JP2014093950A

JP2014093950A - Water-soluble fluorescent dye, method of producing the water-soluble fluorescent dye, water-soluble fluorescent dye labeled primer and method of inspecting biological substance using the same

Info

Publication number: JP2014093950A
Application number: JP2012245729A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Abe; 健一阿部; Koichi Hirayama; 幸一平山; Hirobumi Yamano; 博文山野
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2014-05-22

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To impart high water solubility to a poorly water-soluble fluorescent dye.SOLUTION: A poorly water-soluble fluorescent dye with a solubility (g/100 g-HO) at 20±5°C of 10 or less has nucleotides bonded thereto to obtain water solubility, and the water solubility is controlled according to the number of bonded nucleotide molecules.

Description

本発明は、生体関連物質の標識に使用することができる蛍光色素、当該蛍光色素の製造方法、当該蛍光色素を利用した標識プライマー及び当該標識プライマーを利用した生体関連物質の検査方法に関する。 The present invention relates to a fluorescent dye that can be used for labeling a biological substance, a method for producing the fluorescent dye, a labeled primer that uses the fluorescent dye, and a method for inspecting a biological substance that uses the labeled primer.

蛍光色素は、タンパク質、核酸といった生体関連物質の標識化合物として利用されている。すなわち、生体関連物質に含まれる反応性のアミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基或いはスルフヒドリル基等の官能基と蛍光色素とを結合させることで、当該生体関連物質を蛍光色素で標識することができる。生体関連物質の標識として使用できる蛍光色素としては、種々の化合物が知られている。例えば、特許文献１には、近赤外線ないし遠赤外線の励起光により蛍光を発するインドシアニングリーン誘導体が開示されている。 Fluorescent dyes are used as labeling compounds for biological substances such as proteins and nucleic acids. That is, the biological substance can be labeled with a fluorescent dye by binding a functional group such as a reactive amino group, hydroxyl group, thiol group, carbonyl group or sulfhydryl group contained in the biological substance and the fluorescent dye. it can. Various compounds are known as fluorescent dyes that can be used as labels for biological substances. For example, Patent Document 1 discloses an indocyanine green derivative that emits fluorescence by excitation light of near infrared rays or far infrared rays.

また、特許文献２には、蛍光色素にて標識したオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用して核酸増幅反応を実施し、核酸が固定された所謂マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を利用して増幅産物を検出するシステムが開示されている。特許文献２に開示されたシステムに限らず、蛍光色素を標識として使用することで核酸等の生体関連物質を検出することができる。 In Patent Document 2, a nucleic acid amplification reaction is performed using an oligonucleotide labeled with a fluorescent dye as a primer, and an amplification product is detected using a so-called microarray (DNA chip) on which the nucleic acid is immobilized. Is disclosed. Not only the system disclosed in Patent Document 2, but also a biological substance such as a nucleic acid can be detected by using a fluorescent dye as a label.

このとき、標識として使用される蛍光色素には、高い水溶性が求められる。特許文献１には、水溶性に優れたインドシアニングリーン誘導体を提供するとの記述があるものの、十分とは言えなかった。すなわち、特許文献１に開示されたインドシアニングリーン誘導体や、従来公知の蛍光色素については水溶性が十分でないため、生体関連物質を検出するための標識として使用するのが困難であるといった問題があった。 At this time, the fluorescent dye used as a label is required to have high water solubility. Patent Document 1 describes that an indocyanine green derivative excellent in water solubility is provided, but it is not sufficient. That is, the indocyanine green derivative disclosed in Patent Document 1 and the conventionally known fluorescent dyes are not sufficiently soluble in water, and thus are difficult to use as labels for detecting biologically relevant substances. It was.

特許4098839号公報Japanese Patent No.4098839 特開2009-229398号公報JP 2009-229398

そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、難水溶性の蛍光色素に対して高い水溶性を付与した水溶性蛍光色素、難水溶性の蛍光色素に優れた水溶性を付与する水溶性蛍光色素の製造方法、難水溶性の蛍光色素に対して高い水溶性を付与した水溶性蛍光色素標識プライマー及び当該水溶性蛍光色素標識プライマーを用いた生体関連物質の検査方法を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the above-described circumstances, the present invention provides a water-soluble fluorescent dye that imparts high water solubility to a poorly water-soluble fluorescent dye, and a water-soluble fluorescent dye that imparts excellent water solubility to a hardly water-soluble fluorescent dye. It is an object of the present invention to provide a water-soluble fluorescent dye-labeled primer that imparts high water solubility to a poorly water-soluble fluorescent dye, and a method for inspecting biological substances using the water-soluble fluorescent dye-labeled primer .

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下といった難水溶性の蛍光色素に対して、ヌクレオチドを結合させることで水溶性が付与され、また、結合するヌクレオチド分子の数に応じて水溶性がより高くなるといった知見を見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。 As a result of intensive studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, a nucleotide is bound to a poorly water-soluble fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less. As a result, the inventors have found that water-solubility is imparted and that the water-solubility becomes higher depending on the number of nucleotide molecules to be bound, and the present invention has been completed.
The present invention includes the following.

（１）20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した２mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素。
（２）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。
（３）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（２）記載の水溶性蛍光色素。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（４）上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。
（５）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。 (1) A water-soluble fluorescent dye comprising a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less and a 2mer or more nucleotide bonded to the fluorescent dye.
(2) The water-soluble fluorescent dye according to (1), wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.
(3) The water-soluble fluorescent dye according to (2), wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

(Wherein X ^- represents a halogen ion, acetate ion, perchlorate ion, a carbonate ion or thiocyanate ion)
(4) The water-soluble fluorescent dye according to (1), wherein the nucleotide is 5 mer or more.
(5) The water-soluble fluorescent dye according to (1), wherein the nucleotide is 10 mer or more.

（６）20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させる、水溶性蛍光色素の製造方法。
（７）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
（８）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（７）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（９）上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
（１０）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。 (6) A method for producing a water-soluble fluorescent dye, comprising binding a nucleotide of 2 mer or more to a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less.
(7) The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to (6), wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.
(8) The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to (7), wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

(Wherein X ^- represents a halogen ion, acetate ion, perchlorate ion, a carbonate ion or thiocyanate ion)
(9) The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to (6), wherein the nucleotide is 5 mer or more.
(10) The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to (6), wherein the nucleotide is 10 mer or more.

（１１）20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した６mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１２）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（１１）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１３）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（１２）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（１４）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（１１）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１５）上記（１１）〜（１４）いずれかに記載の水溶性蛍光色素標識プライマーを用いて被検体の核酸を増幅する工程と、上記工程で得られた増幅産物を上記プライマーに含まれる蛍光色素からの蛍光を測定することで、上記水溶性蛍光色素標識プライマーに含まれるヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する核酸を検出する工程とを含む、生体関連物質の検査方法。 (11) A water-soluble fluorescent dye-labeled primer comprising a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less and a 6-mer or more nucleotide bonded to the fluorescent dye.
(12) The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to (11), wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.
(13) The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to (12), wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

(Wherein X ^- represents a halogen ion, acetate ion, perchlorate ion, a carbonate ion or thiocyanate ion)
(14) The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to (11), wherein the nucleotide is 10 mer or more.
(15) A step of amplifying the nucleic acid of the analyte using the water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to any one of (11) to (14) above, and fluorescence contained in the primer obtained from the amplification product obtained in the above step Detecting a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleotide sequence contained in the water-soluble fluorescent dye-labeled primer by measuring fluorescence from the dye.

本発明によれば、20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素に対して水溶性を付与することができる。すなわち、本発明によれば、本来20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下といった難水溶性であって水系溶媒に使用できない蛍光色素であっても水系溶媒にて使用できるようになる。 According to the present invention, water solubility can be imparted to a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less. That is, according to the present invention, even fluorescent dyes that are inherently poorly water-soluble and have a solubility at 20 ± 5 ° C. (g / 100 g-H ₂ O) of 10 or less and cannot be used in aqueous solvents are used in aqueous solvents. become able to.

反応液中のオリゴヌクレオチド又は化合物１で標識されたオリゴヌクレオチドが水層、クロロホルム層にどちらに移行したかについて、移行率を計算した結果を示す特性図である。It is a characteristic view which shows the result of having calculated the transfer rate about which oligonucleotide or the oligonucleotide labeled with the compound 1 transferred to the water layer or the chloroform layer in the reaction liquid. 化合物１を結合したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したPCRによる増幅産物を検出した結果を示す電気泳動写真である。It is an electrophoresis photograph which shows the result of having detected the amplification product by PCR using the oligonucleotide which couple | bonded the compound 1 as a primer.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る水溶性蛍光色素は、20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下といった難水溶性の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させることで難水溶性を改善した（すなわち、水溶性を付与した）ものである。ここで、蛍光色素にヌクレオチドを結合させるとは、蛍光色素に対してヌクレオチドを直接結合させる形態、リンカー分子を介して間接的に結合させる形態の両者を含む意味である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The water-soluble fluorescent dye according to the present invention is hardly water-soluble by binding a nucleotide of 2 mer or more to a poorly water-soluble fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less. Improved (that is, imparted water solubility). Here, binding nucleotides to fluorescent dyes means to include both forms in which nucleotides are directly bonded to fluorescent dyes and forms in which nucleotides are indirectly bonded through linker molecules.

ここで、難水溶性の蛍光色素とは、言い換えると20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下であり、所定の波長の励起光が照射されると蛍光を生ずる化合物を意味する。具体的に、難水溶性の蛍光色素としては、インドシアニングリーン誘導体を含むインドシアニン化合物、フルオレセイン化合物、ローダミン化合物、クマリン化合物、ピレン化合物などを挙げることができる。 Here, the poorly water-soluble fluorescent dye is, in other words, a compound that has a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less and generates fluorescence when irradiated with excitation light of a predetermined wavelength. Means. Specifically, examples of poorly water-soluble fluorescent dyes include indocyanine compounds including indocyanine green derivatives, fluorescein compounds, rhodamine compounds, coumarin compounds, and pyrene compounds.

インドシアニングリーン誘導体としては、特許4098839号公報に開示されたものを挙げることができる。より詳細には、難水溶性の蛍光色素として、下記構造式（１）に示されるインドシアニン化合物を挙げることができる。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）なお、構造式（１）においてXは、母核内の窒素原子上の陽電荷を打ち消して化合物を全体として中性に維持するアニオンである。 Examples of indocyanine green derivatives include those disclosed in Japanese Patent No. 4098839. More specifically, examples of the poorly water-soluble fluorescent dye include indocyanine compounds represented by the following structural formula (1).

(Where X ⁻ represents a halogen ion, acetate ion, perchlorate ion, carbonate ion or thiocyanate ion) In the structural formula (1), X cancels the positive charge on the nitrogen atom in the mother nucleus. An anion that keeps the compound neutral as a whole.

また、難水溶性の蛍光色素に結合させるヌクレオチドとは、五単糖の1位にプリン塩基又はピリミジン塩基がグリコシド結合してなるヌクレオシドに１〜３のリン酸基が結合した化合物である。プリン塩基としてはアデニン及びグアニンを挙げることができる。ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシル及びチミンを挙げることができる。また、五単糖としては、リボース及びデオキシリボースを挙げることができる。 The nucleotide to be bound to the poorly water-soluble fluorescent dye is a compound in which 1 to 3 phosphate groups are bound to a nucleoside formed by glycosidic binding of a purine base or a pyrimidine base at the 1-position of a pentose. Examples of purine bases include adenine and guanine. Pyrimidine bases can include cytosine, uracil and thymine. In addition, examples of the pentasaccharide include ribose and deoxyribose.

また、２mer以上のヌクレオチドとは、複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合して五単糖とリン酸が一つおきにつながった構造を意味する。難水溶性の蛍光色素に結合させるヌクレオチドとしては、上述のように五単糖がリボースであるリボヌクレオチドでも良いし、五単糖がデオキシリボースであるデオキシリボヌクレオチドであっても良い。 In addition, a nucleotide of 2mer or more means a structure in which a plurality of nucleotides are linked by phosphodiester bonds to connect every other pentose and phosphate. The nucleotide to be bound to the poorly water-soluble fluorescent dye may be a ribonucleotide whose pentose is ribose as described above, or a deoxyribonucleotide whose pentose is deoxyribose.

さらに、難水溶性蛍光色素に結合する2mer以上のヌクレオチドの配列としては、特に限定されず、適宜、設計することができる。例えば、所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように、2mer以上のヌクレオチドの配列を設計することができる。また、2mer以上のヌクレオチドの配列としては、ランダム配列であってもよい。すなわち、2mer以上のヌクレオチドが如何なる配列であっても、上述した難水溶性の蛍光色素に対して水溶性を付与することができる。 Furthermore, the nucleotide sequence of 2 mer or more that binds to the poorly water-soluble fluorescent dye is not particularly limited and can be designed as appropriate. For example, a nucleotide sequence of 2 mer or more can be designed so as to be a complementary nucleotide sequence to a predetermined nucleotide sequence. The nucleotide sequence of 2 mer or more may be a random sequence. That is, any sequence of nucleotides of 2 mer or more can impart water solubility to the aforementioned poorly water-soluble fluorescent dye.

なお、難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数は、２mer以上であれば特に限定されるものではない。すなわち、２mer以上のヌクレオチドを結合させることによって上述した難水溶性の蛍光色素は、水溶性が付与されることなる。特に、難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数は、５mer以上とすることが好ましく、１０mer以上とすることがより好ましい。難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数を上記範囲とすることによって、上述した難水溶性の蛍光色素に対してより優れた水溶性を付与することができる。 The number of nucleotides to be bound to the poorly water-soluble fluorescent dye is not particularly limited as long as it is 2 mer or more. That is, the above-mentioned poorly water-soluble fluorescent dye is imparted with water solubility by binding nucleotides of 2 mer or more. In particular, the number of nucleotides bonded to the poorly water-soluble fluorescent dye is preferably 5 mer or more, and more preferably 10 mer or more. By setting the number of nucleotides to be bonded to the poorly water-soluble fluorescent dye within the above range, more excellent water solubility can be imparted to the aforementioned poorly water-soluble fluorescent dye.

一方、上述した難水溶性の蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させるには、予め、２mer以上のヌクレオチドに対して例えば、反応性のアミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基、スルフヒドリル基等を導入しておき、これら官能基に対して蛍光色素を結合させる方法を使用することができる。その他にも、難水溶性の蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させるには、ビオチン−アビジン又はストレプトアビジンなどの相互作用を介した結合方法や酵素反応による結合方法といった方法を適用することもできる。 On the other hand, in order to bind the above-mentioned poorly water-soluble fluorescent dye and 2mer or more nucleotide, for example, reactive amino group, hydroxyl group, thiol group, carbonyl group, sulfhydryl group, etc. with respect to 2mer or more nucleotide in advance. And a method of binding a fluorescent dye to these functional groups can be used. In addition, in order to bind a poorly water-soluble fluorescent dye and a nucleotide of 2 mer or more, a method such as a binding method through an interaction such as biotin-avidin or streptavidin or a binding method by an enzymatic reaction may be applied. it can.

特に、上述した構造式（１）に示した化合物を使用する場合、ジメチルスルホキシド (DMSO)等の適切な溶媒に当該化合物を溶解して蛍光色素溶液を準備し、反応性のアミノ基を導入した２mer以上のヌクレオチドを含む溶液と当該蛍光色素溶液を混合することで、蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させることができる。 In particular, when the compound represented by the structural formula (1) is used, a fluorescent dye solution is prepared by dissolving the compound in an appropriate solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), and a reactive amino group is introduced. By mixing the solution containing the nucleotide of 2 mer or more and the fluorescent dye solution, the fluorescent dye and the nucleotide of 2 mer or more can be bound.

以上のように、難水溶性の蛍光色素に対して２mer以上のヌクレオチドを結合させることによって、全体として水溶性を有する蛍光色素となる。すなわち、本発明によれば、難水溶性の蛍光色素に対して水溶性を付与できるため、蛍光色素としての利用用途が大幅に拡大することとなる。本発明に係る水溶性蛍光色素における２mer以上のヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応に利用することができる。したがって、本発明に係る水溶性蛍光色素は、PCR（Polymerase Chain Reaction）やLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）等の核酸増幅反応のプライマーや、サザンハイブリダイゼーションのプローブ等に利用することができる。 As described above, a fluorescent dye having water solubility as a whole is obtained by binding a nucleotide of 2 mer or more to a poorly water-soluble fluorescent dye. That is, according to the present invention, water-solubility can be imparted to a poorly water-soluble fluorescent dye, so that the usage application as a fluorescent dye is greatly expanded. The nucleotides of 2 mer or more in the water-soluble fluorescent dye according to the present invention can be used for the hybridization reaction. Therefore, the water-soluble fluorescent dye according to the present invention can be used for primers for nucleic acid amplification reactions such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), probes for Southern hybridization, and the like.

なお、本発明に係る水溶性蛍光色素は、所定の波長の励起光を照射することで所定の波長の蛍光を発するため、当該波長の蛍光に基づいて検出することができる。具体的に、特許4098839号公報に開示されたインドシアニングリーン誘導体、特に構造式（１）に示す化合物は、励起波長500〜800nmであり、蛍光波長550〜850nmの蛍光特性を備えている。よって、高出力の半導体レーザーやHe・Neレーザーを励起光源として用い、550〜850nmを検出できる蛍光検出器を用いて高感度に検出することができる。 In addition, since the water-soluble fluorescent dye according to the present invention emits fluorescence of a predetermined wavelength by irradiating excitation light of a predetermined wavelength, it can be detected based on the fluorescence of the wavelength. Specifically, the indocyanine green derivative disclosed in Japanese Patent No. 4098839, particularly the compound represented by the structural formula (1), has an excitation wavelength of 500 to 800 nm and a fluorescence characteristic of a fluorescence wavelength of 550 to 850 nm. Therefore, it is possible to detect with high sensitivity using a fluorescence detector capable of detecting 550 to 850 nm using a high output semiconductor laser or He / Ne laser as an excitation light source.

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.

〔実施例１〕
本実施例では、構造式（１）に示す蛍光色素（なおX^-はCl^-、以下、化合物１）に対して異なる数のヌクレオチドを結合することによる水溶性の変化を検証した。 [Example 1]
In this example, a change in water solubility due to binding of a different number of nucleotides to the fluorescent dye represented by the structural formula (1) (X ⁻ is Cl ⁻ , hereinafter, Compound 1) was verified.

＜方法＞
先ず、化合物１（同仁化学研究所社製）にジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を加え、1 mg/mLになるように溶解した。また、表１に示したヌクレオチド（BIOLOG社製）又は各オリゴヌクレオチド（ライフテクノロジーズジャパン社製）に滅菌水を加え、1 mmol/Lになるように溶解した。 <Method>
First, dimethyl sulfoxide (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) was added to compound 1 (manufactured by Dojindo Laboratories) and dissolved to 1 mg / mL. Moreover, sterilized water was added to the nucleotides shown in Table 1 (manufactured by BIOLOG) or each oligonucleotide (manufactured by Life Technologies Japan) and dissolved to 1 mmol / L.

次に、1.5 mLチューブに表２に示す組成で反応液を作製した。また、実験対照として、オリゴヌクレオチドの代わりに滅菌水を加えた。

Next, a reaction solution was prepared in a 1.5 mL tube with the composition shown in Table 2. As an experimental control, sterilized water was added instead of the oligonucleotide.

上述のように作製した反応液を４℃、遮光下にて16時間以上静置した。その後、少量のサンプルを抜き取った後、減圧下で反応溶液を乾燥させた。そして、乾固物にクロロホルム（キシダ化学社製）を加え、撹拌混合した。その後、さらに滅菌水を加え、撹拌混合した。チューブを遠心して水層（上層）及びクロロホルム層（下層）に分離した。上記工程で抜き取った少量のサンプル、水層及びクロロホルム層について、260 nm及び640 nmの吸光度をそれぞれ測定した。なお、260 nmの吸光度に基づいて核酸濃度が測定でき、640 nmの吸光度に基づいて化合物１の濃度を測定できる。 The reaction solution prepared as described above was allowed to stand for 16 hours or more at 4 ° C. under light shielding. Then, after extracting a small sample, the reaction solution was dried under reduced pressure. Then, chloroform (Kishida Chemical Co., Ltd.) was added to the dried product and mixed with stirring. Thereafter, sterilized water was further added and mixed with stirring. The tube was centrifuged and separated into an aqueous layer (upper layer) and a chloroform layer (lower layer). Absorbances at 260 nm and 640 nm were measured for a small amount of sample, water layer and chloroform layer extracted in the above step. The nucleic acid concentration can be measured based on the absorbance at 260 nm, and the concentration of Compound 1 can be measured based on the absorbance at 640 nm.

＜結果＞
反応液から抜き取った少量のサンプルに含まれる化合物１と各オリゴヌクレオチドのモル濃度を測定した結果を表３に示した。

<Result>
Table 3 shows the results of measuring the molar concentration of Compound 1 and each oligonucleotide contained in a small sample extracted from the reaction solution.

水層とクロロホルム層に含まれる化合物１と各オリゴヌクレオチドのモル濃度を測定した結果をそれぞれ表４及び５に示した、

The results of measuring the molar concentration of Compound 1 and each oligonucleotide contained in the aqueous layer and the chloroform layer are shown in Tables 4 and 5, respectively.

表１〜３に示した測定結果に基づいて、反応液中のオリゴヌクレオチド又は化合物１で標識されたオリゴヌクレオチドが水層、クロロホルム層にどちらに移行したかについて、移行率を計算した結果を表６に示した。また、表６に示した数値をグラフ化したものが図１である。

Based on the measurement results shown in Tables 1 to 3, the results of calculating the transfer rate for the oligonucleotide in the reaction solution or the oligonucleotide labeled with Compound 1 transferred to the aqueous layer or the chloroform layer are shown. This is shown in FIG. FIG. 1 is a graph of the numerical values shown in Table 6.

＜考察＞
表１〜５に示したように化合物１自体の水溶性は著しく低く、化合物１は、難水溶性の蛍光色素であることが理解できる。表６及び図１に示したように、難水溶性の蛍光色素である化合物１に対して２mer以上のヌクレオチドを結合させることで、その鎖長依存的にクロロホルム層から水層に移行するオリゴヌクレオチドが増加した。すなわち、難水溶性の蛍光色素に対して２mer以上のヌクレオチドを結合することで水溶性の蛍光色素として利用できることが示唆された。また、結合するヌクレオチドを1〜4merと段階的に増加した場合には、クロロホルム層でも10%以上核酸が検出されたことから難水溶性である化合物１の物性を段階的に水溶性へ変換したと考えられる。 <Discussion>
As shown in Tables 1 to 5, the water solubility of Compound 1 itself is extremely low, and it can be understood that Compound 1 is a poorly water-soluble fluorescent dye. As shown in Table 6 and FIG. 1, by binding a 2mer or more nucleotide to compound 1, which is a poorly water-soluble fluorescent dye, an oligonucleotide that moves from the chloroform layer to the aqueous layer depending on its chain length increased. That is, it was suggested that it can be used as a water-soluble fluorescent dye by binding a 2mer or more nucleotide to a poorly water-soluble fluorescent dye. In addition, when the number of nucleotides to be bound was increased stepwise from 1 to 4 mer, 10% or more of the nucleic acid was detected even in the chloroform layer, and the physical properties of compound 1, which is poorly water-soluble, were gradually converted to water-soluble. it is conceivable that.

以上の結果から、化合物が難水溶性であっても、化合物に核酸を結合させることにより、水溶性の性質を付加することが可能となることが明らかとなった。 From the above results, it has been clarified that even if a compound is poorly water-soluble, it is possible to add water-soluble properties by binding a nucleic acid to the compound.

〔実施例２〕
本実施例では、PCRに使用するプライマーに対して化合物１を結合し、このプライマーを用いてPCRを行う際に、最適なプライマーの鎖長を検討した。 [Example 2]
In this example, compound 1 was bound to a primer used for PCR, and the optimal primer chain length was examined when PCR was performed using this primer.

＜方法＞
先ず、実施例１と同様に、化合物１（同仁化学研究所社製）にジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を加え、1 mg/mLになるように溶解した。また、表７に記載したオリゴヌクレオチド（ライフテクノロジーズジャパン社製）に滅菌水を加え、1 mmol/Lになるように溶解した。

<Method>
First, in the same manner as in Example 1, dimethyl sulfoxide (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) was added to compound 1 (manufactured by Dojindo Laboratories Co., Ltd.), and dissolved to 1 mg / mL. Moreover, sterilized water was added to the oligonucleotides described in Table 7 (manufactured by Life Technologies Japan) and dissolved to 1 mmol / L.

次に、1.5 mLチューブに表８に示す組成で反応液を作製した。

Next, a reaction solution was prepared in a 1.5 mL tube with the composition shown in Table 8.

上述のように作製した反応液を４℃、遮光下にて16時間以上静置した。その後、MicroSpin G-25 Columns（GEヘルスケア社製）を用いて精製した。そして、精製物の260 nmの吸光度を測定した後、滅菌水で核酸濃度が10μmol/Lとなるように調製した。 The reaction solution prepared as described above was allowed to stand for 16 hours or more at 4 ° C. under light shielding. Then, it refine | purified using MicroSpin G-25 Columns (made by GE Healthcare). Then, after measuring the absorbance at 260 nm of the purified product, the nucleic acid concentration was adjusted to 10 μmol / L with sterilized water.

以上で作製した、化合物１を結合したオリゴヌクレオチドを一方のフォワードプライマーとし5’-TGTGGCGCGGTATTATCC（配列番号１１）をリバースプライマーとしたPCRを行うため、表９に示す組成の反応液を調製した。

In order to perform PCR using the oligonucleotide prepared as described above bound to Compound 1 as one forward primer and 5′-TGTGGCGCGGTATTATCC (SEQ ID NO: 11) as a reverse primer, a reaction solution having the composition shown in Table 9 was prepared.

また、PCRにおけるサーマルサイクルは表１０に示すように設定した。

The thermal cycle in PCR was set as shown in Table 10.

PCRの終了後、PCR産物を含む反応液及び100 bp ladder（タカラバイオ社製）を３％アガロースゲル電気泳動にて泳動後、SYBR Green（LONZA社製）を用いて核酸を染色した。染色後、トランスイルミネーターで染色されたDNAを検出した。 After completion of PCR, the reaction solution containing the PCR product and a 100 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.) were electrophoresed on 3% agarose gel electrophoresis, and then the nucleic acid was stained using SYBR Green (manufactured by LONZA). After staining, DNA stained with a transilluminator was detected.

＜結果＞
染色されたDNAを検出した結果を図２に示した。図２に示すように、化合物１を結合した10mer以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合には、PCRによって増幅産物が得られることが確認できた。実施例１に示したように、10mer以上のオリゴヌクレオチドについても蛍光を観測できていることから、化合物１を結合した10mer以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合、化合物１に基づいて増幅産物を検出できることが示唆された。 <Result>
The result of detecting the stained DNA is shown in FIG. As shown in FIG. 2, it was confirmed that when an oligonucleotide of 10 mer or more bound with compound 1 was used as a primer, an amplification product was obtained by PCR. As shown in Example 1, since fluorescence can be observed for oligonucleotides having a length of 10 mer or more, when a oligonucleotide having a length of 10 mer to which compound 1 is bound is used as a primer, an amplification product based on compound 1 is obtained. It was suggested that it could be detected.

〔実施例３〕
本実施例では、PCRに使用するプライマーに対して化合物１を結合した蛍光色素標識プラマーを用いてPCRを行って得られた増幅産物を、当該増幅産物に相補的な配列を有するプローブを用いて検出する系において蛍光色素を利用できることを検討した。 Example 3
In this example, an amplification product obtained by performing PCR using a fluorescent dye-labeled plummer in which compound 1 is bound to a primer used for PCR is used with a probe having a sequence complementary to the amplification product. We investigated the availability of fluorescent dyes in the detection system.

＜方法＞
ＵＧＴ１Ａ１＊２８遺伝子多型の遺伝子型を判別するための一対の核酸プローブをそれぞれ２点ずつ有するＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップに搭載した核酸プローブの一覧を表１１に示した。

<Method>
A DNA chip having two pairs of nucleic acid probes for discriminating the genotype of the UGT1A1 * 28 gene polymorphism was prepared. Table 11 shows a list of nucleic acid probes mounted on the DNA chip.

実施例２と同様にして、5’末端をアミノ化したオリゴヌクレオチド（配列5’-amino-ATGGCGCCTTTGCTCCT（配列番号１４））に化合物１を結合させたリバースプライマーとし、5’- TAGTCGTCCTTCTTCCTCTCTGGT（配列番号１５）をフォワードプライマーとしたPCRを行うため、表２に示す組成の反応液を調製した。

In the same manner as in Example 2, 5′-TAGTCGTCCTTCTTCCTCTCTGGT (SEQ ID NO: 15) was prepared as a reverse primer in which Compound 1 was bound to an oligonucleotide aminated at the 5 ′ end (sequence 5′-amino-ATGGCGCCTTTGCTCCT (SEQ ID NO: 14)). ) Was used as a forward primer, a reaction solution having the composition shown in Table 2 was prepared.

また、PCRにおけるサーマルサイクルは表１３に示すように設定した。

The thermal cycle in PCR was set as shown in Table 13.

以上のようにして得られた増幅断片をＤＮＡチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、54℃に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液（組成：1×クエン酸ナトリウム緩衝液（SSC）/0.1％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）溶液）を1.5μLとPCR産物を3μL入れ、混合した。混合液のうち3μLをＤＮＡチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱毎、チャンバー内に載置した。その後、54℃で1時間静置した。 When hybridizing the amplified fragment obtained as described above to a DNA chip, a wet box was first placed in a chamber set at 54 ° C. and sufficiently preheated. In a new sample tube, 1.5 μL of hybridization buffer (composition: 1 × sodium citrate buffer (SSC) /0.1% sodium lauryl sulfate (SDS) solution) and 3 μL of PCR product were added and mixed. 3 μL of the mixture was dropped onto the DNA chip, covered, placed in a preheated wet box, and each wet box was placed in the chamber. Then, it left still at 54 degreeC for 1 hour.

その後、直ちに48℃に加温した1×SSC/0.1％SDS溶液に５分間静置、次に室温の1×SSC/0.1％SDS溶液に5分間静置した後、室温の1×SSC溶液に3分間静置して洗浄した。 Immediately after that, it is allowed to stand in a 1 × SSC / 0.1% SDS solution heated to 48 ° C. for 5 minutes, and then left in a 1 × SSC / 0.1% SDS solution at room temperature for 5 minutes, and then placed in a 1 × SSC solution at room temperature. It was allowed to stand for 3 minutes for washing.

さらに表１４に示す順に洗浄し、洗浄後のＤＮＡチップを室温の1×SSC液に測定するまで静置した。

Furthermore, it wash | cleaned in order shown in Table 14, and left still until it measured the DNA chip after washing | cleaning to the 1xSSC liquid at room temperature.

ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）を使用した。このとき、スポット径は16ピクセル（約200μm）に設定し、露光時間を20秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。本実施例のうち、蛍光標識プライマーを用いてPCRを行った検体の蛍光強度を表１５に示した。

BIOSHOT (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used for detection of hybridization. At this time, the spot diameter was set to 16 pixels (about 200 μm), and the exposure time was set to 20 seconds. Further, the median value was obtained from the numerical values of the pixels within each spot diameter. For the same probe spot, the average of the median values was obtained and used as the output value of each spot. Table 15 shows the fluorescence intensities of the samples subjected to PCR using the fluorescently labeled primers in this example.

＜考察＞
表１５に示すように、蛍光標識プライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅産物をDNAチップを用いて検出する際に、蛍光色素標識プライマーに基づいて検出できることが明らかになった。 <Discussion>
As shown in Table 15, it was revealed that when PCR was performed using a fluorescently labeled primer and the obtained amplification product was detected using a DNA chip, it could be detected based on the fluorescent dye-labeled primer.

Claims

20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した２mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素。 A water-soluble fluorescent dye comprising a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less and a nucleotide of 2 mer or more bonded to the fluorescent dye.

前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。 The water-soluble fluorescent dye according to claim 1, wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.

前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項２記載の水溶性蛍光色素。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す） The water-soluble fluorescent dye according to claim 2, wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

(Wherein X ^- represents a halogen ion, acetate ion, perchlorate ion, a carbonate ion or thiocyanate ion)

上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。 The water-soluble fluorescent dye according to claim 1, wherein the nucleotide is 5 mer or more.

上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。 The water-soluble fluorescent dye according to claim 1, wherein the nucleotide is 10 mer or more.

20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させる、水溶性蛍光色素の製造方法。 A method for producing a water-soluble fluorescent dye, comprising binding a nucleotide of 2 mer or more to a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less.

前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。 The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to claim 6, wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.

前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項７記載の水溶性蛍光色素の製造方法。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す） The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to claim 7, wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。 The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to claim 6, wherein the nucleotide is 5 mer or more.

上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。 The method for producing a water-soluble fluorescent dye according to claim 6, wherein the nucleotide is 10 mer or more.

20±5℃における溶解度（g/100g-H₂O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した６mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素標識プライマー。 A water-soluble fluorescent dye-labeled primer comprising a fluorescent dye having a solubility (g / 100 g-H ₂ O) at 20 ± 5 ° C. of 10 or less and a 6-mer or more nucleotide bound to the fluorescent dye.

前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項１１記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。 The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to claim 11, wherein the fluorescent dye is an indocyanine compound.

前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項１２記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。

（ここでX^-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す） The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to claim 12, wherein the indocyanine compound is represented by the following structural formula (1).

上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項１１記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。 The water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to claim 11, wherein the nucleotide is 10mer or more.

請求項１１〜１４いずれかに記載の水溶性蛍光色素標識プライマーを用いて被検体の核酸を増幅する工程と、
上記工程で得られた増幅産物を上記プライマーに含まれる蛍光色素からの蛍光を測定することで、上記水溶性蛍光色素標識プライマーに含まれるヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する核酸を検出する工程とを含む、生体関連物質の検査方法。 Amplifying the nucleic acid of the subject using the water-soluble fluorescent dye-labeled primer according to any one of claims 11 to 14,
By measuring the fluorescence from the fluorescent dye contained in the primer from the amplification product obtained in the above step, a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleotide sequence contained in the water-soluble fluorescent dye-labeled primer is detected. A method for testing a biological substance, comprising: