JP2014020837A - Polynucleotide sequence determination method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ナノポア入口側と出口側に電極を用いた電気泳動及び入口側にせん断力によりポリヌクレオチドを直線化することによりナノポアに導入し、ナノポア間の通過時のトンネル電流により核酸配列を測定する方法に関する。 The present invention introduces a polynucleotide into a nanopore by electrophoresis using electrodes on the inlet and outlet sides of the nanopore and linearizes the polynucleotide by shearing force on the inlet side, and measures the nucleic acid sequence by the tunnel current when passing between the nanopore On how to do.
ＤＮＡのヌクレオチド配列を分析する技術は、単に学術的な研究の分野に留まらず、医療、創薬、および犯罪捜査などの分野にまで応用されておりこの技術の発展にますます関心が集められている。これまでに開発されたＤＮＡのシーケンサーは、ヌクレオチドに付加した標識を蛍光によって識別するという光測定技術を利用しており、ヌクレオチドそのものを直接的に識別するものではない。ヌクレオチドに標識を付加するためには、ＰＣＲを用いてヌクレオチドを化学修飾する必要があるこの手順には、多数の試薬が必要となるだけでなく、多くの時間も費やされる。それ故、ＤＮＡのシーケンシングを行うには、多大な資金と時間とが必要になる。 The technology for analyzing the nucleotide sequence of DNA is not only applied to the field of academic research, but is also applied to fields such as medicine, drug discovery, and criminal investigation, and there is an increasing interest in the development of this technology. Yes. DNA sequencers that have been developed so far use a light measurement technique in which a label added to a nucleotide is identified by fluorescence, and does not directly identify the nucleotide itself. This procedure, which requires chemical modification of the nucleotides using PCR to add a label to the nucleotides, not only requires a large number of reagents, but also takes a lot of time. Therefore, a large amount of money and time are required to perform DNA sequencing.
このような状況の中、過去十数年の間に、個々のゲノムのシーケンシングに向けた一歩として、１分子に基づくＤＮＡのシーケンシング技術に著しい進歩があった。この進歩によってもたらされた最近の際立った成果としては、化学的に設計されたαヘモリシンのナノスケールのポア（以下、「ナノポア」と称する。）を利用した検出器が挙げられる。この検出器では、シクロデキストリンに埋め込まれた生物学的なナノポアを一本鎖ＤＮＡのオリゴマーが通過する間に起こる、イオン電流の一時的な遮断を探知することによってＤＮＡ１分子のシーケンシングを行うことができる。 Under these circumstances, during the past decades, there has been significant progress in single-molecule DNA sequencing technology as a step towards sequencing individual genomes. A recent remarkable result brought about by this advancement is a detector utilizing a chemically designed nanoscale pore of α-hemolysin (hereinafter referred to as “nanopore”). In this detector, sequencing a single molecule of DNA by detecting the transient block of ionic current that occurs during the passage of a single-stranded DNA oligomer through a biological nanopore embedded in cyclodextrin Can do.
このような強固で構造化可能な固体のナノポアが関心を集めており、ポアを通過する単一の生体分子の動態を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たしていた。しかしながら、上述の検出器を用いたイオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングは、（１）ポアサイズの選択が限定されている、（２）システムが不安定である、という問題点を有しており、生物学的なナノポアを利用したシーケンサーの実用化の目処は立っておらず、１分子の分解能を有する、イオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングは未だに検討中である。このイオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングに代わる手法として、横方向の電子輸送（transverse electron transport）に基づくシーケンシング理論が提案された。 Such solid, structurable solid nanopores were of interest and served as a platform for studying the dynamics of a single biomolecule passing through the pore. However, DNA sequencing based on ion current using the above-described detector has the following problems: (1) limited pore size selection; (2) unstable system; There is no prospect of practical use of a sequencer using biological nanopores, and sequencing of DNA based on ion current having a resolution of one molecule is still under investigation. As an alternative to DNA sequencing based on this ionic current, sequencing theory based on transverse electron transport has been proposed.
具体的には、１つのＤＮＡがナノポアを通過する際に、ナノポアの端に設けられたナノスケールの電極間距離を有する電極対（以下、「ナノ電極対」と称する。）に、各ヌクレオチドを介したトンネル電流が生じ、生じたトンネル電流の電流値を測定すれば、この電流値に基づいて、標識することなく、ヌクレオチド配列を直接的に読み取ることが可能となるという考えである。このような横方向の電子輸送に基づくシーケンシングを行えば、１時間当たり４００キロベースを超える、極めて速いシーケンシングのスピードにてＤＮＡ１分子のヌクレオチド配列を直接的に読むことができると予想されている。 Specifically, when one DNA passes through the nanopore, each nucleotide is applied to an electrode pair (hereinafter referred to as “nanoelectrode pair”) having a nanoscale interelectrode distance provided at the end of the nanopore. If the current value of the generated tunnel current is measured, the nucleotide sequence can be read directly without labeling based on this current value. If sequencing based on such lateral electron transport is performed, it is expected that the nucleotide sequence of one DNA molecule can be directly read at an extremely fast sequencing speed exceeding 400 kilobases per hour. Yes.
しかしながら、上述のように横方向の電子輸送に基づくシーケンシングの原理を実証するためのシステムが開発されたが、用いたヌクレオチドが同一の場合であっても、測定毎にトンネル電流の値が変動するため、この値を指標としてヌクレオチドを識別することはできなかった。このことを解決するためにポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値の最頻値を算出し、その電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化し、および規格化した最頻値を参照値と比較することにおり、該基準ヌクレオチドの最頻値は、該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させること、該基準ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出することによって取得されていた（特許文献１）。 However, as described above, a system for demonstrating the principle of sequencing based on lateral electron transport was developed, but even if the nucleotide used was the same, the value of the tunnel current varied from measurement to measurement. Therefore, nucleotides could not be identified using this value as an index. In order to solve this problem, the mode value of the current value of the tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes is calculated, and the mode value of the current value is divided by the mode value of the reference nucleotide. Therefore, the mode value of the current value is normalized, and the normalized mode value is compared with a reference value. The mode value of the base nucleotide is a plurality of base nucleotides between the electrodes. It has been acquired by detecting a pulse of a tunnel current generated between the electrodes when the reference nucleotide passes, and calculating a mode value of a maximum current value in each pulse (Patent Literature). 1).
従来技術では、ナノポアでポリヌクレオチドの核酸配列を測定する方法はあった。しかし、ポリヌクレオチドはすぐに自己会合などによりナノポアに導入することが困難であり、実用面で大きな課題であった。 In the prior art, there has been a method for measuring a nucleic acid sequence of a polynucleotide with a nanopore. However, it is difficult to introduce a polynucleotide into a nanopore by self-association immediately, which is a big problem in practical use.
前記従来の課題を解決するために、本発明のポリヌクレオチド配列決定方法は、
ポリヌクレオチドを装置に添加する工程、
ポリヌクレオチドをナノポアに導入し、電極間を通過させる工程、
該ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、
測定した電流値の最頻値を算出する工程、
該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する工程、
および規格化した最頻値を参照値と比較する工程を包含しており、
該基準ヌクレオチドの最頻値は、該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させる際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出し、各パルスにおける最大電流値の最頻値として算出され、
該ポリヌクレオチドをナノポアに導入する前に予め直線化手段により直線化する。
。
In order to solve the conventional problem, the polynucleotide sequencing method of the present invention comprises:
Adding a polynucleotide to the device;
Introducing a polynucleotide into the nanopore and passing between the electrodes;
Measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through,
Calculating the mode of the measured current value,
Normalizing the mode value of the current value by dividing the mode value of the current value by the mode value of the reference nucleotide;
And comparing the normalized mode value with a reference value,
The mode value of the reference nucleotide is calculated as a mode value of the maximum current value in each pulse by detecting a pulse of a tunnel current generated between the electrodes when the reference nucleotide is passed through the electrodes a plurality of times. ,
Prior to introduction of the polynucleotide into the nanopore, the polynucleotide is previously linearized by a linearization means.
.
前記直線化手段がせん断力を発生できる構造体であることが望ましい。その構造体の形状はどのようなものでも良い。また、各構造体間の間隔は、直線状のポリヌクレオチド鎖が通過できるサイズであればよい。 It is desirable that the straightening means is a structure capable of generating a shearing force. The structure may have any shape. Moreover, the space | interval between each structure should just be a size which a linear polynucleotide chain can pass.
さらには、前記電極間距離が、前記ヌクレオチドの分子直径の０．５倍〜２倍の長さであることが望ましい。 Furthermore, the distance between the electrodes is preferably 0.5 to 2 times the molecular diameter of the nucleotide.
本発明は、ナノポア入口側と出口側に電極を用いた電気泳動及び入口側にせん断力によりポリヌクレオチドを直線化することによりナノポアに導入し、ナノポア間の通過時のトンネル電流により核酸配列を高効率に測定することができる。 The present invention introduces a polynucleotide into a nanopore by electrophoresis using electrodes on the inlet side and outlet side of the nanopore and linearizing the polynucleotide by shearing force on the inlet side. Can be measured in efficiency.
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
（実施の形態１）
本発明を用いたナノポアへのポリヌクレオチド配列決定方法について説明する。図１は、ポリヌクレオチド配列決定装置の概略図である。ポリヌクレオチド配列決定装置は、第一溶液槽３、第二溶液槽８、両溶液槽を分割するナノポア薄膜６で構成される。両溶液槽には、溶液を導入するバッファー導入口および溶液を排出する排出口がそれぞれ具備されている。
(Embodiment 1)
The polynucleotide sequencing method for nanopores using the present invention will be described. FIG. 1 is a schematic diagram of a polynucleotide sequencing apparatus. The polynucleotide sequencing apparatus comprises a
ナノポア薄膜６を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために、両溶液槽３、８には電極１、９が具備されており、前記電極１と９は極性可変の電圧源１４および電流計１３に接続されている。ナノポア薄膜６は、直径１ｎｍのナノポア７が形成された絶縁体の薄膜で構成されている。ここでは、絶縁体薄膜の材料としてＳｉ３Ｎ４を用いているが、他にＳｉＯ２やアスファルテンなどのプラスチック材料でもよい。さらに、Ａｌなどの金属膜の表面に絶縁材量をコートした薄膜でも良い。ナノポア７の径としては、ここでは１ｎｍとしているが、０．５ｎｍから５０ｎｍ程度あればよい。
In order to provide a voltage gradient between the two solution tanks via the nanopore thin film 6, both the
まず、前記方法で得られたＤＮＡ断片４をバッファー溶液に混合し、第一溶液槽３に添加する。電極１が陰極、電極９が陽極になるように電圧源１４により電圧を印加し、ＤＮＡ断片４を第一溶液槽３から第二溶液槽８に泳動させる。
First, the DNA fragment 4 obtained by the above method is mixed with a buffer solution and added to the
添加したＤＮＡ断片４は、細管中を電気泳動すると、泳動方向に伸びながら移動する。
上記細管の電気泳動部の直径は従来と同じく５０μｍ〜１００μｍでよく、それ以上でもよい。ここではＤＮＡ断片４をなるべく直線状にほぐすことが重要な目的であるため、泳動部を有する領域の長さは１ｃｍとしたが、一般に泳動距離は１ｃｍ以上あればよい。ＤＮＡ断片４を大まかに分離する機能をもたせる場合は、ゲルを途中に入れて５ｃｍあるいはそれより長い泳動距離がよい。
The added DNA fragment 4 moves while extending in the migration direction when electrophoresis is performed in the capillary tube.
The diameter of the electrophoresis part of the thin tube may be 50 μm to 100 μm as in the conventional case, or may be larger. Here, since it is an important purpose to loosen the DNA fragments 4 as much as possible, the length of the region having the migration part is 1 cm, but generally the migration distance may be 1 cm or more. In the case of providing a function of roughly separating the DNA fragments 4, a migration distance of 5 cm or longer by placing a gel in the middle is good.
電気泳動路の出口（試料の溶出部）を、内径が数μｍ以下に絞られた細管状の形状にして、この出口よりＤＮＡ断片分子をバッファー液流入口からバッファー液を流入してなるシースフロー用液流と、上部電極１と下部電極９で与えられる電場によって、直径１μｍ以下の領域内をＤＮＡ試料分子４が通過するＤＮＡの配向流路をシースフロー形成管内に形成することができる。
A sheath flow in which the outlet (sample elution part) of the electrophoresis path is shaped like a narrow tube with an inner diameter of several μm or less, and DNA fragment molecules are introduced from this outlet into the buffer solution inlet. The DNA flow path through which the DNA sample molecules 4 pass through the region having a diameter of 1 μm or less can be formed in the sheath flow forming tube by the working liquid flow and the electric field applied by the
本実施例のように２５Ｖ／ｃｍの電場強度を用いた場合、ＤＮＡの流速はＤＮＡの長さによらず約３ｍｍ／秒である（バイオ／テクノロジー（Bio／Technology）第６巻、第８１６頁（１９８８））。 When an electric field strength of 25 V / cm is used as in this example, the flow rate of DNA is about 3 mm / second regardless of the length of the DNA (Bio / Technology, Vol. 6, page 816). (1988)).
細管の下部にはＤＮＡ断片４をせん断力により直線状にするための手段である構造体領域１０１を有している。 At the lower part of the thin tube, there is a structure region 101 which is a means for making the DNA fragment 4 linear by shearing force.
この構造体領域１０１をＤＮＡ断片４が通過することにより直線状になり、容易にナノポア７に挿入することが可能となる。 As the DNA fragment 4 passes through the structure region 101, it becomes linear and can be easily inserted into the nanopore 7.
このＤＮＡ断片４をせん断力により直線状にするための手段の作用機序およびその構造体について下記に詳細に記載する。 The mechanism of action of the means for making this DNA fragment 4 linear by shearing force and its structure are described in detail below.
全ゲノムを含有する核酸を含む、あらゆる長さのポリヌクレオチドを分析するために長い線状のコンホメーションに引き伸ばすことを可能にする構造を提供する。ポリヌクレオチドをデバイスに導入し、特に、物理的によって推進させる該構造を通過させる。引き伸ばしはポリヌクレオチドが構造を通過する際にせん断力を加える、ポリヌクレオチドの通路に障害物を配置する、あるいは、それらの組み合わせによって達成される。 It provides a structure that allows a lengthy linear conformation to be stretched to analyze polynucleotides of any length, including nucleic acids containing the entire genome. A polynucleotide is introduced into the device, in particular through the structure driven by physics. Stretching is accomplished by applying shear forces as the polynucleotide passes through the structure, placing obstacles in the polynucleotide pathway, or a combination thereof.
あらゆるポリヌクレオチドの特性決定に用いることができるが、ポリヌクレオチドは、主として線状または一本鎖構成を有するのが好ましい。 While it can be used to characterize any polynucleotide, it is preferred that the polynucleotide has a predominantly linear or single stranded configuration.
本発明の構造により引き伸ばされたポリヌクレオチドの個々の単位は、合成もしくは修飾結合によって結合してもよい。 Individual units of a polynucleotide stretched by the structure of the present invention may be joined by synthetic or modified bonds.
様々なタイプのポリヌクレオチドが、多種のモノマーから構成される。例えば、ＤＮＡは、デオキシリボースリン酸バックボーンを含むバイオポリヌクレオチドであり、このバックボーンに、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、ヒポキサンチン等のプリンおよびピリミジン、ならびに、その他の天然および非天然の核酸塩基、置換および非置換芳香族成分が結合する。 Various types of polynucleotides are composed of many types of monomers. For example, DNA is a biopolynucleotide containing a deoxyribose phosphate backbone, which includes purines and pyrimidines such as adenine, cytosine, guanine, thymine, 5-methylcytosine, 2-aminopurine, hypoxanthine, and the like, and Other natural and non-natural nucleobases, substituted and unsubstituted aromatic moieties are attached.
ＲＮＡは、リボースリン酸バックボーンを含むバイオポリヌクレオチドであり、このバックボーンに、チミジンに代わりウラシルが用いられる以外は、ＤＮＡについて挙げたものと同様のプリンおよびピリミジンが結合する。デオキシリボヌクレオチドは、5’または3’ヒドロキシル基によるエステル結合を介して互いに結合することによって、ＤＮＡポリヌクレオチドを形成することができる。リボヌクレオチドは、5’、3’または2’ヒドロキシル基によるエステル結合を介して互いに結合することができる。あるいは、5’、3’または2’アミノ基を有するＤＮＡまたはＲＮＡ単位は、ポリヌクレオチドの他の単位とのアミド結合により、結合することができる。 RNA is a biopolynucleotide containing a ribose phosphate backbone to which purines and pyrimidines similar to those listed for DNA are bound except that uracil is used instead of thymidine. Deoxyribonucleotides can form DNA polynucleotides by binding to each other via ester linkages with 5 'or 3' hydroxyl groups. Ribonucleotides can be linked to each other via ester linkages with 5 ', 3' or 2 'hydroxyl groups. Alternatively, DNA or RNA units having 5 ', 3' or 2 'amino groups can be linked by amide bonds with other units of the polynucleotide.
B-コンホメーションを有する十分に引き伸ばされたＤＮＡ分子における、隣接する塩基対間の距離は、3.4Åすなわち0.34ｎｍである。溶液中の天然の状態では、ＤＮＡは、十分に引き伸ばされたB-コンホメーションの形態ではなく、直径が約10μｍのコイルとして存在する。従って、コイル状のＤＮＡ分子上で複数の単位特異的マーカーを分解するのは、一層難しくなるため、分析の前に分子を引き伸ばす必要がある。 In a fully stretched DNA molecule with B-conformation, the distance between adjacent base pairs is 3.4 Å or 0.34 nm. In the natural state in solution, the DNA is not in the form of a fully stretched B-conformation but exists as a coil with a diameter of about 10 μm. Therefore, it is more difficult to degrade a plurality of unit specific markers on a coiled DNA molecule, and it is necessary to stretch the molecule before analysis.
ポリヌクレオチド分子が物理的障害に到達すると、ポリヌクレオチドは、相互作用なしに通過するか、あるいは、該障害の周りに引っ掛かり、その鎖の一部分が該障害物の両側に残る。 When a polynucleotide molecule reaches a physical obstacle, the polynucleotide either passes without interaction or is caught around the obstacle, leaving a portion of the strand on both sides of the obstacle.
さらに、流体の流れに利用可能な断面積が減少するため、障害物のところに局在化した速度勾配が生じる。その結果、障害物間を流れる流体は、その前後の流体より速く移動する。これが、接近する分子に及ぼされる剪断力を生成し、ポリヌクレオチドの引き伸ばし力として働く。この作用が、適切に寸法決定された障害物の領域全体を形成することにより、倍増されれば、ポリヌクレオチドが引き伸ばされることにより、該領域内すべての障害物を通過させることができる。 In addition, the cross-sectional area available for fluid flow is reduced, resulting in a localized velocity gradient at the obstacle. As a result, the fluid flowing between the obstacles moves faster than the fluid before and after the obstacle. This creates a shear force exerted on the approaching molecule and acts as a stretching force for the polynucleotide. If this effect is doubled by forming the entire area of an appropriately sized obstacle, the polynucleotide is stretched to allow all obstacles in the area to pass.
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、直線状に引き伸ばされる。いったんポリヌクレオチドが、障害物アレイを通過し、その十分に引き伸ばされた形態でチャネルに入れば、ポリヌクレオチドは、より低いエネルギー、すなわち、さらにコイル化したコンホメーションに自然に戻ろうとするであろう。これが起こるのを防ぐため、先細りチャネル内のポリヌクレオチドに一定剪断力を供給するようにチャネルを設計し、ポリヌクレオチドが引き伸ばされたコンホメーションのままでいるようにする。 In a preferred embodiment, the polynucleotide is stretched linearly. Once the polynucleotide passes through the obstacle array and enters the channel in its fully stretched form, the polynucleotide will naturally return to a lower energy, i.e., a further coiled conformation. Let's go. To prevent this from happening, the channel is designed to provide a constant shear force to the polynucleotide in the tapered channel so that the polynucleotide remains in the stretched conformation.
深さが１μｍ、長さが１ｍｍ、剪断速度が0.25／秒の水性チャネルは、ＤＮＡを引き伸ばすのに適した約0.25ｐＮの力を与えることが報告されている。 An aqueous channel with a depth of 1 μm, a length of 1 mm, and a shear rate of 0.25 / sec has been reported to give a force of about 0.25 pN suitable for stretching DNA.
特に、この結果から、一定剪断チャネルが、事前に引き伸ばされたＤＮＡの伸びを維持するだけではなく、さらに、ＤＮＡの引伸しに寄与する、あるいは、それ自体でＤＮＡを引き伸ばすことを示している。好ましい実施形態では、引伸しを達成するための２つの一般的方法を組み合わせる。柱である障害物のアレイを、大きさを段階的に変えて、構造に配置すれば、通過する分子に剪断力を賦与することから、障害物によるポリヌクレオチドの初期引伸しのみならず、ポリヌクレオチドが障害物を通過した後も、引伸しの維持を確実にすることができる。 In particular, the results indicate that the constant shear channel not only maintains the pre-stretched DNA stretch, but also contributes to the stretch of the DNA or stretches the DNA by itself. In the preferred embodiment, two general methods for achieving enlargement are combined. If an array of obstacles, which are pillars, is arranged in a structure in stages, the shearing force is applied to the passing molecules, so that not only the initial stretching of the polynucleotide by the obstacles but also the polynucleotides Even after passing through the obstacle, it is possible to ensure that the stretch is maintained.
本発明の、ポリヌクレオチドを引き伸ばすための構造は、2つの構成部分：送達領域およびポリヌクレオチド伸長領域を含んでなる。送達領域は、ポリヌクレオチド伸長領域内に入り、かつ該領域から出ている幅の広いチャネルである。 The structure for stretching a polynucleotide of the present invention comprises two components: a delivery region and a polynucleotide extension region. The delivery region is a wide channel that enters and exits the polynucleotide extension region.
伸長領域は、4つの主要構成部分：(1)漏斗；(2)分岐チャネルを有する構造；(3)湾曲部または曲線部を有するチャネル；および(4)小さな間隔を規定する障害物（ここで障害物は、特に柱および段差であり得る）のうち少なくとも1つを含んでなる。本発明は、4つの主要構成部分の組合せおよびこれらの主要構成部分自体のバリエーションを包含するものである。2つ以上の主要構成部分の特徴を組み合わせることで、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを制御可能な様式で伸長しかつ引き伸ばすのに十分に機能するさらなる設計を得ることができる。さらに、同じ設計をいくつか、並行してまたは連続して繰り返してもよい。 The extension region has four main components: (1) a funnel; (2) a structure with a branch channel; (3) a channel with a bend or curve; and (4) an obstruction that defines a small spacing (where Obstacles may comprise at least one of in particular pillars and steps. The present invention encompasses combinations of four major components and variations of these major components themselves. By combining the features of two or more major components, additional designs can be obtained that function well to extend and stretch polynucleotides, particularly DNA, in a controllable manner. Further, several of the same design may be repeated in parallel or sequentially.
本発明の範囲内に入る構造のさらなる例については下図に示している。これらには、漏斗、障害物、枝管、および連続構造を含む引き伸ばし構造の実施形態；小さな間隔を規定する小さな障害物の組合せを有する連続した漏斗構造を示している。 Further examples of structures that fall within the scope of the invention are shown in the following figure. These show an embodiment of a stretched structure including a funnel, an obstruction, a branch, and a continuous structure; a continuous funnel structure with a combination of small obstructions that define a small spacing.
障害物は断面形状および断面積を変えることができる。障害物は方形柱、円形柱、楕円形柱またはいずれもの縦横比の長方形断面を有する柱を含んでなり、他には四辺形以外の正または不規則な多角形の断面形状を有する柱を含んでなる。障害物の好ましい間隔は解析するポリヌクレオチドに大いに依存している。鎖の直径２ｎｍでらせんの直径が約１μｍより高い様々な値をとる長いＤＮＡの場合、通路の幅は好ましくは100ｎｍ〜800ｎｍであり、最も好ましい値は500ｎｍである。
Obstacles can vary in cross-sectional shape and cross-sectional area. Obstacles include square columns, circular columns, elliptical columns, or columns with any aspect ratio rectangular cross section, and other columns with regular or irregular polygonal cross sections other than quadrilaterals. It becomes. The preferred spacing of obstacles is highly dependent on the polynucleotide being analyzed. For long DNAs with various values of
柱の断面積は、引き伸ばされるポリヌクレオチドのサイズおよび用いるチャネルのサイズに応じて、0.1μｍ２〜1ｍｍ２、好ましくは0.1μｍ２〜10μｍ２、さらに好ましくは1μｍ２〜100μｍ２、いっそうさらに好ましくは1μｍ２〜25μｍ２の間で変えてもよい。 The cross-sectional area of the column is 0.1 μm 2 to 1 mm 2 , preferably 0.1 μm 2 to 10 μm 2 , more preferably 1 μm 2 to 100 μm 2 , even more preferably, depending on the size of the polynucleotide to be stretched and the size of the channel used. it may be varied between 1μm 2 ~25μm 2.
前記電圧印加と同時に電流計１３によってナノポア７を介して流れるイオンの流れを計測する。
Simultaneously with the voltage application, an
ＤＮＡ断片４が電気泳動によりナノポア７に導入される。ＤＮＡ断片４がナノポア７に導入されると電流値は減少する。 The DNA fragment 4 is introduced into the nanopore 7 by electrophoresis. When the DNA fragment 4 is introduced into the nanopore 7, the current value decreases.
ＤＮＡ断片４がナノポア７に通過開始と同時に下記に示す核酸配列測定を実施する。本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、ポリヌクレオチドを、電極間を通過させる工程、ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、測定した電流値の最頻値を算出する工程、電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値の最頻値を規格化する工程、および規格化した最頻値を参照値と比較する工程を包含している。 Simultaneously with the start of passage of the DNA fragment 4 into the nanopore 7, the following nucleic acid sequence measurement is performed. The present invention provides a method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide. The method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide includes a step of passing a polynucleotide between electrodes, a step of measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through, and a step of measuring the maximum of the measured current value. The step of calculating the mode value, the mode of standardizing the mode value of the current value by dividing the mode value of the current value by the mode value of the standard nucleotide, and the normalized mode value as the reference value A step of comparing is included.
上述したように、トンネル電流が種々の条件から大きく影響を受けるので、上記「最頻値を算出する工程」にて算出したトンネル電流の電流値の最頻値を用いてポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別することは困難である。しかし、上記「最頻値を規格化する工程」にて、トンネル電流の電流値の最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、この影響を最小限に留めることができる。このため、上記「規格化した最頻値を参照値と比較する工程」にて、ポリヌクレオチドのヌクレオチドを識別することが可能になる。 As described above, since the tunnel current is greatly influenced by various conditions, the nucleotides constituting the polynucleotide using the mode value of the current value of the tunnel current calculated in the above-mentioned “step of calculating the mode value”. Is difficult to identify. However, this influence can be kept to a minimum by dividing the mode value of the current value of the tunnel current by the mode value of the reference nucleotide in the “step of normalizing the mode value”. For this reason, it becomes possible to identify the nucleotide of the polynucleotide in the above-mentioned “step of comparing the normalized mode value with the reference value”.
複数種のヌクレオチドが識別された場合、本発明に適用したポリヌクレオチドは異なるヌクレオチドからなるものであると判定することができる。この場合、本発明に適用したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するには、ヌクレオチドの並びを特定することが必要となる。この特定を行うために、本発明は、トンネル電流のパルスを検出する工程、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する工程、および規格化した電流値を参照値と比較する工程をさらに包含している。 When multiple types of nucleotides are identified, it can be determined that the polynucleotide applied to the present invention consists of different nucleotides. In this case, in order to determine the nucleotide sequence of the polynucleotide applied to the present invention, it is necessary to specify the nucleotide sequence. In order to perform this specification, the present invention includes a step of detecting a pulse of a tunnel current, a step of normalizing a current value by dividing a current value in the pulse by a mode value of a reference nucleotide, and a standardization The method further includes the step of comparing the current value with the reference value.
このように、本発明では、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別し、必要に応じて、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの並びを特定することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定が実現される。 Thus, in the present invention, the nucleotide sequence of a polynucleotide can be determined by identifying the nucleotides constituting the polynucleotide and, if necessary, specifying the sequence of the nucleotides constituting the polynucleotide.
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」、「遺伝子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。なお、本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、２〜数十個、より具体的には、２〜５０個のヌクレオチドからなるものが意図される。「ポリヌクレオチド」は、数十個以上、具体的には、５０個よりも多くのヌクレオチドからなるものが意図される。 As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “oligonucleotide”, “gene” and is intended to be a polymer of nucleotides. As used herein, “oligonucleotide” is intended to be composed of 2 to several tens of nucleotides, more specifically 2 to 50 nucleotides. A “polynucleotide” is intended to be composed of several tens or more, specifically, more than 50 nucleotides.
ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなるもの（ＤＮＡ）であってもよいし、リボヌクレオチドからなるもの（ＲＮＡ）であってもよい。 The polynucleotide may be deoxyribonucleotide (DNA) or ribonucleotide (RNA).
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列として示される。 As used herein, the term “nucleotide sequence” is used interchangeably with “base sequence” and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
本実施形態の本発明を実施するには、ポリヌクレオチドが通過した際に、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド１分子を介したトンネル電流を生じさせることが必要である。このようなトンネル電流が生じさせるには電極間距離および電極の大きさ（例えば、ポリヌクレオチドが通過する方向の電極の長さや、電極間の方向とポリヌクレオチドが通過する方向とによって形成される平面に垂直な方向の電極の長さ）が重要である。具体的には、電極間距離および電極の大きさは、ヌクレオチドの分子直径よりも少し短いか、等しいか、それよりも少し大きい程度であることが好ましい。このような電極対としては、上述したヌクレオチドを識別する方法にて説明した電極対を用いることができる。 In order to carry out the present invention of this embodiment, it is necessary to generate a tunnel current through one nucleotide molecule constituting the polynucleotide when the polynucleotide passes through. In order to generate such a tunnel current, the distance between the electrodes and the size of the electrodes (for example, the length of the electrodes in the direction in which the polynucleotide passes, the plane formed by the direction between the electrodes and the direction in which the polynucleotide passes) The length of the electrode in the direction perpendicular to Specifically, the distance between the electrodes and the size of the electrodes are preferably slightly shorter than, equal to, or slightly larger than the molecular diameter of the nucleotide. As such an electrode pair, the electrode pair described in the above-described method for identifying nucleotides can be used.
また、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド１分子を介したトンネル電流を電極間に生じさせるには、電極間を通過させるポリヌクレオチドは、線状の一本鎖の形態であることが好ましい。トンネル電流が生じるメカニズムを以下にて説明する。 In order to generate a tunnel current between the electrodes via one nucleotide molecule constituting the polynucleotide, the polynucleotide passing between the electrodes is preferably in the form of a linear single strand. A mechanism for generating the tunnel current will be described below.
ポリヌクレオチドが電極間に進入すると、まず、ポリヌクレオチドを構成する１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉される。１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉されたときに、１番目のヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じる。 When the polynucleotide enters between the electrodes, first, the first nucleotide constituting the polynucleotide is captured between the electrodes. When the first nucleotide is captured between the electrodes, a tunneling current due to the first nucleotide occurs between the electrodes.
ポリヌクレオチドの電極間の移動に伴い、１番目のヌクレオチドが電極間を移動し、２番目のヌクレオチドが電極間に進入する。電極間に捕捉されるヌクレオチドが１番目のヌクレオチドから２番目のヌクレオチドへ変わるときには、電極間に、１番目のヌクレオチドの一部と、２番目のヌクレオチドの一部との両方が捕捉される。この場合、１番目のヌクレオチドの一部と２番目のヌクレオチドの一部との両方またはどちらか一方に起因するトンネル電流が電極間に生じる。 As the polynucleotide moves between the electrodes, the first nucleotide moves between the electrodes, and the second nucleotide enters between the electrodes. When the nucleotide captured between the electrodes changes from the first nucleotide to the second nucleotide, both a portion of the first nucleotide and a portion of the second nucleotide are captured between the electrodes. In this case, a tunnel current caused by a part of the first nucleotide and / or a part of the second nucleotide is generated between the electrodes.
その後、１番目のヌクレオチドが電極間を完全に通過し、２番目のヌクレオチドの全体が電極間に捕捉される。２番目のヌクレオチドの全体が電極間に捕捉されたときに、２番目のヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じる。 The first nucleotide then passes completely between the electrodes, and the entire second nucleotide is captured between the electrodes. When the entire second nucleotide is captured between the electrodes, a tunneling current due to the second nucleotide occurs between the electrodes.
最後に、ポリヌクレオチドが電極間を通過すると（ポリヌクレオチドを構成する最後のヌクレオチドが電極間から解離すると）、電極間に生じていたトンネル電流が消失する。 Finally, when the polynucleotide passes between the electrodes (when the last nucleotide constituting the polynucleotide is dissociated from between the electrodes), the tunnel current generated between the electrodes disappears.
このように、ポリヌクレオチドが電極間に進入し移動すると、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが順番に電極間に捕捉され、これらのヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じ、ポリヌクレオチドが電極間から解離すると、トンネル電流が消失する。つまり、ポリヌクレオチドが電極間を通過すると、このポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスが生じる。 In this way, when the polynucleotide enters and moves between the electrodes, the nucleotides constituting the polynucleotide are sequentially captured between the electrodes, a tunnel current caused by these nucleotides is generated between the electrodes, and the polynucleotide is moved between the electrodes. When dissociated, the tunnel current disappears. That is, when the polynucleotide passes between the electrodes, a pulse of a tunnel current due to the polynucleotide is generated.
本明細書において、「ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルス」は、トンネル電流を所定の時間測定したときに、トンネル電流が基底レベルを超えて上昇し、再び基底レベルに戻るまでのトンネル電流のシグナルが意図される。このトンネル電流の上昇は、ポリヌクレオチドを構成する１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉されたことを示しており、トンネル電流が基底レベルに戻ることは、捕捉された最後のヌクレオチドが電極間から解離したことを示している。 In the present specification, “pulse of a tunnel current caused by a polynucleotide” means a tunnel current that rises above the base level and returns to the base level again when the tunnel current is measured for a predetermined time. A signal is intended. This increase in tunneling current indicates that the first nucleotide constituting the polynucleotide has been captured between the electrodes, and that the tunneling current returns to the basal level indicates that the last captured nucleotide has dissociated from between the electrodes. It shows that.
「基底レベル」は、ノイズの平均値が意図される。「ノイズ」は、ヌクレオチドが電極間に捕捉されていないときに観察されるトンネル電流のシグナルが意図される。例えば、ノイズは、ポリヌクレオチドが溶解していない溶液中に保持された電極間に電圧を印加したときに、生じるトンネル電流の電流値を測定することによって得ることができる。 As the “base level”, an average value of noise is intended. “Noise” is intended to be a signal of the tunneling current that is observed when nucleotides are not trapped between the electrodes. For example, noise can be obtained by measuring a current value of a tunnel current that is generated when a voltage is applied between electrodes held in a solution in which a polynucleotide is not dissolved.
本発明における「ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程」では、このようにして、ポリヌクレオチドが溶解した溶液中に保持された電極間に電圧を印加して、これによって電極間に生じたトンネル電流の電流値を所定の時間測定すればよい。電極間に電圧を印加する方法および電極間に生じたトンネル電流の電流値を測定する方法は、上記ヌクレオチドを識別する方法における説明を援用することができる。 In the “step of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through” in the present invention, a voltage is applied between the electrodes held in the solution in which the polynucleotide is dissolved in this way. Thus, the current value of the tunnel current generated between the electrodes may be measured for a predetermined time. For the method of applying a voltage between the electrodes and the method of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes, the description of the method for identifying nucleotides can be used.
本発明における「測定した電流値の最頻値を算出する工程」では、このようにして測定した電流値に対して統計分析を行うことによって最頻値を算出すればよい。 In the “step of calculating the mode value of the measured current value” in the present invention, the mode value may be calculated by performing statistical analysis on the current value thus measured.
例えば、電流値をその値に基づいて分類し、分類した各群に属する数および電流値に基づいて最頻値を算出すればよい。「電流値をその値に基づいて分類すること」は、例えば、同一または実質的に同一である電流値を同一の群に分類することであってもよいし、一定の範囲に属する電流値を同一の群に分類することであってもよい。なお、「実質的に同一である電流値」は、ある電流値と数％異なる電流値をいい、例えば、ある電流値の９０％〜１１０％の電流値が意図される。 For example, the current value may be classified based on the value, and the mode value may be calculated based on the number and current value belonging to each classified group. “Classifying current values based on the values” may be, for example, classifying current values that are the same or substantially the same into the same group, It may be classified into the same group. Note that the “current value that is substantially the same” refers to a current value that is several percent different from a certain current value.
本発明のポリヌクレオチドの直線化手段及びナノポア構造を利用したポリヌクレオチド配列決定方法を用いることにより、容易にポリヌクレオチドの一次配列を決定することができ、遺伝子解析等の用途に応用できる。 By using the polynucleotide linearization means and the polynucleotide sequencing method using the nanopore structure of the present invention, the primary sequence of the polynucleotide can be easily determined and can be applied to uses such as gene analysis.
１：電極、
２：上部槽、
３：第一溶液槽、
４：ＤＮＡ断片、
５：シースフロー用液流入り口、
６：ナノポア薄膜、
７：第二溶液槽、
８：第二溶液槽、
９：電極、
１０：電圧源、
１１：電流計
１２：データ処理装置、
１３：電流計、
１４：電圧源、
１５：構造体領域
1: electrode,
2: Upper tank,
3: First solution tank,
4: DNA fragment,
5: Liquid inlet for sheath flow,
6: Nanopore thin film,
7: Second solution tank,
8: Second solution tank,
9: electrode,
10: voltage source,
11: Ammeter 12: Data processing device
13: Ammeter,
14: Voltage source
15: Structure area
Claims (3)
ポリヌクレオチドをナノポアに導入し、電極間を通過させる工程、
該ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、
測定した電流値の最頻値を算出する工程、
該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する工程、
および規格化した最頻値を参照値と比較する工程を包含しており、
該基準ヌクレオチドの最頻値は、該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させる際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出し、各パルスにおける最大電流値の最頻値として算出され、
該ポリヌクレオチドをナノポアに導入する前に予め直線化手段により直線化することを特徴とするポリヌクレオチド配列決定方法。 Adding a polynucleotide to the device;
Introducing a polynucleotide into the nanopore and passing between the electrodes;
Measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through,
Calculating the mode of the measured current value,
Normalizing the mode value of the current value by dividing the mode value of the current value by the mode value of the reference nucleotide;
And comparing the normalized mode value with a reference value,
The mode value of the reference nucleotide is calculated as a mode value of the maximum current value in each pulse by detecting a pulse of a tunnel current generated between the electrodes when the reference nucleotide is passed through the electrodes a plurality of times. ,
A polynucleotide sequencing method comprising linearizing in advance by a linearizing means before introducing the polynucleotide into a nanopore.
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