JP2013540439A - 核酸を断片化する方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
流入口として使用するピペットチューブにチャネル及び剪断オリフィスを装着し、微量遠心管内に置いて、上記に記載される実施形態に係る処理装置を形成した。濃度50マイクログラム/ミリリットルの48kbpの出発核酸サイズを有するラムダDNAの試料を、処理装置のピペットチューブに導入した。装置を遠心機に挿入し、次に遠心機を、7,000rpm、8,000rpm、9,000rpm、10,000rpm、11,000rpm、12,000rpm、13,000rpm及び14,500rpmの種々の速度で動作させた。図22に示されるとおり、断片化されたDNAの結果をゲル電気泳動分析によって未処理の試料DNAと比較した。このDNA試料に対して遠心機を約11,000rpm〜約14,500rpmの速度で動作させると、平均核酸サイズが約10kbpのDNAが得られたことが観察された。また、この処理装置に対して遠心機を高速で動作させるほど、DNA断片化の増加がもたらされたことも観察された。
実施例1に記載されるものと同じ処理装置を使用して、様々な濃度の200マイクロリットルのラムダDNA及び大腸菌(E.Coli)DNAを、13,000rpmで動作する遠心機を用いて処理した。ラムダDNAの濃度は、50マイクログラム/ミリリットル、100マイクログラム/ミリリットル、及び200マイクログラム/ミリリットルであった。大腸菌(E.Coli)DNAの濃度は、25マイクログラム/ミリリットル、100マイクログラム/ミリリットル、及び200マイクログラム/ミリリットルであった。図23に示されるとおり、処理後のラムダ及び大腸菌(E.Coli)試料の断片化されたDNAは、約10kbpの平均核酸サイズとなった。
実施例1に記載されるものと同様の、但し剪断オリフィスの直径が異なる4つの処理装置を作成した。すなわち、直径は10ミクロン、20ミクロン、30ミクロン及び50ミクロンであった。処理装置にラムダDNAを充填して遠心機に置き、次に遠心機を10,000rpm及び14,000rpmで動作させた。10,000rpmでは、20ミクロン径及び30ミクロン径の剪断オリフィスについての処理後の平均核酸サイズは、それぞれ約6.4kbp及び約7.0kbpであった。14,000rpmでは、10ミクロン径、20ミクロン径、30ミクロン径及び50ミクロン径の剪断オリフィスについての処理後の平均核酸サイズは、それぞれ約5.2kbp、約5.2kbp、約6.0kbp及び約9.0kbpであった。この処理装置に使用する剪断オリフィスの直径が小さいほど、DNA断片化が増加したことが観察された。また、遠心機を高速で動作させるほど、同様にDNAが断片化される量が増加したことも観察された。
10ミクロン径による剪断を備える実施例3の処理装置を使用して、12,000rpmの定常遠心速度で処理する間の液体試料の流量を計測した。図24及び図25に示されるとおり、断片化プロセスの大半において処理装置を通じる流量に認められる低下は僅かであり、概して比較的一定の流量であると見なされた。流入リザーバに残る液体試料が10マイクロリットル未満になると、流量は大幅に低下したが、10マイクロリットルを超える液体試料の容積については、流量は約1.0マイクロリットル/秒〜約3.0マイクロリットル/秒の範囲でほぼ一貫していた。
図17及び図18に記載した実施形態に係る2つの剪断オリフィスを有する処理装置を使用し、これらは剪断オリフィス間で径方向距離及び試料高さが異なった。直径が50ミクロン、40ミクロン、35ミクロン及び30ミクロンの剪断オリフィスもまた評価した。以下の表は、処理装置において2つの異なる位置に位置決めした剪断オリフィスに対応する最小流量を、剪断オリフィスのそれぞれの直径と共に示す。剪断オリフィスの位置が変わると、遠心機の回転軸からの径方向距離が変化し、剪断オリフィスを通る流量に影響が及び得る。加えて、剪断オリフィスを通る流量は、概してオリフィスの直径が大きいほど高くなることが観察された。
図19〜図20Bにおいて記載した実施形態に係る処理装置を製造した。すなわち、この装置は、第1の位置で処理した後、装置が反転して底側が上を向き、且つ上側が下に向いた第2の位置で処理することが可能である。MG DNA及びラムダDNAを1回、2回、及び4回処理し、ここで装置は、連続する処理ステップ毎に向きを反転させた。すなわち、4回処理した場合、装置は向きを3回反転させ、2回処理した場合、装置は1回反転させ、及び1回処理した場合、装置の向きは反転させなかった。加えて、各処理ステップの間、遠心機は7,000rpmで動作させた。図27に示されるとおり、MG DNA及びラムダDNAを含む試料を4回処理すると、平均核酸サイズが約10kbpの狭い分布が生じたことが観察された。
Claims (46)
- 試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置であって、
核酸を含む前記試料を受け入れる流入部分と、
前記流入部分と流体連通するチャネルであって、容積を有するチャネルと、
前記チャネルと流体連通する剪断領域であって、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に前記試料中の前記核酸を断片化するように構成された剪断領域において、前記流入部分及び前記チャネルは、試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記チャネル容積の少なくとも2倍の試料容積を有する試料に対して、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、剪断領域と、
前記剪断領域と流体連通し、断片化された前記核酸を含む試料を前記剪断領域から受け取る回収部分であって、前記流入部分、前記チャネル、前記剪断領域及び当該回収部分は、核酸を含む前記試料を前記流入部分から前記チャネル及び前記剪断領域を通して当該回収部分へと移動させるために、フローアクチュエータと共に使用するように配置構成される、回収部分、とを備える装置。 - 前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に、40kbp〜1Gbpの平均核酸サイズから約5kbp〜約20kbpの平均核酸サイズへの前記試料中の核酸の断片化を生じさせるように構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の前記進入口の圧力を初期圧力の約40%以下の範囲内に維持するように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記チャネルは約5mm〜約20mmの長さを有する、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、ほぼ一定の試料高さを維持するように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の容積流量を維持するように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口の容積流量を初期容積流量の約50%以内に維持するように配置構成される、請求項6に記載の装置。
- 前記流入部分の断面積は前記チャネルの断面積の5倍以上である、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記チャネル容積の少なくとも5倍の試料容積を有する試料に対して、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記剪断領域を通って流れる試料の速度が、試料が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分内を流れる試料の速度より大きくなるように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れる方向と垂直な角度を形成する壁を有する進入口部分を備える、請求項1に記載の装置。
- 前記フローアクチュエータは遠心機を備える、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分、前記チャネル、前記剪断領域及び前記回収部分は、前記遠心機において第1の向き又は前記第1の向きに対して反転させた第2の向きのいずれかで使用されるように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記剪断領域は、直列構成で配置された複数のオリフィスを備える、請求項1に記載の装置。
- 前記複数のオリフィスは第1オリフィスと第2オリフィスとを含み、前記第1オリフィスは前記第2オリフィスより大きい断面積を有する、請求項14に記載の装置。
- 前記試料は細胞を含み、前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れるときに前記細胞の溶解を生じさせるように配置構成される、請求項1に記載の装置。
- 前記剪断領域のうち前記試料と接触する部分は、ガラス、サファイア、ルビー、金属又はセラミックのなかの少なくとも1つを含む材料から形成される、請求項1に記載の装置。
- 前記剪断領域は、約10ミクロン〜約100ミクロンの幅及び約100ミクロン〜約20mmの長さを有するオリフィスを備える、請求項1に記載の装置。
- 前記流入部分は、核酸を含む前記試料を受け入れる漏斗形のリザーバを含む、請求項1に記載の装置。
- 試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置であって、
核酸を含む前記試料を受け入れる流入口と、
前記流入口と流体連通する剪断領域であって、試料が前記剪断領域を通って流れると同時に前記試料中の前記核酸を断片化するように構成された剪断領域と、
前記剪断領域と流体連通し、前記断片化された核酸を含む試料を前記剪断領域から受け取る回収部分であって、前記流入口、前記剪断領域及び当該回収部分は、遠心機において第1の向き又は前記第1の向きに対して反転させた第2の向きのいずれかで使用するように配置構成される回収部分と、を備える装置。 - 前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に、40kbp〜1Gbpの平均核酸サイズから約5kbp〜約20kbpの平均核酸サイズへの前記試料中の核酸の断片化を生じさせるように構成される、請求項20に記載の装置。
- 前記第1の向きは、遠心機の回転中心から離れる方向を向く第1の端部と、前記遠心機の回転中心に向かう方向を向く第2の端部と、を含み、前記第2の向きは、前記遠心機の回転中心から離れる方向を向く前記第2端部と、前記遠心機の回転中心に向かう方向を向く前記第1端部と、を含む、請求項20に記載の装置。
- 前記回収部分は、前記断片化された核酸を含む前記試料を前記剪断領域から受け取るための蓋を備える、請求項20に記載の装置。
- 前記流入部分は、前記核酸を含む試料を受け入れる漏斗形のリザーバを含む、請求項20に記載の装置。
- 前記試料は細胞を含み、前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れるときに前記細胞の溶解を生じさせるように配置構成される、請求項20に記載の装置。
- 前記剪断領域のうち前記試料と接触する部分は、ガラス、サファイア、ルビー、金属又はセラミックのなかの少なくとも1つを含む材料から形成される、請求項20に記載の装置。
- 前記剪断領域は、約10ミクロン〜約100ミクロンの幅及び約100ミクロン〜約20mmの長さを有するオリフィスを備える、請求項20に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記剪断領域と流体連通するチャネルをさらに備え、前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、請求項20に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、一定の試料高さを維持するように配置構成される、請求項28に記載の装置。
- 前記チャネルは約5mm〜約20mmの長さを有する、請求項28に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の容積流量を維持するように配置構成される、請求項28に記載の装置。
- 前記流入部分及び前記チャネルは、前記剪断領域を通って流れる試料の速度が、試料が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分内を流れる試料の速度より大きくなるように配置構成される、請求項20に記載の装置。
- 試料中に含まれる核酸を断片化する方法であって、
核酸を含む前記試料を少なくとも1つの処理装置の流入部分に提供するステップと、
前記少なくとも1つの処理装置の前記流入部分から剪断領域を通して第1の方向に前記試料を流れさせるステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れる際に前記試料中の核酸に剪断力を加えて前記核酸を断片化するステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域に至る進入口で比較的一定の圧力を維持するステップと、
断片化された核酸を含む前記試料を回収領域に回収するステップと、を含む方法。 - 前記試料中の前記核酸に剪断力を加えるステップは、約40kbp〜1Gbpの初期平均核酸サイズを有する核酸を約5kbp〜約20kbpの平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 核酸に剪断力を加えるステップは、前記試料中の前記核酸を、前記流入部分に提供される前記試料の初期平均核酸サイズの半分以下の最終平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置の前記剪断領域を通して前記試料を少なくとも2回流れさせるステップをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置を第1の向きから第2の向きに反転させて、前記少なくとも1つの処理装置の前記剪断領域を通して前記第1の方向と逆の第2の方向に前記試料を流れさせるステップをさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、比較的一定の容積流量で剪断領域を通る前記試料の流れを引き起こすステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、比較的一定の容積流量で前記剪断領域を通る前記試料の流れを引き起こすステップは、初期容積流量の約50%以内にとどまる速度で前記試料を前記剪断領域に通して流すステップを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域と流体連通している前記試料の一定の試料高さを維持するステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分を流れる前記試料の速度より大きい速度で試料を前記剪断領域に通して流すステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 試料中に含まれる核酸を断片化する方法であって、
核酸を含む前記試料を少なくとも1つの処理装置の流入部分に提供するステップと、
遠心機が発生する力によって、前記少なくとも1つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れる際に前記試料中の核酸に剪断力を加えて前記核酸を約10kbp未満の平均核酸サイズに断片化するステップと、
断片化された核酸を含む前記試料を回収領域に回収するステップと、を含む方法。 - 前記試料中の前記核酸に剪断力を加えるステップは、約40kbp〜1Gbpの初期平均核酸サイズを有する核酸を約10kbp未満の平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項42に記載の方法。
- 核酸に剪断力を加えるステップは、前記試料中の前記核酸を、前記流入部分に提供される前記試料の初期平均核酸サイズの半分以下の最終平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理装置を第1の向きから第2の向きに反転させ、前記少なくとも1つの処理装置の前記剪断領域を通して前記第1の方向と逆の第2の方向に前記試料を流れさせるステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域に至る進入口で比較的一定の圧力を維持するステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。
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