JP2014060948A - Method for determining kinds of beer raw materials and products, and method for evaluating beer quality using the method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ビール原料及び製品の判別方法並びにその方法を利用したビール品質の評価方法に関する。より詳しくは、本発明は、ビールに残存するＤＮＡを適正なプライマー共存下でＰＣＲによって増幅するための鋳型ＤＮＡの調製方法及び該調製方法によって得られる鋳型ＤＮＡを用いるＰＣＲの結果に基づくビール原料及び製品の判別方法並びに該判別結果に基づくビール品質の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating beer raw materials and products, and a method for evaluating beer quality using the method. More specifically, the present invention relates to a template DNA preparation method for amplifying DNA remaining in beer by PCR in the presence of appropriate primers, a beer raw material based on the results of PCR using the template DNA obtained by the preparation method, and The present invention relates to a product discrimination method and a beer quality evaluation method based on the discrimination result.
ビールは大麦の麦芽の酵素活性によって大麦の澱粉を分解し、精製する糖質を酵母によって発酵させてアルコールと二酸化炭素を生成させ、添加したホップによって発酵を調整するとともに、特有の風味を付与した世界で幅広く楽しまれている飲料である。 Beer breaks down barley starch by the enzymatic activity of barley malt, ferment saccharides to be purified by yeast to produce alcohol and carbon dioxide, adjust the fermentation with added hops, and give a unique flavor It is a beverage that is widely enjoyed around the world.
ビールの品質には、原料大麦の種類と特性、麦酒酵母の種類と発酵条件、副原料であるホップの種類と品質が重要な影響を与えるとされている。 It is said that the quality and quality of beer are influenced by the type and characteristics of the raw barley, the type and the fermentation conditions of the barley yeast, and the type and quality of the hop as a secondary ingredient.
大麦種子を試料とするＰＣＲ法による品種識別については、内村ら（非特許文献１：内村要介・古庄雅彦・吉田智彦２００４． 国内二条大麦のＤＮＡ マーカーによる品種識別． 日作紀７３： ３５−４１．）や長嶺ら（非特許文献２：長嶺敬・天谷正行・池田達哉・大関美香・春山直人・加藤常夫・五月女敏範：ビール大麦の主要形質ＤＮＡマーカーの開発・評価と育種利用上の問題点、栃木農試研報Ｎｏ５９：４５〜５４ （２００７））が報告している。 For identification of varieties by PCR using barley seeds as a sample, Uchimura et al. (Non-patent Document 1: Yosuke Uchimura, Masahiko Furusho, Tomohiko Yoshida 2004. Variety identification by DNA markers in domestic Nijo barley. Nisakuki 73: 35- 41.) and Nagahama et al. (Non-patent document 2: Takashi Nagamine, Masayuki Amaya, Tatsuya Ikeda, Mika Ozeki, Naoto Haruyama, Tsuneo Kato, Toshinori Satsuki: Development and evaluation of major trait DNA markers for beer barley and their use in breeding Problem, Tochigi National Agricultural Research Report No 59: 45-54 (2007)).
ビール酵母の菌種判別に関しては、佐藤と土屋（特許文献１：特開２００２−２３３３８２号公報「ビール酵母の識別方法」）は、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子の特徴に注目して醸造用下面ビール酵母と野生酵母の菌種識別技術を開発し、尾形と只見（特許文献２：特開２００８−２４５６３６号公報）は、ビール酵母由来のＤＮＡのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型塩基配列とＳ． ｂａｙａｎｕｓ型塩基配列の組み替えの起こっている箇所を特異的に増幅するＰＣＲ用プライマー対による酵母の識別技術及び香気成分生成などのビール醸造適性の推定技術について報告している。 Regarding the microbial species identification of brewer's yeast, Sato and Tsuchiya (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-233382 “Method for identifying brewer's yeast”) focused on the characteristics of the Lg-FLO1 gene, A strain identification technology for wild yeast has been developed, and Ogata and Tadami (Patent Document 2: Japanese Patent Laid-Open No. 2008-245636) describe S. cerevisiae of DNA derived from brewer's yeast. cerevisiae type nucleotide sequence and S. cerevisiae type nucleotide sequence. This paper reports on yeast identification technology using PCR primer pairs that specifically amplify the places where recombination of Bayanus type nucleotide sequences has occurred, and technology for estimating beer brewing aptitude such as aroma component generation.
ビールの副原料であるホップの品種識別については、土屋らがホップからＤＮＡを抽出してＰＣＲ法による品種判別を行う技術（非特許文献３：Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８４（２）， １０３−１０７， １９９７）を報告し、また、村上がＰＣＲ法によるホップの品種判別を行うに際して、ホップから効率よくＤＮＡを抽出する方法及びＰＣＲ用の好適プライマーについて報告している（特許文献３：特開平第１１−１０３８９５号公報）。 Regarding the identification of varieties of hops, which are secondary ingredients of beer, Tsuchiya et al. (Non-patent Document 3: Tsuchiya et al., Journal of fermentation and bioengineering, 84 ( 2), 103-107, 1997), and Murakami has reported a method for efficiently extracting DNA from hops and suitable primers for PCR when hop varieties are identified by the PCR method (patent) Document 3: JP-A-11-103895).
上記の大麦、ビール酵母及びホップの識別技術は、いずれも種子、菌体あるいは植物体からＤＮＡを抽出して鋳型とし、ＰＣＲを行う技術であり、ビールを試料として原料を識別する技術ではないのに対し、本発明者らは、これまでに、ワイン、日本酒、ビールなどの醸造酒の原料植物をＰＣＲ法を用いるＤＮＡ判別によって識別する技術を開発し、ビールへのトウモロコシや米の配合の有無をＰＣＲ法で識別することが可能であると報告している（特許文献４：日本特許第４９５３０５８号「醸造酒中の原料植物の判別方法」）。 The above barley, brewer's yeast, and hop identification technologies are all technologies that extract DNA from seeds, fungus bodies, or plant bodies, use them as templates, and perform PCR, not technologies that identify raw materials using beer as a sample. On the other hand, the present inventors have developed a technology for discriminating raw materials of brewed liquor such as wine, sake and beer by DNA discrimination using the PCR method, and whether corn or rice is added to beer. Can be identified by the PCR method (Patent Document 4: Japanese Patent No. 4953058 “Method for discriminating raw material plants in brewed liquor”).
本発明者らの報告した上記の技術は、日本酒の主原料である米の品種判別やワインの主原料であるブドウの品種判別に特に適するものであるが、ビールについては、抽出精製できる鋳型ＤＮＡの精製度と量が不十分であり、広範な原料植物の判別のためにはさらなる改良が必要である。 The above-mentioned technique reported by the present inventors is particularly suitable for discriminating rice varieties that are the main ingredients of sake and grape varieties that are the main ingredients of wine, but for beer, template DNA that can be extracted and purified. However, the degree of purification and amount of these are insufficient, and further improvement is necessary for the discrimination of a wide range of raw material plants.
ビールの品質には、原料大麦の種類、ビール酵母の種類と発酵条件、副原料であるホップの品質のすべてが影響するということが知られており、ＰＣＲ法を用いるＤＮＡ判別によってビールの品質を推定するためには、原料大麦、ビール酵母、ホップのそれぞれについて品質に関連するＤＮＡマーカーを開発し、好適なプライマーを開発・設計することが必要であり、複数のＰＣＲに必要とされる高純度にして大量の鋳型ＤＮＡをビールから抽出・精製しなければならず、そのためには、特許第４９５３０５８号で報告した醸造酒からのＤＮＡ抽出精製法を改良して純度の高い鋳型ＤＮＡを効率よく抽出・精製する技術、ＰＣＲプライマーの選別に関する技術などを新たに開発することが必要とされていた。 It is known that the quality of beer is affected by the type of raw barley, the type and fermentation conditions of brewer's yeast, and the quality of hops, which are secondary ingredients, and the quality of beer is determined by DNA discrimination using the PCR method. In order to estimate, it is necessary to develop DNA markers related to quality for each of the raw barley, brewer's yeast, and hops, and to develop and design suitable primers, and the high purity required for multiple PCRs Therefore, a large amount of template DNA must be extracted and purified from beer. To that end, the method for extracting and purifying DNA from brewed liquor reported in Japanese Patent No. 4953058 has been improved to efficiently extract highly pure template DNA. -It was necessary to newly develop technology for purification and technology for PCR primer selection.
本発明の第１の目的は、ビール原料又は製品の判別方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、ビール原料の判別結果に基づくビールの品質評価方法を提供することである。
The first object of the present invention is to provide a method for discriminating beer raw materials or products.
The second object of the present invention is to provide a beer quality evaluation method based on the discrimination result of beer raw materials.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＤＮＡ吸着用担体（例えば、磁性担体とマグネット）を使用するＤＮＡ精製法とアルコール分配法とを併用することによって高純度のＤＮＡを簡便かつ大量に調製できるということを見いだした。
本発明者らはさらに、ビール原料又は製品の判別及びビールの品質評価に好適なＰＣＲプライマーを見出すために、これを使用して、ビールから抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として大麦、酵母及びホップの多数の特定成分のＤＮＡを増幅し、好適なＤＮＡバンドからＤＮＡを抽出してクローニングしてそれぞれのＤＮＡの塩基配列を決定し、その結果に基づいて、もっとも好適なプライマー対群を再設計することに成功した。
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have succeeded in using a DNA purification method using a DNA adsorption carrier (for example, a magnetic carrier and a magnet) and an alcohol partitioning method in combination. It has been found that pure DNA can be prepared easily and in large quantities.
In addition, in order to find a PCR primer suitable for discriminating beer raw materials or products and evaluating the quality of beer, the present inventors used this to identify barley, yeast and hops using DNA extracted and purified from beer as a template. Amplify a large number of DNA of specific components, extract and clone DNA from suitable DNA bands, determine the base sequence of each DNA, and redesign the most suitable primer pair group based on the results succeeded in.
本発明のＤＮＡ調製方法を用いることにより、高純度の鋳型ＤＮＡが大量に調製できるので、該ビールあたり、大麦、酵母、ホップのそれぞれについて各種のプライマー対の存在下でＰＣＲを行うことができ、該ビールのそれぞれの原料の判別が可能になることに加えて、大麦、酵母、ホップそれぞれがビール品質に与える影響を考慮することによって、該ビールの総合的な品質評価が可能になった。 By using the DNA preparation method of the present invention, a large amount of high-purity template DNA can be prepared, so that PCR can be performed in the presence of various primer pairs for each of the barley, yeast, and hops per beer, In addition to making it possible to discriminate each raw material of the beer, the overall quality evaluation of the beer has become possible by taking into consideration the effects of barley, yeast, and hops on beer quality.
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
（１） ビール原料又は製品の判別方法であって、該方法が、（ａ）ビール試料から抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で増幅したＤＮＡを検出するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＤＮＡの検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップを含む、前記方法。
In summary, the present invention encompasses the following features.
(1) A method for discriminating beer raw materials or products, the method comprising: (a) DNA extracted and purified from a beer sample as a template, a plurality of barley discrimination primers, a plurality of hop discrimination primers, and a plurality of beers A step of amplifying the DNA separately or simultaneously using each primer group consisting of primers for yeast discrimination, (b) a step of detecting the DNA amplified in step (a), (c) a DNA in step (b) And determining the type of barley, brewer's yeast, and hops, which are the raw materials used in the production of beer, based on the detection result.
（２） 複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーである、上記（１）に記載の方法。 (2) Barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene, barley protein Z gene, barley alpha amylase gene, barley beta amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley yellow spot mosaic It is a primer for genes of all types from two or more selected from the group consisting of detection genes for viruses, barley powdery mildew-derived genes, barley trypsin inhibitor genes, barley cellulase genes, and barley β-glucanase genes. The method according to (1) above.
（３） 大麦ホルデイン遺伝子が、ホルデインＡ遺伝子、ホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子、又はそれらの組み合わせである、上記（２）に記載の方法。
（４） 大麦プロテインＺ遺伝子が、プロテインＺ７遺伝子、プロテインＺ４遺伝子、又はそれらの組み合わせである、上記（２）又は（３）に記載の方法。
(3) The method according to (2) above, wherein the barley hordein gene is a hordein A gene, a hordein B gene, a hordein C gene, or a combination thereof.
(4) The method according to (2) or (3) above, wherein the barley protein Z gene is a protein Z7 gene, a protein Z4 gene, or a combination thereof.
（５） 大麦澱粉合成酵素遺伝子が、大麦澱粉粒結合性澱粉合成酵素遺伝子である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
(5) The method according to any one of (2) to (4) above, wherein the barley starch synthase gene is a barley starch granule-binding starch synthase gene.
(6) Any of the above (1) to (5), wherein the plurality of barley discrimination primers includes at least primers for detecting barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene and barley protein Z gene. The method of crab.
（７） 大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β−グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなる、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の方法。 (7) The barley polygalacturonase gene detection primer pair is composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the barley hordein gene detection primer pair is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3 And / or SEQ ID NO: 25 and / or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the detection primer pair for the barley starch synthase gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27, and the barley protein Z gene The detection primer pairs consisted of the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31, The detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the detection primer pair of the barley lipoxygenase gene has the sequence A primer pair for detecting a barley yellow mosaic virus-derived gene consisting of the base sequences of No. 11 and SEQ ID NO: 33, and a primer pair for detecting a barley powdery mildew-derived gene consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, and the barley trypsin inhibitor gene detection primer pair comprises the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, and barley cellulase The gene detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and the barley β-glucanase gene detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39 above (2 ) To (6).
（８） 複数のホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーから選択される、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９） 複数のホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対から選択される、上記（８）に記載の方法。
(8) The plurality of hop discrimination primers are selected from a primer for detecting a hop gene belonging to an aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to a fine aroma, and a primer for detecting a hop gene belonging to a bitter. The method according to any one of (1) to (7).
(9) A plurality of hop discrimination primers are a primer pair consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 40, a primer pair consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 41, and the bases of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 42 The method according to (8) above, which is selected from a primer pair consisting of a sequence.
（１０） 複数のビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーから選択される、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１） 複数のビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３のプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４のプライマー対から選択される、上記（１０）に記載の方法。
(10) Any one of the above (1) to (9), wherein the plurality of beer yeast discrimination primers are selected from a primer that makes it possible to distinguish between upper-fermenting yeast and lower-fermenting yeast and a primer for detecting a yeast thioredoxin gene The method described in 1.
(11) The method according to (10) above, wherein the plurality of beer yeast discrimination primers are selected from the primer pair of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43 and the primer pair of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44.
（１２） 鋳型ＤＮＡが、（ａ１）ビール試料に澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解するステップ、（ａ２）ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収するステップ、並びに（ａ３）ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収するステップを含む方法によって得ることができる、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３） 澱粉分解酵素が耐熱性アミラーゼである、上記（１２）に記載の方法。
(12) The template DNA is (a1) a step in which starch degrading enzyme and proteolytic enzyme are allowed to act on a beer sample to decompose starch, starch degradation product and protein, (a2) DNA is recovered from the treatment liquid in step (a1) And (a3) adsorbing the DNA from step (a2) using a DNA-adsorbing solid phase carrier, and recovering the DNA from the solid phase carrier. ) To (11).
(13) The method according to (12) above, wherein the starch degrading enzyme is a thermostable amylase.
（１４） タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼＫである、上記（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５） ＤＮＡ吸着性固相担体が、ガラスビーズ又は磁性ビーズである、上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
(14) The method according to (12) or (13) above, wherein the proteolytic enzyme is proteinase K.
(15) The method according to any one of (12) to (14) above, wherein the DNA-adsorbing solid phase carrier is glass beads or magnetic beads.
（１６） ビールの品質の評価方法であって、上記の（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法を用いて大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを用いる核酸増幅法によって、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップ、並びに、該判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性からなる品質を総合的に評価するステップを含む、前記方法。
（１７） ビールの呈味性が、苦味、酸味、渋み及び旨味である、上記（１６）に記載の方法。
(16) Nucleic acid that is a method for evaluating the quality of beer and uses a barley discrimination primer, a hop discrimination primer, and a brewer's yeast discrimination primer using the method according to any one of (1) to (15) above. A step of discriminating the types of barley, brewer's yeast, and hops, which are raw materials used in the production of beer, by the amplification method, and using the discrimination result, comprehensive quality of beer taste and foam retention is obtained. Evaluating the method.
(17) The method according to (16) above, wherein the beer's taste is bitter, sour, astringent and umami.
（１８） 判別結果を導くための増幅ＤＮＡバンドの有無について、有を１、無を０と２値化し、ビール品質を目的変数とする多変量解析を行うことによって該ビールの品質を推定する、上記（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９） 大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
(18) For the presence or absence of an amplified DNA band for deriving a discrimination result, binarize 1 and
(19) Barley discrimination primer derived from barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene, barley protein Z gene, barley α-amylase gene, barley β-amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley yellow mosaic virus It is a primer for genes of all types from two or more selected from the group consisting of genes, barley powdery mildew-derived genes, barley trypsin inhibitor gene, barley cellulase gene, and barley β-glucanase gene detection primer. Primer for detecting a hop gene belonging to aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to fine aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to bitter, and a primer for discriminating brewer's yeast The method according to any one of the above (16) to (18), wherein is a primer that makes it possible to distinguish between upper surface fermenting yeast and lower surface fermenting yeast and a primer for detecting a yeast thioredoxin gene.
（２０） 大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、上記（１９）に記載の方法。 (20) The barley polygalacturonase gene detection primer pair is composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the barley hordein gene detection primer pair is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3 And / or SEQ ID NO: 25 and / or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the detection primer pair for the barley starch synthase gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27, and the barley protein Z gene The detection primer pairs consisted of the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31, The detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the detection primer pair for the barley lipoxygenase gene is arranged. A primer pair for detecting a barley yellow mosaic virus-derived gene comprising a nucleotide sequence of column No. 11 and SEQ ID NO: 33, comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34, and a primer pair for detecting a barley powdery mildew-derived gene Is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, and the primer pair for detection of the barley trypsin inhibitor gene is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, The cellulase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and the barley β-glucanase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39, and hop discrimination Primer for primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 9 and a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 41, a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 42, and the brewer's yeast discrimination primer is the base sequence of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43 The method according to (19) above, which is a primer pair consisting of and a primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44.
（２１） 上記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法で使用するための、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを含むキットであって、大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、前記キット。 (21) A kit comprising a barley discrimination primer, a hop discrimination primer and a beer yeast discrimination primer for use in the method according to any one of (1) to (20) above, wherein the barley discrimination primer Barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene, barley protein Z gene, barley α-amylase gene, barley β-amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley yellow mosaic virus-derived gene, barley powdery mildew A primer for two or more genes selected from the group consisting of detection primers for genes, barley trypsin inhibitor gene, barley cellulase gene, and barley β-glucanase gene, and hop discrimination primers belong to aroma For detection of hop genes A primer for detecting a hop gene belonging to lymer and fine aroma, and a primer for detecting a hop gene belonging to bitter, and a primer for distinguishing beer yeast from top fermenting yeast and bottom fermenting yeast And a kit for detecting a yeast thioredoxin gene.
（２２）大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、上記（２１）に記載のキット。 (22) The kit according to (21), wherein the barley discrimination primer includes at least primers for detecting a barley polygalacturonase gene, a barley hordein gene, a barley starch synthase gene, and a barley protein Z gene.
（２３） 大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、上記（２１）又は（２２）に記載のキット。 (23) The barley polygalacturonase gene detection primer pair is composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the barley hordein gene detection primer pair is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3 And / or SEQ ID NO: 25 and / or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the detection primer pair for the barley starch synthase gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27, and the barley protein Z gene The detection primer pairs consisted of the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31, The detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the detection primer pair for the barley lipoxygenase gene is arranged. A primer pair for detecting a barley yellow mosaic virus-derived gene comprising a nucleotide sequence of column No. 11 and SEQ ID NO: 33, comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34, and a primer pair for detecting a barley powdery mildew-derived gene Is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, and the primer pair for detection of the barley trypsin inhibitor gene is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, The cellulase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and the barley β-glucanase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39, and hop discrimination Primer for primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 9 and a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 41, a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 42, and the brewer's yeast discrimination primer is the base sequence of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43 The kit according to (21) or (22) above, which is a primer pair comprising: and a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44.
本発明により、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲなどの核酸増幅法によって、該ビールの主原料である大麦の品種判別、該ビールの発酵微生物であるビール酵母の判別、並びに該ビールの副原料であるホップの判別が可能となる。 According to the present invention, by using a nucleic acid amplification method such as PCR using DNA extracted and purified from beer as a template, it is possible to discriminate the variety of barley that is the main raw material of the beer, discriminate the brewer's yeast that is the fermenting microorganism of the beer, and It is possible to identify hops that are auxiliary materials.
本発明により、ビール製品の判別が可能となる。
本発明により、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲなどの核酸増幅法により、該ビールの品質推定が可能となり、特に、ＤＮＡの増幅結果を２値化して説明変数とし、ビールの呈味性や泡の保持性を目的変数とする重回帰分析などの多変量解析を行うことによって、ビール製品のＤＮＡの増幅結果から該ビールの品質を推定することが可能になる。
According to the present invention, a beer product can be identified.
According to the present invention, it is possible to estimate the quality of the beer by a nucleic acid amplification method such as PCR using DNA extracted and purified from beer as a template, and in particular, binarize the DNA amplification results as explanatory variables, It is possible to estimate the quality of the beer from the result of amplification of the DNA of the beer product by performing multivariate analysis such as multiple regression analysis using the property and foam retention as the objective variables.
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ビール原料又は製品の判別方法
本発明は、第一の態様において、ビール原料又は製品の判別方法であって、該方法が、（ａ）ビール試料から抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で増幅したＤＮＡを検出するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＤＮＡの検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップを含む、方法を提供する。
The present invention will be described in further detail.
1. The discriminating method of a beer raw material or a product The present invention, in the first aspect, is a discriminating method of a beer raw material or a product, the method comprising: (a) using a DNA extracted and purified from a beer sample as a template, Amplifying the DNA separately or simultaneously using a primer group comprising a discrimination primer, a plurality of hop discrimination primers and a plurality of brewer's yeast discrimination primers; (b) the DNA amplified in step (a) And (c) providing a method including the step of determining the types of barley, brewer's yeast, and hops, which are raw materials used in the production of beer, based on the detection results of DNA in step (b). .
プライマーを個別に用いるか、或いは組み合わせて用いるかは、同じ泳動条件下で増幅産物が作るラダーのサイズ位置が重なり合わないことが前提となる。そのためには、予め各プライマーを個別に用いて、目的の遺伝子を増幅し、増幅産物のサイズ位置を確認しておくことが必要である。 Whether the primers are used individually or in combination is based on the premise that the size positions of the ladders produced by the amplification products do not overlap under the same electrophoresis conditions. For this purpose, it is necessary to amplify the target gene using each primer individually in advance and confirm the size position of the amplified product.
本明細書中「ビール」とは、大麦の麦芽の酵素活性によって大麦の澱粉を分解し、精製する糖質を酵母によって発酵させてアルコールと二酸化炭素を生成させ、添加したホップによって発酵を調整するとともに、特有の風味を付与した世界で幅広く楽しまれている飲料であり、ドイツ、ベルギー、イギリス、アイルランド、オーストリア、チェコ、米国、中国、韓国、日本等の世界各国で醸造され、ピルスナー、ヴィエナ、デュンケル、ボック、ホワイトエール、ランビック、ストロングエール、セゾン、ペールエール、ブラウンエール、スタウト、ケルシュ、ヴァイツェン、フルーツビール、酒イーストビ−ルなど、各種のスタイルがあり、発酵方法によって上面発酵ビール、下面発酵ビールがある。 In this specification, “beer” refers to the decomposition of barley starch by the enzymatic activity of barley malt, fermenting the sugar to be purified by yeast to produce alcohol and carbon dioxide, and adjusting the fermentation by the added hops. In addition, it is a beverage that is enjoyed widely in the world with a unique flavor, brewed in countries such as Germany, Belgium, United Kingdom, Ireland, Austria, Czech, United States, China, Korea, Japan, Pilsner, Vienna, There are various styles such as Dunkel, Bock, White Ale, Lambic, Strong Ale, Saison, Pale Ale, Brown Ale, Stout, Kelsch, Weizen, Fruit Beer, Liquor East Beer, etc. There is beer.
本明細書中「大麦」とは、学名Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．の単子葉植物の種子を指し、国内で栽培されている二条大麦の例としては、あまぎ二条、アサカゴールド、ミハルゴールド、ほうしゅん、九州二条１６号、ニシノゴールド、ダイセンゴールド、きぬゆたか、ミサトゴールデン、スカイゴールデン、なす二条、おうみゆたか、とね二条、みょうぎ二条、はるな二条、きぬか二条、ミカモゴールデン、さきたま二条、タカホゴールデン、ニューゴールデン、ニシノチカ、ニシノホシ、はるしずく、りょうふう、ほしまさり、小春二条など、外国産二条大麦の例としては、ハリントン、パラス、ボーディン、フラッグシップ、マリータイム、ハメリン、メトカーフ、スターリング、スクーナなどを挙げることができる。
In this specification, “barley” means the scientific name Hordeum vulgare L. Examples of Nijo barley grown in Japan are as follows: Amagi Nijo, Asaka Gold, Miharu Gold, Hoshu,
本明細書中「ビール酵母」とは、一般にビール醸造に使用される酵母を指し、生物学的分類でいうと、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）が挙げられ、歴史的には、「上面ビール酵母」と「下面ビール酵母」との区別は、ビール醸造過程で発酵後に見られるビール酵母の動態（表面付近に浮き上がる又は凝集して沈む）により区別されてきたが、今現在、当業者間では、下面ビール酵母と上面ビール酵母とは生物学的分類において異なる種であり、上面ビール酵母は主としてサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類され、下面ビール酵母はサッカロミセス・セレビシアエとサッカロミセス・バヤナス（Ｓ． ｂａｙａｎｕｓ）との交雑体であってサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）に分類されるという見解が一般的となっており、本明細書において「ビール酵母のゲノムＤＮＡ」とは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡに加えて、サッカロミセス・バヤナス（Ｓ． ｂａｙａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡをも含むものとする。 In this specification, “beer yeast” refers to yeast generally used for brewing beer, and in terms of biological classification, examples include Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastorianus. Historically, the distinction between “upper brewer's yeast” and “lower brewer's yeast” has been distinguished by the dynamics of brewer's yeast (floating near the surface or agglomerating and sinking) seen after fermentation in the brewing process. Now, among those skilled in the art, the lower brewer's yeast and the upper brewer's yeast are different species in biological classification, the upper brewer's yeast is mainly classified as S. cerevisiae, and the lower brewer's yeast is Saccharomyces.・It is a common view that Leviciae is a hybrid of S. bayanus and is classified as S. pastorianus. In this specification, “genomic DNA of beer yeast” In addition to Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) and Saccharomyces pastorianus (Saccharomyces pastorianus), it also includes the genomic DNA of Saccharomyces bayanus.
本明細書中の「ホップ」について、本発明において識別対象となる世界の主な栽培ホップ品種としては、ドイツのファインアロマ、アロマに属するＨｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ，Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ，Ｓｐａｌｔｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ，Ｐｅｒｌｅ，Ｔｅｔｔｎａｎｇｅｒ、ビターに属するＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｒｅｗｅｒ，Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｇｏｌｄ，Ｍａｇｎｕｍ、チェコのファインアロマに属するＳａａｚｅｒ、ビターに属するＢｏｒ、フランスのアロマに属するＳｔｔｒｉｓｓｅｌ Ｓｐａｌｔ、ポーランドのアロマに属するＬｕｂｌｉｎ、スロベニアのアロマに属するＳａｖｉｎｊｓｋｉ．Ｇｏｌｄｉｎｇ、ビターに属するＳｕｐｅｒ Ｓｔｙｒｉａｎ、米国のアロマに属するＦｕｇｇｌｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｅｔｔｎａｎｎｇｅｒ，Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｌｉｂｅｒｔｙ、ビターに属するＮｕｇｇｅｔ，Ｃｌｕｓｔｅｒ，ｃｈｉｎｏｏｋ，Ｇａｌｅｎａ、ニュージーランドのアロマに属するＰａｃｉｆｉｃ．Ｈａｌｌｅｒｔａｕ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、ビターに属するＧｒｅｅｎ．Ｂｕｌｌｅｔ，Ｓｔｉｃｋｌｅ Ｂｒａｃｔ、オーストラリアのＰｒｉｄｅ ｏｆ Ｒｉｎｇｗｏｏｄ、日本のビターに属するキリン２号，とよみどり，きたみどり，イースタンゴールドを挙げることができる。これらのホップの葉、毬花、又は毬花のペレットやベールから、ＰＣＲを適用する場合の鋳型となるゲノムＤＮＡが抽出・精製されることになるが、現在使用されているホップの殆どはペレットに加工（粉砕したのち圧縮）されている。 Regarding the “hop” in the present specification, the main cultivated hop varieties in the world to be identified in the present invention include German fine aroma, Hersbrucker, Hallertauer Tradition, Hallertauer, Sparter Select, Perle, Tettanger, bitter belonging to aroma. North Brewer, Brewers Gold, Magnum, Sazer belonging to Czech fine aroma, Bor belonging to bitter, Strissel Spalt belonging to French aroma, Lublin belonging to Polish aroma, Savinjsk belonging to Slovenia aroma. Golding, Super Styrian belonging to Bitter, Fugle, American Tettnanger, Willamette, Crystal, Liberty belonging to Bitter, Nugget, Cluster, chinook, Galena belonging to Bitter, P. aroma of New Zealand. Hallertau, New Zealand Hallertau, Green. You can list Bullet, Stickle Brat, Australian Pride of Ringwood, Kirin No. 2 belonging to Japanese bitter, Tomidori, Kitamidori and Eastern Gold. From these hop leaves, spikelets, or pellets and veils of spikelets, the genomic DNA that serves as a template for PCR is extracted and purified, but most of the hops currently used are pellets. It is processed (compressed after crushing).
本発明の方法は、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別することによって、ビール原料の判別だけでなくビール製品の判別も可能にする。これは、ビール試料から鋳型ＤＮＡを精製する技術を改良したことと、大麦、ビール酵母及びホップに関連する遺伝子群から判別に有利な特定の遺伝子群を選抜したことに基いている。 The method of the present invention makes it possible not only to discriminate beer materials but also to identify beer products by discriminating the types of barley, brewer's yeast, and hops that are raw materials used in the production of beer. This is based on the improvement of the technology for purifying template DNA from beer samples and the selection of specific gene groups advantageous for discrimination from the gene groups related to barley, brewer's yeast and hops.
１．１．鋳型ＤＮＡの調製
ビール試料からの鋳型ＤＮＡの精製は、以下の（ａ１）〜（ａ３）のステップ
（ａ１）ビール試料に澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解するステップ、
（ａ２）ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収するステップ、並びに
（ａ３）ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収するステップ、
を含む方法によって行うことができる。
1.1. Preparation of template DNA Purification of template DNA from a beer sample includes the following steps (a1) to (a3): (a1) Starch, starch degradation product and protein are allowed to act on a beer sample by causing amylolytic enzyme and proteolytic enzyme to act. Disassembling step,
(A2) a step of recovering DNA from the treatment liquid of step (a1), and (a3) adsorbing DNA from step (a2) using a DNA-adsorbing solid phase carrier and recovering the DNA from the solid phase carrier Step to do,
Can be carried out by a method comprising:
この方法は、ＣＴＡＢ法、アルカリフェノール法、ＩＳＯＰＬＡＮＴキット法、キアゲンキット法、タカラキット法、及び日本特許第４９５３０５８号に記載の方法と比較して、高分子量の鋳型ＤＮＡを調製することが可能であり、しかもＤＮＡ精製度が高く、ビール中に極微量しか残存しない原料大麦、発酵微生物である酵母、副原料であるホップのＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、判別することを可能にするという利点をもたらす。 Compared with the method described in the CTAB method, the alkali phenol method, the ISOPLANT kit method, the Qiagen kit method, the Takara kit method, and Japanese Patent No. 4953058, a high molecular weight template DNA can be prepared. There is also the advantage that it is possible to amplify and discriminate DNA of raw barley, yeast that is a fermenting microorganism, and hops that are secondary raw materials by PCR, which has a high degree of DNA purification and remains in beer in beer. .
ステップ（ａ１）では、核酸以外の主要成分である澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を除去する。ビール試料を凍結乾燥して、水以外の成分を回収する。具体的には、凍結したビールの環境気圧を真空ポンプを使用して下げることにより、ビールが融解しない低温で水を昇華させて乾燥を行い、粉末を得る。その後、該粉末をＤＮＡ溶解用緩衝液に溶解して澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させる。 In step (a1), starch, starch degradation products, and proteins, which are main components other than nucleic acids, are removed. The beer sample is lyophilized to recover components other than water. Specifically, by lowering the ambient pressure of frozen beer using a vacuum pump, water is sublimated and dried at a low temperature at which the beer does not melt to obtain a powder. Thereafter, the powder is dissolved in a buffer solution for dissolving DNA, and amylolytic enzyme and proteolytic enzyme are allowed to act.
ＤＮＡ溶出用緩衝液として、例えば、グリシン・塩酸、クエン酸・リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス・塩酸、ホウ酸、グリシン・水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム・水酸化ナトリウムなどの各種の緩衝液、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの広域緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液などに、たとえば、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピックイオン及び／又はラウリル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、コール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を０．０５重量％〜１０重量％加えた緩衝液を挙げることができる。カオトロピックイオンや界面活性剤を添加することによって、ＤＮＡ分解酵素の反応を抑制しながらタンパク質分解を行うことができる。
Various buffer solutions such as glycine / hydrochloric acid, citric acid / sodium phosphate, sodium phosphate, tris / hydrochloric acid, boric acid, glycine / sodium hydroxide, sodium bicarbonate / sodium hydroxide, etc. Britton and Robinson's broad buffer solution, Good's buffer solution, for example, chaotropic ions such as guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, guanidine thiocyanate and / or sodium lauryl sulfate, Triton X-100, sodium cholate,
本発明における澱粉分解のために、アミラーゼ（例えばαアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ）などの澱粉分解酵素、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等の耐熱性アミラーゼを用いることができる。耐熱性アミラーゼは、市販のもの、例えばαアミラーゼ（米国セントルイスのシグマアルドリッチ社製）を使用することができる。また、タンパク質分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、パパイン、フィシン、ブロメラインなどの各種のタンパク質分解酵素を使用することができるが、ＳＤＳ存在下でタンパク質を分解できるプロテイナーゼＫが好ましい。プロテイナーゼＫは、真菌類Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ由来のセリンプロテアーゼであり、タカラバイオ社、インビトロジェン社などから販売されている。これらの酵素による処理は、例えば、ビール粉末２５０ｍｇをＤＮＡ溶出用緩衝液２．５ｍＬに溶解し、澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を酵素活性を発現する適量添加し、前者は温度８０℃にて、後者は温度50℃にて、それぞれ６０分間反応することによって行うことができる。 For the starch decomposition in the present invention, a starch-degrading enzyme such as amylase (for example, α-amylase, β-amylase, glucoamylase), for example, a thermostable amylase such as Bacillus licheniformis can be used. As the thermostable amylase, a commercially available product such as α-amylase (manufactured by Sigma Aldrich, St. Louis, USA) can be used. As the proteolytic enzyme, various proteolytic enzymes such as pepsin, trypsin, chymotrypsin, subtilisin, papain, ficin, and bromelain can be used, and proteinase K that can degrade proteins in the presence of SDS is preferable. Proteinase K is a serine protease derived from the fungus Triturachium album and is sold by Takara Bio Inc., Invitrogen Corp., and the like. In the treatment with these enzymes, for example, 250 mg of beer powder is dissolved in 2.5 mL of DNA elution buffer, and amylolytic enzyme and proteolytic enzyme are added in appropriate amounts to express enzymatic activity. The former is at a temperature of 80 ° C. The latter can be carried out by reacting each at 60 ° C. for 60 minutes.
ステップ（ａ２）では、ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収する。
具体的には、酵素処理した後、処理液からＤＮＡをアルコール（約９９％エタノールが好ましい）で沈殿させ、遠心分離で沈殿として回収し、氷上で７０％エタノールでＤＮＡを溶出（若しくは、抽出）し、次いでフェノール処理を施し、クロロホルム／イソアミルアルコール処理によってＤＮＡを精製する。或いは、このステップにおいて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールに代えて、フェノール／クロロホルム（通常、容量比約１：１）溶液を用いて抽出を行うこともできる。イソアミルアルコールを使用することによって、クロロホルムだけの場合と比べて水との相容性がよくなるため、有機溶媒相と水相の分離がしやすくなる。イソアミルアルコール：クロロホルムの容量比は、通常、約１：２５でよい。さらにまた、ＤＮＡを沈殿させるためのアルコールとしては、通常、エタノール又は（イソ）プロパノールが使用される。このステップでの７０％エタノールによるＤＮＡの溶出は、以下のステップ（ａ３）（特にＤＮＡ吸着性固相担体の使用）とともに、ビールからのＤＮＡの回収にとって重要である。７０％エタノールによるＤＮＡの溶出では、色素の溶出を避けるために、３分以内の処理が望ましい。このときのエタノール濃度は、６８％〜７２％でよいが、最適濃度は７０％であり、残部は水である。
In step (a2), DNA is recovered from the treatment liquid in step (a1).
Specifically, after enzyme treatment, DNA is precipitated from the treatment solution with alcohol (preferably about 99% ethanol), recovered as a precipitate by centrifugation, and DNA is eluted (or extracted) with 70% ethanol on ice. And then phenol treatment and DNA purification by chloroform / isoamyl alcohol treatment. Alternatively, in this step, extraction can be carried out using a phenol / chloroform (usually about 1: 1 volume ratio) solution instead of phenol / chloroform / isoamyl alcohol. By using isoamyl alcohol, the compatibility with water is improved as compared with the case of chloroform alone, so that the organic solvent phase and the aqueous phase are easily separated. The volume ratio of isoamyl alcohol: chloroform can usually be about 1:25. Furthermore, ethanol or (iso) propanol is usually used as the alcohol for precipitating DNA. The elution of DNA with 70% ethanol in this step is important for the recovery of DNA from beer, together with the following step (a3) (especially the use of a DNA-adsorbing solid phase carrier). In elution of DNA with 70% ethanol, treatment within 3 minutes is desirable to avoid elution of the dye. The ethanol concentration at this time may be 68% to 72%, but the optimum concentration is 70%, and the balance is water.
上記ステップの後、必要に応じてＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）によってＲＮＡを分解除去してもよい。 After the above steps, RNA may be decomposed and removed by RNase if necessary.
ステップ（ａ３）では、ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収する。このステップもまた、ビールからのＤＮＡの効率的な回収のために重要かつ必須である。 In step (a3), the DNA from step (a2) is adsorbed using a DNA-adsorbing solid phase carrier, and the DNA is recovered from the solid phase carrier. This step is also important and essential for efficient recovery of DNA from beer.
ＤＮＡ吸着性固相担体として、例えばガラス又は金属（例えば磁性金属）製の任意の形状体を挙げることができる。形状体として好ましいのは、操作性や回収し易さの点で、微小球状体（すなわち、ビーズ）である。 Examples of the DNA-adsorbing solid phase carrier include any shape made of glass or metal (for example, magnetic metal). The shape body is preferably a microsphere (that is, a bead) in terms of operability and ease of collection.
具体的には、ＤＮＡを磁性ビーズに吸着させ、ビーズをマグネットによって溶液部分から分離した後、塩を含むエタノール又は（イソ）プロパノール溶液で洗浄し、次いでＤＮＡ溶出液で該磁性ビーズからＤＮＡを脱着させて精製する。得られたＤＮＡは、ＴＥ（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）バッファーに溶解して鋳型ＤＮＡとする。ＤＮＡ溶出液としては、純水、ＴＥ、０．５Ｍ以下の塩（ＮａＣｌなど）を含む緩衝液などを挙げることができる。 Specifically, after adsorbing DNA to magnetic beads, separating the beads from the solution portion with a magnet, washing with ethanol or (iso) propanol solution containing salt, then desorbing DNA from the magnetic beads with DNA eluate And purify. The obtained DNA is dissolved in TE (Tris / EDTA) buffer to form template DNA. Examples of the DNA eluate include pure water, TE, and a buffer solution containing 0.5 M or less salt (such as NaCl).
１．２．ＤＮＡの増幅及び検出
上記のステップ（ａ）では、ビール試料から得られたＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅する。
1.2. Amplification and detection of DNA In the above step (a), each primer comprising a plurality of barley discrimination primers, a plurality of hop discrimination primers, and a plurality of beer yeast discrimination primers using DNA obtained from a beer sample as a template The DNA is amplified using groups separately or simultaneously.
本発明の方法では、ビールから抽出及び精製したＤＮＡを鋳型とし、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーの３種類を用いるＰＣＲなどの核酸増幅法によって、原料大麦、ホップ及びビール酵母の３種類を同時に判定することを特徴とする。 In the method of the present invention, DNA extracted and purified from beer is used as a template, and nucleic acid amplification methods such as PCR using a barley discrimination primer, a hop discrimination primer, and a brewer's yeast discrimination primer, the raw material barley, hop and It is characterized by simultaneously determining three types of brewer's yeast.
核酸増幅法は、ＤＮＡ増幅可能な任意の方法であり、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｔ． Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２０００， ２８（２）：Ｅ６３）、ＩＣＡＮ法（等温遺伝子増幅法）などを挙げることができる。 The nucleic acid amplification method is an arbitrary method capable of amplifying DNA, for example, PCR (Polymerase Chain reaction) method, LAMP (Loop-Mediated Isolation Amplification) method (T. Notomi et al. Nucleic Acid Res. 2000, 28 (28)). : E63), ICAN method (isothermal gene amplification method) and the like.
ＰＣＲ法は、一般的な核酸増幅法であり、プライマー群のうちの１種類又は２種類以上のプライマー共存下で、変性、アニーリング、伸長の３反応からなるサイクルを反復することによってプライマー結合部分に挟まれたＤＮＡを増幅する反応を指し、具体的には、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする約９４℃での変性ステップ、プライマーを鋳型ＤＮＡに結合させる約３５〜６８℃でのアニーリングステップ、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなど）を使用して鋳型に沿ってプライマーを伸長させる約７２℃での伸長ステップを１サイクルとして約２０〜４０サイクル繰り返すことを含む。 The PCR method is a general nucleic acid amplification method. In the presence of one or more primers in the primer group, the PCR is performed on the primer binding portion by repeating a cycle consisting of three reactions of denaturation, annealing, and extension. This refers to a reaction for amplifying the sandwiched DNA, specifically, a denaturation step at about 94 ° C. to make double-stranded DNA into a single strand, and an annealing step at about 35 to 68 ° C. to bind the primer to the template DNA And repeating the extension step at about 72 ° C. for extending the primer along the template using a thermostable DNA polymerase (eg, Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, etc.) as a cycle for about 20 to 40 cycles.
ＬＡＭＰ法は、変性反応を不要とし、６０〜６５℃の定温で増幅反応をすることができる。この方法では、最初の増幅産物のプライマー結合部位にループ構造を生じるようにプライマーが設計される。 The LAMP method does not require a denaturation reaction and can carry out an amplification reaction at a constant temperature of 60 to 65 ° C. In this method, the primer is designed to produce a loop structure at the primer binding site of the initial amplification product.
ＩＣＡＮ法は、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを用いて等温（約５０〜６０℃）でＤＮＡを増幅する方法である。 The ICAN method is a method of amplifying DNA isothermally (about 50 to 60 ° C.) using an RNA / DNA chimera primer, a DNA polymerase having strand displacement activity and template exchange activity, and RNaseH.
プライマーの塩基数は、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２１〜２４塩基である。
増幅反応に使用されるプラーマーは、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーである。各プライマーの具体例は、以下のとおりである。
The number of bases of the primer is usually 19 to 30 bases, preferably 21 to 24 bases.
The primers used in the amplification reaction are a plurality of barley discrimination primers, a plurality of hop discrimination primers, and a plurality of brewer's yeast discrimination primers. Specific examples of each primer are as follows.
＜大麦判別用プライマー＞
複数の大麦判別用プライマーは、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種、好ましくは全種、の遺伝子のプライマーである。
<Barley discrimination primer>
Barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene, barley protein Z gene, barley α-amylase gene, barley β-amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley macular mosaic virus-derived gene A barley powdery mildew-derived gene, a barley trypsin inhibitor gene, a barley cellulase gene, and a barley β-glucanase gene and a barley β-amylase gene detection primer. , A gene primer.
ここで、大麦ホルデイン遺伝子は、ホルデインＡ遺伝子、ホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子、又はそれらの組み合わせであり、好ましくは３種の遺伝子の組み合わせである。 Here, the barley hordein gene is a hordein A gene, a hordein B gene, a hordein C gene, or a combination thereof, and preferably a combination of three kinds of genes.
また、大麦プロテインＺ遺伝子は、プロテインＺ７、プロテインＺ４遺伝子、又はそれらの組み合わせ、好ましくは２種の遺伝子の組み合わせである。
また、大麦澱粉合成酵素遺伝子は、大麦澱粉粒結合性澱粉合成酵素遺伝子である。
The barley protein Z gene is protein Z7, protein Z4 gene, or a combination thereof, preferably a combination of two genes.
The barley starch synthase gene is a barley starch granule-binding starch synthase gene.
複数の大麦判別用プライマーとして、例えば、少なくとも、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子（ホルデインＡ遺伝子及びホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子）、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子（プロテインＺ７遺伝子及びプロテインＺ４遺伝子）の検出用プライマーを使用するときには、後述の表２の結果から明らかなように、表に示した試験した大麦品種のすべてを識別することができる。 As a plurality of barley discrimination primers, for example, at least barley polygalacturonase gene, barley hordein gene (hordein A gene and hordein B gene, hordein C gene), barley starch synthase gene and barley protein Z gene (protein Z7 gene) And protein Z4 gene) detection primers, all of the tested barley varieties shown in the table can be identified, as is apparent from the results in Table 2 below.
上記の遺伝子を検出するためのプラマー配列は、個々の遺伝子に特徴的な配列であれば、特に制限されない。以下に上記遺伝子を検出するためのプライマー対（正方向プライマー（Ｆ）及び逆方向プライマー（Ｒ））を例示するが、遺伝子検出用プライマーは例示の特定のプライマーに限定されないものとする。 The plummer sequence for detecting the above gene is not particularly limited as long as it is a sequence characteristic of each gene. Examples of the primer pair (forward primer (F) and reverse primer (R)) for detecting the gene will be described below, but the gene detection primer is not limited to the specific primer illustrated.
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４、配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなる（表１）。 The barley polygalacturonase gene detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the barley hordein gene detection primer pair consists of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 25 and / or consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the primer pair for detecting the barley starch synthase gene consists of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27, and the primer for detecting the barley protein Z gene Primers for detection of barley α-amylase gene consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31 The pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the primer pair for detection of the barley lipoxygenase gene is SEQ ID NO: 1. And the detection primer pair of the barley yellow mosaic virus-derived gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34, and the detection primer pair of the barley powdery mildew-derived gene has the sequence No. 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, the barley trypsin inhibitor gene detection primer pair consists of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, and the barley cellulase gene The detection primer pair consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and the detection primer pair of the barley β-glucanase gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39 (Table 1).
これらの特定のプライマー配列の基になった遺伝子の配列は、米国ＮＣＢＩのＤＮＡデータバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）やＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）等から入手可能であり、ここでＤＤＢＪによる遺伝子と登録番号（塩基配列）との関係は以下のとおりである。
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、ＥＦ４２７９１９
大麦ホルデインＡ遺伝子、ＡＦ４７４３７３
大麦ホルデインＢ遺伝子、Ｑ４００２０
大麦ホルデインＣ遺伝子、Ｑ４００２０
大麦澱粉合成酵素遺伝子、Ｘ０７９３１
大麦プロテインＺ７遺伝子、Ｘ９５２７７
大麦プロテインＺ４遺伝子、Ｐ０６２９３
大麦αアミラーゼ遺伝子、ＡＦ４２７７９１
大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、Ｌ３５９３１
大麦うどんこ病菌由来遺伝子、Ｑ４３４９２
大麦トリプシンインヒビター遺伝子、Ｘ６５８７５
大麦β―グルカナーゼ遺伝子、ＥＵ２６７１８１
The gene sequences that are the basis of these specific primer sequences are available from the NCBI DNA Data Bank (GenBank), DDBJ (Japan DNA Data Bank), etc., where the DDBJ gene and registration number (base The relationship with (array) is as follows.
Barley polygalacturonase gene, EF427919
Barley hordein A gene, AF474373
Barley hordein B gene, Q40020
Barley hordein C gene, Q40020
Barley starch synthase gene, X07931
Barley protein Z7 gene, X95277
Barley protein Z4 gene, P06293
Barley α-amylase gene, AF427791
Barley lipoxygenase gene, L35931
Barley powdery mildew-derived gene, Q43492
Barley trypsin inhibitor gene, X65875
Barley β-glucanase gene, EU267181
上記の遺伝子を検出するためのプライマーは、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いて上記遺伝子（上記登録番号の塩基配列）のコード領域に由来する配列から好ましく選択されてもよく、或いは、上記遺伝子を特異的に検出可能にするならば非コード領域由来の配列から選択されてもよい。非コード領域の例として、イントロン領域、３'−非翻訳領域又は５'−非翻訳領域が挙げられる。 The primer for detecting the gene is preferably selected from sequences derived from the coding region of the gene (base sequence of the registration number) based on the registered base sequence, in addition to the specific primer sequence described above. Alternatively, it may be selected from a sequence derived from a non-coding region if the gene can be specifically detected. Examples of non-coding regions include intron regions, 3′-untranslated regions or 5′-untranslated regions.
＜ホップ判別用プライマー＞
ホップ判別用プライマーは、例えばアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーから選択されうる。
<Primer for hop discrimination>
The primer for hop discrimination can be selected from, for example, a primer for detecting a hop gene belonging to an aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to a fine aroma, and a primer for detecting a hop gene belonging to a bitter.
ホップ判別用プライマー対の具体例は、配列番号１８と配列番号４０のプライマー対、配列番号１９と配列番号４１のプライマー対及び配列番号２０と配列番号４２のプライマー対から選択されるが、これらのプライマーに限定されないものとする（表１）。 Specific examples of the hop discrimination primer pair are selected from the primer pair of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 40, the primer pair of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 41, and the primer pair of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 42. It is not limited to primers (Table 1).
上記例示のプライマー配列の基になるホップの遺伝子は、たとえば、日本特許第４０９７２８８号に記載されており、該特許文献では、例えば配列番号１（ＣＴＡＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣ）、配列番号２（ＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）、配列番号３（ＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧ）などの番号が付与されている。したがって、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いてプライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅するＤＮＡのコード配列又は非コード配列からプライマー配列を選択することも可能である。 The hop gene used as the basis of the primer sequence exemplified above is described in, for example, Japanese Patent No. 4097288. In this patent document, for example, SEQ ID NO: 1 (CTATTTCGGCTAGTTCTGC), SEQ ID NO: 2 (CTATTTTGGCCAGTTTTGT), SEQ ID NO: 3 A number such as (AGCTGAGCAAGCTTCTTTG) is assigned. Therefore, in addition to the specific primer sequence described above, it is also possible to design a primer based on a registered base sequence, perform PCR, and select a primer sequence from the coding sequence or non-coding sequence of the DNA to be amplified.
＜ビール酵母判別用プライマー＞
ビール酵母判別用プライマーは、例えば上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーから選択されうる。
<Primer for distinguishing beer yeast>
The primer for discriminating beer yeast can be selected from, for example, a primer that makes it possible to distinguish between upper fermenting yeast and lower fermenting yeast and a primer for detecting a yeast thioredoxin gene.
ビール酵母判別用プライマー対の具体例は、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対、及び、配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対から選択されるが、これらのプライマーに限定されないものとする（表１）。 Specific examples of the primer pair for discriminating beer yeast are selected from a primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43 and a primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44. It is not limited to primers (Table 1).
上記例示のプライマー配列の基になるビール酵母の遺伝子は、ＤＤＢＪやＧｅｎＢａｎｋに登録されており、例えばＡＢ３００４０９、Ｕ４０８４３などの登録番号が付与されている。したがって、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いて該遺伝子のコード配列又は非コード配列からプライマー配列を選択することも可能である。
上記ステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で増幅されたＤＮＡを検出する。
The brewer's yeast genes that serve as the basis for the primer sequences exemplified above are registered in DDBJ and GenBank, and given registration numbers such as AB300409 and U40843, for example. Therefore, in addition to the specific primer sequence described above, it is also possible to select a primer sequence from the coding sequence or non-coding sequence of the gene based on the registered base sequence.
In step (b) above, the DNA amplified in step (a) is detected.
ＤＮＡの検出は、一般に、電気泳動によって行うことができる。電気泳動は、目的のＤＮＡの検出が可能であれば、いかなる泳動条件で行ってもよい。ゲルの種類としては、一般に、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを使用することができる。 In general, DNA can be detected by electrophoresis. Electrophoresis may be performed under any electrophoresis conditions as long as the target DNA can be detected. In general, polyacrylamide gel, agarose gel, or the like can be used as the type of gel.
泳動条件の具体例としては、２％アガロースゲルを用い、電気泳動装置はコスモバイオ（株）製ミューピッドを使用し、直流電圧１００Ｖで３０分間泳動した。 As a specific example of the electrophoresis conditions, a 2% agarose gel was used, and the electrophoresis apparatus used was a mupid manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd., and the electrophoresis was performed at a DC voltage of 100 V for 30 minutes.
上記遺伝子の増幅産物を、上記のような所定の泳動条件を用いる電気泳動にかけることによって、特定の分子量サイズの位置のバンドとして検出することができる。このとき、通常、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含有する泳動バッファーを使用して電気泳動を行ったのち、ゲルを取り出し、紫外線を照射すると、バンドが視覚化可能になる。ＥｔＢｒは、ＤＮＡの二本鎖の間に入り込む性質があるため、ＤＮＡの検出を可能にする。 The amplification product of the gene can be detected as a band at a specific molecular weight size by subjecting it to electrophoresis using the predetermined electrophoresis conditions as described above. At this time, usually, electrophoresis is performed using an electrophoresis buffer containing ethidium bromide (EtBr), and then the gel is taken out and irradiated with ultraviolet rays, the band can be visualized. EtBr allows DNA to be detected because it has the property of entering between the double strands of DNA.
上記ステップ（ｃ）では、ビール試料中に存在すると推定される上記の大麦、ホップ及びビール酵母由来の複数の遺伝子についての検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ホップ及びビール酵母の種類を判別する。 In the step (c), barley and hops, which are raw materials used for the production of beer, based on the detection results of the barley, hop and a plurality of genes derived from brewer's yeast presumed to be present in the beer sample And the type of brewer's yeast.
必要であれば、増幅産物の塩基配列を決定し、目的の遺伝子の既知の塩基配列とアラインメントし、増幅産物が目的遺伝子であることを確認することができる。 If necessary, the base sequence of the amplification product can be determined and aligned with the known base sequence of the target gene to confirm that the amplification product is the target gene.
後述の表３に、市販される２２種類のビールについて、上記のプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行ったときの、目的遺伝子の有無（＋、−）を判定した結果を示した。これによると、試験した２２種類のすべてのビールの種類を、使用されたビール原料（大麦の品種（表２）、発酵に用いるビール酵母の種類、副原料としてのホップの種類）とともに、本発明の方法によって判別することができることを、表３の結果は示している。特に、主原料である大麦の品種（１６種類）の判別を可能にする。また、ビール原料及びビール製品を判別できることから、本発明の方法は、特に原料面からビールの製造条件を推定することを可能にする。 Table 3 described below shows the results of determining the presence or absence (+, −) of the target gene when PCR was performed using the above-described primers (Table 1) for 22 types of beer commercially available. According to this, all 22 types of beer tested, together with the beer raw materials used (barley variety (Table 2), types of brewer's yeast used for fermentation, types of hops as an auxiliary material), the present invention The results in Table 3 show that the determination can be made by the method. In particular, it is possible to distinguish barley varieties (16 types) as the main raw material. In addition, since the beer raw material and the beer product can be distinguished, the method of the present invention makes it possible to estimate the production conditions of beer from the raw material side.
２．ビールの品質評価
本発明はまた、第二の態様において、ビール品質の評価方法を提供する。この方法は、上記の方法において大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを用いる核酸増幅法によって決定された、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップ、並びに、該判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性（さらに、のどごしなど）からなる品質を総合的に評価するステップを含む。
2. In the second aspect, the present invention also provides a method for evaluating beer quality. In this method, the barley, brewer's yeast, and hops, which are the raw materials used in the production of beer, determined by the nucleic acid amplification method using the barley discriminating primer, the hop discriminating primer, and the brewer's yeast discriminating primer in the above method. A step of discriminating the type, and a step of comprehensively evaluating the quality of the beer's taste and foaming retention properties (further, such as throat squeezing) using the discrimination result.
大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである。 Barley discrimination primers are: barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene, barley protein Z gene, barley α-amylase gene, barley β-amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley macular mosaic virus-derived gene, barley Primers for all kinds of genes selected from the group consisting of detection genes for powdery mildew-derived genes, barley trypsin inhibitor gene, barley cellulase gene, and barley β-glucanase gene. A primer for detecting a hop gene belonging to an aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to a fine aroma, and a primer for detecting a hop gene belonging to a bitter, and a primer for discriminating brewer's yeast. A 酵酵 mother and bottom fermenting yeast is a detection primer of the primer and yeast thioredoxin gene to allow identification.
具体的には、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である。 Specifically, the barley polygalacturonase gene detection primer pair is composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the barley hordein gene detection primer pair is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, sequence Bare protein Z consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 25 and / or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the primer pair for detection of barley starch synthase gene consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27 The gene detection primer pair comprises the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31, and barley α-amylase The gene detection primer pair is composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the barley lipoxygenase gene detection primer pair is A primer pair for detecting a barley yellow mosaic virus-derived gene consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 33, comprising a base sequence of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34, and a primer pair for detecting a barley powdery mildew-derived gene Is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, and the primer pair for detection of the barley trypsin inhibitor gene is composed of the base sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, The cellulase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and the barley β-glucanase gene detection primer pair consists of the base sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39, and hop discrimination Primer for primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 19 and a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 41, a primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 42, and the primer for discriminating beer yeast is the base sequence of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43 And a primer pair consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44.
大麦の品種判別又は醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号１〜１７のプライマーのうちの２種類以上、好ましくは７種類以上から全種類、のプライマー、ホップの品種判別又は醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号１８、１９，２０のうちの２種類以上のプライマー、ビール酵母の菌種判別又はビール醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号２１，２２のうちの２種類のプライマーである。好ましくは、大麦、ホップ及びビール酵母の表１に記載の全てのプライマーの使用がよい。 Primers for discriminating varieties or brewing aptitudes of barley are, for example, two or more, preferably 7 or more to all types of primers of SEQ ID NOs: 1 to 17 in Table 1, hop cultivar discrimination or brewing aptitude The primer for discrimination is, for example, two or more kinds of primers of SEQ ID NOS: 18, 19, and 20 in Table 1, and the primer for discriminating the strain of beer yeast or beer brewing suitability is, for example, SEQ ID NO: 21, Two of 22 primers. Preferably, all the primers listed in Table 1 for barley, hops and brewer's yeast are used.
ビール原料及び製品を判別するために使用した、大麦、ホップ及びビール酵母由来の複数の遺伝子の存在についての増幅ＤＮＡの有無の結果を、２２種類のビールにおける苦み、酸味、渋味、旨味、泡の保持力等の特性の程度と組み合わせてグラフ化するとき、例えば図８、９及び１１に示されるような結果が得られる。このことは、本発明の上記１に記載の方法によって得られた判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性（さらに、のどごしなど）からなる品質を総合的に推定・評価することができることを示している。 The results of the presence or absence of amplified DNA for the presence of a plurality of genes derived from barley, hops and brewer's yeast used to discriminate beer ingredients and products, bitterness, sourness, astringency, umami, foam in 22 types of beer For example, the results shown in FIGS. 8, 9 and 11 are obtained when graphed in combination with the degree of characteristics such as the holding force. This means that the quality of beer's taste and foam retention (further, etc.) can be estimated and evaluated comprehensively using the discrimination results obtained by the method according to 1 of the present invention. It shows what you can do.
すなわち、本発明におけるビールの品質評価の具体例として、ヒトによる官能検査に加えて、人工脂質膜への呈味成分の吸着にともなう膜電位の変化を電気的に検出して味覚認識データとして評価する味覚認識装置（例えば、インテリジェントセンサーテクノロジー社製）による苦み、酸味、渋味、旨味等を目的変数とする品質評価を挙げることができる。 That is, as a specific example of the quality evaluation of beer in the present invention, in addition to the sensory test by humans, the change in membrane potential accompanying the adsorption of the taste component to the artificial lipid membrane is electrically detected and evaluated as taste recognition data Quality evaluation using bitterness, sourness, astringency, umami and the like as objective variables by a taste recognition device (for example, manufactured by Intelligent Sensor Technology).
さらにまた、本発明におけるビールの品質評価の例として、ビールを容器に注いだときの泡の保持力を指標とする品質評価を挙げることができる。 Furthermore, as an example of the quality evaluation of beer in the present invention, there can be mentioned a quality evaluation using as an index the foam holding power when beer is poured into a container.
具体的には、本発明におけるビールの品質評価の例として、味覚認識装置によるビールの呈味性やビールの泡の保持力を目的変数とし、ビールから調製した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲによるＤＮＡ増幅の有無を２値化（たとえば増幅した場合を１、増幅しなかった場合を０とする）して説明変数とし、重回帰分析や主成分分析などの多変量解析によってビールの呈味性、泡保持力などのビールの品質を評価することを挙げることができる（図８〜図１１参照）。 Specifically, as an example of the quality evaluation of beer in the present invention, the presence or absence of DNA amplification by PCR using template DNA prepared from beer with beer taste and beer foam retention by a taste recognition device as target variables Is binarized (for example, 1 for amplified and 0 for non-amplified) as an explanatory variable, and beer taste and foam retention by multivariate analysis such as multiple regression analysis and principal component analysis It can be mentioned that the quality of beer such as is evaluated (see FIGS. 8 to 11).
図８は、味覚認識装置による各種ビール試料の呈味性測定結果の２次元表示を示す。縦軸の数字は苦味の度合い、横軸は酸味の度合いをそれぞれ示しており、プラス（＋）の数字が大きくなるにつれて苦味又は酸味が増加し、逆にマイナス（−）の数字が大きくなるにつれて苦味又は酸味が低下する。また、数字１〜２２は表３に記載の２２種のビールの番号を表す。各ビールについて、味覚認識装置を用いて苦味及び酸味を測定して、それぞれの値をプロットしたのが、この図である。図中、（１）はＬａｇｅｒ ｂｅｅｒの特性範囲であり、（２）はＬｏｗ−ｍａｌｔ ｂｅｅｒの特性範囲であり、（３）はＡｌｅ ｂｅｅｒの特性範囲であり、（４）はｄｒａｆｔ ｂｅｅｒの特性範囲である。図８から、（１）、（２）、（３）および（４）のビールは、従来から言われているように、それぞれ酸味及び苦みにおいて特徴的な味を呈することが判る。
FIG. 8 shows a two-dimensional display of the taste measurement results of various beer samples by the taste recognition device. The number on the vertical axis shows the degree of bitterness, and the horizontal axis shows the degree of sourness. As the positive (+) number increases, the bitterness or sourness increases, and conversely, the negative (-) number increases. Bitterness or sourness decreases.
図９は、味覚認識装置による呈味性（酸味。苦味及び渋み）とＰＣＲ結果（表３の増幅結果（すなわち、＋または−））との関係を示す。３つのグラフについて、縦軸は酸味、苦味又は渋みの実測値（味覚認識装置による測定値）の度合いを示し、横軸は、酸味、苦味又は渋みの推定値の度合いを示す。プラス（＋）の数字が大きくなるにつれて酸味、苦味又は渋みが増加し、逆にマイナス（−）の数字が大きくなるにつれて酸味、苦味又は渋みが低下する。また、数字１〜２２は表３に記載の２２種のビールの番号を表す。Ｒ２は決定係数を表す。これらのグラフでの推定値は、表３のＰＣＲプライマーによる増幅結果（＋又は−）を下記の推定式に代入して算出された値である。
FIG. 9 shows the relationship between the taste (sour taste, bitterness and astringency) by the taste recognition apparatus and the PCR results (amplification results (ie, + or −) in Table 3). About three graphs, a vertical axis | shaft shows the degree of the actual value (measurement value by a taste recognition apparatus) of sourness, bitterness, or astringency, and a horizontal axis shows the degree of the estimated value of sourness, bitterness, or astringency. As the positive (+) number increases, sourness, bitterness or astringency increases. Conversely, as the negative (−) number increases, sourness, bitterness or astringency decreases.
酸味の推定式は、０．５４（６）＋９．２２（７）＋３．１９（２１）＋０．６１（１５）−４．８４（９）−４．４６（１８）−３．５３（２２）−０．４９（８）−０．１１（２０）−０．５８（１９）−１．９８（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））−０．５５（１０）−０．１７（１１）−２．６８（１７）−２．０５である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。 The sourness estimation formula is 0.54 (6) +9.22 (7) +3.19 (21) +0.61 (15) -4.84 (9) -4.46 (18) -3.53 (22 ) -0.49 (8) -0.11 (20) -0.58 (19) -1.98 (1 (or 1a or 1F))-0.55 (10) -0.17 (11)- 2.68 (17) -2.05. Here, the numbers in parentheses are the DNA marker numbers or primer numbers in Table 1, where 1 is when the DNA is amplified, 0 when it is not amplified, and the PCR amplification result in Table 3 is positive (+). In this case, “1” is assigned in parentheses, and in the case of minus (−), “0” is assigned in parentheses.
苦味の推定式は、２．６１（１８）＋１．５９（２２）＋０．４５（２０）＋１．９１（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））＋０．０５（１５）＋３．７２（１７）−１．４１（６）−１．８３（７）−０．３６（９）−１．８５（２１）−０．６７（８）−２．７８（１９）−２．１２（１０）−１．４７（１１）＋０．１０である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。 The estimation formula of bitterness is 2.61 (18) +1.59 (22) +0.45 (20) +1.91 (1 (or 1a or 1F)) + 0.05 (15) +3.72 (17) -1 .41 (6) -1.83 (7) -0.36 (9) -1.85 (21) -0.67 (8) -2.78 (19) -2.12 (10) -1. 47 (11) +0.10. Here, the numbers in parentheses are the DNA marker numbers or primer numbers in Table 1, where 1 is when the DNA is amplified, 0 when it is not amplified, and the PCR amplification result in Table 3 is positive (+). In this case, “1” is assigned in parentheses, and in the case of minus (−), “0” is assigned in parentheses.
渋みの推定式は、０．０６（９）＋０．９１（１８）＋０．４１（２２）＋０．１３（８）＋０．０６（２０）＋０．５２（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））＋０．１３（１５）＋０．９３（１７）−０．３７（６）−０．３９（７）−０．３５（２１）−０．７８（１９）−０．０６（１０）−０．１６（１１）−０．８２である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。 The astringent estimation formula is 0.06 (9) +0.91 (18) +0.41 (22) +0.13 (8) +0.06 (20) +0.52 (1 (or 1a or 1F)) + 0. 13 (15) +0.93 (17) −0.37 (6) −0.39 (7) −0.35 (21) −0.78 (19) −0.06 (10) −0.16 ( 11) -0.82. Here, the numbers in parentheses are the DNA marker numbers or primer numbers in Table 1, where 1 is when the DNA is amplified, 0 when it is not amplified, and the PCR amplification result in Table 3 is positive (+). In this case, “1” is assigned in parentheses, and in the case of minus (−), “0” is assigned in parentheses.
図９から、本発明による方法でビール試料から調製したＤＮＡを鋳型とし、本発明で示す各種のプライマーを用いるＰＣＲの結果に基づく重回帰分析によって、各種のビール試料の酸味、苦みあるいは渋みを推定することが可能であることが判る。 From FIG. 9, the sourness, bitterness or astringency of various beer samples is estimated by multiple regression analysis based on the results of PCR using the DNA prepared from the beer sample by the method according to the present invention as a template and using various primers shown in the present invention. It turns out that it is possible.
図１１は、ビールの泡立ち保持性のＰＣＲ法による推定を示すグラフである。縦軸は実測値であり、横軸は下記の推定式から算出された推定値である。Ｒ２は決定係数を表す。グラフ中の数字は、表３に示す２２種のビールの番号を表す。泡の安定性の推定式は、１４０．６５（７）＋６８．１８（１１）＋２６．２６（９）＋１２．８４（２１）＋１１．２２（２２）＋１１．００（８）＋１．３７（１５）−１．９８（６）−７．３１（１８）−２２．７５（２０）−２０．９５（１９）−１３．７０（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））−８．８１（１０）−４０．３６（１７）＋１２２．３６であり、ここで、括弧内の数字は、表１におけるＤＮＡ ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマー番号を表し、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。 FIG. 11 is a graph showing estimation of beer foam retention by PCR. The vertical axis is an actual measurement value, and the horizontal axis is an estimated value calculated from the following estimation formula. R 2 represents a coefficient of determination. The numbers in the graph represent the numbers of 22 types of beer shown in Table 3. The formula for estimating the stability of the foam is 140.65 (7) +68.18 (11) +26.26 (9) +12.84 (21) +111.22 (22) +11.00 (8) +1.37 (15 ) -1.98 (6) -7.31 (18) -22.75 (20) -20.95 (19) -13.70 (1 (or 1a or 1F))-8.81 (10)- 40.36 (17) +122.36, where the number in parentheses represents the DNA marker number or primer number in Table 1, with 1 when the DNA is amplified and 0 when the DNA is not amplified. If the PCR amplification result of 3 is plus (+), “1” is substituted in parentheses, and if it is minus (−), “0” is substituted in parentheses.
図１１から、各種のビール試料から本発明の方法で調製したＤＮＡを鋳型とする本発明で示したプライマーを用いるＰＣＲ結果に基づく重回帰分析によって、ビールの気泡安定性を推定することが可能であることが判る。 From FIG. 11, it is possible to estimate the bubble stability of beer by multiple regression analysis based on PCR results using the primers shown in the present invention using DNA prepared from various beer samples by the method of the present invention as a template. I know that there is.
これまで、大麦のプロテインＺ（ｓｅｒｐｉｎ）は、ビールの気泡性に影響すると報告されているし（Ｔ． Ｉｉｍｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１， １２２：１９９−２１０）、また、リポキシゲナーゼは、脂質酸化に関係しビール風味の劣化に関係すると言われている。一方、本発明の方法によれば、大麦、ビール酵母及びホップの多数の遺伝子を対象としているため、総合的にビールの品質を評価することができる。 So far, protein Z (serpin) in barley has been reported to affect the foaming properties of beer (T. Imure et al., Theor. Appl. Genetics, 2011, 122: 199-210) and lipoxygenase. Is related to lipid oxidation and to beer flavor deterioration. On the other hand, according to the method of the present invention, since many genes of barley, brewer's yeast and hop are targeted, the quality of beer can be evaluated comprehensively.
３．キット
本発明はまた、第三の態様において、上記１（ビール原料、製造条件又は製品の判別）及び上記２（ビールの品質の評価）に記載の方法で使用するための、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを含むキットであって、大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、キットを提供する。
3. Kit In the third aspect, the present invention also provides a barley discrimination primer for use in the method described in 1 (beer raw material, production conditions or product discrimination) and 2 (beer quality evaluation), A kit comprising a hop discrimination primer and a beer yeast discrimination primer, wherein the barley discrimination primer comprises a barley polygalacturonase gene, a barley hordein gene, a barley starch synthase gene, a barley protein Z gene, a barley α-amylase gene, 2 selected from the group consisting of primers for detecting barley β-amylase gene, barley lipoxygenase gene, barley yellow mosaic virus-derived gene, barley powdery mildew-derived gene, barley trypsin inhibitor gene, barley cellulase gene, and barley β-glucanase gene Genes from all species to all species A primer for detecting a hop gene belonging to an aroma, a primer for detecting a hop gene belonging to a fine aroma, and a primer for detecting a hop gene belonging to a bitter, and a brewer's yeast Provided is a kit in which the discrimination primer is a primer that makes it possible to distinguish between top fermenting yeast and bottom fermenting yeast and a primer for detecting a yeast thioredoxin gene.
大麦判別用プライマーは、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含むことが好ましい。 The barley discrimination primer preferably contains at least a detection primer for barley polygalacturonase gene, barley hordein gene, barley starch synthase gene and barley protein Z gene.
上記プライマーは、具体的に、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３であり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６であり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７であり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１であり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２であり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３であり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４であり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６であり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７であり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８であり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９であり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３のプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４のプライマー対である。 Specifically, the primer pairs for detection of barley polygalacturonase gene are SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 23, and the primer pair for detection of barley hordein gene is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 25 and / or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 26, and the primer pair for detection of barley starch synthase gene is SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 27, and the primer pair for detection of barley protein Z gene Are SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 30 and / or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31, and the primer pair for detection of barley α-amylase gene is a sequence SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 32, and the detection primer pair for the barley lipoxygenase gene is SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 33. A primer pair for detecting a gene derived from zygovirus is SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 34, and a primer pair for detecting a gene derived from barley powdery mildew is SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 36, the barley trypsin inhibitor gene detection primer pair is SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 37, the barley cellulase gene detection primer pair is SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 38, and barley β-glucanase The gene detection primer pair is SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 39, and the hop discrimination primer belongs to a hop gene detection primer belonging to an aroma, a hop gene detection primer belonging to a fine aroma, and a bitter It is a primer for detection of hop genes, and beer yeast size Use primer, a primer pair of primers and SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 43.
プライマーは、一般に１９〜３０塩基長、好ましくは２１〜２４塩基長からなり、例えばホスホロアミダイト法を利用した自動核酸合成機を使用して合成することができる。 The primer generally has a length of 19 to 30 bases, preferably 21 to 24 bases, and can be synthesized using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer utilizing the phosphoramidite method.
キットには、上記プライマーを個々に又は適宜組み合わせて包装した形態で含み、その他に、必要に応じて、ビール試料からのＤＮＡ精製試薬（例えば、ＴＥなどの抽出用バッファー、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノール、（イソ）プロパノールなどの抽出・沈殿用溶媒、磁性ビーズなどのＤＮＡ吸着性固相担体、溶出用バッファーなど）、ＰＣＲなどの核酸増幅用試薬（バッファー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）など）、電気泳動用試薬（ゲル調製用試薬、泳動バッファー、臭化エチジウムなどの検出用試薬など）を適宜含むことができる。 The kit includes the above-mentioned primers individually or appropriately combined and packaged. In addition, if necessary, a DNA purification reagent (eg, extraction buffer such as TE, phenol, chloroform, isoamyl alcohol from beer samples). , Ethanol, (iso) propanol and other extraction / precipitation solvents, magnetic beads and other DNA adsorbent solid phase carriers, elution buffers, etc., and nucleic acid amplification reagents such as PCR (buffers, heat-resistant DNA polymerases, dNTPs (N = A, T, C, G), etc.), and electrophoresis reagents (gel preparation reagents, electrophoresis buffers, detection reagents such as ethidium bromide, etc.) can be included as appropriate.
以下に本発明の実施態様を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
＜ビールからのＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製方法の優位性＞
従来のＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製方法、すなわち、（１）ＣＴＡＢ法、（２）アルカリフェノール法、（３）ＩＳＯＰＬＡＮＴキット法、（４）キアゲンキット法、（５）タカラキット法、（６）日本特許第４９５３０５８号に記載の方法と比較して、本発明の鋳型ＤＮＡ調製方法である「酵素法・ビーズ法複合法」は、高分子量の鋳型ＤＮＡを調製することが可能であり、図１に示すように、糸くず状に析出した。しかもＤＮＡ精製度が高く、ビール中に極微量しか残存しない原料大麦、発酵微生物である酵母、副原料であるホップのＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、判別することが可能であった。
[Example 1]
<Advantage of preparation method of template DNA for PCR from beer>
Conventional methods for preparing template DNA for PCR: (1) CTAB method, (2) alkali phenol method, (3) ISOPLANT kit method, (4) Qiagen kit method, (5) Takara kit method, (6) Japan Compared with the method described in Japanese Patent No. 4953058, the “enzymatic method / bead method combined method”, which is a template DNA preparation method of the present invention, can prepare a high molecular weight template DNA. As shown, it was deposited in the form of lint. Moreover, it was possible to amplify and discriminate the raw barley, the yeast that is a fermenting microorganism, and the hop DNA that is a secondary raw material by PCR, which have a high degree of DNA purification and remain in beer in trace amounts.
具体的な鋳型ＤＮＡ調製方法は以下のとおりである。各種の試料ビールを凍結乾燥した粉末をＤＮＡ溶解用緩衝液に溶解し、耐熱性アミラーゼ及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解した後、遠心分離を行い、上清部分に存在するＤＮＡをフェノール処理及びクロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒（２５：１）処理によって精製した後にアルコール（エタノール）沈殿させ、次いで氷水で冷却しながら７０％エタノールによって溶解するＤＮＡを再度アルコール沈殿させた後にＴＥに溶解し、磁性ビーズにＤＮＡを吸着させ、当該ビーズをマグネットによって溶液部分から分離した後、当該ビーズを塩を含む緩衝液で洗浄し、次いでＤＮＡ溶出液で該ガラスビーズ又は該磁性ビーズからＤＮＡを脱着させて鋳型ＤＮＡとし、大麦判別用プライマー（スターチシンターゼ、表１の配列番号５）共存下でＰＣＲを行った結果を図２及び図３に示す。 The specific template DNA preparation method is as follows. Dissolve the powder obtained by freeze-drying various sample beers in a DNA dissolution buffer, act on heat-resistant amylase and proteolytic enzyme to decompose starch, starch degradation products and protein, then centrifuge and remove the supernatant. Was purified by phenol treatment and chloroform / isoamyl alcohol mixed solvent (25: 1) treatment, followed by alcohol (ethanol) precipitation, and then DNA dissolved in 70% ethanol was alcohol precipitated again while cooling with ice water. After dissolving in TE, adsorbing DNA to magnetic beads, separating the beads from the solution portion with a magnet, washing the beads with a buffer containing salt, and then washing the glass beads or the magnetic beads with a DNA eluate DNA is desorbed from the template to make template DNA, and a barley discrimination primer ( Tachi synthase, results PCR was performed in SEQ ID NO: 5) the presence of Table 1 shown in FIGS.
鋳型ＤＮＡの抽出精製方法の従来法との比較の例として、図２に、市販のＤＮＡ抽出キットであるＩＳＯＰＬＡＮＴ Ｉ、ＩＳＯＰＬＡＮＴ ＩＩ（以上、ニッポンジーン製）及びＤＮＥＡＳＹ（キアゲン製）によってビールから抽出した鋳型ＤＮＡと本発明の方法によってビールから抽出精製した鋳型ＤＮＡを用い、スターチシンターゼのプライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す。市販のＤＮＡ抽出キットを用いて調製した鋳型ＤＮＡの場合は増幅ＤＮＡが出現しないのに対し、本発明の方法で抽出精製した鋳型ＤＮＡの場合は、大麦から直接抽出精製した鋳型ＤＮＡの場合と同様に増幅ＤＮＡ（図２の矢印）が出現した。 As an example of comparison of the template DNA extraction and purification method with the conventional method, FIG. 2 shows a template extracted from beer by commercially available DNA extraction kits ISOPLANT I, ISOPLANT II (Nippon Gene) and DNEASY (Qiagen). The results of PCR using DNA and template DNA extracted and purified from beer by the method of the present invention using a starch synthase primer are shown. In the case of template DNA prepared using a commercially available DNA extraction kit, amplified DNA does not appear, whereas in the case of template DNA extracted and purified by the method of the present invention, it is the same as in the case of template DNA directly extracted and purified from barley. Amplified DNA (arrow in FIG. 2) appeared.
［実施例２］
＜各種の大麦タンパク質ｓｅｒｐｉｎのＤＮＡの検出＞
各種の大麦（下記表３に示す１６種の大麦品種）から調製したＤＮＡを鋳型とし、大麦判別用プライマーとして、大麦の主要タンパク質であるｓｅｒｐｉｎ遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号６，７，８，９）共存下でＰＣＲを行った。その結果、図３に示すように、大部分の大麦にｓｅｒｐｉｎの増幅バンドが検出された。このアガロースゲルから大麦ｓｅｒｐｉｎ遺伝子に相当するＤＮＡバンドを切り出してクローニングし、塩基配列を調べた結果、図５に示すとおり、大麦ｓｅｒｐｉｎの塩基配列と一致した。
[Example 2]
<Detection of various barley protein serpin DNA>
Using DNA prepared from various barleys (16 barley varieties shown in Table 3 below) as a template, as a barley discrimination primer, a primer derived from the serpin gene, which is a major protein of barley (SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9) PCR was performed in the presence of coexistence. As a result, as shown in FIG. 3, a serpin amplification band was detected in most barley. From this agarose gel, a DNA band corresponding to the barley serpin gene was cut out and cloned, and the nucleotide sequence was examined. As a result, as shown in FIG. 5, it coincided with the nucleotide sequence of barley serpin.
［実施例３］
＜ビール中の大麦各種ＤＮＡの検出＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ビール品質に影響する成分として、大麦のリポキシゲナーゼ遺伝子（表１の配列番号１１）、β―グルカナーゼ遺伝子（配列番号１７）、ホルデインＡ（配列番号２）及びホルデインＣ（配列番号４）由来のプライマー共存下でＰＣＲを行った。その結果、図４に示すように、数種類のビールにそれぞれの遺伝子の増幅バンドが検出された。
[Example 3]
<Detection of various barley DNA in beer>
In the same manner as in Example 1, DNA prepared from sample beer was used as a template, and as components affecting beer quality, the barley lipoxygenase gene (SEQ ID NO: 11 in Table 1), β-glucanase gene (SEQ ID NO: 17), hordein A PCR was performed in the presence of primers derived from (SEQ ID NO: 2) and hordein C (SEQ ID NO: 4). As a result, as shown in FIG. 4, amplification bands of the respective genes were detected in several types of beer.
同様にして、表２に示すように、１８種類のＤＮＡマーカーを用いることにより、１６種類の大麦のすべてを互いに識別することが可能になった。ここで、表２のプライマー１ａ及び１ｂはそれぞれ、表１の配列番号１、２３の配列からなる。 Similarly, as shown in Table 2, by using 18 kinds of DNA markers, it was possible to distinguish all 16 kinds of barley from each other. Here, the primers 1a and 1b in Table 2 are composed of the sequences of SEQ ID NOS: 1 and 23 in Table 1, respectively.
［実施例４］
＜ビール中のホップＤＮＡの増幅＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ホップ検出用のプライマーとして、ホップの遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号１８，１９，２０）共存下でＰＣＲを行った。その結果、表３及び図６に示すように、数種類のビールにホップの増幅バンドが検出された。
[Example 4]
<Amplification of hop DNA in beer>
PCR was performed in the same manner as in Example 1 using DNA prepared from sample beer as a template, and coexisting with a hop gene-derived primer (SEQ ID NOs: 18, 19, and 20 in Table 1) as a hop detection primer. As a result, as shown in Table 3 and FIG. 6, hop amplification bands were detected in several types of beer.
［実施例５］
＜ビール中のビール酵母のＤＮＡの増幅＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ビール酵母の判別用プライマーとして、ビール酵母遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号２１及び２２）共存下でＰＣＲを行った。その結果、表３に示すように、数種類のビールに酵母遺伝子由来の増幅ＤＮＡバンドが検出され、図７に示すように、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とし、酵母遺伝子チオレドキシン関連プライマー共存下のＰＣＲによって増幅したＤＮＡの塩基配列が、酵母チオレドキシンの塩基配列の文献記載配列と一致した。
[Example 5]
<Amplification of DNA of brewer's yeast in beer>
In the same manner as in Example 1, DNA prepared from sample beer was used as a template, and PCR was performed in the presence of primers derived from a brewer's yeast gene (SEQ ID NOs: 21 and 22 in Table 1) as primers for distinguishing brewer's yeast. As a result, as shown in Table 3, amplified DNA bands derived from yeast genes were detected in several types of beer. As shown in FIG. 7, DNA extracted and purified from beer was used as a template, and coexisting with yeast gene thioredoxin-related primers. The base sequence of the DNA amplified by PCR matched the sequence described in the literature of the base sequence of yeast thioredoxin.
［実施例６］
＜世界の各種ビールの判別例＞
市販の外国産ビール、チェコ産バドヴァー、米国産ブルックリンラガー、ベルギー産ステラアルトワ、タヒチ産ヒナノ、オランダ産クローシュ、タイ産シンハー、デンマーク産カールスバーグ、英国産フラーズロンドンプライド、ドイツ産ポーラナー・ｈフェ・ヴァイス、オーストラリア産ＶＢビクトリアビター、メキシコ産ソル、米国産プリモ、ドイツ産エルディンガーヴァイスビア、英国産ダッチオリジナルオーガニックオールドルビーエール、ペルー産クリスタル、並びに、国内産サッポロビール２種、サントリービール１種及びキリンビール１種を用いた。各ビールは、図４及び表３に示すように、大麦の種類、酵母の種類、大麦の酵素、ホップの種類等で特徴的な結果を示し、供試した２２種類のビールすべてを識別することが可能であった。
[Example 6]
<Distinguishing examples of various beers around the world>
Commercially available foreign beer, Czech budova, US Brooklyn lager, Belgian Stella Artois, Tahiti hinano, Dutch cloche, Thai shinha, Danish Carlsberg, British frers London pride, German Paulaner hfe Weiss , Australian VB Victoria Bitter, Mexican Sol, American Primo, German Erdinger Weiss Beer, British Dutch Original Organic Dolby Ale, Peruvian Crystal, 2 Domestic Sapporo Beers, 1 Suntory Beer and 1 Kirin Beer A seed was used. As shown in FIG. 4 and Table 3, each beer shows characteristic results in barley type, yeast type, barley enzyme, hop type, etc., and identifies all 22 types of beer tested. Was possible.
［実施例７］
＜味覚認識装置による呈味性評価と表３のＰＣＲ結果による呈味性の推定＞
表３に示す２２種類のビールを試料とし、インテリジェントセンサーテクノロジー社の味覚認識装置ＳＡ２０２を用いて呈味性（苦み、酸味、渋み）の評価を行った。一例として、味覚認識装置よる評価結果を酸味と苦味について２次元表示したものを図８に示す。また、味覚認識装置によって測定した酸味、苦み、渋みのそれぞれの呈味性評価結果を目的変数とし、表３に示すＰＣＲ結果を説明変数とする重回帰分析（酸味、苦み、渋みの
各推定式（重回帰式）（上記）を使用した。）を行った結果を図９に示す。酸味に対して決定係数が０．７５、苦みに対する決定係数が０．６８、渋みに対する決定係数が０．７６とそれぞれ高い値を示し、ビールから抽出精製した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲ結果の多変量解析によって、ビールの苦み、酸味、渋みなどの呈味性を推定できることが示された。
[Example 7]
<Evaluation of taste by taste recognition apparatus and estimation of taste by PCR results in Table 3>
Twenty-two types of beer shown in Table 3 were used as samples, and the taste (bitterness, sourness, astringency) was evaluated using the taste sensor SA202 of Intelligent Sensor Technology. As an example, FIG. 8 shows a two-dimensional display of the evaluation results obtained by the taste recognition device for sourness and bitterness. In addition, multiple regression analysis (Evaluation formulas for sourness, bitterness, and astringency) with the taste evaluation results of acidity, bitterness, and astringency measured by the taste recognition device as objective variables and the PCR results shown in Table 3 as explanatory variables (Multiple regression equation) (above) was used. The coefficient of determination for sourness is 0.75, the coefficient of determination for bitterness is 0.68, and the coefficient of determination for astringency is 0.76, which are high values. By multivariate analysis of PCR results using template DNA extracted and purified from beer It was shown that the taste of beer, such as bitterness, acidity and astringency can be estimated.
［実施例８］
＜ビールの泡立ち保持性試験とＰＣＲ結果による推定＞
表３に示す２２種類のビールを試料とし、図１０に示す方法でビールの泡立ち性を定量的に評価した。すなわち、室温２５℃でビール温度を一定にし、上部のビーカーに一定量（２５０ｍＬ）のビールを入れ、サイフォンによって一定圧力差で下部のメスシリンダーに１００ｍＬのビールを注ぎ、一定時間後の気泡の体積を測定して試料ビールの泡立ち保持性とした。
[Example 8]
<Estimation by beer foam retention test and PCR results>
Using 22 types of beer shown in Table 3 as samples, the foaming property of beer was quantitatively evaluated by the method shown in FIG. That is, with a beer temperature constant at room temperature of 25 ° C., a fixed amount (250 mL) of beer is placed in the upper beaker, 100 mL of beer is poured into the lower graduated cylinder with a constant pressure difference by siphon, and the volume of bubbles after a fixed time Was measured as the foam retention of the sample beer.
このビール泡立ち性を目的変数とし、表３のＰＣＲ結果を説明変数として重回帰分析（泡の安定性の推定式（重回帰式）（上記）を使用した。）を行い、図１１に示す散布図を得た。この重回帰分析の決定係数は０．８７であり、ビールから抽出精製したＤＮＡ鋳型とするＰＣＲ結果を重回帰分析することによって、当該ビールの泡立ち保持性を推定することが可能になった。 Using this beer foaming property as an objective variable and the PCR results in Table 3 as explanatory variables, a multiple regression analysis (using the foam stability estimation formula (multiple regression equation) (above)) was performed, and the dispersion shown in FIG. Got the figure. The coefficient of determination of this multiple regression analysis was 0.87, and it became possible to estimate the foam retention of the beer by performing multiple regression analysis on the PCR results obtained from the DNA template extracted and purified from beer.
［実施例９］
＜ビールの官能検査結果とＰＣＲによる品質推定との関係＞
表３に示す各種のビールを試料として、８名の専門研究者が官能検査を行った総合評価結果を目的変数とし、表３に示すＰＣＲ結果との関係について上記と同様に重回帰分析を行った結果、決定係数０．８２が得られた。この結果、本発明におけるＰＣＲ法によるビールの品質推定は、官能検査結果についても適用が可能であることが示された。
[Example 9]
<Relationship between sensory test results of beer and quality estimation by PCR>
Using the various beers shown in Table 3 as samples, the comprehensive evaluation results of sensory tests conducted by 8 expert researchers were used as objective variables, and the relationship with the PCR results shown in Table 3 was subjected to multiple regression analysis in the same manner as described above. As a result, a determination coefficient of 0.82 was obtained. As a result, it was shown that the quality estimation of beer by the PCR method in the present invention can also be applied to sensory test results.
本発明は、ビールを試料として、ＰＣＲ用の高純度の鋳型ＤＮＡを高効率に調製するものであり、大麦、酵母、ホップのそれぞれを判別することによって、当該ビールの品質を総合的に推定するという技術であり、ビール醸造業界や検査機関、あるいは大麦、酵母、ホップの育成・生産・販売業界にとって利用価値の高い技術である。 The present invention prepares high-purity template DNA for PCR using beer as a sample with high efficiency, and comprehensively estimates the quality of the beer by discriminating each of barley, yeast, and hops. This technology has high utility value for the beer brewing industry, inspection institutions, and the barley, yeast and hop breeding, production and sales industries.
配列番号１〜４６：プライマー SEQ ID NOs: 1-46: Primers
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