JP2014023457A - Nerve cell sheet and method for producing the same - Google Patents
Nerve cell sheet and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014023457A JP2014023457A JP2012165108A JP2012165108A JP2014023457A JP 2014023457 A JP2014023457 A JP 2014023457A JP 2012165108 A JP2012165108 A JP 2012165108A JP 2012165108 A JP2012165108 A JP 2012165108A JP 2014023457 A JP2014023457 A JP 2014023457A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- nerve
- nerve cell
- cell
- cell sheet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、神経細胞シート及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a nerve cell sheet and a method for producing the same.
現在、脳卒中の患者数は日本において約150万人と言われており、毎年25万人以上が新たに脳卒中と診断されている。脳卒中に代表される脳血管疾患では、例えば大脳皮質において神経細胞(ニューロン)が損傷又は死滅するため、損傷部位における機能の回復は非常に困難と考えられている。
一般に、生体組織の一部が損傷した場合の治療又は状態を改善するための方法のひとつとして、損傷した部位に、細胞又は損傷した組織の移植が提案されており、一部の組織については実際に実施されている。
移植に用いられる材料として、例えば、特許文献1には、角膜内皮細胞で構成された再生角膜内皮細胞シートが開示されている。また特許文献2には、表皮細胞で構成された表皮培養細胞シート等が開示されている。
大脳皮質における損傷については、神経細胞を損傷部位に注入する方法が挙げられる(例えば、非特許文献1参照)。
Currently, the number of stroke patients is said to be about 1.5 million in Japan, and more than 250,000 people are newly diagnosed with stroke every year. In cerebrovascular diseases represented by stroke, for example, nerve cells (neurons) are damaged or killed in the cerebral cortex, so that it is considered very difficult to restore the function at the damaged site.
In general, as one of the methods for improving treatment or condition when a part of living tissue is damaged, it has been proposed to transplant cells or damaged tissue to the damaged site. Has been implemented.
As a material used for transplantation, for example, Patent Document 1 discloses a regenerated corneal endothelial cell sheet composed of corneal endothelial cells. Patent Document 2 discloses an epidermal cultured cell sheet composed of epidermal cells.
As for damage in the cerebral cortex, a method of injecting nerve cells into the damaged site can be mentioned (for example, see Non-Patent Document 1).
また、神経疾患の治療として、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞を移植して、損傷した中枢神経を再生する医療が注目されている。この治療のために、神経幹細胞/前駆細胞の増殖促進剤(例えば、特許文献3参照)や、分化促進剤(例えば、特許文献4参照)が開発され、それらの使用が提案されている。 In addition, as a treatment for neurological diseases, medical treatment for regenerating damaged central nerves by transplanting neural stem cells and / or neural progenitor cells has attracted attention. For this treatment, neural stem / progenitor cell proliferation promoters (for example, see Patent Document 3) and differentiation promoters (for example, see Patent Document 4) have been developed and their use has been proposed.
しかしながら、表皮細胞等とは異なり、神経細胞が機能的に作用するためには、軸索や髄鞘、シナプスの形成といった複雑な構造が必要である。また、神経細胞は、このような複雑な構造を有する神経細胞が、ネットワークを形成して細胞間相互作用することにより、初めてその機能が発揮される特殊な細胞であることも知られている。このため、神経細胞を移植物として利用するには、単一細胞の状態で損傷部位に注入しても、期待される効果が得られない場合がある。 However, unlike epidermis cells and the like, a complex structure such as axon, myelin sheath, and synapse formation is necessary for a neuron to function functionally. It is also known that nerve cells having such a complex structure are special cells that exhibit their functions for the first time when they form a network and interact with each other. For this reason, in order to use a nerve cell as a transplant, even if it is injected into a damaged site in a single cell state, the expected effect may not be obtained.
従って、本発明は、神経細胞の機能が効果的に発揮される神経細胞シート及びその製造方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a nerve cell sheet in which the function of nerve cells is effectively exhibited and a method for producing the same.
本発明は以下のとおりである。
[1] 軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シート。
[2] 前記培養神経細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)及び人工多能性幹細胞(iPS細胞)からなる群より選択された少なくとも1種の前駆細胞から誘導された細胞である[1]に記載の神経細胞シート。
[3] 前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、前記神経細胞を、SDF1(Stromal cells-derived factor-1)及びMCP−1(Monocyte chemoattractant propein-1)の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、[1]又は[2]に記載の神経細胞シートの製造方法。
[4] 前記SDF1及びMCP−1の少なくとも一方の培養液中の濃度が、0.5ng/mL〜30ng/mLである[3]記載の神経細胞シートの製造方法。
[5] 前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤が、サイクロパミン、ジェルビン及びトマチジンからなる群より選択された少なくとも1種を含む[3]又は[4]記載の神経細胞シートの製造方法。
[6] 前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤の培養液中の濃度が、2.0×10−7μM〜3.0μMである[3]〜[5]のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
[7] 前記分化誘導剤が、レチノイン酸、ノギン、繊維芽細胞成長因子(FGF)及び神経細胞成長因子(NGF)からなる群より選択された少なくとも1種を含む[3]〜[6]のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
[8] 前記前駆細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞及び神経前駆細胞からなる群より選択された少なくとも1種である[3]〜[7]のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
[9] [1]又は[2]に記載の神経細胞シートを含む移植用シート材。
The present invention is as follows.
[1] A nerve cell sheet having a nerve cell layer formed by cultured nerve cells in which axons are extended.
[2] In the above [1], the cultured neuron cell is a cell derived from at least one progenitor cell selected from the group consisting of an embryonic stem cell (ES cell) and an induced pluripotent stem cell (iPS cell). The nerve cell sheet described.
[3] Progenitor cells are cultured in a culture medium containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation-inducing agent to induce neurons from the precursor cells, and the neurons are transformed into SDF1 (Stromal cells-derived factor). -1) and MCP-1 (Monocyte chemoattractant propein-1) cultured in a culture medium containing at least one, induces axonal extension of the nerve cells, and nerves formed by cultured neurons that have axonal extension Obtaining a cell layer, The method for producing a nerve cell sheet according to [1] or [2].
[4] The method for producing a nerve cell sheet according to [3], wherein the concentration of at least one of the SDF1 and MCP-1 in the culture solution is 0.5 ng / mL to 30 ng / mL.
[5] The method for producing a nerve cell sheet according to [3] or [4], wherein the sonic hedgehog inhibitor includes at least one selected from the group consisting of cyclopamine, jervin and tomatidine.
[6] The production of the nerve cell sheet according to any one of [3] to [5], wherein the concentration of the sonic hedgehog inhibitor in the culture solution is 2.0 × 10 −7 μM to 3.0 μM. Method.
[7] The differentiation inducer according to [3] to [6], wherein the differentiation inducer includes at least one selected from the group consisting of retinoic acid, noggin, fibroblast growth factor (FGF), and nerve cell growth factor (NGF). The manufacturing method of the nerve cell sheet in any one.
[8] The progenitor cells are at least one selected from the group consisting of embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells and neural progenitor cells [3] to [7 ] The manufacturing method of the nerve cell sheet in any one of.
[9] A sheet material for transplantation comprising the nerve cell sheet according to [1] or [2].
本発明によれば、神経細胞の機能が発揮される神経細胞シート及びその製造方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the nerve cell sheet in which the function of a nerve cell is exhibited and its manufacturing method can be provided.
本発明の神経細胞シートは、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートである。
また、本発明の神経細胞シートの製造方法は、前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、並びに、前記神経細胞を、SDF1(Stromal cells-derived factor-1)及びMCP−1(Monocyte chemoattractant propein-1)の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法である。
The nerve cell sheet of the present invention is a nerve cell sheet having a nerve cell layer formed by cultured nerve cells in which axons are extended.
Moreover, the method for producing a nerve cell sheet of the present invention comprises culturing progenitor cells in a culture solution containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer, inducing nerve cells from the progenitor cells, and Culturing the nerve cell in a culture medium containing at least one of SDF1 (Stromal cells-derived factor-1) and MCP-1 (Monocyte chemoattractant propein-1) to induce axonal extension of the nerve cell; A method for producing a nerve cell sheet having a nerve cell layer formed by a nerve cell extended by axon, comprising obtaining a nerve cell layer formed by cultured nerve cells extended by axon.
前記神経細胞シートは、個々の神経細胞が単に集められたものではなく、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有するので、神経細胞層において、神経細胞による細胞間相互作用が保持されている。このため、細胞間相互作用が保持されていない状態の神経細胞を用いる場合と異なり、神経細胞の高い機能の発揮が期待される。 The nerve cell sheet is not a collection of individual nerve cells, but has a nerve cell layer formed by cultured nerve cells in which axons have been extended. Is retained. For this reason, unlike the case of using a nerve cell in a state where the cell-cell interaction is not maintained, it is expected that the nerve cell exhibits a high function.
これを更に説明すれば、神経細胞は、増殖後に最終的に分化すると、軸索伸展可能な突起を有する形態となり、且つ増殖を停止する。神経細胞が機能を発揮するには、神経細胞同士の情報の伝達が不可欠であり、軸索伸展した形態が必須である。本発明にかかる神経細胞シートは、このような軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有するので、神経細胞の細胞間相互作用が保持され、トリプシンを使用して回収された神経細胞を直接投与する従来法より神経細胞の生着率も高くなり、神経細胞の細胞間相互作用に基づく高い機能が発揮される。 To explain this further, when the nerve cell finally differentiates after proliferation, it becomes a form having a protrusion capable of axon extension and stops proliferation. In order for nerve cells to exert their functions, it is indispensable to transmit information between nerve cells, and an axon extended form is essential. Since the nerve cell sheet according to the present invention has a nerve cell layer formed by such cultured axon-extended nerve cells, the nerve cell-cell interaction is retained and the nerves collected using trypsin are retained. Compared with the conventional method in which cells are directly administered, the engraftment rate of nerve cells is increased, and a high function based on the cell-cell interaction of neurons is exhibited.
また本発明の神経細胞シートの製造方法は、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で前駆細胞から神経細胞を誘導し、また、SDF1及びMCP−1の少なくとも一方を含む培養液中で神経細胞の軸索伸展を誘導して、軸索伸展した培養神経細胞により形成された層を得るので、軸索伸展した培養神経細胞を高い含有率で含む神経細胞層を有し、その結果、神経細胞の機能を発現可能な神経細胞シートを効率よく作製することができる。 In addition, the method for producing a nerve cell sheet of the present invention induces a nerve cell from a precursor cell in a culture solution containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer, and also includes a culture containing at least one of SDF1 and MCP-1. Inducing axonal extension of nerve cells in the liquid to obtain a layer formed by cultured nerve cells that have extended axons, so that it has a nerve cell layer that contains a high proportion of cultured neurons that have axonal extension, As a result, a nerve cell sheet capable of expressing the function of nerve cells can be efficiently produced.
本発明において、神経細胞層に関して「神経細胞により形成されている」とは、最終分化を終えた複数の神経細胞を所定条件下で培養することによって伸展した前記複数の神経細胞の軸索が互いに連結することにより、神経細胞層が主として構成されていることを意味する。
本発明において、「軸索伸展した」とは、神経細胞同士が軸細工を網の目状に構築して相互に一体となった状態を意味する。
In the present invention, with respect to the nerve cell layer, “formed by nerve cells” means that the axons of the plurality of nerve cells extended by culturing a plurality of nerve cells that have undergone final differentiation under predetermined conditions are mutually connected. By connecting, it means that the nerve cell layer is mainly composed.
In the present invention, the term “axon extended” means a state in which nerve cells are integrated with each other by constructing a shaftwork in a mesh shape.
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
In this specification, the term “process” is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of the process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
In the present specification, “to” indicates a range including the numerical values described before and after the values as a minimum value and a maximum value, respectively.
Furthermore, in this specification, the amount of each component in the composition is the total amount of the plurality of substances present in the composition unless there is a specific indication when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition. means.
The present invention will be described below.
[神経細胞シート]
本発明にかかる神経細胞シートは、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する。
[Neuron cell sheet]
The nerve cell sheet according to the present invention has a nerve cell layer formed by cultured nerve cells in which axons are extended.
<神経細胞層>
前記神経細胞層は、軸索伸展した培養神経細胞により形成されている。
神経細胞(ニューロン)は、細胞体と突起(樹状突起及び軸索)からなる複雑な構造を有する細胞であり、機能面から、運動神経細胞、介在神経細胞、及び感覚神経細胞の3種に分けられる。前記神経細胞層を形成する神経細胞は、運動神経細胞、介在神経細胞及び感覚神経細胞のいずれであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。運動機能の修復の点で、運動神経細胞であることが好ましい。運動神経細胞としては、皮質運動神経細胞、脊椎運動神経を挙げることができるが、大脳皮質の機能障害に対する治療的効果の観点から皮質運動神経細胞であることがより好ましい。
<Neuron cell layer>
The nerve cell layer is formed by cultured nerve cells in which axons are extended.
A nerve cell (neuron) is a cell having a complex structure composed of a cell body and a process (dendrites and axons), and from a functional aspect, it is classified into three types of motor neurons, intervening neurons, and sensory neurons. Divided. The nerve cells forming the nerve cell layer may be any of motor neurons, intervening neurons and sensory neurons, or a combination thereof. From the viewpoint of repair of motor function, a motor nerve cell is preferable. Examples of motor neurons include cortical motor neurons and spinal motor nerves, and cortical motor neurons are more preferable from the viewpoint of therapeutic effects on cerebral cortical dysfunction.
また、前記神経細胞層には、層の形状を保持できる範囲で、軸索伸展していない神経細胞が含まれていてもよい。神経細胞が軸索伸展していることは、その形態に基づき、光学顕微鏡、実態顕微鏡により確認することができる。前記神経細胞シートの効果的な機能発現の観点から、軸索伸展している神経細胞の含有率は、前記神経細胞層に含まれる神経細胞の全細胞数の70%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましい。神経細胞全細胞数における軸索伸展している神経細胞数の割合は、ヘマトキシリン・エオジン染色により確認することができる。 The nerve cell layer may include nerve cells that are not axonally extended within a range in which the shape of the layer can be maintained. It can be confirmed by the optical microscope and the actual microscope that the nerve cells are axon-extended based on the form. From the viewpoint of effective functional expression of the nerve cell sheet, the content of nerve cells that are axon-extending is preferably 70% or more of the total number of neurons contained in the nerve cell layer, More preferably, it is 80% or more. The ratio of the number of nerve cells having axonal extension in the total number of nerve cells can be confirmed by staining with hematoxylin and eosin.
前記神経細胞は、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞及び神経前駆細胞からなる群より選択された少なくとも1種の前駆細胞から誘導された細胞であることが、細胞の供給量の観点から、好ましい。
前記前駆細胞としては、神経細胞への誘導が可能な細胞であればいずれであってもよく、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPS細胞)、胎児神経細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせ使用することができる。中でも、細胞の供給量の点で、ES細胞及びiPS細胞であることが好ましい。
The neural cell is a cell derived from at least one progenitor cell selected from the group consisting of embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells and neural progenitor cells. Is preferable from the viewpoint of the amount of cells supplied.
The progenitor cells may be any cells that can be induced into nerve cells, such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), fetal nerves Examples thereof include cells, neural stem cells, neural progenitor cells and the like, and these can be used alone or in combination. Among these, ES cells and iPS cells are preferable in terms of the amount of cells supplied.
これらの細胞は、哺乳動物の霊長類(例えばヒト、サルなど)、有蹄類(例えば豚、牛、馬など)、小型哺乳類の齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギなど)の種々の動物に由来するものから、適宜使用目的に応じて選択することができる。また、細胞の供給源としては、成体に限定されず、胎児由来であってもよい。 These cells are used in various animals such as mammalian primates (eg, humans, monkeys, etc.), ungulates (eg, pigs, cows, horses, etc.), small mammal rodents (eg, mice, rats, rabbits, etc.). Can be appropriately selected according to the purpose of use. The cell supply source is not limited to adults, but may be derived from a fetus.
胚性幹細胞とは、初期胚に由来する多能性幹細胞をいい、無限増殖能と複数の細胞系列への分化能を有することを特徴としている。胚性幹細胞は、受精卵ないし受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの段階の初期胚から単離することができ、また例えば理化学研究所から入手することができる。 Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos, and are characterized by infinite proliferation ability and differentiation ability into multiple cell lines. Embryonic stem cells can be isolated from a fertilized egg or an early embryo at a stage from the fertilized egg to a blastocyst that has developed, and can be obtained from, for example, RIKEN.
iPS細胞は、OCT3/4、SOX2、KLF4、C−MYC等の遺伝子を体細胞へ導入して作製される多能性幹細胞である(Cell, Vol.131: pp.861-872)。ここで、「多能性」とは、複数の細胞系列への分化能を意味し、奇形腫形成法により確認することができる。iPS細胞株としては、市販されているものを利用することができ、例えば、理化学研究所 バイオリソースセンター等より、253G1株(ヒト)、201B7株(ヒト)等として入手することができる。また、iPS細胞株は、ヒトの患者皮膚繊維芽細胞から上記文献等に従って新たに作製したiPS細胞であってもよい。iPS細胞及びiPS細胞から誘導された細胞であることは、OCT3/4、SOX2、KLF4、C−MYC等の検出により確認することができる。 iPS cells are pluripotent stem cells prepared by introducing genes such as OCT3 / 4, SOX2, KLF4, and C-MYC into somatic cells (Cell, Vol. 131: pp. 861-872). Here, “pluripotency” means the ability to differentiate into a plurality of cell lines, and can be confirmed by a teratoma formation method. A commercially available iPS cell line can be used, and for example, it can be obtained as a 253G1 strain (human), 201B7 strain (human), etc. from RIKEN BioResource Center. Further, the iPS cell line may be an iPS cell newly prepared from human patient skin fibroblasts according to the above-mentioned document or the like. iPS cells and cells derived from iPS cells can be confirmed by detecting OCT3 / 4, SOX2, KLF4, C-MYC, and the like.
神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア細胞に分化する細胞を供給する能力を持つ幹細胞である。また、神経前駆細胞は、神経のみに分化する未分化細胞である。これらの細胞は、厳密に区別することが困難なため、本発明においては区別なく適用される。神経幹細胞又は神経前駆細胞はいずれも、例えば、ヒトiPS細胞より分化誘導することにより入手することができる。神経幹細胞若しくは神経幹細胞から誘導された細胞、又は神経前駆細胞若しくは神経前駆細胞から誘導された細胞であることは、ネスチン蛋白質の発現、フローサイトメーターによるNCAM陽性により確認することができる。 Neural stem cells are stem cells that have the ability to supply cells that differentiate into neurons and glial cells. Neural progenitor cells are undifferentiated cells that differentiate only into nerves. Since these cells are difficult to distinguish strictly, they are applied without distinction in the present invention. Any of the neural stem cells or neural progenitor cells can be obtained by, for example, inducing differentiation from human iPS cells. Neural stem cells or cells derived from neural stem cells, or neural progenitor cells or cells derived from neural progenitor cells can be confirmed by nestin protein expression and NCAM positivity using a flow cytometer.
前記神経細胞であることは、上述した特徴的な形態に基づく確認の他、神経細胞のマーカーとして既知の分子の検出により確認することができる。例えば、運動神経細胞のマーカーとしては、CTIP2(COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2)、Fezf2(FEZ(Forebraiin embryonic zinc finger) family zing finger 2)、FoxP2(forkhead box P2)、及びCrim1(Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor)等を挙げることができる。これらのマーカーの存在の確認は、遺伝子の発現又はタンパク質の検出などの既知の方法により行うことができる。 Being a neuron can be confirmed by detecting a molecule known as a neuron marker in addition to the confirmation based on the characteristic form described above. For example, CTIP2 (COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) -TF (transcription factor) -interaction protein 2), Fezf2 (FEZ (Forebraiin embryonic zinc finger) family zing finger 2), FoxP2 (forkhead box) P2) and Crim1 (Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor). The presence of these markers can be confirmed by known methods such as gene expression or protein detection.
前記神経細胞層は、神経細胞層を構成する細胞の少なくとも50%以上が前記神経細胞であればよく、層(シート)の形状を保持できる範囲で、神経細胞以外の細胞を含むことができる。神経細胞シートの強度及び機能性発揮の点で、前記神経細胞シートを構成する全細胞における神経細胞の割合は、70%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、85%以上であること更に好ましく、95%以上であることが更により好ましい。シートを構成する全細胞における神経細胞の割合を高くすると、他種の細胞の混入頻度が低下し、シートの強度が向上する傾向があり、また、単位面積あたりの機能発現効率が高くなる傾向がある。 The nerve cell layer is sufficient if at least 50% or more of the cells constituting the nerve cell layer are the nerve cells, and can include cells other than nerve cells as long as the shape of the layer (sheet) can be maintained. In terms of the strength and functionality of the nerve cell sheet, the ratio of the nerve cells in the total cells constituting the nerve cell sheet is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, 85% More preferably, it is more preferably 95% or more. Increasing the proportion of neurons in all the cells that make up the sheet tends to reduce the frequency of mixing of other types of cells, improving the strength of the sheet, and increasing the function expression efficiency per unit area. is there.
前記神経細胞層に含まれうる他の種類の細胞としては、血管内皮細胞、線維芽細胞、口腔粘膜上皮細胞、気管気管支上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞、下腸粘膜上皮細胞等の各種上皮細胞などが挙げられる。これらの細胞が含まれる場合には、神経細胞以外の細胞に対して、放射線照射などの既知の増殖抑制処理を行っておくことが好ましい。
前記神経細胞層を構成する細胞の数については特に制限はなく、例えば、0.1個/cm2〜0.1×106個/cm2とすることができる。
前記神経細胞シートは、移植時等を考慮すると神経細胞層のみで構成されていることが好ましいが、神経細胞層以外の他の層を含むことができる。他の層としては、例えば、線維芽細胞又は上皮細胞を含む細胞層を挙げることができる。これらの他の細胞による層を含むことにより、他の細胞からの因子などにより、神経細胞層に含まれる神経細胞の状態を良好なものにすることができる。
Other types of cells that can be contained in the nerve cell layer include vascular endothelial cells, fibroblasts, oral mucosal epithelial cells, tracheobronchial epithelial cells, gastric mucosal epithelial cells, corneal epithelial cells, intestinal mucosal epithelial cells, etc. Examples include various epithelial cells. When these cells are included, it is preferable to perform known growth suppression treatment such as radiation irradiation on cells other than nerve cells.
Wherein the neurological The number of cells cell layer constituting not particularly limited, for example, be a 0.1 or / cm 2 ~0.1 × 10 6 cells / cm 2.
The nerve cell sheet is preferably composed of only a nerve cell layer in consideration of transplantation and the like, but may include other layers other than the nerve cell layer. Examples of other layers include cell layers including fibroblasts or epithelial cells. By including the layer of these other cells, the state of the nerve cell contained in the nerve cell layer can be improved by factors from other cells.
前記神経細胞シートの厚み及び大きさについては特に制限はなく、必要に応じて、適宜調製することができる。前記神経細胞シートにおける神経細胞層の厚みとしては、一般に0.05mm〜1mmの範囲とすることができる。
前記神経細胞シートの前記神経細胞層の大きさ及び厚みは、後述する製造方法における培養期間の調整や、細胞の播種密度等を調整することにより、前記神経細胞層の厚みを調節することができる。神経細胞層の厚みは、例えば、神経細胞シートの切片を作製することにより顕微鏡下で確認することができる。他の細胞による層を有する場合には、神経細胞層の厚み及び大きさと同様に、培養期間の調整や、細胞の播種密度等を調整することにより適宜調節することができる。
There is no restriction | limiting in particular about the thickness and magnitude | size of the said neuronal cell sheet | seat, It can prepare suitably as needed. The thickness of the nerve cell layer in the nerve cell sheet can generally be in the range of 0.05 mm to 1 mm.
The size and thickness of the nerve cell layer of the nerve cell sheet can adjust the thickness of the nerve cell layer by adjusting the culture period in the manufacturing method described later, the cell seeding density, and the like. . The thickness of the nerve cell layer can be confirmed under a microscope, for example, by preparing a section of a nerve cell sheet. In the case of having a layer of other cells, it can be appropriately adjusted by adjusting the culture period, the cell seeding density, etc., similarly to the thickness and size of the nerve cell layer.
[神経細胞シートの製造方法]
本発明にかかる神経細胞シートの製造方法は、前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること(以下、細胞誘導工程ということがある)、並びに、前記神経細胞を、SDF1(Stromal cells-derived factor-1)及びMCP−1(Monocyte chemoattractant propein-1)の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること(以下、軸索伸展誘導工程ということがある)、を含む、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法である。
[Manufacturing method of nerve cell sheet]
In the method for producing a nerve cell sheet according to the present invention, precursor cells are cultured in a culture solution containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer, and nerve cells are induced from the precursor cells (hereinafter referred to as cells). And may be referred to as an induction step), and the neurons are cultured in a culture medium containing at least one of SDF1 (Stromal cells-derived factor-1) and MCP-1 (Monocyte chemoattractant propein-1), Inducing axonal extension of nerve cells and obtaining a nerve cell layer formed by cultured neurons that have axonal extensions (hereinafter sometimes referred to as axonal extension induction process) A method for producing a nerve cell sheet having a nerve cell layer formed by cells.
前記細胞誘導工程では、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で前駆細胞から神経細胞を誘導する。ソニック・ヘッジホッグは、分化誘導に用いられるタンパク質として既知のものであるが、前記製造方法では、ソニック・ヘッジホッグの阻害剤と分化誘導剤とを組み合わせることにより、前駆細胞から神経細胞を高頻度に誘導することができる。 In the cell induction step, nerve cells are induced from progenitor cells in a culture solution containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer. Sonic hedgehog is known as a protein used for differentiation induction. However, in the production method described above, a nerve cell is frequently generated from progenitor cells by combining a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer. Can be guided to.
ソニック・ヘッジホッグ阻害剤としては、サイクロパミン、ジェルビン及びトマチジン等を挙げることができ、これらを単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらのソニック・ヘッジホッグ阻害剤の中でも、皮質運動神経細胞の誘導効率の点で、サイクロパミン、ジェルビンが好ましく、サイクロパミンがより好ましい。 Examples of the sonic hedgehog inhibitor include cyclopamine, gerbin, tomatidine, and the like, and these can be used alone or in combination of two or more. Among these sonic hedgehog inhibitors, cyclopamine and jervin are preferable, and cyclopamine is more preferable in terms of induction efficiency of cortical motor neurons.
前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤の培養液中の濃度としては、用いられるソニック・ヘッジホッグ阻害剤の種類のよって異なるが、サイクロパミンの場合には、2.0×10−7μM〜3.0μMであることが好ましく、2.5×10−5μM〜2.5×10−2μMであることがより好ましい。2.0×10−7μM以上の濃度であれば、前駆細胞から確実に神経細胞を誘導できる傾向があり、3.0μM以下の濃度であれば、細胞の死滅をより確実に抑制して充分な数の神経細胞を誘導できる傾向がある。特に、2.5×10−2μM以下とすることにより、確実に運動神経細胞へ誘導することができる。 The concentration of the sonic hedgehog inhibitor in the culture solution varies depending on the type of the sonic hedgehog inhibitor used. In the case of cyclopamine, the concentration is 2.0 × 10 −7 μM to 3.0 μM. It is preferable that it is 2.5 * 10 < -5 > micromol-2.5 * 10 < -2 > micromol. If the concentration is 2.0 × 10 −7 μM or more, there is a tendency that nerve cells can be reliably induced from the progenitor cells. If the concentration is 3.0 μM or less, cell death is more reliably suppressed and sufficient. There is a tendency to induce a large number of neurons. In particular, by setting it to 2.5 × 10 −2 μM or less, it can be surely induced into motor neurons.
前記分化誘導剤としては、前駆細胞から神経細胞への分化誘導に寄与することが既知のいずれの分化誘導剤を使用することができる。このような分化誘導剤としては、レチノイン酸(RA)、ノギン(Noggin)、繊維芽細胞成長因子(FGF)及び神経細胞成長因子(NGF)等を挙げることができ、これらを単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。神経細胞への誘導効率の観点から、レチノイン酸、ノギン、FGFからなる群より選択された2つ以上を組み合わせて使用することが好ましく、レチノイン酸及びノギンの組み合わせであることがより好ましい。また、ノギン、FGF及びNGFについては、天然物であってもよく、遺伝子組換え体であってもよい。これらの分化誘導剤は、化合物そのものとして添加してもよく、安定性や反応性の観点から化学的に修飾されたものや多量体形式にしたものであってもよい。例えば、ノギンの場合には、三量体で使用してもよく、免疫グロブリン重鎖の定常部(Fc)と結合体であってもよい。 As the differentiation inducer, any differentiation inducer known to contribute to differentiation induction from progenitor cells to nerve cells can be used. Examples of such differentiation inducers include retinoic acid (RA), noggin, fibroblast growth factor (FGF), and nerve cell growth factor (NGF). These may be used alone or in combination of two. The above can be used in combination. From the viewpoint of the induction efficiency to nerve cells, it is preferable to use a combination of two or more selected from the group consisting of retinoic acid, noggin and FGF, and more preferably a combination of retinoic acid and noggin. Further, noggin, FGF and NGF may be natural products or gene recombinants. These differentiation-inducing agents may be added as the compound itself, or may be those chemically modified from the viewpoint of stability and reactivity or those in a multimeric form. For example, in the case of Noggin, it may be used as a trimer, or may be a conjugate with a constant region (Fc) of an immunoglobulin heavy chain.
前記分化誘導剤の培養液中での濃度は、前駆細胞から神経細胞への分化を誘導可能な濃度であればよく、個々の分化誘導剤にて既知の濃度をそのまま用いることができる。例えば、レチノイン酸の場合には、0.01μM〜10μMであることが好ましく、1μM〜5μMであることが更に好ましい。またノギンの場合には、1ng/ml〜1,000ng/mlであることが好ましく、100ng/ml〜500ng/mlであることが更に好ましい。 The concentration of the differentiation inducer in the culture solution may be any concentration that can induce differentiation from progenitor cells to neurons, and a known concentration can be used as it is for each differentiation inducer. For example, in the case of retinoic acid, it is preferably 0.01 μM to 10 μM, more preferably 1 μM to 5 μM. In the case of Noggin, it is preferably 1 ng / ml to 1,000 ng / ml, more preferably 100 ng / ml to 500 ng / ml.
前記前駆細胞としては、神経細胞への誘導が可能な細胞であればいずれであってもよく、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPS細胞)、神経幹細胞、神経前駆細胞等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて使用することができる。中でも、細胞の供給量の点で、ES細胞及びiPS細胞であることが好ましい。前記前駆細胞として使用可能な胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPS細胞)、神経幹細胞、神経前駆細胞等の前駆細胞については、神経細胞シートに関する前駆細胞として記載した事項をそのまま適用することができる。 The progenitor cells may be any cells that can be induced into nerve cells, such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells. , Neural progenitor cells and the like, and these can be used alone or in combination. Among these, ES cells and iPS cells are preferable in terms of the amount of cells supplied. For progenitor cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, and neural progenitor cells that can be used as the progenitor cells, The matters described can be applied as they are.
分化誘導工程に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、DMEM、MEM、F12、DME培地等を挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、血清成分、抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン等)などを添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10%(v/v)とすることができる。ES細胞又はiPS細胞の培養を行う場合には、血清を含まないことが好ましく、ノックアウト血清代替物(KSR)を用いることが好ましい。
細胞の培養には、通常の培養条件、例えば37℃の温度で5%CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
The culture solution used in the differentiation induction step can be appropriately selected depending on the type of cells to be cultured. The culture medium that can be used may be any known one, and examples thereof include DMEM, MEM, F12, and DME medium. In addition, various components that can be generally added, such as glucose, serum components, antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.), etc., may be added to these culture solutions. In addition, although the density | concentration in the case of adding serum can be suitably changed according to the culture state at that time, it can usually be 10% (v / v). When culturing ES cells or iPS cells, it is preferable not to contain serum, and it is preferable to use a knockout serum substitute (KSR).
For cell culture, normal culture conditions, for example, culture in an incubator with a temperature of 37 ° C. and a concentration of 5% CO 2 are applied.
分化誘導工程の培養に用いられる培養器としては、使用する種類の細胞の培養に通常用いられる培養器であれば特に制限はない。例えば、胚性幹細胞又はiPS細胞の場合には、生育効率の観点から、付着性を有する培養表面を備えた培養器であることが好ましい。
このような付着性の培養表面を有する培養器としては、例えば、フィブロネクチン(FN)、ビトロネクチン(VN)、ラミニン等の細胞接着因子やゼラチン等の水溶性高分子化合物などにより被覆された培養表面を有する培養器等を挙げることができる。
The incubator used for the culture in the differentiation induction step is not particularly limited as long as it is a normal incubator for culturing the type of cells used. For example, in the case of embryonic stem cells or iPS cells, from the viewpoint of growth efficiency, an incubator equipped with an adherent culture surface is preferable.
As an incubator having such an adherent culture surface, for example, a culture surface coated with a cell adhesion factor such as fibronectin (FN), vitronectin (VN), laminin, or a water-soluble polymer compound such as gelatin is used. Examples include incubators having the same.
培養器への前駆細胞の播種密度としては、増殖効率の観点からの観点から、例えば10cmペトリ皿の場合には0.5×105/ペトリ皿〜1.0×107個/ペトリ皿とすることができる。 As the seeding density of the progenitor cells in the incubator, from the viewpoint of proliferation efficiency, for example, in the case of a 10 cm petri dish, 0.5 × 10 5 / petri dish to 1.0 × 10 7 pieces / petri dish can do.
前記前駆細胞の種類によっては、増殖効率等の観点から、フィーダー細胞と共に培養してもよい。フィーダー細胞としては、前駆細胞の増殖及び神経細胞シートの機能を損なわないものであればいずれも使用可能であり、一般に、マウス胎児、線維芽細胞等が挙げられる。また、前記フィーダー細胞としては、放射線照射及びマイトマイシンC等の薬剤の使用により増殖抑制処理を施したものであることが好ましい。 Depending on the type of the progenitor cells, the cells may be cultured with feeder cells from the viewpoint of proliferation efficiency and the like. Any feeder cells can be used as long as they do not impair the proliferation of progenitor cells and the function of the nerve cell sheet, and generally include mouse embryos, fibroblasts and the like. In addition, the feeder cells are preferably those that have been subjected to growth inhibition treatment by irradiation and use of a drug such as mitomycin C.
分化誘導のための培養期間としては、例えば、8〜30日間とすることができる。神経細胞への分化誘導は、PCR法・免疫染色法にてネスチン、ニューロフィラメントM鎖、βIIIチューブリンの発現により確認することができる。 The culture period for differentiation induction can be 8 to 30 days, for example. Induction of differentiation into nerve cells can be confirmed by the expression of nestin, neurofilament M chain, and βIII tubulin by PCR and immunostaining.
前記分化誘導工程の前に、所定の細胞数を満たすことを目的として、前培養工程を設けてもよい。前培養工程としては、分化誘導前の前駆細胞を増殖可能な既知の培養条件を適用することができる。前培養の条件としては、対象となる細胞の種類によって異なるが、当業者であれば、培地組成、培養温度、培養期間等の既知の条件から適宜選択可能である。 Prior to the differentiation induction step, a preculture step may be provided for the purpose of satisfying a predetermined number of cells. As the preculture step, known culture conditions that can proliferate progenitor cells before differentiation induction can be applied. The preculture conditions vary depending on the type of target cells, but those skilled in the art can appropriately select from known conditions such as medium composition, culture temperature, and culture period.
前記軸索伸展誘導工程は、SDF1及びMCP−1の少なくとも一方を含む培養液中で前記神経細胞を培養して、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を得ることを含む。SDF1及び/又はMCP−1が存在する培養液中で前記神経細胞を培養するので、神経細胞の軸索伸展が効率よく生じる。
軸索伸展誘導工程は、前記分化誘導工程において分化が進行した神経細胞の軸索を伸展(伸長)させるために行う工程であり、軸索伸展誘導工程を有しない培養では、前記神経細胞シートを得ることができない。
The axon extension inducing step includes culturing the nerve cell in a culture solution containing at least one of SDF1 and MCP-1 to obtain a nerve cell layer formed by the axon-extended nerve cell. Since the nerve cells are cultured in a culture medium in which SDF1 and / or MCP-1 are present, nerve cell axon extension occurs efficiently.
The axon extension induction step is a step performed to extend (elongate) the axons of the nerve cells that have undergone differentiation in the differentiation induction step. In a culture that does not have the axon extension induction step, the nerve cell sheet is used. Can't get.
なお、前記軸索伸展誘導工程は、前記分化誘導工程において、前駆細胞から神経細胞への分化が充分に終了した後に行ってもよく、前記分化誘導工程と同時に行ってもよい。前記軸索伸展誘導工程を前記分化誘導工程と同時に行う場合には、軸索伸展誘導工程で用いられる培養液に、分化誘導工程で用いられる分化誘導剤が含まれていてもよい。 The axonal extension inducing step may be performed after the differentiation from progenitor cells to neurons has been sufficiently completed in the differentiation inducing step, or may be performed simultaneously with the differentiation inducing step. When the axonal extension induction step is performed simultaneously with the differentiation induction step, a differentiation inducer used in the differentiation induction step may be included in the culture solution used in the axonal extension induction step.
SDF1(Stromal cell-derived factor 1;ストローマ由来因子)は、細胞の増殖、分化、機能発現を行うサイトカインの1種である(Science, 1993, vol.261, pp.600-603)。SDF1を神経細胞へ接触させることにより、神経細胞の成熟を引き起こして、軸索が伸展する。
MCP−1(Monocyte chemoattractant protein-1:単球化学誘因タンパク質1)は、塩基性でヘパリン結合性の高い92〜99アミノ酸からなるケモカインの1種である(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.91,pp.3652-3656,1994)。MCP−1を神経細胞へ接触させることにより、神経細胞の成熟を引き起こして、軸索が伸展する。
SDF1 (Stromal cell-derived factor 1) is one type of cytokine that performs cell proliferation, differentiation and functional expression (Science, 1993, vol.261, pp.600-603). Contacting SDF1 with nerve cells causes maturation of nerve cells and axons extend.
MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1: Monocyte chemoattractant protein-1) is a kind of chemokine consisting of 92 to 99 amino acids having basic and high heparin binding properties (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, pp.3652-3656, 1994). Contacting MCP-1 with nerve cells causes maturation of nerve cells and axons extend.
SDF1とMCP−1とは、これらを単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。使用する細胞の種類に対応して軸索の伸展効率及び生存率の点から、それぞれを単独でまたは組み合わせて使用することが好ましく、SDF1のみを用いることがより好ましい。 SDF1 and MCP-1 can be used alone or in combination of two or more. From the viewpoint of the axon extension efficiency and survival rate corresponding to the type of cells used, it is preferable to use them alone or in combination, and it is more preferable to use only SDF1.
軸索伸展誘導工程におけるSDF1及び/又はMCP−1の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の点で、これらを合計で、0.5ng/mL以上であることが好ましく、1.0ng/mL〜10ng/mLであることがより好ましい。0.5ng/mL以上であれば、確実に軸索の伸展を誘導可能である。上限値については特に制限はないが、添加量に対する効率的な効果発現の点で30ng/mL以下とすることが好ましい。 The concentration of SDF1 and / or MCP-1 in the culture solution in the axon extension induction step is preferably 0.5 ng / mL or more in total in terms of axon extension efficiency and survival rate, More preferably, it is 1.0 ng / mL to 10 ng / mL. If it is 0.5 ng / mL or more, axonal extension can be reliably induced. Although there is no restriction | limiting in particular about an upper limit, It is preferable to set it as 30 ng / mL or less at the point of the efficient effect expression with respect to addition amount.
特に、SDF1を単独で用いる場合の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の観点から0.5ng/mL〜30ng/mLであることが好ましい。またMCP−1を単独で用いる場合の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の観点から、0.5ng/mL〜30ng/mLであることが好ましい。 In particular, when SDF1 is used alone, the concentration in the culture solution is preferably 0.5 ng / mL to 30 ng / mL from the viewpoints of axonal extension efficiency and survival rate. Moreover, it is preferable that the density | concentration in the culture solution when using MCP-1 independently is 0.5 ng / mL-30 ng / mL from a viewpoint of axon extension efficiency and a survival rate.
軸索伸展誘導工程における培養条件としては、分化誘導工程における培養条件として挙げたものをそのまま使用することができる。また軸索伸展誘導工程で使用可能な培養液としては、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含まない以外は、分化誘導工程において記述した培養液及び添加成分をそのまま適用することができる。 As the culture conditions in the axonal extension induction process, those mentioned as the culture conditions in the differentiation induction process can be used as they are. Moreover, as a culture solution which can be used in an axonal extension induction | guidance | derivation process, the culture solution and additive component which were described in the differentiation induction | guidance | derivation process can be applied as it is, except not including a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer.
軸索伸展誘導工程の期間としては、軸索伸展が確認できる期間であれば特に制限はないが例えば、8〜30日間とすることができる。
ここで、SDF1及び/又はMCP−1の培地への添加の時期は、培養開始後、毎日添加することができ、3日毎に行うことが更に好ましい。
神経細胞の軸索伸展は、前述したと同様に、光学顕微鏡、実態顕微鏡により確認することができる。
The period of the axon extension guidance step is not particularly limited as long as it is a period in which axon extension can be confirmed, but may be, for example, 8 to 30 days.
Here, the timing of addition of SDF1 and / or MCP-1 to the medium can be added every day after the start of culture, and more preferably every 3 days.
The axonal extension of the nerve cell can be confirmed with an optical microscope and an actual microscope as described above.
軸索伸展誘導工程における培養は、細胞シートの作製効率の観点から、培養表面上に剥離層を備えた培養器を用いることが好ましい。培養表面上に剥離層を備えた培養器を用いる場合、剥離層上に細胞を播種して培養を行うことにより、剥離層の表面に細胞シートが形成される。その後、剥離層の機能に基づき培養表面と細胞シートとの間を離間させ、細胞シートを培養器から容易に離脱させることができる。 For the culture in the axonal extension induction step, it is preferable to use an incubator equipped with a release layer on the culture surface from the viewpoint of cell sheet production efficiency. When using an incubator equipped with a release layer on the culture surface, a cell sheet is formed on the surface of the release layer by seeding cells on the release layer and culturing. Thereafter, the culture surface and the cell sheet can be separated from each other based on the function of the release layer, and the cell sheet can be easily detached from the incubator.
培養表面と細胞シートとの間を離間させることができる剥離層としては、剥離層そのものが分解又は消滅可能なものを挙げることができ、例えば、コラーゲンゲル、温度反応性ポリマー等を挙げることができる。簡便性及び形状維持の点で、温度反応性ポリマーによる剥離層であることが好ましい。
このような温度反応性ポリマーとしては、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(PIPAA)又はその誘導体などのヒドロゲルを挙げることができる。例えば、PIPAAは、32℃以下になると液状化するため、例えば20℃60分の低温処理により剥離層を液状化して神経細胞シートを培養表面から離脱させることが可能となる。このような温度反応性ポリマーとしては、メビオールジェル(登録商標)やBST−Gel(登録商標)を挙げることができる。超純水に溶解したのち、プラスチックに吸着させる。
またこのような温度反応性ポリマーと、他のコラーゲンゲル等とを組み合わせた多層の剥離層を有する培養器であってもよい。コラーゲンゲル等を用いた場合には、酵素等を用いることによりゲルを分解して細胞シートを剥離させることができる。
Examples of the release layer that can separate the culture surface and the cell sheet include those capable of decomposing or disappearing, for example, collagen gel, temperature-reactive polymer, and the like. . From the viewpoint of simplicity and shape maintenance, a release layer made of a temperature-reactive polymer is preferable.
Examples of such temperature-responsive polymers include hydrogels such as poly-N-isopropylacrylamide (PIPAA) or derivatives thereof. For example, since PIPAA becomes liquefied when the temperature is 32 ° C. or lower, for example, the release layer can be liquefied by low-temperature treatment at 20 ° C. for 60 minutes to release the nerve cell sheet from the culture surface. Examples of such a temperature-responsive polymer include meviol gel (registered trademark) and BST-Gel (registered trademark). After dissolving in ultrapure water, it is adsorbed on plastic.
Moreover, the incubator which has a multilayer peeling layer which combined such a temperature-responsive polymer, other collagen gels, etc. may be sufficient. When collagen gel or the like is used, the cell sheet can be peeled by decomposing the gel by using an enzyme or the like.
軸索伸展誘導工程後には、軸索伸展した神経細胞から形成された神経細胞層を有する神経細胞シートが得られる。前記神経細胞シートの製造方法は、培養器の培養表面から神経細胞シートを分離させて、回収すること(以下、回収工程)を含んでもよい。
回収工程における前記神経細胞シートの回収は、神経細胞シートを培養表面から分離できれば如何なる手段によって行ってもよい。例えば、シートの端部をつまみ上げるなどの方法により分離してもよく、緩やかなピペッティング等により穏やかに剥離してもよい。前記培養器として、剥離層を有する培養器を使用した場合には、剥離層の溶解又は分解を行って、神経細胞シートを分離することができる。
After the axon extension inducing step, a nerve cell sheet having a nerve cell layer formed from nerve cells that have axon extended is obtained. The method for producing a nerve cell sheet may include separating the nerve cell sheet from the culture surface of the incubator and collecting it (hereinafter referred to as a collecting step).
The recovery of the nerve cell sheet in the recovery step may be performed by any means as long as the nerve cell sheet can be separated from the culture surface. For example, the sheet may be separated by a method such as picking up the end of the sheet, or gently peeled by gentle pipetting or the like. When an incubator having a release layer is used as the incubator, the nerve cell sheet can be separated by dissolving or decomposing the release layer.
前記神経細胞シートの他の製造方法としては、最終分化を終えた神経細胞を所定の培養器にて培養することによって作製する方法が挙げられる。この場合には、必要に応じて、軸索伸展を誘導する誘導剤を培養液に添加してもよい。
この他の製造方法で使用可能な培養液については、上述したものをそのまま適用することができる。また、軸索伸展を誘導する誘導剤としては、上述したSDF1、MCP−1等を挙げることができる。最終分化を終えた神経細胞に対して誘導剤を使用する場合には、上述した濃度をそのまま適用すればよい。
As another method for producing the nerve cell sheet, there is a method of producing a nerve cell after final differentiation by culturing it in a predetermined incubator. In this case, if necessary, an inducer that induces axonal extension may be added to the culture solution.
About the culture solution which can be used with this other manufacturing method, what was mentioned above is applicable as it is. Examples of the inducer that induces axonal extension include the above-described SDF1, MCP-1, and the like. When the inducer is used for nerve cells that have undergone final differentiation, the above-described concentrations may be applied as they are.
上記製造方法で得られた神経細胞シートは、軸索伸展し、細胞間相互作用が保持された神経細胞で形成された神経細胞層を有する。このような神経細胞シートが高い機能性を有することは、神経細胞シートにおける神経細胞の含有率の高さや、移植片として移植した場合の神経活動の回復評価等により確認することができる。前記神経活動の回復評価としては、当技術分野で周知の試験を適用すればよい。評価試験としては、神経細胞シートを構成する神経細胞の種類によって異なるが、運動神経細胞の場合には、ビームウオーキング試験、又は回転ロッド試験等を挙げることができる。 The nerve cell sheet obtained by the above production method has a nerve cell layer formed by nerve cells that are axon-extended and that retain cell-cell interactions. The high functionality of such a nerve cell sheet can be confirmed by the high content of nerve cells in the nerve cell sheet, the recovery evaluation of nerve activity when transplanted as a graft, and the like. As the recovery evaluation of the nerve activity, a test well-known in the art may be applied. The evaluation test varies depending on the type of nerve cells constituting the nerve cell sheet, but in the case of motor neurons, a beam walking test, a rotating rod test, or the like can be given.
[用途]
前記神経細胞シートは、神経細胞の細胞間相互作用が保持されており、トリプシンを使用して単離した細胞を直接用いる従来法より生着率も高くなり、神経細胞の機能が発揮しやすく、高い機能性を有する。このため、前記神経細胞シートは、神経細胞の機能に応じた用途に好ましく用いられる。
例えば、神経細胞の損傷に関連する疾患又は症状の治療が挙げられる。このような疾患としては、脳出血、脳卒中、脳梗塞、脳挫傷等を挙げることができる。このような疾患又は症状の治療においては、前記神経細胞シートを、治療対象部位に移植することによって、治療対象部位における治療的効果の発揮が期待される。前記神経細胞シートを移植した場合、前記神経細胞シートの神経細胞層を構成する神経細胞が細胞間相互作用によって治療対象部位の神経細胞と連絡する、又は治療対象部位へ神経細胞が浸潤して、治療的効果が得られると推測されるが、この理論に拘束されない。
[Usage]
The nerve cell sheet retains the cell-cell interaction of nerve cells, has a higher engraftment rate than the conventional method directly using cells isolated using trypsin, and easily exerts the function of nerve cells, High functionality. For this reason, the said nerve cell sheet is preferably used for the use according to the function of the nerve cell.
For example, treatment of diseases or conditions associated with nerve cell damage. Examples of such diseases include cerebral hemorrhage, stroke, cerebral infarction, cerebral contusion and the like. In the treatment of such a disease or symptom, it is expected that the nerve cell sheet is transplanted to the site to be treated to exert a therapeutic effect at the site to be treated. When the nerve cell sheet is transplanted, the nerve cells constituting the nerve cell layer of the nerve cell sheet communicate with the nerve cells of the treatment target site by cell-cell interaction, or the nerve cells infiltrate the treatment target site, It is speculated that a therapeutic effect is obtained, but is not bound by this theory.
また本発明は、前記神経細胞シートを用いた神経細胞の損傷に関連する疾患又は症状の治療方法も包含する。
前記治療方法では、神経細胞の損傷が生じている又は生じている可能性がある局所に、前記神経細胞シートを移植することを含む。移植方法は、前記神経細胞シートを、損傷部位に適用できれば如何なる方法で移植してもよい。
前記治療方法によれば、細胞間相互作用が保持された神経細胞シートを直接、損傷部位に適用するので、神経細胞相互作用に基づく機能が迅速に発揮され、神経細胞の損傷に起因した疾患の状態又は症状が効果的に改善される。
The present invention also includes a method for treating a disease or symptom associated with nerve cell damage using the nerve cell sheet.
The treatment method includes transplanting the nerve cell sheet in a local area where nerve cell damage has occurred or may have occurred. As the transplantation method, the nerve cell sheet may be transplanted by any method as long as it can be applied to the damaged site.
According to the treatment method, since the nerve cell sheet in which the cell-cell interaction is maintained is directly applied to the damaged site, the function based on the nerve cell interaction is rapidly exerted, and the disease caused by the nerve cell damage is prevented. The condition or symptom is effectively improved.
また前記神経細胞シートは、そのままの形態で患部へ適用可能な移植用シート材として使用することができる。即ち、本発明にかかる移植用シート材は、前記神経細胞シートを含む。本移植用シート材を用いることにより、神経細胞の生着がよく、高い治療効果が期待できる。 In addition, the nerve cell sheet can be used as a sheet material for transplantation that can be applied to an affected area in the form as it is. That is, the transplant sheet material according to the present invention includes the nerve cell sheet. By using the present sheet material for transplantation, engraftment of nerve cells is good and a high therapeutic effect can be expected.
前記神経細胞シートは、例えば移植前の取り扱いの観点から、神経細胞層以外の他の層を含むことが好ましい。このような他の層としては、シートの強度を向上させるために基材層が挙げられる。基材層に用いられる基材としては、ニトロセルロースメンブレン等のメンブレンを挙げることができる。前記基材層の厚みとしては特に制限はなく、例えばフィーダー細胞の層であれば0.05m〜1mmとすることができる。 The nerve cell sheet preferably includes layers other than the nerve cell layer from the viewpoint of handling before transplantation, for example. Examples of such other layers include a base material layer in order to improve the strength of the sheet. Examples of the substrate used for the substrate layer include a membrane such as a nitrocellulose membrane. There is no restriction | limiting in particular as the thickness of the said base material layer, For example, if it is a layer of a feeder cell, it can be 0.05 m-1 mm.
前記神経細胞シートが前記神経細胞層以外の他の層を有する場合には、本発明の神経細胞シートの製造方法は、前記他の層を前記神経細胞層に付加する工程を更に含むことができる。
例えば、前記神経細胞シートが基材層を有する場合には、前記軸索伸展誘導により得られた神経細胞層の上に、基材を付与する工程を含むことができる。基材の付与は、用いられる基材の種類によって異なるが、例えばメンブレンを基材とした場合には、前記神経細胞層上に載置することができる。また、メンブレンを予め培養表面に載置した後に、前記神経細胞を播種し、その後に前記軸索伸展誘導工程を行ってもよい。
これにより他の層を有する神経細胞シートを得ることができる。
When the nerve cell sheet has a layer other than the nerve cell layer, the method for producing a nerve cell sheet of the present invention can further include a step of adding the other layer to the nerve cell layer. .
For example, when the nerve cell sheet has a base material layer, a step of providing a base material on the nerve cell layer obtained by the axonal extension induction can be included. The application of the base material varies depending on the type of base material used, but for example, when a membrane is used as the base material, it can be placed on the nerve cell layer. In addition, after placing the membrane on the culture surface in advance, the nerve cells may be seeded, and then the axonal extension inducing step may be performed.
Thereby, a nerve cell sheet having another layer can be obtained.
また前記神経細胞シートは、神経細胞に対する薬剤の効果判定や、学術研究のためにも使用することができる。例えば、神経細胞に対する薬剤の効果判定方法は、候補物質を、前記神経細胞シートと接触させること、接触後の神経細胞シートを、所定の生理活性試験に供すること、試験の結果に基づいて候補物質が目的物質であることを判定することを含むことができる。これにより、神経細胞に対して所定の生理活性を有する化合物か否かを簡便に取り扱いよく判定することができる。 The nerve cell sheet can also be used for determination of the effect of drugs on nerve cells and academic research. For example, in the method for determining the effect of a drug on nerve cells, the candidate substance is brought into contact with the nerve cell sheet, the nerve cell sheet after contact is subjected to a predetermined physiological activity test, and the candidate substance is based on the result of the test. Determining that is a target substance. This makes it possible to easily and well determine whether or not the compound has a predetermined physiological activity on nerve cells.
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to them.
[実施例1]
(1)前駆細胞の準備
(1−1)ヒトiPS細胞の維持
ヒトiPS細胞株253G1又は201B7(理化学研究所より入手)を、フィーダー細胞(マイトマイシンC処理したマウス胎児線維芽細胞)上に1.0×106個/10mLの細胞密度で播種し、20%(v/v)ノックアウト血清代替(KSR:ライフテクノロジーズジャパン社)、非必須アミノ酸混合液、ピルビン酸を補充したDMEM/F12(GIBCO社製)を用いて、23代以上継代して、37℃、5%(v/v)CO2条件下で、培養維持(メンテナンス培養)した。培地交換は、毎日行った。
上記のようにして維持したiPS細胞のうち、50代以内の継代数のものであって、正常な核型を有するものを、以下の神経細胞誘導に用いた。
[Example 1]
(1) Preparation of progenitor cells (1-1) Maintenance of human iPS cells 1. Human iPS cell line 253G1 or 201B7 (obtained from RIKEN) was placed on feeder cells (mouse fetal fibroblasts treated with mitomycin C). DMEM / F12 (GIBCO) seeded at a cell density of 0 × 10 6 cells / 10 mL, supplemented with 20% (v / v) knockout serum (KSR: Life Technologies Japan), non-essential amino acid mixture, pyruvic acid The product was maintained at 37 ° C. and 5% (v / v) CO 2 for maintenance (maintenance culture). The medium was changed every day.
Among the iPS cells maintained as described above, those having the number of passages within the 50th generation and having a normal karyotype were used for the following nerve cell induction.
(1−2)サルES細胞
サルES細胞株(京都大学より入手)を、上記(1−1)と同様にして、メンテナンス培養を行い、以下の神経細胞誘導に用いた。
(1-2) Monkey ES cells A monkey ES cell line (obtained from Kyoto University) was subjected to maintenance culture in the same manner as in (1-1) above, and used for the following nerve cell induction.
(2)前駆細胞から神経細胞への分化誘導の方法とシートの作製
上記のヒトiPS細胞及びサルES細胞を、それぞれ回収して、細菌グレードのプラスチックシャーレ(Falcon社)上に播種して、メンテナンス培養と同一の培地を用いて、浮遊状態による培養を開始した。4日後に、球状の細胞塊である浮遊細胞凝集体(EB)が得られた。これを回収して、新鮮なフィブロネクチンコーティングペトリ皿(ベクトンディッキンソン社製)に上記培地と共に移し、細胞の付着を確認した後、最終濃度1μMのレチノイン酸(RA:シグマ社製)と最終濃度7ng/mLのNoggin−Fc(R&D社製)と、最終濃度2.5×10−2μMのサイクロパミン(シグマアルドリッチ社)を添加した(1日目)。その後、3日目において、RA、Noggin−Fc及びサイクロパミンを含有する培地を、それぞれ、上記と同一最終濃度となるようにペトリ皿に添加した。
(2) Differentiation induction method from progenitor cells to nerve cells and preparation of sheet The above-mentioned human iPS cells and monkey ES cells were collected and seeded on a bacterial grade plastic petri dish (Falcon) for maintenance. Using the same medium as the culture, the culture in a floating state was started. After 4 days, floating cell aggregates (EB), which are spherical cell clusters, were obtained. This was recovered and transferred to a fresh fibronectin-coated Petri dish (Becton Dickinson) together with the above medium. After confirming cell attachment, the final concentration of 1 μM retinoic acid (RA: Sigma) and a final concentration of 7 ng / mL Noggin-Fc (manufactured by R & D) and cyclopamine (Sigma Aldrich) having a final concentration of 2.5 × 10 −2 μM were added (Day 1). Thereafter, on the third day, the medium containing RA, Noggin-Fc and cyclopamine was added to the Petri dish so as to have the same final concentration as above.
培養4日目に、あらかじめ温度反応性ヒドロゲル(メビオールジェル(登録商標)、メビオール株式会社)をコートしてある48穴培養プレート(メビオール社製)に、上記で得られた細胞を、1×105/ウェルの細胞密度で播種し、培養した。3日おきに、SDF1(Abcam社)の最終濃度が1ng/mlとなるようにSDF1を含有する培地を添加した。14日から21日程度培養を継続した後、20℃に温度を変更してヒドロゲルを溶解し、更に軽くピペッティングを行って、各ウェルの培養表面からニトロセルロース膜を用いて、神経細胞シートを剥離し、iPS細胞由来の神経細胞シートと、ES細胞由来の神経細胞シートをそれぞれ回収した。 On the fourth day of culture, the cells obtained above were placed in a 48-well culture plate (Meviol Co.) previously coated with a temperature-responsive hydrogel (Meviol Gel (registered trademark), Meviol Co., Ltd.) with 1 × Seed and cultured at a cell density of 10 5 / well. Every 3 days, a medium containing SDF1 was added so that the final concentration of SDF1 (Abcam) was 1 ng / ml. After culturing for about 14 to 21 days, the temperature is changed to 20 ° C. to dissolve the hydrogel, and lightly pipetting is performed, and a nerve cell sheet is formed from the culture surface of each well using a nitrocellulose membrane. The iPS cell-derived nerve cell sheet and the ES cell-derived nerve cell sheet were each collected.
得られた神経細胞シートの性状は、次のようにして確認した。
即ち、上記で得られた神経細胞シートを回収した。トリプシンを用いて浮遊細胞化集団としてPE標識化抗ヒトNCAM抗体(ベクトンディキンソン社)を用いて染色し、フローサイトメトリーにてNCAM発現細胞の数を確認した。
The properties of the obtained nerve cell sheet were confirmed as follows.
That is, the nerve cell sheet obtained above was collected. Using trypsin, the cells were stained with a PE-labeled anti-human NCAM antibody (Becton Dickinson) as a floating cell population, and the number of NCAM-expressing cells was confirmed by flow cytometry.
更に、得られた神経細胞シートに対して、CTIP2(COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2)に対する抗体(ABCAM社)、Fezf2(FEZ(Forebraiin embryonic zinc finger) family zing finger 2)に対する抗体(Santa Cruz社)、FoxP2(forkhead box P2)に対する抗体(Santa Cruz社)、及びCrim1(Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor)に対する抗体(Santa Cruz社)による染色を行った。 Furthermore, against the obtained nerve cell sheet, an antibody (ABCAM) against CTIP2 (COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter)-TF (transcription factor)-interaction protein 2), Fezf2 (FEZ (Forebraiin embryonic zinc finger) family zing Staining was performed with an antibody against finger 2) (Santa Cruz), an antibody against FoxP2 (forkhead box P2) (Santa Cruz), and an antibody against Crim1 (Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor) (Santa Cruz).
2.5×10−5μMのサイクロパミンを用いて得られた神経細胞シートを、光学顕微鏡(カールツァイス社)にて観察した。結果を図1(20倍)及び図2(2倍)に示す。図1に示されるように、個々の神経細胞の軸索が確認でき、他の神経細胞の軸索と接触し、網目を形成していることがわかる。
また、神経細胞シートでは、全細胞数の60%以上がNCAMを発現しており、神経細胞を高い含有率で含む神経細胞シートであることがわかる。更に上記各抗体の染色によって、神経細胞シートを構成している神経細胞は、ヒト運動神経細胞であることであることが確認できた。なお、蛍光免疫染色(Confocal Scanning Microscope)目視による観察で、フィーダー細胞を0.01%未満であった。このように、本神経細胞シートは、全細胞のほとんどが、軸索伸展した神経細胞で形成された神経細胞層によって構成されていることが確認できた。
The nerve cell sheet obtained using 2.5 × 10 −5 μM cyclopamine was observed with an optical microscope (Carl Zeiss). The results are shown in FIG. 1 (20 times) and FIG. 2 (2 times). As shown in FIG. 1, it can be seen that the axons of individual nerve cells can be confirmed and are in contact with other nerve cell axons to form a network.
Further, in the nerve cell sheet, 60% or more of the total number of cells expresses NCAM, which indicates that the nerve cell sheet contains nerve cells at a high content rate. Furthermore, it was confirmed by the staining of each antibody described above that the nerve cells constituting the nerve cell sheet were human motor neurons. In addition, the feeder cell was less than 0.01% by visual observation by fluorescent immunostaining (Confocal Scanning Microscope). As described above, it was confirmed that the entire nerve cell sheet was composed of a nerve cell layer formed by nerve cells that had axonal extension.
(3)低温傷害による実験的脳損傷と移植
雌C57BL/6マウス(6〜8週齢)を移植に使用した。後続のすべての手順は、聖マリアンナ医科大学のガイドラインに沿って行われた。
マウスは麻酔して、定位フレーム (Narishige, Tokyo, Japan) に配置された。穿頭部位としてはコロナ縫合とラムダ縫合と矢状縫合の外側3.0ミリメートルの間の中間で左頭頂骨とした。
液体窒素で冷やした金属プローブを30秒4回100グラムの力でそのまま穿頭部位の表面に適用した。各マウスに寒冷傷害を4回投与することにより、確実に片麻痺を再現することができ、脳梗塞モデルマウスを作製した。
(3) Experimental brain injury due to cold injury and transplantation Female C57BL / 6 mice (6-8 weeks old) were used for transplantation. All subsequent procedures were performed in accordance with St. Marianna University School of Medicine guidelines.
Mice were anesthetized and placed in a stereotaxic frame (Narishige, Tokyo, Japan). The cephalic site was the left parietal bone between the outer 3.0 mm of corona, lambda and sagittal sutures.
A metal probe cooled with liquid nitrogen was applied to the surface of the burr site as it was, with a force of 100 grams four times for 30 seconds. By administering cold injury to each mouse four times, hemiplegia could be reliably reproduced, and a cerebral infarction model mouse was produced.
この脳梗塞モデルマウスの左大脳運動野に、上記で得られたiPS細胞由来の神経シート又はサルES細胞由来の神経細胞シートをそれぞれ移植した。
神経シートは1mm〜2mm四方にサイズを整えたのちに、損傷部運動皮質上に広げて静置した。その後、出血の無いことを確認した。その上に人工骨を置く、あるいは人工骨を置かずに頭皮を縫合して、手術を終えた。
なお、免疫抑制に関しては異種移植となるために、シクロスポリン(皮下注射)を10μg/gの濃度で、またデキサメタゾン(腹腔内注射)を0.2μg/gの濃度で、移植前1時間に投与した。移植の翌日から、シクロスポリンを10μg/gの濃度は、毎日投与した。
移植後、所定の時期に、下記の運動機能評価を行った。
The iPS cell-derived nerve sheet or monkey ES cell-derived nerve cell sheet obtained above was transplanted into the left cerebral motor area of this cerebral infarction model mouse, respectively.
After adjusting the size of the nerve sheet to 1 mm to 2 mm square, the nerve sheet was spread on the damaged motor cortex and allowed to stand. Thereafter, it was confirmed that there was no bleeding. An artificial bone was placed thereon, or the scalp was sutured without placing the artificial bone, and the operation was completed.
For immunosuppression, cyclosporine (subcutaneous injection) was administered at a concentration of 10 μg / g and dexamethasone (intraperitoneal injection) was administered at a concentration of 0.2 μg / g for 1 hour before transplantation. . From the day after transplantation, cyclosporine was administered daily at a concentration of 10 μg / g.
Following transplantation, the following motor function evaluation was performed at a predetermined time.
(4)運動機能評価
移植後、上下肢の運動機能をビームウオーキング試験で評価した。
具体的には、移植後のマウスを、幅7〜8mm、長さ120mmの木の棒(100mmのソフトパッド上300mmの高さに設定)の上に置いて、その上を約50歩、歩かせて、その間に上下肢が木の棒をつかむことに失敗した回数を計測した。結果を表1に示す。
(4) Motor function evaluation After transplantation, the motor function of the upper and lower limbs was evaluated by a beam walking test.
Specifically, the mouse after transplantation is placed on a wooden stick of 7 to 8 mm in width and 120 mm in length (set to a height of 300 mm on a 100 mm soft pad), and about 50 steps are taken on it. The number of times the upper and lower limbs failed to grab the wooden stick during that time was counted. The results are shown in Table 1.
また、移植後の運動機能及び筋肉の協調を、回転試験により評価した。
具体的には、直径3.5cmの回転ロッドを有する回転ユニット(Muromachi社)を使用した。30rmpで回転ロッドを回転させて、マウスを回転ロッド上で走らせ、落下するまでの時間を測定した。結果を表2に示す。
In addition, the motor function and muscle coordination after transplantation were evaluated by a rotation test.
Specifically, a rotating unit (Muromachi) having a rotating rod having a diameter of 3.5 cm was used. The rotating rod was rotated at 30 rpm, the mouse was run on the rotating rod, and the time until falling was measured. The results are shown in Table 2.
ビームウオーキング試験及び回転試験は、それぞれ対象として、移植マウスにおいて神経細胞シートを移植した部位と同一の部位に、神経細胞シートの代わりにリン酸緩衝液(PBS)を5μl注入したマウスについても同様に行った。結果を表1〜表2にそれぞれ示す。 Similarly, the beam walking test and the rotation test were performed on mice in which 5 μl of a phosphate buffer (PBS) was injected in place of the nerve cell sheet at the same site as the nerve cell sheet transplanted in the transplanted mouse. went. The results are shown in Tables 1 and 2, respectively.
表1〜表2に示されるように、神経細胞シートを移植したマウスでは運動機能の回復が認められた。 As shown in Tables 1 and 2, recovery of motor function was observed in mice transplanted with nerve cell sheets.
[実施例2]
上記実施例1で用いたiPS細胞株を使用し、サイクロパミンの濃度を、2.5μM、2.5×10−4μM、2.5×10−5μM、又は2.5×10−7μMに変更した以外は、実施例1と同様にして、iPS細胞株の神経細胞シートをそれぞれ作製した。
その結果、いずれの濃度のサイクロパミンを用いたものであっても、iPS細胞由来の神経細胞シートを得ることができた。特に、サイクロパミンの濃度を、2.5×10−4μM、2.5×10−5μM、又は2.5×10−7μMに代えた培養した場合には、充分に軸索が伸展しており、軸索伸展した神経細胞による高い機能の発揮に対する期待がより高い。
[Example 2]
The iPS cell line used in Example 1 above was used, and the concentration of cyclopamine was 2.5 μM, 2.5 × 10 −4 μM, 2.5 × 10 −5 μM, or 2.5 × 10 −7. A neuronal cell sheet of the iPS cell line was prepared in the same manner as in Example 1 except that it was changed to μM.
As a result, an iPS cell-derived nerve cell sheet could be obtained regardless of the concentration of cyclopamine. In particular, when the concentration of cyclopamine is changed to 2.5 × 10 −4 μM, 2.5 × 10 −5 μM, or 2.5 × 10 −7 μM, the axons are sufficiently extended. Therefore, there is a higher expectation for the high performance of nerve cells that have extended axons.
なお、2.5μMのサイクロパミンによって分化誘導させて得られた神経細胞シートでは、血管内皮細胞の混入率が他の細胞シートよりも高いため、細胞シートを培養器の培養表面から、破れないように剥離させるのに注意を要する。 In addition, the nerve cell sheet obtained by inducing differentiation with 2.5 μM cyclopamine has a higher contamination rate of vascular endothelial cells than other cell sheets, so that the cell sheet cannot be broken from the culture surface of the incubator. Care must be taken to peel off.
[実施例3]
マウスES細胞株(Science. 1991 Nov 1;254(5032):707-710、E14.1、Passage number 11-15, normal karyotype:Klaus Rajewsky博士(Cologne University)より供与。)、マウスiPS細胞(理化学研究所)及びマウス胎児神経前駆細胞(コスモバイオ株式会社)を用いて、実施例1と同様に、最終濃度1μMのレチノイン酸(RA:シグマ社製)と最終濃度7ng/mLのNoggin−Fc(R&D社製)と、最終濃度2.5×10−2μMのサイクロパミンを用いて分化誘導を行い、最終濃度1ng/mlのSDF1を用いて神経細胞シートを作製した。
[Example 3]
Mouse ES cell line (Science. 1991 Nov 1; 254 (5032): 707-710, E14.1, Passage number 11-15, normal karyotype: provided by Dr. Klaus Rajewsky (Cologne University)), mouse iPS cells (RIKEN) Laboratory) and mouse fetal neural progenitor cells (Cosmo Bio Inc.), as in Example 1, a final concentration of 1 μM retinoic acid (RA: manufactured by Sigma) and a final concentration of 7 ng / mL Noggin-Fc ( R & D) and cyclopamine with a final concentration of 2.5 × 10 −2 μM were used to induce differentiation, and a nerve cell sheet was prepared using SDF1 with a final concentration of 1 ng / ml.
なお、マウスES細胞株、マウスiPS細胞及びマウス胎児神経細胞の培養条件は、実施例1のヒトiPS細胞株の培養条件と同様である。得られた神経細胞シートをそれぞれ図3〜図5に示す。なお、図3はマウスES細胞株からの神経細胞シート(光学顕微鏡、20倍)、図4はマウスiPS細胞からの神経細胞シート(2倍)、図5はマウス胎児神経前駆細胞からの神経細胞シート(光学顕微鏡、20倍)を示す。
図3〜図5に示されるように、いずれの前駆細胞からも軸索伸展した神経細胞シートを得ることができた。
The culture conditions for the mouse ES cell line, mouse iPS cell, and mouse embryonic nerve cell are the same as those for the human iPS cell line of Example 1. The obtained nerve cell sheets are shown in FIGS. 3 is a nerve cell sheet from a mouse ES cell line (light microscope, 20 times), FIG. 4 is a nerve cell sheet from a mouse iPS cell (2 times), and FIG. 5 is a nerve cell from a mouse embryonic neural progenitor cell. A sheet (optical microscope, 20 times) is shown.
As shown in FIG. 3 to FIG. 5, a nerve cell sheet in which axons were extended from any of the progenitor cells could be obtained.
このように本発明の神経細胞シートは、軸索伸展した神経細胞シートで構成され、この神経細胞シートを移植することにより、損傷部位における機能が著しく回復した。このことから、本発明の神経細胞シートは、高い機能性を有するものであることがわかる。 As described above, the nerve cell sheet of the present invention is composed of a nerve cell sheet in which axons are extended, and by transplanting this nerve cell sheet, the function at the damaged site was remarkably recovered. From this, it can be seen that the nerve cell sheet of the present invention has high functionality.
Claims (9)
前記神経細胞を、SDF1(Stromal cells-derived factor-1)及びMCP−1(Monocyte chemoattractant propein-1)の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、
を含む、請求項1又は請求項2記載の神経細胞シートの製造方法。 Culturing progenitor cells in a culture medium containing a sonic hedgehog inhibitor and a differentiation inducer to induce neurons from the progenitor cells; and
Culturing the nerve cell in a culture medium containing at least one of SDF1 (Stromal cells-derived factor-1) and MCP-1 (Monocyte chemoattractant propein-1) to induce axonal extension of the nerve cell; Obtaining a nerve cell layer formed by cultured neurons that have axonal extensions;
The manufacturing method of the nerve cell sheet | seat of Claim 1 or Claim 2 containing this.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012165108A JP2014023457A (en) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Nerve cell sheet and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012165108A JP2014023457A (en) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Nerve cell sheet and method for producing the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014023457A true JP2014023457A (en) | 2014-02-06 |
Family
ID=50197735
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012165108A Pending JP2014023457A (en) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Nerve cell sheet and method for producing the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2014023457A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016039317A1 (en) * | 2014-09-08 | 2016-03-17 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Method for producing cerebellar progenitor tissue |
JP2021519584A (en) * | 2018-03-26 | 2021-08-12 | イファ ユニバーシティ−インダストリー コラボレーション ファウンデーション | How to differentiate motor neurons from tonsil-derived mesenchymal stem cells |
US11421204B2 (en) | 2015-04-07 | 2022-08-23 | Reprocell Incorporated | Method of removing pluripotent cells from culture |
-
2012
- 2012-07-25 JP JP2012165108A patent/JP2014023457A/en active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016039317A1 (en) * | 2014-09-08 | 2016-03-17 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Method for producing cerebellar progenitor tissue |
JPWO2016039317A1 (en) * | 2014-09-08 | 2017-06-15 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Method for producing cerebellar precursor tissue |
JP2020110176A (en) * | 2014-09-08 | 2020-07-27 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Method for producing cerebellum precursor tissue |
US10781420B2 (en) | 2014-09-08 | 2020-09-22 | Riken | Method for producing cerebellar progenitor tissue |
JP7107510B2 (en) | 2014-09-08 | 2022-07-27 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Method for producing cerebellar precursor tissue |
US11421204B2 (en) | 2015-04-07 | 2022-08-23 | Reprocell Incorporated | Method of removing pluripotent cells from culture |
JP2021519584A (en) * | 2018-03-26 | 2021-08-12 | イファ ユニバーシティ−インダストリー コラボレーション ファウンデーション | How to differentiate motor neurons from tonsil-derived mesenchymal stem cells |
JP7473967B2 (en) | 2018-03-26 | 2024-04-24 | イファ ユニバーシティ-インダストリー コラボレーション ファウンデーション | Method for differentiating tonsil-derived mesenchymal stem cells into motor neurons |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102487142B1 (en) | How to differentiate pluripotent cells | |
Tsonis et al. | Lens and retina regeneration: transdifferentiation, stem cells and clinical applications | |
US20200268803A1 (en) | Use of lifr or fgfr3 as a cell surface marker for isolating human cardiac ventricular progenitor cells | |
US10597637B2 (en) | Use of jagged 1/frizzled 4 as a cell surface marker for isolating human cardiac ventricular progenitor cells | |
TWI309678B (en) | ||
JP2011525370A5 (en) | ||
JP2011525370A (en) | Method for preparing human skin substitutes from human pluripotent stem cells | |
KR20160090339A (en) | Method for manufacturing telencephalon or progenitor tissue thereof | |
CN108934168A (en) | For non-pluripotent cell to be reprogrammed to the improved method for multipotential stem cell | |
CN107709545A (en) | Muscle lineage is generated from stem cell | |
US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
WO2016068217A1 (en) | Cell sheet containing peripheral blood mononuclear cells or fibroblasts associated with factor secreted by peripheral blood mononuclear cells | |
KR20060023133A (en) | Nerve cell obtained by electrically pulse-treating es cell | |
US20200102541A1 (en) | Method for increasing the proportion of desired cells from induced pluripotent stem cells | |
KR102653663B1 (en) | Differentiation method of securing large amount of microglia cells by using 3d organoids prepared from human pluripotent stem cells | |
JP2014023457A (en) | Nerve cell sheet and method for producing the same | |
CN112513257A (en) | Methods of generating induced oligodendrocyte lineage cells and treatments using same | |
KR102050223B1 (en) | Method for preparing intestinal organoid from embryonic stem cells | |
EP3766506A1 (en) | Angiogenesis-inducing method using neural stem cell | |
KR102650805B1 (en) | Differentiation method of securing large amount of cells by chopping oligodendrocytes enriched 3D organoids prepared from human pluripotent stem cells | |
WO2021065984A1 (en) | Method for forming sheet of cardiomyocytes | |
CN118139970A (en) | Immune cells derived from iPSC in the prevention and treatment of age-related and neurodegenerative diseases | |
KR20040075957A (en) | Pure populations of astrocyte restricted precursor cells and methods for isolation and use thereof | |
Johnson | Primary cultures of sympathetic ganglia | |
WO2023143637A1 (en) | Construction and use of practical brain-like microorgan |