JP2014010109A - 核酸増幅反応用マイクロチップ - Google Patents

Abstract

【課題】簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップを提供すること。
【解決手段】反応領域に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬の動きを抑制する係止部が設けられている、核酸増幅反応用マイクロチップ。本開示の係止部３を反応領域２内に設置した核酸増幅反応用マイクロチップは、この係止部３によって固相状の試薬の動きを抑制することや制御することが可能となる。そして、固相状の試薬を均一に溶解できるようになることで、この溶液と試料溶液とも均一に混合しやすくなる。これにより、簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップを提供することが可能となる。
【選択図】図１

Description

本開示は、核酸増幅反応用マイクロチップに関する。より詳しくは、核酸増幅反応の反応場となる１つのウェル内に複数の光検出場を有する核酸増幅反応用マイクロチップに関する。

近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。

このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。

μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えばリアルタイムＰＣＲ装置）などがある。

従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な試薬及び鋳型ＤＮＡを予め全て混合し、この混合液をマイクロチップに配設された複数のウェル内に導入して反応を行う方法が取られている。しかし、この方法では、ウェル内に混合液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に混合液内で反応が進行し、非特異的な核酸増幅を容易にし、定量性を低下させてしまう問題が生じていた。

前述の問題に対し、例えば特許文献１には、ウェルに核酸増幅反応に必要な複数の試薬が所定の順序で積層されて固着化されたマイクロチップが開示されている。しかし、さらなる簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップが求められている。

特開２０１１−１６０７２８号公報

本開示は、簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップを提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本開示は、反応領域に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬の動きを抑制する係止部が設けられている、核酸増幅反応用マイクロチップを提供するものである。

前記係止部が、前記反応領域の長手方向及び／又は厚み方向の動きを抑制してもよい。
さらに、前記係止部が、前記反応領域の内面に設けられている凸部及び／又は凹部であってもよい。
前記反応領域中に、光検出を行う面が複数存在してもよい。
前記反応領域に試料溶液が複数の流路から流入してもよい。
前記固相状の試薬が、前記光検出を行う面に配置されてもよい。
前記試料溶液が前記固相状の試薬に向かって流入する流路を有してもよい。

前記凸部は、液体が通過可能なものでもよい。
前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が短手方向の中間に位置するものでもよい。
前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が対向するように設けられものでもよい。
前記凸部が、前記試薬の内周部に嵌合してもよい。
前記凹部が、前記試薬の外周部に嵌合してもよい。
また、前記試料溶液が前記固相状の試薬に向かって流入する流路を有してもよい。
また、前記反応領域が、前記試料溶液が流入する流路より低い位置にあってもよい。
前記反応領域の前記流路から流入する位置に、突起部があってもよい。
前記固相状の試薬が、光検出を行う面の面積の大部分を占めるように配置されてもよい。

また、前記固相状の試薬が、凍結乾燥試薬であってもよい。前記固相状の試薬が、打錠成形物であってもよい。前記固相状の試薬が、２つ以上のものであってもよい。

本開示によれば、簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップを提供することが可能となる。

本開示の第一の実施形態に係るマイクロチップ１ａの構成を説明するための模式図である。 本開示の係止部３の断面の例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に対向する凸部３１，３１の組み合わせを複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に通過部７及び凸部３１の組み合わせを複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の第二の実施形態に係るマイクロチップ１ｂの構成を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に凸部３１と固相状の試薬Ｒの内周部Ｒ１とが嵌合したものが複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に凸部３１と固相状の試薬Ｒの内周部Ｒ１とが嵌合したものが複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に凹部３２と固相状の試薬Ｒの外周部Ｒ２とが嵌合したものが複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に凹部３２と固相状の試薬Ｒの内周部Ｒ２とが嵌合したものが複数有するときの例示を説明するための模式図である。 本開示の１つのウェル２内に１つの固相状の試薬Ｒが収容されたときの模式図である。 本開示のマイクロチップにおいて、固相状の試薬Ｒがウェル２内からでないウェルの形状を説明するための模式図である。 本開示のマイクロチップにおいて、流路５の例示を説明するための模式図である。

以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．本開示の核酸増幅反応用マイクロチップ
２．本開示の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
３．本開示の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
４．本開示の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
５．本開示の変形実施形態１に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
６．本開示の変形実施形態２に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成

１．本開示の核酸増幅反応用マイクロチップ
本開示の核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」ともいう）１には、核酸増幅反応の反応場となる反応領域２に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬Ｒの動きを抑制する係止部３が設けられている。この反応領域２として、例えば、図１にウェル２１ａ〜２５ａ、図２にウェル２のＱ−Ｑ断面の例示、図３及び４にウェル２０１ａ〜２０５ａを示す。また、図５にウェル２１ｂ〜２５ｂ、図６〜９にウェル２０１ｂ〜２０４ｂを示す。また、図１０にウェル２ｃを示す。ウェルの形状は特に限定されないが、長方形で両端に丸みを有することが好ましい。ウェルの両端間の長さを「ウェルの長さ（Ｘ）」及びウェルの両端間の幅を「ウェルの幅（Ｙ）」（長さ（Ｘ）≧幅（Ｙ））、ウェルの深さを「ウェルの深さ（Ｚ）」とする。
そして、本開示のマイクロチップ１は、試料溶液が導入される領域として、外部からサンプル等の液体が導入される導入部４と、核酸増幅反応の反応場となる反応領域２と、導入部４と反応領域２とを接続する流路５（流路５１〜５５）が設けられていることが望ましい。

さらに、１つの反応領域２内には、光を入射及び／又は出射させて反応領域内の核酸増幅反応の光検出を行う側の面（以下、「光検出側面」ともいう）６が単数又は複数存在することが好ましい。この光検出側面６は、固相状の試薬を配置することが可能な面である。そして、当該光検出を行う側の面６に、前記固相状の試薬Ｒが配置されているのが好適である。１つの光検出側面６の面積が、１２．５〜４００ｍｍ^２であるのが好ましい。
前記光検出側面６の数は、特に限定されないが、複数であることが好適である。この数は、係止部３の配置、固相状の試薬の大きさや数、測定の際の照射光及び検出光等によって自由に設計することが可能である。また、当該光検出側面６で、光検出を行なってもよい。
前記光検出を行う側の面６の面積の大部分を占めるように固相状の試薬Ｒが配置され、反応領域内に収容されていることが好適である。当該光学検出側面６の面積のうちの、好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜９５％の占有面積を有する固相状の試薬Ｒが配置されていることが好適である。また、厚み６１は、基板層１１の外側面と、固相状の試薬Ｒ（以下、「試薬Ｒ」ともいう）が配置可能な内側面との間の長さをいう。この厚み６１は、０．５〜２．０ｍｍとすることが好ましい。

また、流路５は、試料溶液が反応領域２に流入するように形成されている。そして、前記流路５１〜５５の各流路は、試料溶液が固相状の試薬Ｒに向かって流入する流路を有することが好適である。当該流入する流路は、流路５が複数に分岐している流路が好適である。複数の流路が反応領域２に接続されていることによって、１つの反応領域内に複数配置された固相状の試薬を均一的に溶解させ易い。
図３、図４及び図１２に流路５の例示を示すが、これに限定されるものではない。
例えば、流路５は、短手の正の方向及び／又は短手の負の方向から反応領域に液体が流入するような分岐流路を設けることが好ましい。当該流路５の分岐流路は、例えば、長手（Ｘ）方向又は短手（Ｙ）の方向に対して略直角方向；長手（Ｘ）及び短手（Ｙ）の方向に対して斜め方向等から液体が流入するように設けられている。
図１２に示すように、反応領域の長手方向に対して略直角方向から試料溶液を流入させる分岐流路を設けることで、反応領域内に均等に液体が流入しやすくなる。これにより、反応領域内にある固相状の試薬を均一に溶解させやすくなる。
このとき、図１２Ａに示すように短手の正方向から又は短手の負方向から反応領域に液体を流入させる流路を設けてもよい。また、図１２Ｃに示すように、短手の正方向と負方向から交互に又は短手の正負方向の両方から反応領域に試料溶液を流入させる流路を設けてもよい。また、図１２Ｂに示すように略直角方向で反応領域に流入させる前に、流路５から斜め方向から流入するように分岐流路を設けてもよい。
また、図１２Ｄに示すように、各流路５の液体が反応領域に同時期に流入するように、各流路長を等しくすることが好ましい。この流路長として、例えば、導入部又は流路が分岐する箇所から反応領域までの流路長等が挙げられる。同時期に液体が固相状の試薬に接触することで、反応領域にある複数の固相状の試薬Ｒが同時期に溶解させ、溶液が均一化しやすい。

前記係止部３は、反応領域２の内面に設けられていることが好ましい。さらに、前記係止部３は、反応領域２の内面に凸３１部及び／又は凹部３２を設けることで形成されたものであることが好ましい（例えば図２及び図５参照）。前記凸部３１及び凹部３２は、例えば、長手方向（Ｘ正負方向）、短手方向（Ｙ正負方向）及び厚み方向（Ｚ正負方向）のいずれに形成されてもよい。

前記係止部３により、反応領域２内にある試薬Ｒの動きを抑制することが可能となる。これにより、液体（例えば試料溶液）が反応領域内に流入した際に固相状の試薬が配置されていた光検出側の面とは異なる場所に移動することを抑制する。また、前記係止部３を設けることで、反応領域２内にある固相状の試薬Ｒの配置を調整することが可能となる。また、この係止部３により、反応領域２内に試薬Ｒを均等に配置することも可能となる。これにより、試料溶液が反応領域２に流入した際に、当該反応領域２内で試薬Ｒを均等に溶解することも可能となる。
好ましくは、固相状試薬Ｒにおける長手方向及び／又は厚み方向の動きを抑制するように係止部を設けるのが好適である。これにより、１つの反応領域内に複数固相状の試薬を配置しても流入する試料溶液にて均一的に溶解させ易い。

ここで、試料溶液及び試薬溶液を混合して核酸増幅反応を行う場合、反応を正確にして精度の高い分析を行うためにはこれら溶液を均一に混合することが重要となってくる。しかし、反応ウェルを大きく設計し、複数の固相状の試薬を配置した場合には、反応ウェルに配置された試薬の位置に応じてこれら溶液が均一になるまでに要する時間が異なってくる。例えば、固相状の試薬が反応ウェルの中心に配置した場合と、端に配置した場合とでは固相状の試薬が溶解した後、これら溶液が均一になる時間は中心に配置した方が短時間で済み、端に配置した場合には長時間を要する。そのため、固相状の試薬の配置が制御できていない場合には、核酸増幅反応が長時間化したり、再現性の低い結果となってしまう問題が生じる。さらに核酸増幅法において試薬の濃度勾配が大きい場合、感度や特異性が低下する等精度に問題が生じる。
溶液を均一に溶解させるために、溶液に対して撹拌、振動、超音波処理等の混合処理を行う方法もあるが、これは新たなプロセスや装置が必要となり、簡便な手法とは言い難い。

しかしながら、本開示の係止部３を反応領域２内に設置した核酸増幅反応用マイクロチップは、この係止部３によって固相状の試薬の動きを抑制することや制御することが可能となる。さらに、前記係止部３を、前記反応領域の長手方向及び／又は厚み方向の動きを抑制するように配置することが望ましい。
そうすることで、物理的処理を用いなくとも、同じ反応領域内にある複数の固相状の試薬を均一に溶解することが可能となる。また、物理的な混合処理を加えることで、より効率的に溶液を均一化できる。固相状の試薬を均一に溶解できるようになることで、この溶液と試料溶液とも均一に混合しやすくなる。これにより、核酸増幅反応が長時間化するのを防ぎ、さらに再現性を高めることも可能となる。また、核酸増幅反応において、感度及び特異性の低下を防ぐことも可能となる。
よって、本開示の核酸増幅反応用マイクロチップを用いれば、簡便で精度の高い分析を行うことが可能となる。

前記マイクロチップの基板（基板層１１〜１３）は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ、ＰＣ、ＣＯＰ、ＰＭＤＳ等）により形成できる。マイクロチップの材質は、光学検出部から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいため光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
マイクロチップの基板への反応領域（ウェル）２、係止部３、各流路５、通過部７等の成形は、ウェットエッチングやドライエッチングによって、またナノインプリントや射出成形、機械加工によって行うことが可能である。なお、流路５は、主流路と反応領域とを接続し、主流路から反応領域の固相状の試薬Ｒに試料溶液を流入させるための分岐流路を配置するように形成してもよい。
マイクロチップは、反応領域（ウェル）２、係止部３、各流路５、通過部７等を形成した基板を、同じ材質又は異なる材質の基板で封止することで形成することが可能である。

本開示に係るマイクロチップを用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。

２．本開示の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１は、本開示の第一実施形態に係るマイクロチップ１ａの構成を説明する模式図である。図１Ａは上面模式図であり、図１Ｂは、図１ＡのＰ１−Ｐ２断面に対応する断面模式図である。図２は、図１ＡのＱ−Ｑ断面に対応する断面模式図の例示である。上述した本開示の核酸増幅反応用マイクロチップと同一の構成についての説明については適宜省略する。

図中、符号１ａで示す核酸増幅反応用マイクロチップには、核酸増幅反応の反応場となる反応領域２に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬Ｒの動きを抑制する係止部３が設けられている。当該反応領域２を、ウェル２１ａ〜２５ａに示すように必要に応じて複数設けても良く、また複数設ける場合には、同一又は異なる反応領域２を配設しても良い。
前記流路５１〜５５の各流路は、試料溶液が前記固相状の試薬Ｒに向かって流入する流路であることが望ましい。これにより、前記固相状の試薬が溶解しやすくなる。

さらに、反応領域２内には、図１Ｂに示すように、光検出を行う側の面（光検出側面）６が複数存在することが好ましい。当該光検出を行う側の面６は、厚み方向に設けるのが好適である。さらに当該光検出側面６に、前記固相状の試薬Ｒが配置されているのが好適である。前記固相状の試薬Ｒは、２つ以上のものでもよい。１つの反応領域２のＸＹ方向の面積が１２．５〜４００ｍｍ^２であることが好ましく、また、厚み６１が０．５〜２．０ｍｍであることが好ましい。

前記係止部３は、反応領域２の内面に形成される凸部３１であることが好ましい。当該凸部３１は液体（例えば、試料溶液や試薬Ｒの混合溶液等）が通過可能な形状又は状態であればよい。液体が通過可能な部分として通過部７を設けてもよい。係止部を設けることにより、試薬溶液が反応領域に流入した際に、固相状の試薬が隣の光検出部に移動することを制限する。そして、係止部を設けて固相状の試薬同士が接触しないように間仕切りする一方で流体は移動可能とすることで、１つの反応領域内で試薬の溶解が均一となり易く複数の光検出した際に各検出結果の誤差が少なくなる。
前記凸部３１が存在する反応領域２のＱ−Ｑ断面の全面積のうち、凸部３１の断面積が占める割合は、好ましくは１０〜６０％、より好ましくは２０〜５０％である。なお、Ｑ−Ｑ断面の全面積とは、反応領域における（ウェルの幅（Ｙ）×ウェルの深さ（Ｚ））で求めることができる。

本開示の係止部３のＱ−Ｑ断面として、図２Ａ〜Ｉに示す例示が挙げられるが、これに限定されるものではない。
図２Ａに示すように短手方向で内面の両端に凸部３１，３１設け、中央付近に通過部７を設けることが好ましい。さらに、この凸部３１は厚み方向に一部が突出するように設けても良い。また、図２Ｂ及びＣに示すように、短手方向の中央付近と、さらに厚み方向に通過部７を設けることが好ましい。
また、図２Ｄに示すように、短手方向で内面の両端に通過部７，７を設け、中央付近に凸部３１を設けることが好ましい。さらに、この凸部３１は厚み方向に一部が突出するように設けても良い。また、図２Ｅ及びＦに示すように、短手方向の両端と、さらに厚み方向に通過部７を設けることが好ましい。
また、図２Ｇに示すように、短手方向の両端とその中央付近に、反応領域２の内面に凸部３１を設け、中央の凸部３１と両端の凸部３１との間に複数の通過部７を設けることが好ましい。さらに、この凸部３１は厚み方向に一部が突出するように設けても良い。
また、図２Ｈに示すように、短手方向と厚み方向で凸部３１を格子状に設け、その格子の間に通過部７を設けることが好ましい。この格子状の凸部３１は厚み方向に一部が突出するように設けても良い。

また、図２Ｉに示すように、凸部３１として、透水性があり、可溶化した試薬Ｒが通過することが可能な繊維状又は膜状のものを設けることが好ましい。例えば、不織布や織布等が挙げられる。この原料としては、アラミド、ガラス、セルロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、ポリオレフィン、レーヨン、低密度ポリエチレン樹脂、エチレン酢酸ビニル樹脂、合成ゴム、共重合ポリアミド樹脂及び共重合ポリエステル樹脂などが挙げられる。このうちから１種又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

また、図２Ａ〜Ｉの構成を適宜組み合わせて用いることも可能である。また、厚み方向を基準に凸部３１及び通過部７を設けてもよい。

また、図３Ａ〜Ｃに示すように、凸部３１が対向するように、反応領域２内に設けられることが好ましい。短手方向及び／又は厚み方向に対向する凸部３１を反応領域２の内面に設けることが好ましい。そして、通過部７は凸部３１，３１の間に設けられていることが好ましい。なお、図３Ａ〜ＣのＱ−Ｑ断面の形状は、例えば、図２Ａ〜Ｃに示す例示の構造が挙げられる。
この対向する凸部３１の形状は、三角、四角等の多角形状；半楕円状；半円状等を挙げることが可能である。

また、図４Ａ〜Ｂに示すように、凸部３１は、短手方向及び／又は厚み方向の中間に位置するように、反応領域２内に設けられることが好ましい。そして、この凸部３１の両端側に通過部７が設けられていることが好ましい。なお、図４Ａ〜ＢのＱ−Ｑ断面の形状は、例えば、図２Ｄ〜Ｆに示す例示の構造が挙げられる。
この中間位置の凸部の形状は、三角、四角等の多角形状；半楕円状；半円状；内湾曲状等が挙げられる。多角形状の際には丸みを帯びていてもよい。
また、図３Ａ〜Ｃ及び図４Ａ〜Ｂに示すように、流路５は、短手正方向及び／又は短手負方向から反応領域２に試料溶液が流入するように設けられていればよい。短手正方向又は短手負方向の何れか一方から試料溶液が流入するように流路５が形成されている方が、マイクロチップを小型化できるので好ましい。

本開示のマイクロチップ１ａは、反応領域（ウェル）２１〜２５、係止部３、各流路５、通過部７等が形成された基板層１２に基板層１１が貼り合わされ、さらに基板層１１に基板層１３が貼り合わされることにより構成されている（図１（Ｂ）参照）。マイクロチップ１ａでは、基板層１１と基板層１２との貼り合わせを大気圧に対して負圧下で行った場合、反応領域（ウェル）２１〜２５、係止部３、各流路５、通過部７の内部を大気圧に対して負圧（１／１００気圧）となるように気密に封止することができる。マイクロチップ１ａにおいて、試料溶液が導入される領域を大気圧に対し負圧とすることにより、試料溶液の導入時にマイクロチップ内部の陰圧によって試料溶液が吸引され、微細な流路構造が形成されたマイクロチップ１ａの内部への試料溶液の導入が、より短時間で行えるようになる。

基板層１１，１２，１３の材料は、ガラスや各種プラスチック類とできる。好ましくは、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成する。マイクロチップ１ａの外面を構成する基板層１２，１３をＰＣなどのガス不透過性を備える材料とすることで、ウェル２１〜２５内に導入された試料溶液が、核酸増幅反応における加熱によって気化し、基板層１１を透過して消失（液抜け）するのを防止できる。また、マイクロチップ１ａの試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、マイクロチップ１ａ外からの空気の浸透を防いで内部の負圧を保持するためにも、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成することが好ましい。

ガス不透過性を備える基板層の材料は、ガラス、プラスチック類、金属類及びセラミック類などが採用できる。プラスチック類としては、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタアクリレート：アクリル樹脂）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ジエチレングリコールビスアリルカーボネート、ＳＡＮ樹脂（スチレン−アクリロニトリル共重合体）、ＭＳ樹脂（ＭＭＡ−スチレン共重合体）、ＴＰＸ（ポリ（４−メチルペンテン−１））、ポリオレフィン、ＳｉＭＡ（シロキサニルメタクリレートモノマー）−ＭＭＡ共重合体、ＳｉＭＡ−フッ素含有モノマー共重合体、シリコーンマクロマー（Ａ）−ＨＦＢｕＭＡ（ヘプタフルオロブチルメタクリレート）−ＭＭＡ３元共重合体、ジ置換ポリアセチレン系ポリマー等が挙げられる。金属類としては、アルミニウム、銅、ステンレス（ＳＵＳ）、ケイ素、チタン、タングステン等が挙げられる。セラミック類としては、アルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）、窒化アルミ（ＡｌＮ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、酸化チタン（ＴｉＯ_２）、酸化ジルコニア（ＺｒＯ_２）、石英等が挙げられる。

基板層１１は、弾性を有する材料で構成されることが好ましい。マイクロチップ１ａにおいて、導入部４を封止する基板層１１を、弾性を有する材料とすることによって、針などの穿刺部材の一部をマイクロチップ１ａ外部から導入部４に穿通することが可能となる。針を接続したシリンジ等に予め試料溶液を充填しておき、基板層１１をその針で穿通すると、封止されていた導入部４がシリンジ内部とだけ接続されて、気泡を生じることなく試料溶液のマイクロチップ１ａ内への導入が可能となる。

また、試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、針の先が導入部４に到達した時点で、マイクロチップ１ａ外部と導入部４との圧力差によって、シリンジ内の試料溶液は、導入部４へ自動的に吸引される。

基板層１１を弾性を有する材料により形成しておくことで、試料溶液導入後、針を導入部４から抜いた際、基板層１１の自己封止性により穿刺箇所が自然に封止されるようにできる。本技術においては、基板層の弾性変形による針の穿刺箇所の自然封止を、基板層の「自己封止性」と定義するものである。

弾性を有する基板層の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系エラストマーの他、アクリル系エラストマー、ウレタン系エラストマー、フッ素系エラストマー、スチレン系エラストマー、エポキシ系エラストマー、天然ゴムなどが挙げられる。

なお、本開示に係るマイクロチップ１ａの各ウェルに保持された物質を、光学的に分析する場合においては、各基板層の材質には、光透過性を有し自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。

次に、マイクロチップ１ａのウェルに収容された試薬Ｒについて説明する。図１に示すように、ウェル２内の各光検出側面６に、固相状の試薬Ｒを少なくとも１つ配置することが好ましい。光検出側面６に、２種以上の試薬Ｒを平面的に又は立体的に配置するのが好適である。このときの２種以上の試薬Ｒａ，Ｒｂには、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」とも称する」）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸鎖を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒａ，Ｒｂに含まれる成分とできる。

試薬Ｒａと試薬Ｒｂに含まれる核酸増幅反応に必要な成分は、各々異なる組成であっても良い。例えば、試薬Ｒａを、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液（第１の試薬液）とし、試薬Ｒｂを、酵素を含んでプライマーを含まない試薬液（第２の試薬液）とすることもできる。このようにプライマーが含まれる試薬Ｒａに酵素が含まれず、酵素が含まれる試薬Ｒｂにプライマーが含まれないことによって、試料溶液がウェル内に導入されるまでプライマーと酵素が混合されず、プライマーダイマーの発生が抑えられる。試薬Ｒａを、酵素を含んでプライマーを含まない試薬液（第２の試薬液）とし、試薬Ｒｂを、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液（第１の試薬液）としても良く、試薬Ｒａ，Ｒｂの組成は任意とできる。なお、試薬Ｒａ，Ｒｂの形状は限定されず、ウェル２内に収容可能な体積であれば、いずれの形状であっても良い。上述の係止部３（具体的には凸部３１又は凹部３２）に対応するような形状であるのが好適である。また、マイクロチップ１ａに設けられた複数のウェルに同一の組成の試薬Ｒａ，Ｒｂが収容されていても良く、異なる組成の試薬Ｒａ，Ｒｂが各ウェルに収容されていても良い。

前記固相状の試薬Ｒは、必要な試薬を含み、所望の形状に成形されたものをウェル２に収容されていればよい。当該試薬Ｒを製造するには、試薬液を乾燥して固化して成形するか、粉体の試薬原料から成形することが可能である。
乾燥方法としては、例えば、凍結乾燥が好適である。また、凍結乾燥には、予備凍結、一次乾燥（昇華凍結）、二次乾燥（結合水の除去）の各工程を含むことが好ましい。
予備凍結においては、凍結温度は共晶点（試薬液が凍結する温度）以下であれば良いが、酵素の失活の防止や試薬液を完全に凍結させる目的のために−４０℃程度で凍結させることが望ましい。一次乾燥においては、予備凍結工程で凍結させた試薬液を乾燥させる。この時、試薬液を共晶点以下で乾燥させることにより、乾燥途中での溶解が防止され、試薬液に含まれる水分を昇華させることが可能となる。一次乾燥における真空度は、例えば１００Ｐａ以下であることが望ましい。１００Ｐａにおける水の沸点は約−２０℃であるため、上述した試薬液の共晶点に近く、乾燥途中の試薬液の溶解が防止される。一次乾燥の真空度は、調製した試薬液の共晶点に応じて、適切な値を選択すれば良い。二次乾燥では、一次乾燥後の試薬液に含まれる成分に付いている分子状態の水を除去する。試薬液に含まれる成分の失活、変性等が起こらない程度の温度まで加熱し、試薬液の乾燥度を高めても良い。

また、凍結乾燥後に、溶解速度が低下しない程度に、打錠機等で圧力を加えることで押し固めても良い。
溶解性を維持しつつ成型するために、試薬液に、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤などを加えてもよい。賦形剤として、Ｄ−マンニトール、グリセリン、乳糖、デンプン、デキストリン、白糖、結晶セルロースが挙げられる。結合剤として、デンプン糊、ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。崩壊剤として、クロスポピドン、カルメロース、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、粉末セルロース、トウモロコシデンプン、キシリトール、潤沢剤として、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。これらの添加物は核酸増幅反応に影響を与えないものが適する。

また、固相状の試薬Ｒは、粉体にした試薬から打錠機等で成形してもよい。
試薬の中に賦形剤などを混ぜ合わせ、試薬を粉体にする。粉体にする手法としては、流動層造粒、高速撹拌造粒、乾式造粒、噴霧乾燥（スプレードライ）、凍結乾燥等が挙げられる。粉体の成型には打錠法やモールディング法が考えられる。
直接打錠法では、上述した異なる平面形状の鋳型に一定量入れ、最適な圧力を加えることで固形化させる。固形化後も溶解性を維持するために、上述の賦形剤、崩壊剤、糖類等を加えてもよい。
モールディング法においては、薬物を含む混合末を水または水／アルコールバインダーで造粒し、湿潤したまま低圧打錠する。その後、溶剤を蒸発させて細孔を多くする。

本開示のマイクロチップ１ａの使用について説明する。まず、試料を採取し調製した試料溶液を、導入部４から注入する。注入された試料溶液は流路５１〜５５の各流路に流入する。流路５５に接続されているウェル２５ａについて説明する。試料溶液は、流路５５から各分岐流路に流入し、さらにウェル２５ａ内にある各試薬Ｒに向かって流入する。そして、反応領域内で核酸増幅反応を行い、光検出可能な面（例えば、光検出側の面６等）で反応をリアルタイムに光検出にて測定する。
当該光検出可能な面は、反応領域２内で光検出可能な面であれば特に限定されない。例えば、係止部３と係止部３との間の箇所、反応領域２の端と係止部３との間の箇所及び光検出面側の面６等が挙げられる。
なお、１つのウェルに光検出する箇所が複数存在する場合には、統計学的な手法にてこれらの平均値を求めて表示することも可能であり、また別々に測定値を表示することも可能である。
このように、反応ウェル２内に試薬Ｒが凸部３１によって均等に配置され、係止されている一方で通過部７によってウェル内で液体が通過し混ざり易くなる。これにより、各試薬Ｒを均等に溶解することができる。さらに、反応の長時間化を防ぎ、再現性を高めることも可能となる。感度や特異性の低下を防ぐこともでき、また定量性を向上させることも可能である。よって、本開示によれば簡便かつ精度の高い分析が可能となる。
また、本開示では、光検出する箇所と試薬の配置位置が一対一でなくともよく、試薬が均一に溶解することで、チップ全体をイメージセンサのようなもので検出することやウェルの一部だけをＰＤにて検出することも可能である。

３．本開示の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図５は、本開示の第ニ実施形態に係るマイクロチップ１ｂの構成を説明する模式図である。図５Ａは上面模式図であり、図５Ｂは、図５ＡのＰ１−Ｐ２断面に対応する断面模式図である。図６〜９Ｂは、図５ＡのＭ−Ｍ断面に対応する断面模式図の例示である。上述した核酸増幅反応用マイクロチップと同一の構成についての説明については適宜省略する。

図中、符号１ｂで示す核酸増幅反応用マイクロチップには、核酸増幅反応の反応場となる反応領域２（ウェル２１ｂ〜２５ｂ）に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬Ｒの動きを抑制する係止部３が設けられている。当該反応領域２を、ウェル２１ａ〜２５ｂに示すように必要に応じて複数設けても良く、また複数設ける場合には、同一又は異なる反応領域２を配設しても良い。

さらに、反応領域２には、図５Ｂに示すように、光検出を行う側の面（光検出側面）６が複数存在することが好ましい。当該光検出側面６に光検出を行うための光が通過する。光検出側面６として、例えば、図６〜９Ｂの破線の間が挙げられる。当該破線は、反応領域の短手方向の幅と同じである。そして、当該光検出を行う面６に、前記固相状の試薬Ｒが配置されているのが好適である。なお、前記固相状の試薬Ｒは、２つ以上のものでもよい。

前記係止部３は、反応領域２内に形成され、固相状の試薬Ｒと嵌合することが好ましい。さらに、係止部３は、凸部３１又は凹部３２であることが好ましい。これにより、試薬の動きを抑制することが可能となる。
前記凸部３１は、固相状の試薬Ｒの内周部Ｒ１に嵌合するように形成されていればよく、固相状の試薬Ｒの内周部を未貫通の状態（図６Ｂ参照）又は貫通の状態（図７Ｂ参照）のいずれでもよい。この試薬Ｒの外周はウェルの短手方向の内面に接していてもよいが、ウェルの内面と試薬Ｒとの間に通過部７が設けられていることが、試薬溶液がウェル内に流入しやすいので、好ましい。
なお、固形状の試薬Ｒの形状は、凸部３１と嵌合するものであればよい。そして、Ｍ−Ｍ断面の試薬Ｒの全面積のうち、凸部３１の断面積が占める割合は、好ましくは１０〜６０％、より好ましくは２０〜５０％である。なお、試薬Ｒの全面積（Ｍ−Ｍ断面）とは、試薬の高さ（Ｚ）×試薬の幅（Ｙ）で求めることができる。

前記凹部３２は、固相状の試薬Ｒの外周部Ｒ２に嵌合するように形成されていればよく、固相状の試薬Ｒの外周部Ｒ２の一部を囲んだ状態（図８Ｂ参照）又は全部を囲んだ状態（図９Ｂ参照）のいずれでもよい。前記凹部３２はリング状であってもよく、これにより固相状の試薬Ｒを囲むことが可能となる。固相状の試薬Ｒの外周部Ｒ２の全部を囲む場合、前記凹部３２には、液体が通過可能な通過部７を設けることが好ましい。当該通過部７は本開示の第一実施形態で述べたもの同じ構成を採用すればよい。
なお、固形状の試薬Ｒの形状は、凹部３２と嵌合するものであればよい。そして、Ｍ−Ｍ断面の凹部３２の全面積のうち、試薬Ｒの断面積が占める割合は、好ましくは１０〜６０％、より好ましくは２０〜５０％である。なお、凹部３２の断面積（Ｍ−Ｍ断面）とは、ウェルの幅（Ｙ）×厚み６１（Ｚ）で求めることができる。図８及び９に示すような、破線部分間の距離がウェルの幅（Ｙ）である。

本開示のマイクロチップ１ｂの使用について説明する。試料溶液を、導入部４から注入する。注入された試料溶液は流路５１〜５５の各流路に流入する。流路５５に接続されているウェル２５ｂについて説明する。試料溶液は、流路５５から各分岐流路に流入し、さらにウェル２５ｂ内にある各試薬Ｒに向かって流入する。そして、核酸増幅反応を行い、各光検出側面６での反応をリアルタイムに光検出にて測定する。
反応ウェル２内に試薬Ｒが凹部３２によって均等に配置され、均一になるための拡散距離を短くすることができる。これにより、すみやかに各試薬Ｒを均等に溶解することができる。さらに、反応の長時間化を防ぎ、再現性を高めることも可能となる。感度や特異性の低下を防ぐこともでき、また定量性を向上させることも可能である。

４．本開示の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
本開示の第三実施形態に係る核酸増幅反応マイクロチップは、本開示の第一実施形態と第二実施形態とを組み合わせたものである。上述した本開示の核酸増幅反応用マイクロチップと同一の構成についての説明については適宜省略する。
本開示の係止部３が、反応領域２の内面に凸部３１及び／又は凹部３２として設けられている。前述のように、凸部３１，３１を短手方向及び／又は厚み方向で対向するように設けてもよい。また、前述のように、凸部３１を短手方向の中間に位置するように設けてもよい。また、前述の凸部３１及び凹部３２を固相状の試薬Ｒの内周部Ｒ１及び外周部Ｒ２に嵌合するように設けてもよい。
また、本開示の第三実施形態に係る核酸増幅反応マイクロチップに、異なる係止部３を有する反応領域２を複数設けても良い。

５．本開示の変形実施形態１に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１０は、本開示の変形実施形態１に係るマイクロチップ１ｄの構成を説明する模式図の一部であり、ウェル２Ｃの上面模式図である。ウェル２Ｃは、反応領域２内に光検出側面６の数よりも少ない固相状の試薬Ｒを配置するものである。図１０は、１つの固相状の試薬Ｒによって、反応領域２内の大部分を満たす状態を示す図である。
上述した核酸増幅反応用マイクロチップと同一の構成についての説明については適宜省略する。上述の構成を適宜組み込んでもよい。
１つの反応領域２のＸＹ方向の面積が１２．５〜４００ｍｍ^２であることが好ましく、また、厚み６１が０．５〜２．０ｍｍであることが好ましい。また、光学検出をおこなう面６のＸＹ方向の面積のうち、好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜９５％の占有面積を有する固相状の試薬Ｒが充填されていることが好適である。なお、反応領域２の容量の一例として、反応領域２の容量は、６．２５〜８００μＬであることが好ましく、２５〜２００μＬであることがより好ましい。

６．本開示の変形実施形態２に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１１は、本開示の変形実施形態２に係るマイクロチップ１ｅの構成を説明する模式図の一部であり、図１のＭ−Ｍ断面に対応する断面模式図の例示である。流路とウェルの位置関係やウェルの入り口部分の形状を調整し、また反応領域内の空間スペースを調整することによって、固相状の試薬が割れたときに反応ウェルから試薬が出ることを防ぐことが可能となる。これにより、１つのウェル内に存在する複数の試薬を均一に溶解させることが容易となる。また、上述した核酸増幅反応用マイクロチップと同一の構成についての説明については適宜省略する。上述の構成を適宜組み込んでもよい。
図１１Ａ及びＢには、デッドエンド型となっているウェルを有するマイクロチップの一部を示す。
図１１Ａに示すように、前記反応領域２は前記試料溶液が流入する流路５より低い位置にあることが好ましい。さらに、厚み方向にて前記固相状の試薬Ｒとウェル２との隙間が少ないことが好ましい。
また、図１１Ｂに示すように、前記反応領域２の前記流路５から流入する位置に、突起部があることが好ましい。これにより、流路から試料溶液がウェルに流入する入口部のみに遮りを設けることが好ましい。
図１１Ｃ及びＤには、流路５から流入させる試料溶液が短手正方向及び負方向から流入可能な貫通型となっているウェルを有するマイクロチップの一部を示す。
図１１Ｃに示すように前記反応領域２は前記試料溶液が流入する流路５より低い位置にあることが好ましい。さらに、厚み方向にて前記固相状の試薬Ｒとウェル２との隙間が少ないことが好ましい。
また、図１１Ｄに示すように、前記反応領域２の前記流路５から流入する位置に、突起部があることが好ましい。これにより、流路から試料溶液がウェルに流入する入口部のみに遮りを設けることが好ましい。

本技術は、以下の構成を採用することができる。
〔１〕 反応領域に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬の動きを抑制する係止部が設けられている、核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔２〕 前記係止部が、前記反応領域の内面に設けられている凸部及び／又は凹部である前記〔１〕記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔３〕 前記凸部は、液体が通過可能なものである前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔４〕 前記反応領域中に、光検出を行う側の面が複数存在する前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔５〕 前記反応領域に試料溶液が複数の流路から流入する前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔６〕 前記固相状の試薬が、前記光検出を行う面に配置されている前記〔１〕〜〔５〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔７〕 前記試料溶液が前記固相状の試薬に向かって流入する流路を有する前記〔１〕〜〔６〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔８〕 前記係止部が、前記反応領域の長手方向及び／又は厚み方向の動きを抑制するものである前記〔１〕〜〔７〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔９〕 前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が短手方向の中間に位置するものである前記〔１〕〜〔８〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１０〕 前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が対向するように設けられものである前記〔１〕〜〔９〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。

〔１１〕 前記凸部が、前記試薬の内周部に嵌合する前記〔１〕〜〔１０〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１２〕 前記凹部が、前記試薬の外周部に嵌合する前記〔１〕〜〔１１〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１３〕 前記試料溶液が前記固相状の試薬に向かって流入する流路を有する前記〔１〕〜〔１２〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１４〕 前記反応領域が、前記試料溶液が流入する流路より低い位置にある前記〔１〕〜〔１３〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１５〕 前記反応領域の前記流路から流入する位置に、突起部がある前記〔１〕〜〔１４〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１６〕 前記固相状の試薬が、光検出を行う面の面積の大部分を占めるように配置されている前記〔１〕〜〔１５〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１７〕 前記固相状の試薬が、凍結乾燥試薬である前記〔１〕〜〔１６〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１８〕 前記固相状の試薬が、打錠成形物である前記〔１〕〜〔１７〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
〔１９〕 前記固相状の試薬が、２つ以上のものである請前記〔１〕〜〔１８〕の何れか１項記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。

１ａ，１ｂ マイクロチップ；２，２ａ，２ｂウェル；３，３１，３２係止部；４ 導入部；５ 流路；６ 光検出側面；７ 通過部；Ｒ，Ｒａ，Ｒｂ 固相状の試薬；Ｒ１ 内周部；Ｒ２外周部

Claims (18)

1. 反応領域に、核酸増幅反応に必要な物質を含む固相状の試薬の動きを抑制する係止部が設けられている、核酸増幅反応用マイクロチップ。
2. 前記係止部が、前記反応領域の長手方向及び／又は厚み方向の動きを抑制するものである請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
3. 前記係止部が、前記反応領域の内面に設けられている凸部及び／又は凹部である請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
4. 前記反応領域中に、光検出を行う側の面が単数又は複数存在する請求項２又は３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
5. 前記反応領域に試料溶液が複数の流路から流入する請求項４記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
6. 前記固相状の試薬が、前記光検出を行う側の面に配置されている請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
7. 前記試料溶液が前記固相状の試薬に向かって流入する流路を有する請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
8. 前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が短手方向の中間に位置するものである請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
9. 前記凸部は、液体が通過可能なものである請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
10. 前記凸部が反応領域内に設けられ、当該凸部が対向するように設けられものである請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
11. 前記凸部が、前記試薬の内周部に嵌合する請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
12. 前記凹部が、前記試薬の外周部に嵌合する請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
13. 前記反応領域が、前記試料溶液が流入する流路より低い位置にある請求項３記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
14. 前記反応領域の前記流路から流入する位置に、突起部がある請求項５記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
15. 前記固相状の試薬が、光検出を行う側の面の面積の大部分を占めるように配置されている請求項６記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
16. 前記固相状の試薬が、凍結乾燥試薬である請求項６記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
17. 前記固相状の試薬が、打錠成形物である請求項６記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
18. 前記固相状の試薬が、２つ以上のものである請求項６記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
    

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