JP2014003920A - Gene coding acyl homoserine lactone synthetic enzyme and its utilization - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子、及び当該遺伝子を用いた形質転換体によるアシルホモセリンラクトン合成酵素の製造方法、さらに当該酵素による特定のアシルホモセリンラクトン化合物の生産方法に関する。 The present invention relates to a gene encoding an acyl homoserine lactone synthase, a method for producing an acyl homoserine lactone synthase using a transformant using the gene, and a method for producing a specific acyl homoserine lactone compound using the enzyme.
微生物は自然環境中において非常に複雑なコミュニティーを形成しており、微生物同士が常に相互作用し、環境適応機構を発達させている。中でも、化合物を介した微生物間のシグナル伝達機構は、コミュニティーを発達、維持するために必要とされている(非特許文献１)。特定の真正細菌において、菌数依存的に生物活性を制御するシステムをQuorum sensing(QS)という(非特許文献２)。
微生物はオートインデューサー(AI)と呼ばれる低分子化合物を言葉のように利用して互いに情報交換しており、バイオフィルム形成や発光、走化性、病原因子の発現に関与している(非特許文献３、４)。グラム陰性細菌における代表的なAIはアシルホモセリンラクトン(N-acyl-L-homoserine lactones：AHLs)であり、３位の炭素の状態やアシル鎖の長さが異なるAHLの異性体がAIとして利用されている。アシルホモセリンラクトンは、下記式(１)で表される。
(式中、Ｒは水素原子、水酸基、または酸素原子を表し、ｎは0〜10の整数を表す。)
QS機構により制御されている微生物の病原性発現を抑止する新たな手法の構築に、AIを活用することが注目されており、将来的に医療分野や工業分野など幅広い応用が期待されている(非特許文献５)
Microorganisms form a very complex community in the natural environment. Microorganisms always interact with each other and develop an environmental adaptation mechanism. Among them, a signal transduction mechanism between microorganisms via a compound is required to develop and maintain a community (Non-patent Document 1). A system that controls biological activity in a specific eubacteria in a bacterial number-dependent manner is called Quorum sensing (QS) (Non-patent Document 2).
Microorganisms exchange information with each other using words like low-molecular compounds called autoinducers (AI), and are involved in biofilm formation, luminescence, chemotaxis, and expression of pathogenic factors (non-patented) References 3, 4). A typical AI in gram-negative bacteria is N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs), and AHL isomers with different carbon states and acyl chain lengths are used as AI. ing. The acyl homoserine lactone is represented by the following formula (1).
(In the formula, R represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an oxygen atom, and n represents an integer of 0 to 10).
The use of AI is attracting attention for the construction of new methods to suppress the pathogenicity of microorganisms controlled by the QS mechanism, and a wide range of applications in the medical and industrial fields are expected in the future ( Non-patent document 5)
アシルホモセリンラクトン(AHL)は、化学合成法によっても製造可能ではあるが、環境低負荷型の効率のよい製造法として微生物由来のAHL合成酵素を用いる酵素法が想定されている(非特許文献５)。しかし、すでにアシルホモセリンラクトンの微生物変換に関わるいくつかの遺伝子・酵素が報告されているが、現在報告されているAHL合成酵素は、単一のAHLを生産するものではなかった
(非特許文献６、７、８)。
Although acyl homoserine lactone (AHL) can be produced by a chemical synthesis method, an enzymatic method using a microorganism-derived AHL synthase is assumed as an efficient production method with low environmental load (Non-patent Document 5). ). However, several genes and enzymes related to microbial conversion of acyl homoserine lactone have already been reported, but the currently reported AHL synthase did not produce a single AHL.
(Non-patent documents 6, 7, and 8).
最近、アシルホモセリンラクトン化合物のうちで、下記式(２)で表される、ドデカノイルホモセリンラクトン(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone ：C12HSL)が、環境微生物や病原性微生物が産生する微生物間コミュニケーション物質として、環境微生物の挙動を制御し、特に病原性微生物に対する病原性発現を調節する物質として注目を集めている(非特許文献９、１０、１１)。
しかしながら、従来報告されているC12HSLを生産する微生物は、C12HSL以外のAHL異性体を副生成物として含むAHL混合物として産生するため、C12HSL化合物を単離する為には複雑な精製工程を経る必要があった(非特許文献１１)。
したがって、C12HSLを単一の生成物として生産可能なAHL合成酵素を探索し、当該酵素遺伝子のクローニング及びそれを用いた組換え微生物による効率的なC12HSLの生産が望まれていた。
Recently, among the acyl homoserine lactone compounds, N-dodecanoyl-L-homoserine lactone (C12HSL), represented by the following formula (2), is an inter-microbial communication produced by environmental microorganisms and pathogenic microorganisms. As a substance, it attracts attention as a substance that controls the behavior of environmental microorganisms and regulates the expression of pathogenicity against pathogenic microorganisms (Non-Patent Documents 9, 10, and 11).
However, since conventionally reported microorganisms producing C12HSL are produced as AHL mixtures containing AHL isomers other than C12HSL as by-products, it is necessary to go through complicated purification steps in order to isolate C12HSL compounds. (Non-Patent Document 11).
Therefore, AHL synthase capable of producing C12HSL as a single product was searched for, and cloning of the enzyme gene and efficient production of C12HSL by a recombinant microorganism using the same were desired.
本発明は、アシルホモセリンラクトンの一種であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の合成酵素をコードする遺伝子、及びこの遺伝子が発現する酵素を用いたドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a gene encoding a synthase of dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL), which is a kind of acyl homoserine lactone, and a method for producing dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) using the enzyme expressed by this gene. With the goal.
上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、メタゲノムライブラリーからアシルホモセリンラクトン(AHL)の１種であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の合成活性を有する新規な合成酵素をコードする遺伝子(ahlI遺伝子)を単離することに成功した。そして、当該遺伝子がコードするドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素(配列番号１)が、AHL化合物の異性体を副産物として含むこと無く、式(２)のドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)のみを製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive research to solve the above problems, a gene encoding a novel synthase having a synthesis activity of dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL), which is one of acyl homoserine lactones (AHL), from a metagenomic library ( ahlI gene) was successfully isolated. And the dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthetase (SEQ ID NO: 1) encoded by the gene produces only dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) of the formula (2) without containing an isomer of AHL compound as a byproduct. The inventors have found what can be done and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質；
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(ｃ)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％のホモロジーを有するアミノ酸配列。
〔２〕 前記〔１〕に記載のタンパク質をコードする核酸。
〔３〕 下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかの塩基配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；
(ａ)配列番号２に示される塩基配列、
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と少なくとも80％のホモロジーを有する塩基配列。
〔４〕 前記〔２〕又は〔３〕に記載の核酸を含むベクター。
〔５〕 前記〔４〕に記載のベクターを含む形質転換体。
〔６〕 前記〔５〕に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からC12HSL合成酵素を採取することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素の製造方法。
〔７〕 前記〔５〕に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の製造方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A protein comprising any of the amino acid sequences shown in the following (a) to (c) and having dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase activity;
(a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(c) an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[2] A nucleic acid encoding the protein according to [1].
[3] A nucleic acid encoding a protein comprising any one of the base sequences shown in the following (a) to (c) and having dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase activity;
(a) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(b) a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions;
(c) a base sequence having at least 80% homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[4] A vector comprising the nucleic acid according to [2] or [3].
[5] A transformant comprising the vector according to [4].
[6] A method for producing dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase, comprising culturing the transformant according to [5] and collecting C12HSL synthase from the obtained culture.
[7] A method for producing dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL), wherein the transformant according to [5] is cultured.
本発明により、新規なドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素をコードする遺伝子が提供される。これらの遺伝子がコードする酵素は、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)を他のAHL化合物を含むことなく単一のAHL産物として合成することができるためドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の精製が容易である。当該C12HSL合成酵素遺伝子による形質転換微生物を用いることで、QS機構による微生物の病原性発現の調節作用が期待されるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)を、安価で安定かつ効率的に供給可能となる。 According to the present invention, a gene encoding a novel dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase is provided. Enzymes encoded by these genes can synthesize dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) as a single AHL product without containing other AHL compounds, making it easy to purify dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) . By using a microorganism transformed with the C12HSL synthase gene, dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL), which is expected to regulate the virulence expression of the microorganism by the QS mechanism, can be supplied stably at low cost.
以下に本発明を詳細に説明する。
１．ドデカノイルホモセリンラクトン(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone：C12HSL)
微生物間のコミュニケーションに用いられるオートインデューサー(AI)のうち、グラム陰性細菌における代表的なAIは下記式(１)で表されるアシルホモセリンラクトン(AHLs)である。
(式中、Ｒは水素原子、水酸基、または酸素原子を表し、ｎは0〜10の整数を表す。)
本発明の目的化合物であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)は、グラム陰性細菌間のオートインデューサー(AI)として広く知られるアシルホモセリンラクトン化合物のうちでも、環境微生物の挙動を制御し、特に病原性微生物に対する病原性発現を調節する物質として注目を集めている下記式(２)の化合物である。
1. N-dodecanoyl-L-homoserine lactone (C12HSL)
Among autoinducers (AI) used for communication between microorganisms, a typical AI in gram-negative bacteria is acyl homoserine lactone (AHLs) represented by the following formula (1).
(In the formula, R represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an oxygen atom, and n represents an integer of 0 to 10).
The target compound of the present invention, dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL), controls the behavior of environmental microorganisms among acyl homoserine lactone compounds widely known as autoinducers (AI) among Gram-negative bacteria, and is particularly pathogenic. It is a compound of the following formula (2) that is attracting attention as a substance that regulates the pathogenicity of microorganisms.
２．ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素遺伝子について
(２−１)C12HSL合成酵素遺伝子の単離
本発明者は、新規なC12HSL合成酵素遺伝子を単離するため、まず、森林土壌から複合微生物のDNAを抽出し、宿主として大腸菌(Escherichia coli) EPI300株とベクターとしてフォスミド(Fosmid)ベクターを利用して、平均約40kbpの長さのDNAを含むクローン群からなるメタゲノムライブラリーを構築した。
当該メタゲノムライブラリーをLB(Luria-bertani)液体培地で培養し、さらにC12HSLを感知する微生物センサーの菌体懸濁液を培養し、微生物センサーが陽性を示したクローンを得た。フォスミドDNAを抽出して塩基配列の決定を行い、その結果、既知のアシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子と相同性がある新規の遺伝子の単離に成功した。
当該遺伝子を発現させ、その発現タンパク質がアシルホモセリンラクトンのうちでドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)のみを合成する活性を有することを確認して、該遺伝子がC12HSL合成酵素をコードする遺伝子であると同定し、該遺伝子について、ahlIと命名した。ahlI遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸をコードする遺伝子であり、配列番号２の塩基配列からなる。
2. About dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase gene
(2-1) Isolation of C12HSL Synthase Gene In order to isolate a novel C12HSL synthase gene, the present inventor first extracted DNA of a complex microorganism from forest soil and used Escherichia coli EPI300 as a host. Using a fosmid vector as a strain and a vector, a metagenomic library consisting of a group of clones containing DNA having an average length of about 40 kbp was constructed.
The metagenomic library was cultured in an LB (Luria-bertani) liquid medium, and a cell suspension of a microbial sensor that senses C12HSL was further cultured to obtain a clone in which the microbial sensor was positive. The fosmid DNA was extracted and the nucleotide sequence was determined. As a result, a novel gene having homology with a known acyl homoserine lactone synthase gene was successfully isolated.
Express the gene, confirm that the expressed protein has the activity to synthesize only dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) among acyl homoserine lactones, and identify that the gene encodes C12HSL synthase The gene was named ahlI. The ahlI gene is a gene encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 1, and consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
(２−２)本発明のC12HSL合成酵素遺伝子
本発明のC12HSL合成酵素遺伝子の典型的な遺伝子は上記ahlI遺伝子であるが、その部分配列であっても、また当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じている場合であっても、当該タンパク質がC12HSL合成活性を有している限り、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子に含まれる。
すなわち、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子がコードするC12HSL合成酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、C12HSLの合成能のある酵素活性を有するタンパク質と表現することができる。ここで、「１若しくは数個」というとき、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは１〜５個を表す。
また、C12HSL合成酵素の全長でなく部分配列であってもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有するアミノ酸配列であればよい。
したがって、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子は、上記のように表されるC12HSL合成酵素をコードする核酸である、ということができる。
また、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子は、典型的なahlI遺伝子の塩基配列である配列番号２を用いて、以下のように表現することもできる。
下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかの塩基配列を含み、かつC12HSL合成酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であると表現することもできる。
(ａ)配列番号２に示される塩基配列。
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性(identity 80％以上、好ましくは90％以上)を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。このような「ストリンジェントな条件」は、例えば、2 x SSC、0.1％SDS及び50％ホルムアミドの溶液中で25℃にて加温した後、0.1 x SSC、0.1％SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件をいう。
但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、これら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有する塩基配列。
(2-2) C12HSL synthase gene of the present invention A typical gene of the C12HSL synthase gene of the present invention is the ahlI gene, but even if it is a partial sequence, the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Even if one or several amino acids have a mutation such as deletion, substitution, addition, etc., as long as the protein has C12HSL synthesizing activity, it is included in the C12HSL synthase gene of the present invention. .
That is, the C12HSL synthase encoded by the C12HSL synthase gene of the present invention has one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The protein can be expressed as a protein having an enzymatic activity capable of synthesizing C12HSL. Here, “1 or several” means 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5.
Further, it may be a partial sequence instead of the full length of C12HSL synthase, as long as it is an amino acid sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Good.
Therefore, it can be said that the C12HSL synthase gene of the present invention is a nucleic acid encoding the C12HSL synthase expressed as described above.
The C12HSL synthase gene of the present invention can also be expressed as follows using SEQ ID NO: 2 which is a typical base sequence of ahlI gene.
It can also be expressed as a nucleic acid encoding a protein containing any one of the base sequences shown in (a) to (c) below and having C12HSL synthetase activity.
(a) The base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(b) a base sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Here, stringent conditions refer to conditions in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, it refers to conditions under which DNA having high homology (identity 80% or more, preferably 90% or more) hybridizes. Such “stringent conditions” are, for example, heating in a solution of 2 × SSC, 0.1% SDS and 50% formamide at 25 ° C. and then in a solution of 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 68 ° C. The conditions for washing with
However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and the same stringency can be realized by appropriately selecting these factors.
(c) A base sequence having a homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(２−３)C12HSL合成酵素遺伝子の調製法
上記遺伝子は、他のC12HSL合成活性を持つ細菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。同様に上記遺伝子の塩基配列から設計したプロープを用いたハイブリダイズ法を利用することもできる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。遺伝子への変異の導入法は限定されないが、市販の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan-K(TAKARA社製)やMutan-G(TAKARA社製)などを用いることができる。
(2-3) C12HSL synthase gene preparation method The above gene is prepared from DNA prepared from other bacteria having C12HSL synthesis activity by PCR using primers designed based on the base sequence of the above gene. can do. Similarly, a hybridization method using a probe designed from the base sequence of the gene can also be used.
In addition, mutants of the gene of the present invention having the above functions or activities can be synthesized by site-directed mutagenesis. The method for introducing a mutation into a gene is not limited, but a commercially available mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method (for example, Mutan-K (TAKARA) or Mutan-G (TAKARA)) is used. be able to.
３．C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体
(３−１)C12HSL合成酵素遺伝子発現ベクター
本発明のC12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターは、適当なベクターにC12HSL合成酵素遺伝子を連結することにより得られる。
本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。
ベクター中に導入する遺伝子の方向及び順序は、遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。
3. Transformant capable of producing C12HSL synthase
(3-1) C12HSL synthase gene expression vector The C12HSL synthase gene expression vector of the present invention can be obtained by linking a C12HSL synthase gene to an appropriate vector.
The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, such as a plasmid, a cosmid, or a bacteriophage. Further, the host such as Escherichia coli and actinomycetes is not limited as long as the vector functions.
The direction and order of the gene to be introduced into the vector may be arbitrarily selected and sequenced as long as the gene is expressed and the expressed protein can function as an enzyme.
(３−２)本発明のC12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターを含む形質転換体:
本発明においては、上記C12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターを含む形質転換体として、人為的に上記作製したベクターを導入した微生物が包含されるが、これらに限定されない。
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを上記宿主に導入し、形質転換を行うことにより作製される。形質転換体を作製する場合、上記組換えベクターを宿主に導入することにより行われるが、これにはそれ自体公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの手法を用いることができる。また、形質転換体の作製に際しては、ベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮して、これらを選択して用いることによって、C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体を作製することができる。
典型的には、C12HSL合成酵素遺伝子を発現プラスミドベクターに組み込み、大腸菌に導入し、発現させる。
本実施例では、宿主としてEscherichia coli DH5alpha株、ベクターとして、開始コドンATG、及びその上流にRBS、さらに上流にlacプロモーターを含むpUC19ベクターを使用した例を示す。得られたC12HSL合成酵素遺伝子が導入された形質転換体は、良好なC12HSL合成酵素の生産性を示している。
この例に限らず宿主やベクター、発現制御系などをうまく機能する様に組み合わせて用いることによって、C12HSL合成酵素遺伝子を高発現する微生物の作製が可能となる。
(3-2) Transformant containing the C12HSL synthase gene expression vector of the present invention:
In the present invention, the transformant containing the C12HSL synthase gene expression vector includes, but is not limited to, a microorganism into which the artificially prepared vector is introduced.
The transformant of the present invention is produced by introducing the recombinant vector into the host and performing transformation. When producing a transformant, it is carried out by introducing the above-mentioned recombinant vector into a host, and this is a method known per se such as electroporation method, protoplast method, calcium chloride method (spheroplast method), etc. Can be used. In addition, when producing transformants, C12HSL synthase production ability can be improved by selecting and using vectors, hosts, induction substrates that induce high expression, combinations of promoters, operators, enhancers, etc. The transformant which has can be produced.
Typically, the C12HSL synthase gene is incorporated into an expression plasmid vector, introduced into E. coli, and expressed.
In this example, Escherichia coli DH5alpha strain is used as a host, a pUC19 vector containing an initiation codon ATG, an RBS upstream thereof, and a lac promoter further upstream is used as a vector. The resulting transformant into which the C12HSL synthase gene has been introduced shows good C12HSL synthase productivity.
It is possible to produce a microorganism that highly expresses the C12HSL synthase gene by using a combination of not only this example but also a host, a vector, an expression control system and the like so as to function well.
４．ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素について
(４−１)本発明のC12HSL合成酵素
本発明のC12HSL合成酵素は、典型的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質であるが、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、C12HSLの合成能のある酵素活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、「１若しくは数個」というとき、1〜10個、好ましくは1〜5個を表す。また、C12HSL合成酵素の全長でなく部分配列であってもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有するアミノ酸配列であればよい。
4). About dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase
(4-1) C12HSL Synthase of the Present Invention The C12HSL synthase of the present invention is typically an enzyme protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Alternatively, a protein having an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted, or added and having an enzymatic activity capable of synthesizing C12HSL is also included. Here, “1 or several” means 1 to 10, preferably 1 to 5. Further, it may be a partial sequence instead of the full length of C12HSL synthase, as long as it is an amino acid sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Good.
(４−２)本発明のC12HSL合成酵素の製造法
本発明において、目的のC12HSL合成酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
(4-2) Method for producing C12HSL synthase of the present invention In the present invention, the target C12HSL synthase can be obtained by culturing the microorganism having the gene encoding it and collecting it from the culture. it can. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, or disrupted cells. The method of culturing the microorganism of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing microorganisms. As a medium for culturing microorganisms such as actinomycetes and bacteria, any medium that contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and that can efficiently culture microorganisms can be used. Any of synthetic media may be used.
上記で示した組み換え大腸菌の場合は当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてIPTGなどの誘導物質を加えることにより、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜、抗生物質を加えたLB培地(1.0％ペプトン、0.5％乾燥酵母エキス、1.0％NaClから成る)で37℃、8-12時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいLB培地に容量比1-5％植菌、37℃、2-4時間本培養し、IPTGを加え、さらに30℃で2-4時間培養する。
他の形質転換体の場合も、それぞれの宿主細胞用に適した培地で培養する。形質転換微生物の場合、懸濁培養する際には懸濁液の濃度は、600nmの濁度で1-2が好適であり、必要に応じて増減できる。
In the case of the recombinant Escherichia coli shown above, it is cultured in a nutrient medium usually used in this research field, and if necessary, an inducer such as IPTG is added to highly express the enzyme in a nutrient medium in which Escherichia coli can grow. be able to. Under normal culture conditions, pre-cultured for 8-12 hours at 37 ° C in LB medium (1.0% peptone, 0.5% dry yeast extract, 1.0% NaCl) supplemented with antibiotics. As a seed, inoculate a new LB medium with a volume ratio of 1-5%, 37 ° C, main culture for 2-4 hours, add IPTG, and further culture at 30 ° C for 2-4 hours.
In the case of other transformants, the cells are cultured in a medium suitable for each host cell. In the case of a transformed microorganism, the suspension concentration is preferably 1-2 at a turbidity of 600 nm during suspension culture, and can be increased or decreased as necessary.
培養後、目的の酵素のタンパク質が菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の酵素タンパク質を通常のタンパク質精製方法を用いて単離精製することができる。目的の酵素タンパク質が得られたか否かは、単離した後に、一般的なタンパク質の同定方法であるSDS-PAGE等によっても確認することができるが、形質転換体の発現産物である組換えC12HSL合成酵素により培養液中に分泌されるC12HSLを抽出して同定することによっても、組換えC12HSL合成酵素がC12HSLを合成する酵素活性を有するか否かを確認することができる。 When the protein of the target enzyme is produced in the microbial cells after culturing, the protein is extracted by disrupting the microbial cells. When the target protein is produced outside the cells, the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, Thus, the target enzyme protein can be isolated and purified using a conventional protein purification method. Whether or not the target enzyme protein has been obtained can be confirmed by SDS-PAGE or the like, which is a general protein identification method, after isolation, but the recombinant C12HSL, which is the expression product of the transformant. It can also be confirmed whether or not the recombinant C12HSL synthase has the enzyme activity to synthesize C12HSL by extracting and identifying C12HSL secreted into the culture solution by the synthase.
５．組換えC12HSL合成酵素によるC12HSLの生産方法
(５−１)C12HSLの生産方法
ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)は、前記C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体を培養して組換えC12HSL合成酵素を産生する際に、当該培養液中に前記組換えC12HSL合成酵素の基質の前駆体となるアミノ酸が含まれていれば、宿主となる微生物により当該組み換えC12HSL合成酵素基質であるS-アデノシルメチオニンとアシル-アシルキャリアータンパク質(Acyl-ACP)が製造されて、直接培養液中にC12HSLが分泌される。
また、前記の本発明の組換えC12HSL合成酵素を単離して、又は単離せずに培養液の状態で取得し、基質であるS-アデノシルメチオニンとアシル-アシルキャリアータンパク質(Acyl-ACP)に作用させれば、C12HSLが合成される。
5. Production method of C12HSL by recombinant C12HSL synthase
(5-1) Method for producing C12HSL When dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) is produced by culturing a transformant having the ability to produce C12HSL synthase to produce recombinant C12HSL synthase, If the amino acid that is the precursor of the substrate of the recombinant C12HSL synthase is contained, the host microorganism may contain S-adenosylmethionine and acyl-acyl carrier protein (Acyl-ACP) that are the recombinant C12HSL synthase substrate. Manufactured and secreted C12HSL directly into the culture medium.
In addition, the recombinant C12HSL synthase of the present invention is obtained in the state of a culture solution with or without isolation, and the substrate is S-adenosylmethionine and acyl-acyl carrier protein (Acyl-ACP). If it is allowed to act, C12HSL is synthesized.
(５−２)C12HSLの単離精製方法
上記形質転換体の培養菌体、若しくは培養上清又は酵素反応液から、有機溶媒等を用いて抽出する。その際、培養菌体、若しくは培養上清は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてもよい。緩衝液としては種々の緩衝液を使用でき、また緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。
C12HSLを精製するためには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて用いることができる。
本発明の実施例では、まずイオン交換クロマトグラフィーを用い、エタノールを用いて溶後、クロロフォルムを用いた溶媒抽出を行い、クロロフォルム層をシリカゲルカラムで精製し(展開溶媒は、クロロフォルム：メタノール＝20：1)、最終的には逆相高速液体クロマトグラムにより単離した。
(5-2) Isolation and purification method of C12HSL Extract from the cultured bacterial cells, culture supernatant or enzyme reaction solution of the transformant using an organic solvent or the like. At that time, the cultured cells or the culture supernatant may be a cell suspension prepared by suspending in an appropriate buffer. Various buffers can be used as the buffer, and water, a medium, or the like can be used instead of the buffer.
In order to purify C12HSL, ion exchange chromatography, gel chromatography, reverse phase chromatography and the like can be used alone or in combination.
In Examples of the present invention, first, ion exchange chromatography was used, and after dissolution with ethanol, solvent extraction with chloroform was performed, and the chloroform layer was purified with a silica gel column (developing solvent was chloroform: methanol = 20: 1) Finally, it was isolated by reverse phase high performance liquid chromatogram.
(５−３)C12HSLの同定
C12HSL化合物を簡便に同定するためには、Andersenらの方法(Andersen，J.B.et al.，2001，Appl．Environ．Microbiol．67：575-585)により作製できるC12HSLを感知する微生物センサー(Andersen，J．B．et al.，2001，Appl．Environ．Microbiol. 67：575-585)が用いられる。当該「微生物センサー」を用いることで、C12HSLのゲルクロマトグラフィーなどを用いた精製過程で得られたどの画分にC12HSLが濃縮されているかが簡便に判定できる。
C12HSLが、他のアシルホモセリンラクトン類が含まれない状態で単離されていることを、正確に判定するためには、得られたC12HSL化合物に対して核磁気共鳴スペクトル、旋光性、質量分析を測定し、標準品の数値と対比すればよい。
(5-3) Identification of C12HSL
In order to easily identify the C12HSL compound, a microbial sensor (Andersen, J. et al.) That senses C12HSL can be prepared by the method of Andersen et al. (Andersen, JB et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 575-585). B. et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 575-585). By using the “microorganism sensor”, it can be easily determined which fraction obtained in the purification process using C12HSL gel chromatography or the like is enriched with C12HSL.
In order to accurately determine that C12HSL has been isolated in the absence of other acyl homoserine lactones, the obtained C12HSL compound was subjected to nuclear magnetic resonance spectrum, optical rotation and mass spectrometry. Measure and compare with the standard values.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Other terms and concepts in the present invention are based on the meanings of terms that are conventionally used in the field, and various techniques used to implement the present invention include those that clearly indicate the source. Except for this, it can be easily and reliably carried out by those skilled in the art based on known documents and the like. In addition, various analyzes were performed by applying the methods described in the analytical instruments or reagents used, kit instruction manuals, catalogs, and the like.
In addition, the description content in the technical literature, the patent gazette, and the patent application specification cited in this specification shall be referred to as the description content of the present invention.
(実施例１)大腸菌によるC12HSL遺伝子の発現
(１−１)C12HSL遺伝子の単離
森林土壌(茨城県つくば市)から複合微生物の由来のDNAを抽出し、木村らの方法(Kimura N．et al.，Microbes Environ，2010，25：133-9.)に従って、メタゲノムライブラリーを構築した。具体的には、宿主として大腸菌(Escherichia coli)EPI300株とベクターとしてフォスミド(Fosmid)ベクターを利用し、平均約40kbpの長さのDNAを含むクローン群としてのメタゲノムライブラリーを構築した。
構築したメタゲノムライブラリーをLB(Luria-bertani)液体培地で培養し、さらにC12HSLを感知する微生物センサー(Andersen，J．B．et al.，2001，Appl．Environ. Microbiol. 67：575-585)の菌体懸濁液を培養し、微生物センサーが陽性を示したクローンを得た。得られたクローンのM12株からフォスミドDNAを抽出して塩基配列の決定を行い、その結果、AHL合成遺伝子と相同性がある新規の遺伝子(ahlI遺伝子)の単離に成功した。
(Example 1) Expression of C12HSL gene by E. coli
(1-1) Isolation of C12HSL gene DNA derived from complex microorganisms was extracted from forest soil (Tsukuba City, Ibaraki Prefecture), and Kimura et al. (Kimura N. et al., Microbes Environ, 2010, 25: 133-). A metagenomic library was constructed according to 9.). Specifically, an Escherichia coli EPI300 strain as a host and a fosmid vector as a vector were used, and a metagenomic library was constructed as a clone group containing DNA having an average length of about 40 kbp.
The constructed metagenomic library is cultured in an LB (Luria-bertani) liquid medium, and a microbial sensor that senses C12HSL (Andersen, JB et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 575-585) The cell suspension was cultured to obtain a clone with a positive microbial sensor. Fosmid DNA was extracted from the obtained clone M12 and the nucleotide sequence was determined. As a result, a novel gene (ahlI gene) having homology with the AHL synthetic gene was successfully isolated.
(１−２)ahlI遺伝子による形質転換大腸菌の作製
メタゲノムクローン M12株からフォスミドDNAの塩基配列を決定し、それを鋳型としてahlI遺伝子(配列番号１)をPCRにより増幅し、pUC19ベクター(タカラバイオ社)に導入した。
PCRに用いたプライマーの配列は、次の通りである。
ahlIF-1(5’- ATGCGTAGGGTTAAAGATGTCGA-3’(配列番号３)
ahlIR-1(5’- TCA CGC CTC TGC GCC GAC CAA TC-3’(配列番号４)
pUC19ベクターは開始コドンとするATGとその上流にRBS、さらに上流にlacプロモーターを含むもので、用いる遺伝子をその開始コドンと読み枠に合わせて導入することにより、他菌株からの遺伝子でも効率的な発現が期待できるものである。構築したプラスミドを宿主としてEscherichia coli DH5alpha株へ形質転換した。
(1-2) Preparation of E. coli transformed with ahlI gene The base sequence of fosmid DNA was determined from the metagenomic clone M12 strain, and the ahlI gene (SEQ ID NO: 1) was amplified by PCR using it as a template. The pUC19 vector (Takara Bio Inc.) ).
Primer sequences used for PCR are as follows.
ahlIF-1 (5'- ATGCGTAGGGTTAAAGATGTCGA-3 '(SEQ ID NO: 3)
ahlIR-1 (5'-TCA CGC CTC TGC GCC GAC CAA TC-3 '(SEQ ID NO: 4)
The pUC19 vector contains ATG as the start codon, RBS upstream, and lac promoter upstream, and by introducing the gene to be used in accordance with the start codon and reading frame, genes from other strains are also efficient. The expression can be expected. The constructed plasmid was transformed into Escherichia coli DH5alpha strain as a host.
(１−３)形質転換大腸菌の培養と微生物細胞の集菌
実施例１で得られた組み換え大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを含む3ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
前培養した組み換え大腸菌を20L LB培地に植菌し、培養液の600nmの吸光度が0.6になったときにlacプロモーター誘導剤である１mMのIPTGを添加した。その後、37℃でさらに4時間培養した。
培養液を250ml容量の遠心チューブに入れ6,000rpmで15分遠心、集菌しペレット状の菌体を得た。
(1-3) Culture of transformed E. coli and collection of microbial cells The recombinant E. coli obtained in Example 1 was inoculated into 3 ml LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and shaken overnight at 37 ° C. Cultured.
The pre-cultured recombinant Escherichia coli was inoculated into 20 L LB medium, and 1 mM IPTG as a lac promoter inducer was added when the absorbance at 600 nm of the culture solution reached 0.6. Thereafter, the cells were further cultured at 37 ° C. for 4 hours.
The culture solution was placed in a 250 ml centrifuge tube, centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes, and collected to obtain pelleted cells.
(実施例２)C12HSL化合物の単離
(実施例１)で得られたペレット状の菌体を40mlのLB培地を加えて溶解し、80mlのエタノールを加え、10分間手動で撹拌後、8,000rpmで15分間遠心分離を行い、エタノールをガラスのバイアルに移した。イオン交換クロマトグラフィー Diaion HP-20(三菱ケミカル)を用いて化合物の分離を行った。化合物はエタノールを用いて溶出した。
得られた溶出液に対して、クロロフォルムを用いた溶媒抽出を行い、クロロフォルム層をシリカゲルカラムで精製した。展開溶媒は、クロロフォルム：メタノール＝20：1を用いた。
C12HSL化合物を感知する微生物センサーを用いてC12HSLを含む画分を特定し、さらに当該画分をシリカゲルカラムで精製し、最終的に下記の逆相高速液体クロマトグラムによりC12HSL化合物の分離を行った。
カラム ：Cosmosil 5C18-MS-II (内径4.6mm、長さ25cm、ナカライテスク社)
溶出条件：30％から100％メタノール、流速0.6ml min-1、解析時間30分
検出波長：220nm
保持時間：27.1min
Example 2 Isolation of C12HSL Compound
The pelleted cells obtained in Example 1 were dissolved by adding 40 ml of LB medium, added with 80 ml of ethanol, manually stirred for 10 minutes, and then centrifuged at 8,000 rpm for 15 minutes. Transferred to a glass vial. The compounds were separated using ion exchange chromatography Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical). The compound was eluted using ethanol.
The obtained eluate was subjected to solvent extraction using chloroform, and the chloroform layer was purified with a silica gel column. As the developing solvent, chloroform: methanol = 20: 1 was used.
A fraction containing C12HSL was identified using a microorganism sensor that senses the C12HSL compound, the fraction was further purified with a silica gel column, and finally the C12HSL compound was separated by the following reversed-phase high-performance liquid chromatogram.
Column: Cosmosil 5C 18 -MS-II (inner diameter 4.6 mm, length 25 cm, Nacalai Tesque)
Elution conditions: 30% to 100% methanol, flow rate 0.6ml min-1, analysis time 30 minutes Detection wavelength: 220nm
Retention time: 27.1min
(実施例３)C12HSL化合物の同定
(実施例２)で単離されたC12HSL化合物を、下記の分析条件で同化合物の核磁気共鳴スペクトルを核磁気共鳴装置(NMR)JEOL社 JNM-A500を用いて行ったところ、図１と図２に示す値が得られた。
分析条件：500MHz for 1H，125MHz for 13C in CDCl3
次いで、同化合物の旋光性をDIP-1000デジタル旋光計(Jasco社)を用いて行ったところ、立体配置は2Sという値が得られた。
さらに、FAB質量分析装置(FAB MS)(JEOL社 JMS-700 MStation)を用いて質量分析(マトリックスとしてグリセロールを使用)を行ったところ、図３に示す値が得られた。
Example 3 Identification of C12HSL Compound
The C12HSL compound isolated in Example 2 was subjected to a nuclear magnetic resonance spectrum of the compound under the following analytical conditions using a nuclear magnetic resonance apparatus (NMR) JEOL JNM-A500. The value shown in 2 was obtained.
Analysis conditions: 500MHz for 1 H, 125MHz for 13 C in CDCl 3
Subsequently, when the optical rotation of the compound was performed using a DIP-1000 digital polarimeter (Jasco), the configuration had a value of 2S.
Further, mass spectrometry (using glycerol as a matrix) was performed using a FAB mass spectrometer (FAB MS) (JEOL JMS-700 MStation), and the values shown in FIG. 3 were obtained.
以上の解析結果から、(実施例１)で得られたahlI遺伝子を発現する組換え大腸菌が生産するAHL化合物は、FAB MSや旋光計、NMRの計測からC12HSLと同定された。
すなわち、(実施例１)で得られたahlI遺伝子が、式(２)のC12HSL合成酵素遺伝子であることが示された。
From the above analysis results, the AHL compound produced by recombinant Escherichia coli expressing the ahlI gene obtained in (Example 1) was identified as C12HSL from FAB MS, polarimeter, and NMR measurement.
That is, it was shown that the ahlI gene obtained in (Example 1) is the C12HSL synthase gene of formula (2).
本発明により、QS機構による微生物の病原性発現の調節作用が注目されるC12HSLの安価で安定かつ効率的な供給が可能となり、将来的に医療分野や工業分野など幅広い応用が期待されている。 According to the present invention, it is possible to supply C12HSL, which is attracting attention for the regulation of virulence expression of microorganisms by the QS mechanism, at low cost and stably and efficiently, and is expected to be widely applied in the medical field and industrial field in the future.
Claims (7)
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(ｃ)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％のホモロジーを有するアミノ酸配列。 A protein comprising any one of the amino acid sequences shown in (a) to (c) below and having dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase activity;
(a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(c) an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ａ)配列番号２に示される塩基配列、
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と少なくとも80％のホモロジーを有する塩基配列。 A nucleic acid encoding a protein comprising any of the base sequences shown in the following (a) to (c) and having dodecanoyl homoserine lactone (C12HSL) synthase activity;
(a) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(b) a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions;
(c) a base sequence having at least 80% homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
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