JP2014006450A

JP2014006450A - Super-resolution microscope and microscopic observation method

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Publication number: JP2014006450A
Application number: JP2012143499A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2014-01-16

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a super-resolution microscope capable of observing a super-resolution image in high definition with high reliability.SOLUTION: A super-resolution microscope for observing a sample S including a substance having at least two excited quantum states includes: a first optical system radiating activation light and non-activation light on the sample S; a second optical system for condensation of pump light and erasing light to the sample S by partially superposing spacially; a scanning section 36 for scanning the sample S by the erasing light and the pump light; a detector 55 for detecting light emission from the sample S; and an arithmetic control section 56 for controlling radiation of the activation light, non-activation light, pump light, and erasing light to the sample S and scanning by the scanning section 36 and generating the light emission image of the sample S on the basis of the detection signal from the detector 55. The arithmetic control section 56 generates a light emission image of the sample S on the basis of the detection signal from the detector 55 in respective scanning points when the erasing light and the pump light are scanned after radiating activation light and non-activation light sequentially.

Description

本発明は、超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法に関するものである。 The present invention relates to a super-resolution microscope and a microscope observation method.

近年、蛍光顕微鏡分野では、画像処理による超解像技術の開発が盛んに行われている。この超解像技術は、図７に示すような蛍光輝点の像、すなわち顕微鏡の光学系によるＰＳＦ（Point spread function；点像分布関数）を、光学理論で仮定される関数形として、理論的に又は標準試料を用いて予め測定する。そして、実際の観察試料から取得された画像を、測定されたＰＳＦに基づいてデコンボリューション処理して、最大強度の点を決定するものである。 In recent years, in the field of fluorescence microscopes, development of super-resolution technology by image processing has been actively performed. This super-resolution technique is theoretically based on a fluorescence bright spot image as shown in FIG. 7, that is, a PSF (Point Spread Function) by a microscope optical system as a functional form assumed in optical theory. Or in advance using a standard sample. Then, an image acquired from an actual observation sample is subjected to deconvolution processing based on the measured PSF, and the point of maximum intensity is determined.

この画像処理による超解像技術によると、蛍光輝点が重ならないスパースな蛍光画像の場合は、各輝点の像において決定した最大強度の点を計算機上で重ね合わせることにより、回折限界より精細な画像を再生することが可能となる。また、蛍光輝点が重なるようなスパースでない蛍光画像の場合は、例えば特許文献１に開示のように、蛍光物質の活性化と不活性化とを繰り返しながら、不活性化状態での蛍光画像を順次取得し、その順次の蛍光画像を同様にデコンボリューション処理して合成することにより、回折限界より精細な画像を再生することが可能となる。 According to this image processing super-resolution technique, in the case of a sparse fluorescent image where the fluorescent luminescent spots do not overlap, the point of maximum intensity determined in each luminescent spot image is superimposed on the computer so that it is finer than the diffraction limit. It is possible to reproduce a simple image. In addition, in the case of a non-sparse fluorescent image in which fluorescent luminescent spots overlap, for example, as disclosed in Patent Document 1, a fluorescent image in an inactivated state is obtained while repeating activation and deactivation of a fluorescent substance. By sequentially acquiring and synthesizing the sequential fluorescent images by deconvolution processing in the same manner, it becomes possible to reproduce an image finer than the diffraction limit.

特表２００８−５４２８２６号公報Special table 2008-542826 gazette

しかしながら、従来の画像処理による超解像技術は、光学理論で仮定される関数形としてＰＳＦを測定している。そのため、実際の観察試料に対して異なる結果を与えることになる。また、光学理論で仮定されるＰＳＦの関数形がガウス型で、先頭形状が急峻でないため、最大点の位置の決定が不正確となって、再生画像の信頼性が低下することが懸念される。 However, the conventional super-resolution technique based on image processing measures PSF as a functional form assumed in optical theory. Therefore, different results are given to the actual observation sample. Further, since the PSF function form assumed in optical theory is Gaussian and the leading shape is not steep, the determination of the position of the maximum point becomes inaccurate, and there is a concern that the reliability of the reproduced image is lowered. .

したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、高精細で高信頼性の超解像画像を観察可能な超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention made in view of such points is to provide a super-resolution microscope and a microscope observation method capable of observing a super-resolution image with high definition and high reliability.

上記目的を達成する第１の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる活性化光及び前記物質を不活性化させる不活性化光を前記試料に照射する第１光学系と、
前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光及び前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光を、空間的に一部重ね合わせて前記試料に集光する第２光学系と、
前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記活性化光、前記不活性化光、前記ポンプ光及び前記イレース光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記活性化光及び前記不活性化光を順次に照射させた後、前記イレース光及び前記ポンプ光を走査させた際に、各走査点において前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする。 The invention of the super-resolution microscope according to the first aspect to achieve the above object is a super-resolution microscope for observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states,
A first optical system for irradiating the sample with activation light for activating the substance and deactivation light for deactivating the substance;
Pump light that excites the substance from the activated state to the emission quantum state and emits light and erase light that suppresses light emission by transitioning the substance to the emission suppression quantum state are partially overlapped and collected in the sample. A second optical system that emits light;
A scanning unit that scans the sample by relatively displacing the erase light, the pump light, and the sample;
A detection unit for detecting light emission from the sample;
The activation light, the deactivation light, the pump light, the irradiation of the erase light to the sample, and the scanning by the scanning unit are controlled, and the light emission image of the sample based on the detection signal from the detection unit An arithmetic control unit for generating
The calculation control unit sequentially detects the detection light obtained from the detection unit at each scanning point when the erase light and the pump light are scanned after sequentially irradiating the activation light and the deactivation light. And generating a luminescence image of the sample based on the above.

第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、前記第２光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する。 The invention according to a second aspect is the super-resolution microscope according to the first aspect, wherein the second optical system has a beam shaping element that spatially modulates or polarizes the erase light in a beam plane. .

さらに、上記目的を達成する第３の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で集光させる照射光学系と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記走査部による前記試料の各走査点において、前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光を順次に照射させた際に前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする。 Furthermore, the invention of a super-resolution microscope according to a third aspect for achieving the above object is a super-resolution microscope for observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states,
Return light for activating the substance, erase light for transitioning the activated substance to a light emission suppression quantum state to suppress light emission, and a pump for exciting the substance in the activated state to light emission quantum state to emit light An irradiation optical system for concentrating light on the sample coaxially;
A scanning unit that scans the sample by relatively displacing the return light, the erase light, the pump light, and the sample;
A detection unit for detecting light emission from the sample;
An arithmetic control unit that controls irradiation of the return light, erase light, and pump light to the sample, and scanning by the scanning unit, and generates a light emission image of the sample based on a detection signal from the detection unit; Have
The arithmetic control unit is configured to detect the sample based on a detection signal obtained from the detection unit when the return light, the erase light, and the pump light are sequentially irradiated at each scanning point of the sample by the scanning unit. The luminescent image is generated.

第４の観点に係る発明は、第３の観点に係る超解像顕微鏡において、前記照射光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する。 According to a fourth aspect of the present invention, in the super-resolution microscope according to the third aspect, the irradiation optical system has a beam shaping element that spatially modulates or polarizes the erase light in a beam plane.

第５の観点に係る発明は、第１〜４のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記走査部は、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる。 The invention according to a fifth aspect is the super-resolution microscope according to any one of the first to fourth aspects, wherein the scanning unit irradiates the sample with sequential scanning points on the sample. Displace at a distance smaller than the diffraction limit.

第６の観点に係る発明は、第１〜５のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部で生成される発光画像を表示する表示部をさらに有する。 The invention according to a sixth aspect further includes a display unit for displaying a luminescent image generated by the arithmetic control unit in the super-resolution microscope according to any one of the first to fifth aspects.

第７の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部は、前記検出部から得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する。 The invention according to a seventh aspect is the super-resolution microscope according to any one of the first to sixth aspects, wherein the calculation control unit performs a deconvolution process on the intensity distribution of the detection signal obtained from the detection unit using a Lorentz function. Then, the light emission image is generated by calculating the spatial position and intensity of the maximum value of the intensity distribution.

第８の観点に係る発明は、第１〜７のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部は、さらに前記イレース光の尖頭値強度又は照射時間を調整する。 The invention according to an eighth aspect is the super-resolution microscope according to any one of the first to seventh aspects, wherein the calculation control unit further adjusts the peak value intensity or irradiation time of the erase light.

第９の観点に係る発明は、第１〜８のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記走査部は、前記試料に照射する光を走査するガルバノミラーを有する。 The invention according to a ninth aspect is the super-resolution microscope according to any one of the first to eighth aspects, wherein the scanning unit includes a galvanometer mirror that scans the light applied to the sample.

さらに、上記目的を達成する第１０の観点に係る顕微鏡観察法の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる活性化光を前記試料に照射する活性化ステップと、
前記活性化光が照射された領域に、活性化状態の前記物質が分子レベルで空間分離するように、前記物質を不活性化させる不活性化光を照射する不活性化ステップと、
前記不活性化光が照射された領域に、前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光と、前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光とを空間的に一部重ね合わせて集光して、当該領域内を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする。 Further, the invention of the microscope observation method according to the tenth aspect for achieving the above object is to observe a sample containing a substance having at least two excited quantum states with a microscope.
An activation step of irradiating the sample with an activation light that activates the substance;
An inactivation step of irradiating the activation light to inactivate the substance so that the activated substance is spatially separated at a molecular level in the region irradiated with the activation light;
Pump light that excites the substance from an activated state to an emission quantum state and emits light in a region irradiated with the inactivation light; and erase light that suppresses light emission by transitioning the substance to an emission suppression quantum state; Scanning step for condensing and condensing a part of the space, and scanning the area,
A detection step of detecting light emission from the sample by the scanning step;
A calculation control step for generating a light emission image of the sample based on each scanning position on the sample by the scanning step and a detection signal by the detection step at the scanning position;
It is characterized by having.

第１１の観点に係る発明は、第１０の観点に係る顕微鏡観察法において、前記活性化ステップ、前記不活性化ステップ、前記走査ステップ及び前記検出ステップを順次繰り返し行い、
前記演算制御ステップは、順次の前記検出ステップによる検出信号を合成して前記試料の発光画像を生成する。 The invention according to an eleventh aspect is the microscope observation method according to the tenth aspect, in which the activation step, the deactivation step, the scanning step, and the detection step are sequentially repeated,
The calculation control step generates a light emission image of the sample by synthesizing detection signals from the sequential detection steps.

さらに、上記目的を達成する第１２の観点に係る顕微鏡観察法の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で順次に照射する照射ステップと、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。 Furthermore, the invention of the microscope observation method according to the twelfth aspect for achieving the above object is to observe a sample containing a substance having at least two excited quantum states with a microscope.
Return light for activating the substance, erase light for transitioning the activated substance to a light emission suppression quantum state to suppress light emission, and a pump for exciting the substance in the activated state to light emission quantum state to emit light An irradiation step of sequentially irradiating the sample with light coaxially;
A scanning step of scanning the sample by relatively displacing the return light, the erase light, the pump light, and the sample;
A detection step of detecting light emission from the sample by the scanning step;
A calculation control step for generating a light emission image of the sample based on each scanning position on the sample by the scanning step and a detection signal by the detection step at the scanning position;
A microscope observation method characterized by comprising:

第１３の観点に係る発明は、第１０〜１２いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記走査ステップは、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる。 The invention according to a thirteenth aspect is the microscope observation method according to any one of the tenth to twelfth aspects, wherein the scanning step comprises diffracting the pump light applied to the sample at sequential scanning points on the sample. Displace at a distance less than the limit.

第１４の観点に係る発明は、第１０〜１３いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記演算制御ステップは、前記検出ステップから得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する。 The invention according to a fourteenth aspect is the microscope observation method according to any one of the tenth to thirteenth aspects, wherein the calculation control step performs a deconvolution process on the intensity distribution of the detection signal obtained from the detection step using a Lorentz function. The light emission image is generated by calculating the spatial position and intensity of the maximum value of the intensity distribution.

第１５の観点に係る発明は、第１０〜１４いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記試料は、凍結試料である。 The invention according to a fifteenth aspect is the microscope observation method according to any one of the tenth to fourteenth aspects, wherein the sample is a frozen sample.

第１６の観点に係る発明は、第１０〜１５いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記試料に照射される前記イレース光は、ラゲールガウシアンビームである。 The invention according to a sixteenth aspect is the microscope observation method according to any one of the tenth to fifteenth aspects, wherein the erase light applied to the sample is a Laguerre Gaussian beam.

本発明によれば、高精細で高信頼性の超解像画像を観察可能な超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a super-resolution microscope and a microscope observation method capable of observing a super-resolution image with high definition and high reliability.

第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of the optical system of the super-resolution microscope which concerns on 1st Embodiment. 図１の位相板の３つの例を示す図である。FIG. 3 is a diagram illustrating three examples of the phase plate of FIG. 1. 図１の超解像顕微鏡による顕微鏡観察法を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the microscope observation method by the super-resolution microscope of FIG. 図１の超解像顕微鏡のＰＳＦを従来の顕微鏡のＰＳＦと比較して示す図である。It is a figure which compares the PSF of the super-resolution microscope of FIG. 1 with the PSF of the conventional microscope. 第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of the optical system of the super-resolution microscope which concerns on 2nd Embodiment. 図５の超解像顕微鏡による顕微鏡観察法を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the microscope observation method by the super-resolution microscope of FIG. 従来の顕微鏡のＰＳＦを示す図である。It is a figure which shows PSF of the conventional microscope.

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.

（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。本実施の形態では、例えば遺伝子導入により蛍光タンパク質のドロンパ（Doronpa）が発現した試料Ｓを超解像で観察する。なお、試料Ｓは、分子等が移動しないように凍結されていてもよい。 (First embodiment)
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of an optical system of a super-resolution microscope according to the first embodiment of the present invention. In the present embodiment, for example, the sample S in which the fluorescent protein Doronpa is expressed by gene introduction is observed by super-resolution. The sample S may be frozen so that molecules and the like do not move.

ドロンパは、蛍光発光可能な状態（活性化状態）で、波長が約５０３ｎｍの光が照射されると緑色の蛍光を発する。しかし、波長４８８ｎｍの光が照射されると、照射総量に応じて、試料Ｓ中のドロンパが不活性化される確率が高くなり、極限の場合、活性化状態で残存するドロンパが１分子レベルで空間分離される。また、ドロンパは、波長４０５ｎｍの光が照射されると、活性化状態に復帰する。 The dronepa emits green fluorescence when irradiated with light having a wavelength of about 503 nm in a state where fluorescence can be emitted (activated state). However, when light with a wavelength of 488 nm is irradiated, there is a high probability that the drompa in the sample S will be inactivated according to the total irradiation amount. Spatial separation. Further, the dromper returns to the activated state when irradiated with light having a wavelength of 405 nm.

図１に示す超解像顕微鏡は、上記のドロンパの性質を利用して試料Ｓを超解像観察するもので、第１の光源１１〜第４の光源１４を備える。第１の光源１１は、試料Ｓの活性化光を得るための第１の光を射出し、第２の光源１２は、試料Ｓの不活性化光を得るための第２の光を射出する。第３の光源１３は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を励起するポンプ光を得るための第３の光を射出し、第４の光源１４は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を抑制するイレース光を得るための第４の光を射出する。 The super-resolution microscope shown in FIG. 1 is for super-resolution observation of the sample S using the properties of the above-described Dronpa, and includes a first light source 11 to a fourth light source 14. The first light source 11 emits first light for obtaining the activation light of the sample S, and the second light source 12 emits second light for obtaining the inactivation light of the sample S. . The third light source 13 emits third light for obtaining pump light for exciting fluorescence emission when observing the sample S with super-resolution, and the fourth light source 14 super-resolves the sample S. When observing with an image, fourth light for emitting erase light that suppresses fluorescence emission is emitted.

第１の光源１１〜第４の光源１４から射出される第１の光〜第４の光の光路は、ビームコンバイナ２１で同軸に合わされた後、ダイクロイックミラー２２により、第１の光及び第２の光の光路と、第３の光及び第４の光の光路とに分岐される。 The optical paths of the first light to the fourth light emitted from the first light source 11 to the fourth light source 14 are coaxially matched by the beam combiner 21, and then the first light and the second light are reflected by the dichroic mirror 22. And the third light beam and the fourth light beam are branched.

ダイクロイックミラー２２で分岐される第１の光及び第２の光は、反射ミラー２３を経てＡＯＴＦ（Acoust-Optic Tunable Filters：音響光学波長可変フィルタ）２４に入射される。これにより、それぞれ活性化光及び不活性化光が得られる。活性化光及び不活性化光は、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７及び二次元ガルバノミラー２８を経て、ダイクロイックミラー２９に入射される。 The first light and the second light branched by the dichroic mirror 22 are incident on an AOTF (Acoust-Optic Tunable Filters) 24 through a reflection mirror 23. Thereby, activation light and deactivation light are obtained, respectively. The activation light and the deactivation light are incident on the dichroic mirror 29 through the broadband fiber 25, the lens 26, the defocus lens 27, and the two-dimensional galvanometer mirror 28.

また、ダイクロイックミラー２２で分岐される第３の光及び第４の光は、ＡＯＴＦ３１に入射される。これにより、それぞれポンプ光及びイレース光が得られる。ポンプ光及びイレース光は、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、ビーム整形素子を構成する位相板３４、ダイクロイックミラー３５及び走査部を構成する二次元ガルバノミラー３６を経て、ダイクロイックミラー２９に入射される。 The third light and the fourth light branched by the dichroic mirror 22 are incident on the AOTF 31. Thereby, pump light and erase light are obtained, respectively. Pump light and erase light are incident on a dichroic mirror 29 via a broadband fiber 32, a lens 33, a phase plate 34 constituting a beam shaping element, a dichroic mirror 35, and a two-dimensional galvanometer mirror 36 constituting a scanning unit.

位相板３４は、例えば、図２（ａ）〜（ｃ）に示す構成のものが使用可能である。図２（ａ）に示す位相板３４は、イレース光の位相を光軸周りに２πで周回させるように構成されたものである。 As the phase plate 34, for example, the one having the configuration shown in FIGS. 2A to 2C can be used. The phase plate 34 shown in FIG. 2A is configured to rotate the phase of the erase light around the optical axis by 2π.

図２（ｂ）に示す位相板３４は、同心円状に分割された輪帯状の中央部領域３４ａと周辺部領域３４ｂとを有し、中央部領域３４ａに光学多層膜がコートされた輪帯位相板である。光学多層膜は、例えばＴｉＯ_２とＳｉＯ_２とを交互に４層程度積層して構成される。中央部領域３４ａは、光学多層膜の屈折率の波長分散性により、イレース光及びポンプ光の波長に対して異なる実効屈折率を有し、中央部領域３４ａを通過したイレース光のみを位相反転し、ポンプ光については反射、又は位相を反転させることなく透過させるように設計されている。なお、周辺部領域３４ｂは、ポンプ光及びイレース光を位相変調することなく透過させるように構成される。 The phase plate 34 shown in FIG. 2 (b) has an annular zone region 34a and a peripheral region 34b that are concentrically divided, and the annular zone phase 34a is coated with an optical multilayer film. It is a board. The optical multilayer film is formed by, for example, laminating about 4 layers of TiO ₂ and SiO ₂ alternately. The central region 34a has different effective refractive indexes with respect to the wavelengths of the erase light and the pump light due to the wavelength dispersion of the refractive index of the optical multilayer film, and phase-inverts only the erase light that has passed through the central region 34a. The pump light is designed to be transmitted without reflection or phase inversion. The peripheral region 34b is configured to transmit pump light and erase light without phase modulation.

図２（ｃ）に示す位相板３４は、図２（ｂ）と同様に同心円状に分割された輪帯状の中央部領域３４ａと周辺部領域３４ｂとを有する輪帯位相板である。中央部領域３４ａ及び周辺部領域３４ｂは、それぞれイレース光の位相を光軸の周りで２π変化させるが、位相シフトの回転方向が光軸に関して互いに反対方向となるように構成される。 The phase plate 34 shown in FIG. 2C is a zonal phase plate having a zonal central region 34a and a peripheral region 34b that are divided concentrically as in FIG. 2B. The central region 34a and the peripheral region 34b are configured such that the phase of the erase light is changed by 2π around the optical axis, but the rotation direction of the phase shift is opposite to the optical axis.

図１において、ダイクロイックミラー２９は、活性化光及び不活性化光の射出光路と、ポンプ光及びイレース光の射出光路とを一致させる。ダイクロイックミラー２９から射出される光は、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により、試料ステージ４５に載置された試料Ｓに照射される。 In FIG. 1, the dichroic mirror 29 matches the emission light paths of the activation light and the deactivation light with the emission light paths of the pump light and the erase light. The light emitted from the dichroic mirror 29 passes through the pupil projection lenses 41 and 42 and the reflection mirror 43, and is irradiated onto the sample S placed on the sample stage 45 by the microscope objective lens 44.

したがって、図１において、ＡＯＴＦ２４、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７、二次元ガルバノミラー２８、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２、反射ミラー４３及び顕微鏡対物レンズ４４は、第１光学系を構成する。また、ＡＯＴＦ３１、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、位相板３４、ダイクロイックミラー３５、二次元ガルバノミラー３６、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２、反射ミラー４３及び顕微鏡対物レンズ４４は、第２光学系を構成する。 Accordingly, in FIG. 1, the AOTF 24, the broadband fiber 25, the lens 26, the defocus lens 27, the two-dimensional galvanometer mirror 28, the dichroic mirror 29, the pupil projection lenses 41 and 42, the reflection mirror 43, and the microscope objective lens 44 are the first optical elements. Configure the system. The AOTF 31, the broadband fiber 32, the lens 33, the phase plate 34, the dichroic mirror 35, the two-dimensional galvano mirror 36, the dichroic mirror 29, the pupil projection lenses 41 and 42, the reflection mirror 43, and the microscope objective lens 44 are the second optical system. Configure.

一方、試料Ｓから発生する蛍光は、顕微鏡対物レンズ４４により集光され、ポンプ光及びイレース光の光路を逆に辿ってダイクロイックミラー３５により、ポンプ光及びイレース光の光路から分岐される。そして、ダイクロイックミラー３５から射出される蛍光は、レンズ５１、共焦点ピンホール５２、回折格子５３及びピンホール５４を経て、検出部を構成する光電子増倍管（ＰＭＴ）５５で検出される。光電子増倍管５５の検出信号は、演算制御部５６に入力される。 On the other hand, the fluorescence generated from the sample S is collected by the microscope objective lens 44 and traces the optical paths of the pump light and erase light in reverse, and is branched from the optical paths of the pump light and erase light by the dichroic mirror 35. The fluorescence emitted from the dichroic mirror 35 is detected by a photomultiplier tube (PMT) 55 that constitutes a detection unit, through a lens 51, a confocal pinhole 52, a diffraction grating 53, and a pinhole 54. A detection signal of the photomultiplier tube 55 is input to the arithmetic control unit 56.

演算制御部５６は、試料Ｓに対する活性化光、不活性化光、ポンプ光及びイレース光の照射、及び、二次元ガルバノミラー２８，３６の動作を制御するとともに、光電子増倍管５５からの検出信号に基づいて試料Ｓの蛍光画像を生成して表示部５７に表示する。 The arithmetic control unit 56 controls the irradiation of the activation light, the deactivation light, the pump light and the erase light on the sample S, and the operation of the two-dimensional galvanometer mirrors 28 and 36, and the detection from the photomultiplier tube 55. A fluorescent image of the sample S is generated based on the signal and displayed on the display unit 57.

次に、本実施の形態に係る超解像顕微鏡による顕微鏡観察法について、図３（ａ）〜（ｃ）に示す模式図を参照しながら説明する。 Next, a microscopic observation method using the super-resolution microscope according to the present embodiment will be described with reference to schematic diagrams shown in FIGS.

本実施の形態に係る顕微鏡観察法は、試料Ｓの観察領域に対して、デフォーカス状態での活性化光の照射と、デフォーカス状態での不活性化光の照射と、フォーカス状態での超解像用のポンプ光及びイレース光による走査及び蛍光検出とを、順次繰り返し行うことにより、試料Ｓを超解像で観察する。そのため、先ず、演算制御部５６は、第１の光源１１から第１の光を射出させて、第１の光を、ビームコンバイナ２１、ダイクロイックミラー２２及び反射ミラー２３を経てＡＯＴＦ２４に入射させる。そして、ＡＯＴＦ２４から波長４０５ｎｍの活性化光を射出させる。 In the microscope observation method according to the present embodiment, irradiation of activation light in the defocused state, irradiation of inactivation light in the defocused state, and superposition in the focused state are performed on the observation region of the sample S. The sample S is observed with super-resolution by sequentially repeating scanning with a resolution pump light and erase light and fluorescence detection. Therefore, first, the arithmetic control unit 56 emits the first light from the first light source 11 and causes the first light to enter the AOTF 24 through the beam combiner 21, the dichroic mirror 22, and the reflection mirror 23. Then, activation light having a wavelength of 405 nm is emitted from the AOTF 24.

ＡＯＴＦ２４から射出される活性化光は、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７、二次元ガルバノミラー２８、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓに照射させる。これにより、試料Ｓの観察領域を、図３（ａ）に示すようにデフォーカス状態で照明して、当該観察領域に位置するドロンパを確実に蛍光発光可能な活性化状態に初期化する。なお、この場合の活性化光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。また、活性化光による試料Ｓの観察領域は、二次元ガルバノミラー２８により決定される。 The activation light emitted from the AOTF 24 passes through the broadband fiber 25, the lens 26, the defocus lens 27, the two-dimensional galvano mirror 28, the dichroic mirror 29, the pupil projection lenses 41 and 42, and the reflection mirror 43, and then by the microscope objective lens 44. The sample S is irradiated. As a result, the observation region of the sample S is illuminated in a defocused state as shown in FIG. 3A, and the droneper located in the observation region is initialized to an activated state that can reliably emit fluorescence. In this case, the peak intensity or the irradiation time of the activation light is appropriately set by the calculation control unit 56. The observation area of the sample S by the activation light is determined by the two-dimensional galvanometer mirror 28.

次に、演算制御部５６は、第２の光源１２から第２の光を射出させて、第２の光を第１の光と同一光路に入射させる。そして、ＡＯＴＦ２４から波長４８８ｎｍの不活性化光を射出させて、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓにデフォーカス状態で不活性化光を照射させる。これにより、図３（ａ）において活性化光が照射された観察領域を、図３（ｂ）に示すように不活性化光により照明して、当該観察領域に蛍光発光可能なドロンパが１分子レベルで空間分離して残存するように不活性化させる。つまり、観察領域内の活性化状態のドロンパを間引きしてスパースな状態とする。なお、この場合の不活性化光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。 Next, the arithmetic control unit 56 emits the second light from the second light source 12 and causes the second light to enter the same optical path as the first light. Then, inactivation light having a wavelength of 488 nm is emitted from the AOTF 24, and the sample objective S is irradiated with the inactivation light in a defocused state by the microscope objective lens 44. As a result, the observation region irradiated with the activation light in FIG. 3 (a) is illuminated with the inactivation light as shown in FIG. 3 (b), so that one molecule of fluorescent light can be emitted in the observation region. Inactivate them so that they remain spatially separated at the level. That is, the activated droneper in the observation region is thinned out to obtain a sparse state. In this case, the peak intensity or irradiation time of the inactivating light is appropriately set by the calculation control unit 56.

次に、演算制御部５６は、第３の光源１３及び第４の光源１４からそれぞれ第３の光及び第４の光を射出させて、第３の光及び第４の光をビームコンバイナ２１及びダイクロイックミラー２２を経てＡＯＴＦ３１に入射させる。そして、ＡＯＴＦ３１から波長５０３ｎｍのポンプ光及び波長６５３ｎｍのイレース光をそれぞれ射出させる。 Next, the arithmetic control unit 56 emits the third light and the fourth light from the third light source 13 and the fourth light source 14, respectively, and outputs the third light and the fourth light to the beam combiner 21 and The light enters the AOTF 31 through the dichroic mirror 22. Then, pump light having a wavelength of 503 nm and erase light having a wavelength of 653 nm are respectively emitted from the AOTF 31.

ＡＯＴＦ３１から射出されるポンプ光及びイレース光は、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、位相板３４、ダイクロイックミラー３５、二次元ガルバノミラー３６、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓに照射させる。これにより、図３（ｃ）に示すように、フォーカス状態（回折限界）のポンプ光及びイレース光によって、観察領域を二次元に走査する。なお、ポンプ光及びイレース光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。また、二次元ガルバノミラー３６による走査は、少なくとも通常の蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を与える必要があるため、試料Ｓ上の順次の走査点が、試料Ｓに照射されるポンプ光の回折限界よりも小さい距離とする。 The pump light and erase light emitted from the AOTF 31 pass through the broadband fiber 32, the lens 33, the phase plate 34, the dichroic mirror 35, the two-dimensional galvano mirror 36, the dichroic mirror 29, the pupil projection lenses 41 and 42, and the reflection mirror 43. The sample S is irradiated with the microscope objective lens 44. As a result, as shown in FIG. 3C, the observation region is scanned two-dimensionally with the pump light and the erase light in the focus state (diffraction limit). Note that the peak intensity or irradiation time of the pump light and erase light is appropriately set by the calculation control unit 56. Further, since the scanning by the two-dimensional galvanometer mirror 36 needs to provide at least a higher spatial resolution than a normal fluorescence microscope, sequential scanning points on the sample S are more than the diffraction limit of the pump light irradiated on the sample S. Is also a small distance.

ここで、イレース光は、光軸上の強度が最小となる中空状のビームとして試料Ｓに照射される。したがって、イレース光の中空領域にドロンパが存在すると、ドロンパはポンプ光により活性化状態から発光量子状態に励起されて蛍光を発する。また、イレース光の照射領域に活性化状態のドロンパが存在すると、当該ドロンパは発光抑制量子状態に遷移されて発光が抑制される。そして、試料Ｓから発した蛍光は、上述したように光電子増倍管５５で検出されて演算制御部５６に入力される。これにより、試料Ｓを染色するドロンパを、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える１分子レベルの超解像で検出することが可能となる。なお、二重共鳴吸収過程を用いた超解像原理については、例えば、特開２００１−１００１０２号公報等に開示されて周知であるので、ここでは詳細な説明は省略する。演算制御部５６は、光電子増倍管５５からの入力信号を試料Ｓのポンプ光の照射位置に対応する出力として記憶する。 Here, the erase light is applied to the sample S as a hollow beam having a minimum intensity on the optical axis. Therefore, if a drompa exists in the hollow area of the erase light, the drompa is excited from the activated state to the light-emitting quantum state by the pump light and emits fluorescence. In addition, when an activated dronpa exists in the erase light irradiation region, the dronpa is transitioned to a light emission suppression quantum state and light emission is suppressed. Then, the fluorescence emitted from the sample S is detected by the photomultiplier tube 55 as described above and input to the arithmetic control unit 56. As a result, it is possible to detect the Dronpa staining the sample S with a super-resolution at a single molecule level exceeding the diffraction limit using a double resonance absorption process. Note that the super-resolution principle using the double resonance absorption process is well known as disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-100102, and the detailed description thereof is omitted here. The arithmetic control unit 56 stores the input signal from the photomultiplier tube 55 as an output corresponding to the irradiation position of the pump light of the sample S.

以後、演算制御部５６は、図３（ａ）〜図３（ｃ）の一連のプロセルを所定回数繰り返す。そして、所定回数の一連のプロセルが終了すると、演算制御部５６は、所定回数の蛍光出力を合成して観察領域の蛍光強度分布を得、該蛍光強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、蛍光強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して蛍光画像（発光画像）を生成し、該蛍光画像を表示部５７に表示させる。 Thereafter, the arithmetic control unit 56 repeats a series of processes shown in FIGS. 3A to 3C a predetermined number of times. Then, when the predetermined number of series of processes are completed, the calculation control unit 56 synthesizes the predetermined number of fluorescence outputs to obtain the fluorescence intensity distribution of the observation region, deconvolves the fluorescence intensity distribution with the Lorentz function, The fluorescence position (luminescence image) is generated by calculating the spatial position and intensity of the maximum value of the fluorescence intensity distribution, and the fluorescence image is displayed on the display unit 57.

以上のように、本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、試料Ｓの観察領域に対して、デフォーカス状態での活性化光の照射と、デフォーカス状態での不活性化光の照射と、フォーカス状態での超解像用のポンプ光及びイレース光による走査及び蛍光検出とを、順次繰り返し行う。ここで、イレース光は、位相板３４により光軸上の強度が最小となるラゲールガウシアンビームとして試料Ｓに照射されるので、この場合のＰＳＦは、例えば図４に実線で示すように幅の狭い急峻なローレンス関数となる。なお、図４には、比較のために図７に示したＰＳＦを破線で示している。したがって、光軸上すなわち観測点における分子の位置同定精度が極めて高くなるので、高精細で高信頼性の超解像画像を観察することが可能となる。 As described above, the super-resolution microscope according to the present embodiment irradiates the observation region of the sample S with the activation light in the defocused state and the inactivation light in the defocused state. Then, scanning and fluorescence detection with super-resolution pump light and erase light in the focus state are sequentially repeated. Here, since the erase light is irradiated onto the sample S as a Laguerre Gaussian beam having a minimum intensity on the optical axis by the phase plate 34, the PSF in this case has a narrow width as shown by a solid line in FIG. It becomes a steep Lawrence function. In FIG. 4, for comparison, the PSF shown in FIG. 7 is indicated by a broken line. Therefore, since the molecular position identification accuracy on the optical axis, that is, at the observation point is extremely high, it is possible to observe a high-resolution and high-reliability super-resolution image.

特に、図３（ｂ）又は図３（ｃ）に示した位相板３４を用いた場合、イレース光については、光の干渉により、焦点近傍で光が当たらない微小な立体空間（ダークホール）を生成することができる。また、ポンプ光については、光の位相面が変化しないためにダークホールの中心に集光させることができる。したがって、ダークホールの生成により、光軸方向にも超解像機能を発現でき、これにより３次元的な画像観察も可能となる。 In particular, when the phase plate 34 shown in FIG. 3 (b) or FIG. 3 (c) is used, the erase light has a minute three-dimensional space (dark hole) that is not exposed to light in the vicinity of the focal point due to light interference. Can be generated. Further, the pump light can be condensed at the center of the dark hole because the phase plane of the light does not change. Therefore, by generating dark holes, a super-resolution function can be developed also in the optical axis direction, thereby enabling three-dimensional image observation.

（第２実施の形態）
図５は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。本実施の形態では、例えばジアリールエテンにルシファーイエローを化学修飾したフォトクロミック分子によって染色された試料Ｓを超解像で観察する。試料Ｓは、第１実施の形態の場合と同様に、凍結されていてもよい。 (Second Embodiment)
FIG. 5 is a diagram showing the configuration of the optical system of the super-resolution microscope according to the second embodiment of the present invention. In the present embodiment, for example, the sample S stained with a photochromic molecule obtained by chemically modifying lucifer yellow on diarylethene is observed with super-resolution. The sample S may be frozen as in the case of the first embodiment.

フォトクロミック分子は、蛍光発光部をルシファーイエローが担い、ジアリールエテンがルシファーイエローの蛍光応答を支配する。より具体的には、ジアリールエテンの６員環の化学結合基を開閉することで、ルシファーイエローの発光を制御する。そして、波長５３０ｎｍ前後の光（復帰光）が照射されると、６員環の化学結合基が開き、ルシファーイエローが蛍光発光可能な状態（活性化状態）に変化する。このとき、波長４５０ｎｍ前後の光（ポンプ光）が照射されると、波長５２０ｎｍの強い蛍光を発する。しかし、紫外領域の光（イレース光）が照射されると、６員環の化学結合基が閉じて、ルシファーイエローが無蛍光状態（不活性化状態）になる。この変化は、蛍光共鳴エネルギー移動に基づくものである。 In the photochromic molecule, lucifer yellow is responsible for the fluorescence emission part, and diarylethene dominates the fluorescence response of lucifer yellow. More specifically, the emission of lucifer yellow is controlled by opening and closing the chemical bonding group of the 6-membered ring of diarylethene. When light having a wavelength of around 530 nm (return light) is irradiated, the 6-membered ring chemical bond group is opened, and the lucifer yellow changes to a state capable of fluorescence emission (activated state). At this time, when light (pump light) having a wavelength of around 450 nm is irradiated, strong fluorescence with a wavelength of 520 nm is emitted. However, when irradiated with light in the ultraviolet region (erase light), the 6-membered ring chemical bonding group closes, and Lucifer Yellow becomes non-fluorescent (inactivated). This change is based on fluorescence resonance energy transfer.

図５に示す超解像顕微鏡は、上記のフォトクロミック分子の性質を利用して試料Ｓを超解像観察するもので、第１の光源１０１〜第３の光源１０３を備える。第１の光源１０１は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を抑制するイレース光を得るための第１の光を射出する。第２の光源１０２は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を励起するポンプ光を得るための第２の光を射出する。第３の光源１０３は、試料Ｓの復帰光を得るための第３の光を射出する。 The super-resolution microscope shown in FIG. 5 performs super-resolution observation of the sample S using the properties of the above-described photochromic molecule, and includes a first light source 101 to a third light source 103. The first light source 101 emits first light for obtaining erase light that suppresses fluorescence emission when the sample S is observed with super-resolution. The second light source 102 emits second light for obtaining pump light that excites fluorescence emission when the sample S is observed with super-resolution. The third light source 103 emits third light for obtaining return light of the sample S.

例えば、第１の光源１０１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザからなり、その３倍波（３５５ｎｍ）がイレース光として使用される。第２の光源１０２は、波長４４５ｎｍの半導体レーザからなり、その基本波がポンプ光として使用される。第３の光源１０３は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザからなり、その２倍波（５３２ｎｍ）が復帰光として使用される。これらのレーザは、小型でありながら１００ｍＷ以上の出力があるので、分子の蛍光制御及び読出しには十分である。 For example, the first light source 101 is composed of an Nd: YAG laser, and its third harmonic (355 nm) is used as erase light. The second light source 102 is a semiconductor laser having a wavelength of 445 nm, and the fundamental wave is used as pump light. The third light source 103 is composed of an Nd: YAG laser, and its second harmonic (532 nm) is used as return light. Although these lasers are small and have an output of 100 mW or more, they are sufficient for molecular fluorescence control and readout.

本実施の形態に係る超解像顕微鏡では、復帰光、イレース光、ポンプ光を試料Ｓに時系列で照射する。そのため、第１の光源１０１〜第３の光源１０３の射出光路には、それぞれＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator：音響光学素子）１１１〜１１３が配置されて、射出光がナノ秒単位のレベルでパルス化される。 In the super-resolution microscope according to this embodiment, the sample S is irradiated with return light, erase light, and pump light in time series. Therefore, AOMs (Acousto-Optic Modulators) 111 to 113 are arranged in the emission light paths of the first light source 101 to the third light source 103, respectively, and the emitted light is pulsed at the level of nanoseconds. Is done.

第１の光源１０１及び第２の光源１０２から、それぞれＡＯＭ１１１及び１１２を経て射出されるイレース光及びポンプ光の光路は、ビームコンバイナ１２１により同軸に合わされる。ビームコンバイナ１２１から射出される光は、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４及びビーム整形素子を構成する位相板１２５を経てビームコンバイナ１２６に入射される。位相板１２５は、例えば図２（ａ）〜（ｃ）に示した構成のものが使用可能である。 The optical paths of the erase light and the pump light emitted from the first light source 101 and the second light source 102 through the AOMs 111 and 112, respectively, are coaxially matched by the beam combiner 121. The light emitted from the beam combiner 121 is incident on the beam combiner 126 through the collector lens 122, the single mode fiber 123, the collimator lens 124, and the phase plate 125 constituting the beam shaping element. For example, the phase plate 125 having the configuration shown in FIGS. 2A to 2C can be used.

また、第３の光源１０３からＡＯＭ１１３を経て射出される復帰光は、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８及び反射ミラー１２９を経てビームコンバイナ１２６に入射される。ビームコンバイナ１２６は、イレース光、ポンプ光及び復帰光の光路を一致させる。ビームコンバイナ１２６から射出される光は、ハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、走査部を構成する３次元試料ステージ１３２に載置された試料Ｓに照射される。 The return light emitted from the third light source 103 via the AOM 113 is incident on the beam combiner 126 via the diaphragm 127, the defocus lens 128, and the reflection mirror 129. The beam combiner 126 matches the optical paths of the erase light, pump light, and return light. The light emitted from the beam combiner 126 is irradiated to the sample S placed on the three-dimensional sample stage 132 constituting the scanning unit by the microscope objective lens 131 through the half mirror 130.

したがって、図５において、ＡＯＭ１１１、ＡＯＭ１１２、ビームコンバイナ１２１、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４、位相板１２５、ビームコンバイナ１２６、ＯＭ１１３、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８、反射ミラー１２９、ハーフミラー１３０、顕微鏡対物レンズ１３１は、照射光学系を構成する。 Therefore, in FIG. 5, AOM 111, AOM 112, beam combiner 121, collector lens 122, single mode fiber 123, collimator lens 124, phase plate 125, beam combiner 126, OM 113, aperture 127, defocus lens 128, reflection mirror 129, half The mirror 130 and the microscope objective lens 131 constitute an irradiation optical system.

一方、試料Ｓから発生する蛍光は、顕微鏡対物レンズ１３１により集光され、照明光の光路を逆に辿ってハーフミラー１３０により照明光の光路から分岐される。そして、ハーフミラー１３０から射出される蛍光は、ブロックフィルタ１３３、コレクターレンズ１３４及び共焦点ピンホール１３５を経て、検出部を構成する光電子増倍管１３６で検出される。光電子増倍管１３６の検出信号は、演算制御部１３７に入力される。 On the other hand, the fluorescence generated from the sample S is collected by the microscope objective lens 131, traces the optical path of the illumination light in reverse, and is branched from the optical path of the illumination light by the half mirror 130. Then, the fluorescence emitted from the half mirror 130 is detected by the photomultiplier tube 136 constituting the detection unit via the block filter 133, the collector lens 134 and the confocal pinhole 135. A detection signal of the photomultiplier tube 136 is input to the arithmetic control unit 137.

演算制御部１３７は、試料Ｓに対する復帰光、ポンプ光及びイレース光の照射、及び、３次元試料ステージ１３２の動作を制御するとともに、光電子増倍管１３６からの検出信号に基づいて試料Ｓの蛍光画像を生成して表示部１３８に表示する。 The arithmetic control unit 137 controls the return light, pump light and erase light irradiation on the sample S, and the operation of the three-dimensional sample stage 132, and the fluorescence of the sample S based on the detection signal from the photomultiplier tube 136. An image is generated and displayed on the display unit 138.

図５において、特に、イレース光及びポンプ光に関しては、色収差の無い顕微鏡対物レンズ１３１で試料Ｓに集光させれば、完全にイレース光の中心にポンプ光が集光する。なぜなら、これら２色の光りは、完全点光源と見なせる同一のシングルモードファイバから放出されるからである。 In FIG. 5, in particular, regarding the erase light and the pump light, if the microscope objective lens 131 having no chromatic aberration is condensed on the sample S, the pump light is completely condensed at the center of the erase light. This is because these two colors of light are emitted from the same single mode fiber that can be regarded as a perfect point light source.

一方、復帰光の光軸は、イレース光及びポンプ光の光軸と一致しており、試料Ｓにおける照明領域は、イレース光及びポンプ光の集光スポットサイズより広い。なぜなら、試料Ｓの照射領域に存在する全分子を、活性化状態に確実に初期化する必要があるからである。本実施の形態に係る超解像顕微鏡では、絞り１２７により、復帰光のビーム径をイレース光及びポンプ光のビーム径より細くしているとともに、復帰光の光路にデフォーカスレンズ１２８を挿入して、復帰光の集光スポットサイズを調整している。なお、復帰光の集光スポットサイズは、絞り１２７及びデフォーカスレンズ１２８の双方を用いて調整する場合に限らず、いずれか一方のみで調整するようにしてもよい。 On the other hand, the optical axis of the return light coincides with the optical axes of the erase light and the pump light, and the illumination area in the sample S is wider than the condensing spot size of the erase light and the pump light. This is because it is necessary to reliably initialize all the molecules present in the irradiation region of the sample S to the activated state. In the super-resolution microscope according to the present embodiment, the aperture 127 reduces the beam diameter of the return light from the beam diameter of the erase light and the pump light, and inserts a defocus lens 128 in the optical path of the return light. The focus spot size of the return light is adjusted. The condensing spot size of the return light is not limited to the adjustment using both the stop 127 and the defocus lens 128, and may be adjusted by only one of them.

次に、本実施の形態に係る超解像顕微鏡による顕微鏡観察法について、図６（ａ）〜図６（ｅ）に示す模式図を参照しながら説明する。なお、図６（ａ）〜図６（ｅ）において、試料Ｓ内に白抜きで示す分子は、不活性化状態にある分子を示し、斜線を施して示す分子は、活性化状態にある分子を示す。 Next, a microscopic observation method using the super-resolution microscope according to the present embodiment will be described with reference to schematic diagrams shown in FIGS. 6 (a) to 6 (e). In FIG. 6A to FIG. 6E, a molecule shown in white in the sample S indicates a molecule in an inactivated state, and a molecule indicated by hatching indicates a molecule in an activated state. Indicates.

まず、演算制御部１３７は、３次元移動ステージ１３２を駆動して、試料Ｓを観測点の初期ポイントにセットする。次に、ＡＯＭ１１３を駆動して、パルス化された復帰光を、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８、反射ミラー１２９、ビームコンバイナ１２６及びハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、図６（ａ）に示すように試料Ｓに照射させる。その際、図６（ｂ）に示すように、照射ポイントの蛍光分子が確実に活性化状態に初期化されるように、演算制御部１３７により復帰光のパルス幅又は尖頭値強度を調整する。 First, the arithmetic control unit 137 drives the three-dimensional movement stage 132 to set the sample S as the initial point of the observation point. Next, the AOM 113 is driven, and the pulsed return light is passed through the aperture 127, the defocus lens 128, the reflection mirror 129, the beam combiner 126, and the half mirror 130 by the microscope objective lens 131 as shown in FIG. The sample S is irradiated as shown. At that time, as shown in FIG. 6B, the calculation control unit 137 adjusts the pulse width or peak value intensity of the return light so that the fluorescent molecule at the irradiation point is surely initialized to the activated state. .

次に、演算制御部１３７は、ＡＯＭ１１１を駆動して、パルス化されたイレース光を、ビームコンバイナ１２１、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４、位相板１２５、ビームコンバイナ１２６及びハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により試料Ｓに照射する。これにより、図６（ｃ）に示すように、ビーム中央で強度の極小値をもつ中空状のイレース光を試料Ｓに集光させる。その際、図６（ｄ）に示すように、光軸中央部のみ１分子レベルで活性化状態の蛍光分子が残存し、光軸以外の領域に存在する活性化状態の蛍光分子が不活性化状態に転換されるように、演算制御部１３７によりイレース光のパルス幅又は尖頭値強度を調整する。 Next, the arithmetic control unit 137 drives the AOM 111 to convert the pulsed erase light into a beam combiner 121, a collector lens 122, a single mode fiber 123, a collimator lens 124, a phase plate 125, a beam combiner 126, and a half mirror. Through 130, the sample S is irradiated by the microscope objective lens 131. Thereby, as shown in FIG. 6C, hollow erase light having a minimum intensity value at the center of the beam is condensed on the sample S. At that time, as shown in FIG. 6 (d), the fluorescent molecules in the activated state remain at the single molecule level only in the central portion of the optical axis, and the activated fluorescent molecules existing in the region other than the optical axis are inactivated. The pulse width or peak value intensity of the erase light is adjusted by the arithmetic control unit 137 so that the state is converted.

次に、演算制御部１３７は、ＡＯＭ１１２を駆動して、パルス化されたポンプ光を、イレース光と同じ光路を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、図６（ｅ）に示すように試料Ｓに照射させる。そして、照明領域から放出される蛍光を、顕微鏡対物レンズ１３１、ハーフミラー１３０、ブロックフィルタ１３３、コレクターレンズ１３４及び共焦点ピンホール１３５を経て光電子増倍管１３６で検出する。その際、光電子増倍管１３６が飽和しないように、ポンプ光のパルス幅又は尖頭値強度、及び、光電子増倍管１３６の印加電圧を調整する。光電子増倍管１３６の出力信号は、演算制御部１３７において光軸の位置座標に対応して記憶される。 Next, the arithmetic control unit 137 drives the AOM 112 to irradiate the sample S with the pulsed pump light through the same optical path as the erase light by the microscope objective lens 131 as shown in FIG. . Then, the fluorescence emitted from the illumination region is detected by the photomultiplier tube 136 through the microscope objective lens 131, the half mirror 130, the block filter 133, the collector lens 134, and the confocal pinhole 135. At that time, the pulse width or peak intensity of the pump light and the applied voltage of the photomultiplier 136 are adjusted so that the photomultiplier 136 is not saturated. The output signal of the photomultiplier tube 136 is stored in the arithmetic control unit 137 corresponding to the position coordinate of the optical axis.

以後、演算制御部１３７は、３次元移動ステージ１３２を駆動して、試料Ｓに対する光軸位置を移動させながら、図６（ａ）〜図６（ｅ）の一連のプロセスを繰り返す。なお、この際の光軸位置の移動量は、少なくとも通常の蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を与える必要があるため、ポンプ光の回折限界よりも小さく調整する。そして、試料Ｓの観察領域の走査が終了すると、演算制御部１３７は、観察領域のすべての位置の蛍光出力の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、蛍光強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して蛍光画像（発光画像）を生成し、該蛍光画像を表示部１３８に表示させる。 Thereafter, the arithmetic control unit 137 repeats a series of processes shown in FIGS. 6A to 6E while driving the three-dimensional moving stage 132 to move the optical axis position with respect to the sample S. Note that the amount of movement of the optical axis position at this time must be adjusted to be smaller than the diffraction limit of the pump light because it is necessary to provide at least a higher spatial resolution than that of a normal fluorescence microscope. When the scanning of the observation area of the sample S is completed, the arithmetic control unit 137 deconvolves the fluorescence output intensity distribution at all positions in the observation area with the Lorentz function, and the spatial position of the maximum value of the fluorescence intensity distribution. And the intensity are calculated to generate a fluorescence image (luminescence image), and the fluorescence image is displayed on the display unit 138.

本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、中空状のイレース光の照射により、光軸位置に存在する蛍光分子を活性化状態に保ち、それ以外の領域に存在する蛍光分子を不活性化状態に転換できるので、高い精度で光軸上すなわち観測点における蛍光分子の存在の有無を検出することができる。特に、イレース光にラゲールガウシアンビームを用いることで、活性化状態にある蛍光分子の存在確率が、光軸から離れるに従いローレンツ関数に従って急激に減少する。しかも、その半値幅は、イレース光の強度と照射時間とで決まる総ドーズ量の増加に従って細くなる。言い換えると、多数の活性化状態の蛍光分子が存在するとき、イレース光の照射総量を調整することで、極限の場合、光軸以外に存在する蛍光分子を不活性化状態にすることができる。これにより、活性化状態の蛍光分子の確率分布を、光軸を中心とするデルタ関数とすることができ、蛍光分子の位置同定精度を極めて高くできるので、高精細で高信頼性の超解像画像を観察することが可能となる。また、３次元移動ステージ１３２を光軸方向に移動させることにより、３次元的な画像観察も可能となる。 According to the super-resolution microscope according to the present embodiment, the irradiation of the hollow erase light keeps the fluorescent molecules present at the optical axis position in an activated state and inactivates the fluorescent molecules present in other regions. Since the state can be changed, the presence or absence of fluorescent molecules on the optical axis, that is, at the observation point can be detected with high accuracy. In particular, by using a Laguerre Gaussian beam for the erase light, the existence probability of the fluorescent molecule in the activated state decreases rapidly according to the Lorentz function as the distance from the optical axis increases. In addition, the half width becomes narrower as the total dose amount determined by the intensity of the erase light and the irradiation time increases. In other words, when there are a large number of activated fluorescent molecules, by adjusting the total irradiation amount of erase light, in the extreme case, fluorescent molecules existing outside the optical axis can be inactivated. This enables the probability distribution of activated fluorescent molecules to be a delta function centered on the optical axis, and the position identification accuracy of the fluorescent molecules can be extremely high, resulting in high-definition and high-reliability super-resolution. An image can be observed. In addition, three-dimensional image observation is also possible by moving the three-dimensional movement stage 132 in the optical axis direction.

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、蛍光分子（染色物質）はドロンパに限らず、kaede(カエデ)等も適用可能であり、使用される染色物質に応じて、活性化光、不活性化光、ポンプ光、イレース光の波長を設定すればよい。また、第１実施の形態において、試料Ｓの観察領域は、二次元ガルバノミラー２８によることなく、試料ステージ４５により行うようにしてもよい。また、ポンプ光及びイレース光による二次元走査は、二次元ガルバノミラー３６によることなく、二次元方向に移動可能な試料ステージにより行うようにしてもよいし、試料ステージと一次元ガルバノミラーとを互いに直交する方向に移動させて行うようにしてもよい。 In addition, this invention is not limited only to the said embodiment, Many deformation | transformation or a change is possible. For example, in the first embodiment, the fluorescent molecule (staining substance) is not limited to dronepa, but kaede can also be applied. Depending on the staining substance used, activation light, inactivation light, What is necessary is just to set the wavelength of pump light and erase light. In the first embodiment, the observation region of the sample S may be performed by the sample stage 45 without using the two-dimensional galvanometer mirror 28. Further, the two-dimensional scanning by the pump light and the erase light may be performed by a sample stage movable in the two-dimensional direction without using the two-dimensional galvanometer mirror 36, or the sample stage and the one-dimensional galvanometer mirror may be mutually connected. You may make it carry out by moving in the orthogonal direction.

また、第２実施の形態においても、染色物質は、フォトクロミック分子に限らず、他の物質の場合にも適用可能であり、使用される染色物質に応じて、ポンプ光、イレース光、復帰光の波長を設定すればよい。また、第２実施の形態においては、二次元ガルバノミラーを用いて試料Ｓを走査するように構成してもよいし、試料ステージと一次元ガルバノミラーとを互いに直交する方向に移動させて試料Ｓを走査するように構成してもよい。 Also in the second embodiment, the staining material is not limited to the photochromic molecule but can be applied to other materials, and pump light, erase light, and return light can be used depending on the staining material used. What is necessary is just to set a wavelength. In the second embodiment, the sample S may be scanned using a two-dimensional galvanometer mirror, or the sample stage and the one-dimensional galvanometer mirror are moved in directions orthogonal to each other. May be configured to scan.

さらに、第１実施の形態及び第２実施の形態においては、ビーム整形素子として位相板を用いてイレース光をビーム面内において空間的に位相変調することにより、集光点において中空状に整形したが、位相板に代えてイレース光をビーム面内において空間的に偏光制御して、集光点において中空状に整形する偏光制御素子を用いてもよい。 Furthermore, in the first embodiment and the second embodiment, erase light is spatially phase-modulated in the beam plane using a phase plate as a beam shaping element, and shaped into a hollow shape at a condensing point. However, instead of the phase plate, a polarization control element that spatially controls the erase light in the beam plane and shapes it in a hollow shape at the condensing point may be used.

Ｓ試料
１１，１２，１３，１４光源
２１ビームコンバイナ
２４，３１ＡＯＴＦ（音響光学波長可変フィルタ）
２５，３２ブロードバンドファイバ
２７デフォーカスレンズ
２８，３６二次元ガルバノミラー
３４位相板
４４顕微鏡対物レンズ
４５試料ステージ
５２共焦点ピンホール
５３回折格子
５４ピンホール
５５光電子増倍管
５６演算制御部
５７表示部
１０１，１０２，１０３光源
１１１，１１２，１１３ＡＯＭ（音響光学素子）
１２１，１２６ビームコンバイナ
１２３シングルモードファイバ
１２５位相板
１２７絞り
１２８デフォーカスレンズ
１３１顕微鏡対物レンズ
１３２３次元試料ステージ
１３５共焦点ピンホール
１３６光電子増倍管
１３７演算制御部
１３８表示部
S Sample 11, 12, 13, 14 Light source 21 Beam combiner 24, 31 AOTF (acousto-optic wavelength tunable filter)
25, 32 Broadband fiber 27 Defocus lens 28, 36 Two-dimensional galvanometer mirror 34 Phase plate 44 Microscope objective lens 45 Sample stage 52 Confocal pinhole 53 Diffraction grating 54 Pinhole 55 Photomultiplier tube 56 Operation control unit 57 Display unit 101 , 102, 103 Light source 111, 112, 113 AOM (acousto-optic device)
121, 126 Beam combiner 123 Single mode fiber 125 Phase plate 127 Aperture 128 Defocus lens 131 Microscope objective lens 132 Three-dimensional sample stage 135 Confocal pinhole 136 Photomultiplier tube 137 Calculation control unit 138 Display unit

Claims

少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる活性化光及び前記物質を不活性化させる不活性化光を前記試料に照射する第１光学系と、
前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光及び前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光を、空間的に一部重ね合わせて前記試料に集光する第２光学系と、
前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記活性化光、前記不活性化光、前記ポンプ光及び前記イレース光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記活性化光及び前記不活性化光を順次に照射させた後、前記イレース光及び前記ポンプ光を走査させた際に、各走査点において前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする超解像顕微鏡。 A super-resolution microscope for observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states,
A first optical system for irradiating the sample with activation light for activating the substance and deactivation light for deactivating the substance;
Pump light that excites the substance from the activated state to the emission quantum state and emits light and erase light that suppresses light emission by transitioning the substance to the emission suppression quantum state are partially overlapped and collected in the sample. A second optical system that emits light;
A scanning unit that scans the sample by relatively displacing the erase light, the pump light, and the sample;
A detection unit for detecting light emission from the sample;
The activation light, the deactivation light, the pump light, the irradiation of the erase light to the sample, and the scanning by the scanning unit are controlled, and the light emission image of the sample based on the detection signal from the detection unit An arithmetic control unit for generating
The calculation control unit sequentially detects the detection light obtained from the detection unit at each scanning point when the erase light and the pump light are scanned after sequentially irradiating the activation light and the deactivation light. A super-resolution microscope characterized in that an emission image of the sample is generated based on the above.

前記第２光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する、請求項１に記載の超解像顕微鏡。 The super-resolution microscope according to claim 1, wherein the second optical system includes a beam shaping element that spatially modulates or polarizes the erase light in a beam plane.

少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で集光させる照射光学系と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記走査部による前記試料の各走査点において、前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光を順次に照射させた際に前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする超解像顕微鏡。 A super-resolution microscope for observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states,
Return light for activating the substance, erase light for transitioning the activated substance to a light emission suppression quantum state to suppress light emission, and a pump for exciting the substance in the activated state to light emission quantum state to emit light An irradiation optical system for concentrating light on the sample coaxially;
A scanning unit that scans the sample by relatively displacing the return light, the erase light, the pump light, and the sample;
A detection unit for detecting light emission from the sample;
An arithmetic control unit that controls irradiation of the return light, erase light, and pump light to the sample, and scanning by the scanning unit, and generates a light emission image of the sample based on a detection signal from the detection unit; Have
The arithmetic control unit is configured to detect the sample based on a detection signal obtained from the detection unit when the return light, the erase light, and the pump light are sequentially irradiated at each scanning point of the sample by the scanning unit. A super-resolution microscope characterized by generating a luminescence image.

前記照射光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する、請求項３に記載の超解像顕微鏡。 The super-resolution microscope according to claim 3, wherein the irradiation optical system includes a beam shaping element that spatially modulates or polarizes the erase light in a beam plane.

前記走査部は、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。 The super solution according to claim 1, wherein the scanning unit displaces sequential scanning points on the sample by a distance smaller than a diffraction limit of the pump light irradiated on the sample. Image microscope.

前記演算制御部で生成される発光画像を表示する表示部をさらに有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。 The super-resolution microscope according to claim 1, further comprising a display unit that displays a light emission image generated by the arithmetic control unit.

前記演算制御部は、前記検出部から得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。 The calculation control unit deconvolves the intensity distribution of the detection signal obtained from the detection unit with a Lorentz function, calculates the spatial position and intensity of the maximum value of the intensity distribution, and generates the emission image. The super-resolution microscope as described in any one of Claims 1-6.

前記演算制御部は、さらに前記イレース光の尖頭値強度又は照射時間を調整する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。 The super-resolution microscope according to any one of claims 1 to 7, wherein the arithmetic control unit further adjusts a peak value intensity or irradiation time of the erase light.

前記走査部は、前記試料に照射する光を走査するガルバノミラーを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。 The super-resolution microscope according to claim 1, wherein the scanning unit includes a galvanometer mirror that scans light applied to the sample.

少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる活性化光を前記試料に照射する活性化ステップと、
前記活性化光が照射された領域に、活性化状態の前記物質が分子レベルで空間分離するように、前記物質を不活性化させる不活性化光を照射する不活性化ステップと、
前記不活性化光が照射された領域に、前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光と、前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光とを空間的に一部重ね合わせて集光して、当該領域内を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。 In observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states with a microscope,
An activation step of irradiating the sample with an activation light that activates the substance;
An inactivation step of irradiating the activation light to inactivate the substance so that the activated substance is spatially separated at a molecular level in the region irradiated with the activation light;
Pump light that excites the substance from an activated state to an emission quantum state and emits light in a region irradiated with the inactivation light; and erase light that suppresses light emission by transitioning the substance to an emission suppression quantum state; Scanning step for condensing and condensing a part of the space, and scanning the area,
A detection step of detecting light emission from the sample by the scanning step;
A calculation control step for generating a light emission image of the sample based on each scanning position on the sample by the scanning step and a detection signal by the detection step at the scanning position;
A microscope observation method characterized by comprising:

前記活性化ステップ、前記不活性化ステップ、前記走査ステップ及び前記検出ステップを順次繰り返し行い、
前記演算制御ステップは、順次の前記検出ステップによる検出信号を合成して前記試料の発光画像を生成する、
ことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡観察法。 Sequentially performing the activation step, the deactivation step, the scanning step and the detection step;
The calculation control step generates a light emission image of the sample by synthesizing detection signals from the sequential detection steps.
The microscope observation method according to claim 10.

少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で順次に照射する照射ステップと、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。 In observing a sample containing a substance having at least two excited quantum states with a microscope,
Return light for activating the substance, erase light for transitioning the activated substance to a light emission suppression quantum state to suppress light emission, and a pump for exciting the substance in the activated state to light emission quantum state to emit light An irradiation step of sequentially irradiating the sample with light coaxially;
A scanning step of scanning the sample by relatively displacing the return light, the erase light, the pump light, and the sample;
A detection step of detecting light emission from the sample by the scanning step;
A calculation control step for generating a light emission image of the sample based on each scanning position on the sample by the scanning step and a detection signal by the detection step at the scanning position;
A microscope observation method characterized by comprising:

前記走査ステップは、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。 The microscope observation according to any one of claims 10 to 12, wherein the scanning step displaces sequential scanning points on the sample by a distance smaller than a diffraction limit of the pump light irradiated on the sample. Law.

前記演算制御ステップは、前記検出ステップから得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。 The calculation control step deconvolves the intensity distribution of the detection signal obtained from the detection step with a Lorentz function, calculates the spatial position and intensity of the maximum value of the intensity distribution, and generates the emission image. The microscope observation method as described in any one of Claims 10-13.

前記試料は、凍結試料である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。 The microscope observation method according to any one of claims 10 to 14, wherein the sample is a frozen sample.

前記試料に照射される前記イレース光は、ラゲールガウシアンビームである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。
The microscope observation method according to claim 10, wherein the erase light irradiated on the sample is a Laguerre Gaussian beam.