JP2014058464A - 天蚕セリシンの抽出・精製方法および天蚕セリシンを含む医薬組成物、食品、化粧料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050%のNaOHと0.490〜0.450%のNa2CO3を含み、NaOHとNa2CO3の合計が全液量の0.5%であるNaOH/Na2CO3混合液に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して、セリシンを含む精練液を得る精練工程;(2)精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第1冷却工程;(3)精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第2冷却工程;(4)第1、2冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程;および(5)遠心分離後の精練液を透析してセリシン溶液を得る透析工程を含む抽出・精製方法とする。
【選択図】図1
Description
<1>以下の工程:
(1)90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050%のNaOHと0.490〜0.450%のNa2CO3を含み、NaOHとNa2CO3の合計が全液量の0.5%であるNaOH/Na2CO3混合液に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程;
(2)精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第1冷却工程;
(3)精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第2冷却工程;
(4)第1、2冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程;および
(5)遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含む。
<2>第1冷却工程における冷却時間は5〜10分であり、第2冷却工程における冷却時間は、30分〜1時間である。
<3>精練工程におけるNaOH/Na2CO3混合液は、NaOHの濃度が0.025%であり、かつ、Na2CO3の濃度が0.475%である。
<4>透析工程後、(6)天蚕セリシン溶液を凍結乾燥して天蚕セリシン粉末を得る工程を含む。
(1)90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050%のNaOHと0.490〜0.450%のNa2CO3を含み、NaOHとNa2CO3の合計が全液量の0.5%であるNaOH/Na2CO3混合液に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程;
(2)精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第1冷却工程;
(3)精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第2冷却工程;
(4)第1、2冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程;および
(5)遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含む。
天蚕由来セリシンの抽出、精製の工程を図1に沿って説明する。図1は、本発明の天蚕セリシン抽出・精製方法の一実施形態を例示したフローチャートである。
実施例1で得た天蚕セリシン粉末(可溶性パウダー)を6Nの塩酸1mlに溶解し、減圧封管した。封管したものを加水分解(110℃/24時間)を経て真空乾燥処理した後、Lithium citrate サンプルバッファー(pH2.2)で溶解し、孔径0.45μmのフィルター(直径4mm, Millipore社)で濾過し、分析試料とした。分析試料は、アミノ酸アナライザー(JLC-500/v, 日本電子社)に注入してアミノ酸組成を測定した。
実施例1の精練工程におけるNaOH/Na2CO3混合液について、NaOHとNa2CO3の濃度を変更し、天蚕セリシンを得るために好適な比率を検討した。
(1)NaOH:0.010%、Na2CO3:0.490%、
(2)NaOH:0.025%、Na2CO3:0.475%(実施例1と同じ)、
(3)NaOH:0.050%、Na2CO3:0.450%、
(4)NaOH:0.100%、Na2CO3:0.400%、
(5)NaOH:0.200%、Na2CO3:0.300%、
を使用し、実施例1と同様の精練工程、第1冷却工程、第2冷却工程、遠心工程、透析工程を経て、天蚕セリシン粉末を得た。
収率=天蚕セリシン粉末の回収量/練減量×100
結果を表2に示す。
マウス脾臓リンパ細胞(A:全リンパ球細胞、B:リンパ球B細胞)について、天蚕セリシンによる免疫賦活作用の検討を行った。
図2−Aに、天蚕セリシンの濃度に対する全リンパ球細胞の増殖率を示す。
ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)およびショウジョウバエ由来細胞(schneider S2 cell)について、天蚕セリシンによる影響を検討した。
ラット肝ガン細胞(dRLh84)について、天蚕セリシンによる影響を検討した。
線虫(C.elegans)に対して、実施例1で得られた天蚕セリシンが与える影響について検討した。
線虫は飼育プレート上で、インキュベーター(MIR-153、SANYO)を用い、20oCで飼育した。培地は、0.3%NaCl、0.25%ポリペプトン、1.7%寒天、0.5μg/ml コレステロール、1mM CaCl2、1mM MgSO4、25mM KH2PO4-KOH(pH 6.0)を含む Nematode Growth Medium(NGM)寒天培地を用い、これをコントロールとした。供試試料についても、同様の方法で調製した。プレートは、滅菌シャーレに各 NGM 寒天培地を約2.5 ml ずつ分注して作製した。線虫の飼育には、餌として大腸菌 Escherichia coli(OP50)を用いた。餌とする大腸菌は、 5mlのLB培地に一白銀耳懸濁させ、バイオシェーカー(BR-40LF、TAITEC)により、37oC、120rpm、15時間培養したものを用いた。この懸濁液を1プレートあたり約30μl滴下し、壁面に当らない程度にスプレッダーで広げた。大腸菌を塗った NGM 寒天培地(以下飼育プレート)は室温で 12 時間培養した後、使用するまで4℃で保存した。平均寿命の測定に用いる線虫は、4齢幼虫(L4)であるが、孵化直後から供試試料を与えた線虫を使用するためにあらかじめ各飼料を添加した飼育プレートで飼育しておいた。飼育プレート中の線虫の多くが L4 に成長するまで飼育し、1 試料に対して 2 枚の新しい飼育プレートを用意して、30 頭ずつ植え継いだ。この日を観察 0 日目とし、線虫が卵を産まなくなるまで毎日〜1日おきに新しい飼育プレートに植え継いだ。観察は毎日定時±2時間の範囲でおこない、死亡個体はその都度除外した。また、平均寿命の測定試験中に体内で卵が孵化してしまったものや、植え継ぎの際に外傷を負ってしまった個体も同様に除外した。
平均寿命(days)=
(線虫が死亡し始めた観察日 + 線虫が生きていた最後の観察日)/ 2
結果を表3および図6に示す。図6は、controlと天蚕セリシンの生存率、生存日数の比較を示したグラフである。
実施例1で抽出された天蚕セリシン溶液について、UV吸光度を紫外可視近赤外分光光度計(日本分光株式会社製、V-570)で測定した。
実施例1で得た天蚕セリシン粉末を、10%(T)、3%(C)の分離ゲル上に濃縮ゲルを重層した垂直型スラブゲルを用いて分離した(Schagger and Jagow, 1987)。電気泳動装置の陰極槽は0.1M Tris、0.1M Tricine、0.1%(W/V)SDSとし、陽極槽は0.2M Tris-HCl buffer (pH 8.9)とし、泳動用試料(10μl)は等量のTricine SDS-PAGE用sample buffer [50mM Tris-HCl(pH 6.8)、4%(W/V) SDS、12%(W/V) glycerol、2%(V/V)β-mercaptethanol、0.01%(W/V) Serva blue ]を加え、3分間熱処理したものを用いた。分子量マーカーには、Protein Marker Kit (M.W. Range 97,000〜14,400, GEヘルスケアサイエンス社)を使用した。泳動は、分離ゲルに入るまでは印加電圧を30Vととし、その後、分離ゲルの下端に達するまでは印加電圧を100Vの定電圧で通電した。泳動後のゲルは、0.25% Coomassie brilliant blure (CBB) R-250、45% ethanol、7% acetic acid 中で染色し、20% ethanol、7% acetic acid中で脱色した。
Claims (13)
- 以下の工程:
(1)90℃〜98℃であり、かつ、0.010〜0.050%のNaOHと0.490〜0.450%のNa2CO3を含み、NaOHとNa2CO3の合計が全液量の0.5%であるNaOH/Na2CO3混合液に、天蚕由来の絹繊維を浸漬して、天蚕セリシンを含む精練液を得る精練工程;
(2)精練液を含む容器を、外部から15℃〜25℃の水で冷却する第1冷却工程;
(3)精練液を含む容器を、外部から0℃〜10℃の水または氷水で冷却する第2冷却工程;
(4)第1、2冷却工程を経た精練液を遠心分離する遠心工程;および
(5)遠心分離後の精練液を透析して天蚕セリシン溶液を得る透析工程
を含むことを特徴とする天蚕セリシンの抽出・精製方法。 - 第1冷却工程における冷却時間は5〜10分であり、第2冷却工程における冷却時間は、30分〜1時間であることを特徴とする請求項1の天蚕セリシンの抽出・精製方法。
- 精練工程におけるNaOH/Na2CO3混合液は、NaOHの濃度が0.025%であり、かつ、Na2CO3の濃度が0.475%であることを特徴とする請求項1または2の天蚕セリシンの抽出・精製方法。
- 透析工程後、(6)天蚕セリシン溶液を凍結乾燥して天蚕セリシン粉末を得る工程を含むことを特徴とする請求項1から3のいずれかの天蚕セリシンの抽出・精製方法。
- 請求項1または2の天蚕セリシンの抽出・精製方法によって得られた、天蚕セリシンを含む天蚕セリシン溶液であって、天蚕セリシンは、アミノ酸として、スレオニン13.0 Mol%以上、セリン20.0 Mol%以上、ヒスチジン2.0 Mol%以上、アルギニン3.5 Mol%以上を含み、かつ、分子量が15kDa〜120kDaであることを特徴とする天蚕セリシン溶液。
- 請求項4の天蚕セリシンの抽出・精製方法によって得られた天蚕セリシン粉末であって、アミノ酸組成として、スレオニン13.0 Mol%以上、セリン20.0 Mol%以上、ヒスチジン2.0 Mol%以上、アルギニン3.5 Mol%以上を含み、かつ、分子量が15kDa〜120kDaであることを特徴とする天蚕セリシン粉末。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする抗加齢用医薬組成物。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする抗加齢用食品。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする抗ガン用医薬組成物。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする抗ガン用食品。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする免疫賦活用医薬組成物。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする免疫賦活用食品。
- 請求項5の天蚕セリシン溶液または請求項6の天蚕セリシン粉末を含むことを特徴とする化粧料。
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