JP2014061489A - 石油汚染土壌の浄化方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】石油分解菌を含む有機資材を石油汚染土壌に添加することにより、石油汚染土壌中の全炭素の含有量(但し、石油の炭素量を除く)を10,000〜60,000 mg/kgに、且つ石油汚染土壌中のC/N比を8〜16に調整する工程を含む石油汚染土壌の浄化方法、並びに石油分解菌を含み、全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30である石油汚染土壌の浄化用組成物。
【選択図】図2
Description
項2.前記有機資材が1×106 cells/g以上の量で石油分解菌を含む、項1に記載の方法。
項3.前記有機資材が堆肥を主成分として含む組成物である、項1又は2に記載の方法。
項4.前記有機資材が堆肥であって、該堆肥中の全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30である、項1又は2に記載の方法。
項5.石油分解菌を含み、全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30である石油汚染土壌の浄化用組成物。
本発明の石油汚染土壌の浄化方法は、石油分解菌を含む有機資材を石油汚染土壌に添加することにより、石油汚染土壌中の全炭素の含有量(但し、石油の炭素量を除く)を10,000〜60,000 mg/kgに、且つ石油汚染土壌中のC/N比を8〜16に調整する工程を含むことを特徴とする。
本発明の石油汚染土壌の浄化用組成物は、石油分解菌を含み、全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30であることを特徴とする。
・総細菌数
50 ml容遠沈管に土壌1.0 gを量り取り、表1に示すDNA抽出緩衝液(pH 8.0)を8.0 ml、20%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム溶液を1.0 ml加え、1,500 rpm、室温で20分間撹拌した。撹拌後、50 ml容遠沈管から滅菌済み1.5 mlマイクロチューブに1.5 ml分取し、16℃、8,000 rpmで10分間遠心分離した。水層を新たなマイクロチューブに700μl分取し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール(25:24:1、v/v)を700μl加えて混和した後、16℃、13,000 rpmで10分遠心分離した。遠心分離後、水層を新たなマイクロチューブに500μl分取し、2-プロパノールを300μl加えて緩やかに混和し、16℃、13,000 rpmで15分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、70%(v/v)エタノールを500μl加え16℃、13,000 rpmで5分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去しアスピレーターで30分間減圧乾燥させた。これに表2に示すTE 10:1緩衝液(pH 8.0)を50μl加えよく溶解させ、これを環境DNA溶液とした。
Y = 4.0 × 109 X(R2 = 0.99)[Y;土壌バクテリア数(cells/g-soil)、X;環境DNA量(μg/g-soil)]
を用いて土壌バクテリア数を算出した。
前述するのと同様の方法で、環境DNA溶液とアガロースゲルを調製した。環境DNA溶液15μlにローディングダイ(東洋紡、大阪) 2.0μlを混合し、全量17μlをアガロースゲルにアプライした。これを100 Vで40分間電気泳動を行った後、アガロースゲルにUV照射し、DNAバンドを確認した。アガロースゲルからDNAバンドを切り出し、環境DNAを精製した。KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixを10μl、10μMのフォワードプライマー(5'-AACTAYMTCGARCAYTAYGG-3')及びリバースプライマー(5'-TGRTCKSWRTGNCGYTGVARGTG-3')を1μl、ROX highを0.4μl、精製した環境DNAを1〜5μl含む20μlの反応液を200μl容チューブに加え、Applied Biosystems 7300 Real Time System (アプライドバイオシステムズ、USA)にセットして、リアルタイムPCRを行った。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、60℃・30〜60秒の反応を40サイクルとした。なお、リアルタイムPCRに用いた試料のうち、KAPA SYBR、ROX highは、KAPA SYBR qPCR kit (KAPA BIOSYSTEMS、大阪)のプロトコールに従って用いた。得られたCt値から以下の式を使って石油分解菌数を算出した。
石油分解菌数(cells/g-sample) = (3×1014) × e(-0.516×Ct値)
この方法により、石油分解菌を特異的に高感度で定量することができる。
サンプルに含まれる油分はIR(HORIBA oil content analyzer OCMA-355, 堀場製作所、京都)で分析した。
サンプルのTCは全炭素計(TOC-V CPH, 島津製作所、京都)を用いて測定した。
バイオスティミュレーションにおいては土着の石油分解菌数を把握することが重要である。そこで、新たに設計したプライマーセットを用いて様々な土壌中における石油分解菌の分布を調べた。総細菌数及び石油分解菌数は上記の方法によって調べた。その結果を表4に示す。
石油汚染土壌の浄化を行うためには、石油分解菌が多数含まれる資材を使うことでより高い効果を期待できると考えられる。そこで、堆肥中における石油分解菌の分布を調べた。その結果を表5に示す。
石油分解菌を多く含む有機資材を用いることで石油汚染土壌のバイオレメディエーションが効率化するかどうかを調べるため、油分濃度、総細菌数、及び石油分解菌数の関係を解析した。
堆肥中には比較的多くの石油分解菌が存在しており、特に鶏糞堆肥に多くの石油分解菌が存在していた。石油汚染土壌に発酵鶏糞を添加し、TC及びC/N比を一定の範囲に調整することにより、土壌細菌及び石油分解菌が増加すると共に高く維持され、油分分解も促進した。
TCが約1,000 mg/kgの土壌に5,000 mg/kgになるように軽油を添加し、本土壌を石油汚染土壌とした。石油汚染土壌にTCが約10,000 mg/kg(油分のTCは除く)になるように表6に示す発酵牛糞堆肥(東商製)又は鶏糞堆肥(坂本産業製)を添加して混合し、室温で13日間静置した。土壌中の油分の定量はIRで行った。その結果を図4に示す。
TCが2,000 mg/kgの石油汚染土壌に5,000 mg/kgになるように自動車用エンジンオイルのベースオイル(新日本石油)を添加し、本土壌を石油汚染土壌とした。石油汚染土壌にTCが10,000 mg/kg(油分のTCは除く)になるように鶏糞堆肥(アグリエヌワイ社製)を添加して混合し、室温で28日間静置した。土壌中の油分の定量はIRで行った。その結果を表7に示す。
Claims (5)
- 石油分解菌を含む有機資材を石油汚染土壌に添加することにより、石油汚染土壌中の全炭素の含有量(但し、石油の炭素量を除く)を10,000〜60,000 mg/kgに、且つ石油汚染土壌中のC/N比を8〜16に調整する工程を含む石油汚染土壌の浄化方法。
- 前記有機資材が1×106 cells/g以上の量で石油分解菌を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記有機資材が堆肥を主成分として含む組成物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記有機資材が堆肥であって、該堆肥中の全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30である、請求項1又は2に記載の方法。
- 石油分解菌を含み、全炭素の含有量が150,000 mg/kg以上、全窒素の含有量が8,000 mg/kg以上、及びC/N比が18〜30である石油汚染土壌の浄化用組成物。
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