JP2014037358A - Oral formulation of nucleic acid medicine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、デコイ等の核酸医薬を効果的に経口投与することができる、核酸医薬製剤に関する。 The present invention relates to a nucleic acid pharmaceutical preparation capable of effectively orally administering a nucleic acid pharmaceutical such as decoy.
ＤＮＡデコイ等のオリゴヌクレオチドからなる核酸医薬は、酸あるいは酵素(ヌクレアーゼ等)に不安定であるため、従来は局所投与に限定され、それ以外は安定化誘導体の静脈内投与が一部検討されているに過ぎなかった。 Nucleic acid pharmaceuticals consisting of oligonucleotides such as DNA decoys are unstable to acids or enzymes (nucleases, etc.), so they have been limited to local administration in the past. I was just there.
しかしながら慢性疾患など継続／反復投与が必要とされる疾患に対し、経皮剤を除く局所投与は現実的ではなく、また静脈内投与も病院でしか実施できず在宅治療には利用できないことから、核酸医薬の優れた薬理作用を生かすには、経口投与製剤の開発が広く求められていた。 However, for diseases that require continuous / repeated administration such as chronic diseases, local administration excluding transdermal agents is not practical, and intravenous administration can only be performed in hospitals and cannot be used for home treatment. In order to take advantage of the excellent pharmacological action of nucleic acid drugs, development of oral dosage forms has been widely demanded.
一方、現時点で炎症性腸疾患に対し承認されているのはメサラジン(Mesalazine, 5-アミノ-2-ヒドロキシ安息香酸)のみであるが、メサラジンはアスピリン誘導体であり、薬理学的にはシクロオキシゲナーゼ阻害作用に基づく抗炎症剤である。従って抗炎症剤としての対症療法しか期待できず、継続投与するとシクロオキシゲナーゼのインダクション(酵素誘導)が起こりリバンド(再発)する問題点も指摘されていた。一方でNF-κBデコイは酵素阻害剤ではないため、リバンドが起こる可能性はない。さらにメサラジンの投与量は、1,500〜2,250mg/日(潰瘍性大腸炎)、1,500〜3,000 mg/日(クローン病)と大量であり、毎日この量を継続服用するのは非常に困難であり、コンプライアンス(服薬遵守)面での問題もあった。 On the other hand, only mesalazine (Mesalazine, 5-amino-2-hydroxybenzoic acid) is currently approved for inflammatory bowel disease, but mesalazine is an aspirin derivative and has a cyclooxygenase inhibitory action pharmacologically. Is an anti-inflammatory agent based on Therefore, only symptomatic treatment as an anti-inflammatory agent can be expected, and it has been pointed out that cyclooxygenase induction (enzyme induction) occurs and rebands (recurs) when it is continuously administered. On the other hand, since NF-κB decoy is not an enzyme inhibitor, there is no possibility of rebanding. Furthermore, the dose of mesalazine is large, 1,500-2,250 mg / day (ulcerative colitis), 1,500-3,000 mg / day (Crohn's disease), and it is very difficult to take this amount every day. There were also problems with compliance.
本発明の目的は、経口投与された核酸医薬の生体内での高い安定性を達成することができ、それによって、経口投与された核酸医薬の薬理効果を生体内において有効に発揮させることが可能な核酸医薬製剤を提供することである。 An object of the present invention is to achieve high in vivo stability of an orally administered nucleic acid drug, thereby enabling the effective pharmacological effect of the orally administered nucleic acid drug in vivo. Is to provide a nucleic acid pharmaceutical preparation.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の物質で内層、中間層及び外層を構成した３層のシームレスカプセルとし、内層に核酸医薬を含有させることで、経口投与された核酸医薬の生体内での高い安定性を達成することができ、それによって、経口投与された核酸医薬の薬理効果を生体内において有効に発揮させることが可能なことを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies, the inventors of the present invention have made a three-layer seamless capsule comprising an inner layer, an intermediate layer and an outer layer with a specific substance. The present inventors have found that high stability can be achieved, and that the pharmacological effects of orally administered nucleic acid drugs can be effectively exhibited in vivo, thus completing the present invention.
すなわち、本発明は、以下の３層により構成されたシームレスカプセルからなる核酸医薬製剤を提供する。
(1) 常温で非流動性の疎水性物質に懸濁された核酸医薬含有生分解性ポリマーを主成分とする内層
(2) 常温で非流動性の疎水性物質とレシチンとの混合物を主成分とする中間層
(3) ゼラチン、ペクチンおよびソルビトールの混合物を主成分とする外層
That is, this invention provides the nucleic acid pharmaceutical formulation which consists of a seamless capsule comprised by the following three layers.
(1) Inner layer composed mainly of biodegradable polymer containing nucleic acid drug suspended in non-flowable hydrophobic substance at room temperature
(2) Intermediate layer mainly composed of a mixture of a non-flowable hydrophobic substance at room temperature and lecithin
(3) Outer layer mainly composed of a mixture of gelatin, pectin and sorbitol
本発明により、経口投与された核酸医薬の生体内での高い安定性を達成することができる核酸医薬製剤が初めて提供された。本発明の核酸医薬製剤を経口投与すると、核酸医薬の生体内での分解が防止され、核酸医薬の薬理効果が生体内において効果的に発揮される。 The present invention provides for the first time a nucleic acid pharmaceutical preparation capable of achieving high in vivo stability of an orally administered nucleic acid pharmaceutical. When the nucleic acid pharmaceutical preparation of the present invention is orally administered, the nucleic acid pharmaceutical is prevented from being decomposed in vivo, and the pharmacological effect of the nucleic acid pharmaceutical is effectively exhibited in vivo.
上記の通り、本発明の製剤は、内層、中間層及び外層から構成される３層のシームレスカプセルの形態にある。シームレスカプセルは、薬効成分を含むカプセルの構成材料を良溶媒に溶解した溶液を、該材料の貧溶媒中に滴下することにより調製することができる継ぎ目のないカプセルであり、シームレスカプセル自体は周知であり、常用されているものである。３層のシームレスカプセルも公知であり、各層を構成する成分の良溶媒溶液を、同心３重ノズルから同時に貧溶媒中に滴下することにより調製することができる（特許文献２）。 As described above, the preparation of the present invention is in the form of a three-layer seamless capsule composed of an inner layer, an intermediate layer, and an outer layer. Seamless capsules are seamless capsules that can be prepared by dripping a solution in which a constituent material of a capsule containing medicinal ingredients is dissolved in a good solvent into a poor solvent of the material. Yes, it is what is used regularly. A three-layer seamless capsule is also known, and can be prepared by simultaneously dropping a good solvent solution of components constituting each layer into a poor solvent from a concentric triple nozzle (Patent Document 2).
シームレスカプセルの内層は、常温で非流動性の疎水性物質に懸濁された核酸医薬含有生分解性ポリマーを主成分とするものである。 The inner layer of the seamless capsule is mainly composed of a biodegradable polymer containing a nucleic acid drug suspended in a non-flowable hydrophobic substance at room temperature.
ここで、「常温で非流動性の疎水性物質」の好ましい例としては、食用硬化油、ショ糖脂肪酸エステル及びグリセリン脂肪酸エステルから選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。ここで、「食用硬化油」の好ましい例としては、ヤシ硬化油、大豆硬化油、綿実硬化油、ナタネ硬化油及びパーム硬化油から選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。また、ショ糖脂肪酸エステル及びグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪部分は、飽和でも不飽和でもよく、飽和又は不飽和アルキル部分の炭素数は、１０〜２０程度が好ましい。 Here, as a preferable example of the “hydrophobic substance that is non-flowable at normal temperature”, at least one selected from edible hardened oil, sucrose fatty acid ester, and glycerin fatty acid ester can be given. Here, as a preferable example of “edible hardened oil”, there can be mentioned at least one selected from hardened palm oil, hardened soybean oil, hardened cottonseed oil, hardened rapeseed oil and hardened palm oil. Moreover, the fat part which comprises sucrose fatty acid ester and glycerol fatty acid ester may be saturated or unsaturated, and carbon number of a saturated or unsaturated alkyl part has about 10-20 preferable.
上記「生分解性ポリマー」の好ましい例としては、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)及び乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)から選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。生分解性ポリマーの平均分子量は、特に限定されないが、通常、5,000〜30,000程度が好ましい。また、乳酸・グリコール酸共重合体中の乳酸とグリコール酸の組成比（モル比）は、特に限定されないが50：50ないし75：25程度が好ましい。これらの平均分子量や組成比は、市販の乳酸・グリコール酸共重合体やポリ乳酸が有しているものであり、従って、本発明では、市販の乳酸・グリコール酸共重合体またはポリ乳酸を好適に利用することができる。 Preferable examples of the “biodegradable polymer” include at least one selected from polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), and lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA). The average molecular weight of the biodegradable polymer is not particularly limited, but is usually preferably about 5,000 to 30,000. The composition ratio (molar ratio) of lactic acid to glycolic acid in the lactic acid / glycolic acid copolymer is not particularly limited, but is preferably about 50:50 to 75:25. These average molecular weights and composition ratios are those possessed by commercially available lactic acid / glycolic acid copolymers and polylactic acid. Therefore, in the present invention, commercially available lactic acid / glycolic acid copolymers or polylactic acids are preferred. Can be used.
生分解性ポリマーに含まれる核酸医薬は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡである核酸、又はＰＮＡ等の人工核酸であれば特に限定されず、好ましい例としてデコイ、アンチセンス、siRNA、miRNA、リボザイム、アプタマー及びプラスミドDNA等を挙げることができる。これらの核酸医薬は、ホスホロチオエート化（リン酸エステル部分の、リンと二重結合している酸素原子をイオウ原子に変えること）や、PEG化（ポリエチレングリコール鎖を一端に連結すること）等の自体周知の方法により生体内での安定性を高めたものであってもよい。核酸医薬としては、二本鎖ＤＮＡデコイが好ましく、特に後述するNF-κBデコイが好ましいが、これに限定されるものではない。生分解性ポリマーに含まれる核酸医薬の量は、特に限定されないが、通常、生分解性ポリマー１００重量部に対して０．１〜５０重量部程度、好ましくは１．０〜３０重量部程度である。 The nucleic acid drug contained in the biodegradable polymer is not particularly limited as long as it is a nucleic acid that is DNA or RNA, or an artificial nucleic acid such as PNA. Preferred examples include decoy, antisense, siRNA, miRNA, ribozyme, aptamer, and plasmid DNA. Etc. These nucleic acid drugs are themselves such as phosphorothioate (changing the oxygen atom double-bonded to phosphorus in the phosphate ester moiety to a sulfur atom) or PEGylation (linking a polyethylene glycol chain at one end). The in-vivo stability may be improved by a known method. As the nucleic acid drug, a double-stranded DNA decoy is preferable, and an NF-κB decoy described below is particularly preferable, but is not limited thereto. The amount of the nucleic acid drug contained in the biodegradable polymer is not particularly limited, but is usually about 0.1 to 50 parts by weight, preferably about 1.0 to 30 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the biodegradable polymer. is there.
核酸医薬含有生分解性ポリマーの表面がカチオン性高分子で被覆されていることが好ましい。ここで、「カチオン性高分子」の好ましい例としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）、細胞膜（生体膜）の構成成分であるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と重合性に優れたメタクリロイル基とを併せ持つ２−メタクリロイルオキシエチルホスホルコリン（ＭＰＣ）を構成単位とする高分子に第４級アンモニウム塩等のカチオン基を結合させたカチオン性高分子（例えばＭＰＣと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとのコポリマー）等が挙げられるが、特にキトサン又はその誘導体が好適に用いられる。ここで、キトサン誘導体の例としてはヒドロキシプロピルキトサン(カチオン化キトサン)を挙げることができる。なお、キトサン又はその誘導体で表面を被覆した核酸医薬含有生分解性ポリマー自体は公知であり、特許文献１に記載されている。カチオン性高分子の被覆量は限定されないが、核酸医薬含有生分解性ポリマー１００重量部に対して、通常、１〜５０重量部程度、好ましくは、１０〜３０重量部程度である。
It is preferable that the surface of the biodegradable polymer containing a nucleic acid drug is coated with a cationic polymer. Here, preferable examples of the “cationic polymer” include chitosan and chitosan derivatives, cationized cellulose obtained by binding a plurality of cationic groups to cellulose, polyamino compounds such as polyethyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyornithine, Polyamino acids such as polylysine, polyvinyl imidazole, polyvinyl pyridinium chloride, alkylaminomethacrylate quaternary salt polymer (DAM), alkylaminomethacrylate quaternary salt / acrylamide copolymer (DAA), cell membrane (biological membrane) A cationic group such as a quaternary ammonium salt is bonded to a polymer having 2-methacryloyloxyethylphosphocholine (MPC) as a structural unit, which has both a phospholipid polar group (phosphorylcholine group) and a highly polymerizable methacryloyl group. Although such is not a cationic polymer (e.g., MPC and 2-hydroxy-3-methacryloyl copolymers of trimethylammonium chloride) and the like, is preferably used in particular chitosan or a derivative thereof. Here, examples of chitosan derivatives include hydroxypropyl chitosan (cationized chitosan). The biodegradable polymer containing a nucleic acid drug whose surface is coated with chitosan or a derivative thereof is known and described in
内層を構成する、前記疎水性物質と前記核酸医薬含有生分解性ポリマーの混合比率は、特に限定されないが、疎水性物質１００重量部に対して、核酸医薬含有生分解性ポリマーが通常、１〜２５重量部程度、好ましくは、１〜１０重量部程度である。 The mixing ratio of the hydrophobic substance and the nucleic acid drug-containing biodegradable polymer constituting the inner layer is not particularly limited, but the nucleic acid drug-containing biodegradable polymer is usually 1 to 100 parts by weight of the hydrophobic substance. About 25 parts by weight, preferably about 1 to 10 parts by weight.
また、本明細書及び特許請求の範囲において、「主成分とする」（後述する他の層も同様）とは、この主成分が、重量基準で、全体の５０重量％超、好ましくは、９０重量％以上、さらに好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９９重量％以上、最も好ましくは１００重量％であることを意味する。主成分以外の成分でも、本発明の効果に悪影響を与えないものであれば、任意成分として含まれていてもよい。内層におけるこのような任意成分の例としては、食用硬化油脂、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができるが、これらの任意成分は含まれていなくても問題はない。 In the present specification and claims, the term “main component” (as well as other layers described later) means that the main component is more than 50% by weight based on the weight, preferably 90%. It means that it is not less than wt%, more preferably not less than 95 wt%, more preferably not less than 99 wt%, most preferably 100 wt%. Components other than the main component may be included as optional components as long as they do not adversely affect the effects of the present invention. Examples of such optional components in the inner layer include edible hardened oils and fats, glycerin fatty acid esters and the like, but there is no problem even if these optional components are not included.
中間層は、常温で非流動性の疎水性物質とレシチンとの混合物を主成分とする。常温で非流動性の疎水性物質の好ましい例は、内層を構成する常温で非流動性の疎水性物質の好ましい例と同様である。疎水性物質とレシチンとの混合比率は、特に限定されないが、疎水性物質１００重量部に対してレシチンが、通常、５〜１００重量部程度、好ましくは１０〜５０重量部程度である。中間層に含むことができる任意成分の例としては、食用硬化油脂、ショ糖脂肪酸エステル(ＳＡＩＢ)、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができるが、これらの任意成分は含まれていなくても問題はない。 The intermediate layer is mainly composed of a mixture of a non-flowable hydrophobic substance and lecithin at room temperature. Preferred examples of the non-flowable hydrophobic substance at normal temperature are the same as the preferred examples of the non-flowable hydrophobic substance constituting the inner layer at normal temperature. The mixing ratio of the hydrophobic substance and lecithin is not particularly limited, but lecithin is usually about 5 to 100 parts by weight, preferably about 10 to 50 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the hydrophobic substance. Examples of optional components that can be included in the intermediate layer include edible hardened fats and oils, sucrose fatty acid ester (SAIB), glycerin fatty acid ester, etc., but these optional components are not included even if they are not included. Absent.
外層は、ゼラチン、ペクチンおよびソルビトールの混合物を主成分とする。これらの混合比率は、特に限定されないが、ゼラチン１００重量部に対して、ペクチンが通常５〜４５重量部程度、好ましくは５〜２５重量部程度、ソルビトールが通常５〜１２０重量部程度、好ましくは２０〜１００重量部程度である。外層に含むことができる任意成分の例としては、ゼラチン、寒天、カラギーナン、アラビアガム、ジェランガム、キサンタンガム、ペクチン、アルギン酸、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール等を挙げることができるが、これらの任意成分は含まれていなくても問題はない。 The outer layer is mainly composed of a mixture of gelatin, pectin and sorbitol. These mixing ratios are not particularly limited, but pectin is usually about 5 to 45 parts by weight, preferably about 5 to 25 parts by weight, and sorbitol is usually about 5 to 120 parts by weight, preferably 100 parts by weight of gelatin. About 20 to 100 parts by weight. Examples of optional components that can be included in the outer layer include gelatin, agar, carrageenan, gum arabic, gellan gum, xanthan gum, pectin, alginic acid, sorbitol, glycerin, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol and the like. However, there is no problem if these optional components are not included.
カプセルのサイズは、特に限定されないが、好ましくは、直径が１〜７mm程度である。また、内層、中間層、外層の重量比率は、特に限定されないが、内層１００重量部に対して中間層が通常１０〜１００重量部程度、好ましくは３０〜７５重量部程度、外層が通常２０〜１６０重量部程度、好ましくは３０〜１３０重量部程度である。 The size of the capsule is not particularly limited, but preferably the diameter is about 1 to 7 mm. The weight ratio of the inner layer, intermediate layer, and outer layer is not particularly limited, but the intermediate layer is usually about 10 to 100 parts by weight, preferably about 30 to 75 parts by weight, and the outer layer is usually 20 to 20 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the inner layer. About 160 parts by weight, preferably about 30 to 130 parts by weight.
本発明の核酸医薬製剤は、腸溶性であることが好ましく、上記した各構成成分として上記した好ましい成分を採用すれば、カプセルは腸溶性になる。この場合、核酸医薬として、潰瘍性大腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患に対する治療効果を有するもの、好ましくは、後述する、NF-κBデコイを用いることにより、上記の通り対症療法薬しかない炎症性腸疾患の治療薬を提供することができる。なお、NF-κBデコイを含む本発明の製剤を炎症性腸疾患治療薬として経口投与する場合、その投与量は、患者の症状やNF-κBデコイの種類等により適宜選択されるが、通常、成人患者１日当たり、本発明の製剤の投与量は、１００mg〜２００００mg程度、好ましくは１００mg〜１０００mg程度である。 The nucleic acid pharmaceutical preparation of the present invention is preferably enteric, and the capsule becomes enteric when the above-described preferred components are employed as the above-described constituent components. In this case, the nucleic acid drug has a therapeutic effect on inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease, and preferably only a symptomatic drug as described above by using NF-κB decoy described later. There can be provided a remedy for inflammatory bowel disease. In addition, when orally administering the preparation of the present invention containing NF-κB decoy as a therapeutic agent for inflammatory bowel disease, the dosage is appropriately selected according to the patient's symptoms, the type of NF-κB decoy, etc. The dose of the preparation of the present invention per day for an adult patient is about 100 mg to 20000 mg, preferably about 100 mg to 1000 mg.
本発明の特に好ましい態様によれば、ヤシ硬化油に懸濁された、キトサン被覆デコイ含有乳酸・グリコール酸共重合体を主成分とする内層、ヤシ硬化油およびレシチンの混合物を主成分とする中間層、ゼラチン、ペクチンおよびソルビトールの混合物を主成分とする外層により構成されたシームレスカプセルが提供される。 According to a particularly preferred embodiment of the present invention, an inner layer mainly composed of a chitosan-coated decoy-containing lactic acid / glycolic acid copolymer suspended in a coconut hardened oil, an intermediate mainly composed of a mixture of coconut hardened oil and lecithin. A seamless capsule composed of a layer, an outer layer mainly composed of a mixture of gelatin, pectin and sorbitol is provided.
ここで、デコイは、NF-κBデコイが好ましく、二本鎖ＤＮＡのものが好ましい。NF-κBデコイは、種々のものが公知であり、例えば、特許文献３〜６等に記載されているものを挙げることができる。特許文献５に記載されているような環状のデコイも好ましく用いることができる。NF-κBデコイは、コンセンサス配列としてggrhtyyh、特に、ggatttcc又はggactttcを含むものが好ましく、下記実施例では、配列番号１に示す20merのNF-κB二本鎖ＤＮＡデコイを用いているが限定されず、それ以外にも例えば配列番号２、配列番号３で示されるNF-κBデコイなどを挙げることもできる。NF-κBデコイは、上記した炎症性腸疾患を包含する炎症性疾患の他、虚血性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患および腫瘍をはじめとするあらゆるNF-κBに起因する疾患の、予防、改善および/または治療剤として使用することができる。NF-κBの活性を低減させることにより、これらの疾患の治癒、および/または進行の遅延が得られることは、種々の文献により、当業者には既に公知である。 Here, the decoy is preferably an NF-κB decoy, and preferably a double-stranded DNA. Various NF-κB decoys are known, and examples thereof include those described in Patent Documents 3 to 6 and the like. An annular decoy as described in Patent Document 5 can also be preferably used. The NF-κB decoy preferably includes ggrhtyyh as a consensus sequence, particularly ggatttcc or ggactttc. In the following examples, the 20-mer NF-κB double-stranded DNA decoy shown in SEQ ID NO: 1 is used, but is not limited. In addition, for example, NF-κB decoys represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 can be exemplified. NF-κB decoy is a preventive measure against all NF-κB-induced diseases including ischemic diseases, allergic diseases, autoimmune diseases and tumors, in addition to the inflammatory diseases including inflammatory bowel diseases described above. It can be used as an ameliorating and / or therapeutic agent. It is already known to the person skilled in the art from various literatures that reduction of the activity of NF-κB can lead to the healing and / or delay of progression of these diseases.
本発明のシームレスカプセルは、例えば、次のようにして製造することができる。まず、生分解性ポリマーを、アセトン／エタノール混合液のような良溶媒（なお、良溶媒に溶解した溶液を便宜的に良溶媒と呼ぶこともある。貧溶媒も同様）に溶解した溶液に、核酸医薬水溶液を添加して核酸医薬含有生分解性ポリマーを調製する。キトサンのようなカチオン性高分子で生分解性ポリマーの表面を被覆する場合には、カチオン性高分子の水溶液を貧溶媒として、良溶媒を貧溶媒に滴下することにより、カチオン性高分子で表面が被覆された核酸医薬含有生分解性ポリマー粒子を得ることができる。 The seamless capsule of the present invention can be produced, for example, as follows. First, a biodegradable polymer is dissolved in a good solvent such as an acetone / ethanol mixed solution (a solution dissolved in a good solvent may be referred to as a good solvent for the sake of convenience. A biodegradable polymer containing a nucleic acid drug is prepared by adding an aqueous solution of the nucleic acid drug. When coating the surface of a biodegradable polymer with a cationic polymer such as chitosan, the aqueous solution of the cationic polymer is used as a poor solvent, and a good solvent is added dropwise to the poor solvent. A biodegradable polymer particle containing a nucleic acid drug coated with can be obtained.
上記した、常温で非流動性の疎水性物質を融点以上の温度に加熱して溶融させ、これに上記核酸医薬含有生分解性ポリマー粒子を添加して懸濁し、この懸濁液を同心３重ノズルの最も内側のノズルに充填する。一方、常温で非流動性の疎水性物質を融点以上の温度に加熱して溶融させ、これにレシチンを添加、混合した溶液を同心３重ノズルの２番目のノズルに充填する。さらに、ゼラチン、ペクチンおよびソルビトールの混合物の溶液を同心３重ノズルの最も外側のノズルに充填する。そして、これらのノズルから、冷却され流動している油（貧溶媒として機能）に、同時に各液を滴下することにより、本発明の核酸医薬製剤であるシームレスカプセルを得ることができる。 The above-mentioned non-flowable hydrophobic substance at room temperature is heated to a temperature equal to or higher than the melting point and melted, and the nucleic acid drug-containing biodegradable polymer particles are added and suspended therein. Fill the innermost nozzle of the nozzle. On the other hand, a non-flowable hydrophobic substance at room temperature is heated to a temperature equal to or higher than the melting point, and lecithin is added thereto, and the mixed solution is filled in the second nozzle of the concentric triple nozzle. In addition, the outermost nozzle of the concentric triple nozzle is filled with a solution of a mixture of gelatin, pectin and sorbitol. A seamless capsule that is the nucleic acid pharmaceutical preparation of the present invention can be obtained by simultaneously dropping each liquid from these nozzles into cooled and flowing oil (functioning as a poor solvent).
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、全ての％は、特に断りがない限り重量％を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples. In addition, all% means weight% unless there is particular notice.
(1) キトサン被覆デコイ含有乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)の製造
1) 晶析工程
乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）6.25gをアセトン(645mL)／エタノール(250mL)混液に分散し、さらに0.166重量% の配列番号１のNF-κBデコイ水溶液を75mL添加し、良溶媒とした。1%キトサン水溶液を凍結乾燥処理により粉末とした。キトサン粉末2gとクエン酸水和物0.03ｇを精製水100mLに溶かし、2%キトサン水溶液とした（なお、クエン酸水和物は、キトサンの溶解性向上のために添加）。ポリビニルアルコール(PVA)8.33gならびに2%キトサン水溶液83.7gを精製水900mLに混合し貧溶媒とした（なお、PVAはナノ粒子の安定化剤として添加）。この貧溶媒中に前記良溶媒を40℃、400rpmで攪拌下、一定速度(4mL/分)で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってPLGAナノ粒子の懸濁液を得た。
(1) Production of chitosan-coated decoy-containing lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA)
1) Crystallization process Disperse 6.25 g of lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) in a mixture of acetone (645 mL) / ethanol (250 mL), and add 75 mL of 0.166% by weight NF-κB decoy aqueous solution of SEQ ID NO: 1. And a good solvent. A 1% chitosan aqueous solution was powdered by freeze-drying. 2 g of chitosan powder and 0.03 g of citric acid hydrate were dissolved in 100 mL of purified water to give a 2% chitosan aqueous solution (note that citric acid hydrate was added to improve the solubility of chitosan). 8.33 g of polyvinyl alcohol (PVA) and 83.7 g of a 2% chitosan aqueous solution were mixed with 900 mL of purified water to make a poor solvent (PVA was added as a nanoparticle stabilizer). The good solvent was dropped into the poor solvent at a constant rate (4 mL / min) while stirring at 40 ° C. and 400 rpm, and a suspension of PLGA nanoparticles was obtained by diffusion of the good solvent into the poor solvent.
2) 留去工程
減圧下にてPLGAナノ粒子の懸濁液からアセトン／エタノールを留去した後、得られたNF-κBデコイ含有粒子1.8gを以下の工程に供した。
2) Distillation step After acetone / ethanol was distilled off from the suspension of PLGA nanoparticles under reduced pressure, 1.8 g of the obtained NF-κB decoy-containing particles were subjected to the following step.
3) 凍結乾燥工程
続いて、マンニトール25gを添加した後、凍結乾燥によってPLGAナノ粒子粉末を得た（なお、マンニトールは、凍結保護剤として粒子同士の凝集防止、生体内でのナノサイズへの再分散性の向上、カプセル化する際の粉末のハンドリング改善のために添加）。PLGAナノ粒子粉末は、目開き106μmの篩で篩過処理したのち、カプセル剤製造に用いた。
3) Freeze-drying step Subsequently, PLGA nanoparticle powder was obtained by freeze-drying after adding 25 g of mannitol (note that mannitol was used as a cryoprotectant to prevent aggregation of particles, and to resize to nanosize in vivo. Added to improve dispersibility and improve powder handling during encapsulation). The PLGA nanoparticle powder was sieved with a sieve having an aperture of 106 μm and then used for capsule production.
4) 粒子物性
得られたPLGAナノ粒子の平均粒子径を動的光散乱法(測定装置：MICROTRAC UPA、日機装社製)により測定したところ、235nmであった。また、粒子表面のゼータ電位をゼータ電位計(ZETASIZER Nano-Z,Malvern Instruments社製）を用いて測定したところ、+15mVであった。さらに、ナノ粒子中のNF-κBデコイ含有量を紫外可視吸光度法で定量したところ、4.4%であった。
4) Particle properties The average particle diameter of the obtained PLGA nanoparticles was measured by a dynamic light scattering method (measuring device: MICROTRAC UPA, manufactured by Nikkiso Co., Ltd.) and found to be 235 nm. Further, the zeta potential of the particle surface was measured using a zeta electrometer (ZETASIZER Nano-Z, manufactured by Malvern Instruments) and found to be +15 mV. Furthermore, the NF-κB decoy content in the nanoparticles was quantified by the UV-visible absorbance method, and it was 4.4%.
(2) ３層シームレスソフトカプセルの製造
得られたデコイ配合PLGAナノ粒子複合体５ｇを融点約34℃および融点約43℃のグリセリン脂肪酸エステル準拠食用油脂(ヤシ硬化油)９５ｇを融解した中に分散し計１００ｇとし、これを同心三重ノズルの内側ノズルから、さらにその外側の中間ノズルから融点約43℃のグリセリン脂肪酸エステル準拠食用油脂４０gおよびレシチンを１０g融解した液５０ｇを、また最外側ノズルから皮膜となるゼラチン３５g、ペクチン５g、D-ソルビトール１０g、水１５０gの水溶液２００ｇを冷却され流動している油中に同時に滴下させることにより直径約1.2mmの３層構造のシームレスカプセルを作製し、このカプセルを通気乾燥させた。
(2) Production of three-layer seamless soft capsule 5 g of the obtained decoy-containing PLGA nanoparticle composite was dispersed in 95 g of glycerin fatty acid ester-based edible oil (hardened palm oil) having a melting point of about 34 ° C. and a melting point of about 43 ° C. 100 g in total, and this from the inner nozzle of the concentric triple nozzle, and further from the outer intermediate nozzle, 40 g of glycerin fatty acid ester-based edible fat and oil with a melting point of about 43 ° C. A continuous capsule having a diameter of about 1.2 mm was prepared by simultaneously dropping 200 g of an aqueous solution of 35 g of gelatin, 5 g of pectin, 10 g of D-sorbitol and 150 g of water into a cooled and flowing oil. Air-dried.
(3) マウス炎症性腸炎モデルにおける３層シームレスソフトカプセル製剤の効果
1) 方法
動物実験は臨床に近いモデルとしてTNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸)誘発慢性腸炎マウスを使用した。7週齢のオスC57BL/6Jマウス(約22g)の大腸に炎症を誘発するため25％エタノール50μLにTNBS 4mgを溶解し全量を200μLに調整したTNBS溶液を注腸で大腸内に注入した。その後1週毎に同量のTNBS溶液を大腸内に注入して（７、１４、２１日目）慢性化の病態を維持した。
(3) Effect of three-layer seamless soft capsule formulation in mouse inflammatory bowel disease model
1) Method Animal experiments used TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) -induced chronic enteritis mice as a clinical model. To induce inflammation in the large intestine of 7-week-old male C57BL / 6J mice (about 22 g), TNBS 4 mg dissolved in 50 μL of 25% ethanol and adjusted to a total volume of 200 μL was injected into the large intestine by enema. Thereafter, the same amount of TNBS solution was injected into the large intestine every week (7th, 14th, and 21st days) to maintain a chronic pathological condition.
慢性炎症の完成した7日目から前記３層シームレスソフトカプセルの大腸内投与(経肛門)を開始した。投与回数は週2回（9、13、16、20、23、27日目）で、28日目（4週目）に組織の摘出を行い、有効性の評価は生存率、体重変化、Disease activity index (DAI)、大腸長の変化で行った。なお、DAIはClin Exp Immunol. 2000 Apr;120(1):51-8.に従い、以下の項目の点数を合計しスコアを算出した(体重減少率スコア＋便性状スコア＋血便スコア、最低０〜最大12）。 On the 7th day after the completion of chronic inflammation, administration of the three-layer seamless soft capsule into the large intestine (transanal) was started. The frequency of administration is twice a week (9th, 13th, 16th, 20th, 23rd and 27th days). Tissues are removed on the 28th day (4th week), and efficacy is evaluated by survival rate, weight change, disease Activity index (DAI), changes in large intestine length. DAI was calculated according to Clin Exp Immunol. 2000 Apr; 120 (1): 51-8. The score was calculated by adding the scores of the following items (weight loss rate score + fecal property score + blood stool score, minimum 0- Up to 12).
慢性腸炎を誘発したマウスは、下記6群に無作為に振り分けた。
1. シャム群（食液の注入により大腸炎の誘発なし）
2. コントロール群（慢性腸炎誘発マウス）
3. 低用量治療群（慢性腸炎誘発後にNF-κBデコイ製剤2.26mg/kg投与）
4. 低用量ダミー群（慢性腸炎誘発後に低用量群と同じ量のダミー製剤を投与）
5. 高用量治療群（慢性腸炎誘発後にNF-κBデコイ製剤11.32mg/kg投与）
6. 高用量ダミー群（慢性腸炎誘発後に高用量群と同じ量のダミー製剤を投与）
Mice that induced chronic enteritis were randomly assigned to the following 6 groups.
1. Siamese group (no colitis induced by infusion of food)
2. Control group (chronic enteritis-induced mice)
3. Low-dose treatment group (NF-κB decoy preparation 2.26 mg / kg administered after induction of chronic enteritis)
4. Low-dose dummy group (administer the same amount of dummy as the low-dose group after induction of chronic enteritis)
5. High-dose treatment group (11.32 mg / kg of NF-κB decoy preparation after induction of chronic enteritis)
6. High-dose dummy group (administer the same amount of dummy preparation as the high-dose group after induction of chronic enteritis)
2) 結果
高用量治療群はコントロール群に比べ、体重減少(図１)、DAI(図２)そして大腸長の短縮は軽度であった(図３)。その結果、デコイ治療群は用量依存的に有意な生存率の改善を認め(図４)、本製剤の有効性が確認された。
2) Results In the high-dose treatment group, weight loss (Figure 1), DAI (Figure 2), and shortening of the colon length were milder than those in the control group (Figure 3). As a result, the decoy treatment group showed a significant improvement in survival rate in a dose-dependent manner (FIG. 4), confirming the effectiveness of this preparation.
Claims (16)
(1) 常温で非流動性の疎水性物質に懸濁された核酸医薬含有生分解性ポリマーを主成分とする内層
(2) 常温で非流動性の疎水性物質とレシチンとの混合物を主成分とする中間層
(3) ゼラチン、ペクチンおよびソルビトールの混合物を主成分とする外層 A nucleic acid pharmaceutical preparation comprising seamless capsules composed of the following three layers.
(1) Inner layer composed mainly of biodegradable polymer containing nucleic acid drug suspended in non-flowable hydrophobic substance at room temperature
(2) Intermediate layer mainly composed of a mixture of a non-flowable hydrophobic substance at room temperature and lecithin
(3) Outer layer mainly composed of a mixture of gelatin, pectin and sorbitol
(式中、rはAまたはGを、hはA、CまたはTを、yはCまたはTを、それぞれ意味する。) The nucleic acid pharmaceutical preparation according to claim 13, wherein the NF-κB decoy is an oligonucleotide comprising the sequence ggrhtyyh.
(In the formula, r means A or G, h means A, C or T, and y means C or T.)
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