JP2014091731A - Peptide compound from novel somatostatin, and dna polymerase inhibitor, anticancer agent and apoptosis-inducing agent comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規ソマトスタチン由来ペプチド化合物並びに該化合物を含むDNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤及びアポトーシス誘導剤に関する。 The present invention relates to a novel somatostatin-derived peptide compound and a DNA polymerase inhibitor, anticancer agent and apoptosis inducer containing the compound.
（ソマトスタチン）
ソマトスタチン-14（SRIF）は、天然環状テトラデカペプチドであり、成長ホルモンの分泌を阻害し、グルカゴン、インシュリン、ガストリン及びセクレチン等を含む生理活性ホルモンを抑制し、また細胞増殖の調節に影響を与える。これらの多様な薬理活性は、脳、消化管、膵臓等を含むヒト組織だけでなく複数の腫瘍細胞に広く分布しているソマトスタチン1-5（SSTRS1-5）を介して示される。今日、ほとんどのソマトスタチンアナログは、内分泌腫瘍の診断剤及び薬剤として知られている。しかし、これらの抗癌剤としての臨床的利用は、分泌抑制作用及び低い経口バイオアベイラビリティにより、制限されている。
本発明らは、ソマトスタチンから誘導したTT-232 [H-D-Phe-c(Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2]のアミノ酸配列を基にしたペプチドを合成して構造活性相関研究を行っている（参照：非特許文献１）。
しかし、報告されたTT-232のアミノ酸配列を基にしたペプチドの構造は、本発明のソマトスタチン由来ペプチド化合物の構造と明らかに異なる。
(Somatostatin)
Somatostatin-14 (SRIF) is a natural cyclic tetradecapeptide that inhibits the secretion of growth hormone, suppresses bioactive hormones such as glucagon, insulin, gastrin and secretin, and also affects the regulation of cell proliferation . These various pharmacological activities are shown through somatostatin 1-5 (SSTR S 1-5), which is widely distributed not only in human tissues including brain, gastrointestinal tract, pancreas, but also in multiple tumor cells. Today, most somatostatin analogs are known as diagnostic agents and drugs for endocrine tumors. However, their clinical use as anticancer agents is limited by their secretion-inhibiting action and low oral bioavailability.
The present inventors synthesized a peptide based on the amino acid sequence of TT-232 [HD-Phe-c (Cys-D-Trp-Lys-Cys) -Thr-NH 2 ] derived from somatostatin, and the structure-activity relationship Research is underway (see Non-Patent Document 1).
However, the structure of the peptide based on the reported amino acid sequence of TT-232 is clearly different from the structure of the somatostatin-derived peptide compound of the present invention.
（DNAポリメラーゼ）
真核生物のDNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ、TdT（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）及Rev1の15種類の分子種が知られている。
これらのDNAポリメラーゼは、細胞の増殖、***、分化等に関与している。例えば、α型はDNA複製、β型、λ型及びTdTは修復及び組換え、δ型及びε型は複製と修復、ζ〜κ型は修復を担っている。
(DNA polymerase)
Eukaryotic DNA synthase (DNA polymerase) has been α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ, σ, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) ) And Rev1 15 molecular species are known.
These DNA polymerases are involved in cell proliferation, division, differentiation and the like. For example, α type is responsible for DNA replication, β type, λ type and TdT are responsible for repair and recombination, δ type and ε type are responsible for replication and repair, and ζ to κ are responsible for repair.
（DNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物）
本発明者らの１人は、DNA複製型のDNAポリメラーゼα,δ,ε阻害剤には、ヒト由来癌細胞増殖抑制活性があることを報告している（参照：非特許文献２）。
また、本発明者らの１人は、DNA修復・組換え型のDNAポリメラーゼλ阻害活性と起炎剤TPAで誘導したマウス耳抗炎症活性やLPSで炎症刺激を与えたマクロファージのTNF-α産生抑制活性には正の相関があることを報告している（参照：非特許文献３）。
特に、DNAポリメラーゼβは、多くの抗癌剤及び外因性アルキル化剤によるDNAの損傷塩基の修復に関与していることが知られている。すなわち、DNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害することができる化合物は、多くの抗癌剤及び外因性アルキル化剤の効果を維持、向上するだけでなく、単独の抗癌剤の有効成分となることもできる。
以上により、DNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物は、癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に期待されている。
(Compound having DNA polymerase inhibitory activity)
One of the present inventors has reported that a DNA replication type DNA polymerase α, δ, ε inhibitor has a human-derived cancer cell growth inhibitory activity (see Non-Patent Document 2).
In addition, one of the inventors of the present invention produced TNF-α from macrophages that had been stimulated with DNA repair / recombinant DNA polymerase λ inhibitory activity and anti-inflammatory activity of mouse ear induced with TPA, and LPS. It has been reported that the inhibitory activity has a positive correlation (see Non-Patent Document 3).
In particular, DNA polymerase β is known to be involved in the repair of damaged bases in DNA by many anticancer agents and exogenous alkylating agents. That is, a compound that can selectively inhibit DNA polymerase β activity can not only maintain and improve the effects of many anticancer agents and exogenous alkylating agents, but can also be an active ingredient of a single anticancer agent.
As described above, compounds having DNA polymerase inhibitory activity are expected for the prevention and treatment of viral diseases such as cancer and AIDS and immune diseases.
（DNAポリメラーゼ阻害剤）
DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害するDNAポリメラーゼ阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制活性を示し、エイズに対してHIV由来逆転写酵素に対する阻害活性を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制活性を示すことが知られている。
DNAポリメラーゼ阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、HIV由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（参照：特許文献１）。
現在、DNAポリメラーゼ阻害剤として、ジデオキシTTP（ddTTP）、Ｎ-メチルマレイミド、ブチルフェニル-dGTPなどが知られている。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもDNA合成酵素阻害作用が見出されている（参照：特許文献１）。
(DNA polymerase inhibitor)
A DNA polymerase inhibitor that inhibits the enzyme activity of DNA polymerase, for example, exhibits cancer cell growth-suppressing activity against cancer, exhibits inhibitory activity against HIV-derived reverse transcriptase against AIDS, and also against immune diseases It is known to exhibit immunosuppressive activity that suppresses the production of specific antibodies against antigens.
It has been reported that glycolipids having DNA polymerase inhibitory activity are useful as anticancer agents, HIV-derived reverse transcriptase inhibitors, and immunosuppressants (see Patent Document 1).
Currently, dideoxy TTP (ddTTP), N-methylmaleimide, butylphenyl-dGTP, and the like are known as DNA polymerase inhibitors. In addition, sulfosynovosyl acylglycerides, which are plant-derived glycolipids, have been found to inhibit DNA synthase (see Patent Document 1).
また、本発明者らの１人は、DNAポリメラーゼ阻害剤を複数開発して報告している（参照：特許文献２〜４）。 In addition, one of the present inventors has developed and reported a plurality of DNA polymerase inhibitors (see: Patent Documents 2 to 4).
しかし、報告されたDNAポリメラーゼ阻害剤の有効成分の構造は、本発明のDNAポリメラーゼ阻害剤の有効成分の構造とは明らかに異なる。 However, the structure of the active ingredient of the reported DNA polymerase inhibitor is clearly different from the structure of the active ingredient of the DNA polymerase inhibitor of the present invention.
本発明は、新規ソマトスタチン由来ペプチド化合物を合成し、さらに該化合物を利用した新たな医薬組成物（DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、アポトーシス誘導剤）を提供することを解決すべき課題とした。 An object of the present invention is to synthesize a novel somatostatin-derived peptide compound and to provide a new pharmaceutical composition (DNA polymerase inhibitor, anticancer agent, apoptosis inducer) using the compound.
本発明者らは、上記課題を解決するために、TT-232のアミノ酸配列を基にした新規ソマトスタチン由来ペプチド化合物を合成した。
さらに、本発明者らは、該化合物の一部がDNAポリメラーゼ阻害活性、癌細胞増殖抑制活性及びアポトーシス誘導作用を有することを確認した。
以上により、本発明を完成した。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors synthesized a novel somatostatin-derived peptide compound based on the amino acid sequence of TT-232.
Furthermore, the present inventors have confirmed that some of the compounds have DNA polymerase inhibitory activity, cancer cell proliferation inhibitory activity, and apoptosis-inducing activity.
Thus, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
７．前記DNAポリメラーゼが、DNAポリメラーゼβである前項６に記載のDNAポリメラーゼ阻害剤。
８．前項２〜５のいずれか１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
９．前記抗癌剤が大腸癌用抗癌剤である前項８に記載の抗癌剤。
１０．前記抗癌剤を、MMS (メタンスルホン酸メチル)と併用投与することを特徴とする前項８又は９に記載の抗癌剤。
１１．前項２〜５のいずれか１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
１２．前記アポトーシス誘導剤を、MMSと併用投与することを特徴とする前項１１に記載のアポトーシス誘導剤。
That is, the present invention is as follows.
1. The compound represented by the following general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
7). 7. The DNA polymerase inhibitor according to item 6 above, wherein the DNA polymerase is DNA polymerase β.
8). 6. An anticancer agent comprising the compound according to any one of items 2 to 5 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
9. 9. The anticancer agent according to 8 above, wherein the anticancer agent is an anticancer agent for colorectal cancer.
10. 10. The anticancer agent according to 8 or 9 above, wherein the anticancer agent is administered in combination with MMS (methyl methanesulfonate).
11. 6. An apoptosis inducer comprising the compound according to any one of items 2 to 5 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
12 12. The apoptosis inducer according to 11 above, wherein the apoptosis inducer is administered in combination with MMS.
本発明の新規ソマトスタチン由来ペプチド化合物の一部がDNAポリメラーゼ阻害活性、癌細胞増殖抑制活性及びアポトーシス誘導作用を有する。 Some of the novel somatostatin-derived peptide compounds of the present invention have DNA polymerase inhibitory activity, cancer cell growth inhibitory activity, and apoptosis-inducing activity.
（本発明の化合物）
本発明の化合物は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
(Compound of the present invention)
The compound of the present invention relates to a compound represented by the following general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
なお、上記Ｚは、以下の（a1）〜（a19）のいずれか１から選択される。 The Z is selected from any one of the following (a1) to (a19).
一般式（Ｉ）で表される化合物において、好ましくは、下記の化合物３〜６である。これらの化合物は、下記実施例で示すように、選択的にDNAポリメラーゼβ活性阻害作用、癌細胞増殖抑制活性及びアポトーシス誘導作用を有する。 In the compound represented by the general formula (I), the following compounds 3 to 6 are preferable. These compounds selectively have a DNA polymerase β activity inhibitory activity, a cancer cell proliferation inhibitory activity, and an apoptosis-inducing activity, as shown in the Examples below.
上記化合物に加えて、下記表に記載の化合物も本発明のソマトスタチン由来ペプチド化合物（以後、「本発明の化合物」、又は「化合物」と称する場合がある）に含まれる。 In addition to the above compounds, the compounds listed in the following table are also included in the somatostatin-derived peptide compounds of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “compounds of the present invention” or “compounds”).
（薬学的に許容し得る塩）
本発明における「その薬学的に許容し得る塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；１級、２級又は３級アミンの塩；４級アンモニウム塩；アミノ酸塩などが挙げられる。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、水等の溶媒和物であってもよい。
(Pharmaceutically acceptable salt)
Examples of the salt of “pharmaceutically acceptable salt thereof” in the present invention include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; ammonium salt; primary, secondary or tertiary amine salt; quaternary ammonium salt; amino acid Examples include salt. The compound represented by the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be a solvate such as water.
（本発明の化合物１〜６、１０〜１５の合成方法）
本発明の化合物１〜６、１０〜１５は、好ましくは、液相合成法により合成する。出発原料して、OBzl基で保護された側鎖であるAsp（化合物１）及びGlu（化合物２）以外は、側鎖の保護基なしのN-Boc基アミノ酸を使用する。
本発明の化合物１〜６の合成に関し、出発原料である保護アミノ酸（参照：表１）は、ジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethylamine：DIPEA）を含むN,N-ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide：DMF）中で、（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（benzotriazol-1-yloxy-tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate：PyBOP）を使用して、1-ナフチルアミン（1-naphthylamine）とカップリング反応を行う。なお、化合物１であるBoc-Asp(OBzl)-OH 及び化合物２であるBoc-Glu(OBzl)-OHのカップリングに関し、それぞれのアミノ酸は、混合酸無水物法によって、1-ナフチルアミンとカップリング反応を行う。
前記カップリング反応で得られた化合物のBoc基を、4M/HCl/dioxaneで除去して、化合物３〜６が得られる。なお、化合物１、２は、さらに脱保護工程を行う。化合物１、２のOBzl基は、数時間（好ましくは、２時間程度）、少量メタノールを含む50%酢酸中でPd-Blackを使用して触媒水素化により脱保護を行い、化合物１、２が得られる。
前記化合物は、RP-HPLCにより精製して、最終化合物として回収する。なお、回収する最終生成物の純度は好ましくは98％以上にする。
なお、本発明の化合物１０〜１５は、上記方法を基にして、合成することが可能である。
(Synthesis method of compounds 1 to 6 and 10 to 15 of the present invention)
Compounds 1 to 6 and 10 to 15 of the present invention are preferably synthesized by a liquid phase synthesis method. Starting from Asp (compound 1) and Glu (compound 2) which are side chains protected with an OBzl group, N-Boc group amino acids without side chain protecting groups are used.
Regarding the synthesis of compounds 1 to 6 of the present invention, the protected amino acid (reference: Table 1) as a starting material is in N, N-dimethylformamide (DMF) containing diisopropylethylamine (DIPEA). Then, a coupling reaction is performed with 1-naphthylamine using (benzotriazol-1-yloxy-tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate: PyBOP). Regarding the coupling of Boc-Asp (OBzl) -OH which is compound 1 and Boc-Glu (OBzl) -OH which is compound 2, each amino acid is coupled with 1-naphthylamine by a mixed acid anhydride method. Perform the reaction.
The Boc group of the compound obtained by the coupling reaction is removed with 4M / HCl / dioxane to obtain compounds 3-6. Compounds 1 and 2 are further subjected to a deprotection step. The OBzl group of compounds 1 and 2 is deprotected by catalytic hydrogenation using Pd-Black in 50% acetic acid containing a small amount of methanol for several hours (preferably about 2 hours). can get.
The compound is purified by RP-HPLC and recovered as the final compound. The purity of the final product to be recovered is preferably 98% or more.
In addition, the compounds 10-15 of this invention are compoundable based on the said method.
（本発明の化合物７〜９、１６〜１９の合成方法）
本発明の化合物７〜９、１６〜１９は、好ましくは、液相合成法により合成する。出発原料して、側鎖の保護基なしの脂肪族アミノ酸を使用する。
本発明の化合物７〜９の合成に関し、それぞれ、3-アミノプロピオン酸、5-アミノ吉草酸及び7-アミノヘプタン酸を出発原料として使用し、次に、混合酸無水物法によって、1-ナフチルアミンとカップリング反応して化合物７〜９を得る。
前記化合物は、RP-HPLCにより精製して、最終化合物として回収する。なお、回収する最終生成物の純度は好ましくは98％以上にする。
なお、本発明の化合物１６〜１９は、上記方法を基にして、合成することが可能である。
(Method for synthesizing compounds 7-9 and 16-19 of the present invention)
Compounds 7 to 9 and 16 to 19 of the present invention are preferably synthesized by a liquid phase synthesis method. The starting material is an aliphatic amino acid without a side chain protecting group.
For the synthesis of compounds 7-9 according to the invention, 3-aminopropionic acid, 5-aminovaleric acid and 7-aminoheptanoic acid are used as starting materials respectively, and then by a mixed acid anhydride method, 1-naphthylamine To give compounds 7-9.
The compound is purified by RP-HPLC and recovered as the final compound. The purity of the final product to be recovered is preferably 98% or more.
In addition, the compounds 16-19 of this invention are compoundable based on the said method.
（本発明の化合物の用途）
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の内、少なくも化合物３〜６は、DNAポリメラーゼ阻害活性、癌細胞増殖抑制活性及びアポトーシス誘導作用を有することから、医薬品への利用が可能である。
例えば、DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、アポトーシス誘導剤、さらには抗炎症剤等の医薬組成物として有用である。
加えて、本発明の化合物は、さらに、医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。
なお、ヒトと他の哺乳類のDNAポリメラーゼの構造は殆ど同じであるため、本発明のDNAポリメラーゼ阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のDNAポリメラーゼ阻害剤としても利用可能である。
(Use of the compound of the present invention)
Among the compounds represented by the general formula (I) of the present invention, at least compounds 3 to 6 have a DNA polymerase inhibitory activity, a cancer cell growth inhibitory activity and an apoptosis-inducing activity, and therefore can be used for pharmaceuticals. is there.
For example, it is useful as a pharmaceutical composition such as a DNA polymerase inhibitor, an anticancer agent, an apoptosis inducer, and an anti-inflammatory agent.
In addition, the compound of the present invention can also be used as a lead compound in the pharmaceutical development process.
Since the DNA polymerase structures of humans and other mammals are almost the same, the DNA polymerase inhibitor of the present invention can also be used as a DNA polymerase inhibitor derived from mammals other than humans.
（本発明の化合物を含む医薬組成物）
本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物（DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、アポトーシス誘導剤、抗炎症剤等）は、単独又は自体公知の担体と共に医薬組成物となし、動物及びヒトに投与することができる。
医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
(Pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention)
A pharmaceutical composition (DNA polymerase inhibitor, anticancer agent, apoptosis inducer, anti-inflammatory agent, etc.) containing the compound of the present invention as an active ingredient is made into a pharmaceutical composition alone or together with a carrier known per se, and is administered to animals and humans. be able to.
The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be appropriately selected as necessary.For example, tablets, capsules, granules, fine granules, powders and other oral preparations, injections, Non-oral preparations such as suppositories are mentioned, and preferred examples include parenteral preparations.
本発明の化合物、特に化合物３〜６を有効成分とする医薬組成物は、下記実施例の結果より、MMSを含むことにより、抗癌剤の効果及び／又はアポトーシス誘導効果を向上させることができる。よって、本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物は、好ましくは、MMSを含む。 The pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention, particularly compounds 3 to 6, as active ingredients, can improve the effect of the anticancer agent and / or the apoptosis-inducing effect by including MMS from the results of the following Examples. Therefore, the pharmaceutical composition containing the compound of the present invention as an active ingredient preferably contains MMS.
非経口剤の医薬組成物の場合には、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として１日あたり1〜200mgの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤は、一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。 In the case of a parenteral pharmaceutical composition, it varies depending on the patient's age, body weight, and severity of the disease, but is usually 1 to 200 mg / day, intravenous drip infusion as the weight of the compound of the present invention in an adult, Subcutaneous injection and intramuscular injection are appropriate. This parenteral preparation is manufactured according to a conventional method, and diluents generally use distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, etc. Can do.
（本発明の化合物を含む食用組成物）
本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、又は抗炎症効果を有する食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
(Edible composition containing the compound of the present invention)
The compound of the present invention can be used for food as well as for pharmaceuticals. For example, it can also be used as an edible composition (for example, a health food) having an anticancer effect, an anticarcinogenic effect, or an anti-inflammatory effect by adding and blending into a food or drink.
（本発明の化合物の特性）
本発明者の一人は、DNAポリメラーゼ阻害活性、抗炎症活性及び抗発癌活性の間には互いに関連性が認められることを確認している。
したがって、本発明の化合物をリードとして、DNAポリメラーゼに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤又は抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングができる。本発明は、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、DNAポリメラーゼに対する阻害活性を調べる方法は自体公知の方法を採用することができる。
(Characteristics of the compound of the present invention)
One of the inventors has confirmed that there is a correlation between DNA polymerase inhibitory activity, anti-inflammatory activity and anti-carcinogenic activity.
Accordingly, by examining the inhibitory activity against DNA polymerase using the compound of the present invention as a lead, it is possible to efficiently screen for candidate compounds for anti-cancer agents or anti-inflammatory agents. The present invention includes such a screening method. In this screening method, a method known per se can be adopted as a method for examining the inhibitory activity against DNA polymerase.
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited at all by these Examples.
（本発明の化合物１〜９の合成）
以下の記載の方法により化合物１〜９を合成した。さらに、合成した化合物３〜６は、下記の実施例２〜６で使用した。詳細は、以下の通りである。
(Synthesis of compounds 1 to 9 of the present invention)
Compounds 1 to 9 were synthesized by the method described below. Furthermore, the synthesized compounds 3 to 6 were used in Examples 2 to 6 below. Details are as follows.
（材料）
化学的に合成したDNA鋳型及びpoly(dA)は、Sigma-Aldrich, Inc.より購入した。Oligo(dT)18DNAプライマーは、Sigma-Aldrich Japan K.Kに特注製造により得た。放射性ヌクレオチドである。[3H]-deoxythylmidine5’-triphosphate（dTTP）（43 Ci/mmol）は、MP Biomedicals LLCより得た。1-ナフチルアミンは、Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.より購入した。アミノ酸は、Watanabe chemical Industries, Ltdより購入した。その他のすべての試薬は、分析用試薬であり、Nacalai Tesque Inc.およびWatanabe chemical Industries, Ltd.より購入した。
RP-HPLCには、Waters 600E を用い、 COSMOSIL 5C18-AR-II(4.6 x 250mm)(分析） 及び5C18-AR-II (20 x 250mm)（分取）を使用した。溶媒移動相は、（Ａ）0.05%TFA in water、（Ｂ）0.05% in acetonitrile、（Ｃ）water及び（Ｄ）acetonitrileを使用した。マス(MS)スペクトルは、Brukermicro TOF-Q with electrospray ionization (ESI-TOF-MS)より得た。1H-NMRスペクトルは、化合物をCDCl3又はDMSO に溶解し、Bruker DPX-400 (400MHz)により得た。シリカゲルは、オープンカラムクロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィー用として、それぞれ、Silica gel 60 (0.063-0.200 mm, 70-230 mesh,Merck)及びKieselgel G 60 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)を使用した。
(material)
Chemically synthesized DNA templates and poly (dA) were purchased from Sigma-Aldrich, Inc. Oligo (dT) 18 DNA primer was obtained by custom manufacturing at Sigma-Aldrich Japan KK. It is a radioactive nucleotide. [ 3 H] -deoxythylmidine 5′-triphosphate (dTTP) (43 Ci / mmol) was obtained from MP Biomedicals LLC. 1-naphthylamine was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Amino acids were purchased from Watanabe chemical Industries, Ltd. All other reagents were analytical reagents and were purchased from Nacalai Tesque Inc. and Watanabe chemical Industries, Ltd.
For RP-HPLC, Waters 600E was used, and COSMOSIL 5C 18 -AR-II (4.6 × 250 mm) (analysis) and 5C 18 -AR-II (20 × 250 mm) (preparation) were used. As the solvent mobile phase, (A) 0.05% TFA in water, (B) 0.05% in acetonitrile, (C) water and (D) acetonitrile were used. Mass (MS) spectra were obtained from Brukermicro TOF-Q with electrospray ionization (ESI-TOF-MS). 1 H-NMR spectrum was obtained by Bruker DPX-400 (400 MHz) by dissolving the compound in CDCl 3 or DMSO 3 . Silica gel used was Silica gel 60 (0.063-0.200 mm, 70-230 mesh, Merck) and Kieselgel G 60 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) for open column chromatography and thin layer chromatography, respectively.
（化合物１〜６の製造）
DMF (50 mL)中のBoc-Tyr-OH(720 mg, 2.60 mmol) 及び H-[Asp(OBzl),Glu(OBzl),Phe,IIe,Leu又はVal]-1-naphthylamide ｛Boc-[ Asp(OBzl),Glu(OBzl),Phe,IIe,Leu又はVal]-1-naphthylamide (1.00 g, 2.60 mmol) 及び4 M/HCl/dioxane(6.40 mL, 25.6 mmol)から調製した｝をPyBOP (1.47 g, 2.80 mmol)及びDIPEA (2.68 mL, 15.3 mmol)により室温、一晩、カップリングさせた。溶媒を除去した後に、残留物を酢酸エチルで抽出し、さらに10%クエン酸、5%NaHCO3及び水で洗浄して、Na2SO4で乾燥させた。乾燥後、ろ過によりNa2SO4を除去し、ろ液を濃縮させて固形物を得た。
さらに、化合物１及び２に関しては、少量の水を含むメタノール（20mL）中の各固形物に、少量のPd-blackを添加し、続いてH2ガスを２時間通じた。ろ過により、触媒を除去し、ろ液を濃縮させて固形物を得た。
前記化合物１〜６の固形物は、溶媒移動相である（Ａ）：（Ｂ）を５分間90：10で保持し、次に、40分間で10：90に移行するグラジエントプログラムでHPLCにて分析した。
化合物１及び２は、（Ｃ）:（Ｄ）を５分間で70：30から40:60に移行し、次に10分間で10：90に移行するグラジエントプログラムでHPLCによる分取精製を行い、最終生成物である化合物１及び２を得た。化合物３〜６は、（Ｃ）:（Ｄ）を５分間で70：30から50:50に移行し、次に15分間で20：80に移行するグラジエントプログラムでHPLCによる分取精製を行い、最終生成物である化合物３〜６を得た。
(Production of compounds 1 to 6)
Boc-Tyr-OH (720 mg, 2.60 mmol) and H- [Asp (OBzl), Glu (OBzl), Phe, IIe, Leu or Val] -1-naphthylamide {Boc- [Asp in DMF (50 mL) (OBzl), Glu (OBzl), Phe, IIe, Leu or Val] -1-naphthylamide (1.00 g, 2.60 mmol) and 4 M / HCl / dioxane (6.40 mL, 25.6 mmol)} were prepared from PyBOP (1.47 g, 2.80 mmol) and DIPEA (2.68 mL, 15.3 mmol) and coupled overnight at room temperature. After removal of the solvent, the residue was extracted with ethyl acetate, further washed with 10% citric acid, 5% NaHCO 3 and water and dried over Na 2 SO 4 . After drying, Na 2 SO 4 was removed by filtration, and the filtrate was concentrated to obtain a solid.
In addition, for compounds 1 and 2, a small amount of Pd-black was added to each solid in methanol (20 mL) with a small amount of water, followed by H 2 gas for 2 hours. The catalyst was removed by filtration, and the filtrate was concentrated to obtain a solid.
The solids of the above compounds 1 to 6 are (A) :( B), which is a solvent mobile phase, held at 90:10 for 5 minutes, and then by HPLC with a gradient program that moves to 10:90 in 40 minutes. analyzed.
Compounds 1 and 2 were preparatively purified by HPLC with a gradient program in which (C) :( D) was transferred from 70:30 to 40:60 in 5 minutes and then 10:90 in 10 minutes. The final products, compounds 1 and 2, were obtained. Compounds 3 to 6 were subjected to preparative purification by HPLC with a gradient program in which (C) :( D) was transferred from 70:30 to 50:50 in 5 minutes and then transferred to 20:80 in 15 minutes. Compounds 3 to 6 as final products were obtained.
（化合物１の合成の確認）
上記化合物１は、ヘキサンで沈殿させて白色固体（40.0％）として得た。
化合物１の物性は、以下の通りである。
mp125-129oC, Rf 0.46 (CHCl3:MeOH:H2O= 8:3:1), RT 34.0 min,ESI-MS m/zcalcd [M+H]+ :522.22, found 522.22. Anal. Calcd for C28H31N3O7・0.3H2O・2.5MeOH: C, 60.83; H, 6.88; N, 7.53. Found:C, 60.85; H, 7.05; N, 7.51. 1H NMR (CDCl3) δ10.21 (s, 1H), 9.19 (br, 1H), 8.43 (br,1H), 8.1 0(br, 1H), 7.93 (t, J = 4.7Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H),7.66 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.54-7.47(m, 3H), 7.05 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.83(d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.86 (br, 1H), 4.13 (br,1H), 2.91 (br, 1H), 2.67 (br, 2H), 1.27 (s, 9H).
本発明者らは、上記物性により、化合物１が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 1)
Compound 1 was obtained as a white solid (40.0%) by precipitation with hexane.
The physical properties of Compound 1 are as follows.
mp125-129 o C, R f 0.46 (CHCl 3 : MeOH: H 2 O = 8: 3: 1), R T 34.0 min, ESI-MS m / zcalcd [M + H] + : 522.22, found 522.22. Anal Calcd for C 28 H 31 N 3 O 7・ 0.3H 2 O ・ 2.5MeOH: C, 60.83; H, 6.88; N, 7.53. Found: C, 60.85; H, 7.05; N, 7.51.1. 1 H NMR ( CDCl 3 ) δ 10.21 (s, 1H), 9.19 (br, 1H), 8.43 (br, 1H), 8.1 0 (br, 1H), 7.93 (t, J = 4.7Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.54-7.47 (m, 3H), 7.05 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.86 (br, 1H), 4.13 (br, 1H), 2.91 (br, 1H), 2.67 (br, 2H), 1.27 (s, 9H).
The present inventors have confirmed that compound 1 can be synthesized based on the above physical properties.
（化合物２の合成の確認）
上記化合物２は、ヘキサンで沈殿させて白色固体（45.7％）として得た。
化合物２の物性は、以下の通りである。
mp117-120°C, Rf 0.51 (CHCl3:MeOH:H2O = 8:3:1), RT 33.7 min, ESI-MS m/z calcd[M+H]+ :536.23, found 536.27. Anal. Calcd for C29H33N3O7・0.9H2O: C, 63.12; H, 6.36; N,7.62. Found: C, 63.00; H, 6.26; N, 7.65. 1H NMR (CDCl3) δ10.05 (s, 1H), 9.19 (br, 1H),8.23 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.05 (br,1H), 7.94 (td, J = 1.9 and 5.9 Hz,1H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.65(d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.57-7.48 (m,3H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95(d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.65 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 2.91 (dd,J = 4.0 and 14 Hz, 1H), 2.67 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H), 2.42-2.31 (br,2H), 2.14 (br, 1H), 2.10 (br, 1H), 1.27 (s, 9H).
本発明者らは、上記物性により、化合物２が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 2)
Compound 2 was obtained as a white solid (45.7%) by precipitation with hexane.
The physical properties of Compound 2 are as follows.
mp117-120 ° C, R f 0.51 (CHCl 3 : MeOH: H 2 O = 8: 3: 1), R T 33.7 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 536.23, found 536.27. Anal.Calcd for C 29 H 33 N 3 O 7・ 0.9H 2 O: C, 63.12; H, 6.36; N, 7.62. Found: C, 63.00; H, 6.26; N, 7.65. 1 H NMR (CDCl 3 ) δ10.05 (s, 1H), 9.19 (br, 1H), 8.23 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.05 (br, 1H), 7.94 (td, J = 1.9 and 5.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.57-7.48 (m, 3H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.65 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 2.91 (dd, J = 4.0 and 14 Hz, 1H ), 2.67 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H), 2.42-2.31 (br, 2H), 2.14 (br, 1H), 2.10 (br, 1H), 1.27 (s, 9H).
The present inventors have confirmed that compound 2 can be synthesized based on the above physical properties.
（化合物３の合成の確認）
上記化合物３は、ヘキサン及び少量のエーテルで沈殿させて白色固体（60.0％）として得た。
化合物３の物性は、以下の通りである。
mp207-210°C, Rf 0.44 (CHCl3:MeOH:AcOH = 90:8:2), RT 40.3 min, ESI-MS m/z calcd[M+H]+ :554.26, found 554.29. Anal. Calcd for C33H35N3O5・0.1H2O: C, 71.35; H, 6.39; N,7.57. Found: C, 71.30; H, 6.37; N, 7.64. 1H NMR (CDCl3) δ 10.04 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.25(d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.76 (t-like, 2H),7.54-7.45 (m, 4H), 7.37-7.21 (m, 5H), 7.00 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.88 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.3 Hz,2H), 4.93 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.12(m, 1H), 3.16 (dd, J = 6.7 and 13 Hz,1H), 3.07 (dd, J = 7.9 and 14 Hz,1H), 2.81 (dd, J = 4.1 and 14 Hz,1H), 2.62 (dd, J = 10 and 13 Hz, 1H),1.29 (s, 9H).
本発明者らは、上記物性により、化合物３が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 3)
Compound 3 was obtained as a white solid (60.0%) by precipitation with hexane and a small amount of ether.
The physical properties of Compound 3 are as follows.
mp207-210 ° C, R f 0.44 (CHCl 3 : MeOH: AcOH = 90: 8: 2), R T 40.3 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 554.26, found 554.29. Calcd for C 33 H 35 N 3 O 5・ 0.1H 2 O: C, 71.35; H, 6.39; N, 7.57. Found: C, 71.30; H, 6.37; N, 7.64. 1 H NMR (CDCl 3 ) δ 10.04 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.25 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.76 (t-like, 2H), 7.54-7.45 (m, 4H), 7.37-7.21 (m, 5H), 7.00 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.3 Hz, 2H) , 4.93 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.16 (dd, J = 6.7 and 13 Hz, 1H), 3.07 (dd, J = 7.9 and 14 Hz, 1H), 2.81 ( dd, J = 4.1 and 14 Hz, 1H), 2.62 (dd, J = 10 and 13 Hz, 1H), 1.29 (s, 9H).
The present inventors confirmed that compound 3 could be synthesized based on the above physical properties.
（化合物４の合成の確認）
上記化合物４は、エーテルで沈殿させて白色固体（89.0％）として得た。
化合物４の物性は、以下の通りである。
mp197-200°C, Rf 0.48 (CHCl3:MeOH:AcOH= 90:8:2), RT 39.7 min,ESI-MS m/z calcd [M+H]+ :520.27,found 519.90. Anal. Calcd for C30H37N3O5・1.2H2O:C, 66.57; H, 7.34; N, 7.77. Found: C, 66.44; H, 7.29; N, 7.76. 1HNMR (CDCl3) δ 10.12 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.06 (br,1H), 8.00 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.94(td, J = 1.5 and 5.0 Hz, 1H), 7.79(d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.57-7.49 (m, 3H), 7.38(d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.19 (m, 1H), 2.90 (dd,J = 4.0 and 7.2 Hz, 1H), 2.69 (dd, J = 6.9 and 10 Hz, 1H), 1.92 (br, 1H),1.61 (br, 1H), 1.32-1.27 (m, 10H), 1.02 (d, J= 6.7 Hz, 3H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz,3H).
本発明者らは、上記物性により、化合物４が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 4)
Compound 4 was obtained as a white solid (89.0%) by precipitation with ether.
The physical properties of Compound 4 are as follows.
mp197-200 ° C, R f 0.48 (CHCl 3 : MeOH: AcOH = 90: 8: 2), R T 39.7 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 520.27, found 519.90. Calcd for C 30 H 37 N 3 O 5・ 1.2H 2 O: C, 66.57; H, 7.34; N, 7.77. Found: C, 66.44; H, 7.29; N, 7.76. 1 HNMR (CDCl 3 ) δ 10.12 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.06 (br, 1H), 8.00 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.94 (td, J = 1.5 and 5.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.57-7.49 (m, 3H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.19 (m, 1H), 2.90 (dd, J = 4.0 and 7.2 Hz, 1H), 2.69 ( dd, J = 6.9 and 10 Hz, 1H), 1.92 (br, 1H), 1.61 (br, 1H), 1.32-1.27 (m, 10H), 1.02 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.91 (t , J = 7.2 Hz, 3H).
The present inventors confirmed that compound 4 could be synthesized based on the above physical properties.
（化合物５の合成の確認）
上記化合物５は、エーテルで沈殿させて白色固体（53.4％）として得た。
化合物５の物性は、以下の通りである。
mp205-209°C, Rf 0.37 (CHCl3:MeOH:AcOH= 90:8:2), RT 40.4 min,ESI-MS m/z calcd [M+H]+ :520.27,found 520.31. Anal. Calcd for C30H37N3O5・0.4H2O:C, 68.39; H, 7.23; N, 7.98. Found: C, 68.27; H, 7.28; N, 8.11. 1HNMR (CDCl3) δ 10.03 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.03 (t-like, 1H), 7.94(td, J = 1.7 and 4.3 Hz, 1H), 7.79(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61-7.48 (m,4H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92(d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.68 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 2.89 (dd,J = 4.0 and 14 Hz, 1H), 2.67 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H), 1.78-1.68 (m,3H), 1.31 (s, 9H), 0.99 (d, J = 6.3Hz, 2H), 0.95 (d, J = 6.2 Hz, 2H).
本発明者らは、上記物性により、化合物５が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 5)
Compound 5 was precipitated with ether to give a white solid (53.4%).
The physical properties of Compound 5 are as follows.
mp205-209 ° C, R f 0.37 (CHCl 3 : MeOH: AcOH = 90: 8: 2), R T 40.4 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 520.27, found 520.31. Calcd for C 30 H 37 N 3 O 5・ 0.4H 2 O: C, 68.39; H, 7.23; N, 7.98. Found: C, 68.27; H, 7.28; N, 8.11. 1 HNMR (CDCl 3 ) δ 10.03 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.03 (t-like, 1H), 7.94 (td, J = 1.7 and 4.3 Hz, 1H), 7.79 ( d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61-7.48 (m, 4H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.68 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 2.89 (dd, J = 4.0 and 14 Hz, 1H), 2.67 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H ), 1.78-1.68 (m, 3H), 1.31 (s, 9H), 0.99 (d, J = 6.3Hz, 2H), 0.95 (d, J = 6.2 Hz, 2H).
The present inventors confirmed that compound 5 could be synthesized based on the above physical properties.
（化合物６の合成の確認）
上記化合物６は、エーテルで沈殿させて白色固体（66.7％）として得た。
化合物６の物性は、以下の通りである。
mp197-200°C, Rf 0.38 (CHCl3:MeOH:AcOH= 90:8:2), RT 38.1 min,ESI-MS m/z calcd [M+H]+ : 506.26,found 506.26. Anal. Calcd for C29H35N3O5・0.5H2O:C, 67.69; H, 7.05; N, 8.17. Found: C, 67.85; H, 7.05; N, 8.29. 1HNMR (CDCl3) d 10.11 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.06 (br,1H), 7.97-7.93 (m, 2H), 7.79 (d, J =8.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.1 Hz,1H), 7.58-7.49 (m, 3H), 7.07 (d, J =8.4 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz,1H), 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.59(t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.20 (m, 1H),2.91 (dd, J = 4.0 and 14 Hz, 1H),2.69 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H),2.21-2.12(m, 1H), 1.32 (s, 9H),1.04 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.00 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
本発明者らは、上記物性により、化合物６が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 6)
Compound 6 was obtained as a white solid (66.7%) by precipitation with ether.
The physical properties of Compound 6 are as follows.
mp197-200 ° C, R f 0.38 (CHCl 3 : MeOH: AcOH = 90: 8: 2), R T 38.1 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 506.26, found 506.26. Calcd for C 29 H 35 N 3 O 5・ 0.5H 2 O: C, 67.69; H, 7.05; N, 8.17.Found: C, 67.85; H, 7.05; N, 8.29. 1 HNMR (CDCl 3 ) d 10.11 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.06 (br, 1H), 7.97-7.93 (m, 2H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.58-7.49 (m, 3H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.59 ( t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.20 (m, 1H), 2.91 (dd, J = 4.0 and 14 Hz, 1H), 2.69 (dd, J = 10 and 14 Hz, 1H), 2.21-2.12 (m , 1H), 1.32 (s, 9H), 1.04 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.00 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
The present inventors have confirmed that compound 6 can be synthesized based on the above physical properties.
（化合物７〜９の製造）
テトラヒドロフラン（THF）(30 mL)中のBoc-NH-(CH2)n-OH (n = 2, 4 又は6) (4.10 mmol)に、トリエチルアミン（TEA）(0.70 mL, 5.00 mmol)及びクロロギ酸イソブチル(0.60 mL, 4.50 mmol)を添加して、15分間、−15℃で撹拌した。撹拌後の溶液に、1-ナフチルアミン(0.60 g, 4.10 mmol) を含むDMF ｛40 mL：TEA (0.70 mL, 5.00 mmol)を含む｝を添加し、室温で一晩撹拌した。溶媒を除去した後に、残留物を酢酸エチルで抽出し、さらに10%クエン酸、5% NaHCO3及び水で洗浄して、Na2SO4で乾燥させた。乾燥後に、ろ過によりNa2SO4を除去し、ろ液を濃縮させて固形物を得た。各固形物は、エーテルで沈殿させて結晶を得た。
前記化合物７〜９の固形物は、溶媒移動相である（Ａ）：（Ｂ）を５分間90：10で保持し、次に、40分間で10：90に移行するグラジエントプログラムでHPLCにて分析した。化合物７〜９は、（Ｃ）:（Ｄ）を５分間で70：30から40:60に移行し、次に10分間で30：70に移行するグラジエントプログラムでHPLCによる分取精製を行い、最終生成物である化合物７〜９を得た。
(Production of compounds 7 to 9)
Boc-NH- (CH 2 ) n -OH (n = 2, 4 or 6) (4.10 mmol) in tetrahydrofuran (THF) (30 mL) was added to triethylamine (TEA) (0.70 mL, 5.00 mmol) and chloroformate Isobutyl (0.60 mL, 4.50 mmol) was added and stirred for 15 minutes at −15 ° C. To the solution after stirring, DMF {40 mL: containing TEA (0.70 mL, 5.00 mmol)} containing 1-naphthylamine (0.60 g, 4.10 mmol) was added and stirred overnight at room temperature. After removing the solvent, the residue was extracted with ethyl acetate, further washed with 10% citric acid, 5% NaHCO 3 and water and dried over Na 2 SO 4 . After drying, Na 2 SO 4 was removed by filtration, and the filtrate was concentrated to obtain a solid. Each solid was precipitated with ether to obtain crystals.
The solids of the compounds 7 to 9 are (A) :( B), which is a solvent mobile phase, held at 90:10 for 5 minutes, and then by HPLC with a gradient program that moves to 10:90 in 40 minutes. analyzed. Compounds 7-9 were subjected to preparative purification by HPLC with a gradient program in which (C) :( D) was transferred from 70:30 to 40:60 in 5 minutes and then transferred to 30:70 in 10 minutes. The final products, compounds 7-9, were obtained.
（化合物７の合成の確認）
上記化合物７は白色固体（61.5％）として得られた。
化合物７の物性は、以下の通りである。
mp125-130°C, Rf 0.49 (AcOEt:hexane = 1:1), RT 35.1 min, ESI-MS m/z calcd [M+H]+ :315.16, found 315.19. Anal. Calcd for C18H22N2O3:C, 68.77; H, 7.05; N, 8.91. Found: C, 68.52; H, 7.24; N, 8.85. 1HNMR (CDCl3) δ 7.93 (br, 1H), 7.86-7.82 (m, 3H), 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51-7.41 (m, 3H), 5.23 (br, 1H), 3.54 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H).
本発明者らは、上記物性により、化合物７が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 7)
Compound 7 was obtained as a white solid (61.5%).
The physical properties of Compound 7 are as follows.
mp125-130 ° C, R f 0.49 (AcOEt: hexane = 1: 1), R T 35.1 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 315.16, found 315.19. Anal. Calcd for C 18 H 22 N 2 O 3 : C, 68.77; H, 7.05; N, 8.91.Found: C, 68.52; H, 7.24; N, 8.85. 1 HNMR (CDCl 3 ) δ 7.93 (br, 1H), 7.86-7.82 ( m, 3H), 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51-7.41 (m, 3H), 5.23 (br, 1H), 3.54 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H).
The present inventors confirmed that compound 7 could be synthesized based on the above physical properties.
（化合物８の合成の確認）
上記化合物８は白色固体（63.8％）として得られた。
化合物８の物性は、以下の通りである。
mp122-127°C, Rf 0.38 (AcOEt:hexane = 1:1), RT 37.7 min, ESI-MS m/z calcd [M+H]+ :343.19,found 343.42. Anal. Calcd for C20H26N2O3:C, 70.15; H, 7.65; N, 8.18. Found: C, 70.07; H, 7.70; N, 8.19.1H NMR(CDCl3) δ 7.96 (br, 1H), 7.90-7.84 (m, 3H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50-7.42 (m, 3H), 4.70 (br, 1H), 3.19 (br-q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.85-1.77 (m, 2H),1.62-1.55 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
本発明者らは、上記物性により、化合物８が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 8)
Compound 8 was obtained as a white solid (63.8%).
The physical properties of Compound 8 are as follows.
mp122-127 ° C, R f 0.38 (AcOEt: hexane = 1: 1), R T 37.7 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 343.19, found 343.42. Anal. Calcd for C 20 H 26 N 2 O 3 : C, 70.15; H, 7.65; N, 8.18.Found: C, 70.07; H, 7.70; N, 8.19. 1 H NMR (CDCl 3 ) δ 7.96 (br, 1H), 7.90-7.84 (m, 3H), 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50-7.42 (m, 3H), 4.70 (br, 1H), 3.19 (br-q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.52 ( t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.85-1.77 (m, 2H), 1.62-1.55 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
The present inventors confirmed that compound 8 could be synthesized based on the above physical properties.
（化合物９の合成の確認）
上記化合物９は白色固体（82.4％）として得られた。
化合物９の物性は、以下の通りである。
mp89-94°C, Rf 0.60 (AcOEt:hexane = 1:1), RT 40.4 min, ESI-MS m/z calcd [M+H]+ :371.23,found 371.13. Anal. Calcd for C22H30N2O3:C, 71.32; H, 8.16; N, 7.56. Found: C, 71.56; H, 8.23; N, 7.61.1H NMR(CDCl3) δ 7.88-7.84 (m, 3H), 7.80 (br, 1H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50-7.43 (m, 3H), 4.54 (br, 1H), 3.11 (br-q, J = 5.4 Hz, 2H), 2.48 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.80-1.74 (m, 2H),1.62-1.55 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.44-1.35 (m, 6H).
本発明者らは、上記物性により、化合物９が合成できていることを確認した。
(Confirmation of synthesis of compound 9)
Compound 9 was obtained as a white solid (82.4%).
The physical properties of Compound 9 are as follows.
mp89-94 ° C, R f 0.60 (AcOEt: hexane = 1: 1), R T 40.4 min, ESI-MS m / z calcd [M + H] + : 371.23, found 371.13. Anal. Calcd for C 22 H 30 N 2 O 3:. C , 71.32; H, 8.16; N, 7.56 Found:. C, 71.56; H, 8.23; N, 7.61 1 H NMR (CDCl 3) δ 7.88-7.84 (m, 3H), 7.80 (br, 1H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50-7.43 (m, 3H), 4.54 (br, 1H), 3.11 (br-q, J = 5.4 Hz, 2H), 2.48 ( t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.80-1.74 (m, 2H), 1.62-1.55 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.44-1.35 (m, 6H).
The inventors of the present invention confirmed that compound 9 was synthesized based on the above physical properties.
（本発明の化合物３〜６のDNAポリメラーゼアッセイ）
本発明の化合物３〜６が、DNAポリメラーゼ活性を選択的に阻害するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
(DNA polymerase assay of compounds 3-6 of the present invention)
It was confirmed whether the compounds 3 to 6 of the present invention selectively inhibit the DNA polymerase activity. Details are as follows.
哺乳類由来の高活性を有するDNAポリメラーゼは、文献「J. Nat. Prod. 75 (2012) p135-141」に記載の方法に準じて精製した。DNAポリメラーゼα、βに対する標準DNAポリメラーゼ基質溶液は、文献「Biochim. Biophys. Acta 1308(1996) p256-262」及び「Biochim.Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521」に記載の方法に準じて作製した。DNAポリメラーゼκは、DNAポリメラーゼαと同じ方法により作製した。
DNAポリメラーゼ反応に関し、活性化DNA（例えば、ウシデオキシリボヌクレアーゼI処理済仔ウシ胸腺DNA）及び４つのdNTPs（[3H]-dTTPを含む）は、それぞれ、DNA鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質に使用した。
化合物３〜６は、それぞれ、DMSOで溶解し、そして、30秒間超音波処理した。超音波処理後の4 μLサンプルを、pH7.5の50 mM Tris-HCl｛1 mMジチオスレイトール、50%グリセロール（by vol）及び1 mM EDTAを含む｝中の各酵素（0.05units）16μLと混合し、0℃、10分間保存した。そして、各化合物を含む溶液8 μLをDNAポリメラーゼ酵素液16μLと混合し、37℃、60分間保温した。そして、本混合液（各化合物-酵素液）の各8 μL量を、DNAポリメラーゼ酵素液16μLと混合し、37℃、60分間保温した。阻害物質を含まない活性を100％に設定し、各阻害物質濃度による相対的な活性を測定した。DNAポリメラーゼ活性の１単位は、37℃、60分間及び通常の反応条件下｛参照文献：Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262、Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521｝において、1 nmol dNTP（特に、dTTP）が合成DNA鋳型プライマーに触媒作用により取り込まれる酵素の量として設定した。
A DNA polymerase having high activity derived from a mammal was purified according to the method described in the literature “J. Nat. Prod. 75 (2012) p135-141”. The standard DNA polymerase substrate solution for DNA polymerase α, β is in accordance with the method described in the literature “Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262” and “Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521”. Produced. DNA polymerase κ was prepared by the same method as DNA polymerase α.
For the DNA polymerase reaction, activated DNA (eg, bovine deoxyribonuclease I-treated calf thymus DNA) and four dNTPs (including [ 3 H] -dTTP) were used for the DNA template primer substrate and nucleotide substrate, respectively. .
Compounds 3-6 were each dissolved in DMSO and sonicated for 30 seconds. After sonication, 4 μL samples were added with 16 μL of each enzyme (0.05 units) in 50 mM Tris-HCl (containing 1 mM dithiothreitol, 50% glycerol (by vol) and 1 mM EDTA) at pH 7.5. Mix and store at 0 ° C. for 10 minutes. Then, 8 μL of the solution containing each compound was mixed with 16 μL of the DNA polymerase enzyme solution and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Then, 8 μL each of this mixture (each compound-enzyme solution) was mixed with 16 μL of DNA polymerase enzyme solution and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. The activity without inhibitor was set to 100%, and the relative activity with each inhibitor concentration was measured. One unit of DNA polymerase activity is at 37 ° C. for 60 minutes and under normal reaction conditions {Reference: Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262, Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521}. 1 nmol dNTP (particularly dTTP) was set as the amount of enzyme incorporated into the synthetic DNA template primer by catalysis.
（本発明の化合物３〜６のDNAポリメラーゼアッセイの結果）
本発明の化合物３〜６のDNAポリメラーゼアッセイの結果を図１に示す。
図１から明らかなように、化合物３〜６は、DNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害することを確認した。また、化合物４は、化合物１〜９のすべての化合物の中で最もDNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害した（化合物１、２、７〜９のデータは示していない）。また、DNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害する効果の順は、化合物４、化合物３、化合物５及び化合物６となった。
加えて、化合物３〜６は、チロシン及び疎水性アミノ酸を含むことにより、DNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害することができると考えられる。よって、チロシン及び疎水性アミノ酸を含む本発明の化合物も同様な効果を有すると考えられる。
なお、活性化DNA（ウシデオキシリボヌクレアーゼI処理済仔ウシ胸腺DNA）を、合成DNA [poly(dA)/oligo(dT)18(A/T = 2/1)]の代わりに、DNA鋳型プライマー基質として使用し、及びdNTPを、dTTPの代わりに核酸基質として使用しても、各化合物のDNAポリメラーゼβ活性の阻害効果に変化はなかった（データは記載していない）。
以上により、化合物３〜６を有効成分とする医薬組成物は、DNAポリメラーゼβ活性阻害剤とすることができる。
(Results of DNA polymerase assay of compounds 3 to 6 of the present invention)
The results of DNA polymerase assay of compounds 3-6 of the present invention are shown in FIG.
As is clear from FIG. 1, it was confirmed that the compounds 3 to 6 selectively inhibit the DNA polymerase β activity. Compound 4 selectively inhibited DNA polymerase β activity most among all compounds 1 to 9 (data for compounds 1, 2, and 7-9 are not shown). Further, the order of the effect of selectively inhibiting the DNA polymerase β activity was Compound 4, Compound 3, Compound 5 and Compound 6.
In addition, it is believed that compounds 3-6 can selectively inhibit DNA polymerase β activity by including tyrosine and hydrophobic amino acids. Therefore, the compound of the present invention containing tyrosine and a hydrophobic amino acid is considered to have the same effect.
Activated DNA (bovine deoxyribonuclease I-treated calf thymus DNA) was replaced with synthetic DNA [poly (dA) / oligo (dT) 18 (A / T = 2/1)] as a DNA template primer substrate. And using dNTP as a nucleic acid substrate instead of dTTP did not change the inhibitory effect of each compound on DNA polymerase β activity (data not shown).
By the above, the pharmaceutical composition which uses compound 3-6 as an active ingredient can be used as a DNA polymerase (beta) activity inhibitor.
（本発明の化合物４のDNAポリメラーゼアッセイ及びDNAポリメラーゼβ活性の阻害機構の確認）
上記実施例２で優れた選択的DNAポリメラーゼβ活性の阻害効果を有する化合物４がDNAポリメラーゼβを含む11種類のDNAポリメラーゼの活性を阻害するかどうかを確認した。さらに、化合物４の優れた選択的DNAポリメラーゼβ活性の阻害効機構を確認した。詳細は、以下の通りである。
(Confirmation of inhibition mechanism of DNA polymerase β activity and DNA polymerase β activity of compound 4 of the present invention)
Whether or not Compound 4 having an excellent inhibitory effect on selective DNA polymerase β activity in Example 2 inhibits the activity of 11 types of DNA polymerases including DNA polymerase β was confirmed. Furthermore, the excellent inhibitory mechanism of selective DNA polymerase β activity of Compound 4 was confirmed. Details are as follows.
（本発明の化合物４のDNAポリメラーゼアッセイ）
哺乳類のポリメラーゼ分子種は15種類が存在しており、アミノ酸配列の相同性や機能の類似性からA-, B-, X-,Y-の４つのファミリーに分類されている。各ポリメラーゼファミリーを代表して、哺乳類由来のDNAポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ι、κ、λ、μ、TdT、について試験を行った。
DNAポリメラーゼαは、仔牛の胸腺から常法により抽出し、抗体カラムで精製した標品を使用した。DNAポリメラーゼβは、ラット由来の該当遺伝子を、DNAポリメラーゼγ、η、κ、μ、λは、ヒト由来の該当遺伝子を、DNAポリメラーゼιは、マウス由来の該当遺伝子を、それぞれ通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を使用した。DNAポリメラーゼδ、εは、ヒト癌細胞抽出液から抗体カラムを使用して精製した標品を使用した。TdTは仔牛由来の該当遺伝子を、通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた試薬（製品コード：2230A）をタカラバイオ（株）から購入して使用した。
これらのDNAポリメラーゼに対する化合物４の阻害活性の測定には、一般的なDNAポリメラーゼ反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸IV、東京化学同人、63〜66頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した[3H]-TTPを含む系においてDNA合成反応を行い、鋳型DNA[poly(dA)/oligo(dT)18]へ重合された放射比活性を生成物（合成DNA鎖）量の指標とするものである。
阻害率は、(a)コントロールでの合成DNA量、(b)被検物質存在下での合成DNA量について、
b / a × 100 = DNAポリメラーゼ残存活性（％）
として評価した。なお、得られたデータは３回の測定値の平均値である。
(DNA polymerase assay of compound 4 of the present invention)
There are 15 types of mammalian polymerase molecules, and they are classified into four families, A-, B-, X-, and Y-, based on their amino acid sequence homology and functional similarity. On behalf of each polymerase family, DNA polymerases α, β, γ, δ, ε, η, ι, κ, λ, μ, and TdT derived from mammals were tested.
DNA polymerase α was extracted from calf thymus by a conventional method and purified using an antibody column. DNA polymerase β is the relevant gene from rat, DNA polymerase γ, η, κ, μ, λ is the relevant gene from human, and DNA polymerase ι is the relevant gene from mouse. The preparations incorporated into Escherichia coli and produced were used. As DNA polymerases δ and ε, preparations purified from human cancer cell extracts using an antibody column were used. TdT used a calf-derived reagent (product code: 2230A) purchased from Takara Bio Co., Ltd. by incorporating it into Escherichia coli by a conventional genetic recombination method.
For the measurement of the inhibitory activity of compound 4 against these DNA polymerases, a general DNA polymerase reaction system (edited by the Japanese Biochemical Society, Shinsei Kagaku Koza 2, Nucleic Acid IV, Tokyo Kagaku Dojin, pages 63-66) was used. In other words, a DNA synthesis reaction is carried out in a system containing [ 3 H] -TTP labeled with a radioisotope, and the specific activity of the radioactivity polymerized into the template DNA [poly (dA) / oligo (dT) 18 ] is obtained as a product (synthesis DNA strand) is an index of the amount.
The inhibition rate is (a) the amount of synthetic DNA in the control, and (b) the amount of synthetic DNA in the presence of the test substance.
b / a x 100 = DNA polymerase residual activity (%)
As evaluated. The obtained data is an average value of three measurements.
（本発明の化合物４のDNAポリメラーゼアッセイの結果）
本発明の化合物４のDNAポリメラーゼアッセイの結果を図２に示す。
図２から明らかなように、化合物４は、DNAポリメラーゼβ活性のみを選択的に阻害することを確認した。さらに、化合物４は、DNAポリメラーゼβと同じくXファミリーに属し、相同性が高くかつ３次構造が同様なλ、μ及びTdTのポリメラーゼ活性を阻害しなかった。
(Results of DNA polymerase assay of compound 4 of the present invention)
The results of the DNA polymerase assay of compound 4 of the present invention are shown in FIG.
As is clear from FIG. 2, it was confirmed that Compound 4 selectively inhibits only DNA polymerase β activity. Furthermore, Compound 4 belongs to the X family, like DNA polymerase β, and did not inhibit the polymerase activity of λ, μ and TdT, which have high homology and the same tertiary structure.
（本発明の化合物４のDNAポリメラーゼβ活性の阻害機構の確認）
化合物４によるDNAポリメラーゼβ活性の阻害機構がDNA結合によるものであるかポリメラーゼβ結合によるものであるかを解明するために、化合物４の存在下又は存在しない条件下でのDNAの温度遷移を測定した。dsDNAと化合物４の相互作用は、熱電気セルホルダーを備えた分光光度計を使用して、過剰の100μMの該化合物の存在下でのdsDNAの融解温度を測定することにより調べた。温度遷移の変更は、該化合物の濃度範囲では確認できなかった。一方、ポジティブコントロールである典型的なインターカレーション試薬である臭化エチジウム（15μM）は、明確な温度遷移の変更を確認できた。
さらに、化合物４によるDNAポリメラーゼβ活性阻害がポリメラーゼβに非特異的吸着又は特定の部位に選択的に結合するものであるかを解明するために、過剰量の核酸｛poly(rC)｝又はタンパク質｛bovineserum albumin (BSA)｝の存在下でDNAポリメラーゼβ活性の阻害効果を確認した。poly(rC)及びBSAは、化合物４によるDNAポリメラーゼβ活性の阻害に対してわずか又はまったく影響を与えなかった。
以上により、化合物４は、DNAインターカレーション試薬としての作用ではなく、DNAポリメラーゼβに直接結合して、該ポリメラーゼ活性を阻害することができる。これにより、化合物４を含む本発明の化合物３〜６は、強力かつ選択的にDNAポリメラーゼβ活性を阻害することができることを確認した。
(Confirmation of inhibition mechanism of DNA polymerase β activity of compound 4 of the present invention)
In order to elucidate whether the inhibition mechanism of DNA polymerase β activity by compound 4 is due to DNA binding or polymerase β binding, DNA temperature transition in the presence or absence of compound 4 is measured. did. The interaction between dsDNA and compound 4 was examined by measuring the melting temperature of dsDNA in the presence of an excess of 100 μM of the compound using a spectrophotometer equipped with a thermoelectric cell holder. No change in temperature transition could be confirmed in the concentration range of the compound. On the other hand, ethidium bromide (15 μM), which is a typical intercalation reagent as a positive control, confirmed a clear change in temperature transition.
Further, in order to elucidate whether inhibition of DNA polymerase β activity by compound 4 is nonspecific adsorption to polymerase β or selectively binds to a specific site, an excessive amount of nucleic acid {poly (rC)} or protein The inhibitory effect of DNA polymerase β activity was confirmed in the presence of {bovineserum albumin (BSA)}. Poly (rC) and BSA had little or no effect on the inhibition of DNA polymerase β activity by compound 4.
As described above, compound 4 does not act as a DNA intercalation reagent, but can directly bind to DNA polymerase β and inhibit the polymerase activity. Thereby, it was confirmed that the compounds 3 to 6 of the present invention including the compound 4 can strongly and selectively inhibit the DNA polymerase β activity.
（癌細胞増殖抑制活性の確認）
上記実施例１で合成した化合物３〜６が癌抑制遺伝子p53の有無による癌細胞増殖抑制活性を有するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
(Confirmation of cancer cell growth inhibitory activity)
Whether or not the compounds 3 to 6 synthesized in Example 1 above have cancer cell growth inhibitory activity depending on the presence or absence of the tumor suppressor gene p53 was confirmed. Details are as follows.
（癌細胞増殖抑制活性の測定）
本実施例に用いた細胞は、ヒト大腸癌由来HCT116細胞である。より詳しくは、野生型p53(HCT116 p53+/+)及び同系p53欠失型(HCT116p53-/-)を使用した。培地としては、McCoy’s 5A培地｛牛胎児血清10％、ペニシリン（100units/mL）及びストレプトマイシン（100 mg/mL）を添加している｝を用いた。培養は、5％CO2インキュベーターにて37℃で行った。本測定のために、培養した細胞（1×104）を、20μM又は200μMの本化合物３〜４が添加されたマイクロプレートの各穴に添加した。
前記添加後は、5％CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献［「RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1:Application toProliferation and Cytotoxicity Assays」、TimMosmann, J. Immunol. Methods、６５巻、５５頁（１９８３）］に記載されているMTTアッセイ法を用いた。即ち、上記２４時間後テトラゾリウム塩MTTを添加し、更に４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ.Ｄ.）で定量した。
細胞生存率は次の式により算出した。
細胞生存率（％） = 試験区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］／対照区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］
得られた結果は５ウェルの平均である。
(Measurement of cancer cell growth inhibitory activity)
The cells used in this example are human colon cancer-derived HCT116 cells. More specifically, wild type p53 (HCT116 p53 + / + ) and syngeneic p53 deletion type (HCT116p53 − / − ) were used. As the medium, McCoy's 5A medium (fetal bovine serum 10%, penicillin (100 units / mL) and streptomycin (100 mg / mL) added) was used. Culturing was performed at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. For this measurement, cultured cells (1 × 10 4 ) were added to each well of a microplate to which 20 μM or 200 μM of the present compounds 3-4 were added.
After the addition, the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator, and the cell viability of each test group was determined. The determination of the survival rate is based on the MTT assay method described in the literature [“Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays”, TimMosmann, J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983)]. Using. That is, after 24 hours, the tetrazolium salt MTT was added and further cultured for 4 hours. The amount of formazan produced through reduction by viable cells was considered to be proportional to viable cells, and was quantified with an optical density (OD) of 570 nm.
Cell viability was calculated by the following formula.
Cell viability (%) = OD of test group [570 nm] / OD of control group [570 nm]
The result obtained is an average of 5 wells.
（癌細胞増殖抑制活性の測定結果）
癌細胞増殖抑制活性の測定結果を図３に示す。図３の結果から明らかなように、化合物３〜６は、p53発現の有無に関わらずヒト大腸がん細胞（HCT116）の増殖を抑制した。増殖抑制効果は、順に、化合物４（LD50:13.2μM）、化合物３（LD50:13.7μM）、化合物６及び化合物５となった。
化合物３〜６は、チロシン及び疎水性アミノ酸を含むことにより、ヒト大腸がん細胞増殖を抑制することができると考えられる。よって、チロシン及び疎水性アミノ酸を含む本発明の化合物も同様な効果を有すると考えられる。
加えて、化合物３〜６は、p53発現の有無に関わらずヒト大腸がん細胞の増殖を抑制できることにより、p53発現は該化合物の大腸がん細胞の増殖抑制効果に影響を与えないことを確認した。よって、化合物３〜６は、DNAポリメラーゼβ活性を阻害することにより、大腸がん細胞の増殖を抑制していると考えられる。
以上により、本発明の化合物３〜６は、DNAポリメラーゼβ活性阻害効果だけではなく、がん細胞増殖抑制効果も有する。これにより、化合物３〜６を有効成分とする医薬組成物は、DNAポリメラーゼβ活性阻害剤だけでなく抗癌剤とすることができる。
(Measurement results of cancer cell growth inhibitory activity)
The measurement result of cancer cell growth inhibitory activity is shown in FIG. As is apparent from the results of FIG. 3, Compounds 3 to 6 inhibited the growth of human colon cancer cells (HCT116) regardless of the presence or absence of p53 expression. The growth inhibitory effects were compound 4 (LD 50 : 13.2 μM), compound 3 (LD 50 : 13.7 μM), compound 6 and compound 5 in this order.
Compounds 3-6 are thought to be able to suppress human colon cancer cell growth by containing tyrosine and hydrophobic amino acids. Therefore, the compound of the present invention containing tyrosine and a hydrophobic amino acid is considered to have the same effect.
In addition, it has been confirmed that compounds 3 to 6 can suppress the growth of human colon cancer cells regardless of the presence or absence of p53 expression, and that p53 expression does not affect the growth inhibitory effect of the compound on colon cancer cells. did. Therefore, it is considered that compounds 3 to 6 inhibit the growth of colon cancer cells by inhibiting the DNA polymerase β activity.
As described above, the compounds 3 to 6 of the present invention have not only a DNA polymerase β activity inhibitory effect but also a cancer cell growth inhibitory effect. Thereby, the pharmaceutical composition which uses the compounds 3-6 as an active ingredient can be used not only as a DNA polymerase β activity inhibitor but also as an anticancer agent.
（MMSとの併用による本発明の化合物の癌細胞増殖抑制活性の確認）
上記実施例１で合成した化合物４とMMSの併用による癌細胞増殖抑制効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
(Confirmation of cancer cell growth inhibitory activity of the compound of the present invention in combination with MMS)
The cancer cell proliferation inhibitory effect by combined use of Compound 4 synthesized in Example 1 and MMS was confirmed. Details are as follows.
（MMSとの併用による本発明の化合物の癌細胞増殖抑制活性の測定）
癌細胞として、p53発現又は発現しないヒト大腸がん細胞（参照：実施例４）を１mM MMSで1時間処理し、続いて1%DMSO（vehicle コントロール）又は化合物４（LD50になるように、p53発現細胞には13.2μM、p53未発現細胞には13.7μM）を添加した。８日経過後のコロニーをメタノールで固定し、メチレンブルーで染色した。そして、染色後のコロニー数を計測した。相対的なコロニー形成割合｛Relative colony formation（%）｝は、「各化合物で処理したコロニー形成数／コントロールで形成されるコロニー形成数」で示した。
(Measurement of cancer cell growth inhibitory activity of the compound of the present invention in combination with MMS)
As cancer cells, human colon cancer cells expressing or not expressing p53 (see: Example 4) were treated with 1 mM MMS for 1 hour, followed by 1% DMSO (vehicle control) or compound 4 (LD 50 ). 13.2 μM was added to p53 expressing cells and 13.7 μM was added to p53 non-expressing cells. After 8 days, the colonies were fixed with methanol and stained with methylene blue. Then, the number of colonies after staining was counted. The relative colony formation rate {Relative colony formation (%)} is indicated by “number of colonies formed with each compound / number of colonies formed by control”.
（MMSとの併用による本発明の化合物の癌細胞増殖抑制活性の測定結果）
MMSとの併用による本発明の化合物の癌細胞増殖抑制活性の測定結果を図４に示す。
１mM MMS処理のみで得られた画分の相対的なコロニー形成割合は、HCT116 p53+/+で0.05±0.01、HCT116 p53-/-で0.63±0.13であった。HCT116 p53+/+の相対的なコロニー形成割合が、HCT116 p53-/-の相対的なコロニー形成割合と比較して高いのは、p53依存性塩基除去修復経路を介してMMSによって損傷したDNAが修復されたからであると考えられる。
MMSとの併用による化合物４で処理して得られた画分の相対的なコロニー形成割合は、p53発現又は発現に関係なく、MMS単独で得られた画分の相対的なコロニー形成割合と比較して、顕著にコロニー形成能を阻害した。
以上により、MMSとの併用により本発明の化合物の癌細胞増殖抑制活性を向上させることができた。これにより、化合物４とMMSを含む医薬組成物は優れた抗癌剤となる。
(Measurement result of cancer cell proliferation inhibitory activity of the compound of the present invention in combination with MMS)
FIG. 4 shows the measurement results of the cancer cell growth inhibitory activity of the compound of the present invention in combination with MMS.
The relative colony formation rates of the fractions obtained by treatment with 1 mM MMS alone were 0.05 ± 0.01 for HCT116 p53 + / + and 0.63 ± 0.13 for HCT116 p53 − / − . The relative colonization rate of HCT116 p53 + / + is higher than that of HCT116 p53 -/- because DNA damaged by MMS via the p53-dependent base excision repair pathway It is thought that it was because it was repaired.
The relative colony formation rate of the fraction obtained by treatment with compound 4 in combination with MMS is compared with the relative colony formation rate of the fraction obtained with MMS alone, regardless of p53 expression or expression. Thus, the ability to form colonies was significantly inhibited.
As described above, the cancer cell proliferation inhibitory activity of the compound of the present invention could be improved by the combined use with MMS. Thereby, the pharmaceutical composition containing the compound 4 and MMS becomes an excellent anticancer agent.
（本発明の化合物の癌細胞アポトーシス誘導及びその割合の確認）
本発明の化合物による癌細胞増殖抑制活性は、癌細胞のアポトーシスを誘導しているかどうか、さらには誘導割合を確認した。詳細は、以下の通りである。
(Induction of cancer cell apoptosis of compound of the present invention and confirmation of its ratio)
The cancer cell growth inhibitory activity of the compound of the present invention was confirmed to induce apoptosis of cancer cells, and the induction ratio. Details are as follows.
（本発明の化合物による癌細胞アポトーシス誘導の確認）
アポトーシスの誘導確認は、アガロース電気泳動によるDNAフラグメントアッセイにより行った。全DNAは、化合物４又はMMS存在下で培養したHCT116p53+/+又はHCT116 p53-/-から抽出し、そして5μgの抽出液を1.5%（w/v）アガロース電気泳動｛40 mMTris-5 mM sodium acetate-1 mM EDTA (pH 7.8)｝により分離し、次に、臭化エチジウムで染色した。染色したDNAバンドは、紫外線照射下で、視覚化した。
（本発明の化合物による癌細胞アポトーシス誘導割合の測定）
2.5×104細胞（HCT116 p53+/+又はHCT116 p53-/-）を各プレートの穴に導入し、さらに化合物４（LD50になるように、p53発現細胞には13.2μM、p53未発現細胞には13.7μM、）を添加して、37℃、24時間、保温した。アポトーシスの検出方法として、公知のキット｛ApopTag Red In SituApoptosis Detection Kit (CHEMICON, CA, USA)｝を使用した。アポトーシス細胞は、25μMエトポシドで5時間、37℃で処理した。培養皿を染色し、そして、染色したアポトーシス細胞の割合を、蛍光顕微鏡（Olympus IX70; Olympus,Tokyo, Japan）で計測した。
(Confirmation of cancer cell apoptosis induction by the compound of the present invention)
Induction of apoptosis was confirmed by DNA fragment assay by agarose electrophoresis. Total DNA was extracted from HCT116p53 + / + or HCT116 p53 − / − cultured in the presence of Compound 4 or MMS, and 5 μg of the extract was subjected to 1.5% (w / v) agarose electrophoresis {40 mM Tris-5 mM sodium acetate-1 mM EDTA (pH 7.8)} and then stained with ethidium bromide. Stained DNA bands were visualized under UV irradiation.
(Measurement of cancer cell apoptosis induction ratio by the compound of the present invention)
2.5 × 10 4 cells (HCT116 p53 + / + or HCT116 p53 − / −) are introduced into the holes of each plate, and further compound 4 (p53 expressing cells are 13.2 μM, p53 non-expressing cells so that LD 50 is obtained) Was added at 13.7 μM, and incubated at 37 ° C. for 24 hours. As a method for detecting apoptosis, a known kit {ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit (CHEMICON, CA, USA)} was used. Apoptotic cells were treated with 25 μM etoposide for 5 hours at 37 ° C. Culture dishes were stained and the percentage of stained apoptotic cells was counted with a fluorescence microscope (Olympus IX70; Olympus, Tokyo, Japan).
本発明の化合物による癌細胞アポトーシス誘導の確認の結果を図５Ａ、本発明の化合物による癌細胞アポトーシス誘導割合の測定結果を図５Ｂに示す。
図５Ａの結果より、化合物４（図５Ａ：Lane2、4）並びにMMS（図５Ａ：Lane5、6）では、p53発現に関係なく大腸癌細胞のアポトーシスを誘導した。
図５Ｂの結果より、化合物４の癌細胞アポトーシス誘導効果は、MMSの癌細胞アポトーシス誘導効果と比較して、約５倍であることを確認した。さらに、化合物４及びMMS併用の癌細胞アポトーシス誘導効果は、化合物４単独の癌細胞アポトーシス誘導効果と比較して、有意に高いことを確認した。
以上により、化合物４は、強力な癌細胞アポトーシス誘導効果を有することを確認した。これにより、化合物３〜６を有効成分とする医薬組成物は、アポトーシス誘導剤とすることができる。
さらに、化合物４及びMMS併用の癌細胞アポトーシス誘導効果は、化合物４単独の癌細胞アポトーシス誘導効果よりも高いので、化合物４とMMSを含む医薬組成物は優れた癌細胞アポトーシス誘導剤となる。
FIG. 5A shows the results of confirming the induction of cancer cell apoptosis by the compound of the present invention, and FIG. 5B shows the measurement results of the cancer cell apoptosis induction ratio by the compound of the present invention.
From the results shown in FIG. 5A, compound 4 (FIG. 5A: Lanes 2 and 4) and MMS (FIG. 5A: Lanes 5 and 6) induced apoptosis of colon cancer cells regardless of p53 expression.
From the result of FIG. 5B, it was confirmed that the cancer cell apoptosis-inducing effect of Compound 4 was about 5 times that of MMS compared with the cancer cell apoptosis-inducing effect. Furthermore, it was confirmed that the cancer cell apoptosis-inducing effect of Compound 4 and MMS in combination was significantly higher than that of Compound 4 alone.
From the above, it was confirmed that Compound 4 has a strong cancer cell apoptosis-inducing effect. Thereby, the pharmaceutical composition which uses the compounds 3-6 as an active ingredient can be used as an apoptosis inducer.
Furthermore, since the cancer cell apoptosis-inducing effect of Compound 4 and MMS in combination is higher than the cancer cell apoptosis-inducing effect of Compound 4 alone, a pharmaceutical composition containing Compound 4 and MMS is an excellent cancer cell apoptosis-inducing agent.
新規なDNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤及びアポトーシス誘導剤を提供することができる。 Novel DNA polymerase inhibitors, anticancer agents, and apoptosis inducers can be provided.
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107073069A (en) * | 2014-08-18 | 2017-08-18 | 康奈尔大学 | It is used as the dipeptide analogue of the inhibitor of people's immunoproteasome |
| WO2018034987A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | The Johns Hopkins University | Dna polymerase beta inhibitors |
| US11066397B2 (en) | 2015-10-15 | 2021-07-20 | Cornell University | Proteasome inhibitors and uses thereof |
| US11203613B2 (en) | 2017-10-11 | 2021-12-21 | Cornell University | Peptidomimetic proteasome inhibitors |
| USRE49816E1 (en) | 2014-01-10 | 2024-01-30 | Cornell University | Dipeptides as inhibitors of human immunoproteasomes |
-
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE49816E1 (en) | 2014-01-10 | 2024-01-30 | Cornell University | Dipeptides as inhibitors of human immunoproteasomes |
| CN107073069A (en) * | 2014-08-18 | 2017-08-18 | 康奈尔大学 | It is used as the dipeptide analogue of the inhibitor of people's immunoproteasome |
| US11202817B2 (en) | 2014-08-18 | 2021-12-21 | Cornell University | Dipeptidomimetics as inhibitors of human immunoproteasomes |
| CN107073069B (en) * | 2014-08-18 | 2022-03-08 | 康奈尔大学 | Dipeptide mimetics as inhibitors of human immunoproteasome |
| US11066397B2 (en) | 2015-10-15 | 2021-07-20 | Cornell University | Proteasome inhibitors and uses thereof |
| US11629141B2 (en) | 2015-10-15 | 2023-04-18 | Cornell University | Proteasome inhibitors and uses thereof |
| WO2018034987A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | The Johns Hopkins University | Dna polymerase beta inhibitors |
| US10711027B2 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-14 | The Johns Hopkins University | DNA polymerase beta inhibitors |
| US11203613B2 (en) | 2017-10-11 | 2021-12-21 | Cornell University | Peptidomimetic proteasome inhibitors |
| US11732005B2 (en) | 2017-10-11 | 2023-08-22 | Cornell University | Peptidomimetic proteasome inhibitors |
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