JP2013539974A - Mannosidase capable of uncapping and demannosylating phosphorylated N-glycans from mannose-1-phospho-6-mannose linkages and methods for promoting glycoprotein uptake by mammalian cells - Google Patents

Mannosidase capable of uncapping and demannosylating phosphorylated N-glycans from mannose-1-phospho-6-mannose linkages and methods for promoting glycoprotein uptake by mammalian cells Download PDF

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Abstract

本発明は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分のキャップを外すことができかつリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化することのできるマンノシダーゼ、このようなマンノシダーゼを使用する方法、該方法を使用して産生される糖タンパク質、および糖タンパク質の哺乳類細胞への取り込みを促進する方法を提供する。糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、ａ）マンノース−６−リン酸部分が脱マンノシル化した糖タンパク質を提供する工程と、ｂ）該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程とを含む、方法。The present invention relates to a mannosidase capable of uncapping the mannose-1-phospho-6-mannose moiety and demannosylating phosphorylated N-glycans, a method using such a mannosidase, using the method And a method for promoting the uptake of the glycoprotein into mammalian cells. A method of directing a glycoprotein to the interior of a mammalian cell comprising: a) providing a glycoprotein demannosylated at the mannose-6-phosphate moiety; and b) contacting the cell with the demannosylated glycoprotein. Comprising the step of:

Description

本発明は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することができかつ、（ｉｉ）このようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼに関する。本発明は、糖タンパク質の哺乳類細胞への取り込みを促進する方法にも関する。   The present invention is capable of (i) hydrolyzing a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to phospho-6-mannose, and (ii) such phosphates. Terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety, and / or Alternatively, it relates to a mannosidase that can hydrolyze the α-1,6 mannose moiety. The present invention also relates to a method for promoting uptake of glycoproteins into mammalian cells.

高性能発現系は、現に開発下にある大部分の生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（例えば、組換えタンパク質）を産生するのに必要とされる。これらの生物薬剤のうちの多くの生物活性は、それらの翻訳後修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に左右される。酵母を基にした発現系は、微生物の遺伝子操作および発酵の簡便さを、タンパク質を分泌および改変する能力と組み合わせている。しかしながら、酵母細胞において産生された組換え糖タンパク質は、主として異種性の高マンノースおよび過剰マンノースのグリカン構造を示し、該構造は、タンパク質の機能、下流のプロセシング、およびその後の治療的使用に有害である可能性があり、特に酵母細胞においては、グリコシル化は生物学的に重要な役割を担っている。   High performance expression systems are required to produce most biopharmaceuticals (eg, recombinant proteins) currently under development. Many of these biological agents depend on their post-translational modifications (eg, phosphorylation or glycosylation). Yeast-based expression systems combine the ease of microbial genetic manipulation and fermentation with the ability to secrete and modify proteins. However, recombinant glycoproteins produced in yeast cells exhibit predominantly heterogeneous high mannose and excess mannose glycan structures that are detrimental to protein function, downstream processing, and subsequent therapeutic use. There is a possibility, especially in yeast cells, where glycosylation plays an important biological role.

本文書は、とりわけ、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノース（本明細書においては「マンノース−６−リン酸」とも呼ばれる）に加水分解する（「キャップを外す」）ことができかつ、このようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解する（「脱マンノシル化する」）ことのできるマンノシダーゼの発見、ならびに（ｉｉ）（個別の酵素または単一の酵素のいずれかによる）キャップを外すことおよび脱マンノシル化の両方が糖タンパク質の哺乳類細胞への取り込みを達成するために必要とされるという発見を基にしている。   This document describes, inter alia, (i) a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety as a phospho-6-mannose (herein “mannose-6-phosphate”). The terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1, of such a phosphate-containing glycan that can be hydrolyzed (also “uncapped”). Discovery of mannosidases capable of hydrolyzing ("demannosylating") 6 mannose linkages or terminal α-1,2 mannose moieties, α-1,3 mannose moieties, and / or α-1,6 mannose moieties; And (ii) both uncapping and demannosylation (either by individual enzymes or a single enzyme) are sugars It is based on the discovery that is required to achieve the incorporation into protein in mammalian cells.

一態様においては、本文書は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分のキャップを外して、糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化するための方法を特色にする。上記方法は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程、ならびに該糖タンパク質を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程を含む。上記マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼであり得る。上記マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来であり得る。   In one aspect, this document is for demannosylating phosphorylated N-glycans in glycoproteins by uncapping the mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety. Featuring the method of The method comprises providing a glycoprotein having a phosphorylated N-glycan containing a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or a mannose-1-phospho-6-mannose moiety, as well as (i) ) Capable of hydrolyzing the mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to mannose-6-phosphate and (ii) the terminal α-1,2 mannose linkage, α −1,3 mannose bond and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety and / or α-1,6 mannose moiety is hydrolyzed Contacting with a mannosidase capable of The mannosidase can be a family 38 glycosyl hydrolase. The mannosidase can be derived from Canavalia ensiformis or Yarrowia lipolytica.

本文書は、リン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する方法も特色にする。本方法は、リン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を提供する工程、ならびに該糖タンパク質を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくは末端α−１，６マンノース結合またはα−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程を含む。上記マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼであり得る。上記マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来であり得る。   This document also features a method for demannosylating phosphorylated N-glycans. The method comprises the steps of providing a glycoprotein comprising phosphorylated N-glycans, as well as (i) mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties as mannose. Can be hydrolyzed to -6-phosphate and (ii) terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or terminal α-1,6 mannose bond or α-1,2 Contacting the mannose moiety, the α-1,3 mannose moiety, and / or the α-1,6 mannose moiety with a mannosidase capable of hydrolyzing. The mannosidase can be a family 38 glycosyl hydrolase. The mannosidase can be derived from Canavalia ensiformis or Yarrowia lipolytica.

本明細書に記載されている方法はさらに、提供工程および接触工程の後に、哺乳類細胞を、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質と接触させる工程であって、ここで、該接触後、該糖タンパク質は該哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の内部に輸送される工程を含むことができる。   The methods described herein further comprise contacting the mammalian cell with a glycoprotein comprising a demannosylated phosphorylated N-glycan after the providing and contacting steps, wherein the contacting Later, the glycoprotein can include a step of being transported inside the mammalian cell (eg, a human cell).

本明細書に記載されている方法はさらに、上記方法において産生される糖タンパク質を単離する工程を含むことができる。上記タンパク質は、真菌において発現するヒトタンパク質であり得る。例えば、真菌は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。上記真菌は、   The methods described herein can further comprise isolating the glycoprotein produced in the method. The protein can be a human protein expressed in fungi. For example, the fungus can be Yarrowia lipolytica or Arxula adeninivorans. The fungus is

Figure 2013539974
Figure 2013539974

上記タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。例えば、上記リソソームタンパク質は、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）と関連したリソソーム酵素のようなリソソーム酵素であり得る。ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症（Ｇｅｌｅｏｐｈｙｓｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）であり得る。 The protein can be a pathogen protein, lysosomal protein, growth factor, cytokine, chemokine, antibody or antigen-binding fragment thereof, or a fusion protein. For example, the lysosomal protein can be a lysosomal enzyme, such as a lysosomal enzyme associated with lysosomal storage disorders (LSD). LSD is Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick disease , Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilip's disease, Morquio's disease, Marlotho's disease, hyaluronidase deficiency, aspartylglucosamineuria, fucose accumulation disease, mannose accumulation disease, Schindler's disease, type 1 sialidosis, Pompe disease, concentrated heterogeneity , Ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid accumulation disorder, chylomicron accumulation disease with marinesco-sjogren's syndrome, hermannsky Padorakku syndrome, Chediak-Higashi syndrome, may be Danon disease, or happiness facial bone dysplasia (Geleophysic dysplasia).

本文書は、真菌におけるキャップを外されたマンノース−６−リン酸結合またはマンノース−６−リン酸部分および脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する標的タンパク質を産生する方法も特色にする。上記方法は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノース部分に加水分解することができかつこのようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞を提供する工程、ならびに標的タンパク質をコードする核酸を該細胞へ導入する工程を含む。   This document also features a method of producing a target protein having an uncapped mannose-6-phosphate bond or mannose-6-phosphate moiety and a demannosylated phosphorylated N-glycan in a fungus. The above method can hydrolyze a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to a phospho-6-mannose moiety and the terminal α- of such phosphate-containing glycans. 1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety, and / or α-1,6 Providing a fungal cell genetically engineered to contain a nucleic acid encoding a mannosidase capable of hydrolyzing a mannose moiety, and introducing a nucleic acid encoding a target protein into the cell.

本文書は、キャップを外されたマンノース−６−リン酸および脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞も特色にする。上記真菌細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。上記真菌細胞は、   This document also features isolated fungal cells that have been genetically engineered to produce glycoproteins that include uncapped mannose-6-phosphate and demannosylated phosphorylated N-glycans. The fungal cell can be Yarrowia lipolytica or Arxula adeninivorans. The fungal cell is

Figure 2013539974
Figure 2013539974

上記真菌細胞は、マンノシダーゼをコードする核酸を含むことができ、該マンノシダーゼは（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することできる。上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作され得る。上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、ここで、該真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作される。上記マンノシダーゼは、該マンノシダーゼを細胞内区画へ導くための分泌シグナルおよび／またはターゲッティングシグナルを含むことができる。 The fungal cell can comprise a nucleic acid encoding a mannosidase, wherein the mannosidase comprises (i) a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or a mannose-1-phospho-6-mannose moiety as a mannose-6-phosphate. And (ii) a terminal α-1,2 mannose bond, an α-1,3 mannose bond, and / or an α-1,6 mannose bond or a terminal α-1,2 mannose moiety, α- The 1,3 mannose moiety and / or the α-1,6 mannose moiety can be hydrolyzed. The fungal cell can further comprise a nucleic acid encoding a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation. The fungal cell can be genetically engineered to lack OCH1 activity. The fungal cell can further comprise a nucleic acid encoding a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation, wherein the fungal cell is genetically engineered to be deficient in OCH1 activity. The mannosidase can include a secretion signal and / or a targeting signal for directing the mannosidase to the intracellular compartment.

真菌細胞はさらに、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸を含むことができる。上記標的タンパク質はヒトタンパク質であり得る。上記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。上記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素であり得る。上記標的タンパク質は、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症のようなＬＳＤと関連したタンパク質であり得る。   The fungal cell can further comprise a nucleic acid encoding a target protein that is a glycoprotein. The target protein can be a human protein. The target protein can be a pathogen protein, lysosomal protein, growth factor, cytokine, chemokine, antibody or antigen-binding fragment thereof, or a fusion protein. The lysosomal protein can be a lysosomal enzyme. The target proteins are Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann Pick's disease, Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilipo's disease, Morquio's disease, Malrotor's disease, hyaluronidase deficiency, aspartylglucosamineuria, fucose accumulation disease, mannose accumulation disease, Schindler's disease, type 1 sialidosis, Pompe disease, concentration Dysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid accumulation disorder, chylomicron accumulation disease with marinesco-sjogren syndrome, F Man-Pudlak syndrome, Chediak-Higashi syndrome, may be a protein associated with LSD, such as Danone's disease, or happiness facial bone dysplasia.

マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、ＭＮＮ４ポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｌｙｔｉｃａポリペプチド、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリペプチド、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａポリペプチド、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓポリペプチド、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓポリペプチド）であり得る。マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１ポリペプチドであり得る。   The polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation can be a MNN4 polypeptide (eg, Yarrowia liplytica polypeptide, S. cerevisiae polypeptide, Ogataea minuta polypeptide, Pichia pastoris polypeptide, or C. albicans polypeptide). . Polypeptides capable of promoting mannosyl phosphorylation are pastoris PNO1 polypeptide.

さらに別の態様においては、本文書は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞、Ｏｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ細胞の実質的に純粋な培養物を特色にし、かなりの数の該細胞が遺伝子操作されて、キャップを外されたマンノース−６−リン酸結合またはキャップを外されたマンノース−６−リン酸部分および脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を生成する。かなりの数とは、上記培養物における生細胞の総数の約４０％超が遺伝子操作されていることを示す。上記細胞は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ、（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むことができる。上記細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作され得る。上記細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、かつＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作され得る。上記マンノシダーゼは、該マンノシダーゼを細胞内区画へ導くための分泌シグナルおよび／またはターゲッティングシグナルを含むことができる。   In yet another aspect, the document may include a Yarrowia lipolytica cell, a Pichia pastoris cell, a Hansenula polymorpha cell, an Ogataea minuta cell, a Pichia methanolica cell, an Arxula adenulins cell, A significant number of the cells are engineered to contain uncapped mannose-6-phosphate linkages or uncapped mannose-6-phosphate moieties and demannosylated phosphorylated N-glycans To produce glycoproteins. A significant number indicates that more than about 40% of the total number of living cells in the culture has been genetically engineered. The cell is capable of (i) hydrolyzing a mannose-1-phospho-6-mannose bond or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to mannose-6-phosphate, and (ii) a terminal α- 1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety, and / or α-1,6 Nucleic acids encoding mannosidases that can hydrolyze the mannose moiety can be included. The cell can further include a nucleic acid encoding a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation. The cells can be genetically engineered to lack OCH1 activity. The cell can further include a nucleic acid encoding a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation and can be genetically engineered to be deficient in OCH1 activity. The mannosidase can include a secretion signal and / or a targeting signal for directing the mannosidase to the intracellular compartment.

本文書は、糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法も特色にする。上記方法は、マンノース−６−リン酸結合が脱マンノシル化した糖タンパク質を提供する工程、および該細胞を脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程を含む。上記糖タンパク質は、ファミリー４７またはファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼを使用して脱マンノシル化され得る。上記糖タンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化され得る。上記糖タンパク質は、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のマンノシダーゼのようなファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼを使用して脱マンノシル化され得る。   This document also features a method for directing glycoproteins into the interior of mammalian cells. The method includes providing a glycoprotein demannosylated with mannose-6-phosphate linkages and contacting the cell with a demannosylated glycoprotein. The glycoprotein may be demannosylated using a family 47 or family 92 glycosyl hydrolase. The glycoprotein can be demannosylated using a mannosidase from Aspergillus satoi or Cellulosimicrobium cellulans. The glycoproteins can be demannosylated using a family 38 glycosyl hydrolase, such as a mannosidase from Canavaria ensiformis or Yarrowia lipolytica.

別の態様においては、本文書は、糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法を特色にする。上記方法には、上記細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない、リン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程と、該糖タンパク質を、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程であって、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に脱マンノシル化した糖タンパク質を生成し、ここで、該脱マンノシル化の後、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する工程と、該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程とが含まれる。上記糖タンパク質は、ファミリー４７またはファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼを使用して脱マンノシル化され得る。上記マンノシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来であり得る。上記糖タンパク質は、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のマンノシダーゼのようなファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼを使用して脱マンノシル化され得る。   In another aspect, this document features a method of directing a glycoprotein to the interior of a mammalian cell. The method includes the steps of providing a glycoprotein having phosphorylated N-glycans that do not substantially bind to the cellular mannose-6-phosphate receptor; Contacting the linked or terminal α-1,2 mannose moiety with a mannosidase capable of hydrolyzing to produce a demannosylated glycoprotein when the underlying mannose is phosphorylated, wherein: Following the demannosylation, the glycoprotein comprises substantially binding to the mannose-6-phosphate receptor of the cell and contacting the cell with the demannosylated glycoprotein. The glycoprotein may be demannosylated using a family 47 or family 92 glycosyl hydrolase. The mannosidase can be derived from Aspergillus satoi or Cellulosimicrobium cellulans. The glycoproteins can be demannosylated using a family 38 glycosyl hydrolase, such as a mannosidase from Canavaria ensiformis or Yarrowia lipolytica.

なおも別の態様においては、本文書は、糖タンパク質を、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する第二の形態へ変換する工程であって、ここで、該第一の形態においては、該糖タンパク質は、６位にリン酸残基を含有するマンノース残基に１位で結合する１つ以上の末端マンノース残基を含有する１つ以上のＮ−グリカンを含む。上記方法は、上記第一の形態の糖タンパク質を、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触させる工程を含む。上記マンノシダーゼは、キャップを外す活性および脱マンノシル化する活性を有することができる。例えば、上記マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来であり得る。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼは、キャップを外す活性を有していない（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ）。   In yet another aspect, the document provides a mammalian cell mannose-6-phosphate receptor from a first form that does not substantially bind the glycoprotein to a mammalian cell mannose-6-phosphate receptor. Wherein the glycoprotein is in position 1 on a mannose residue containing a phosphate residue in position 6; One or more N-glycans containing one or more terminal mannose residues attached at The method includes contacting the first form of glycoprotein with a mannosidase that demannosylates a terminal mannose residue. The mannosidase can have uncapping activity and demannosylation activity. For example, the mannosidase can be derived from Canavalia ensiformis or Yarrowia lipolytica. In some embodiments, the mannosidase has no uncapping activity (eg, a mannosidase from Aspergillus satoi or Cellulosimicrobium cellulans).

本文書は、１つ以上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含む糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法も特色にする。上記方法は、（ａ）該糖タンパク質における該１つ以上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸へとキャップを外す工程であって、ここで、キャップを外した後、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない工程および、工程（ａ）の後、（ｂ）該糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する工程であって、ここで、該キャップを外す工程および該脱マンノシル化する工程の両者の後に、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する工程、の後に該細胞を該糖タンパク質と接触させる工程を含む。工程（ａ）および工程（ｂ）は、２つの異なる酵素（例えば、ＣｃＭａｎ５のようなＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ、およびＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼ）によって、または単一の酵素によって触媒され得る。   This document also features a method of directing glycoproteins containing one or more mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties to the interior of mammalian cells. The method comprises (a) uncapping the one or more mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties in the glycoprotein to mannose-6-phosphate. Wherein, after uncapping, the glycoprotein does not substantially bind to the mannose-6-phosphate receptor of the cell, and after step (a), (b) the glycoprotein Demannosylating phosphorylated N-glycans in the cell, wherein after both the uncapping step and the demannosylation step, the glycoprotein is mannose-6-phosphate acceptor of the cell Substantially binding to the body, followed by contacting the cell with the glycoprotein. Step (a) and step (b) can be catalyzed by two different enzymes (eg, Cellulosimicrobium cellulans mannosidase such as CcMan5, and Canavalia ensiformis mannosidase) or by a single enzyme.

別の態様においては、本文書は、糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法を特色にする。上記方法には、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程、および該哺乳類細胞を該糖タンパク質と接触させる工程が含まれる。   In another aspect, this document features a method of directing a glycoprotein to the interior of a mammalian cell. The method includes providing a glycoprotein having uncapped and demannosylated phosphorylated N-glycans, and contacting the mammalian cell with the glycoprotein.

本明細書に記載される方法においては、前記糖タンパク質はヒトタンパク質であり得る。   In the methods described herein, the glycoprotein can be a human protein.

本明細書に記載される方法においては、前記糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。上記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素（例えば、酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼ）であり得る。上記糖タンパク質は、ＬＳＤ（例えば、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症）と関連し得る。   In the methods described herein, the glycoprotein can be a pathogen protein, lysosomal protein, growth factor, cytokine, chemokine, antibody or antigen-binding fragment thereof, or a fusion protein. The lysosomal protein can be a lysosomal enzyme (eg, acid alpha glucosidase or alpha galactosidase). The glycoprotein is LSD (for example, Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic white matter) Dystrophy, Niemann-Pick disease, Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilip's disease, Morquio's disease, Maroto Lamy's disease, hyaluronidase deficiency, aspartylglucosamineuria, fucose accumulation disease, mannose accumulation disease, Schindler disease, type 1 sialidosis, Pompe Disease, concentrating dysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid accumulation disorder, cairomic with marinesco-sjogren syndrome Down storage diseases, Hermann-Pudlak syndrome, Chediak-Higashi syndrome, Danon disease, or happiness facial bone dysplasia) and may be related.

本文書は、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかで処理されている、哺乳類細胞の内部へ輸送することのできる糖タンパク質、およびこのような糖タンパク質を含む哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）も特色にする。別の態様においては、本文書は、このような糖タンパク質を投与することを必要とする被験体へ該糖タンパク質を投与する工程を含む処置の方法を特色にする。   This document describes glycoproteins that can be transported into the interior of mammalian cells, treated with any of the methods described herein, and mammalian cells containing such glycoproteins (eg, Human cells) are also featured. In another aspect, this document features a method of treatment comprising administering the glycoprotein to a subject in need of administering such glycoprotein.

別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を下記に説明する。本明細書において記載されている刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号、および他の参考文献はすべて、それらの内容が全体として参照により援用されている。矛盾する場合においては、定義を含む本出願が支配する。材料、方法、および実施例は、例示的であるに過ぎず、制限するよう意図するものではない。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, exemplary methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, Genbank® accession numbers, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present application, including definitions, will control. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかである。   Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims.

図１Ａは、太字のｌｉｐ２プレ配列を有するヒトαグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１）の記述である。FIG. 1A is a description of the codon optimized nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of human α-glucosidase (GAA) with bold lip2 presequence. 図１Ｂは、太字のｌｉｐ２プレ配列を有するヒトＧＡＡのアミノ酸配列（配列番号２）の記述であり、ここで＊は、終止コドンを表す。FIG. 1B is a description of the amino acid sequence of human GAA (SEQ ID NO: 2) having a bold lip2 presequence, where * represents a stop codon. 図２は、ｈｕＧＡＡのクローン化に使用したＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現ベクターの概略図である。FIG. 2 shows Y. cerevisiae used for cloning of huGAA. 1 is a schematic diagram of a lipolytica expression vector. FIG. 図３Ａは、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＡＭＳ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号３）の記述である。FIG. 3A is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the open reading frame (ORF) of Yarrowia lipolytica AMS1 with a C-terminal His tag. 図３Ｂは、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＡＭＳ１のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４）の記述である。FIG. 3B is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) of the ORF of Yarrowia lipolytica AMS1 with an N-terminal His tag. 図３Ｃは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＡＭＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）の記述である。FIG. 3C is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the Yarrowia lipolytica AMS1 polypeptide. 図４は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ８）、一リン酸化ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（ＭＰ−Ｍ８）、および／または二リン酸化（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（（ＭＰ）２−Ｍ８）糖（ＭＮＮ４糖またはＭＮＮ４ Ｎ−グリカンと呼ぶ）を含有する、ＭＮＮ４を過剰発現するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株に由来する、８−アミノ−１，３，６−ピレントリスルホン酸（ＡＰＴＳ）標識した糖からの潜在的な最終加水分解産物の概略図であり、α−マンノシダーゼはまたマンノース残基をＭＮＮ４ Ｎ−グリカンから完全に除去することができると仮定している。FIG. 4 shows Man 8 GlcNAc 2 (M8), monophosphorylated ManP-Man 8 GlcNAc 2 (MP-M8), and / or diphosphorylated (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 ((MP) 2 -M8) From an 8-amino-1,3,6-pyrenetrisulfonic acid (APTS) labeled sugar derived from a Yarrowia lipolytica strain overexpressing MNN4 containing a sugar (referred to as MNN4 sugar or MNN4 N-glycan) Schematic of potential final hydrolysates, assuming that α-mannosidase can also completely remove mannose residues from MNN4 N-glycans. 図５は、タチナタマメ（Ｊｂ）α−マンノシダーゼで処理したＭＮＮ４ Ｎ−グリカンのＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。ＤＮＡシークエンサー支援型、フルオロフォア支援型の炭水化物電気泳動（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を使用して、分析を実施した。「Ｍ１」、「Ｍ２」、「Ｍ３」、「Ｍ４」、「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、基礎となるＮ−アセチルグルコサミンの構造に結合したマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、各Ｎ−グリカン構造の量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、キャピラリーを通過した各Ｎ−グリカン構造の相対移動度を表す。FIG. 5 is a series of electropherograms describing the N-glycan analysis of MNN4 N-glycans treated with red bean (Jb) α-mannosidase. Analysis was performed using DNA sequencer assisted, fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis (DSA-FACE). “M1”, “M2”, “M3”, “M4”, “M5”, “M6”, “M8”, and “M9” are mannose residues attached to the structure of the underlying N-acetylglucosamine. Point to a number. The Y axis represents relative fluorescence units as an indicator of the amount of each N-glycan structure. The X axis represents the relative mobility of each N-glycan structure that has passed through the capillary. 図６は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＡＭＳ１（ＹｌＡｍｓ１）を使用して脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し活性（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｎｃａｐｐｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す一連の電気泳動図である。FIG. 6 is a series of electropherograms showing the demannosylation and phosphate uncapping activity using AMS1 from Yarrowia lipolytica (YlAms1). 図７は、タチナタマメα−１，２−マンノシダーゼ処理の前および後のｈｕＧＡＡのＮ−グリカン特性を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 7 is a series of electropherograms describing the N-glycan properties of huGAA before and after treatment with red bean α-1,2-mannosidase. 図８Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ５（ＣｃＭａｎ５）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号６）の記述である。FIG. 8A is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) of the open reading frame (ORF) of DsbA-Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 5 (CcMan5). 図８Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ５（ＣｃＭａｎ５）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号６）の記述である。FIG. 8A is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) of the open reading frame (ORF) of DsbA-Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 5 (CcMan5). 図８Ｂは、太字のシグナル配列を有するＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）の記述である。FIG. 8B is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the CcMan5 polypeptide having a bold signal sequence. 図８Ｃは、シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）の記述である。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドの予想される分子量は１７３ｋＤａである。FIG. 8C is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of a CcMan5 polypeptide without a signal sequence. The predicted molecular weight of a CcMan5 polypeptide without a signal sequence is 173 kDa. 図９Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ４（ＣｃＭａｎ４）のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号９）の記述である。FIG. 9A shows DsbA-C. It is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) of ORF of cellulans mannosidase 4 (CcMan4). 図９Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ４（ＣｃＭａｎ４）のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号９）の記述である。FIG. 9A shows DsbA-C. It is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) of ORF of cellulans mannosidase 4 (CcMan4). 図９Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ４（ＣｃＭａｎ４）のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号９）の記述である。FIG. 9A shows DsbA-C. It is a description of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) of ORF of cellulans mannosidase 4 (CcMan4). 図９Ｂは、太字のシグナル配列を有するＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）の記述である。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ４ポリペプチドの予想される分子量は１８４ｋＤａである。FIG. 9B is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of a CcMan4 polypeptide having a bold signal sequence. The predicted molecular weight of a CcMan4 polypeptide without a signal sequence is 184 kDa. 図９Ｂは、太字のシグナル配列を有するＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）の記述である。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ４ポリペプチドの予想される分子量は１８４ｋＤａである。FIG. 9B is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of a CcMan4 polypeptide having a bold signal sequence. The predicted molecular weight of a CcMan4 polypeptide without a signal sequence is 184 kDa. 図１０は、プラスミドｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ５およびｐＬＳＡＨＣｃＭＡＮ４の概略図である。FIG. 10 is a schematic diagram of plasmids pLSAHCcMan5 and pLSAHCcMAN4. 図１１は、ＣｃＭａｎ４および／またはＣｃＭａｎ５で処理したヒトαグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 11 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of human α-glucosidase (GAA) treated with CcMan4 and / or CcMan5. 図１２は、キャップ形成されたＮ−グリカンの概略図であり、図中、Ｐはホスフェートを指し、黒四角はＧｌｃＮａｃ部分を指し、白丸はβ結合型マンノースを指し、黒丸はα結合型マンノースを指す。FIG. 12 is a schematic diagram of capped N-glycans, where P refers to phosphate, black square refers to GlcNac moiety, white circle refers to β-linked mannose, and black circle refers to α-linked mannose. Point to. 図１３は、ＣｃＭａｎ４で処理したミオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）（登録商標）のＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 13 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of Myozyme® treated with CcMan4. 図１４は、ＣｃＭａｎ４および／またはＣｃＭａｎ５で処理したヒトαグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 14 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of human α-glucosidase (GAA) treated with CcMan4 and / or CcMan5. 図１５は、ＪｂＭａｎで処理したヒトＧＡＡのＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 15 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of human GAA treated with JbMan. 図１６は、ＪｂＭａｎで処理したヒトＧＡＡのＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 16 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of human GAA treated with JbMan. 図１７は、示された濃度の酵素（Ｕ／ｍＬ）でのミオザイム（登録商標）（菱形）またはＣｃＭａｎ５（四角）、ＣｃＭａｎ４（三角）、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５（×）、もしくはＪｂＭａｎ（＊）で処理されたヒトＧＡＡに関する細胞内ＧＡＡ活性（Ｕ／ｍｇ）の線グラフである。各データ点は、用量あたりの二つ組の平均±標準偏差を表す。星印で標識したデータ点は、用量あたりの単一の刺激条件に由来する結果である。FIG. 17 shows treatment with Myozyme® (diamonds) or CcMan5 (squares), CcMan4 (triangles), CcMan4 and CcMan5 (×), or JbMan (*) with the indicated concentrations of enzyme (U / mL). 2 is a line graph of intracellular GAA activity (U / mg) with respect to human GAA produced. Each data point represents the mean ± standard deviation of duplicates per dose. Data points labeled with asterisks are the result from a single stimulation condition per dose. 図１８は、ミオザイム（登録商標）（菱形）、ミオザイム（登録商標）にＭ６Ｐを加えたもの（四角）、ＣｃＭａｎ４で処理されたミオザイム（登録商標）（三角形）、ＣｃＭａｎ４で処理されたミオザイム（登録商標）にＭ６Ｐを加えたもの（×）、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５で処理されたヒトＧＡＡ（＊）、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５で処理されたヒトＧＡＡにＭ６Ｐを加えたもの（丸）、ＪｂＭａｎで処理されたヒトＧＡＡ（ｌ）、またはＪｂＭａｎで処理されたヒトＧＡＡに提示濃度の酵素（Ｕ／ｍＬ）でＭ６Ｐを加えたもの（ ）に関する細胞内ＧＡＡ活性（Ｕ／ｍｇ）の線グラフである。各データ点は、用量あたりの二つ組の平均±標準偏差を表す。星印で標識したデータ点は、用量あたりの単一の刺激条件に由来する結果である。FIG. 18 shows myozyme (registered trademark) (diamond), myozyme (registered trademark) with M6P added (square), myozyme (registered trademark) (triangle) treated with CcMan4, and myozyme treated with CcMan4 (registered). (Trademark) plus M6P (×), human GAA treated with CcMan4 and CcMan5 (*), human GAA treated with CcMan4 and CcMan5 (circle), human treated with JbMan It is a line graph of the intracellular GAA activity (U / mg) about what added M6P with the enzyme (U / mL) of the presentation density | concentration to human GAA processed with GAA (l) or JbMan (). Each data point represents the mean ± standard deviation of duplicates per dose. Data points labeled with asterisks are the result from a single stimulation condition per dose. 図１９は、ミオザイム、ＪｂＭａｎ、またはＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の組み合わせとともに１４時間または４６時間のいずれかでインキュベートしたポンペの線維芽細胞における細胞内ＧＡＡ活性（Ｕ／ｍｇ）の棒グラフである。二つ組の平均±標準偏差を表している。FIG. 19 is a bar graph of intracellular GAA activity (U / mg) in Pompe fibroblasts incubated with either myozyme, JbMan, or a combination of CcMan4 and CcMan5 for either 14 or 46 hours. Duplicate means ± standard deviation. 図２０は、ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎで処理したヒトＧＡＡのＮ−グリカン分析を記述する一連の電気泳動図である。FIG. 20 is a series of electropherograms describing N-glycan analysis of human GAA treated with CcMan5 and JbMan. 図２１は、ｈｕＧＡＡおよびミオザイムそれぞれを使用した細胞の細胞外刺激の後の、精製され、キャップを外され、かつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡの細胞内活性とミオザイム（登録商標）の細胞内活性との線グラフである。細胞に添加される酵素の量（酵素活性単位として表される）を酵素濃度（ｎＭとして表される）に変換し、Ｋ取り込みの算出のために比活性（Ｕ／ｍｇで表される）に対してプロットした。Ｋ取り込みおよび標準偏差をｈｕＧＡＡについては１４データ点（濃度あたり２データ点）によって、ミオザイム（登録商標）については１２データ点によって非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰｒｉｓｍで算出した。FIG. 21 shows the intracellular activity of purified, uncapped and demannosylated huGAA versus the intracellular activity of Myozyme® after extracellular stimulation of cells using huGAA and myozyme, respectively. It is a line graph. The amount of enzyme added to the cells (expressed as enzyme activity units) is converted to enzyme concentration (expressed as nM) and converted to specific activity (expressed in U / mg) for calculation of K uptake. Plotted against. K uptake and standard deviation were calculated with GraphPrism using non-linear regression with 14 data points (2 data points per concentration) for huGAA and 12 data points for Myozyme®. 図２２は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のマンノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１１）の記述である。FIG. 22 is a description of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of mannosidase derived from Aspergillus saitoi.

（詳細な説明）
一般に、本文書は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノース（本明細書においては「マンノース−６−リン酸」とも呼ぶ）に加水分解すること（「キャップを外すこと」）、かつこのようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解すること（「脱マンノシル化すること」）のための方法および材料を提供する。（個別の酵素または単一の酵素のいずれかによる）キャップを外すことおよび脱マンノシル化の両方が糖タンパク質の哺乳類細胞への取り込みを達成するために必要とされる場合に哺乳類細胞による糖タンパク質の取り込みを促進する方法も提供される。本明細書に記載される方法および材料は、リソソーム中の蓄積産物の分解に関与する触媒酵素のそこなわれた活性によるリソソーム中の該蓄積産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の１つの異なる群であるリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）を有する患者を処置するための薬剤を生成するのに特に有用である。蓄積産物の集積は、細胞の機能障害および進行性の臨床症状をもたらす。異化酵素の欠損は、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって修正することができるが、但し、投与される酵素が罹患した細胞のリソソームへ導かれることができることを条件とする。リソソーム酵素は、典型的には、小胞体（ＥＲ）において合成され、分泌経路を介してゴルジ体へ輸送され、次いでリソソームへ動員される糖タンパク質である。本明細書に記載される方法および材料を用いて、微生物を基にしたプロセスは、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する治療タンパク質を得るために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法および材料は、ＬＳＤのような代謝障害の処置のために糖タンパク質を調製するのに有用である。 (Detailed explanation)
In general, this document refers to mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties as phospho-6-mannose (also referred to herein as “mannose-6-phosphate”). And terminal α-1,2, mannose, α-1,3 mannose, and / or α-1,6 mannose linkages of such phosphate-containing glycans or Methods and materials are provided for hydrolyzing (“demannosylating”) terminal α-1,2 mannose moieties, α-1,3 mannose moieties, and / or α-1,6 mannose moieties. . If both uncapping and demannosylation (either by individual enzymes or a single enzyme) are required to achieve glycoprotein uptake into mammalian cells, A method for promoting uptake is also provided. The methods and materials described herein provide for one of the inherited metabolic disorders characterized by the accumulation of accumulated products in lysosomes due to the detrimental activity of catalytic enzymes involved in degradation of accumulated products in lysosomes. It is particularly useful for generating drugs for treating patients with different groups of lysosomal storage disorders (LSD). Accumulation of accumulation products results in cellular dysfunction and progressive clinical symptoms. Catalytic enzyme deficiency can be corrected by enzyme replacement therapy (ERT), provided that the administered enzyme can be directed to the lysosomes of the affected cells. Lysosomal enzymes are glycoproteins that are typically synthesized in the endoplasmic reticulum (ER), transported to the Golgi apparatus via the secretory pathway, and then recruited to the lysosome. Using the methods and materials described herein, microbial-based processes can be used to obtain therapeutic proteins with demannosylated phosphorylated N-glycans. Accordingly, the methods and materials described herein are useful for preparing glycoproteins for the treatment of metabolic disorders such as LSD.

（マンノシダーゼ）
本文書は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合もしくはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することができる、かつ／または（ｉｉ）このようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することができるマンノシダーゼをコードする単離された核酸を提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書においては互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸類似体を含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であることができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。 (Mannosidase)
This document describes (i) the ability to hydrolyze a mannose-1-phospho-6-mannose bond or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to phospho-6-mannose and / or (ii) Terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety, And / or an isolated nucleic acid encoding a mannosidase capable of hydrolyzing the α-1,6 mannose moiety. The terms “nucleic acid” and “polynucleotide” are used interchangeably herein and include both RNA and DNA, including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, and DNA (or RNA) containing nucleic acid analogs. Point to. The polynucleotide can have any three-dimensional structure. The nucleic acid can be double-stranded or single-stranded (ie, the sense strand or the antisense strand). Non-limiting examples of polynucleotides include genes, gene fragments, exons, introns, messenger RNA (mRNA), transfer RNA, ribosomal RNA, siRNA, microRNA, ribozyme, cDNA, recombinant polynucleotide, branched polynucleotide, plasmid, Vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes, and primers, and nucleic acid analogs.

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては互換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。典型的には、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、マンノシダーゼまたはキャップを外されかつ脱マンノシル化した標的タンパク質）は、該ポリペプチドが、調製物中の総タンパク質の少なくとも６０重量％、例えば、試料中の総タンパク質の６０％を構成する場合、単離されている。一部の実施形態においては、本明細書に記載される「ポリペプチドは、調製物中の総タンパク質の少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９９重量％からなる。   “Polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein and mean any peptide-linked chain of amino acids, regardless of length or post-translational modification. Typically, a polypeptide described herein (eg, a mannosidase or uncapped and demannosylated target protein) is one in which the polypeptide is at least 60% by weight of the total protein in the preparation, For example, it is isolated if it makes up 60% of the total protein in the sample. In some embodiments, the “polypeptides described herein consist of at least 75%, at least 90%, or at least 99% by weight of the total protein in the preparation.

「単離された核酸」は、天然に存在するゲノム（例えば、酵母ゲノム）における核酸の片側または両側に正常に隣接している核酸を含む、天然に存在するゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を指す。用語「単離された」は核酸に関して本明細書で使用する場合、天然に存在しない任意の核酸配列も含んでおり、なぜなら、このような非天然の配列は天然には見出されず、かつ天然に存在するゲノムにおいてじかに接触する配列を有さないからである。   An “isolated nucleic acid” is from other nucleic acid molecules present in a naturally occurring genome, including nucleic acids that are normally adjacent to one or both sides of the nucleic acid in a naturally occurring genome (eg, a yeast genome). Refers to isolated nucleic acid. The term “isolated” as used herein with respect to nucleic acids includes any nucleic acid sequence that does not occur in nature, because such non-natural sequences are not found in nature and are naturally occurring. This is because there is no sequence that makes direct contact in the existing genome.

単離された核酸は、例えば、ＤＮＡ分子であることができるが、但し、天然に存在するゲノムにおける該ＤＮＡ分子にじかに隣接することが通常見出されている核酸配列のうちの１つは、除去されており、または不在であることを条件とする。したがって、単離された核酸は、他の配列とは独立した別個の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）として存在するＤＮＡ分子、およびベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）へと、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへと組み込まれたＤＮＡを含むが、これらに限定されない。加えて、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるＤＮＡ分子のような操作された核酸を含むことができる。例えばｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー内に、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス内にある何百〜何百万もの他の核酸のうちに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。   An isolated nucleic acid can be, for example, a DNA molecule, provided that one of the nucleic acid sequences normally found to be immediately adjacent to the DNA molecule in a naturally occurring genome is: Subject to being removed or absent. Thus, an isolated nucleic acid exists as a separate molecule (eg, a chemically synthesized nucleic acid, or a cDNA or genomic DNA fragment produced by PCR or restriction endonuclease treatment) independent of other sequences. DNA molecules and vectors, autonomously replicating plasmids, viruses (eg, any paramyxovirus, retrovirus, lentivirus, adenovirus, or herpes virus) or to prokaryotic or eukaryotic genomic DNA And incorporated DNA, but is not limited thereto. In addition, an isolated nucleic acid can include an engineered nucleic acid such as a DNA molecule that is part of a hybrid or fusion nucleic acid. Nucleic acids present in hundreds of millions of other nucleic acids, eg, in a cDNA library or genomic library, or in a gel slice containing a genomic DNA restriction digest are Not considered.

用語「外来性」は、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書において使用する場合、天然に見出されるような特定の細胞において生じない（かつその細胞から得ることができない）任意の核酸を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であるとみなされる。天然に存在しない核酸が、天然に見出される核酸配列の核酸部分配列または断片を含有することができることを留意することは重要であり、但し、該核酸は全体として天然には存在しないことを条件とする。例えば、発現ベクター内にゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は天然に存在しない核酸であり、したがって、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であり、なぜなら、該核酸分子は全体（ゲノムＤＮＡにベクターＤＮＡを加えたもの）として天然には存在しないからである。したがって、全体として天然には存在しない任意のベクター、自律的に複製するプラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）は、天然に存在しない核酸であるとみなされる。ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたゲノムＤＮＡ断片ならびにｃＤＮＡは、天然には見出されない別個の分子として存在するので、天然に存在しない核酸であるとみなされるということになる。天然には見出されない配置のプロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する任意の核酸が天然に存在しない核酸であることにもなる。天然に存在する核酸は、特定の細胞に対して外来性ともなり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された全染色体は、一旦、該染色体が酵母ｙの細胞へと導入されると、酵母ｙの細胞に関して外来性の核酸である。   The term “foreign” as used herein with respect to nucleic acid and a particular host cell refers to any nucleic acid that does not occur in (and cannot be obtained from) that particular cell as found in nature. Thus, a non-naturally occurring nucleic acid is considered exogenous to the host cell once introduced into the host cell. It is important to note that a non-naturally occurring nucleic acid can contain a nucleic acid subsequence or fragment of a nucleic acid sequence found in nature, provided that the nucleic acid as a whole does not occur in nature. To do. For example, a nucleic acid molecule that contains a genomic DNA sequence within an expression vector is a non-naturally occurring nucleic acid, and thus is foreign to the host cell once introduced into the host cell because the nucleic acid molecule This is because they do not exist in nature as a whole (genomic DNA plus vector DNA). Thus, any vector that does not occur in nature as a whole, autonomously replicating plasmid, or virus (eg, retrovirus, adenovirus, or herpes virus) is considered to be a non-naturally occurring nucleic acid. Genomic DNA fragments and cDNAs produced by PCR or restriction endonuclease treatment will be considered non-naturally occurring nucleic acids because they exist as separate molecules that are not found in nature. Any nucleic acid containing a promoter sequence and a polypeptide-encoding sequence (eg, cDNA or genomic DNA) that are not found in nature will also be non-naturally occurring nucleic acids. Naturally occurring nucleic acids can also be exogenous to specific cells. For example, a total chromosome isolated from a yeast x cell is a foreign nucleic acid with respect to the yeast y cell once the chromosome has been introduced into the yeast y cell.

マンノシダーゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号９において示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有することができる。一部の実施形態においては、本明細書に記載される核酸は、配列番号５、７、８、１０、または１１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％）の同一性を有するマンノシダーゼポリペプチドをコードすることができる。例えば、核酸は、配列番号５、７、８、１０、１１において示されるアミノ酸配列、またはその一部と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５または９８％）の同一性を有するマンノシダーゼをコードすることができる。例えば、核酸は、配列番号８の１〜７７４番目のアミノ酸残基と少なくとも９０％の同一性を有するマンノシダーゼをコードすることができる。特定のアミノ酸配列と配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１１において示されるアミノ酸配列の間の％同一性は、以下のとおり決定することができる。まず、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含有する独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺ由来のＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用してアミノ酸配列を整列させる。この独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺは、Ｆｉｓｈ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎのウェブサイト（例えば、ｗｗｗ．ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔ／）または米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用する方法を説明する指示は、ＢＬＡＳＴＺに添付のリードミーファイルにおいて見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列間の比較を実行する。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のとおり設定される。−ｉは、比較されるべき第一のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｊは、比較されるべき第二のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｐはｂｌａｓｔｐに対して設定され、−ｏは任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に対して設定され、かつ他のオプションはすべて該オプションのデフォルト設定のままである。例えば、２つのアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを生じるために、以下のコマンド、すなわちＣ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｐ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔを使用することができる。この２つの比較される配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列した配列として示す。この２つの比較される配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列した配列を示さない。類似の手順は、ｂｌａｓｔｎを使用することを除き、核酸配列について行なわれてよい。   A nucleic acid encoding a mannosidase has at least 70% sequence identity (eg, at least 80%, 85%, 90%, 95) to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 9. %, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence identity). In some embodiments, a nucleic acid described herein is at least 70% (eg, at least 75, 80, 85, 90) with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, or 11. , 95, 99, or 100%) identity. For example, the nucleic acid encodes a mannosidase having at least 90% (eg, at least 95 or 98%) identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, 11, or a portion thereof. it can. For example, the nucleic acid can encode a mannosidase having at least 90% identity with amino acid residues 1 to 774 of SEQ ID NO: 8. The% identity between a particular amino acid sequence and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11 can be determined as follows. First, the amino acid sequences are aligned using the BLAST 2 Sequences (Bl2seq) program from a stand-alone version of BLASTZ containing BLASTP version 2.0.14. This stand-alone version of BLASTZ can be obtained from the Fish & Richardson website (eg, www.fr.com/blast/) or the National Government Biotechnology Information Center website (www.ncbi.nlm.nih.gov). Can do. Instructions describing how to use the Bl2seq program can be found in the readme file attached to BLASTZ. Bl2seq performs a comparison between two amino acid sequences using the BLASTP algorithm. In order to compare two amino acid sequences, the options for Bl2seq are set as follows. -I is set for a file containing the first amino acid sequence to be compared (eg C: \ seq1.txt), -j is a file containing the second amino acid sequence to be compared (E.g. C: \ seq2.txt), -p is set for blastp, -o is set for any desired file name (e.g. C: \ output.txt) All other options remain at their default settings. For example, to generate an output file containing a comparison between two amino acid sequences, the following command is used: C: \ Bl2seq -ic: \ seq1. txt -j c: \ seq2. txt -p blastp -oc: \ output. txt can be used. If the two compared sequences share homology, the designated output file will show the regions of homology as aligned sequences. If the two compared sequences do not share homology, the specified output file will not show the aligned sequences. Similar procedures may be performed on the nucleic acid sequence except using blastn.

一旦整列すると、マッチ数は、同一のアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を計数することによって決定される。％同一性は、マッチ数を全長のマンノシダーゼポリペプチドアミノ酸配列の長さによって除した後に、結果として生じる値に１００を乗じることによって決定される。   Once aligned, the number of matches is determined by counting the number of positions where the same amino acid residue is present in both sequences. % Identity is determined by dividing the number of matches by the length of the full length mannosidase polypeptide amino acid sequence and then multiplying the resulting value by 100.

％同一性の値は、最も近い１０分の１の位に丸められることは留意される。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１へと切り捨てられるのに対し、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２と切り上げられる。長さの値が常に整数であることも留意される。   Note that the% identity value is rounded to the nearest tenth. For example, 78.11, 78.12, 78.13, and 78.14 are truncated to 78.1, while 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, and 78.19. Is rounded up to 78.2. It is also noted that the length value is always an integer.

多くの核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることは認識される。遺伝暗号の縮重は、当該技術分野に周知であり、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のためのコドンとして機能する１つを超えるヌクレオチドのトリプレットがある。例えば、所与のマンノシダーゼポリペプチドについてのコード配列におけるコドンは、特定の種（例えば、細菌または真菌）における最適な発現が、該種のための適切なコドンバイアス表を使用して得られるよう改変され得る。   It will be appreciated that many nucleic acids can encode a polypeptide having a specific amino acid sequence. The degeneracy of the genetic code is well known in the art, ie, for many amino acids, there are more than one nucleotide triplets that function as codons for amino acids. For example, the codons in the coding sequence for a given mannosidase polypeptide are modified so that optimal expression in a particular species (eg, bacteria or fungi) is obtained using the appropriate codon bias table for that species. Can be done.

２つの核酸配列間の相同性を評価するために、ハイブリダイゼーションを使用することもできる。本明細書に記載される核酸配列、またはその断片もしくはバリアントは、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。関心対象のプローブ（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＡＭＳ１ヌクレオチド配列の一部を含有するプローブ）の、試験源由来のＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、該試験源におけるプローブに対応するＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ＡＭＳ１ヌクレオチド配列）の存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６、１９９１において得ることができる。中程度のハイブリダイゼーション条件は、３０℃での２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く５０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄と等価として定義される。高度にストリンジェントな条件は、４５℃での６×塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄と等価として定義される。   Hybridization can also be used to assess homology between two nucleic acid sequences. The nucleic acid sequences described herein, or fragments or variants thereof, can be used as hybridization probes according to standard hybridization techniques. Hybridization of a probe of interest (eg, a probe containing a portion of the Yarrowia lipolytica AMS1 nucleotide sequence) with DNA or RNA from a test source results in DNA or RNA (eg, AMS1 nucleotides) corresponding to the probe in the test source. This is an indicator of the presence of an array. Hybridization conditions are known to those of skill in the art and are described in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N .; Y. 6.3.1 to 6.3.6, 1991. Moderate hybridization conditions are defined as equivalent to washing in 2 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at 30 ° C. followed by washing in 1 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. Highly stringent conditions are defined as equivalent to a wash in 6X sodium hydrochloride / sodium citrate (SSC) at 45 ° C followed by a wash in 0.2X SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. Is done.

本明細書における使用に好適なマンノシダーゼポリペプチドの他の候補物は、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定することができる。例えば、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のデータベースに関する質問を実行することにより、マンノシダーゼポリペプチドのホモログおよび／またはオルトログを同定することができる。配列分析は、公知のマンノシダーゼアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ分析、Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＢＬＡＳＴ分析、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を包含することができる。４０％超の配列同一性を有するデータベースにおけるマンノシダーゼポリペプチドは、マンノシダーゼポリペプチドとしての好適性についてのさらなる評価のための候補物として同定することができる。アミノ酸配列類似性は、ある疎水性残基の別の疎水性残基との置き換えまたはある極性残基の別の極性残基との置き換えのような保存的アミノ酸置換を可能にする。所望の場合、さらに評価されるべき候補物の数を絞るために、このような候補物の手動点検を実施することができる。   Other candidates for mannosidase polypeptides suitable for use herein can be identified by analysis of nucleotide and polypeptide sequence alignments. For example, by querying a database of nucleotide or polypeptide sequences, homologs and / or orthologs of mannosidase polypeptides can be identified. Sequence analysis can include non-redundant database BLAST, Reciprocal BLAST, or PSI-BLAST analysis using known mannosidase amino acid sequences. A mannosidase polypeptide in a database with greater than 40% sequence identity can be identified as a candidate for further evaluation for suitability as a mannosidase polypeptide. Amino acid sequence similarity allows for conservative amino acid substitutions such as replacement of one hydrophobic residue with another hydrophobic residue or replacement of one polar residue with another polar residue. If desired, a manual check of such candidates can be performed to further reduce the number of candidates to be evaluated.

本文書は、本明細書に記載されるマンノシダーゼの（ｉ）生物活性のあるバリアントおよび（ｉｉ）その生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントも提供する。マンノシダーゼの生物活性のあるバリアントは、配列番号５、７、８、１０、および１１に示す配列に対する付加、欠失、または置換を含有することができる。置換を有するタンパク質は一般的に、５０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０を超えない）の保存的アミノ酸置換を有する。保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似の特徴を有する別のアミノ酸との置換である。保存的置換には、以下の群内の置換が含まれる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。上記の極性基、塩基性基、または酸性基のうちのある構成員の、同一群の別の構成員による任意の置換は、保存的置換であるとみなすことができる。対照的に、非保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似していない特徴を有する別のアミノ酸との置換である。   This document also provides (i) biologically active variants of mannosidases described herein and (ii) biologically active fragments or biologically active variants thereof. Biologically active variants of mannosidase can contain additions, deletions or substitutions to the sequences shown in SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, and 11. Proteins with substitutions are generally 50 or less (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, or 50 Conservative amino acid substitutions). A conservative substitution is a substitution of one amino acid with another amino acid having similar characteristics. Conservative substitutions include substitutions within the following groups: valine, alanine, and glycine; leucine, valine, and isoleucine; aspartic acid and glutamic acid; asparagine and glutamine; serine, cysteine, and threonine; lysine and arginine; And phenylalanine and tyrosine. Nonpolar hydrophobic amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Any substitution of one member of the above polar, basic, or acidic groups with another member of the same group can be considered a conservative substitution. In contrast, a non-conservative substitution is a substitution of one amino acid for another amino acid with dissimilar characteristics.

欠失バリアントは、（２つ以上のアミノ酸の）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸セグメントまたは非連続的な単一のアミノ酸を欠失することができる。   Deletion variants are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 (two or more amino acids) Or 20 amino acid segments or non-contiguous single amino acids can be deleted.

付加（付加バリアント）には、（ａ）配列番号５、７、８、１０、１１に示すマンノシダーゼまたはその断片と、（ｂ）内部または末端（ＣまたはＮ）の無関係のまたは異種性のアミノ酸配列とを含有する融合タンパク質が含まれる。このような融合タンパク質の文脈においては、用語「異種性アミノ酸配列」は、（ａ）以外のアミノ酸配列を指す。異種性配列は例えば、組換えタンパク質（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））の精製に使用される配列であることができる。異種性配列は、診断用マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であることもできる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、別のタンパク質由来のシグナル配列を含有する。ある宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）においては、標的タンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用によって増大することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、例えば抗体産生のための免疫応答を惹起するのに有用なキャリア（例えば、ＫＬＨ）、または小胞体もしくはゴルジ装置の保持シグナルを含有することができる。異種性配列は多様な長さであることができ、一部の場合においては、異種性配列が結合する全長の標的タンパク質よりも長い配列であることができる。   Addition (addition variant) includes (a) the mannosidase shown in SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, 11, or a fragment thereof, and (b) an irrelevant or heterologous amino acid sequence at the internal or terminal (C or N). And a fusion protein containing In the context of such fusion proteins, the term “heterologous amino acid sequence” refers to an amino acid sequence other than (a). Heterologous sequences include, for example, recombinant proteins (eg, FLAG, polyhistidine (eg, hexahistidine), hemagglutinin (HA), glutathione-S-transferase (GST), or maltose binding protein (MBP)). The sequence used for the purification of The heterologous sequence can also be a protein useful as a diagnostic or detectable marker, such as luciferase, green fluorescent protein (GFP), or chloramphenicol acetyltransferase (CAT). In some embodiments, the fusion protein contains a signal sequence from another protein. In some host cells (eg, yeast host cells), expression and / or secretion of the target protein can be increased through the use of heterologous signal sequences. In some embodiments, the fusion protein can contain a carrier (eg, KLH) useful for eliciting an immune response, eg, for antibody production, or an endoplasmic reticulum or Golgi apparatus retention signal. The heterologous sequence can be of various lengths, and in some cases can be a sequence that is longer than the full length target protein to which the heterologous sequence binds.

マンノシダーゼの生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントは、野生型の全長の成熟タンパク質のマンノシダーゼ活性（例えば、キャップを外すことおよび／または脱マンノシル化すること）の少なくとも４０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％、またはさらにそれより大）を有する。例えば、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼの生物活性断片は、配列番号８の第１〜７７４番目の残基を含有することができる。   A bioactive fragment or bioactive variant of mannosidase is at least 40% (eg, at least 50%) of the mannosidase activity (eg, uncapping and / or demannosylating) of the wild-type full-length mature protein. %, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 100%, or even more). For example, a biologically active fragment of mannosidase capable of hydrolyzing a mannose-1-phospho-6-mannose bond or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to phospho-6-mannose is represented by the first to It can contain the 774th residue.

キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を生成するために、本明細書に記載されるマンノシダーゼを使用することができる。上記方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。   The mannosidases described herein can be used to generate uncapped and demannosylated target molecules. The above methods can be performed in vitro or in vivo.

（糖タンパク質を脱マンノシル化する、または糖タンパク質のキャップを外しかつ脱マンノシル化する方法）
本明細書に記載されるとおり、リン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質は脱マンノシル化され得、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質は、該糖タンパク質を（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることによってキャップを外されかつ脱マンノシル化され得る。このようなマンノシダーゼの非限定例としては、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ（Ｊａｃｋ ｂｅａｎ））マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）が挙げられる。タチナタマメマンノシダーゼおよびＡＭＳ１マンノシダーゼの両方は、ファミリー３８のグリコシドヒドドラーゼである。 (Methods of demannosylating glycoproteins or uncapping and demannosylating glycoproteins)
As described herein, glycoproteins containing phosphorylated N-glycans can be demannosylated and contain mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties. Glycoproteins containing phosphorylated N-glycans can be obtained by hydrolyzing the glycoprotein (i) mannose-1-phospho-6-mannose bond or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to mannose-6-phosphate. And (ii) a terminal α-1,2 mannose bond, an α-1,3 mannose bond, and / or an α-1,6 mannose bond or a terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 By contacting the mannose moiety and / or the alpha-1,6 mannose moiety with a mannosidase capable of hydrolyzing. And removed the cap Te may be de-mannosylated. Non-limiting examples of such mannosidases include Canavaria ensiformis (Jack bean) mannosidase and Yarrowia lipolytica mannosidase (eg, AMS1). Both red bean mannosidase and AMS1 mannosidase are family 38 glycoside hydrolases.

タチナタマメマンノシダーゼは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から硫酸アンモニウム懸濁液（カタログ番号Ｍ７２５７）およびプロテオミクス等級の調製物（カタログ番号Ｍ５５７３）として市販されている。実施例８に記載するように、このような商業的調製物は、例えばホスファターゼのような混入物を除去するためにゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。タチナタマメマンノシダーゼは、以下のアミノ酸配列ＮＫＩＰＲＡＧＷＱＩＤＰＦＧＨＳＡＶＱＧ（配列番号１２）を有するセグメントを含有する。Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（４）：２０６７−２０７２、１９９８を参照されたい。   Tatin bean mannosidase is commercially available, for example, from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA) as an ammonium sulfate suspension (Catalog Number M7257) and a proteomic grade preparation (Catalog Number M5573). As described in Example 8, such commercial preparations can be further purified by gel filtration chromatography to remove contaminants such as phosphatases. Tachinama bean mannosidase contains a segment having the following amino acid sequence NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG (SEQ ID NO: 12). Howard et al. Biol. Chem. 273 (4): 2067-2072, 1998.

Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＭＳ１マンノシダーゼは組換え産生することができる。Ｃ末端もしくはＮ末端のポリヒスチジンタグを有するＡＭＳ１をコードする核酸配列を配列番号３および配列番号４にそれぞれ示す（図３Ａおよび図３Ｂも参照されたい）。上記ＡＭＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に示す（図３Ｃも参照されたい）。マンノシダーゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、標準的な技術によって生成することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を得るために使用することができる。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡに由来する配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡに由来する特定の配列を増幅するために使用することができる。一般的には、関心対象の領域の末端からのまたはそれを越えたところからの配列情報を使用して、増幅されるべきテンプレートの反対鎖と配列が同一または類似であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。種々のＰＣＲ戦略も利用可能であり、該戦略によって、部位特異的ヌクレオチド配列改変は、テンプレート核酸へと導入することができる。単離された核酸は、単一の核酸分子として（例えば、ホスホルアミダイト技法を使用する３’から５’への方向における自動ＤＮＡ合成を使用して）、または一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる場合に二本鎖が形成されるよう、各対が相補性のある短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含有する所望の配列を含有する、１対以上の長いオリゴヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド超）を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長し、結果として、オリゴヌクレオチド対あたり単一の二本鎖核酸分子を生じ、それを次にベクターへと連結することができる。単離された核酸は、例えば、天然に存在するＤＮＡの変異誘発によって得ることもできる。   Yarrowia lipolytica AMS1 mannosidase can be produced recombinantly. Nucleic acid sequences encoding AMS1 with a C-terminal or N-terminal polyhistidine tag are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively (see also FIGS. 3A and 3B). The amino acid sequence of the AMS1 polypeptide is shown in SEQ ID NO: 5 (see also FIG. 3C). An isolated nucleic acid molecule encoding a mannosidase polypeptide can be produced by standard techniques. For example, polymerase chain reaction (PCR) technology can be used to obtain an isolated nucleic acid containing a nucleotide sequence described herein. PCR can be used to amplify specific sequences derived from DNA as well as RNA, including sequences derived from total genomic DNA or total cellular RNA. In general, sequence information from the end of the region of interest or beyond is used to design oligonucleotide primers that are identical or similar in sequence to the opposite strand of the template to be amplified. . Various PCR strategies are also available, by which site-specific nucleotide sequence modifications can be introduced into the template nucleic acid. The isolated nucleic acid is either as a single nucleic acid molecule (eg, using automated DNA synthesis in the 3 'to 5' direction using phosphoramidite techniques) or as a series of oligonucleotides. It can also be synthesized chemically. For example, one or more pairs containing a desired sequence containing a short segment of complementarity (eg, about 15 nucleotides) such that a duplex is formed when the oligonucleotide pairs are annealed Long oligonucleotides (eg, greater than 100 nucleotides) can be synthesized. DNA polymerase can be used to extend the oligonucleotide, resulting in a single double-stranded nucleic acid molecule per oligonucleotide pair, which can then be ligated into a vector. Isolated nucleic acids can also be obtained, for example, by mutagenesis of naturally occurring DNA.

マンノシダーゼポリペプチドを組換え生成するために、マンノシダーゼポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターを使用する。本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、遺伝子が転写されるようにすることができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、そのＲＮＡポリメラーゼが転写を開始する。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが直接結合するかまたはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含有する。プロモーター配列は、「エンハンサー領域」も含まれ得、該領域は、タンパク質（すなわち、トランス作用因子であり、ほとんどが１群の転写因子のようである）と結合して遺伝子クラスターにおける遺伝子の転写レベルを高めることのできるＤＮＡの１つ以上の領域（したがって、その名前を有する）である。エンハンサーは、コード領域の５’末端では典型的に、プロモーター配列とも異なることができる一方で、例えば、遺伝子のイントロン領域内または該遺伝子のコード領域に対して３’内にあることができる。   To recombinantly produce a mannosidase polypeptide, a vector containing a promoter operably linked to a nucleic acid encoding the mannosidase polypeptide is used. As used herein, “promoter” refers to a DNA sequence that enables a gene to be transcribed. The promoter is recognized by RNA polymerase, which initiates transcription. Thus, a promoter contains a DNA sequence that is either directly bound by RNA polymerase or involved in the recruitment of RNA polymerase. A promoter sequence can also include an “enhancer region” that binds to a protein (ie, is a trans-acting factor, most of which appears to be a group of transcription factors) and the level of transcription of a gene in a gene cluster. One or more regions of DNA that can enhance (and therefore have that name). An enhancer can typically differ from the promoter sequence at the 5 'end of the coding region, while it can be, for example, in the intron region of the gene or 3' to the coding region of the gene.

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を有効に制御するよう、遺伝子コンストラクト（例えば、ベクター）へと組み込まれることを意味する。   As used herein, “operably linked” means that an expression control sequence is incorporated into a gene construct (eg, a vector) so as to effectively control the expression of the coding sequence of interest. To do.

発現ベクターは、コードされたポリペプチドの発現のために宿主細胞へと（例えば、形質転換またはトランスフェクションによって）導入したのち、精製することができる。マンノシダーゼポリペプチドの小規模または大規模な産生のために使用することのできる発現系は、上記核酸分子を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、および該核酸分子を含有する組換え真菌発現ベクターで形質転換された真菌（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような微生物を含むが、これらに限定されない。有用な発現系は、上記核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系、および組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス）に感染させたまたは該核酸分子を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系も含む。マンノシダーゼポリペプチドは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを有する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、および３Ｔ３ Ｌ１細胞のような不死化した細胞系）を含む哺乳類発現系を使用して産生することもできる。   An expression vector can be purified after introduction into a host cell (eg, by transformation or transfection) for expression of the encoded polypeptide. Expression systems that can be used for small or large scale production of mannosidase polypeptides are transformed with recombinant bacteriophage DNA expression vectors, plasmid DNA expression vectors, or cosmid DNA expression vectors containing the nucleic acid molecules described above. Bacteria (eg, E. coli), and fungi transformed with a recombinant fungal expression vector containing the nucleic acid molecule (eg, S. cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Pichia pastoris, Hansenula poly) Or a microorganism such as Aspergillus, but useful expression systems include recombinant viral expression vectors containing the nucleic acid molecules described above. An insect cell line infected with (eg baculovirus) and a recombinant plasmid expression vector (eg Ti plasmid) infected with or containing a recombinant viral expression vector (eg tobacco mosaic virus) Also includes plant cell lines transformed with a mannosidase polypeptide comprising a promoter derived from a mammalian cell genome (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, an adenovirus late promoter and a cytomegalovirus promoter). Cells with recombinant expression constructs containing (eg, immortalized cell lines such as COS cells, Chinese hamster ovary cells, HeLa cells, human fetal kidney 293 cells, and 3T3 L1 cells) It can also be produced using mammalian expression systems, including.

典型的には、組換えマンノシダーゼポリペプチドに、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような異種性アミノ酸配列をタグ付けして、該タンパク質を精製するのを支援する。タンパク質を精製するための他の方法には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術が含まれる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＨａｒｄｉｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８１４：７１〜８１（１９９８）を参照されたい）。   Typically, recombinant mannosidase polypeptides include FLAG, polyhistidine (eg, hexahistidine), hemagglutinin (HA), glutathione-S-transferase (GST), or maltose binding protein (MBP). Tag such heterologous amino acid sequences to help purify the protein. Other methods for purifying proteins include chromatographic techniques such as ion exchange chromatography, hydrophobic and reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography, hydrophobic charge induction chromatography and the like. (See, for example, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814: 71-81 (1998)).

一部の実施形態においては、キャップを外す工程および脱マンノシル化する工程は、２つの異なる酵素によって触媒される。例えば、マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分のキャップを外す工程は、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ５）を使用して実施することができる。シグナル配列を含有するＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に示す。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に示す。ＣｃＭａｎ５ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号６に示す。一部の実施形態においては、ＣｃＭａｎ５ポリペプチドの生物活性断片を使用する。例えば、生物活性断片には、配列番号８に示すアミノ酸配列の１〜７７４番目の残基を含めることができる。国際公開第２０１１／０３９６３４号も参照されたい。ＣｃＭａｎ５マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。   In some embodiments, the uncapping and demannosylation steps are catalyzed by two different enzymes. For example, the step of uncapping the mannose-1-phospho-6 mannose bond or the mannose-1-phospho-6 mannose moiety can be performed using a mannosidase derived from Cellulosimicrobium cellulans (eg, CcMan5). The amino acid sequence of a CcMan5 polypeptide containing a signal sequence is shown in SEQ ID NO: 7. The amino acid sequence of a CcMan5 polypeptide that does not have a signal sequence is shown in SEQ ID NO: 8. The nucleic acid sequence encoding the CcMan5 polypeptide is shown in SEQ ID NO: 6. In some embodiments, biologically active fragments of CcMan5 polypeptides are used. For example, the biologically active fragment can include residues 1 to 774 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. See also International Publication No. 2011/039634. CcMan5 mannosidase is a family 92 glycoside hydrolase.

キャップを外された糖タンパク質の脱マンノシル化は、（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知の）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ（Ａｓ）由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４）を使用して触媒することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼは、ファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼであり、ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１１（図２２参照）に、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＢＡＡ０８６３４号に示す。ＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号９に示すヌクレオチド配列は、配列番号１０のポリペプチドをコードする。   Demannosylation of uncapped glycoproteins can be catalyzed using a mannosidase from Aspergillus satoi (As) (also known as Aspergillus phoenisis) or a mannosidase from Cellulomicromicrobacterium cellulans (eg, CcMan4). Aspergillus satoi mannosidase is a family 47 glycoside hydrolase and CcMan4 mannosidase is a family 92 glycoside hydrolase. The amino acid sequence of Aspergillus satoi mannosidase is shown in SEQ ID NO: 11 (see FIG. 22), and GenBank Accession No. BAA08634. The amino acid sequence of the CcMan4 polypeptide is shown in SEQ ID NO: 10. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 encodes the polypeptide of SEQ ID NO: 10.

キャップを外された糖タンパク質の脱マンノシル化は、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）のようなファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼ由来のマンノシダーゼを使用して触媒することもできる。例えば、ＣｃＭａｎ５を使用して、糖タンパク質のマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分のキャップを外すことができ、タチナタマメマンノシダーゼを使用して、キャップを外された糖タンパク質を脱マンノシル化することができる。   Demannosylation of uncapped glycoproteins can also be catalyzed using a mannosidase from a family 38 glycoside hydrolase, such as Canavaria ensiformis mannosidase or Yarrowia lipolytica mannosidase (eg, AMS1). For example, CcMan5 can be used to uncapped the mannose-1-phospho-6 mannose portion of a glycoprotein and Taman bean mannosidase can be used to demannosylate an uncapped glycoprotein. it can.

脱マンノシル化した糖タンパク質、またはキャップを外されかつ脱マンノシル化した糖タンパク質を産生するために、マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分を含有する標的分子を、好適な条件下で、好適なマンノシダーゼ（複数可）と、および／または組換え産生した好適なマンノシダーゼ（複数可）を含有する細胞溶解産物と接触させる。好適なマンノシダーゼは上記している。細胞溶解産物は、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞を含む、遺伝子操作した任意の細胞由来であることができる。動物細胞の非限定例としては、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、および、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒトのような哺乳類が挙げられる。   In order to produce a demannosylated glycoprotein, or an uncapped and demannosylated glycoprotein, a target molecule containing a mannose-1-phospho-6 mannose linkage or mannose-1-phospho-6 mannose moiety is prepared. Contacting the cell lysate containing suitable mannosidase (s) and / or recombinantly produced suitable mannosidase (s) under suitable conditions. Suitable mannosidases are described above. The cell lysate can be derived from any genetically engineered cell, including fungal cells, plant cells, or animal cells. Non-limiting examples of animal cells include nematodes, insects, plants, birds, reptiles, and mice, rats, rabbits, hamsters, gerbils, dogs, cats, goats, pigs, cows, horses, whales, monkeys, or humans Mammals such as

標的分子（例えば、糖タンパク質）を、精製したマンノシダーゼおよび／または細胞溶解産物と接触させると、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分は、ホスホ−６−マンノースに加水分解することができ、そしてこのようなホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分は、加水分解され、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。一部の実施形態においては、キャップを外す工程および脱マンノシル化する工程の両方を触媒する１つのマンノシダーゼを使用する。一部の実施形態においては、キャップを外す工程を触媒するために１つのマンノシダーゼを使用し、脱マンノシル化工程を触媒するために異なるマンノシダーゼを使用する。標的分子がキャップを外されかつ脱マンノシルしたかどうかを決定するために、実施例５に記載される方法を使用することができる。マンノシダーゼによる処理の後、標的分子を単離することができる。   When the target molecule (eg, glycoprotein) is contacted with purified mannosidase and / or cell lysate, the mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety becomes phospho-6 A terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1 of such phosphate-containing glycans that can be hydrolyzed to mannose , 2 mannose moieties, α-1,3 mannose moieties, and / or α-1,6 mannose moieties can be hydrolyzed to produce uncapped and demannosylated target molecules. In some embodiments, one mannosidase is used that catalyzes both the uncapping step and the demannosylation step. In some embodiments, one mannosidase is used to catalyze the uncapping step and a different mannosidase is used to catalyze the demannosylation step. The method described in Example 5 can be used to determine if the target molecule is uncapped and demannosylated. After treatment with mannosidase, the target molecule can be isolated.

細胞溶解産物におけるマンノシダーゼ活性の活性度または完全性を保存する該細胞溶解産物を得るのに好適な方法には、該細胞溶解産物におけるＮ−グリコシル化活性の変化を保存または最小化する適切なバッファならびに／またはヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む阻害剤の使用を含めることができる。このような阻害剤は例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−四酢酸（ＥＧＴＡ）のようなキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなどのようなプロテアーゼ阻害剤、ならびにホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどのようなホスファターゼ阻害剤が挙げられる。酵素活性を含有する溶解産物を得るのに適切なバッファおよび条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（別冊４７）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｔｉｅｔｚ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に記載されている。   A suitable method for obtaining the cell lysate that preserves the activity or integrity of mannosidase activity in the cell lysate includes a suitable buffer that preserves or minimizes changes in N-glycosylation activity in the cell lysate. And / or the use of inhibitors, including nuclease inhibitors, protease inhibitors, and phosphatase inhibitors. Such inhibitors include, for example, chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol bis (P-aminoethyl ether) N, N, N1, N1-tetraacetic acid (EGTA), phenylmethylsulfonyl fluoride ( PMSF), protease inhibitors such as aprotinin, leupeptin, antipain and the like, as well as phosphatase inhibitors such as phosphate, sodium fluoride, vanadate and the like. Suitable buffers and conditions for obtaining lysates containing enzyme activity are described, for example, in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (separate volume 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Anti: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1999) Tibet; Ashwood eds., W. B. Saunders, Philadelphia (1999).

細胞溶解産物は適宜、干渉する物質の存在を除去または最小化するようさらに処理することができる。所望の場合、細胞溶解産物は、細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、およびイオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術を含む、当業者に周知の種々の方法によって分画することができる。   The cell lysate can optionally be further processed to remove or minimize the presence of interfering substances. If desired, cell lysates can be used for subcellular fractionation and ion exchange chromatography, hydrophobic and reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography, hydrophobic charge induction chromatography, etc. Fractionation can be accomplished by a variety of methods well known to those skilled in the art, including chromatographic techniques.

一部の実施形態においては、細胞溶解産物は、細胞小器官全体が無傷および／または機能的であるままで調製することができる。例えば、溶解産物は、無傷の粗面小胞体、無傷の滑面小胞体、または無傷のゴルジ装置のうちの１つ以上を含有することができる。無傷の細胞小器官を含有する溶解産物を調製して、該小器官の機能性について試験するのに好適な方法は、例えば、Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２９〜４３３３；Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２２〜４３２８；Ｒｅｘａｃｈら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２１９〜２２９；およびＰａｕｌｉｋら（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７（２）：２６５〜２７３に記載されている。   In some embodiments, the cell lysate can be prepared while the entire organelle remains intact and / or functional. For example, the lysate can contain one or more of an intact rough endoplasmic reticulum, an intact smooth endoplasmic reticulum, or an intact Golgi apparatus. Suitable methods for preparing lysates containing intact organelles and testing for their functionality are described, for example, by Moreau et al. (1991) J. MoI. Biol. Chem. 266 (7): 4329-4333; Moreau et al. (1991) J. MoI. Biol. Chem. 266 (7): 4322-4328; Rexach et al. (1991) J. MoI. Cell Biol. 114 (2): 219-229; and Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367 (2): 265-273.

標的分子は、本明細書で使用する場合、（ｉ）末端マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合もしくは末端マンノース−１−ホスホ−６マンノース部分を含有する任意の分子、（ｉｉ）真菌起源の細胞において発現する場合、マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合もしくはマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分を含有する任意の分子、（ｉｉｉ）ホスフェートを含有するグリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合、または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を含有する任意の分子、あるいは（ｉｖ）真菌起源の細胞において発現する場合、ホスフェートを含有するグリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合、または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を含有する任意の分子を指す。一部の実施形態においては、標的タンパク質は、ヒト糖タンパク質である。好適な標的タンパク質には、破傷風トキソイドまたはジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイドのような病原体タンパク質；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ、Ｈ、およびｇＣＩＩＩ、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンベロープ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エンベロープ糖タンパク質、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）エンベロープ糖タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）エンベロープ糖タンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）エンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、ならびに肝炎ファミリー表面抗原のようなウイルス表面タンパク質、リソソームタンパク質（例えば、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼ、またはガラクトセレブロシダーゼ）、インスリン、グルカゴン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ならびにこれらの抗体または断片を挙げることができる。増殖因子には、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形態形成因子（ＢＭＰ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。サイトカインには、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−３３（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１５）のようなインターロイキンが含まれる。ケモカインには、例えば、Ｉ−３０９、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１０、ＭＲＰ−２、ＭＡＲＣ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＭＲＰ−２、ＣＣＦ１８、ＭＩＰ−１γ、エオタキシン、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−４、ＮＣＣ−１、Ｃｋβ１０、ＨＣＣ−１、ロイコタクチン−１、ＬＥＣ、ＮＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＰＡＲＣ、またはエオタキシン−２が含まれる。腫瘍糖タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）も含まれる［ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＦｉｎｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，ｐｐ．２１７〜５６（１９９６）］。   A target molecule as used herein is (i) any molecule containing a terminal mannose-1-phospho-6 mannose linkage or terminal mannose-1-phospho-6 mannose moiety, (ii) a cell of fungal origin Any molecule containing a mannose-1-phospho-6 mannose linkage or mannose-1-phospho-6 mannose moiety, (iii) a terminal α-1,2 mannose linkage of a glycan containing phosphate, -1,3 mannose linkages and / or α-1,6 mannose linkages or any containing terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety and / or α-1,6 mannose moiety Or (iv) the terminal α- of a glycan containing phosphate when expressed in cells of fungal origin , 2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond, or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose moiety, and / or α-1,6 Refers to any molecule containing a mannose moiety. In some embodiments, the target protein is a human glycoprotein. Suitable target proteins include pathogen proteins such as tetanus toxoid or diptheria toxoid; cytomegalovirus (CMV) glycoproteins B, H, and gCIII, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope glycoprotein Rous sarcoma virus (RSV) envelope glycoprotein, herpes simplex virus (HSV) envelope glycoprotein, Epstein-Barr virus (EBV) envelope glycoprotein, varicella-zoster virus (VZV) envelope glycoprotein, human papillomavirus (HPV) envelope sugar Proteins, influenza virus glycoproteins, and viral surface proteins such as hepatitis family surface antigens, lysosomal proteins (eg acidic Glucosidase, alpha-galactosidase, glucocerebrosidase, cerebrosidase or galactocerebrosidase), may be mentioned insulin, glucagon, growth factors, cytokines, chemokines, and these antibodies or fragments. Examples of the growth factor include vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor (IGF), bone morphogenic factor (BMP), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( GM-CSF), nerve growth factor (NGF), neurotrophin, platelet derived growth factor (PDGF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), myostatin (GDF-8), growth differentiation factor 9 (GDF9), base Sex fibroblast growth factor (bFGF or FGF2), epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF). Cytokines include, for example, IL-1 to IL-33 (eg, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-12, IL-13, or IL-15). Chemokines include, for example, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1γ, eotaxin, MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, leucotactin-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC, or eotaxin-2. Also included are tumor glycoproteins (eg, tumor associated antigens), such as carcinoembryonic antigen (CEA), human mucin, HER-2 / neu, and prostate specific antigen (PSA) [Henderson and Finn, Advances in Immunology, 62 , Pp. 217-56 (1996)].

一部の実施形態においては、標的タンパク質は、リソソーム蓄積障害と関連したものであることができ、該標的タンパク質は、例えば酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、α−Ｌ−マンノシダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼを含む。   In some embodiments, the target protein can be associated with a lysosomal storage disorder, such as acid alpha glucosidase, alpha galactosidase, alpha-L-iduronidase, beta-D-galactosidase, β-glucosidase, β-hexosaminidase, β-D-mannosidase, α-L-fucosidase, arylsulfatase B, arylsulfatase A, α-N-acetylgalactosaminidase, aspartylglucosaminidase, iduronic acid-2-sulfatase , Α-glucosaminide-N-acetyltransferase, β-D-glucuronidase, hyaluronidase, α-L-mannosidase, α-neuraminidase, phosphotransferase, acid lipase, acid cease Including Midaze, sphingomyelinase, thioesterase, cathepsin K, and lipoprotein lipase.

一部の実施形態においては、標的タンパク質は、それが別のポリペプチド配列に、またはポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、もしくは検出可能な（例えば、蛍光、発光、または放射性）部分に融合した融合タンパク質である。例えば、標的タンパク質は、低分子タンパク質の分子量を増加させるために、および／または循環滞留時間を延長するために、ポリエチレングリコールのようなポリマーに結合することができる。   In some embodiments, the target protein is a fusion where it is fused to another polypeptide sequence or to a polymer, carrier, adjuvant, immunotoxin, or detectable (eg, fluorescent, luminescent, or radioactive) moiety. It is a protein. For example, the target protein can be conjugated to a polymer such as polyethylene glycol to increase the molecular weight of the small molecule protein and / or to increase the circulation residence time.

哺乳類細胞の、キャップを外されかつ脱マンノシル化したホスフェートＮ−グリカンを含有する標的分子と接触すると、標的分子は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の内部へ輸送され得る。キャップを外されたが脱マンノシル化していないリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質は、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体を実質的に結合せず、それ自体、該細胞の内部へと効率的に輸送されない。本明細書で使用する場合、「実質的に結合しない」とは、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に糖タンパク質分子の１５％未満（例えば、１４％未満、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、またはそれより小、または０％）が結合することを意味する。しかしながら、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合にこのような糖タンパク質が、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触すれば、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しかつ該細胞の内部へ効率よく輸送される脱マンノシル化した糖タンパク質が生成される。本明細書で使用する場合、「実質的に結合する」とは、糖タンパク質分子の１５％以上（例えば、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％よりも大）が哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合することを意味する。リン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すが脱マンノシル化しない酵素を含有する調製物（例えば、組換え宿主細胞または無細胞調製物）に、リン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する酵素が混入し得ることは理解される。このような調製物との接触後の標的タンパク質試料は、キャップを外されるだけの一部のリン酸化Ｎ−グリカンを有するタンパク質分子、およびキャップを外されかつ脱マンノシル化したその他のリン酸化Ｎ−グリカンを有するタンパク質分子を含有することができる。キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する天然の上記タンパク質分子は、マンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合することができる。「実質的に結合しない」に関する上の定義は、タンパク質分子におけるリン酸化Ｎ−グリカンが、キャップを外されたが脱マンノシル化していないことを特徴とすることができないので、このような標的タンパク質試料に適用されない。   Upon contacting a mammalian cell with a target molecule containing an uncapped and demannosylated phosphate N-glycan, the target molecule can be transported into the interior of the mammalian cell (eg, a human cell). Glycoproteins with phosphorylated N-glycans that have been uncapped but not demannosylated do not substantially bind the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells and as such enter the interior of the cell. It is not transported efficiently. As used herein, “substantially non-binding” means less than 15% (eg, less than 14%, 12%, 10%, etc.) of glycoprotein molecules to the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells. 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, or less, or 0%). However, if the underlying mannose is phosphorylated, such a glycoprotein comes into contact with a mannosidase that can hydrolyze the terminal α-1,2 mannose bond or the terminal α-1,2 mannose moiety, Demannosylated glycoproteins are produced that bind substantially to the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells and are efficiently transported into the interior of the cells. As used herein, “substantially bind” refers to 15% or more (eg, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%) of a glycoprotein molecule. %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or greater than 95%) bind to the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells It means to do. Preparations containing enzymes that uncapped but not demannosylated phosphorylated N-glycans (eg, recombinant host cells or cell-free preparations) may be contaminated with enzymes that demannosylate phosphorylated N-glycans It is understood. The target protein sample after contact with such a preparation is composed of protein molecules having some phosphorylated N-glycans that are only uncapped, and other phosphorylated N that are uncapped and demannosylated. -Protein molecules with glycans can be contained. Naturally occurring protein molecules containing uncapped and demannosylated phosphorylated N-glycans can bind substantially to the mannose-6-phosphate receptor. The above definition for “substantially does not bind” is such that a phosphorylated N-glycan in a protein molecule cannot be characterized as uncapped but not demannosylated. Not applicable.

実施例９および実施例１２に示すように、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子は、キャップを外されたリン酸化Ｎ−グリカンを含有する標的分子よりも、哺乳類細胞によって効率よく取り込まれる。例えば、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子は、キャップを外されていない糖タンパク質よりも少なくとも１０倍（例えば、少なくとも１５、２０、２５、または３０倍）効率的に取り込まれ得る。   As shown in Example 9 and Example 12, uncapped and demannosylated target molecules are more efficiently taken up by mammalian cells than target molecules containing uncapped phosphorylated N-glycans. . For example, an uncapped and demannosylated target molecule can be taken up at least 10 times (eg, at least 15, 20, 25, or 30 times) more efficiently than an uncapped glycoprotein.

したがって、本文書は、糖タンパク質を、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合する第二の形態へ変換する方法を提供する。第一の形態においては、糖タンパク質は、６位にリン酸残基を含有するマンノース残基に１位で結合する１つ以上のマンノース残基を含有する１つ以上のＮ−グリカンを含む。このような方法においては、第一の形態の糖タンパク質は、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触して、６位にホスフェートを含有するマンノースを結果として生じ、末端マンノースとなる。一部の実施形態においては、該マンノシダーゼは、キャップを外す活性も脱マンノシル化活性も有する（例えば、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ（Ｊａｃｋ ｂｅａｎ））マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＭＳ１マンノシダーゼ）。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼは、キャップを外す活性を有さない（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４））。   Thus, this document converts a glycoprotein from a first form that does not bind to mannose-6-phosphate receptor in mammalian cells to a second form that binds to mannose-6-phosphate receptor in mammalian cells. Provide a way to do it. In a first form, the glycoprotein comprises one or more N-glycans containing one or more mannose residues that bind at position 1 to a mannose residue containing a phosphate residue at position 6. In such a method, the first form of glycoprotein is contacted with a mannosidase that demannosylates the terminal mannose residue, resulting in a mannose containing a phosphate at the 6 position, resulting in a terminal mannose. In some embodiments, the mannosidase has both uncapping and demannosylating activity (eg, Canavaria ensiformis (Jack bean) mannosidase or Yarrowia lipolytica AMS1 mannosidase). In some embodiments, the mannosidase has no uncapping activity (eg, a mannosidase from Aspergillus satoi or a mannosidase from Cellulosimicrobium cellulans (eg, CcMan4)).

糖タンパク質の細胞の内部への輸送は、実施例９に示す細胞取り込みアッセイのような細胞取り込みアッセイを使用して評価することができる。例えば、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する哺乳類細胞および標的分子をインキュベートし、次に、細胞を洗浄および溶解することができる。細胞溶解産物は、標的分子の存在について（例えば、ウェスタンブロット法によって）、または細胞溶解産物における標的分子の活性によって評価することができる。例えば、標的分子がヒトαグルコシダーゼのようなグルコシダーゼである場合、取り込みは、酸性αグルコシダーゼ活性を欠損する線維芽細胞において評価することができる。αグルコシダーゼの細胞内活性は、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）アッセイを使用して評価することができる。実施例３を参照されたい。グルコシダーゼによる基質４−ＭＵＧの切断は、蛍光原性産物４−ＭＵの生成をもたらし、４−ＭＵは、紫外光による照射によって視覚化または検出することができる。   Transport of glycoproteins into the cell can be assessed using a cell uptake assay such as the cell uptake assay shown in Example 9. For example, mammalian cells containing uncapped and demannosylated phosphorylated N-glycans and target molecules can be incubated and then the cells washed and lysed. Cell lysates can be assessed for the presence of the target molecule (eg, by Western blotting) or by the activity of the target molecule in the cell lysate. For example, if the target molecule is a glucosidase such as human alpha glucosidase, uptake can be assessed in fibroblasts that lack acid alpha glucosidase activity. The intracellular activity of α-glucosidase can be assessed using a 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside (4-MUG) assay. See Example 3. Cleavage of the substrate 4-MUG by glucosidase results in the production of the fluorogenic product 4-MU, which can be visualized or detected by irradiation with ultraviolet light.

（糖タンパク質のキャップを外しかつ脱マンノシル化するインビボでの方法）
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を産生するために使用することができる。例えば、細胞を基にした方法は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、キャップを外されたリン酸化Ｎ−グリカンを含有する標的分子を産生する工程を含むことができる。このようなリン酸化Ｎ−グリカンは、上に記載したとおり脱マンノシル化され得る。細胞を基にした別の方法は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することができる工程と、（ｉｉ）ホスフェート含有グリカンの末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を産生する工程を含むことができる。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼおよび標的分子をコードする核酸は、該マンノシダーゼおよび標的分子が共分泌されるよう、分泌配列を含有する。 (In vivo method of uncapping and demannosylating glycoproteins)
The genetically engineered cells described herein can be used to produce uncapped and demannosylated target molecules. For example, cell-based methods include nucleic acids encoding mannosidases that can hydrolyze mannose-1-phospho-6-mannose linkages or mannose-1-phospho-6-mannose moieties to phospho-6-mannose. Introducing a nucleic acid encoding the target molecule into a genetically engineered fungal cell, wherein the cell produces a target molecule containing uncapped phosphorylated N-glycans Can be included. Such phosphorylated N-glycans can be demannosylated as described above. Another cell-based method includes (i) a step of hydrolyzing a mannose-1-phospho-6-mannose linkage or mannose-1-phospho-6-mannose moiety to phospho-6-mannose; (Ii) Terminal α-1,2 mannose bond, α-1,3 mannose bond, and / or α-1,6 mannose bond or terminal α-1,2 mannose moiety, α-1,3 mannose of phosphate-containing glycan Introducing a nucleic acid encoding a target molecule into a fungal cell genetically engineered to include a nucleic acid encoding a mannosidase capable of hydrolyzing the moiety and / or the alpha-1,6 mannose moiety, wherein The cell can include the step of producing an uncapped and demannosylated target molecule. In some embodiments, the nucleic acid encoding the mannosidase and target molecule contains a secretory sequence such that the mannosidase and target molecule are co-secreted.

本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、マンノシダーゼをコードする核酸を含有する。標的分子のインビボでの産生に好適な細胞は、   The genetically engineered cells described herein contain a nucleic acid encoding a mannosidase. Suitable cells for in vivo production of the target molecule are

Figure 2013539974
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このような細胞は、本明細書に記載されるような遺伝子操作の前に、種々の商業的供給源および研究資源施設（例えば、米国培養細胞系統保存機関（米国メリーランド州ロックヴィルなど）から得ることができる。標的分子には、本明細書に記載される任意の標的タンパク質などのタンパク質が含まれる（上を参照されたい）。 Such cells are obtained from various commercial sources and research resource facilities (eg, US Cultured Cell Line Conservation Organization (Rockville, MD, USA), etc.) prior to genetic manipulation as described herein. Target molecules include proteins such as any of the target proteins described herein (see above).

細胞の遺伝子操作は、マンノシダーゼをコードする外来性核酸に加えて、（ｉ）外側鎖伸長（ＯＣＨ１）タンパク質をコードする内在性遺伝子の欠失、（ｉｉ）マンノシルリン酸化を促進してマンノース残基のリン酸化を増大させることができるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）をコードする組換え核酸の導入、（ｉｉｉ）ＯＣＨ１タンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現、（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内在性または外来性）タンパク質をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）組換え核酸の導入、（ｖ）上記の標的分子をコードする組換え核酸の導入、あるいは（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内在性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを変更し、したがってそれらののコードタンパク質の発現を変更などの１種類以上の遺伝子改変を含むことができる。ＲＮＡ分子は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。遺伝子操作には、Ｎ−グリコシル化活性を有して、付加（例えば、異種性配列）、欠失、または置換（例えば、点変異のような変異、保存的変異または非保存的変異）を有するタンパク質を産生するタンパク質をコードする内在性遺伝子を変更することも含まれる。変異は、（例えば、部位特異的変異誘発または相同組換えによって）特異的に導入することができ、または無作為に導入することができる（例えば、細胞は、例えばＮｅｗｍａｎおよびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５（４）：１５８７）に記載されるように化学的に変異誘発され得る）。   In addition to exogenous nucleic acid encoding mannosidase, genetic manipulation of cells includes (i) deletion of an endogenous gene encoding outer chain extension (OCH1) protein, and (ii) mannose residue by promoting mannosyl phosphorylation A polypeptide capable of increasing phosphorylation (eg, a MNN4 polypeptide derived from Yarrowia liplytica, S. cerevisiae, Ogataea minuta, Pichia pastoris, or C. albicans, or a PNO1 polypeptide derived from P. pastoris) Introduction of a recombinant nucleic acid encoding, (iii) introduction or expression of an RNA molecule that interferes with the functional expression of the OCH1 protein, (iv) a wild-type (eg endogenous or exogenous) tag having N-glycosylation activity Introduction of a recombinant nucleic acid encoding a protein (ie expressing a protein having N-glycosylation activity), (v) introduction of a recombinant nucleic acid encoding the target molecule, or (v) N-glycosylation One or more genetic modifications can be included, such as altering the promoter or enhancer element of one or more endogenous genes that encode proteins with activity, and thus altering the expression of those encoded proteins. RNA molecules include, for example, small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), antisense RNA, or microRNA (miRNA). Genetic engineering has N-glycosylation activity and has additions (eg, heterologous sequences), deletions, or substitutions (eg, mutations such as point mutations, conservative mutations or non-conservative mutations). It also includes altering the endogenous gene encoding the protein that produces the protein. Mutations can be introduced specifically (eg, by site-directed mutagenesis or homologous recombination) or can be introduced randomly (eg, cells can be introduced, eg, Newman and Ferro-Novick (1987)). J. Cell Biol. 105 (4): 1587) may be chemically mutagenized).

本明細書に記載される遺伝子改変は結果的に、（ｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の増大、（ｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の低下、または（ｉｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の局在性もしくは細胞内分布の変化、のうちの１つ以上を生じることができる。特定の活性の量の増大（例えば、マンノシルリン酸化を促進すること）は、マンノシルリン酸化を促進することのできる１種類以上のタンパク質を過剰発現させること、内在性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）、または内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増大を刺激する該遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの変更によることができる。１種類以上の特定の活性の低下は、変異体形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の過剰発現、特定の活性を有する１種類以上のタンパク質の発現を低下させる１種類以上の干渉性ＲＮＡ分子の導入もしくは発現、または特定の活性を有するタンパク質をコードする１種類以上の内在性遺伝子の欠失によることができる。   The genetic modification described herein results in (i) an increase in one or more activities in the genetically modified cell, (ii) a decrease in one or more activities in the genetically modified cell, or (iii) a genetic modification. One or more of the localization of one or more activities in a cell or a change in subcellular distribution can occur. Increasing the amount of a particular activity (eg, promoting mannosyl phosphorylation) can overexpress one or more proteins that can promote mannosyl phosphorylation, increase the copy number of an endogenous gene (eg, , Gene duplication), or alteration of the promoter or enhancer of the gene that stimulates increased expression of the protein encoded by the endogenous gene. Reduction of one or more specific activities may result in the overexpression of mutant forms (eg, dominant negative forms), the introduction of one or more interfering RNA molecules that reduce the expression of one or more proteins having specific activities. Alternatively, it can be by expression or deletion of one or more endogenous genes encoding a protein having a specific activity.

相同組換えによって遺伝子を破壊させるために、「遺伝子置換」ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子を含むような方法で構築することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、５’末端および３’末端の両方で、相同組換えを仲介するのに十分な長さの遺伝子の部分に作動可能に連結され得る。選択可能なマーカーは、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、およびＨＩＳ３遺伝子を含む、宿主細胞栄養要求性を補完するかまたは抗生物質耐性を提供するかのいずれかである任意の数の遺伝子のうちの１つであることができる。他の好適な選択可能なマーカーには、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現による青色コロニーを結果として生じるｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化ＤＮＡ断片を、当該技術分野で周知の方法を使用して上記細胞へと導入する（下記を参照されたい）。その線状断片のゲノムへの組込みおよび上記遺伝子の破壊は、選択マーカーを基にして決定することができ、例えば、サザンブロット分析によって実証することができる。選択可能なマーカーは、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによって宿主細胞のゲノムから除去することができる（下記を参照されたい）。   In order to disrupt a gene by homologous recombination, a “gene replacement” vector can be constructed in such a way as to contain a selectable marker gene. The selectable marker gene can be operably linked to a portion of the gene that is long enough to mediate homologous recombination at both the 5 'and 3' ends. The selectable marker is one of any number of genes that either complement host cell auxotrophy or provide antibiotic resistance, including the URA3 gene, the LEU2 gene, and the HIS3 gene. Can be. Other suitable selectable markers include the CAT gene conferring chloramphenicol resistance to yeast cells, or the lacZ gene resulting in a blue colony due to expression of β-galactosidase. Next, the linearized DNA fragment of the gene replacement vector is introduced into the cells using methods well known in the art (see below). Integration of the linear fragment into the genome and disruption of the gene can be determined based on a selectable marker and can be demonstrated, for example, by Southern blot analysis. Selectable markers can be removed from the host cell genome by, for example, the Cre-loxP system (see below).

あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の一部を含むような方法で構築することができ、該一部は、任意の内在性遺伝子プロモーター配列がまったくなく、かつ該遺伝子のコード配列のいずれもコードせず、または該コード配列の不活性断片をコードする。「不活性断片」とは、上記遺伝子の全長のコード配列から生成されるタンパク質の活性の例えば約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。上記遺伝子のこのような一部を、公知のプロモーター配列が該遺伝子配列に作動可能に連結されないものの、終止コドンおよび転写終結配列が該遺伝子配列の一部に作動可能に連結されるような方法で、ベクターに挿入する。このベクターはその後、遺伝子配列の一部において線状化し、細胞へと形質転換することができる。単一の相同組換えによって、この線状化ベクターを次に、上記遺伝子の内在性対応物に組み込む。   Alternatively, a gene replacement vector can be constructed in such a way as to include a portion of the gene to be disrupted, which portion is completely free of any endogenous gene promoter sequence and of the coding sequence of the gene. Neither encodes, or encodes an inactive fragment of the coding sequence. An “inactive fragment” is, for example, less than about 10% (eg, less than about 9%, less than about 8%, less than about 7%, less than about 6%) of the activity of a protein generated from the full-length coding sequence of the gene. , Less than about 5%, less than about 4%, less than about 3%, less than about 2%, less than about 1%, or 0%). Such a portion of the gene is ligated in such a way that a stop codon and transcription termination sequence are operably linked to a part of the gene sequence, although a known promoter sequence is not operably linked to the gene sequence. Insert into the vector. This vector can then be linearized in part of the gene sequence and transformed into cells. By linear homologous recombination, this linearized vector is then integrated into the endogenous counterpart of the gene.

発現ベクターは、自律的または組込み型であることができる。組換え核酸（例えばマンノシダーゼをコードする組換え核酸）は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはウイルス粒子のような発現ベクターの形態で細胞へと導入することができる。組換え核酸は、染色体外で維持することができ、または酵母細胞染色体ＤＮＡへと組み込むことができる。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換した細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下で細胞生存度に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含有することができる（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。発現ベクターには、自律複製配列（ＡＲＳ）も含めることができる。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるプラスミドを維持するのに好適な手段を提供する自律複製配列を記載している。   Expression vectors can be autonomous or integrative. A recombinant nucleic acid (eg, a recombinant nucleic acid encoding mannosidase) can be introduced into a cell in the form of an expression vector such as a plasmid, phage, transposon, cosmid, or viral particle. The recombinant nucleic acid can be maintained extrachromosomally or can be integrated into yeast cell chromosomal DNA. An expression vector is a selectable marker gene (eg, uracil biosynthesis) that encodes a protein required for cell viability under selected conditions to allow detection and / or selection of cells transformed with the desired nucleic acid. URA3, which encodes an enzyme required for TRP1, or TRP1, which encodes an enzyme required for tryptophan biosynthesis (see, for example, US Pat. No. 4,704,362). An expression vector can also include an autonomously replicating sequence (ARS). For example, US Pat. No. 4,837,148 describes an autonomously replicating sequence that provides a suitable means for maintaining a plasmid in Pichia pastoris.

統合型ベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号において開示されている。統合型ベクターには一般的に、少なくとも１つの第一の挿入可能なＤＮＡ断片、１つの選択可能なマーカー遺伝子、および１つの第二の挿入可能なＤＮＡ断片からなる連続的に配置された配列が含まれる。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は各々、長さ約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００、またはそれより長い）ヌクレオチドであり、かつ形質転換されるべき種のゲノムＤＮＡの部分に対して相同的であるヌクレオチド配列を有する。発現のための関心対象の遺伝子（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であろうと後であろうと、このベクターにおいて、第一の挿入可能なＤＮＡ断片と第二の挿入可能なＤＮＡ断片の間に挿入される。統合型ベクターは、関心対象のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進するために、酵母形質転換前に線状化され得る。   Integrated vectors are disclosed, for example, in US Pat. No. 4,882,279. An integrated vector generally has a sequentially arranged sequence of at least one first insertable DNA fragment, one selectable marker gene, and one second insertable DNA fragment. included. The first and second insertable DNA fragments are each about 200 nucleotides in length (eg, about 250, about 300, about 350, about 400, about 450, about 500, or about 1000, or longer) nucleotides. And has a nucleotide sequence that is homologous to a portion of the genomic DNA of the species to be transformed. The nucleotide sequence containing the gene of interest for expression (eg, a gene encoding a protein having N-glycosylation activity), whether before or after the marker gene, It is inserted between the insertable DNA fragment and the second insertable DNA fragment. The integrated vector can be linearized prior to yeast transformation to facilitate integration of the nucleotide sequence of interest into the host cell genome.

発現ベクターは、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、または他の好適な真菌種）プロモーターの制御下での組換え核酸の特色をなすことができ、該プロモーターによって、真菌細胞において発現することができる。好適な酵母プロモーターには、例えば、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ｈｐ４ｄプロモーター、ＰＯＸプロモーター、およびＧａｌ１０プロモーターが含まれる（例えば、Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（２３）：７４１０を参照されたい）。追加の好適なプロモーターは、例えば、ＺｈｕおよびＺｈａｎｇ（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５（７〜８）：６０８〜６１１ならびに米国特許第６，２６５，１８５号に記載されている。   The expression vector can feature a recombinant nucleic acid under the control of a yeast (eg, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, P. pastoris, or other suitable fungal species), and in the fungal cell Can be expressed. Suitable yeast promoters include, for example, the ADC1 promoter, TPI1 promoter, ADH2 promoter, hp4d promoter, POX promoter, and Gal10 promoter (see, eg, Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (23 ): 7410). Additional suitable promoters are described, for example, in Zhu and Zhang (1999) Bioinformatics 15 (7-8): 608-611 and US Pat. No. 6,265,185.

プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）であることができる。構成的プロモーターは、は、標準的な培養条件下で発現が一定であるプロモーターであると理解されている。誘導性プロモーターとは、１つ以上の誘導指示（Ｃｕｅ）に対して応答性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節されることができ（例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の低分子のような化学的誘導剤の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）、または物理的に調節され得る（例えば、光または高温もしくは低温のような物理的誘導因子の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターは、化学的指示または物理的指示によってそれ自体が直接的に調節される１種類以上の転写因子によって間接的に調節されることもできる。   Promoters can be constitutive or inducible (conditional). A constitutive promoter is understood to be a promoter whose expression is constant under standard culture conditions. An inducible promoter is a promoter that is responsive to one or more induction instructions (Cue). For example, an inducible promoter can be chemically regulated (eg, its transcriptional activity is regulated by the presence or absence of chemical inducers such as alcohols, tetracyclines, steroids, metals, or other small molecules. Promoter, or can be physically regulated (eg, a promoter whose transcriptional activity is regulated by the presence or absence of light or a physical inducer such as high or low temperature). Inducible promoters can also be regulated indirectly by one or more transcription factors that themselves are directly regulated by chemical or physical instructions.

遺伝子操作された他の改変も条件的であることができることは理解される。例えば、遺伝子は、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系のような部位特異的ＤＮＡ組換え酵素を使用して、条件的に欠失させることができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：１５３〜１７３および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照されたい）。   It is understood that other genetically engineered modifications can also be conditional. For example, a gene can be conditionally deleted using a site-specific DNA recombinase such as the Cre-loxP system (eg, Gossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36: 153. ˜173 and U.S. Patent Application Publication No. 2006014264).

組換え核酸は、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法のような種々の方法を使用して、本明細書に記載された細胞へと導入することができる。プラスミドまたは線状核酸ベクターの細胞への形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、米国特許第４，８７９，２３１号、およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５９：１１５に記載されており、これらの各々の開示は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。電気穿孔法およびＰＥＧ１０００全細胞形質転換法も、ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３章、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、ｐｐ．２７〜３９（１９９８）に記載されているとおり使用してもよい。   Recombinant nucleic acids can be introduced into the cells described herein using a variety of methods, such as spheroplast technology or whole cell lithium chloride yeast transformation methods. Other methods useful for transformation of plasmids or linear nucleic acid vectors into cells are described, for example, in US Pat. No. 4,929,555, Hinnen et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 1929, Ito et al. (1983) J. MoI. Bacteriol. 153: 163, US Pat. No. 4,879,231, and Sreekrishna et al. (1987) Gene 59: 115, the disclosures of each of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Built in. Electroporation and PEG1000 whole cell transformation methods are also described in Cregg and Russel, Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N .; J. et al. Pp. 27-39 (1998).

形質転換した真菌細胞は、新たな表現型の選択および検出のために（細胞の栄養要求性により）必要とされる生化学的産物の不在下で形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の不在下で酵母に対して毒性のある抗生物質の存在下で培養することを含むがこれらに限定されない適切な技術を使用することによって選択することができる。形質転換体は、例えばサザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価することのできる、ゲノムへの発現カセットの組込みによって選択および／または実証することもできる。   Transformed fungal cells are cultured after transformation in the absence of biochemical products required (by cellular auxotrophy) for selection and detection of new phenotypes, Or can be selected by using an appropriate technique including, but not limited to, culturing in the presence of an antibiotic that is toxic to yeast in the absence of the resistance gene contained in the transformant. . Transformants can also be selected and / or verified by integration of an expression cassette into the genome, which can be assessed, for example, by Southern blot or PCR analysis.

ベクターを関心対象の標的細胞に導入する前に、ベクターは、上に記載したとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞において増殖させる（例えば、増幅させる）ことができる。ベクターＤＮＡは、ベクターＤＮＡの細菌環境からの精製を結果として生じる、当該技術分野で公知の方法のうちの何らかによって、細菌細胞から単離することができる。精製されたベクターＤＮＡは、大腸菌タンパク質が哺乳類細胞に対して毒性であることができるので、これらのタンパク質がプラスミドＤＮＡ調製物中に存在しないことを確保するために、フェノール、クロロホルム、およびエーテルで徹底的に抽出することができる。   Prior to introducing the vector into the target cell of interest, the vector can be propagated (eg, amplified) in a bacterial cell, such as E. coli, as described above. Vector DNA can be isolated from bacterial cells by any of the methods known in the art that result in purification of the vector DNA from the bacterial environment. Purified vector DNA is exhaustive with phenol, chloroform, and ether to ensure that these proteins are not present in plasmid DNA preparations because E. coli proteins can be toxic to mammalian cells. Can be extracted.

一部の実施形態においては、遺伝子操作された真菌細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠いており、ＯＣＨ１活性を欠損している。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）を発現する。例えば、真菌細胞は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＭＮＮ４ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＸＭ＿５０３２１７、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照コード：ＹＡＬＩ０Ｄ２４１０１ｇ）を発現することができる。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しており、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドを発現する。   In some embodiments, the genetically engineered fungal cell lacks the OCH1 gene or gene product thereof (eg, mRNA or protein) and lacks OCH1 activity. In some embodiments, the engineered cell is a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation (eg, MNN4 from Yarrowia lipolytica, S. cerevisiae, Ogataea minuta, Pichia pastoris, or C. albicans). Polypeptide, or PNO1 polypeptide derived from P. pastoris). For example, fungal cells are The lipopolyca-derived MNN4 polypeptide (Genbank (registered trademark) accession number: XM — 503217, Genolevures reference code: YALI0D24101g) can be expressed. In some embodiments, the engineered cell is deficient in OCH1 activity and expresses a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation.

キャップを外しかつ脱マンノシル化の後、標的分子は単離することができる。一部の実施形態においては、標的分子は、酵母細胞内で維持され、細胞溶解の際に放出される。一部の実施形態においては、標的分子は、上記細胞からの該分子の分泌を誘導する、（外来性核酸に対して天然であるかまたは発現ベクターへと操作されるかのいずれかである）コード配列によって提供される機序を介して培養培地へと分泌される。細胞溶解産物または培養培地中のキャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子の存在は、該分子の存在を検出するための種々の標準的なプロトコルによって実証することができる。例えば、変更した標的分子がタンパク質である場合、このようなプロトコルは、変更した標的タンパク質に特異的な抗体（または該標的タンパク質自体）を使用するイムノブロッティングまたは放射性免疫沈降、変更した標的タンパク質に特異的なリガンド（または該標的タンパク質自体）の結合、または変更した標的タンパク質（または該標的タンパク質自体）の酵素の比活性についての試験が含まれ得るが、これらに限定されない。   After uncapping and demannosylation, the target molecule can be isolated. In some embodiments, the target molecule is maintained in the yeast cell and released upon cell lysis. In some embodiments, the target molecule induces secretion of the molecule from the cell (either native to the exogenous nucleic acid or engineered into an expression vector). It is secreted into the culture medium via the mechanism provided by the coding sequence. The presence of an uncapped and demannosylated target molecule in cell lysate or culture medium can be demonstrated by various standard protocols for detecting the presence of the molecule. For example, if the altered target molecule is a protein, such protocols can be immunoblotting or radioimmunoprecipitation using an antibody specific to the altered target protein (or the target protein itself), specific for the altered target protein. May include, but are not limited to, binding of a specific ligand (or the target protein itself), or specific enzyme activity of the altered target protein (or the target protein itself).

一部の実施形態においては、単離後に、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子は、例えば酵素的手段または化学的手段を使用して異種性部分に結合することができる。「異種性部分」は、変更した標的分子に（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）結合した任意の構成要素を指し、該構成要素は、変更した標的分子に元々存在する構成要素とは異なる。異種性部分には、例えばポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、または検出可能な（例えば、蛍光、発光、または放射性）部分を含む。一部の実施形態においては、追加のＮ−グリカンは、変更した標的分子に付加することができる。   In some embodiments, after isolation, the uncapped and demannosylated target molecule can be attached to the heterologous moiety using, for example, enzymatic or chemical means. “Heterologous moiety” refers to any component bound to a modified target molecule (eg, covalently or non-covalently), which is what is originally present in the modified target molecule Different. Heterologous moieties include, for example, polymers, carriers, adjuvants, immunotoxins, or detectable (eg, fluorescent, luminescent, or radioactive) moieties. In some embodiments, additional N-glycans can be added to the altered target molecule.

標的分子のグリコシル化を検出するための方法には、ＤＮＡシーケンサー支援型（ＤＳＡ）、フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）または表面支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）が挙げられる。例えば、分析は、例えば糖タンパク質を変性させた後に、例えばメンブラン上へ固定化するＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用することができる。上記糖タンパク質は次に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのような好適な還元剤を用いて還元することができる。上記タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸のような酸を使用してカルボキシ化することができる。次に、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦのような酵素を使用して該タンパク質から放出することができる。Ｎ−グリカンは必要に応じて、還元アミノ化によって再構成および誘導体化することができる。誘導体化したＮ−グリカンは次に濃縮することができる。Ｎ−グリカン分析に好適な計測手段には、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。データ分析は、例えばＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施することができる。単離されたマンノプロテインは、そのＮ−グリカン状態を確認するために、仔ウシ腸ホスファターゼのような１種類以上の酵素を使用してさらに処理することができる。Ｎ−グリカン分析の追加の方法には、例えば、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相における高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、グリカンが標識されていない場合にはパルス電流検出を使用し、グリカンが適切に標識されている場合、紫外吸収または蛍光を使用する）が含まれる。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１（４）：２７５〜２８１、およびＦｒｅｉｒｅら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７（２）：５５９〜５６４も参照されたい。   Methods for detecting glycosylation of target molecules include DNA sequencer assisted (DSA), fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) or surface assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF). MS). For example, the analysis can utilize, for example, DSA-FACE which is immobilized on a membrane, for example, after denaturing the glycoprotein. The glycoprotein can then be reduced using a suitable reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or β-mercaptoethanol. The sulfhydryl group of the protein can be carboxylated using an acid such as iodoacetic acid. N-glycans can then be released from the protein using an enzyme such as N-glycosidase F. N-glycans can be reconstituted and derivatized by reductive amination as required. The derivatized N-glycan can then be concentrated. Suitable measuring means for N-glycan analysis includes, for example, an ABI PRISM (registered trademark) 377 DNA sequencer (Applied Biosystems). Data analysis can be performed using, for example, GENESCAN® 3.1 software (Applied Biosystems). The isolated mannoprotein can be further processed using one or more enzymes, such as calf intestinal phosphatase, to confirm its N-glycan status. Additional methods of N-glycan analysis include, for example, mass spectrometry (eg, MALDI-TOF-MS), high pressure liquid chromatography (HPLC) in normal phase, reverse phase, and ion exchange chromatography (eg, glycan labeled) If not, pulse current detection is used, and if the glycan is properly labeled, ultraviolet absorption or fluorescence is used). Callawaert et al. (2001) Glycobiology 11 (4): 275-281, and Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17 (2): 559-564.

（操作された細胞の培養物）
本文書は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちの任意の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において使用する場合、遺伝子操作された細胞の「実質的に純粋な培養物」とは、該培養物における生細胞の総数の約４０％未満（すなわち、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．０００１％未満、またはさらにより小）が遺伝子操作された細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）、マイコプラズマ細胞、または原生動物細胞以外の生細胞である。本文脈における用語「約」とは、関連した百分率が、指定された百分率の１５％ほど指定された百分率を上回るまたは下回ることができることを意味する。したがって、例えば、約２０％とは、１７％〜２３％であることができる。遺伝子操作された細胞のこのような培養物には、細胞および、増殖媒体、保存媒体、または輸送媒体が含まれる。媒体は、液体、半固形（例えば、ゼラチン媒体）、または凍結であることができる。上記培養物には、液体または半固形媒体で増殖する細胞、または、凍結保存媒体または輸送媒体を含む保存媒体または輸送媒体中で保存または輸送される細胞が含まれる。上記培養物は、培養容器または保存容器または基材（例えば、培養皿、培養フラスコ、もしくは培養チューブ、または保存バイアルもしくは保存チューブ）の中にある。 (Cultivated cell culture)
This document also provides a substantially pure culture of any of the genetically engineered cells described herein. As used herein, a “substantially pure culture” of genetically engineered cells is less than about 40% (ie, less than about 35%, about 30% of the total number of living cells in the culture). Less than about 25%, less than about 20%, less than about 15%, less than about 10%, less than about 5%, less than about 2%, less than about 1%, less than about 0.5%, less than about 0.25% Less than about 0.1%, less than about 0.01%, less than about 0.001%, less than about 0.0001%, or even smaller), eg, bacterial cells, fungal cells (yeasts) Including), mycoplasma cells, or living cells other than protozoan cells. The term “about” in this context means that the associated percentage can be above or below the specified percentage by as much as 15% of the specified percentage. Thus, for example, about 20% can be 17% to 23%. Such cultures of genetically engineered cells include cells and growth media, storage media, or transport media. The medium can be liquid, semi-solid (eg, gelatin medium), or frozen. Such cultures include cells that grow in liquid or semi-solid media, or cells that are stored or transported in storage media or transport media, including cryopreservation media or transport media. The culture is in a culture or storage container or substrate (eg, a culture dish, culture flask, or culture tube, or storage vial or storage tube).

本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、例えば、凍結した細胞懸濁液として、例えば、グリセロールまたはスクロースのような凍結保護物質を含有するバッファ中に、凍結乾燥した細胞として保存することができる。あるいは、上記細胞は、例えば、流動床乾燥もしくは噴霧乾燥、または任意の他の好適な乾燥方法によって得られる乾燥した細胞調製物として保存することができる。   The genetically engineered cells described herein may be stored as lyophilized cells, eg, as a frozen cell suspension, eg, in a buffer containing a cryoprotectant such as glycerol or sucrose. Can do. Alternatively, the cells can be stored as a dried cell preparation obtained, for example, by fluid bed drying or spray drying, or any other suitable drying method.

（代謝障害）
キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子は、種々の代謝障害を処置するために使用することができる。代謝障害とは、個々のヒト（または動物）細胞内でのエネルギー産生に影響する障害である。ほとんどの代謝障害は遺伝性であるが、一部は、食事、毒素、感染症などの結果として「後天的」であることができる。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知である。一般に、遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程における一部のプロセスに必要な酵素を失うことまたは不適切に構成されることを結果的に生じる遺伝的欠陥に起因する。最大のクラスの代謝障害は、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、有機酸代謝の障害（有機酸性尿）、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、プリン代謝もしくはピリミジン代謝の障害、ミトコンドリア機能におけるステロイド代謝障害の障害、ペルオキシソーム機能の障害、およびリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）である。 (Metabolic disorder)
Uncapped and demannosylated molecules can be used to treat a variety of metabolic disorders. A metabolic disorder is a disorder that affects energy production in individual human (or animal) cells. Most metabolic disorders are hereditary, but some can be “acquired” as a result of diet, toxins, infections, and the like. Inherited metabolic disorders are also known as inborn errors of metabolism. In general, inherited metabolic disorders result from genetic defects that result in the loss or improper organization of enzymes required for some processes in the metabolic processes of the cell. The largest class of metabolic disorders are: carbohydrate metabolism disorders, amino acid metabolism disorders, organic acid metabolism disorders (organic acidic urine), fatty acid oxidation and mitochondrial metabolism disorders, porphyrin metabolism disorders, purine or pyrimidine metabolism disorders, Impaired steroid metabolism in mitochondrial function, impaired peroxisome function, and impaired lysosome accumulation (LSD).

キャップを外されかつ脱マンノシル化した１つ以上の分子（または該分子の薬学的組成物）の投与によって処置することのできる代謝障害の例としては、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚型白皮症、プロテインＣ欠乏症、遺伝性血管性浮腫Ｉ型、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠損症、クリグラー・ナジャーＩＩ型、ラロン症候群、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、家族性高コレステロール血症、家族性乳糜血症、無ベータリポタンパク血症（ａｂｅｔａ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍａ）、低い血漿リポタンパク質Ａレベル、肝損傷を伴う遺伝性気腫、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、α１−アンチキモトリプシン欠損症、腎性尿崩症、神経下垂体性尿崩症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッハー病、フォンウィルブランド病ＩＩＡ型、複合第Ｖ因子・第ＶＩＩＩ因子欠損症、遅発性脊椎骨端異形成、コロイデレミア、Ｉ細胞病、バッテン病、毛細管拡張性運動失調、ＡＤＰＫＤすなわち常染色体優性多発嚢胞腎症、微絨毛性封入体病、結節硬化症、ローの眼脳腎症候群、筋萎縮性側索硬化症、骨髄異形成症候群、不全リンパ球症候群、タンジアー病、家族性肝内胆汁鬱滞、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、スコット症候群、ヘルマンスキー・パドラック症候群１型および２型、ツェルヴェーガー症候群、近接短縮性点状軟骨異形成症、常染色体劣性原発性高シュウ酸尿症、モール・トラネビャエルグ（Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ）症候群、脊髄性および延髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｌａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性線毛運動不全（カルタゲナー症候群）、巨人症および先端巨大症、乳汁漏出、アジソン病、副腎性男性化、クッシング症候群、ケトアシドーシス、原発性または続発性アルドステロン症、ミラー・ディカー症候群、滑沢脳、運動ニューロン疾患、アッシャー症候群、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、オピッツ症候群（Ｏｐｔｉｚ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハンチントン病、遺伝性膵炎、抗リン脂質抗体症候群、オーバーラップ結合組織病（ｏｖｅｒｌａｐ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、ブルガダ症候群、フィンランド型先天性腎炎症候群、デュービン・ジョンソン症候群，Ｘ染色体連鎖低リン酸血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）、ペンドレッド症候群、新生児持続性高インスリン性低血糖症、遺伝性球状赤血球症、無セルロプラスミン血症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、偽性軟骨形成不全症および多発性骨端骨形成不全症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ）、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、Ｘ染色体連鎖シャルコー・マリー・ツース病、常染色体優性網膜色素変性、ウォルコット・ラリソン症候群（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クッシング病、肢帯筋ジストロフィー、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｌｏｙ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）ＩＶ型、フィンランド型遺伝性家族性アミロイドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｏｆ Ｆｉｎｉｓｈ）、アンダーソン病、肉腫、慢性骨髄単球性白血病、心筋症、顔面生殖器形成不全症（ｆａｃｉｏｇｅｎｉｔａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、捻転症、ハンチントン運動失調および脊髄小脳性運動失調、遺伝性高ホモシステイン血症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｓｙｔｅｉｎｅｍｉａ）、多発ニューロパチー、下位運動ニューロン疾患、色素性網膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、セロネガティブ多発性関節炎、間質性肺線維症、レイノー現象、ウエゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、タンパク尿（ｐｒｅｏｔｅｉｎｕｒｉａ）、ＣＤＧ−Ｉａ型、ＣＤＧ−Ｉｂ型、ＣＤＧ−Ｉｃ型、ＣＤＧ−Ｉｄ型、ＣＤＧ−Ｉｅ型、ＣＤＧ−Ｉｆ型、ＣＤＧ−ＩＩａ型、ＣＤＧ−ＩＩｂ型、ＣＤＧ−ＩＩｃ型、ＣＤＧ−ＩＩｄ型、エーラース・ダンロス症候群、多発性外骨腫症、グリセリ症候群（１型または２型）、またはＸ染色体連鎖非特異的精神遅滞を挙げることができる。加えて、代謝障害には、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス（ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症などだがこれらに限定されないリソソーム蓄積障害も含めることができる。 Examples of metabolic disorders that can be treated by administration of one or more uncapped and demannosylated molecules (or pharmaceutical compositions of the molecules) include hereditary hemochromatosis, ocular dermis Disease, protein C deficiency, hereditary angioedema type I, congenital sucrase isomaltase deficiency, crigler nager type II, laron syndrome, hereditary myeloperoxidase, primary hypothyroidism, congenital long QT syndrome, thyroxine Combined globulin deficiency, familial hypercholesterolemia, familial cholestasis, abeta-lipoproteinemia, low plasma lipoprotein A levels, hereditary emphysema with liver injury, congenital thyroid function Hypoplasia, osteogenesis imperfecta, hereditary hypofibrinogenemia, α1-antichymotry Syn deficiency, nephrogenic diabetes insipidus, neuropituitary insipidus, adenosine deaminase deficiency, Perizeus-Merzbacher disease, von Willebrand disease type IIA, complex factor V / factor VIII deficiency, delayed vertebra Dysplasia, choroideremia, I-cell disease, Batten's disease, telangiectasia ataxia, ADPKD or autosomal dominant polycystic nephropathy, microvillous inclusion body disease, tuberous sclerosis, Rho ocular and brain kidney syndrome, muscle atrophy Lateral sclerosis, myelodysplastic syndrome, dysplastic lymphocyte syndrome, tanger disease, familial intrahepatic cholestasis, X-chromosome-linked adrenoleukodystrophy, Scott syndrome, Hermannsky-Padlac syndrome type 1 and type 2, Zellweger syndrome , Proximity shortened punctate cartilage dysplasia, autosomal recessive primary hyperoxaluria, Mohl-Tranebjerg (Traneb) jaerg) syndrome, spinal and bulbar muscular atrophy, primary ciliary dyskinetics (cartagener syndrome), giantism and acromegaly, milk leakage, Addison's disease, adrenal masculinization, Cushing Syndrome, ketoacidosis, primary or secondary aldosteronism, Miller-Dicker syndrome, smooth brain, motor neuron disease, Usher syndrome, Viscott Aldrich syndrome, Optiz syndrome, Huntington's disease, hereditary pancreatitis, Anti-phospholipid antibody syndrome, overlap connective tissue disease, Sjogren's syndrome, Stiffman syndrome, Brugada syndrome, Finnish congenital nephritis Symptoms, Dubin-Johnson syndrome, X-linked hypophosphatemia, Pendred syndrome, neonatal persistent hyperinsulinic hypoglycemia, hereditary spherocytosis, aceruloplasminemia, infants Nervous ceroid lipofuscinosis, pseudochondral dysplasia and multiple epiphyseal dystrophy, Stargardt-like macular dystrophy, X-chromosome-linked Charcot-Marie-Tooth disease, autosomal dominant retinal pigment degeneration, Walcott・ Wolcott-Rallison syndrome, Cushing disease, limb girdle muscular dystrophy, mucopolysaccharidosis type IV, Finnish type familial familial amyloidosis Hereditary family amyloidosis of finnish, Anderson disease, sarcoma, chronic myelomonocytic leukemia, cardiomyopathy, facial genital dysplasia, torsion, Huntington's ataxia and spinocerebellar ataxia Homocysteinemia (hypercysteine hyperemiaineemia), polyneuropathy, lower motor neuron disease, pigmented retinitis, seronegative polyarthritis, interstitial pulmonary fibrosis, Raynaud's phenomenon, Wegener's granulomatosis (Wegner's granulomatosis), proteinuria (preinuria), CDG-Ia type, CDG-Ib type, CDG-I Type, CDG-Id type, CDG-Ie type, CDG-If type, CDG-IIa type, CDG-IIb type, CDG-IIc type, CDG-IId type, Ehrers-Danlos syndrome, multiple exostosis, glyceri syndrome (Type 1 or type 2), or X chromosome linkage non-specific mental retardation. In addition, metabolic disorders include Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM 1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhof disease, GM 2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic Leukodystrophies, Niemann-Pick disease (types A, B, and C), Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilipo disease, Morquio's disease, Maroto Lamy's disease, hyaluronidase deficiency, aspartylglucosamineuria, fucose accumulation disease, Mannose storage disease, Schindler's disease, type 1 sialidosis, Pompe disease, concentrated dysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman's disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis (type II, III and IV), cystinosis, sialic acid accumulation disorder Chylomicron storage disease with Marinesco-Sjogren's syndrome, Hermann-Pudlak syndrome, Chediak-Higashi syndrome, but I like Danon disease, or happiness facial bone dysplasia can also include lysosomal storage disorders including, but not limited to these.

代謝障害の症状は多岐にわたっており、例えば、貧血、疲労、容易な紫斑形成、少ない血小板、肝腫脹、脾腫脹、骨格の弱化、肺の欠陥、感染症（例えば、胸部の感染症または肺炎）、腎臓の欠陥、進行性脳障害、発作、非常に濃い胎便、咳嗽、喘鳴、唾液または粘液の過剰産生、息切れ、腹痛、腸閉塞または消化管閉塞、妊孕性の問題、鼻の中のポリープ、指／足指の爪および皮膚の太鼓ばち指形成、手または足の疼痛、被角血管腫、少ない発汗、角膜およびレンズの混濁、白内障、僧帽弁逸脱症および／または僧帽弁逆流、心肥大、温度不耐症（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｔｏｌｅｒｎｃｅ）、歩行困難、嚥下困難、進行性失明、進行性聴覚喪失、緊張低下、巨舌、反射消失、腰痛、睡眠時無呼吸、起座呼吸、傾眠、脊柱前弯、あるいは脊柱側弯のうちの１種類以上を含むことができる。欠損しているタンパク質または存在しないタンパク質の多様な性質および結果として生じる疾患の表現型（例えば、代謝障害の症候的呈示）により、所与の障害が一般的には、その特定の障害に対して特徴的な症状のみを示すことは理解される。例えば、ファブリー病患者は、温度不耐症、角膜回転、疼痛、皮疹、吐き気、または下痢のような、しかしこれらに限定されない上記の症状の特定の部分集合を示し得る。ゴーシェ症候群患者は、巨脾腫症、硬変、痙攣、緊張亢進、無呼吸、骨粗鬆症、または皮膚変色を示し得る。   Symptoms of metabolic disorders are diverse, such as anemia, fatigue, easy purpura formation, low platelets, liver swelling, spleen swelling, skeletal weakness, lung defects, infections (eg chest infections or pneumonia), Kidney defects, progressive brain damage, seizures, very dense meconium, cough, wheezing, saliva or mucus overproduction, shortness of breath, abdominal pain, bowel obstruction or gastrointestinal obstruction, fertility problems, polyps in the nose, fingers / Toenails and skin drumstick formation, hand or foot pain, horned hemangioma, low sweating, corneal and lens opacity, cataracts, mitral valve prolapse and / or mitral regurgitation, heart Hypertrophy, temperature intolerance, difficulty walking, difficulty swallowing, progressive blindness, progressive hearing loss, hypotonia, big tongue, reflex loss, low back pain, sleep apnea, sitting breathing, somnolence, lordosis ,is there It can include at one or more of the scoliosis. Due to the diverse nature of the missing or absent protein and the resulting disease phenotype (eg, symptomatic presentation of metabolic disorders), a given disorder is generally associated with that particular disorder. It is understood that only characteristic symptoms are shown. For example, Fabry patients may exhibit a particular subset of the above symptoms such as but not limited to temperature intolerance, corneal rotation, pain, rash, nausea, or diarrhea. Gaucher syndrome patients may exhibit splenomegaly, cirrhosis, convulsions, hypertonia, apnea, osteoporosis, or skin discoloration.

本明細書に記載されるキャップを外されかつ脱マンノシル化した１つ以上の分子の投与に加えて、代謝障害は、適切な栄養およびビタミン類（例えば、補因子療法）、理学療法、および疼痛用薬物適用によっても処置することができる。   In addition to the administration of one or more molecules uncapped and demannosylated as described herein, metabolic disorders include appropriate nutrition and vitamins (eg, cofactor therapy), physical therapy, and pain. It can also be treated by application of drugs.

所与の代謝障害の具体的な性質に応じて、患者は、いずれかの齢においてこれらの症状を示し得る。多くの症例においては、症状は、小児期にまたは青年期に示し得る。例えば、ファブリー病の症状は、少年期、例えば１０歳または１１歳で示し得る。   Depending on the specific nature of a given metabolic disorder, a patient may exhibit these symptoms at any age. In many cases, symptoms can be manifested in childhood or in adolescence. For example, symptoms of Fabry disease can be manifested as adolescents, such as 10 or 11 years old.

本明細書で使用する場合、「代謝障害を発達させる危険にある」被験体とは、障害を発達させる素因、すなわち、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、α−Ｌ−マンノシダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、またはリポタンパク質リパーゼのような酵素における変異の結果として代謝障害を発達させる遺伝素因を有する被験体である。明らかに、「代謝障害を発達させる危険にある」被験体とは、関心対象の種内の被験体すべてではない。   As used herein, a subject “at risk of developing a metabolic disorder” is a predisposition to develop a disorder, ie, acid α-glucosidase, α-galactosidase, α-L-iduronidase, β-D-galactosidase, β-glucosidase, β-hexosaminidase, β-D-mannosidase, α-L-fucosidase, arylsulfatase B, arylsulfatase A, α-N-acetylgalactosaminidase, aspartylglucosaminidase, iduronic acid-2-sulfatase , Α-glucosaminide-N-acetyltransferase, β-D-glucuronidase, hyaluronidase, α-L-mannosidase, α-neuraminidase, phosphotransferase, acid lipase, acid ceramidase, spore Gomierinaze a thioesterase, a subject having a genetic predisposition to develop metabolic disorders as a result of a mutation in the enzyme as a cathepsin K or lipoprotein lipase. Clearly, a subject “at risk of developing a metabolic disorder” is not all subjects in the species of interest.

「障害を有すると疑われる」被験体とは、本明細書に記載される代謝障害のうちのいずれかなど代謝障害の１つ以上の症状を有する被験体である。   A subject “suspected of having a disorder” is a subject that has one or more symptoms of a metabolic disorder, such as any of the metabolic disorders described herein.

（薬学的組成物および処置方法）
キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子は、治療有効量の該分子と１種類以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤とを含有する薬学的組成物へと組み込むことができる。許容し得る希釈剤、キャリア、および賦形剤は典型的には、受容者の恒常性（例えば、電解質平衡）に有害に影響することはない。許容し得るキャリアには、生体適合性、不活性、または生体吸収可能な塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、保存剤などが含挙げられる。ある例示的なキャリアは、生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）である。別の例示的なキャリアは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。薬学的組成物の製剤化および投与についての技術に関するさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ペンシルバニア州イーストン）において得ることができる。補充用活性化合物も上記組成物中に組み込むことができる。 (Pharmaceutical compositions and methods of treatment)
The uncapped and demannosylated target molecule can be incorporated into a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of the molecule and one or more adjuvants, excipients, carriers, and / or diluents. it can. Acceptable diluents, carriers, and excipients typically do not adversely affect recipient homeostasis (eg, electrolyte balance). Acceptable carriers include biocompatible, inert, or bioabsorbable salts, buffers, oligosaccharides or polysaccharides, polymers, viscosity improvers, preservatives, and the like. One exemplary carrier is saline (0.15 M NaCl, pH 7.0-7.4). Another exemplary carrier is 50 mM sodium phosphate, 100 mM sodium chloride. Further details regarding techniques for formulation and administration of pharmaceutical compositions can be obtained, for example, at Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa., USA). Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.

キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子を含有する薬学的組成物の投与は、全身性または局所性であることができる。薬学的組成物は、非経口投与および／または経口投与に好適であるよう製剤化することができる。具体的な投与様式には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、髄腔内投与、経口投与、直腸投与、口腔投与、局所投与、鼻投与、眼投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、リンパ投与、膣投与、および子宮内投与が含まれる。   Administration of pharmaceutical compositions containing uncapped and demannosylated molecules can be systemic or local. The pharmaceutical composition can be formulated to be suitable for parenteral and / or oral administration. Specific administration modes include subcutaneous administration, intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, transdermal administration, intrathecal administration, oral administration, rectal administration, buccal administration, topical administration, nasal administration, ocular administration, Intraarticular administration, intraarterial administration, subarachnoid administration, bronchial administration, lymphatic administration, vaginal administration, and intrauterine administration are included.

投与は、薬学的組成物のボーラスによる周期的注入によることができるか、または外部（例えば、静脈内用の袋）または内部（例えば、生分解性埋没物、生体人工臓器、または植え込み型の改変Ｎ−グリコシル化分子産生細胞のコロニー）である貯蔵器からの静脈内投与または腹腔内投与によって中断されないでいることができ、もしくは持続的であることができる。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号、および同第５，８００，８２８号を参照されたい。薬学的組成物の投与は、ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ、４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４：１６９８（１９８４）を参照されたい）、マイクロカプセル封入（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号、同第４，３５３，８８８号、および同第５，０８４，３５０号を参照されたい）、持続放出性ポリマー埋没物（例えば、Ｓａｂｅｌの米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい）、マクロカプセル封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびにＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９２／１９１９５号、ＷＯ９５／０５４５２号を参照されたい）、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、もしくは他の好適な部位のいずれかへの注射、またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、もしくは持続放出製剤での経口投与のような好適な送達手段を使用して達成することができる。   Administration can be by periodic bolus injection of the pharmaceutical composition, or external (eg, intravenous bag) or internal (eg, biodegradable implant, bioartificial organ, or implantable modification) Colonies of N-glycosylated molecule producing cells) can be uninterrupted or persistent by intravenous or intraperitoneal administration from reservoirs. See, for example, U.S. Pat. Nos. 4,407,957, 5,798,113, and 5,800,828. Administration of the pharmaceutical composition is by pump (see, eg, Anals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984)), microencapsulated (See, eg, US Pat. Nos. 4,352,883, 4,353,888, and 5,084,350), sustained release polymer implants (eg, Sabel US Pat. No. 4,883,666), macroencapsulation (eg, US Pat. Nos. 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859, and 4,968,733, as well as PCT published patent applications WO92 / 19195, WO95 / 5452), injection subcutaneously, intravenously, intraarterially, intramuscularly, or any other suitable site, orally in capsules, solutions, tablets, pills, or sustained release formulations It can be achieved using suitable delivery means such as administration.

非経口送達系の例としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み可能な注入系、ポンプ送達、被包細胞送達、リポソーム送達、針送達系注射、無針注射、ネブライザー、エーロゾライザー、電気穿孔法、および経皮パッチが挙げられる。   Examples of parenteral delivery systems include ethylene-vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, implantable infusion systems, pump delivery, encapsulated cell delivery, liposome delivery, needle delivery system injection, needleless injection, nebulizers, aerosols Includes risers, electroporation, and transdermal patches.

非経口投与に好適な製剤は、改変Ｎ−グリコシル化分子の滅菌水性調製物を便利に含有しており、好ましくは受容者の血液と等張である（例えば、生理学的塩類溶液）。製剤は、単位用量形態または複数回用量形態で提供することができる。   Formulations suitable for parenteral administration conveniently contain a sterile aqueous preparation of the modified N-glycosylated molecule and are preferably isotonic with the recipient's blood (eg, physiological saline). The formulation can be provided in unit dose form or in multiple dose forms.

経口投与に好適な製剤は、各々、あらかじめ決めておいた量の改変Ｎ−グリコシル化分子を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤、もしくはロゼンジ、またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤、もしくは頓服水剤（ｄｒａｕｇｈｔ）のような、水性リカーもしくは非水性液中の懸濁剤のような分離した単位として提供することができる。   Formulations suitable for oral administration are capsules, cachets, tablets, or lozenges each containing a predetermined amount of a modified N-glycosylated molecule, or syrup, elixir, emulsion, or swallowed water Can be provided as discrete units, such as aqueous liquor or suspensions in non-aqueous liquids, such as

局所投与に好適なキャップを外されかつ脱マンノシル化した分子は、哺乳類（例えば、ヒト患者）へ、例えばクリーム、スプレー、泡状物質、ジェル、軟膏、塗薬、またはドライラブ（ｄｒｙ ｒｕｂ）として投与することができる。ドライラブは、投与部位で再含水することができる。このような分子は、包帯、ガーゼ、またはパッチへも直接注入することができ（例えば、浸漬して、および乾燥して）、次に、それは局所的に適用することができる。このような分子は、局所投与のための包帯、ガーゼ、またはパッチに半液状、ゲル状、または完全に液状で維持することもできる（例えば、米国特許第４，３０７，７１７号を参照されたい）。   Uncapped and demannosylated molecules suitable for topical administration are administered to mammals (eg, human patients) as, for example, creams, sprays, foams, gels, ointments, paints, or dry rubs can do. The dry lab can be rehydrated at the site of administration. Such molecules can also be injected directly into bandages, gauze, or patches (eg, soaked and dried), which can then be applied topically. Such molecules can also be maintained in a semi-liquid, gel-like, or completely liquid state in a bandage, gauze, or patch for topical administration (see, eg, US Pat. No. 4,307,717). ).

治療有効量の薬学的組成物は、それを必要とする被験体へ、当業者によって確かめることのできる投与計画で投与することができる。例えば、組成物は、上記被験体へ、例えば１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０，０００μｇの薬用量で全身投与することができる。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１００μｇである。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜３０μｇ、例えば、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり３μｇ〜１０μｇである。   A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition can be administered to a subject in need thereof on a dosage regime ascertainable by one skilled in the art. For example, the composition can be systemically administered to the subject, for example, at a dosage of 0.01 μg to 10,000 μg per kg body weight of the subject per dose. In another example, the dosage is 1 μg to 100 μg per kg body weight of the subject per dose. In another example, the dosage is 1 μg to 30 μg per kg body weight of the subject per dose, eg, 3 μg to 10 μg per kg subject weight per dose.

治療効能を最適化するために、キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子はまず、異なる投与計画で投与することができる。単位用量および計画は、例えば、哺乳類の種、その免疫状態、該哺乳類の体重を含む因子に左右される。典型的には、組織におけるこのような分子のレベルは、例えば、所与の処置計画の効能を決定するための臨床試験手順の一部として適切なスクリーニングアッセイを使用して監視することができる。   In order to optimize therapeutic efficacy, uncapped and demannosylated molecules can be initially administered in different dosing schedules. The unit dose and schedule will depend on factors including, for example, the species of mammal, its immune status, and the weight of the mammal. Typically, the level of such molecules in a tissue can be monitored, for example, using an appropriate screening assay as part of a clinical trial procedure to determine the efficacy of a given treatment plan.

キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子についての投与頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護師）の技術および臨床的判断のうちにある。典型的には、投与計画は、最適な投与パラメータを確立し得る臨床試験によって確立する。しかしながら、上記従事者は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医学的状態に従ってこのような投与計画を変更してもよい。投与の頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変更することができる。   The frequency of administration for uncapped and demannosylated molecules is within the skill and clinical judgment of a healthcare professional (eg, a doctor or nurse). Typically, dosing schedules are established by clinical trials that can establish optimal dosing parameters. However, the practitioner may change such dosing regimes according to the subject's age, health, weight, sex, and medical condition. The frequency of administration can vary depending on whether the treatment is prophylactic or therapeutic.

このような分子またはその薬学的組成物の毒性および治療的効能は、例えば細胞培養物または実験動物における公知の医薬手順によって決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するために使用することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。毒性のある副作用を示す薬学的組成物を使用することはできるが、正常細胞（例えば、非標的細胞）に対する潜在的な障害を最小化し、それにより副作用を低減するために、影響される組織の部位にこのような化合物を向ける送達系を設計するよう注意を払うべきである。 Toxicity and therapeutic efficacy of such molecules or pharmaceutical compositions thereof can be determined by known pharmaceutical procedures, for example in cell cultures or experimental animals. These procedures can be used, for example, to determine LD 50 (amount that 50% of the population is lethal) and ED 50 (therapeutically effective amount in 50% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD 50 / ED 50. Pharmaceutical compositions that exhibit high therapeutic indices are preferred. Pharmaceutical compositions that exhibit toxic side effects can be used, but in order to minimize potential damage to normal cells (eg, non-target cells) and thereby reduce side effects, Care should be taken to design a delivery system that directs such compounds to the site.

細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、適切な被験体（例えば、ヒト患者）における使用のためのある範囲の薬用量を製剤化する上で使用することができる。このような薬学的組成物の薬用量は一般的に、ほとんどまたはまったく毒性を有さないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内に収まる。薬用量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。（例えば、被験体における代謝障害を処置するために）本明細書に記載されるように使用される薬学的組成物については、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する薬学的組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。 Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosages for use in appropriate subjects (eg, human patients). The dosage of such pharmaceutical compositions is generally little or falls within a range of circulating concentrations that completely include the ED 50 with no toxicity. The dosage may vary within this range depending on the dosage form employed and the route of administration utilized. For pharmaceutical compositions used as described herein (eg, for treating metabolic disorders in a subject), the therapeutically effective dose can be estimated initially from cell culture assays. The dose is formulated in an animal model to achieve a circulating plasma concentration range that includes an IC 50 (ie, the concentration of the pharmaceutical composition that achieves half-maximal inhibition of symptoms) as determined in cell culture. Can do. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. Plasma levels can be measured, for example, by high performance liquid chromatography.

本明細書において定義する場合、キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子の「治療有効量」とは、処置された被験体における医学的に望ましい結果（例えば、代謝障害の１種類以上の症状の改善）を生むことのできる分子の量である。治療有効量（すなわち、有効薬用量）には、被験体の体重または試料の重量の１キログラムあたりの化合物のミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム〜１キログラムあたり約５ミリグラム、または１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含めることができる。   As defined herein, a “therapeutically effective amount” of an uncapped and demannosylated molecule is a medically desirable result (eg, of one or more symptoms of a metabolic disorder) in a treated subject. The amount of molecules that can produce (improvement). A therapeutically effective amount (ie, effective dosage) includes a milligram or microgram amount of compound per kilogram of the subject's body weight or sample weight (eg, about 1 microgram per kilogram to about 500 per kilogram Milligrams, about 100 micrograms per kilogram to about 5 milligrams per kilogram, or about 1 microgram per kilogram to about 50 micrograms per kilogram).

被験体は、任意の哺乳類、例えばヒト（例えば、ヒト患者）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、ある種の家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ）、イヌ、ネコ、またはクジラであることができる。   The subject can be any mammal, such as a human (eg, a human patient) or a non-human primate (eg, chimpanzee, baboon, or monkey), mouse, rat, rabbit, guinea pig, gerbil, hamster, horse, or some livestock. (E.g., cow, pig, sheep, or goat), dog, cat, or whale.

本明細書に記載される分子またはその薬学的組成物は、被験体へ、別の処置、例えば、代謝障害（例えば、リソソーム蓄積障害）のための処置との併用療法として投与することができる。例えば、併用療法には、被験体（例えば、ヒト患者）へ、代謝障害（例えば、リソソーム蓄積障害）を発達させる（または有すると疑われる）危険を有するまたは該危険にある被験体へ治療上の利点を提供する１種類以上の追加の薬剤を投与することを含めることができる。したがって、上記化合物または薬学的組成物および１種類以上の追加の薬剤は、同時に投与することができる。あるいは、上記分子を第一に投与し、かつ第二に上記１種類以上の追加の薬剤を投与することができ、またはその逆を行なうこともできる。   The molecules described herein, or pharmaceutical compositions thereof, can be administered to a subject as a combination therapy with another treatment, such as a treatment for a metabolic disorder (eg, a lysosomal storage disorder). For example, in combination therapy, a subject (eg, a human patient) has a risk of developing (or suspected of having) a metabolic disorder (eg, a lysosomal storage disorder) and is therapeutic to a subject at risk. Administering one or more additional agents that provide benefits can be included. Thus, the compound or pharmaceutical composition and one or more additional agents can be administered simultaneously. Alternatively, the molecule can be administered first and secondly the one or more additional agents can be administered, or vice versa.

以前の治療薬が特に毒性である場合（例えば、重大な副作用特性を有する、代謝障害に対する処置）においては、本明細書に記載される分子の投与を用いて、以前の治療薬の量を、毒性を有さずに同じかまたは改良された治療上の利点を与えるのに十分なレベルまで代償するおよび／または低下させることができる。   In cases where the previous therapeutic agent is particularly toxic (e.g., treatment for metabolic disorders that have significant side-effect properties), administration of the molecules described herein can be used to It can be compensated and / or reduced to a level sufficient to provide the same or improved therapeutic benefit without toxicity.

本明細書に記載される薬学的組成物のうちの任意のものが、投与のための指示とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。   Any of the pharmaceutical compositions described herein can be included in a container, pack, or dispenser along with instructions for administration.

以下は、本発明の実施例である。該実施例は、本発明の範囲をいずれかの方法で制限するものとして解釈されるべきではない。   The following are examples of the invention. The examples should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.

実施例１
（ヒトαグルコシダーゼ発現株の生成）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＯＸＹＹ１５８９を以下のとおり構築した。上記株は、３コピーのヒトαグルコシダーゼ遺伝子（ｈｕＧＡＡ、酸性αグルコシダーゼまたは酸性マルターゼＥＣ３．２．１．３としても公知）および２コピーのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４遺伝子を含有する。ＯＸＹ１５８９株の遺伝子型は、以下のとおりである。 Example 1
(Generation of human α-glucosidase expression strain)
Y. The lipolytica strain OXYY1589 was constructed as follows. The strain contains 3 copies of the human α-glucosidase gene (also known as huGAA, acid α-glucosidase or acid maltase EC 3.2.1.3) and 2 copies of Y. contains the lipolytica MNN4 gene. The genotype of the OXY1589 strain is as follows.

Figure 2013539974
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形質転換はすべて、異なる選択的マーカーのための改変を使用する十分に確立されたプロトコルに従って実施した。別段の指定がない限り、ｈｕＧＡＡ組込み断片を発現プラスミドのＮｏｔＩ制限消化によって得て、カナマイシン耐性遺伝子を除去した。制限消化から結果的に生じる断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ｈｕＧＡＡ断片をＱｉａｇｅｎカラム精製した。３つの安定した組込み型形質転換を実施して、最終のｈｕＧＡＡ産生株ＯＸＹＹ１５８９を得た。   All transformations were performed according to well-established protocols using modifications for different selective markers. Unless otherwise specified, the huGAA integration fragment was obtained by NotI restriction digestion of the expression plasmid to remove the kanamycin resistance gene. The fragments resulting from restriction digests were separated by agarose gel electrophoresis, and the huGAA fragment was purified by Qiagen column. Three stable integrative transformations were performed to obtain the final huGAA production strain OXYY1589.

（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化ｈｕＧＡＡ発現ベクター）
１１０ｋＤＡのｈｕＧＡＡ前駆体をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成し、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現についてコドン最適化した。表１は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてのコドン使用頻度を示す。データは、５，９６７のコード配列に存在する２，９４５，９１９のコドンに由来した。表１の内容は、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝２８４５９１におけるワールドワイドウェブ見出すことのできるコドン使用頻度データベースから得た。 (Y. lipolytica codon optimized huGAA expression vector)
A nucleotide sequence encoding a 110 kDa huGAA precursor was chemically synthesized; Codon optimized for lipolytica expression. Table 1 shows Y.C. The codon usage frequency for lipolytica is shown. Data were derived from 2,945,919 codons present in the 5,967 coding sequence. The contents of Table 1 are kazusa. or. jp / codon / cgi-bin / showcodon. cgi? It was obtained from the World Wide Web found codon usage database at specifications = 284591.

Figure 2013539974
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合成コンストラクトにおいては、上記タンパク質がアミノ酸５７において開始するよう、プレｈｕＧＡＡシグナルペプチドおよびプロｈｕＧＡＡシグナルペプチドを除去した。ｈｕＧＡＡの合成オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（図１Ａ）をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２シグナル配列（プレ）の５’末端から３’末端までをインフレームで融合させ、２つのＸｘｘ−Ａｌａ切断部位のコード配列をその後に続け、発現ベクターへのクローニングのためのＢａｍＨＩ制限部位およびＡｖｒＩＩ制限部位を隣接させた。上記コンストラクトにおいては、融合ポリペプチドをコードする配列は、誘導性ＰＯＸ２プロモーターの制御下にあった。融合コンストラクトの完全なアミノ酸配列を図１Ｂに示す。   In the synthetic construct, the pre-huGAA signal peptide and the pro-huGAA signal peptide were removed so that the protein starts at amino acid 57. The synthetic open reading frame (ORF) of huGAA (FIG. The 5 ′ to 3 ′ end of the lipolytica LIP2 signal sequence (pre) is fused in-frame, followed by the coding sequence of two Xxx-Ala cleavage sites, and a BamHI restriction site for cloning into the expression vector and An AvrII restriction site was flanked. In the construct, the sequence encoding the fusion polypeptide was under the control of the inducible POX2 promoter. The complete amino acid sequence of the fusion construct is shown in FIG. 1B.

Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現ベクターの一般的な概略図を図２に示す。細菌部分は、ｐＨＳＳ６プラスミドに由来しており、細菌複製起点（ｏｒｉ）およびカナマイシンに対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含有する。組込みカセットは、ａ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの形質転換のための選択マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２）、ｂ）プロモーターから構成される発現カセット、ｃ）インフレームでシグナル配列とともにｈｕＧＡＡを挿入するためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、およびｄ）ＬＩＰ２遺伝子のターミネーターを含む。組込みカセットは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムへの安定した非相同組込みのためのζ配列によって隣接される。２つのＮｏｔＩ制限部位は、形質転換前の発現カセットの単離を可能にする。ｐＲＡＮ０３４プラスミド、ｐＲＡＮ０３６プラスミド、およびＯＸＹＰ１８３プラスミドを使用して、ＵＲＡ３形質転換マーカー、ＬＥＵ２形質転換マーカー、およびＧＵＴ２形質転換マーカーをそれぞれ含有するｈｕＧＡＡ発現ベクターｐＲＡＮ０５８、ｐＲＡＮ０５９、およびｐＲＡＮ０６０をそれぞれ生成した。   Y. A general schematic of the lipolytica expression vector is shown in FIG. The bacterial part is derived from the pHSS6 plasmid and contains the bacterial origin of replication (ori) and the kanamycin resistance gene (KanR) conferring resistance to kanamycin. Integration cassettes are: a) selectable markers for transformation into Yarrowia lipolytica (URA3, LEU2, GUT2), b) expression cassette composed of promoter, c) multiple for inserting huGAA with signal sequence in frame A cloning site (MCS), and d) a terminator of the LIP2 gene. The built-in cassette is Y.C. Flanked by ζ sequences for stable non-homologous integration into the lipolytica genome. Two NotI restriction sites allow for isolation of the expression cassette prior to transformation. pRAN034 plasmid, pRAN036 plasmid, and OXYP183 plasmid were used to generate huGAA expression vectors pRAN058, pRAN059, and pRAN060, respectively containing URA3 transformation marker, LEU2 transformation marker, and GUT2 transformation marker.

（縦列ＹｌＭＮＮ４発現ベクターＯＸＹＰ１４７０Ｂ）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４（ＹｌＭＮＮ４）遺伝子を、誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターの制御下で、かつ（半）構成的ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローン化した。ＹｌＭＮＮ４のこれら２つの発現カセットを１つのベクターにおいて、ゲノムのＡＤＥ２遺伝子座への標的化組込みのためのＡＤＥ２遺伝子と選択的マーカーとしてのＡＤＥ２遺伝子からなる隣接領域（ＰＴ）を保有する縦列コンストラクトとしてサブクローニングした。 (Tandem YlMNN4 expression vector OXYP1470B)
Y. The lipolytica MNN4 (YlMNN4) gene was cloned under the control of the inducible pPOX2 promoter and under the control of the (semi) constitutive hp4d promoter. Subcloning these two expression cassettes of YlMNN4 in one vector as a tandem construct carrying a contiguous region (PT) consisting of the ADE2 gene for targeted integration into the genomic ADE2 locus and the ADE2 gene as a selective marker did.

（中間株ＯＸＹＹ１５６９）
第一の形質転換は、中間の組換え株ＯＸＹＹ１５６９を作製するため、ＵＲＡ３マーカーおよびＬＥＵ２マーカーを使用して、ｐＲＡＮ０５８ベクターおよびｐＲＡＮ０５９ベクターから精製した発現カセットを有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＧ０１４株の共形質転換であった。したがって、ＯＸＹＹ１５６９は、Ｇ０１４株のゲノムに無作為に組み込まれたｐＰＯＸ２プロモーターの制御下でｈｕＧＡＡの２つの発現コンストラクトを保有している。 (Intermediate stock OXYY1569)
The first transformation was performed using a URA3 marker and a LEU2 marker to generate an intermediate recombinant strain OXYY1569, and Y. cerevisiae having expression cassettes purified from the pRAN058 and pRAN059 vectors. It was cotransformation of lipolytica G014 strain. Thus, OXYY1569 carries two expression constructs of huGAA under the control of the pPOX2 promoter randomly integrated into the G014 strain genome.

ＯＸＹＹ１５６９を以下のとおり選択した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムへのｈｕＧＡＡ ＤＮＡの組込みは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングによって確認した。ＰＣＲ反応のためのプライマーは、ｈｕＧＡＡヌクレオチド配列の２５５２塩基対の断片を増幅させるよう設計した。少なくとも２コピーのｈｕＧＡＡ ＤＮＡの組込みを確認するために、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析も実施した。詳細には、ＯＸＹＹ１５６９クローン由来のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｈｕＧＡＡ ＤＩＧ標識した特異的プローブを使用して探査した。   OXYY1569 was selected as follows. Y. Integration of huGAA DNA into the lipolytica genome was confirmed by PCR screening of genomic DNA. The primers for the PCR reaction were designed to amplify a 2552 base pair fragment of the huGAA nucleotide sequence. Southern blot analysis of genomic DNA was also performed to confirm the incorporation of at least two copies of huGAA DNA. Specifically, genomic DNA from the OXYY1569 clone was probed with a specific probe digested with HindIII and labeled with huGAA DIG.

高レベルのｈｕＧＡＡを分泌するクローンを選択するために、少なくとも２コピーのｈｕＧＡＡ ＤＮＡの組込みの確認された無作為に選択したいくつかのクローンを、１％酵母抽出物、２％ペプトン、および５％乳化オレイン酸を含有する培地を使用するＰＯＸ２誘導条件下で、振盪フラスコ中で増殖させた。すべての場合において、培養上清を誘導７２時間後に回収し、標準的なウェスタンブロットおよび実施例３に記載される４−ＭＵＧアッセイを使用する酵素活性アッセイ分析においてスクリーニングした。ＯＸＹＹ１５６９のＮ−グリカン分析は、ＯＸＹＹ１５６９における支配的な構造がＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であることを示した。 In order to select clones that secrete high levels of huGAA, several randomly selected clones confirmed to integrate at least 2 copies of huGAA DNA were selected from 1% yeast extract, 2% peptone, and 5% Grow in shake flasks under POX2 induction conditions using medium containing emulsified oleic acid. In all cases, culture supernatants were collected 72 hours after induction and screened in standard Western blots and enzyme activity assay analysis using the 4-MUG assay described in Example 3. N-glycan analysis of OXYY1569 showed that the predominant structure in OXYY1569 is Man 8 GlcNAc 2 .

（中間の株ＯＸＹＹ１５８４）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４遺伝子の２つのコピーをそのゲノムに組み込んで、ＯＸＹＹ１５８４を生成するために、プラスミドＯＸＹＰ１４７９Ｂから切り出した発現カセットを使用して組換え株ＯＸＹＹ１５６９を形質転換した。プラスミドＯＸＹＰ１４７９ＢからＳａｃＩＩ／ＸｍａＩ制限消化を使用して、発現カセットを切り出した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムのＡＤＥ２遺伝子座への標的化組込みのために発現カセットを設計した。組換え株をサザンブロット法およびグリカン分析の後に選択して、増大したリン酸化に関する該株の挙動を評価した。任意に選択したいくつかの形質変換体のゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、ＭＮＮ４特異的なＤＩＧ標識したプローブを使用して探査した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムのＡＤＥ２遺伝子座へのＭＮＮ４発現カセットの正確な標的化組込みは、ＳｐｅＩ消化後に４２０７塩基対および５６８３塩基対のバンドを生じた。陽性クローンを標準的な振盪フラスコ手順で増殖させた。中間のクローンＯＸＹＹ１５８４を選択するために、分泌したタンパク質のＮ−グリカン分析を実施した。親株ＯＸＸＹ１５６９と比較して、ＭＮＮ４過剰発現後の支配的な構造は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（ＰＭａｎ）１およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（ＰＭａｎ）２であった。 (Intermediate stock OXY1584)
Y. In order to integrate two copies of the lipolytica MNN4 gene into its genome and generate OXYY1584, an expression cassette excised from plasmid OXYP1479B was used to transform recombinant strain OXYY1569. The expression cassette was excised from plasmid OXYP1479B using SacII / XmaI restriction digestion. Y. An expression cassette was designed for targeted integration of the lipolytica genome into the ADE2 locus. Recombinant strains were selected after Southern blotting and glycan analysis to assess their behavior with respect to increased phosphorylation. The genomic DNA of several arbitrarily selected transformants was digested with SpeI and probed using MNN4-specific DIG-labeled probes. Y. Accurate targeted integration of the MNN4 expression cassette into the ADE2 locus of the lipolytica genome resulted in 4207 and 5683 base pair bands after SpeI digestion. Positive clones were grown using standard shake flask procedures. In order to select the intermediate clone OXYY1584, N-glycan analysis of the secreted protein was performed. Compared to the parent strain OXXY1569, the dominant structures after MNN4 overexpression were Man 8 GlcNAc 2 (PMan) 1 and Man 8 GlcNAc 2 (PMan) 2 .

（産生株ＯＸＹＹ１５８９）
最終の原栄養体産生株ＯＸＹＹ１５８９を生成するために、ｈｕＧＡＡの第三のコピーを組換えＯＸＹＹ１５８４株のゲノムに組み込んだ。ｐＲＡＮ０６９からＮｏｔＩで切り出した発現カセットを使用して形質転換を実施した。最初に、ｈｕＧＡＡの追加のコピーの存在について、形質転換体のゲノムＤＮＡをＰＣＲによってスクリーニングした。ｈｕＧＡＡ産生を評価するために、標準的な振盪フラスコ培養後の発現について、任意に選択したＰＣＲ陽性クローンをさらに分析した。最高レベルのｈｕＧＡＡを発現するクローン（ＯＸＹＹ１５８９）をウェスタンブロット分析および酵素活性アッセイ（実施例３に記載される４−ＭＵＧアッセイ）後に選択した。Ｍ８のＭＰ２−Ｍ８ Ｎ−グリカンおよびＭＰ−Ｍ８ Ｎ−グリカンへの転換レベルが追加のｈｕＧＡＡ発現カセットの存在によって影響されないことも再確認した。 (Production strain OXY1589)
A third copy of huGAA was integrated into the genome of the recombinant OXYY1584 strain to generate the final prototrophic production strain OXYY1589. Transformation was performed using an expression cassette excised from pRAN069 with NotI. Initially, transformant genomic DNA was screened by PCR for the presence of additional copies of huGAA. To evaluate huGAA production, randomly selected PCR positive clones were further analyzed for expression after standard shake flask culture. A clone expressing the highest level of huGAA (OXYY1589) was selected after Western blot analysis and enzyme activity assay (4-MUG assay described in Example 3). It was also reconfirmed that the conversion level of M8 to MP2-M8 N-glycan and MP-M8 N-glycan was not affected by the presence of an additional huGAA expression cassette.

実施例２
（ＯＸＹＹ１５８９株の流加培養）
ＯＸＹＹ１５８９株（実施例１）からｈｕＧＡＡを産生するために、作業容積６〜８Ｌを有する撹拌した１０Ｌタンクを使用して流加プロセスを確立した。上記プロセスを２つの相に分割した。 Example 2
(Fed-batch culture of OXYY1589 strain)
To produce huGAA from OXYY 1589 strain (Example 1), a fed-batch process was established using a stirred 10 L tank with a working volume of 6-8 L. The above process was divided into two phases.

１）バイオマス形成のためのグルコースに関するバッチ増殖
２）限定されたオレイン酸供給の支援による誘導による産物形成。 1) Batch growth on glucose for biomass formation 2) Product formation by induction with support of limited oleic acid supply.

典型的には、バッチ相は約２０時間（ｈ）であり、産生相はおよそ７２時間であった。上記プロセスの終了時点で、培養ブロスを遠心分離し、上清を回収した。上清をｈｕＧＡＡの精製のための出発材料として使用した（実施例３を参照されたい）。   Typically, the batch phase was about 20 hours (h) and the production phase was approximately 72 hours. At the end of the process, the culture broth was centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was used as starting material for the purification of huGAA (see Example 3).

以下のパラメータを発酵中に制御した。エアレーションを１．５ｖｖｍ空気（１分間あたり１容積あたりの容積）の一定値で維持した。溶存酸素（ＤＯ）を初期には３０％で維持した。撹拌を６００ｒｐｍから１２００ｒｐｍへとＤＯレベルに応じて増大させた。一旦撹拌が最大値１２００ｒｐｍに到達すると、その速度を一定のままにし、ＤＯ設定値を１０％に設定した。１０％ＤＯを維持するために、酸素を５０％の最大百分率で反応器へと加えた。泡沫の発生（ｆｏａｍ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を泡沫プローブによって制御した。泡沫を検出した場合、消泡剤をバイオリアクターへ添加した。ｐＨ６．８の一定値を維持するために、１４％（ｖ／ｖ）アンモニア（塩基）または１０％リン酸を添加することによって、ｐＨを制御した。全プロセスの間中、温度を２８℃で一定のままにした。   The following parameters were controlled during fermentation. Aeration was maintained at a constant value of 1.5 vvm air (volume per volume per minute). Dissolved oxygen (DO) was initially maintained at 30%. Agitation was increased from 600 rpm to 1200 rpm depending on the DO level. Once the agitation reached the maximum value of 1200 rpm, the speed was kept constant and the DO setting was set to 10%. In order to maintain 10% DO, oxygen was added to the reactor at a maximum percentage of 50%. Foam evolution was controlled by a foam probe. If foam was detected, an antifoam was added to the bioreactor. In order to maintain a constant value of pH 6.8, the pH was controlled by adding 14% (v / v) ammonia (base) or 10% phosphoric acid. The temperature remained constant at 28 ° C. throughout the entire process.

バイオマスを、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）の測定によって監視した。試料を蒸留水で２〜１０００倍希釈して、分光光度計の直線範囲で値を得た。産物形成をウェスタンブロット分析および特異的酵素活性試験によって検出した。   Biomass was monitored by measurement of optical density (OD600) at 600 nm. Samples were diluted 2-1000 times with distilled water and values were obtained in the linear range of the spectrophotometer. Product formation was detected by Western blot analysis and specific enzyme activity test.

実施例３
（組換えｈｕＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）の精製）
培養後の上清（実施例２を参照されたい）を、デプス濾過を介して清澄化した。次に、結果として生じる材料を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を介して２０倍濃縮し、１０ｋＤａのＭＮＣＯメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および１００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析濾過した。 Example 3
(Purification of recombinant huGAA (rhGAA))
The supernatant after culturing (see Example 2) was clarified via depth filtration. The resulting material was then concentrated 20-fold via tangential flow filtration (TFF) and dialyzed against 20 mM sodium phosphate (pH 6) and 100 mM NaCl using a 10 kDa MNCO membrane (Millipore). Filtered.

ｒｈＧＡＡの精製を、最高１Ｍ濃度までの硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。遠心分離後、上清をＴｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＸＫ１６／４０カラムにのせた。１Ｍから０Ｍへの硫酸アンモニウムの直線勾配を溶出に適用した。次に、ｒｈＧＡＡを含有する画分をプールし、１０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（ｐＨ６）へのバッファ交換に供した。０Ｍから１ＭへのＮａＣｌの直線塩勾配を使用する、ソース３０Ｑを充填したＴｒｉｃｏｒｎ １０／５０またはＸＫ２５／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを介して、さらなる精製を達成した。次に、結果として生じるＧＡＡ含有画分を濃縮した後、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および２００ｍＭ ＮａＣｌであらかじめ平衡化しておいた最終のＨｉｌｏａｄ １６／６０ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にのせた。比活性およびクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける純度を基にして画分を選択した後、合一して、５〜１０ｍｇ／ｍｌの終濃度へと濃縮した。１０ｋＤａのＭＷＣＯを備えた１５ｍｌのＡｍｉｃｏｎ超遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、タンパク質を濃縮した。   The purification of rhGAA was initiated by adding ammonium sulfate to a maximum concentration of 1M. After centrifugation, the supernatant was loaded onto an XK16 / 40 column packed with Toyopearl-Phenyl 650M (Tosoh Biosciences). A linear gradient of ammonium sulfate from 1M to 0M was applied to the elution. Next, the fractions containing rhGAA were pooled and subjected to buffer exchange to 10 mM BIS-TRIS (pH 6). Further purification was achieved via anion exchange chromatography on a Tricorn 10/50 or XK25 / 20 column (GE Healthcare) packed with source 30Q, using a linear salt gradient of NaCl from 0M to 1M. The resulting GAA-containing fraction was then concentrated and loaded onto a final Hiload 16/60 superdex 200 gel filtration column (GE Healthcare) pre-equilibrated with 50 mM sodium phosphate (pH 6) and 200 mM NaCl. Fractions were selected based on specific activity and purity on Coomassie stained SDS-PAGE gels, then combined and concentrated to a final concentration of 5-10 mg / ml. The protein was concentrated using a 15 ml Amicon ultracentrifuge device (Millipore) equipped with a 10 kDa MWCO.

４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）アッセイを使用して、ｒｈＧＡＡをスクリーニングした。グルコシダーゼによる基質４−ＭＵＧの切断は、蛍光原性産物４−ＭＵの生成をもたらし、４−ＭＵは、紫外光による照射によって視覚化または検出することができる。ｒｈＧＡＡについての定性的スクリーニングの反応を、１０：１または２０：１の容積比で、０．３５ｍＭ４−ＭＵＧ、０．１％ＢＳＡ、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）からなる反応緩衝液を１０μｌまたは５μｌの溶出画分へ添加することによって開始した。すべての反応を９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて実施した。３７℃で３０分間〜１時間のインキュベーション時間後、等容積の１００ｍＭグリシン（ｐＨ１１）を添加して、反応を停止させ、蛍光原性反応産物４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の放出を紫外光の下で観察した。比活性（単位／ｍｇタンパク質）を、黄色のｐ−ニトロフェノラート反応産物の酵素放出を測定する合成基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を用いる比色アッセイを使用して決定した。上記反応は、１０μｌの酵素溶液および９０μｌの基質反応緩衝液（１５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４）、１％ＢＳＡ中の２ｍＭ ＰＮＰＧ）をマイクロタイタープレートの反応ウェル中で混合することによって開始し、その後３７℃でインキュベートした。１〜２時間インキュベートした後、等容積の停止バッファ１０％炭酸ナトリウム（ｐＨ１２）を添加して、その反応をクエンチし、放出されたｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）をイオン化状態にした。バックグラウンド補正した吸光度およびｐ−ニトロフェノラート標準物質を４０５ｎｍの波長で測定し、比活性を算出した。タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）法によって決定した。１単位を、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中の２ｍＭの最終基質濃度において３７℃、１分間当たり１ｎｍｏｌのＰＮＰＧから１ｎｍｏｌのＰＮＰおよびＤ−グルコースへの変換を触媒する酵素の量として定義した。   The rhGAA was screened using a 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside (4-MUG) assay. Cleavage of the substrate 4-MUG by glucosidase results in the production of the fluorogenic product 4-MU, which can be visualized or detected by irradiation with ultraviolet light. Qualitative screening reactions for rhGAA were performed in 10 or 5 μl reaction buffer consisting of 0.35 mM 4-MUG, 0.1% BSA, and 100 mM sodium acetate (pH 4) in a volume ratio of 10: 1 or 20: 1. By adding to the elution fraction of. All reactions were performed in 96 well flat bottom microtiter plates. After an incubation period of 30 minutes to 1 hour at 37 ° C., an equal volume of 100 mM glycine (pH 11) is added to stop the reaction and release the fluorogenic reaction product 4-methylumbelliferone (4MU) with ultraviolet light. Observed under. Specific activity (units / mg protein) is determined using a colorimetric assay with a synthetic substrate p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG) that measures enzyme release of the yellow p-nitrophenolate reaction product. did. The reaction is initiated by mixing 10 μl of enzyme solution and 90 μl of substrate reaction buffer (150 mM citrate-phosphate buffer (pH 4), 2 mM PNPG in 1% BSA) in the reaction well of the microtiter plate. And then incubated at 37 ° C. After incubation for 1-2 hours, an equal volume of stop buffer 10% sodium carbonate (pH 12) was added to quench the reaction and ionize released p-nitrophenol (PNP). The background-corrected absorbance and p-nitrophenolate standard were measured at a wavelength of 405 nm, and the specific activity was calculated. Protein concentration was determined by the bicinchoninic acid (BCA) method. The amount of enzyme that catalyzes the conversion of 1 unit from 1 nmol PNPG to 1 nmol PNP and D-glucose per minute at 37 ° C. at a final substrate concentration of 2 mM in citrate-phosphate buffer (pH 4.0). Defined as

実施例４
（ＹｌＡＭＳ１のクローニングおよび発現）
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＡｍｓ１遺伝子（ＹｌＡｍｓ１）を、ＹａｒｒｏｗｉａゲノムＤＮＡから、遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＹｌＡＭＳ１タンパク質が生成され得るよう、ＨＩＳ６タグ付きコード配列をＹｌＡｍｓ１のＯＲＦの３’末端に融合し、かつＮ末端Ｈｉｓタグを有するＹＬＡＭＳ１タンパク質が生成され得るよう、ＹｌＡｍｓ１ ＯＲＦの５’末端へも融合した。両ＯＲＦを半構成的ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローン化し（図３Ａおよび図３Ｂ）、発現カセットをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへと形質転換した。細胞を複合培地（ＹＰＤ）中で増殖させ、７２時間の増殖後に収穫した。細胞を超音波処理によってばらばらにした後、ＡＭＳ１タンパク質を、ＮＴＡカラムを使用して精製した。精製した材料を、ＰＮＰ−マンノースを基質として使用して活性について分析した。活性のある画分をプールし、グリカン分析のために維持した。 Example 4
(Cloning and expression of YlAMS1)
The Ams1 gene (YlAms1) from Yarrowia lipolytica was PCR amplified from Yarrowia genomic DNA using gene-specific primers. 5 of the YlAms1 ORF so that a YLAMS1 protein with a N-terminal His tag can be generated by fusing the HIS6-tagged coding sequence to the 3 ′ end of the YlAms1 ORF so that a YlAMS1 protein with a C-terminal His tag can be generated 'Fused to the end. Both ORFs were cloned under the control of the semiconstitutive hp4d promoter (FIGS. 3A and 3B) and the expression cassette was transformed into Yarrowia lipolytica. Cells were grown in complex medium (YPD) and harvested after 72 hours of growth. After dissociating the cells by sonication, the AMS1 protein was purified using an NTA column. The purified material was analyzed for activity using PNP-mannose as a substrate. Active fractions were pooled and maintained for glycan analysis.

実施例５
（ＡＰＴＳ標識したリン酸化Ｎ−グリカンのＧＨ３８α−マンノシダーゼを用いた脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し）
タチナタマメα−マンノシダーゼ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。３．０Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液（Ｓｉｇｍａ−Ｍ７２５７）およびプロテオミクス等級のタチナタマメα−マンノシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ｍ５５７３）の両方をＮ−グリカン分析において使用した。両バッチは、同一の結果を与えたので、さらなる記載においてはＪｂＭａｎと命名する。実施例４に記載したとおり、ＹｌＡｍｓ１を発現させ精製した。ＪｂＭａｎおよびＹｌＡＭＳ１を、ＭＮＮ４を過剰発現するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株に由来する、８−アミノ−１，３，６，−ピレントリスルホン酸（ＡＰＴＳ）で標識した糖の混合物で試験した。上記糖は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ８）、一リン酸化ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（ＭＰ−Ｍ８）、および／または二リン酸化（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（（ＭＰ）２−Ｍ８）糖（ＭＮＮ４糖またはＭＮＮ４ Ｎ−グリカンと呼ぶ）を含有している。図４においては、潜在的な最終加水分解産物を概略的に示し、ここで、α−マンノシダーゼは、ＭＮＮ４ Ｎ−グリカンも完全に刈り込むことができることを想定しており、これには、非リン酸化アームの加水分解、基礎をなすマンノースがリン酸化されている場合の、末端α−１，２−マンノースの加水分解、および／またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合におけるホスフェートのキャップ外しを含む。 Example 5
(Demannosylation of APTS-labeled phosphorylated N-glycan with GH38α-mannosidase and uncapping of phosphate)
Red bean α-mannosidase (Canavaglia ensiformis) was obtained from Sigma-Aldrich. Both 3.0M ammonium sulfate suspension (Sigma-M7257) and proteomic grade Tama α-mannosidase (Sigma-M5573) were used in the N-glycan analysis. Both batches gave identical results and will be named JbMan in the further description. YlAms1 was expressed and purified as described in Example 4. JbMan and YlAMS1 were tested with a mixture of sugars labeled with 8-amino-1,3,6, -pyrenetrisulfonic acid (APTS) from a Yarrowia lipolytica strain overexpressing MNN4. The sugars are Man 8 GlcNAc 2 (M8), monophosphorylated ManP-Man 8 GlcNAc 2 (MP-M8), and / or diphosphorylated (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 ((MP) 2 -M8). Contains sugar (referred to as MNN4 sugar or MNN4 N-glycan). In FIG. 4, a potential final hydrolysis product is shown schematically, where α-mannosidase assumes that MNN4 N-glycans can also be completely trimmed, which includes non-phosphorylated Hydrolysis of the arm, hydrolysis of the terminal α-1,2-mannose when the underlying mannose is phosphorylated, and / or phosphate uncapping at the mannose-1-phospho-6-mannose linkage .

別段の記載がない限り、ＡＰＴＳ標識したＮ−グリカンに関するＪｂＭａｎおよびＹｌＡＭＳ１との反応はすべて、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で３７℃、一晩実施した。 Unless otherwise stated, all reactions with JbMan and YlAMS1 for APTS-labeled N-glycans were performed overnight at 37 ° C. in 10 mM ammonium acetate buffer (pH 5.0) containing 2 mM CaCl 2 .

図５においては、ＭＮＮ４ Ｎ−グリカンのＪｂＭａｎによる加水分解を示すＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を示す。試料には、新たに現れるピークを同定することができるよう、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を基質として含んでいた（パネルＢ）。ＪｂＭａｎは、一晩のインキュベーション後にＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２しか得られなくなるまで（パネルＤ）、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を連続的に加水分解した（パネルＣ）。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を含有する基質溶液の加水分解（パネルＥ）はより複雑であった。脱マンノシル化活性およびホスフェートのキャップ外し活性は両方とも、基質をＪｂＭａｎとともに２時間インキュベートすると、電気泳動図の左側に迅速に泳動されるピークの出現に関与した（パネルＦ）。末端のホスフェートの過剰の電荷は脱マンノシル化とともに、迅速な電気泳動移動度を示すピークの出現に関与した。それにもかかわらず、一晩のインキュベーション後、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２として同定されるピークのみが観察された（パネルＧ）。市販のＪｂＭａｎ調製物中に存在するホスファターゼ活性は、この結果に関与する。 FIG. 5 shows a DSA-FACE electrophoretic diagram showing hydrolysis of MNN4 N-glycan by JbMan. The sample contained Man 8 GlcNAc 2 as a substrate so that newly appearing peaks could be identified (panel B). JbMan continuously hydrolyzed Man 8 GlcNAc 2 (Panel C) until only Man 1 GlcNAc 2 was obtained after overnight incubation (Panel D). Hydrolysis of the substrate solution containing Man 8 GlcNAc 2 and ManP-Man 8 GlcNAc 2 (panel E) was more complex. Both demannosylation activity and phosphate uncapping activity were involved in the appearance of a rapidly migrating peak on the left side of the electropherogram when the substrate was incubated with JbMan for 2 hours (panel F). The terminal phosphate excess charge, along with demannosylation, contributed to the emergence of peaks showing rapid electrophoretic mobility. Nevertheless, only a peak identified as Man 1 GlcNAc 2 was observed after overnight incubation (panel G). The phosphatase activity present in commercial JbMan preparations is responsible for this result.

ＪｂＭａｎによるＭＮＮ４糖の消化を、ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を含有する基質溶液を用いて反復した（パネルＨ）。２時間インキュベートした後、潜在的なキャップの外れたピークが現れ、それを、パネルＩにおいては「Ｐ−Ｍｘ」および「Ｐ２Ｍｘ」と示している。迅速な電気泳動移動度領域においては、ピークの分離はより小さく、キャップの外れた一リン酸化構造および二リン酸化構造、例えば、Ｐ−Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮａｃ２は一緒に泳動された可能性がある。一晩の消化後の結果は、さらなる脱マンノシル化を示唆している。パネルＪにおいてＰ−ＭｙおよびＰ２−Ｍｙで示されるこれらのピークは、Ｐ−Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である可能性があるが、中性のＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２、およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もパネルＪにおいて観察することができる。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は基質溶液中に存在しなかったので、これらのピークは、潜在的な混入ホスファターゼ活性とマンノースのさらなる刈り込みの結果である。 Digestion of MNN4 sugar by JbMan was repeated with a substrate solution containing ManP-Man 8 GlcNAc 2 and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 (panel H). After 2 hours of incubation, a potential uncapped peak appears, which is indicated in panel I as “P-Mx” and “P2Mx”. In the fast electrophoretic mobility region, the peak separation is smaller and uncapped mono- and di-phosphorylated structures such as P-Man 4 GlcNAc 2 and P2-Man 6 GlcNac 2 migrate together. It may have been done. Results after overnight digestion suggest further demannosylation. These peaks, indicated as P-My and P2-My in panel J, may be P-Man 3 GlcNAc 2 and P2-Man 5 GlcNAc 2 , but neutral Man 1 GlcNAc 2 , Man 2 GlcNAc 2 and Man 3 GlcNAc 2 can also be observed in panel J. Since Man 8 GlcNAc 2 was not present in the substrate solution, these peaks are the result of potential contaminating phosphatase activity and further trimming of mannose.

パネルＪのキャップを外されたピークを同定するために、反応混合物を仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。キャップを外された（従って、末端のホスフェートを含有している）グリカンの処理は、電気泳動図において非常により遅く泳動し右側へとより多く現れる中性オリゴ糖を結果として生じた。実際、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ６ＧｌｃＮａｃ２はパネルＫに現れている。その活性は、市販のＪｂＭａｎ調製物中のホスファターゼ活性の存在によって阻害されたが、示されたデータは、完全に脱マンノシル化しかつホスフェートがキャップを外された構造（すなわち、Ｐ−Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）が、ＡＰＴＳ標識したＭＮＮ４糖をＪｂＭａｎで処理した場合に得ることができることを明らかにしている。 To identify the uncapped peak in panel J, the reaction mixture was treated with calf intestinal phosphatase (CIP). Treatment of uncapped glycans (thus containing terminal phosphates) resulted in neutral oligosaccharides that migrated much slower in the electropherogram and appeared more to the right. In fact, Man 3 GlcNAc 2 to Man 6 GlcNac 2 appear in panel K. Although its activity was inhibited by the presence of phosphatase activity in commercial JbMan preparations, the data shown are completely demannosylated and phosphate uncapped structures (ie P-Man 3 GlcNAc 2 And P2-Man 5 GlcNAc 2 ) reveal that APTS-labeled MNN4 sugars can be obtained when treated with JbMan.

脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し活性は、図６に示すように、ＹｌＡＭＳ１を使用しても観察される。ＹｌＡＭＳ１は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２を完全に加水分解することができる（パネルＣ）。ＹｌＡＭＳ１の、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を含有する基質溶液とのインキュベーション（パネルＤ）は、おそらくホスフェートがキャップを外されたグリカンである迅速な電気泳動移動度を有する産物を生じる（パネルＥ）。反応を希釈したＹｌＡＭＳ１試料で２時間のインキュベーションの間に反復した場合の、一連のキャップを外されたＮ−グリカンを観察した（パネルＦ）。ホスフェートがキャップを外されたグリカンの存在を、反応混合物をＣＩＰで処理することで一連の中性Ｎ−グリカンが生じることによって確認した（パネルＧ）。したがって、ＹｌＡＭＳ１は、パネルＩにおいて観察されるように、（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のキャップを外すことはできるが、Ｐ２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはさらにマンノースで刈り込んだグリカンのいずれの産物を形成するのかは未明のままである。 Demannosylation and phosphate uncapping activity are also observed using YlAMS1, as shown in FIG. YlAMS1 can completely hydrolyze Man 8 GlcNAc 2 to Man 1 GlcNAc 2 (panel C). Incubation of YlAMS1 with a substrate solution containing Man 8 GlcNAc 2 and ManP-Man 8 GlcNAc 2 (Panel D) yields a product with a rapid electrophoretic mobility, probably a phosphate uncapped glycan (Panel E). A series of uncapped N-glycans was observed when the reaction was repeated during a 2 hour incubation with diluted YlAMS1 samples (Panel F). The presence of phosphate uncapped glycans was confirmed by treating the reaction mixture with CIP to produce a series of neutral N-glycans (Panel G). Thus, YlAMS1 can uncapped (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 as observed in panel I, but it does not produce any product of glycans trimmed with P2-Man 8 GlcNAc 2 or even mannose. Whether to form remains unclear.

実施例６
（より高次のリン酸化Ｎ−グリカンを有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ株において発現した糖タンパク質のＧＨ３８α−マンノシダーゼを使用した脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し）
ヒトリソソームα−グルコシダーゼｈｕＧＡＡをＹ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ株ＯＸＹＹ１５８９において発現させ、高次のリン酸化Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を生じた。ｈｕＧＡＡを実施例３に記載したとおり精製した。 Example 6
(Demannosylation and uncapping of phosphate of glycoprotein expressed in Yarrowia lypolytica strain with higher order phosphorylated N-glycans using GH38α-mannosidase)
Human lysosomal α-glucosidase huGAA It was expressed in lypolytica strain OXYY1589, resulting in a glycoprotein having a higher order phosphorylated N-glycan structure. huGAA was purified as described in Example 3.

タチナタマメα−マンノシダーゼ（ＪｂＭａｎ）を、２ｍＭ ＣａＣｌ２を有する１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）中のｈｕＧＡＡの溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩インキュベートした。本質的にはＬａｒｏｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１：３９７〜４０５（２００６）に記載したとおり、Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦで放出させ、ＡＰＴＳで標識した後、ＤＳＡ−ＦＡＣＥにおいて分析した。α−１，２−マンノシダーゼ処理の前および後のＮ−グリカン特性を図７に示す。精製されたｈｕＧＡＡから放出されたＮ−グリカン混合物は主として、ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２から構成されていた（パネルＢ）。ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２よりもわずかに迅速に泳動されるピークは、ＭａｎＰ−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２と定めた。非常に微量のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２しか存在しなかった。ＪｂＭａｎは糖タンパク質であるので、タチナタマメ特異的Ｎ−グリカンについて補正することのできるよう、対照試料をパネルＣに示す。パネルＤにおいては、ｈｕＧＡＡをＪｂＭａｎとインキュベートした後に得られるＮ−グリカンを示す。ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークはもはや存在しなかった。代わりに、いくつかのピークが電気泳動図の左側に（潜在的にホスフェートがキャップを外されたＮ−グリカン）Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２とともに現れた。後者は主として、市販のＪｂＭａｎ調製物中に存在するホスファターゼ活性および得られた中性Ｎ−グリカンのさらなる脱マンノシル化から結果として生じた。 Tamanama α-mannosidase (JbMan) was added to a solution of huGAA in 100 mM ammonium acetate (pH 5.0) with 2 mM CaCl 2 . The reaction mixture was incubated overnight at room temperature. Essentially as described by Laroy et al., Nature Protocols, 1: 397-405 (2006), N-glycans were released with PNGaseF, labeled with APTS, and then analyzed in DSA-FACE. The N-glycan characteristics before and after α-1,2-mannosidase treatment are shown in FIG. The N-glycan mixture released from purified huGAA was mainly composed of ManP-Man 8 GlcNAc 2 and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 (panel B). The peak that migrated slightly faster than ManP-Man 8 GlcNAc 2 was defined as ManP-Man 7 GlcNAc 2 . Only very small amounts of Man 8 GlcNAc 2 and Man 7 GlcNAc 2 were present. Since JbMan is a glycoprotein, a control sample is shown in Panel C so that it can be corrected for the yellow bean-specific N-glycan. In panel D, N-glycans obtained after incubating huGAA with JbMan are shown. The peaks corresponding to ManP-Man 8 GlcNAc 2 and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 no longer existed. Instead, several peaks appeared with Man 1 GlcNAc 2 on the left side of the electropherogram (potentially uncapped N-glycans). The latter mainly resulted from phosphatase activity present in commercial JbMan preparations and further demannosylation of the resulting neutral N-glycans.

実施例７
（組換えヒトα−グルコシダーゼ（ｈｕＧＡＡ）のＣｃＭａｎ５およびＣｃＭａｎ４を用いたキャップ外しおよび脱マンノシル化）
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ４（ＣｃＭａｎ４）およびＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ５（ＣｃＭａｎ５）をコードする核酸を、ＤｓｂＡシグナル配列を含有して結果的にＮ末端ＨＩＳタグを有するタンパク質の発現を生じるｐＬＳＡＨ３６ベクターへとクローン化した。ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ５およびＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ４のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を図８および図９にそれぞれ提供する。これらのタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ２１細胞において発現させ、ペリプラズムに存するタンパク質を、Ｔａｌｏｎカラムを使用して単離および精製した。ｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ５プラスミドおよびｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ４プラスミドの図解表示を図１０に与える。 Example 7
(Uncapping and demannosylation of recombinant human α-glucosidase (huGAA) using CcMan5 and CcMan4)
A nucleic acid encoding Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 4 (CcMan4) and Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 5 (CcMan5) was cloned into a pLSAH36 vector containing a DsbA signal sequence and resulting in the expression of a protein with an N-terminal HIS tag. The nucleotide sequences of the open reading frames of DsbA-CcMan5 and DsbA-CcMan4 are provided in FIGS. 8 and 9, respectively. These proteins were expressed in E. coli B21 cells, and proteins present in the periplasm were isolated and purified using Talon columns. A graphic representation of the pLSAHCcMan5 and pLSAHCcMan4 plasmids is given in FIG.

一連のＣｃＭａｎ５キャップ外し実験およびＣｃＭａｎ４脱マンノシル化実験を、実施例３に記載したとおり精製した１００μｇバッチのｈｕＧＡＡを使用して実施した。３０μＬのｈｕＧＡＡ（１００ｍＭマンニトールを有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）における３．７ｍｇ／ｍＬ）を、３ｍＭ ＣａＣｌ２を有する４６μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４と呼ばれる）ある実験においては、１００：１の重量：重量（ｗ：ｗ）比のｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ４を使用し、１４μＬのＣｃＭａｎ４（ＰＢＳ中で調製される（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）８０μｇ／ｍｌ）をｈｕＧＡＡ溶液に添加した。（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ５と呼ばれる）別の実験においては、１００：２のｗ：ｗ比のｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５を使用し、１４μＬのＣｃＭａｎ５（ＰＢＳ中で調製される１５４μｇ／ｍＬ）をｈｕＧＡＡ溶液に添加した。（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５と呼ばれる）組み合わせ実験においては、１００：２：１のｗ：ｗ比のｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５：ＣｃＭａｎ４を使用し、１４μＬのＣｃＭａｎ５および１４μＬのＣｃＭａｎ４を３０μＬのｈｕＧＡＡおよび３ｍＭ ＣａＣｌ２を有する３２μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。対照実験（ｈｕＧＡＡ＿対照）においては、１０μＬのｈｕＧＡＡを３ｍＭ ＣａＣｌ２を有する２０μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。試料をすべて３０℃で１６時間インキュベートした後、試料を４℃で使用時まで維持した。 A series of CcMan5 uncapping experiments and CcMan4 demannosylation experiments were performed using a 100 μg batch of huGAA purified as described in Example 3. 30 μL of huGAA (3.7 mg / mL in 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) with 100 mM mannitol) was added to 46 μL of 100 mM HEPES buffer (pH 7.0) with 3 mM CaCl 2 . In one experiment (called huGAA_CcMan4), a 100: 1 weight: weight (w: w) ratio of huGAA: CcMan4 was used, and 14 μL of CcMan4 (80 μg / ml formulated in PBS) was huGAA. Added to the solution. In another experiment (called huGAA_CcMan5), a 100: 2 w: w ratio of huGAA: CcMan5 was used and 14 μL of CcMan5 (154 μg / mL prepared in PBS) was added to the huGAA solution. In combination experiments (called huGAA_CcMan4 / 5), a 100: 2: 1 w: w ratio of huGAA: CcMan5: CcMan4 was used, 14 μL CcMan5 and 14 μL CcMan4 with 30 μL huGAA and 3 mM CaCl 2 Of 100 mM HEPES buffer (pH 7.0). In a control experiment (huGAA_control), 10 μL of huGAA was diluted with 20 μL of 100 mM HEPES buffer (pH 7.0) with 3 mM CaCl 2 . All samples were incubated at 30 ° C. for 16 hours, and then the samples were kept at 4 ° C. until use.

２μＬの各試料を実施例６に記載したとおり、Ｎ−グリカン分析に使用した。ｈｕＧＡＡ処理した試料のＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を図１１に示す。ＣｃＭａｎ４処理は結果的に、ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の完全な脱マンノシル化を生じ、産物ＭａｎＰ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＭａｎＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２が形成された（図１１、第三のパネル）。上記の反応条件の下で、ＣｃＭａｎ５によるホスフェートのキャップ外しは、ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンについて完全であり、Ｐ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２が形成された。二リン酸化Ｎ−グリカン（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を加水分解して、完全にキャップの外れたＰ２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２にしたが、匹敵するピーク高を有してよりゆっくりと泳動されるピークも観察され、該ピークは、部分的にキャップの外れた（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ８−（Ｐ）ＧｌｃＮＡｃ２（Ｎ−グリカンのα−１，６アームにおいてキャップの外されたホスフェート、およびα−１，３アームにおいてキャップ形成されたホスフェートを潜在的に有する）に相当した（図１１、第四のパネル）。ＣｃＭａｎ５およびＣｃＭａｎ４による処理の後に、キャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡを得、該ｈｕＧＡＡは結果的に、Ｐ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ６−（Ｐ）ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカン特性を生じた。Ｍａｎ５ならびにＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、ＭａｎＰ−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（後者のリン酸化Ｎ−グリカンは潜在的に、α−１，３アームがリン酸化されている）に相当する小さなピークを観察した（図１１、第五のパネル）。キャップを外されたＮ−グリカンの概略図を図１２の（Ｂ）に示す。 2 μL of each sample was used for N-glycan analysis as described in Example 6. A DSA-FACE electrophoretic diagram of the huGAA-treated sample is shown in FIG. CcMan4 treatment resulted in complete demannosylation of ManP-Man 8 GlcNAc 2 , and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 , and the products ManP-Man 5 GlcNAc 2 , ManP-Man 6 GlcNAc 2 , and ( ManP) 2 -Man 6 GlcNAc 2 was formed (FIG. 11, third panel). Under the reaction conditions described above, the uncapping of the phosphate with CcMan5 was complete for ManP-Man 8 GlcNAc 2 N-glycans, and P-Man 8 GlcNAc 2 was formed. Diphosphorylated N-glycan (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 was hydrolyzed to fully uncapped P2-Man 8 GlcNAc 2 , but migrated more slowly with comparable peak height that peaks were observed, the peak was partially out of the cap (ManP) -Man 8 - (P ) GlcNAc 2 ( phosphate was removed with the cap in alpha-1, 6 arm of N- glycans, and alpha (Potentially having phosphate-capped phosphate in the 1,3 arms) (FIG. 11, fourth panel). After treatment with CcMan5 and CcMan4, uncapped and demannosylated huGAA is obtained, which results in P 2 -Man 6 GlcNAc 2 , (ManP) -Man 6- (P) GlcNAc 2 , and N-glycan properties with P-Man 5 GlcNAc 2 were produced. Man 5 as well as P-Man 6 GlcNAc 2 , P-Man 7 GlcNAc 2 , ManP-Man 7 GlcNAc 2 (the latter phosphorylated N-glycan is potentially phosphorylated at the α-1,3 arm) A corresponding small peak was observed (FIG. 11, fifth panel). A schematic view of the uncapped N-glycan is shown in FIG.

別のＣｃＭａｎ５／ＣｃＭａｎ４のキャップ外しおよび脱マンノシル化実験を、同じ精製バッチ由来のｈｕＧＡＡを使用して実施した。ｈｕＧＡＡのための調製緩衝液が、（１００ｍＭマンニトールを有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）よりもむしろ）２ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｍＭマンニトールを有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）である以外は、本実験を本質的には上記のとおり実施した。ｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５：ＣｃＭａｎ４について１００：３：０．５のｗ：ｗ比を使用した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。市販のヒトα−グルコシダーゼであるミオザイム（登録商標）（アルグルコシダーゼα、Ｇｅｎｚｙｍｅ社）の試料を、同一条件下、ミオザイム：ＣｃＭａｎ４について１００：０．５のｗ：ｗ比で、ＣｃＭａｎ４を使用して処理した。これらの試料のＮ−グリカン分析を上で詳論したとおり実施した。本様式で精製しかつＣｃＭａｎ５およびＣｃＭａｎ４で処理したｈｕＧＡＡについてのＮ−グリカン特性は、図１１に示されるものと類似していた。ＣｃＭａｎ４で処理したミオザイム（登録商標）についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を図１３に示す。 Another CcMan5 / CcMan4 uncapping and demannosylation experiment was performed using huGAA from the same purification batch. This experiment except that the preparation buffer for huGAA is 100 mM HEPES (pH 7.0) with 2 mM CaCl 2 and 100 mM mannitol (rather than 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) with 100 mM mannitol). Was carried out essentially as described above. A w: w ratio of 100: 3: 0.5 was used for huGAA: CcMan5: CcMan4. The reaction was incubated at 37 ° C. for 24 hours. A sample of the commercially available human α-glucosidase Myozyme® (Alglucosidase α, Genzyme) was used under the same conditions with CcMan4 at a w: w ratio of 100: 0.5 for Myozyme: CcMan4. Processed. N-glycan analysis of these samples was performed as detailed above. N-glycan properties for huGAA purified in this manner and treated with CcMan5 and CcMan4 were similar to those shown in FIG. A DSA-FACE electropherogram for Myozyme® treated with CcMan4 is shown in FIG.

細胞内ｈｕＧＡＡプロセシング（実施例１０を参照されたい）を理解するために、ＣｃＭａｎ５／ＣｃＭａｎ４によるキャップ外しおよび脱マンノシル化実験を、異なる精製バッチ由来のｈｕＧＡＡを使用して実施した。上記のものと類似の条件下で精製を実施し、これもまた２ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｍＭマンニトールを有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）をｈｕＧＡＡ調製緩衝液として使用した。キャップ外しおよび脱マンノシル化を、ｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５：ＣｃＭａｎ４について１００：３：０．５のｗ：ｗ比で実施し、反応混合物を３０℃で２４時間インキュベートした。Ｎ−グリカン特性を図１４に示す。この実験においては、二リン酸化Ｎ−グリカンであるＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ６−（Ｐ）ＧｌｃＮＡｃ２をＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２へとそれぞれ部分的に脱リン酸化した。ｈｕＧＡＡ試料中のホスファターゼ活性を、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中の一般的なホスファターゼ基質パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を使用して検出した。 To understand intracellular huGAA processing (see Example 10), uncapping and demannosylation experiments with CcMan5 / CcMan4 were performed using huGAA from different purification batches. Purification was performed under conditions similar to those described above, which also used 100 mM HEPES (pH 7.0) with 2 mM CaCl 2 and 100 mM mannitol as the huGAA preparation buffer. Uncapping and demannosylation was performed on huGAA: CcMan5: CcMan4 at a w: w ratio of 100: 3: 0.5 and the reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 24 hours. N-glycan characteristics are shown in FIG. In this experiment, the diphosphorylated N-glycans P 2 -Man 6 GlcNAc 2 and (ManP) -Man 6- (P) GlcNAc 2 were converted to P-Man 6 GlcNAc 2 , (ManP) -Man 6 GlcNAc 2 . And partially dephosphorylated. The phosphatase activity of huGAA samples was detected using a general phosphatase substrate para nitrophenyl phosphate 100 mM HEPES buffer (pH 7.5) in having 1mM MgCl 2 (PNPP).

実施例８
（タチナタマメα−マンノシダーゼを使用した組換えｈｕＧＡＡのキャップ外しおよび脱マンノシル化）
実施例６のキャップ外し実験および脱マンノシル化実験を、ＪｂＭａｎの硫酸アンモニウム懸濁液をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによるゲル濾過によってさらに精製して、混入しているホスファターゼ活性を除去した後に反復した。 Example 8
(Uncapping and demannosylation of recombinant huGAA using Tachinama bean α-mannosidase)
The uncapping and demannosylation experiments of Example 6 were repeated after the JbMan ammonium sulfate suspension was further purified by gel filtration through a Superdex 200 column to remove contaminating phosphatase activity.

ｈｕＧＡＡ＿ＪｂＭａｎと呼ばれるある実験においては、ｈｕＧＡＡ：ＪｂＭａｎの１００：１５のｗ：ｗ比を使用した。１０μＬのＪｂＭａｎ（ＰＢＳ中１．５ｍｇ／ｍｌ）を、３０μｌのｈｕＧＡＡ（１００ｍＭマンニトールを有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中３．７ｍｇ／ｍｌ）および５０μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有する溶液に添加した。対照試料（ｈｕＧＡＡ＿対照）は、ｈｕＧＡＡを含有していたが、ＪｂＭａｎは含有していなかった。３０℃での１６時間のインキュベーション後、試料を４℃でさらなる使用まで維持した。Ｎ−グリカン分析については、２μＬの各試料を使用して、実施例６に記載したとおり、Ｎ−グリカンを放出させ標識した。ＪｂＭａｎで処理したｈｕＧＡＡ由来のＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を図１５に示す。ＪｂＭａｎによる処理は結果的に、ｈｕＧＡＡのＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の部分的なキャップ外しおよび脱マンノシル化を生じ、主としてＰ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ６−（Ｐ）ＧｌｃＮＡｃ２を形成した。後者のＮ−グリカンは、電気泳動図においてＰ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とともに泳動する。完全にキャップを外された少量のＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２も存在している。Ｐ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２よりもゆっくり泳動されるピークは、中性Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である可能性がある。Ｐ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ−Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２は、ＪｂＭａｎによってさらに脱マンノシル化されることはない（図１５、第三のパネル）。 In one experiment called huGAA_JbMan, a 100: 15 w: w ratio of huGAA: JbMan was used. 10 μL of JbMan (1.5 mg / ml in PBS), 30 μl of huGAA (3.7 mg / ml in 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) with 100 mM mannitol) and 50 μl of 100 mM sodium acetate buffer (pH 5. 0) was added to the solution. The control sample (huGAA_control) contained huGAA but no JbMan. After 16 hours incubation at 30 ° C., samples were maintained at 4 ° C. until further use. For N-glycan analysis, 2 μL of each sample was used to release and label N-glycans as described in Example 6. FIG. 15 shows a DSA-FACE electrophoretic diagram of huGAA-derived N-glycan treated with JbMan. Treatment with JbMan resulted in partial uncapping and demannosylation of huGAA's ManP-Man 8 GlcNAc 2 and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 , primarily P-Man 5 GlcNAc 2 and (ManP) -Man 6- (P) GlcNAc 2 was formed. The latter N-glycans migrate with P-Man 5 GlcNAc 2 in the electropherogram. There is also a small amount of P2-Man 6 GlcNAc 2 completely uncapped. The peak that migrates more slowly than P-Man 5 GlcNAc 2 may be neutral Man 3 GlcNAc 2 . P2-Man 6 GlcNAc 2 and P-Man 4 GlcNAc 2 are not further demannosylated by JbMan (FIG. 15, third panel).

第二のＪｂＭａｎによるキャップ外しおよび脱マンノシル化実験を、同じ精製バッチ由来のｈｕＧＡＡを使用して実施した。本実験を本質的には上記のとおり実施し、ｈｕＧＡＡ調製バッファとしては、１ｍＭ ＺｎＣｌ２および１００ｍＭマンニトールを有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）であった。ｈｕＧＡＡ：ＪｂＭａｎについて１００：１０のｗ：ｗ比を使用した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。ＪｂＭａｎ処理後のこれらの試料のＮ−グリカン特性は、図１５に示すＮ−グリカン特性と類似していた。 A second JbMan uncapping and demannosylation experiment was performed using huGAA from the same purification batch. This experiment was performed essentially as described above, and the huGAA preparation buffer was 100 mM sodium acetate (pH 5.0) with 1 mM ZnCl 2 and 100 mM mannitol. A w: w ratio of 100: 10 was used for huGAA: JbMan. The reaction was incubated at 37 ° C. for 24 hours. The N-glycan properties of these samples after JbMan treatment were similar to the N-glycan properties shown in FIG.

細胞内ｈｕＧＡＡプロセシング（実施例１０を参照されたい）を理解するために、ＪｂＭａｎを使用するキャップ外しおよび脱マンノシル化実験を、異なる精製バッチ由来のｈｕＧＡＡを使用して実施した。上記のものと類似の反応条件を使用した。使用したｈｕＧＡＡ調製バッファは、１ｍＭ ＺｎＣｌ２および１００ｍＭマンニトールを有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）であり、ｈｕＧＡＡ：ＪｂＭａｎについて１００：１０のｗ：ｗ比を使用し、反応混合物を３０℃で２４時間インキュベートした。Ｎ−グリカン特性を図１６に示す。二リン酸化Ｎ−グリカンであるＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は、本電気泳動図において観察されていない。ｈｕＧＡＡ試料中のホスファターゼ活性の存在により、部分的な脱リン酸化が生じ、結果的に、中性Ｎ−グリカンであるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２とともに、一リン酸化した比較的多量のＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２の存在がもたらされた。 To understand intracellular huGAA processing (see Example 10), uncapping and demannosylation experiments using JbMan were performed using huGAA from different purification batches. Reaction conditions similar to those described above were used. The huGAA preparation buffer used was 100 mM sodium acetate (pH 5.0) with 1 mM ZnCl 2 and 100 mM mannitol, using a w: w ratio of 100: 10 for huGAA: JbMan and the reaction mixture at 30 ° C. for 24 hours. Incubated. N-glycan characteristics are shown in FIG. P 2 -Man 6 GlcNAc 2 which is a diphosphorylated N-glycan is not observed in the electropherogram. The presence of phosphatase activity in the huGAA sample resulted in partial dephosphorylation, resulting in a relatively large amount of monophosphorylated P along with neutral N-glycans Man 3 GlcNAc 2 to Man 6 GlcNAc 2. -The presence of Man 6 GlcNAc 2 and ManP-Man 6 GlcNAc 2 was brought about.

実施例９
（ポンペ線維芽細胞への組換えｈｕＧＡＡの取り込み）
実施例７および実施例８由来のキャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡおよびミオザイム（登録商標）（ＣｃＭａｎ４で未処理および処理済み）を細胞取り込み実験において使用した。キャップされたｈｕＧＡＡまたは、ＣｃＭａｎ５（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ５）、Ｃｃｍａｎ４（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４）、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の併用（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５）、またはタチナタマメマンノシダーゼ（ｈｕＧＡＡ＿ＪＢＭａｎ）のいずれかで処理したｈｕＧＡＡの酵素比活性（実施例７および実施例８を参照されたい）を、４−ＭＵＧアッセイを使用して試験した。グルコシダーゼによる基質４−ＭＵＧの切断は、蛍光原性産物４−ＭＵの生成をもたらし、この４−ＭＵは、紫外光による照射によって可視化または検出することができる。実施例３を参照されたい。ｈｕＧＡＡの活性をミオザイム（登録商標）の活性と比較した。上記酵素を３つの異なる濃度（１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、および３１．２５ｎｇ／ｍｌ）へ、０．１％ＢＳＡを含有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）（反応緩衝液）において希釈し、５０μｌの各希釈物を９６ウェルプレートへ三つ組で入れた。４−ＭＵＧ基質（Ｓｉｇｍａ）を反応緩衝液で４ｍＭに希釈し、この希釈した基質５０μｌを各ウェルに添加した。酵素反応物を３７℃で６０分間インキュベートした後、１００μｌの１５０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２塩（ｐＨ１１．５）を添加して、この反応をクエンチした。蛍光を励起３６０／４０ｎｍおよび発光４６０／４０ｎｍで測定した。４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を使用した標準曲線を適応させて、比活性を算出した。種々の酵素の活性をＵ／ｍｇとして報告した。ここで、１単位は、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．０）＋０．１％ＢＳＡ中の２ｍＭ基質濃度での１時間あたりの１ｎｍｏｌ基質の加水分解を触媒する酵素の量として定義する。上記酵素の各々の比活性は、約２００×１０３Ｕ／ｍｇであった。 Example 9
(Incorporation of recombinant huGAA into Pompe fibroblasts)
Uncapped and demannosylated huGAA and Myozyme® (untreated and treated with CcMan4) from Example 7 and Example 8 were used in cell uptake experiments. Examples of capped huGAA or CcMan5 (huGAA_CcMan5), Ccman4 (huGAA_CcMan4), a combination of CcMan4 and CcMan5 (huGAA_CcMan4 / 5), or any of the ratios of the activity of Tamatama mannosidase (huGAA_JBMan) Example 8) was tested using a 4-MUG assay. Cleavage of the substrate 4-MUG by glucosidase results in the production of the fluorogenic product 4-MU, which can be visualized or detected by irradiation with ultraviolet light. See Example 3. The activity of huGAA was compared to that of Myozyme®. The enzyme was brought to three different concentrations (125 ng / ml, 62.5 ng / ml, and 31.25 ng / ml) in 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) containing 0.1% BSA (reaction buffer) ) And 50 μl of each dilution was placed in triplicate into a 96 well plate. 4-MUG substrate (Sigma) was diluted to 4 mM with reaction buffer and 50 μl of this diluted substrate was added to each well. After incubating the enzyme reaction for 60 minutes at 37 ° C., 100 μl of 150 mM EDTA-Na 2 salt (pH 11.5) was added to quench the reaction. Fluorescence was measured at excitation 360/40 nm and emission 460/40 nm. Specific activity was calculated by adapting a standard curve using 4-methylumbelliferone (4-MU). The activity of various enzymes was reported as U / mg. Here, 1 unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1 nmol substrate per hour at 2 mM substrate concentration in 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) + 0.1% BSA. The specific activity of each of the enzymes was about 200 × 10 3 U / mg.

ＣｃＭａｎ５（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ５）、Ｃｃｍａｎ４（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４）、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の併用（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５）、またはタチナタマメマンノシダーゼで処理したｈｕＧＡＡの取り込みを、ヒトポンペ線維芽細胞系であるＧＭ００２４８線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、米国ニュージャージー州キャムデン）において評価した。ＧＭ００２４８線維芽細胞は、酸性αグルコシダーゼ活性が欠損しており（正常の０．２７％）、かつＧＡＡのｍＲＮＡもタンパク質も検出可能なレベルを有していない。１５％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補充したイーグル塩および非必須アミノ酸を含有する最少必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）において、ＧＭ００２４８線維芽細胞を播種しおよび集密になるまで増殖させた。酵素投与前日、熱失活させた５％ＦＣＳ（５６℃で３０分間）を補充したＨａｍのＦ１０培地を有する２４ウェルプレートに細胞を播種した。   CcMan5 (huGAA_CcMan5), Ccman4 (huGAA_CcMan4), a combination of CcMan4 and CcMan5 (huGAA_CcMan4 / 5), or huGAA treated with tachinama bean mannosidase or cell blast cell os Re (Camden, New Jersey). GM00248 fibroblasts are deficient in acid alpha glucosidase activity (0.27% of normal) and have no detectable levels of GAA mRNA or protein. GM00248 fibroblasts were seeded and grown to confluence in minimal essential medium (MEM, Invitrogen) containing Eagle's salt supplemented with 15% FCS and 2 mM glutamine and non-essential amino acids. The day before enzyme administration, cells were seeded in 24-well plates with Ham's F10 medium supplemented with heat-inactivated 5% FCS (30 min at 56 ° C).

実験当日、キャップ形成したｈｕＧＡＡおよびキャップを外されたｈｕＧＡＡを、種々の酵素活性まで取り込み媒体で希釈した後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。取り込み媒体中の各酵素希釈物の活性を、４−ＭＵＧアッセイを使用して再度測定し、実際の酵素活性を決定し、該酵素活性を細胞に添加した。   On the day of the experiment, capped huGAA and uncapped huGAA were diluted with uptake media to various enzyme activities and then filtered through a 0.22 μm filter. The activity of each enzyme dilution in the uptake medium was measured again using a 4-MUG assay to determine the actual enzyme activity and the enzyme activity was added to the cells.

ＧＭ００２４８線維芽細胞を上記酵素とともに１６時間インキュベートし、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、プロテアーゼインヒビターを補充した０．５ｍｌ ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００で溶解した（４℃、３０分間）。細胞溶解産物を１００００×ｇで回転させ、細胞残屑を除去した。ｈｕＧＡＡの細胞内活性を、上記のとおり４−ＭＵＧ活性アッセイを使用して測定した。タンパク質濃度を製造元のプロトコルに従って、ビシンコニン酸法（ミクロＢＣＡキット、Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。ｈｕＧＡＡの細胞内活性を総タンパク質１ｍｇあたりの単位（Ｕ／ｍｇ）として表す。   GM00248 fibroblasts were incubated with the above enzyme for 16 hours, washed twice with ice-cold PBS and then lysed with 0.5 ml PBS + 0.5% Triton X 100 supplemented with protease inhibitors (4 ° C., 30 minutes). . Cell lysates were spun at 10,000 xg to remove cell debris. The intracellular activity of huGAA was measured using a 4-MUG activity assay as described above. Protein concentration was determined by the bicinchoninic acid method (micro BCA kit, Pierce) according to the manufacturer's protocol. The intracellular activity of huGAA is expressed as units (mg / mg) per mg of total protein.

図１７は、ＧＭ００２４８ヒトポンペ線維芽細胞におけるｈｕＧＡＡの細胞内活性を示す。ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンおよび（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎグリカンの混合物を含有するキャップ形成されたｈｕＧＡＡ（図１１、第二のパネルを参照されたい）は、細胞に入らなかった。キャップ形成されたｈｕＧＡＡで処理した細胞の細胞内活性は、非処理の細胞と同様であった（データ非表示）。完全に脱マンノシル化されているｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４（図１１、第三のパネルを参照されたい）も、ポンペ線維芽細胞における取り込みを示さなかった。ＣｃＭａｎ５処理は結果的に、キャップを外された一リン酸化のＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および完全にキャップを外された二リン酸化のＰ２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の形成をもたらしたが、細胞の取り込みは試験した用量範囲にわたって観察されなかった（図１７）。用量依存性細胞取り込みは、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の併用（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５）またはタチナタマメマンノシダーゼ（ｈｕＧＡＡ＿ＪＢＭａｎ）のいずれかによりキャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡであるＨｕＧＡＡについて観察された。ＣｃＭａｎ４／５またはＪｂＭａｎのいずれかにより処理されたｈｕＧＡＡの細胞内活性は、約５００〜１０００Ｕ／ｍｌでプラトーレベルに到達したのに対し、ミオザイム（登録商標）の細胞内活性は、２５００Ｕ／ｍｌでプラトーに到達しなかった。ホスフェートがキャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡは、ミオザイム（登録商標）よりもおよそ２．５倍効率的に取り込まれた。 FIG. 17 shows the intracellular activity of huGAA in GM00248 human Pompe fibroblasts. Capped huGAA containing a mixture of ManP-Man 8 GlcNAc 2 N-glycans and (ManP) 2 -Man 8 GlcNAc 2 N glycans (see FIG. 11, second panel) does not enter the cells. It was. Intracellular activity of cells treated with capped huGAA was similar to untreated cells (data not shown). Fully demannosylated huGAA_CcMan4 (see FIG. 11, third panel) also showed no uptake in Pompe fibroblasts. CcMan5 treatment resulted in the formation of uncapped monophosphorylated P-Man 8 GlcNAc 2 and fully uncapped diphosphorylated P 2 -Man 8 GlcNAc 2 No uptake was observed over the dose range tested (Figure 17). Dose-dependent cellular uptake was observed for HuGAA, a huGAA that was uncapped and demannosylated by either a combination of CcMan4 and CcMan5 (huGAA_CcMan4 / 5) or Tamanama bean mannosidase (huGAA_JBMan). The intracellular activity of huGAA treated with either CcMan4 / 5 or JbMan reached a plateau level at about 500-1000 U / ml, whereas the intracellular activity of Myozyme® was 2500 U / ml. Did not reach the plateau. The uncapped and demannosylated phosphate huGAA incorporated approximately 2.5 times more efficiently than Myozyme®.

取り込みがマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体への結合によるのかどうかを調べるために、第二のセットの実験を実施した。これらの実験については、上記の実験で使用された同じ精製バッチ由来のｈｕＧＡＡを、実施例７に記載されるようなマンノース−１−リン酸−６−マンノース結合型グリカンのキャップを外すためのＣｃＭａｎ４マンノシダーゼおよびＣｃＭａｎ５マンノシダーゼで、または実施例８に記載されているようなタチナタマメマンノシダーゼで処理した。ミオザイム（登録商標）を対照標準として使用した。ｈｕＧＡＡの取り込み効率に及ぼす末端α−１，２マンノースの効果を調べるために、ミオザイム（登録商標）をＣｃＭａｎ４マンノシダーゼにより処理した。この酵素の比活性を、上記のような４−ＭＵＧアッセイを使用して決定した。取り込みアッセイを上記のとおり実施した。この酵素を取り込み媒体における等しい酵素活性に希釈し、濾過し、および種々の用量をＧＭ００２４８線維芽細胞に、５ｍＭ Ｍ６Ｐ（Ｓｉｇｍａ社）を存在させて添加し、またはそれを存在さないで添加し、１６時間インキュベートした。各細胞取り込み実験を二つ組で実施した。インキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼインヒビターを補充した０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００で溶解し、４−ＭＵＧアッセイを使用して細胞内ｈｕＧＡＡ活性についてアッセイした。   To investigate whether the uptake was due to binding to the mannose-6-phosphate (M6P) receptor, a second set of experiments was performed. For these experiments, huGAA from the same purification batch used in the above experiment was converted to CcMan4 for uncapping mannose-1-phosphate-6-mannose linked glycans as described in Example 7. Treated with mannosidase and CcMan5 mannosidase, or with red bean mannosidase as described in Example 8. Myozyme® was used as a reference standard. To examine the effect of terminal α-1,2 mannose on huGAA incorporation efficiency, Myozyme® was treated with CcMan4 mannosidase. The specific activity of this enzyme was determined using a 4-MUG assay as described above. The uptake assay was performed as described above. This enzyme is diluted to equal enzyme activity in the uptake medium, filtered, and various doses are added to GM00248 fibroblasts in the presence or absence of 5 mM M6P (Sigma); Incubated for 16 hours. Each cell uptake experiment was performed in duplicate. Following incubation, cells were washed with ice-cold PBS, lysed with 0.5 ml PBS + 0.5% Triton X 100 supplemented with protease inhibitors, and assayed for intracellular huGAA activity using a 4-MUG assay.

図１８は、ＧＭ００２４８線維芽細胞におけるｈｕＧＡＡ酵素の取り込みを示す。ＣｃＭａｎ４によるミオザイム（登録商標）の処理は、ミオザイム（登録商標）のＮ−グリカン特性を変化させることも（図１３、第三のパネルを参照されたい）、その取り込みの効率性を変化させることもなかった。ミオザイム（登録商標）の取り込みは、遊離Ｍ６Ｐの添加によって阻害された。図１８における結果は、キャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡ（ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５、ｈｕＧＡＡ＿ＪＢＭａｎ）の用量依存性取り込みを示しており、これはＭ６Ｐの添加によって阻害される。これらの結果は、キャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡの取り込みがＭ６Ｐ受容体を介して仲介されることを示している。   FIG. 18 shows the uptake of huGAA enzyme in GM00248 fibroblasts. Treatment of Myozyme® with CcMan4 can change the N-glycan properties of Myozyme® (see FIG. 13, third panel) or change its efficiency of uptake. There wasn't. Myozyme® uptake was inhibited by the addition of free M6P. The results in FIG. 18 show a dose dependent uptake of uncapped and demannosylated huGAA (huGAA_CcMan4 / 5, huGAA_JBMan), which is inhibited by the addition of M6P. These results indicate that uptake of uncapped and demannosylated huGAA is mediated through the M6P receptor.

実施例１０
（ポンペ線維芽細胞のリソソームにおけるｈｕＧＡＡのプロセシング）
ｈｕＧＡＡは、小胞体において１１０ｋＤａ前駆体として産生される。該ｈｕＧＡＡは、ゴルジ装置においてＮ−グリカンプロセシングを受け、リソソームにおいてさらに、中間の分子形態の９５ｋＤａを経て７６ｋＤａおよび７０ｋＤａの活性のあるタンパク質へとタンパク質分解でプロセシングされる。この活性のあるタンパク質は、その天然基質であるグリコーゲンの分解に関与する。以下の実験においては、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａで１１０ｋＤａタンパク質として産生される、精製された組換えｈｕＧＡＡの細胞内プロセシングを調べた。これらの実験については、調製緩衝液を２ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｍＭマンニトールを有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）へと交換して、実施例９において使用されたものとは異なる精製バッチ由来のｈｕＧＡＡ（実施例７を参照されたい）を、実施例７に記載したとおり、ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５を併用して、またはタチナタマメマンノシダーゼで処理した。キャップを外された酵素の比活性を、４−ＭＵＧアッセイを使用して決定した。実験前日、ＧＭ００２４８線維芽細胞を、上記のとおり、取り込み媒体中５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。翌日、線維芽細胞を２ｍｌ取り込み媒体中１０００Ｕ／ｍｌのｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５またはｈｕＧＡＡ＿ＪＢＭａｎとともに１４時間または４６時間インキュベートした。対照標準として、細胞をミオザイム（登録商標）とともにインキュベートし、酵素とともにインキュベートしなかった細胞を陰性対照として使用した。各細胞取り込み実験を二つ組で実施した。インキュベーション後、ＧＭ００２４８線維芽細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理（０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを有する０．０５％トリプシン）によって収穫した。細胞を遠心分離し、プロテアーゼインヒビターを補充した０．５ｍｌ ＰＢＳ＋０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００に溶解した。細胞溶解産物を遠心分離して細胞残屑を除去し、上記のような４−ＭＵＧアッセイを使用して細胞内ＧＡＡ活性についてアッセイした。タンパク質濃度をＢＣＡ法によって決定した。 Example 10
(Processing of huGAA in lysosomes of Pompe fibroblasts)
huGAA is produced as a 110 kDa precursor in the endoplasmic reticulum. The huGAA undergoes N-glycan processing in the Golgi apparatus and is further proteolytically processed in the lysosome via an intermediate molecular form of 95 kDa to an active protein of 76 kDa and 70 kDa. This active protein is involved in the degradation of its natural substrate, glycogen. In the following experiment, Y.C. The intracellular processing of purified recombinant huGAA produced as a 110 kDa protein in lipolytica was examined. For these experiments, the prepared buffer was replaced with 100 mM HEPES (pH 7) with 2 mM CaCl 2 and 100 mM mannitol, and huGAA from a purification batch different from that used in Example 9 (Example 7). (See) was treated with CcMan4 and CcMan5 in combination or with Tamanamamannosidase as described in Example 7. The specific activity of the uncapped enzyme was determined using a 4-MUG assay. The day before the experiment, GM00248 fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 5 × 10 5 cells / well in uptake medium as described above. The next day, fibroblasts were incubated with 1000 U / ml huGAA_CcMan4 / 5 or huGAA_JBMan in 2 ml uptake medium for 14 or 46 hours. As a control, cells were incubated with Myozyme® and cells that were not incubated with enzyme were used as negative controls. Each cell uptake experiment was performed in duplicate. After incubation, GM00248 fibroblasts were washed with ice cold PBS and harvested by trypsinization (0.05% trypsin with 0.53 mM EDTA). Cells were centrifuged and lysed in 0.5 ml PBS + 0.5% Triton X100 supplemented with protease inhibitors. Cell lysates were centrifuged to remove cell debris and assayed for intracellular GAA activity using a 4-MUG assay as described above. Protein concentration was determined by the BCA method.

図１９は、細胞内ｈｕＧＡＡ活性を示す。ｈｕＧＡＡ＿Ｃｃｍａｎ４／５は部分的に脱リン酸化されてＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡ２および（ＭａｎＰ）−Ｍａｎ６ＧｌｃＮａｃ２となり（図１４、第三のパネル）、この酵素は、試験した両インキュベーション時間でミオザイム（登録商標）よりも１．８倍良好に取り込まれた。ｈｕＧＡＡ＿ＪＢＭａｎもミオザイム（登録商標）より良好に取り込まれたが、おそらく二リン酸化したＮ−グリカンであるＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２が存在しないことにより、ｈｕＧＡＡ＿ＣｃＭａｎ４／５と比較してあまり効率的ではなかった（図１６、第三のパネル）。 FIG. 19 shows intracellular huGAA activity. huGAA_Cman4 / 5 is partially dephosphorylated to P-Man 6 GlcNA 2 and (ManP) -Man 6 GlcNac 2 (FIG. 14, third panel), and this enzyme is myozyme (both at both incubation times tested). It was taken in 1.8 times better than (registered trademark). huGAA_JBMan was also better incorporated than Myozyme®, but was less efficient compared to huGAA_CcMan4 / 5, probably due to the absence of the diphosphorylated N-glycan P2-Man 6 GlcNAc 2 (FIG. 16, third panel).

この実験の目的は、線維芽細胞によって取り込まれたｈｕＧＡＡが７６ｋＤａおよび７０ｋＤａの活性型へとプロセシングされるかどうかを試験することであった。それゆえ、細胞試料をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）／デオキシコール酸（ＤＯＣ）法によって沈殿させた。試料（５００μｌ、１６０μｇのタンパク質を含有）を５０μＬの０．５％ＤＯＣと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。ＴＣＡ１００％（１００μｌ）を添加して１５％のＴＣＡ終濃度を得た後、試料を混合して−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿物を微量遠心分離機において１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ペレットからＴＣＡを吸引した。上記ペレットを５００〜７００μｌの氷冷アセトンで洗浄し、混合して、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを５０℃で１０分間乾燥させた後、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤を含有する１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料バッファ中で再度可溶化した。試料を１００℃で３分間煮沸した後、２０μｇのタンパク質（１０μｌ）を、５００μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤を含有する１×ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動バッファを有する４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にのせた。ミオザイム（登録商標）（５０ｎｇ）を対照標準として上記ゲルにのせた。試料をニトロセルロースメンブラン上に一晩ブロットし、細胞内ｈｕＧＡＡを、ポリクローナルウサギ抗ｈｕＧＡＡ血清（１／２０００希釈）を一次抗体として、かつヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（１／５０００希釈、Ｓｉｇｍａ社）を二次抗体として使用して検出した。このメンブレンをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、メンブランを、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して顕色した。キャップを外された酵素との、およびミオザイム（登録商標）との１４時間のインキュベーション時間は結果的に、主として前駆体タンパク質の存在を生じた。ｈｕＧＡＡ＿Ｃｃｍａｎ４／５処理した細胞においては、少量の７６ｋＤａタンパク質が観察された。４６時間のインキュベーション後、キャップを外された酵素を活性のある７６ｋＤａポリペプチドへとプロセシングされた。ミオザイム（登録商標）も活性のあるポリペプチドへとプロセシングされているが、バンドはあまり濃くなかった。   The purpose of this experiment was to test whether huGAA taken up by fibroblasts was processed into active forms of 76 kDa and 70 kDa. Therefore, cell samples were precipitated by the trichloroacetic acid (TCA) / deoxycholic acid (DOC) method. Samples (500 μl, containing 160 μg protein) were mixed with 50 μL 0.5% DOC and incubated on ice for 30 minutes. After adding 100% TCA (100 μl) to obtain a final concentration of 15% TCA, the samples were mixed and precipitated overnight at −20 ° C. The precipitate was centrifuged at 13000 rpm for 30 minutes in a microcentrifuge, and then TCA was aspirated from the pellet. The pellet was washed with 500-700 μl of ice cold acetone, mixed and centrifuged at 13000 rpm. The pellet was dried at 50 ° C. for 10 minutes and then resolubilized in 1 × NuPAGE® LDS sample buffer containing NuPAGE® sample reducing agent. After boiling the sample at 100 ° C. for 3 min, 20 μg protein (10 μl) was added to 4-12% NuPAGE® with 1 × MOPS SDS running buffer containing 500 μl NuPAGE® antioxidant. Bis-Tris gel (Invitrogen) was applied. Myozyme® (50 ng) was placed on the gel as a control. Samples were blotted overnight on a nitrocellulose membrane, intracellular huGAA, polyclonal rabbit anti-huGAA serum (1/2000 dilution) as primary antibody and goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugated antibody (1/5000 dilution, Sigma) Was detected as a secondary antibody. After the membrane was washed with PBS / Tween, the membrane was developed using an ECL western blotting detection reagent (GeHealthcare). A 14 hour incubation time with the uncapped enzyme and with Myozyme® resulted primarily in the presence of the precursor protein. A small amount of 76 kDa protein was observed in huGAA_Ccman4 / 5 treated cells. After 46 hours of incubation, the uncapped enzyme was processed into the active 76 kDa polypeptide. Myozyme® was also processed into an active polypeptide, but the band was not very dark.

実施例１１
（ＣｃＭａｎ５およびタチナタマメα−マンノシダーゼによる組換えｈｕＧＡＡのキャップ外しおよび脱マンノシル化）
ｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５：ＪｂＭａｎについて１００：５：１０のｗ：ｗ比でＣｃＭａｎ５およびＪＢＭａｎによって組換えｈｕＧＡＡのキャップを外しかつ脱マンノシル化した。１．０８ｍｌのｈｕＧＡＡ（４０ｍＭ ＮａＣｌを有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中４．８ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、１．６９ｍｌのＣｃＭａｎ５（ＰＢＳ緩衝液中０．１５４ｍｇ／ｍｌ）および１．０４ｍｌのＪｂＭａｎ（ＰＢＳ緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。総反応容積を、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）により５．２ｍｌに調整した。反応混合物を３０℃で１５時間インキュベートした。キャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡを、実施例３に記載したとおり、Ｈｉｌｏａｄ １６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。 Example 11
(Uncapping and demannosylation of recombinant huGAA with CcMan5 and red bean α-mannosidase)
Recombinant huGAA was uncapped and demannosylated with CcMan5 and JBMan at a w: w ratio of 100: 5: 10 for huGAA: CcMan5: JbMan. To a solution of 1.08 ml huGAA (4.8 mg / ml in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) with 40 mM NaCl), 1.69 ml CcMan5 (0.154 mg / ml in PBS buffer) and 1 .04 ml of JbMan (0.5 mg / ml in PBS buffer) was added. The total reaction volume was adjusted to 5.2 ml with 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) containing 2 mM CaCl 2 . The reaction mixture was incubated at 30 ° C. for 15 hours. Uncapped and demannosylated huGAA was purified using a Hiload 16/60 superdex 200 gel filtration column (GE Healthcare) as described in Example 3.

実施例６に記載されるとおり、１０μｇの精製された最終のｈｕＧＡＡからＮ−グリカンが放出され、そして標識された。ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎの両方で処理したｈｕＧＡＡ由来のＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を図２０に示す。キャップ外しおよび脱マンノシル化の後に観察される主要ピークは、二リン酸化のＰ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２および一リン酸化のＰ−Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ−ＭａｎＧｌｃＮＡｃ２であった。 As described in Example 6, N-glycan was released from 10 μg of the final purified huGAA and labeled. A DSA-FACE electropherogram of huGAA-derived N-glycans treated with both CcMan5 and JbMan is shown in FIG. The major peaks observed after uncapping and demannosylation are diphosphorylated P2-Man 6 GlcNAc 2 and monophosphorylated P-Man 4 GlcNAc 2 , P-Man 5 GlcNAc 2 , and P-ManGlcNAc 2 there were.

実施例１２
（ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎによってキャップを外されかつ脱マンノシル化した組換えｈｕＧＡＡのポンペ線維芽細胞への取り込み）
実施例９に記載したとおりＧＭ００２４８線維芽細胞系を使用して、キャップを外され、脱マンノシル化し、かつ精製されたｈｕＧＡＡ（実施例１１に記載されたとおりＪｂＭａｎおよびＣｃＭａｎ５で処理した）の細胞取り込みを、ミオザイム（登録商標）の細胞取り込みと比較した。 Example 12
(Incorporation of recombinant huGAA uncapped and demannosylated by CcMan5 and JbMan into Pompe fibroblasts)
Cell uptake of uncapped, demannosylated and purified huGAA (treated with JbMan and CcMan5 as described in Example 11) using the GM00248 fibroblast cell line as described in Example 9 Were compared to the cellular uptake of Myozyme®.

図２１は、ミオザイム（登録商標）の細胞内活性に対する、キャップを外されかつ脱マンノシル化した精製されたｈｕＧＡＡの細胞内活性を示す。細胞に添加される酵素の量（酵素活性単位して表される）を酵素濃度（ｎＭとして表される）へ変換し、Ｋ取り込みの計算のために、その比活性（Ｕ／ｍｇで表される）に対してプロットした。Ｋ取り込みおよび標準偏差をｈｕＧＡＡについては１４のデータ点（濃度あたり２データ点）を、およびミオザイム（登録商標）については１２のデータ点によって非線形回帰を使用するＧｒａｐｈＰｒｉｓｍで算出した。用量依存性細胞取り込みをｈｕＧＡＡについて観察し、約２５ｎＭでプラトーレベルに達し、そしてＫ取り込みが１．７±０．２ｎＭであったのに対し、ミオザイムの細胞内活性は、２００ｎＭでプラトーに到達せず、かつ６４±５ｎＭのＫ取り込みを有している。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて産生されるキャップを外され、脱マンノシル化したｈｕＧＡＡは、ポンペ線維芽細胞において、ミオザイム（登録商標）よりも３０倍効率的に取り込まれた。 FIG. 21 shows the intracellular activity of purified huGAA, uncapped and demannosylated, against the intracellular activity of Myozyme®. The amount of enzyme added to the cell (expressed in enzyme activity units) is converted to enzyme concentration (expressed as nM) and its specific activity (expressed in U / mg) for the calculation of K uptake. ). K uptake and standard deviation were calculated with GraphPrism using nonlinear regression with 14 data points (2 data points per concentration) for huGAA and 12 data points for Myozyme®. Dose-dependent cellular uptake was observed for huGAA, reaching a plateau level at about 25 nM, and K uptake was 1.7 ± 0.2 nM, whereas the intracellular activity of myozyme reached a plateau at 200 nM. And has a K uptake of 64 ± 5 nM. Uncapped and demannosylated huGAA produced in Yarrowia lipolytica was taken up 30-fold more efficiently in Pompe fibroblasts than Myozyme®.

実施例１３
（ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎによってキャップを外されかつ脱マンノシル化した組換えｈｕＧＡＡのポンペ線維芽細胞のリソソームにおけるプロセシング）
実施例１１に記載されたようにＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎで処理したＹａｒｒｏｗｉａ産生ｈｕＧＡＡがリソソーム中で該ｈｕＧＡＡの成熟形態へとプロセシングされるかどうかを決定するために、細胞取り込みアッセイを実施した。実験前日、ＧＭ００２４８線維芽細胞を、取り込み媒体中３×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。翌日、線維芽細胞を２ｍｌ取り込み媒体中２０００Ｕ／ｍｌ ｈｕＧＡＡで８時間もしくは２４時間刺激し、または２４時間刺激した（「パルス」期間）後、細胞を洗浄し、２ｍｌの増殖培地を細胞へ最長１００時間のチェイス期間にわたって添加した。酵素で処理されていない細胞を陰性対照として使用した。 Example 13
(Processing in lysosomes of Pompe fibroblasts of recombinant huGAA uncapped and demannosylated by CcMan5 and JbMan)
To determine whether Yarrowia-produced huGAA treated with CcMan5 and JbMan was processed in lysosomes to the mature form of huGAA as described in Example 11, a cell uptake assay was performed. The day before the experiment, GM00248 fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 3 × 10 5 cells / well in uptake medium. The next day, after fibroblasts were stimulated with 2000 U / ml huGAA in 2 ml uptake medium for 8 or 24 hours, or after 24 hours (“pulse” period), the cells were washed and 2 ml of growth medium was applied to the cells for up to 100 Added over the chase period of time. Cells not treated with enzyme were used as negative controls.

インキュベーション後、細胞を洗浄し、細胞溶解産物を実施例１０に記載したようなＤＯＣ／ＴＣＡ法を使用して沈殿させ、ウェスタンブロット法に供した。対照標準として、精製ｈｕＧＡＡ（３０ｎｇ）をゲルにのせた。試料を一晩ブロットし、ポリクローナルウサギ抗ｈｕＧＡＡ血清（１／２０００希釈）を一次抗体として、かつヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（１／８０００希釈、Ａｂｃａｍ社）を二次抗体として使用して、細胞内ｈｕＧＡＡを検出した。ＥＣＬウェスタンブロット法検出試薬（ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してメンブランを顕色させた。   Following incubation, cells were washed and cell lysates were precipitated using the DOC / TCA method as described in Example 10 and subjected to Western blotting. As a control standard, purified huGAA (30 ng) was applied to the gel. Samples were blotted overnight using polyclonal rabbit anti-huGAA serum (1/2000 dilution) as the primary antibody and goat anti-rabbit IgG peroxidase-conjugated antibody (1/8000 dilution, Abcam) as the secondary antibody. Internal huGAA was detected. The membrane was developed using ECL Western blotting detection reagent (GeHealthcare).

キャップを外されかつ脱マンノシル化した酵素との８時間のインキュベーション期間は結果的に、前駆体タンパク質（１１０ｋＤａ）の存在を生じた。２４時間のインキュベーション期間は結果的に、前駆体タンパク質およびプロセシングされたタンパク質（７６ｋＤ）の両方の存在を生じたのに対し、２４時間のパルス期間および最長１００時間のチェイス期間の後、ほぼすべてのタンパク質が、活性のある７６ｋＤのポリペプチドへとプロセシングされていた。これらの結果は、キャップを外されかつ脱マンノシル化したｈｕＧＡＡが線維芽細胞によって取り込まれ、リソソームにおいて活性のあるポリペプチドへとプロセシングされたことを実証している。   An 8 hour incubation period with the uncapped and demannosylated enzyme resulted in the presence of the precursor protein (110 kDa). A 24 hour incubation period resulted in the presence of both precursor protein and processed protein (76 kD), whereas after a 24 hour pulse period and up to 100 hour chase period, almost all The protein was processed into an active 76 kD polypeptide. These results demonstrate that uncapped and demannosylated huGAA was taken up by fibroblasts and processed into a polypeptide active in lysosomes.

（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、上の記載は、本発明の範囲を明示するよう意図されており、かつ該範囲を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。 (Other embodiments)
While the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the above description is intended to clarify the scope of the invention and is not intended to limit the scope thereof, but by the appended claims. Defined. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims (58)

糖タンパク質におけるマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分のキャップを外して、リン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、
ａ）該マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを有する該糖タンパク質を提供する工程と、
ｂ）該糖タンパク質を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程
とを含む、前記方法。 A method for uncapping a mannose-1-phospho-6-mannose moiety in a glycoprotein to demannosylate phosphorylated N-glycans comprising:
a) providing the glycoprotein having phosphorylated N-glycans containing the mannose-1-phospho-6-mannose moiety;
b) the glycoprotein (i) can hydrolyze the mannose-1-phospho-6-mannose moiety to mannose-6-phosphate and (ii) a terminal α-1,2 mannose bond, α-1 , 3 mannose linkage, and / or contacting with a mannosidase capable of hydrolyzing α-1,6 mannose linkage. リン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する方法であって、
ａ）リン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を提供する工程と、
ｂ）該糖タンパク質を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程
とを含む、前記方法。 A method for demannosylating phosphorylated N-glycans comprising:
a) providing a glycoprotein comprising phosphorylated N-glycans;
b) the glycoprotein (i) can hydrolyze the mannose-1-phospho-6-mannose moiety to mannose-6-phosphate and (ii) a terminal α-1,2 mannose bond, α-1 , 3 mannose linkage, and / or contacting with a mannosidase capable of hydrolyzing α-1,6 mannose linkage. 前記マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項１または２に記載の方法。 3. The method of claim 1 or 2, wherein the mannosidase is a family 38 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mannosidase is derived from Canavalia ensiformis. 前記マンノシダーゼは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mannosidase is derived from Yarrowia lipolytica. 工程（ａ）および工程（ｂ）の後に、哺乳類細胞を、前記脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む前記糖タンパク質と接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程の後に、該糖タンパク質は、該哺乳類細胞の内部へ輸送される工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 After step (a) and step (b), contacting a mammalian cell with said glycoprotein comprising said demannosylated phosphorylated N-glycan, wherein after said contacting step, 6. The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising the step of transporting the glycoprotein into the mammalian cell. 前記哺乳類細胞はヒト細胞である、請求項６に記載の方法。 The method of claim 6, wherein the mammalian cell is a human cell. 糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、ａ）マンノース−６−リン酸部分が脱マンノシル化した糖タンパク質を提供する工程と、ｂ）該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程とを含む、方法。 A method of directing a glycoprotein to the interior of a mammalian cell comprising: a) providing a glycoprotein demannosylated at the mannose-6-phosphate moiety; and b) contacting the cell with the demannosylated glycoprotein. Comprising the step of: 前記マンノシダーゼはファミリー４７のグリコシルヒドロラーゼである、請求項８に記載の方法。 9. The method of claim 8, wherein the mannosidase is a family 47 glycosyl hydrolase. 前記糖タンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来のマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化される、請求項８または請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 8 or claim 9, wherein the glycoprotein is demannosylated using a mannosidase from Aspergillus satoi. 前記マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼである、請求項８に記載の方法。 9. The method of claim 8, wherein the mannosidase is a family 92 glycosyl hydrolase. 前記糖タンパク質は、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化される、請求項８または請求項１１に記載の方法。 12. A method according to claim 8 or claim 11, wherein the glycoprotein is demannosylated using a mannosidase from Cellulosimicrobium cellulans. 前記マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項８に記載の方法。 9. The method of claim 8, wherein the mannosidase is a family 38 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来である、請求項８または請求項１３に記載の方法。 14. The method of claim 8 or claim 13, wherein the mannosidase is derived from Canavaria ensiformis or Yarrowia lipolytica. 糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、
ａ）リン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程であって、ここで、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない工程と、
ｂ）該糖タンパク質を、末端α−１，２マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程であって、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に脱マンノシル化した糖タンパク質を生成し、ここで、該糖タンパク質は該脱マンノシル化の後、該細胞における該マンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する工程と、
ｃ）該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程
とを含む、前記方法。 A method of directing a glycoprotein into the interior of a mammalian cell,
a) providing a glycoprotein having phosphorylated N-glycans, wherein the glycoprotein does not substantially bind to the mannose-6-phosphate receptor of the cell;
b) contacting the glycoprotein with a mannosidase capable of hydrolyzing the terminal α-1,2 mannose bond, producing a demannosylated glycoprotein when the underlying mannose is phosphorylated Wherein the glycoprotein substantially binds to the mannose-6-phosphate receptor in the cell after the demannosylation;
c) contacting the cell with the demannosylated glycoprotein. 前記マンノシダーゼはファミリー４７のグリコシルヒドロラーゼである、請求項１５に記載の方法。 16. The method of claim 15, wherein the mannosidase is a family 47 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来である、請求項１５または請求項１６に記載の方法。 The method according to claim 15 or 16, wherein the mannosidase is derived from Aspergillus satoi. 前記マンノシダーゼはファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼである、請求項１５に記載の方法。 16. The method of claim 15, wherein the mannosidase is a family 92 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、請求項１５または請求項１８に記載の方法。 19. The method according to claim 15 or claim 18, wherein the mannosidase is derived from Cellulosimicrobium cellulans. 前記マンノシダーゼはファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項１５に記載の方法。 16. The method of claim 15, wherein the mannosidase is a family 38 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼはＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来である、請求項１５または請求項２０に記載の方法。 21. A method according to claim 15 or claim 20, wherein the mannosidase is from Canavaria ensiformis or Yarrowia lipolytica. 糖タンパク質を、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する第二の形態へと変換する方法であって、該第一の形態の該糖タンパク質を、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触させる工程を含み、ここで、該第一の形態において、該糖タンパク質は、その６位にリン酸残基を含有するマンノース残基に対しその１位で結合するマンノース残基を１つ以上含有する１つ以上のＮ−グリカンを含む、方法。 From a first form that does not substantially bind the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells to a second form that substantially binds to the mannose-6-phosphate receptor of mammalian cells. A method of conversion comprising contacting the first form of the glycoprotein with a mannosidase that demannosylates a terminal mannose residue, wherein in the first form the glycoprotein comprises: A method comprising one or more N-glycans containing one or more mannose residues bound at the 1-position to a mannose residue containing a phosphate residue at the 6-position. 前記マンノシダーゼは、キャップを外してかつ脱マンノシル化する活性を有する、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the mannosidase has activity of uncapping and demannosylation. 前記マンノシダーゼはファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項２２または請求項２３に記載の方法。 24. The method of claim 22 or claim 23, wherein the mannosidase is a family 38 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼはＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。 25. A method according to any one of claims 22 to 24, wherein the mannosidase is derived from Canavalia ensiformis or Yarrowia lipolytica. 前記マンノシダーゼはキャップを外す活性を有しない、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the mannosidase has no uncapping activity. 前記マンノシダーゼは、ファミリー４７またはファミリーの９２グリコシルヒドロラーゼである、請求項２２または請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 22 or claim 26, wherein the mannosidase is a family 47 or family 92 glycosyl hydrolase. 前記マンノシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、請求項２２、請求項２６、または請求項２７に記載の方法。 28. The method of claim 22, 26, or claim 27, wherein the mannosidase is from Aspergillus satoi or Cellulosimicrobium cellulans. １つ以上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含む糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、（ａ）該糖タンパク質における該１つ以上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸へとキャップを外す工程であって、ここで、キャップを外した後、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しない工程、および、工程（ａ）の後、（ｂ）該糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する工程であって、ここで、該キャップを外す工程および該脱マンノシル化する工程の両者の後に、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合する工程、の後に該細胞を該糖タンパク質と接触させる工程を含む、方法。 A method of directing a glycoprotein comprising one or more mannose-1-phospho-6-mannose moieties into the interior of a mammalian cell, comprising: (a) the one or more mannose-1-phospho-6-6 in the glycoprotein Uncapping the mannose moiety to mannose-6-phosphate, wherein the glycoprotein does not substantially bind to the mannose-6-phosphate receptor of the cell after uncapping. And after step (a), (b) demannosylating phosphorylated N-glycans in the glycoprotein, wherein both the step of removing the cap and the step of demannosylation Later, the method comprising the step of binding the glycoprotein substantially to the mannose-6-phosphate receptor of the cell followed by contacting the cell with the glycoprotein. 工程（ａ）および工程（ｂ）は２つの異なる酵素によって触媒される、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29, wherein step (a) and step (b) are catalyzed by two different enzymes. 工程（ａ）および工程（ｂ）は単一の酵素によって触媒される、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29, wherein step (a) and step (b) are catalyzed by a single enzyme. 糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程と、該哺乳類細胞を該糖タンパク質と接触させる工程とを含む、方法。 A method of directing a glycoprotein to the interior of a mammalian cell, comprising providing a glycoprotein having an uncapped and demannosylated phosphorylated N-glycan; and contacting the mammalian cell with the glycoprotein; Including a method. 前記糖タンパク質はヒトタンパク質である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 32, wherein the glycoprotein is a human protein. 前記糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 32, wherein the glycoprotein is a pathogen protein, a lysosomal protein, a growth factor, a cytokine, a chemokine, an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or a fusion protein. 前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、請求項３４に記載の方法。 35. The method of claim 34, wherein the lysosomal protein is a lysosomal enzyme. 前記リソソーム酵素は、酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼである、請求項３５に記載の方法。 36. The method of claim 35, wherein the lysosomal enzyme is acid alpha glucosidase or alpha galactosidase. 前記糖タンパク質はＬＳＤと関連している、請求項３３に記載の方法。 34. The method of claim 33, wherein the glycoprotein is associated with LSD. 前記ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項３７に記載の方法。 The LSD is Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick Disease, Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilip's disease, Morquio's disease, Maroto Lamy's disease, hyaluronidase deficiency, aspartyl glucosamineuria, fucose accumulation disease, mannose accumulation disease, Schindler disease, type 1 sialidosis, Pompe disease Osteopathy, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid accumulation disorder, chylomicron accumulation disease with Marinesco-Sjogren's syndrome, Hermans Over-Padorakku syndrome, Chediak-Higashi syndrome, Danon disease, or happiness facial dysplasia The method of claim 37. 請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法で処理された、哺乳類細胞の内部へ輸送されることのできる糖タンパク質。 A glycoprotein that can be transported into the interior of a mammalian cell, treated by the method of any one of claims 1-38. 請求項３９に記載の糖タンパク質を含む哺乳類細胞。 40. A mammalian cell comprising the glycoprotein of claim 39. 前記細胞はヒト細胞である、請求項４０に記載の哺乳類細胞。 41. The mammalian cell of claim 40, wherein the cell is a human cell. 請求項３９に記載の糖タンパク質の投与を必要とする被験体に、該糖タンパク質を投与する工程を含む、処置方法。 40. A treatment method comprising the step of administering the glycoprotein to a subject in need of administration of the glycoprotein of claim 39. 脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該マンノシダーゼが、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端α−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することができる、真菌細胞。 An isolated fungal cell engineered to produce a glycoprotein comprising a demannosylated phosphorylated N-glycan comprising a nucleic acid encoding mannosidase, wherein the mannosidase comprises (i) mannose-1- The phospho-6-mannose moiety can be hydrolyzed to mannose-6-phosphate and (ii) a terminal α-1,2 mannose bond, an α-1,3 mannose bond, and / or an α-1,6 mannose Fungal cells that can hydrolyze bonds. 前記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項４３に記載の真菌細胞。 44. The fungal cell of claim 43, wherein the fungal cell further comprises a nucleic acid encoding a polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation. 前記真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作される、請求項４３または請求項４４に記載の真菌細胞。 45. The fungal cell of claim 43 or claim 44, wherein the fungal cell is genetically engineered to be deficient in OCH1 activity. 標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の真菌細胞であって、ここで、該標的タンパク質が糖タンパク質である、該真菌細胞。 46. The fungal cell according to any one of claims 43 to 45, further comprising a nucleic acid encoding a target protein, wherein the target protein is a glycoprotein. 前記標的タンパク質はヒトタンパク質である、請求項４６に記載の真菌細胞。 48. The fungal cell of claim 46, wherein the target protein is a human protein. 前記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項４６に記載の真菌細胞。 47. The fungal cell of claim 46, wherein the target protein is a pathogen protein, lysosomal protein, growth factor, cytokine, chemokine, antibody or antigen-binding fragment thereof, or a fusion protein. 前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、請求項４８に記載の真菌細胞。 49. The fungal cell of claim 48, wherein the lysosomal protein is a lysosomal enzyme. 前記リソソーム酵素は酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼである、請求項４９に記載の真菌細胞。 52. The fungal cell of claim 49, wherein the lysosomal enzyme is acid alpha glucosidase or alpha galactosidase. 前記糖タンパク質は、ＬＳＤと関連しているタンパク質である、請求項４７に記載の真菌細胞。 48. The fungal cell of claim 47, wherein the glycoprotein is a protein associated with LSD. 前記ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項５１に記載の真菌細胞。 The LSD is Fabry disease, mucopolysaccharidosis type I, Faber disease, Gaucher disease, GM1 gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activator disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick Disease, Schaeer's disease, Hunter's disease, Sanfilip's disease, Morquio's disease, Maroto Lamy's disease, hyaluronidase deficiency, aspartyl glucosamineuria, fucose accumulation disease, mannose accumulation disease, Schindler disease, type 1 sialidosis, Pompe disease Osteopathy, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storage disease, Wolman disease, multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid accumulation disorder, chylomicron accumulation disease with Marinesco-Sjogren's syndrome, Hermans Over-Padorakku syndrome, Chediak-Higashi syndrome, Danon disease, or happiness facial dysplasia, fungal cells of claim 51. 前記真菌細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞またはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞である、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の真菌細胞。 The fungal cell according to any one of claims 32 to 41, wherein the fungal cell is a Yarrowia lipolytica cell or an Arxula adeninivorans cell. マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドはＭＮＮ４ポリペプチドである、請求項３３に記載の真菌細胞。 34. The fungal cell of claim 33, wherein the polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation is a MNN4 polypeptide. 前記ＭＮＮ４ポリペプチドは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａポリペプチド、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリペプチド、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａポリペプチド、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓポリペプチド、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓポリペプチドである、請求項４３に記載の真菌細胞。 The MNN4 polypeptide is a Yarrowia lipolytica polypeptide, S. cerevisiae. cerevisiae polypeptide, Ogataea minuta polypeptide, Pichia pastoris polypeptide, or C.I. 44. The fungal cell of claim 43, which is an albicans polypeptide. マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１ポリペプチドである、請求項４４に記載の真菌細胞。 The polypeptide capable of promoting mannosyl phosphorylation is P.I. 45. The fungal cell of claim 44, which is a pastoris PNO1 polypeptide. 前記マンノシダーゼは分泌シグナルを含む、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載の真菌細胞。 57. The fungal cell according to any one of claims 43 to 56, wherein the mannosidase comprises a secretion signal. 前記マンノシダーゼは、該マンノシダーゼを細胞内区画へ導くためのターゲッティングシグナルを含む、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載の真菌細胞。 57. The fungal cell according to any one of claims 43 to 56, wherein the mannosidase comprises a targeting signal for directing the mannosidase to an intracellular compartment.
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