（59Ｆｅ）、ストロンチウム８９（89Ｓｒ）、金１９８（198Ａｕ）、水銀２０３（203Ｈｇ）、鉛２１２（212Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（165Ｄｙ）、ルテニウム１０３（103Ｒｕ）、ビスマス２１２（212Ｂｉ）、ビスマス２１３（213Ｂｉ）、ホルミウム１６６（166Ｈｏ）、サマリウム１５３（153Ｓｍ）、ルテチウム１７７（177Ｌｕ）などを挙げることができる。好ましくは、90Ｙ 153Ｓｍ、177Ｌｕである。
抗体と放射性物質の結合は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １994 Mar-Apr;5(２):１0１-4.）。
As a radioactive substance to be used, a substance known to those skilled in the art can be used. For example, yttrium 90 ( 90 Y), rhenium 186 ( 186 Re), rhenium 188 ( 188 Re), copper 67 ( 67 Cu), iron 59 ( 59 Fe), strontium 89 ( 89 Sr), gold 198 ( 198 Au), Mercury 203 ( 203 Hg), Lead 212 ( 212 Pb), Dysprosium 165 ( 165 Dy), Ruthenium 103 ( 103 Ru), Bismuth 212 ( 212 Bi), Bismuth 213 ( 213 Bi), Holmium 166 ( 166 Ho), Samarium 153 ( 153 Sm), lutetium 177 ( 177 Lu), and the like. 90 Y 153 Sm and 177 Lu are preferable.
The antibody and radioactive substance can be bound by methods known to those skilled in the art (Bioconjug Chem. 1994 Mar-Apr; 5 (2): 101-4.).
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いたがん治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １998 Nov-Dec;9(6):773-82.）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。 Cancer treatment using an antibody to which a compound containing a radioisotope is bound can be performed by a method known to those skilled in the art (Bioconjug Chem. 1998 Nov-Dec; 9 (6): 773-82.). Specifically, an antibody conjugated with a compound containing a small amount of radioisotope is first administered to a patient, and a systemic scintigram is performed. After confirming that there are few bonds between normal tissue cells and antibodies and that there are many cancer cells and antibodies, a large amount of antibody to which a compound containing a radioisotope is bound is administered.
本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物による製剤も本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体を含有する医薬組成物に加え、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗がん剤のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬組成物による製剤単独の投与でもよいし、他の薬剤と併用でもよい。 Formulations with pharmaceutical compositions containing the anti-human TfR antibodies of the present invention are also included within the scope of the present invention. Such a formulation preferably includes a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the pharmaceutical composition containing the antibody and is in contact with other drugs such as other antibodies or anticancer agents. It may be a mixture. Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline. Alternatively, the antibody may be lyophilized (freeze-dried) and reconstituted by adding a buffered aqueous solution as described above when needed. The dosage form is oral administration by tablet, capsule, granule, powder, syrup, etc., or injection (subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, etc.), transdermal, transmucosal, nasal And parenteral administration by pulmonary, suppository and the like. The pharmaceutical preparation of the present invention may be administered alone or in combination with other drugs.
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、抗体の量として、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。 The dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but usually, in oral administration, the amount of antibody is about 0.01 mg to 1000 mg per day for an adult. It can be administered once or divided into several times. In parenteral administration, about 0.01 mg to 1000 mg can be administered once by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention in detail but are not to be construed to limit the scope thereof.
実施例１：癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング
胃癌株ＭＫＮ４５細胞を１５ｃｍ デイッシュで培養し、２ｍｇ/ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ/ ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によりデイッシュから剥離した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０13ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５−１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれに事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌ ｐｈｔａｌａｔｅ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)に重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。
Example 1: Screening of phage antibodies using cancer cell lines (1) Screening of phage antibodies that bind to cancer cells Gastric cancer strain MKN45 cells were cultured in a 15 cm dish and 2 mg / mL collagenase I / cell dissociation buffer (Gibco BRL) from the dish. It peeled. The cells were collected and washed with chilled PBS, and then mixed with 1 × 10 13 cfu human antibody phage library (see JP 2005-185281, WO 2008/007648, WO 2006/090750), The reaction solution (1% BSA, 0.1% NaN3, MEM) was added to a final volume of 1.6 mL, and the reaction was performed by slowly rotating at 4 ° C. for 4 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was divided into two, and each layer was layered on 0.6 mL of an organic solution (dibutyl phthalate cyclohexide 9: 1) prepared in advance, and centrifuged for 2 minutes (3000 rpm) with a microcentrifuge. The supernatant was discarded, and the cells that settled at the bottom of the tube were suspended in 0.7 mL of 1% BSA / MEM, and overlaid with 0.7 mL of an organic solvent. Similarly, the supernatant was discarded by centrifugation, and the cells were suspended in 0.3 mL of PBS and frozen in liquid nitrogen.
凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０11ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，０．５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これが１ｓｔスクリーニングのファージとした。 Frozen cells were thawed at 37 ° C. and infected with 20 mL of E. coli DH12S (OD0.5) in 1 hour. E. coli infected with the phage was placed in 600 mL of 2 × YTGA medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin, 1% glucose) and cultured overnight at 30 ° C. Thereafter, 10 mL was taken and placed in 200 mL 2 × YTA medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin) and cultured at 37 ° C. for 1.5 hours. 1 × 10 11 helper phage KO7 was added and further cultured at 37 ° C. for 1 hour. 800 mL of 2 × YTGAK medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin, 0.5% Glucose, 50 μg / mL kanamycin) was added and cultured at 30 ° C. overnight. The supernatant was collected by centrifugation (8000 rpm) for 10 minutes. 200 mL of PEG solution (20% polyethyleneglycol 6000, 2.5 M NaCl) was added to the collected supernatant and stirred well, and then phages were precipitated by centrifugation (8000 rpm) for 10 minutes. This was suspended in 10 mL of PBS, and this was used as the 1st screening phage.
次は、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０7培養細胞と１×１０10１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液を（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。 Next, 2nd screening was performed. 2 × 10 7 cultured cells and 1 × 10 10 1st screening phage were mixed, and the reaction solution (1% BSA, 0.1% NaN 3, MEM) was added to a final volume of 0.8 mL. Thereafter, the same method as the 1st screening was performed to obtain 2nd screening phage.
実施例２：可溶性ヒトＴｆＲと反応するファージのスクリーニング
（１）可溶性ＴｆＲ抗原産生細胞の作製
癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ２, ＳＫＯＶ−３を用いて、ＴｆＲのｃＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。常法によりＴｆＲ 細胞外ドメインのｃＤＮＡを調整し、ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ（クロンテク社製）に挿入することにより、可溶性ＴｆＲ抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株２９３Ｔへ導入し、可溶性ＴｆＲ抗原を産生する発現細胞を作製した。
Example 2: Screening of phages that react with soluble human TfR (1) Preparation of soluble TfR antigen-producing cells TfR cDNA was prepared by PCR using the cancer cell lines MIAPaCa2 and SKOV-3. A cDNA for TfR extracellular domain was prepared by a conventional method and inserted into pCMV-Script (Clontech) to prepare a soluble TfR antigen expression vector. This expression vector was introduced into cell line 293T to produce expression cells that produce soluble TfR antigens.
（２）可溶性ヒトＴｆＲによるパニング
精製した可溶性ＴｆＲ抗原を使用しＩｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＣ）に１０μｇ分を添加し４℃一晩静置した。その後２ｎｄファージ１ｘ１０10相当を抗体液として室温で２時間抗原と反応させた。反応終了後Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅに１８０μＬのＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加える事で洗浄し、この操作を２０回繰り返した。洗浄終了後Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅに１００μＬの０．２ＭＧｌｙｃｉｎｅ−Ｈｃｌ（ｐＨ３．０）を加えファージ抗体を溶出し、１Ｎ Ｔｒｉｓによって回収した溶液を中和した。
(2) Panning with soluble human TfR Using the purified soluble TfR antigen, 10 μg was added to Immuno Module / Stripe Plates (NUNC), and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, the 2nd phage 1 × 10 10 equivalent was reacted with the antigen at room temperature for 2 hours as an antibody solution. After completion of the reaction, washing was performed by adding 180 μL of PBS / 0.05% Tween 20 to the Immuno Module, and this operation was repeated 20 times. After completion of washing, 100 μL of 0.2MGlycine-Hcl (pH 3.0) was added to the Immuno Module to elute the phage antibody, and the solution recovered with 1N Tris was neutralized.
回収したファージ抗体は２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。感染終了後回収量を測定する目的でＬＢＧＡプレートに任意の量でサンプリングした。続いてファージに感染した大腸菌は６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０11ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，０．５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これを３ｒｄスクリーニングのファージとした。 The collected phage antibody was infected with 20 mL of E. coli DH12S (OD0.5) in 1 hour. An arbitrary amount was sampled on an LBGA plate for the purpose of measuring the amount collected after the infection was completed. Subsequently, E. coli infected with the phage was placed in 600 mL of 2 × YTGA medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin, 1% glucose) and cultured at 30 ° C. overnight. Thereafter, 10 mL was taken and placed in 200 mL 2 × YTA medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin) and cultured at 37 ° C. for 1.5 hours. 1 × 10 11 helper phage KO7 was added and further cultured at 37 ° C. for 1 hour. 800 mL of 2 × YTGAK medium (2 × YT, 200 μg / mL ampicillin, 0.5% Glucose, 50 μg / mL kanamycin) was added and cultured at 30 ° C. overnight. The supernatant was collected by centrifugation (8000 rpm) for 10 minutes. 200 mL of PEG solution (20% polyethyleneglycol 6000, 2.5 M NaCl) was added to the collected supernatant and stirred well, and then phages were precipitated by centrifugation (8000 rpm) for 10 minutes. This was suspended in 10 mL of PBS and used as a 3rd screening phage.
（３）抗体含有大腸菌培養上清の調製
３ｒｄスクリーニングでサンプリングしたプレートからファージ抗体を個別にクローン化し２ｘＹＴＧＡで培養後、終濃度１ｍＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ βーＤ―１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを加え３０℃一晩培養することで抗体の発現誘導を行った。翌日培養液を１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。
(3) Preparation of antibody-containing E. coli culture supernatant Phage antibodies were individually cloned from the plate sampled by 3rd screening, cultured in 2xYTGA, and then added with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside with a final concentration of 1 mM and cultured overnight at 30 ° C. Thus, the expression of the antibody was induced. On the next day, the culture medium was centrifuged for 10 minutes (8000 rpm), and the supernatant was collected.
（４）ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
上記可溶性ＴｆＲ産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性ＴｆＲ抗原を取得した。この可溶性ＴｆＲ抗原を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ＴｆＲ抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＣ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ＴｆＲ抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％ スキムミルク / ０．０５％ ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記抗体発現培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ ｉｎ ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2 を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。 ２ＮＨ2ＳＯ2を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。可溶性ＴｆＲ抗原と顕著な陽性反応を示すものを選び、ファージのＤＮＡ配列を解析した。その結果、５株新規ファージ抗体を得られた。この５株ファージ抗体のＣＤＲ配列は下記の通りである。
(4) Screening for positive phages by ELISA The supernatant of the soluble TfR-producing cells was collected, and the soluble TfR antigen was obtained by purification. Using this soluble TfR antigen, the reactivity of the antigen antibody by ELISA was examined. Specifically, soluble TfR antigen was adjusted to 10 μg / mL with PBS, added to Immuno Module / Stripe Plates (NUNC) at 50 μL / well, and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the soluble TfR antigen was discarded, Blocking solution (5% skim milk / 0.05% NaN3 / PBS) was added at 200 μL / well, and blocking was performed at 37 ° C. for 2 hours. The blocking solution was removed, the plate was washed with PBS, 100 μL / well of the antibody expression culture supernatant was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBS 5 times, 100 μL / well of 1 μg / mL Rabbit anti-cp3 diluted with PBS / 0.05% Tween 20 was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBS 5 times, anti-Rabbit IgG (H + L) -HRP diluted 2000 times with PBS / 0.05% Tween 20 was further added at 100 μL / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with PBS, OPD in 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.1) + 0.01% H 2 O 2 was added at 100 μL / well and reacted at room temperature for 5 minutes. 2 NH 2 SO 2 was added at 100 μL / well to stop the color reaction. Thereafter, the absorbance at 492 nm was measured with SPECTRAmax340PC (Molecular Devices). Those having a remarkable positive reaction with the soluble TfR antigen were selected, and the DNA sequence of the phage was analyzed. As a result, 5 new phage antibodies were obtained. The CDR sequences of the five-strain phage antibody are as follows.
(１)ＴｆＲ０３０抗体
VH CDR1：配列番号１、VH CDR2：配列番号２、VH CDR3：配列番号３
VL CDR1：配列番号４、VL CDR2：配列番号５、VL CDR3：配列番号６
(２)ＴｆＲ０３４抗体
VH CDR1：配列番号７、VH CDR2：配列番号８、VH CDR3：配列番号９
VL CDR1：配列番号１０、VL CDR2：配列番号１１、VL CDR3：配列番号１２
(３)ＴｆＲ０３５抗体
VH CDR1：配列番号１３、VH CDR2：配列番号１４、VH CDR3：配列番号１５
VL CDR1：配列番号１６、VL CDR2：配列番号１７、VL CDR3：配列番号１８
(４)ＴｆＲ０３６
VH CDR1：配列番号１９、VH CDR2：配列番号２０、VH CDR3：配列番号２１
VL CDR1：配列番号２２、VL CDR2：配列番号２３、VL CDR3：配列番号２４
(５)ＴｆＲ０３７
VH CDR1：配列番号２５、VH CDR2：配列番号２６ VH CDR3：配列番号２７
VL CDR1：配列番号２８、VL CDR2：配列番号２９、VL CDR3：配列番号３０
(1) TfR030 antibody
VH CDR1: SEQ ID NO: 1, VH CDR2: SEQ ID NO: 2, VH CDR3: SEQ ID NO: 3
VL CDR1: SEQ ID NO: 4, VL CDR2: SEQ ID NO: 5, VL CDR3: SEQ ID NO: 6
(2) TfR034 antibody
VH CDR1: SEQ ID NO: 7, VH CDR2: SEQ ID NO: 8, VH CDR3: SEQ ID NO: 9
VL CDR1: SEQ ID NO: 10, VL CDR2: SEQ ID NO: 11, VL CDR3: SEQ ID NO: 12
(3) TfR035 antibody
VH CDR1: SEQ ID NO: 13, VH CDR2: SEQ ID NO: 14, VH CDR3: SEQ ID NO: 15
VL CDR1: SEQ ID NO: 16, VL CDR2: SEQ ID NO: 17, VL CDR3: SEQ ID NO: 18
(4) TfR036
VH CDR1: SEQ ID NO: 19, VH CDR2: SEQ ID NO: 20, VH CDR3: SEQ ID NO: 21
VL CDR1: SEQ ID NO: 22, VL CDR2: SEQ ID NO: 23, VL CDR3: SEQ ID NO: 24
(5) TfR037
VH CDR1: SEQ ID NO: 25, VH CDR2: SEQ ID NO: 26 VH CDR3: SEQ ID NO: 27
VL CDR1: SEQ ID NO: 28, VL CDR2: SEQ ID NO: 29, VL CDR3: SEQ ID NO: 30
配列番号１：GYYMH
配列番号２：WINPNSGGTNYAQKFQG
配列番号３：ETQHYGDYFDY
配列番号４：SGSSSNIGSNYVS
配列番号５：DNFKRPA
配列番号６：GTWDHSLNLNWV
配列番号７：SYGIS
配列番号８：WISAYNGNTNYAQKLQG
配列番号９：EGFEAGTFDY
配列番号１０：SGSISDIGSNYVH
配列番号１１：RNNQRPS
配列番号１２：AAWDDSLSGYV
配列番号１３：DYGMHW
配列番号１４：MISYDGSKVYYADSVRG
配列番号１５：DLWGHLDHW
配列番号１６：GSSSSIGAGYDVH
配列番号１７：TNNNRPS
配列番号１８：QSYDSSLSVYV
配列番号１９：GHEMN
配列番号２０：YISSSGSTIYYADSVKG
配列番号２１：EYPHYDFLTGFYYYYGMDV
配列番号２２：SGSSSNIGSNYVY
配列番号２３：RNNQRPS
配列番号２４：AAWDDSLSGWV
配列番号２５：NYAMS
配列番号２６：TIGGGGDTYYADSVKG
配列番号２７：GRPLSYEEGLDL
配列番号２８：TRSSGSIASNSVQ
配列番号２９ YEDTQRPS
配列番号３０ QSYDSAYHWV
Sequence number 1: GYYMH
Sequence number 2: WINPNSGGTNYAQKFQG
Sequence number 3: ETQHYGDYFDY
Sequence number 4: SGSSSNIGSNYVS
Sequence number 5: DNFKRPA
Sequence number 6: GTWDHSLNLNWV
Sequence number 7: SYGIS
Sequence number 8: WISAYNGNTNYAQKLQG
Sequence number 9: EGFEAGTFDY
Sequence number 10: SGSISDIGSNYVH
SEQ ID NO: 11: RNNQRPS
Sequence number 12: AAWDDSLSGYV
SEQ ID NO: 13: DYGMHW
Sequence number 14: MISYDGSKVYYADSVRG
Sequence number 15: DLWGHLDHW
Sequence number 16: GSSSSIGAGYDVH
SEQ ID NO: 17: TNNNRPS
Sequence number 18: QSYDSSLSVYV
Sequence number 19: GHEMN
Sequence number 20: YISSSGSTIYYADSVKG
Sequence number 21: EYPHYDFLTGFYYYYGMDV
Sequence number 22: SGSSSNIGSNYVY
SEQ ID NO: 23: RNNQRPS
Sequence number 24: AAWDDSLSGWV
Sequence number 25: NYAMS
SEQ ID NO: 26: TIGGGGDTYYADSVKG
SEQ ID NO: 27: GRPLSYEEGLDL
Sequence number 28: TRSSGSIASNSVQ
SEQ ID NO: 29 YEDTQRPS
SEQ ID NO: 30 QSYDSAYHWV
実施例３：ファージ抗体（ｓｃＦｖ）のIgG化
（１）ＴｆＲ０３０ＩｇＧ抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
ファージ抗体のIgG化はＴｆＲ０３０のＩｇＧ化を例として下記のように説明する。他の抗体について同様な手法でＩｇＧ化した。
Example 3: IgG conversion of phage antibody (scFv) (1) Preparation of plasmid expressing TfR030 IgG antibody IgG conversion of phage antibody is explained as follows using TfR030 IgG conversion as an example. Other antibodies were converted to IgG by the same method.
ＴｆＲ０３０のファージ抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子はＶＨ-ＶＬの順で並んでおり、ＶＨとＶＬはリンカー（配列番号３５）で接続したｓｃＦｖの構造をしている。 The genes of TfR030 phage antibody (scFv) are arranged in the order of VH-VL, and VH and VL have the structure of scFv connected by a linker (SEQ ID NO: 35).
ＴｆＲ０３０のＶＨ,ＶＬで使用していると推定されるヒト生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴ (*)で検索した結果を表１で示す。
(*) ＩＭＧＴ : http://www.imgt.org
Table 1 shows the results of searching for human germline genes presumed to be used in TfR030 VH and VL by IMGT (*).
(*) IMGT: http://www.imgt.org
ＩＭＧＴの検索結果を参考にして、ファージ抗体のＩｇＧ化をおこなった。ＴｆＲ０３０のＶＨ（配列番号３１）をヒトG１の定常領域（配列番号３２）と連結した。ＴｆＲ０３０のＶＬ（配列番号３３）はＩＧＬＪ３＊２遺伝子と並列に並んでいるＩＧＬＣ３＊０１（ヒト軽鎖λ定常領域：配列番号３４）と連結した遺伝子配列を作製した。5'側にＮｈｅＩ、3'側にＥｃｏＲＩを付加したH鎖、Ｌ鎖遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全合成した。。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗TfR０３０抗体Ｈ鎖発現ベクター、およびＬ鎖発現ベクターを得た。 With reference to the IMGT search results, the phage antibody was converted to IgG. TfR030 VH (SEQ ID NO: 31) was ligated with human G1 constant region (SEQ ID NO: 32). A VL of TfR030 (SEQ ID NO: 33) was ligated with IGLC3 * 01 (human light chain λ constant region: SEQ ID NO: 34) aligned in parallel with the IGLJ3 * 2 gene. The H chain and L chain genes with NheI added to the 5 ′ side and EcoRI added to the 3 ′ side were completely synthesized by GenScript. . The synthesized heavy and light chain genes were incorporated into separate expression vectors. That is, the artificial synthetic genes of H chain and L chain were cleaved with NheI and EcoRI, and incorporated into the NheI and EcoRI sites of expression vector pCAGGS to obtain anti-TfR030 antibody H chain expression vector and L chain expression vector.
（２）ＩｇＧ抗体の一過性発現
ＩｇＧ抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ （ライフテクノロジーズ）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３-Ｆ（ライフテクノロジーズ）は前日に継代した。トランスフェクション当日、一種類の抗体発現には、１ｘ１０6細胞／ｍＬの細胞濃度に調整した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これに抗体重鎖発現ベクターを１００μｇ、軽鎖発現ベクターを１００μｇ合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調整した。次に２００μＬのＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭに加えた（溶液ＩＩ）。溶液（Ｉ）と（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３-F細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７°C、８％ＣＯ2で細胞培養震盪機のＴＡＩＴＥＣ ＢｉｏＳｈａｋｅｒ ＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、それぞれの組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。
(2) Transient expression of IgG antibody FreeStyle (Life Technologies) was used for transient expression of IgG antibody. 293-F (Life Technologies), a floating cell for gene transfer, was passaged the day before. On the day of transfection, 400 mL of a cell suspension adjusted to a cell concentration of 1 × 10 6 cells / mL was prepared for the expression of one type of antibody. A solution (I) was prepared by suspending 100 μg of antibody heavy chain expression vector and 100 μg of light chain expression vector in total 200 μg of plasmid in OptiPro SFM. 200 μL of MAX reagent was then added to 8 mL of OptiPRO SFM (Solution II). Solutions (I) and (II) were mixed and allowed to stand at room temperature for 10 to 20 minutes. A total of 16 mL of the reaction solution was added to 400 mL of 293 expression medium in which 293-F cells were suspended, and cultured for 6 to 7 days at 37 ° C. and 8% CO 2 on a TAITEC BioShaker BR-43FL in a cell culture shaker. . After 6 to 7 days, culture supernatants containing the respective recombinant antibodies were collected and purified into materials.
（３）ＩｇＧ抗体の精製
上記で発現した培養上清に含まれるＩｇＧ抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅを用いたＡｂ-Ｃａｐｃｈｅｒ ＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したＩｇＧ抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。ＩｇＧ抗体の吸光係数はＥＸＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）に各抗体の全アミノ酸配列を用いて計算して求めた。
(3) Purification of IgG antibody The IgG antibody protein contained in the culture supernatant expressed above was purified with an Ab-Capcher ExTra (Protenova) affinity column using AKTAprime. The obtained peak fraction was further purified by gel filtration through a Sephacryl S-300 column equilibrated with Dulbecco's PBS as a solvent. The quantification of the purified IgG antibody protein was calculated using the extinction coefficient. The extinction coefficient of IgG antibody was calculated by using EXPASY's ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) using the total amino acid sequence of each antibody.
（４）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による各ＴｆＲＩｇＧ抗体の定量
各ＴｆＲＩｇＧ抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ELISA）による定量もおこなった。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ-１１０ＵＤ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（５μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトＩｇＧを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。
(4) Quantification of each TfRIgG antibody by enzyme immunoassay (ELISA) The concentration of the antibody contained in the culture supernatant of each TfRIgG antibody-producing cell and the concentration of the purified antibody, together with the quantification by absorbance, are determined by enzyme immunoassay (ELISA) Quantification was also performed. As a solid-phase antibody, goat anti-human IgG (H + L) (absorbed for mouse, rabbit, bovine, mouse IgG) (Cosmo Bio: American Qualex International, Inc .; AQI, Cat. No. A-110UD) It was added at 100 μl / well (concentration of 5 μg / mL) and left at 4 ° C. overnight. Next, Block Ace was added at 200 μL / well and blocked for 1 hour at room temperature, and then the antibody of the sample was serially diluted and added to each well and incubated for 1 hour to react. After washing 5 times with PBST (0.05% Tween 20, PBS), goat anti-human IgG (H + L) (absorbed for mouse, rabbit, bovine, mouse IgG) -HRP (Cosmo Bio: AQI, Cat. A- 110 PD) was diluted 10,000 times with PBST, and a detection antibody solution was added at a rate of 100 μL / well. After incubation for 1 hour, the plate was washed 5 times with PBST, and then substrate buffer TMB was added at a rate of 100 μL / well. After incubation for 15 minutes in the dark at room temperature, the reaction was stopped by adding a reaction stop solution at a rate of 100 μL / well, and the absorbance at 450 nm was measured. A calibration curve was prepared using purified human IgG as a standard, and the concentration of human antibody was calculated using this.
実施例４：ＩｇＧ化したＴｆＲ抗体の反応性
ＴｆＲ発現細胞株、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３：ＣＭＬ）を用いて、ＩｇＧ化した抗ＴｆＲ抗体の反応性を検討した。K５６２細胞を遠心により回収した。回収した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ３ 入りＰＢＳ）で細胞を１×１０6／ｍＬなるように懸濁し、この細胞懸濁液１００μＬを９６- ｗｅｌｌ Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３８９７）に分注した。、それぞれのＴｆＲＩｇＧ抗体をＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで０．０２〜２μｇ／ｍＬに調製し、調製した抗体溶液１００μＬを細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣS Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄した後、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ で７５０倍に希釈したＡｌｅｘａ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）溶液１００μＬを添加し、更に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ で遠心により２回洗浄した後、ＦＡＣS Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットして各ｗｅｌｌのＦＬ１蛍光強度を測定した。図１に示すように、各抗体（a:１０ｎｇ/ｍＬ；ｂ：１００ｎｇ/ｍＬ；ｃ：１μｇ/ｍＬ）がＫ５６２と強い反応性を示した。ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＴｆＲ（１μg/ｍＬ ＭＢＬ Ｄ２５９−３）はｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。
Example 4: Reactivity of IgG-converted TfR antibody The reactivity of IgG-converted anti-TfR antibody was examined using a TfR-expressing cell line, K562 (ATCC CCL-243: CML). K562 cells were collected by centrifugation. The collected cells were washed once with PBS, and then suspended in 1 × 10 6 / mL with FACS Buffer (PBS containing 1% BSA, 2 mM EDTA, 0.1% NaN 3). 100 μL of the solution was dispensed into a 96-well V bottom plate (Costar 3897). Each TfRIgG antibody was prepared at 0.02 to 2 μg / mL with FACS Buffer, and 100 μL of the prepared antibody solution was added to the cells and incubated at 4 ° C. for 1 hour. After the cells were washed twice with FACS Buffer, 100 μL of Alexa-anti-human IgG (invitrogen) solution diluted 750 times with FACS Buffer was added, and further incubated at 4 ° C. for 1 hour. After washing twice by centrifugation with FACS Buffer, it was set in HTS of FACS Calibur (BD) and the FL1 fluorescence intensity of each well was measured. As shown in FIG. 1, each antibody (a: 10 ng / mL; b: 100 ng / mL; c: 1 μg / mL) showed strong reactivity with K562. Anti-human TfR (1 μg / mL MBL D259-3) was used as a positive control.
実施例５：ＩｇＧ化したＴｆＲ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果
ＴｆＲ発現細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）を２５００／ｍＬ密度になるよう培養液で調製し、９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＮＵＮＣ １６７００８）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。ＴｆＲ０３０抗体４．６ｎｇ〜１０μｇ／ｍＬの抗体希釈系列を作製し、その１００μＬを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気で９６時間培養した。培養終了後、プレートにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ （ＤＯＪＩＮＤＯ）２０μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気で３時間培養した。Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ４５０ｎｍ で測定した。各濃度の抗体添加による増殖率を下記の計算式で算出した。Ｍａｓｔｅｒ Ｐｌｅｘ ２０１０ソフトウエア（日立ソリューションズ）を使用して、増殖率５０％を示す抗体濃度（ＩＣ５０）を求めた。図２で示したように、ＴｆＲ０３０抗体の添加により、白血病細胞株Ｋ５６２細胞の増殖が著しく抑制された。
増殖率＝抗体添加ｗｅｌｌ値−Ｂｌａｎｋ（培養液のみ）/Ｃｏｎｔｒｏｌ値（抗体なしｗｅｌｌ）−Ｂｌａｎｋ（培養液のみ）Ｘ１００％
ＴｆＲ０３０抗体ＩＣ５０：９０４ｎｇ/ｍｌ
Example 5: In vitro growth inhibitory effect of TfR antibody converted to IgG TfR-expressing cell line K562 (ATCC CCL-243) was prepared in a culture solution to a density of 2500 / mL, and 100 μL / mL was added to a 96-well flat-bottom plate (NUNC 167008). Wells were dispensed. An antibody dilution series of 4.6 ng to 10 μg / mL of TfR030 antibody was prepared, 100 μL thereof was added to the cells, and the cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 96 hours. After completion of the culture, 20 μl of Cell Counting Kit (DOJINDO) was added to the plate and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 3 hours. Absorbance was measured at 450 nm. The growth rate due to addition of antibody at each concentration was calculated by the following formula. Using Master Plex 2010 software (Hitachi Solutions), the antibody concentration (IC50) showing a growth rate of 50% was determined. As shown in FIG. 2, the proliferation of leukemia cell line K562 cells was remarkably suppressed by the addition of the TfR030 antibody.
Growth rate = well value with added antibody-Blank (culture medium only) / Control value (well without antibody) -Blank (culture medium only) X 100%
TfR030 antibody IC50: 904 ng / ml
Claims (17)
軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲと特異的に結合する抗体。 SEQ ID NOS: 1-3, 7-9 as heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), and heavy chain third complementarity determining region (VH CDR3), respectively. Amino acid sequence of any one of 13 to 15, 19 to 21, 25 to 27, light chain first complementarity determining region (VL CDR1), light chain second complementarity determining region (VL CDR2), light chain third complementarity An antibody that specifically binds to human TfR containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, 10 to 12, 16 to 18, 22 to 24, and 28 to 30 as a determination region (VL CDR3).
（１）配列番号１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（３）配列番号１３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（４）配列番号１９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号２４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（５）配列番号２５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号３０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体； An antibody that specifically reacts with human TfR, selected from the following (1) to (5).
(1) Heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 1, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 2, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 3 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 4, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 5 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of six light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(2) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 7, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 8, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 9 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 10, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 11 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 12 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(3) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 13, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 14, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 15 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 16, light chain second complementarity determining region of SEQ ID NO: 17 (VL CDR2), SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 18 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(4) SEQ ID NO: 19 heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1), SEQ ID NO: 20 heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2), SEQ ID NO: 21 heavy chain third complementarity determining region ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 22, light chain second complementarity determining region (VL CDR2) of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 24 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
(5) heavy chain first complementarity determining region (VH CDR1) of SEQ ID NO: 25, heavy chain second complementarity determining region (VH CDR2) of SEQ ID NO: 26, heavy chain third complementarity determining region of SEQ ID NO: 27 ( VH CDR3) heavy chain variable region having CDR, light chain first complementarity determining region (VL CDR1) of SEQ ID NO: 28, light chain second complementarity determining region (VL CDR2) of SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: An antibody having a light chain variable region having a CDR consisting of 30 light chain third complementarity determining regions (VL CDR3);
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|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
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