JP2013532979A - 追加のキシロースイソメラーゼ活性を有する組換えザイモモナス(Zymomonas)中における改善されたキシロース利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第DE−FC36−07GO17056の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
a)位置226のロイシン、
b)位置223のメチオニン、
c)位置191のイソロイシン、
d)位置195のスレオニン、セリン、またはバリン、
e)位置88のメチオニン、スレオニンまたはグアニン(quanine)、
f)位置290のヒスチジン、
g)位置221のグルタミン酸またはアスパラギン酸、
h)位置242のフェニルアラニン、バリン、またはロイシン、
i)位置243のヒスチジン、
j)位置193のロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニン、
k)位置256のグルタミン、
l)位置213のグリシン、
m)位置288のプロリン、チロシン、アラニン、またはセリン、および
n)位置249のグルタミン。
a)I群に属さないキシロースイソメラーゼを含んでなるキシロース利用経路を含んでなる、ザイモモナス(Zymomonas)およびザイモバクター(Zymobacter)からなる群から選択される組換え細菌株を提供するステップと;
b)キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップを含んでなり、ポリペプチドがI群キシロースイソメラーゼである、組換え細菌細胞中でキシロース利用を改善する方法を提供する。
a)本発明の組換え細菌株を提供するステップと;
b)(a)の株がエタノールを産生する条件下で株をキシロースと接触させるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
配列番号307は、LoxPw−aadA−LoxPw DNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である
キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ(XI)は、細菌細胞中で発現されると炭素源としてキシロースを利用する能力を提供する、4つの酵素の1つである。キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼと共に、XIは、図1に示されるように、エタノール生合成中に供給される果糖−6−Pおよびグリセルアルデヒド−3−Pを生成する、キシロースからの経路を提供する。キシロース利用経路の第1の酵素として、キシロースイソメラーゼ活性は、究極的にキシロースをエタノールに変換する能力を提供する上で、特に重要である。出願人らは、エタノール産生細菌、ザイモモナス(Zymomonas)中で発現された際に、典型的に使用される大腸菌(E.coli)XIと比較して、より高い活性を有して改善されたキシロース利用およびエタノール産生を支援する、キシロースイソメラーゼを同定した。
I群に属するあらゆるXIを検討中の株で使用して、キシロース利用を改善してもよい。I群XIは、それらの長さによってII群XIから区別される。I群XIは長さが典型的に約380〜390個のアミノ酸であるのに対し、II群XIは長さが典型的に約440〜460個のアミノ酸であることが分かった。I群XI中では少なくとも約50%のアミノ酸同一性があるのに対し、II群XIはI群XIと20〜30%のアミノ酸同一性のみを有する。したがってこれらの構造基準を使用して、XIはI群またはII群に属すると容易に分類され得る。
1)AA226はロイシンであり;AA277はヒスチジンである
2)AA223はメチオニンであり;AA274はロイシンである
3)AA191はイソロイシンであり;AA242はグルタミンである
4)AA195はスレオニン、セリン、またはバリンであり;AA246はアスパラギン酸である
5)AA88はメチオニン、スレオニン、またはグアニンであり;AA139はアルギニンまたはトリプトファンである
6)AA290はヒスチジンであり;AA337はアスパラギンまたはメチオニンである7)AA221はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり;AA272はアラニン、スレオニン、またはグリシンである
8)AA242はフェニルアラニン、バリン、またはロイシンであり;A293はグリシン、システイン、またはトリプトファンである
9)AA243はヒスチジンであり;AA294はセリン、アスパラギン、グリシン、またはロイシンである
10)AA193はロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニンであり;AA244はアスパラギン酸である
11)AA256はグルタミンであり;AA308はスレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン、チロシン、またはヒスチジンである
12)AA213はグリシンであり;AA264はリジン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アルギニン、またはグルタミンである
13)AA288はプロリン、チロシン、アラニン、またはセリンであり;AA335はバリンまたはグリシンである
14)AA249はグルタミンであり;AA301はアスパラギン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、セリン、またはアラニンである。
検討中の株では、Z.モビリス(Z.mobilis)やザイモバクター(Zymobacter)などのザイモモナス(Zymomonas)株または関連エタノロジェン中で、上述したようなキシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子と共に、上述のI群XIのいずれかを発現させてもよく、次にそれは下述するようにキシロースを利用できる。ザイモバクター・パルメ(Zymobacter palmae)は、ザイモモナス(Zymomonas)について下述するように、Z.モビリス(Z.mobilis)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼおよびエノラーゼプロモーターを使用して、キシロース利用のための遺伝子発現によってキシロース利用のために遺伝子改変されている、エタノール産生細菌である(Yanase et al.Applied and Environmental Microbiology(2007)73:2592−2599)。
I群XIコーディング領域を含んでなるキメラ遺伝子またはオペロンによる形質転換に加えて、検討中の株はまた、キシロースの利用に必要な3つのその他の酵素の発現のために遺伝子改変される。キシルロースをリン酸化してキシルロース5−リン酸を形成するキシルロキナーゼ;およびペントース代謝を解糖作用エントナー・ドウドロフ経路に連結してキシロースがエタノールに代謝できるようにする中間体に、キシルロース5−リン酸を変換するペントースリン酸経路の2つの酵素、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ(図1参照)。キシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株は、米国特許第5514583号明細書、米国特許第5712133号明細書、米国特許第6566107号明細書、国際公開第95/28476号パンフレット、Feldmann et al.((1992)Appl Microbiol Biotechnol 38:354−361)、Zhang et al.((1995)Science 267:240−243に記載される。これらの株は、II群キシロースイソメラーゼをはじめとする大腸菌(E.coli)遺伝子からのコード配列によって形質転換された。
I群キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子、およびキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼ発現のための遺伝子またはオペロンを有する遺伝子改変キシロース利用株を発酵で使用して、株の天然生成物を生産し、または株がそれを産生するように遺伝子改変されている生成物を生産してもよい。例えばザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)およびザイモバクター・パルメ(Zymobacter palmae)は、天然のエタノロジェンである。一例として、発明のZ.モビリス(Z.mobilis)株によるエタノールの生産が記載される。
略語の意味は次の通り。「kb」はキロベースを意味し、「bp」は塩基対を意味し、「nt」はヌクレオチドを意味し、「hr」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「L」はリットルを意味し、「ml」または「mL」はミリリットルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「μM」はマイクロモル濃度を意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「μmol」はマイクロモルを意味し、「pmol」はピコモルを意味し、「Cm」はクロラムフェニコールを意味し、「Cmr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Cms」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Spr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Sps」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「XI」はキシロースイソメラーゼであり、「XK」はキシルロキナーゼであり、「TAL」はトランスアルドラーゼであり、「TKT」はトランスケトラーゼであり、「RM」は10g/Lの酵母抽出物プラス2g/LのKH2PO4を含有する富栄養培地を意味し、「MM」は10g/Lの酵母抽出物、5g/Lのトリプトン、2.5g/Lの(NH4)2SO4、および0.2g/LのKH2PO4を含有する交配培地を意味する。
キメラキシロースイソメラーゼ遺伝子の構築および二重交叉自殺ベクターのアセンブリー ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)への組み込みおよび発現のために、アクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)(AMxylA)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(LBxylA)、および大腸菌(Escherichia coli)(ECxylA)からのキシロースイソメラーゼのコード領域のコンストラクトを作成した。コード配列は、GenScriptCorporation(Piscataway,NJ)によって、Z.モビリス(Z.mobilis)ZM4のコドンバイアスに従ってZ.モビリス(Z.mobilis)中の発現のために最適され、合成された。それぞれEcoRV部位でpUC57にクローンされ、プラスミドpUC57−AMxylA(コドン最適化AMxylAコーディング領域:配列番号308)、pUC57−LBxylA(コドン最適化LBxylAコーディング領域:配列番号309)、およびpUC57−ECxylA(コドン最適化ECxylAコーディング領域:配列番号310)として提供された。最適化xylAコード配列は、天然キシロースイソメラーゼ(XI)をコードする。
キメラAMxylA、LBxylA、およびECxylA遺伝子のザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)ZW641株への組み込み
ZW641株を使用して、キシロース利用ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)中における、A.ミズーリエンシス(A.missouriensis)、L.ブレビス(L.brevis)または大腸菌(E.coli)XIの発現の効果をアッセイした。ZW641株の調製は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第7,741,119号明細書の実施例1に記載される。その中に記載されるX13L3株は、後にZW641と改称された。ZW641は、クロラムフェニコール耐性選択可能マーカーと共に、2つのオペロンPgapxylABおよびPgaptaltktをザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)をZW1(ATCC#31821)ゲノムに逐次組み込むことで、調製された。キシロース含有培地中で成長させることで、形質転換体をキシロース利用にさらに適応させた。
ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)ZW641株中のAMxylA、LBxylA、およびECxylA発現の特性解析
ZW641は、低レベルで発現される天然大腸菌(E.coli)xylAコーディング領域のコピーを有する。ZW641株−ara355、ZW641−ara356、およびZW641−ara357は、コドン最適化xylAコーディング領域、すなわちAMxylA、LBxylA、およびECxylAの追加的コピーをそれぞれ含有する。株について、キシロース中におけるキシロース利用、エタノール産生、および成長の改善をアッセイした。
キシロースイソメラーゼ酵素の構造的解析
キシロースイソメラーゼ(XI)活性を有することが知られているシード配列セットを最初に同定することで、潜在的キシロースイソメラーゼである、利用できるタンパク質配列のコレクションを作成した。シード配列は、高信頼度機能注解を有するタンパク質配列を含有する、SWISSPROTデータベースからのキシロースイソメラーゼとして取得した。SWISSPROT(Swiss Institute of Bioinformatics)から取得された180個のXIシード配列、配列番号2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137、142、および148〜306があった。次に、BLASTのblastallラッパー中の1群の複数クエリー配列として、これらのシード配列を使用してNCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda,MD)非重複性(nr)包括的タンパク質データベースを検索した。合計444配列が、XI活性タンパク質の配列空間として記載し得るセットを形成すると同定された。
444個のXI配列から出発する:
ステップ1 70%同一性群を確立する:
444個の配列からの最長配列を第1のマスターと称した。第1のマスターと70%以上の配列同一性を有する444個の配列のその他の配列をグループ分けして、第1のref70クラスター(A)を形成した。残りの配列から、最長配列を第2のマスターに指定して使用し、同様に第2のref70クラスターを作り出した(B)。全ての配列がクラスターに入るまで、分類過程を継続した。クラスターのいくつかは、単集合であった。
クラスターAとBの全ての対で、Aの配列の3分の1が70%以上の配列同一性でBの配列に関連している場合、そして逆の場合も、クラスターAとBをマージさせた。70%の一致度の閾値を使用してマージし得る対がなくなるまで、この過程を継続した。
ステップ2と同一過程に従ったが、50%の配列一致度の閾値を使用した。
ステップ2と同一過程に従ったが、30%の配列一致度の閾値を使用した。
方法1
GroupSim分析(Capra and Singh(2008)Bioinformatics 24:1473−1480)によって、I群メンバーとII群メンバーの区別を実施した。GroupSim法は、タンパク質の機能的特異性を決定するアミノ酸残基を同定する。その配列が複数群に分けられる、タンパク質ファミリーの複数配列アラインメント(MSA)において、配列の官能基を区別するアミノ酸残基を同定し得る。方法は、複数配列アラインメント(MSA)を採用し、公知の特異性分類を入力して、MSA中の各アミノ酸位置にスコアを割り当てる。より高いスコアは、アミノ酸位置が特異性決定位置(SDP)であるより大きな可能性を示唆する。
方法2
酵素のキシロースイソメラーゼファミリー群の代案の構造/機能特性解析は、HMMER(Janelia Farm Research Campus,Ashburn,VA)から入手できる利用者用ガイドに従って、HMMERソフトウェアパッケージを使用して実施された(プロファイルHMMの背後にある理論は、R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh,and G.Mitchison,Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids,Cambridge University Press,1998;Krogh et al.,1994;J.Mol.Biol.235:1501−1531に記載される)。
ステップ1.配列アラインメントを構築する
Clustal Wをデフォルトパラメータで使用して、I群中の21個のシード配列(高信頼度注釈がある配列)を配列比較した。
ステップ2.プロファイルHMMを構築する
整合配列セット上で、デフォルトパラメータを使用してhmmbuildプログラムを実行した。hmmbuildは複数配列アラインメントファイルを読み取って、新しいプロファイルHMMを構築し、プロファイルHMMをファイルに保存する。このプログラムを使用して、上述のシード配列セットのために、多重アラインメントから未較正プロファイルを作成した。
プロファイル(使用される合成配列のデフォルト数は5,000である)を有する多数の合成ランダム配列をスコアするhmmcalibrateを使用して、プロファイルHMMを読み取り、これらのスコアに対するヒストグラムに極値分布(EVD)を適合させ、この時点でEVDパラメータを含むHMMファイルを再度保存する。タンパク質配列データベースに対してプロファイルを検索する際に、これらのEVDパラメータ(μおよびλ)を使用して、ビットスコアのE値が計算される。hmmcalibrateは、HMMファイル中の「EVD」と標識された行に、2つのパラメータを書き出す。これらのパラメータは、SWISS−PROTとほぼ同じ長さおよび残基組成の無作為に生成された配列に対して計算されたスコアのヒストグラムに最も適合する、極値分布(EVD)のμ(位置)およびλ(尺度)パラメータである。この較正を各プロファイルHMMに対して1回行った。
Zパラメータを10億に設定したhmmsearchを使用して、II群からI群メンバーを識別する能力について、I群プロファイルHMMを評価した。hmmsearchプログラムは、I群プロファイルHMMのためのhmmファイル、および双方の群からの全配列を取って、各配列にE値スコアを割り当てる。このE値スコアはプロファイルHMMの適合の尺度であり、スコアが低いほどより良く適合する。得られたスコア割り当て一覧は、添付中で表2として提供される。最悪得点のI群メンバー(2.2e−181)と最良得点のII群メンバー(1.5e−07)の間に、E値の差違の大きなマージンがあったので、プロファイルHMMはII群メンバーからI群メンバーを明らかに区別する。
1群XIのキメラPgapS−xylA遺伝子の構築および二重交叉自殺ベクターのアセンブリー
ゲオデルマトフィルス・オブスクルス(Geodermatophilus obscurus)DSM43160(GOxylA;配列番号64)、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)str.MC2155(MSxylA;配列番号10)、サリニスポラ・アレニコーラ(Salinispora arenicola)CNS−205(SAxylA;配列番号18)、およびキシラニモナス・セルシリティカ(Xylanimonas cellulosilytica)DSM15894(XCxylA;配列番号40)からのキシロースイソメラーゼは全て、実施例4に記載されるアミノ酸配列分析に基づいて、1群キシロースイソメラーゼに属する。これらのタンパク質をコードする配列(それぞれ配列番号335、336、337、および338)は、GenScript Corporation(Piscataway,NJ)によって、Z.モビリス(Z.mobilis)ZM4のコドンバイアスに従って、Z.モビリス(Z.mobilis)中での発現のためにそれぞれ最適化され、SpeIおよびXhoI部位と境を接するDNA断片として新規に合成されて、コーディング領域は変異Z.モビリス(Z.mobilis)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(PgapS;配列番号339)に隣接する。PgapSは、米国特許出願公開第2009−0246876号明細書で開示されるように、プロモーターからの発現を増大させる、天然プロモーター断片(Pgap)の位置116における「G」から「T」への変化の突然変異がある、改善されたPgapである。SpeI−PgapS−xylA−XhoI断片は、GenScript Corporation(Piscataway,NJ)によってEcoRV部位でpUC57にクローンされた。得られた中間体プラスミドは、pUC57−PgapSGOxylA、pUC57−PgapSMSxylA、pUC57−PgapSSAxylA、およびpUC57−PgapSXCxylAと称された。最適化xylAコード配列は、GOxylA(配列番号335)、MSxylA(配列番号336)、SAxylA(配列番号337)、およびXCxylA(配列番号338)である。
ZW641へのキメラPgapS−xylA遺伝子の組み込みおよびそれらの発現の特性解析
本実施例は、実施例2に記載されるZW641株中のPgapS−xylAキメラ遺伝子の組み込みおよび発現について記載し、4つの試験されたI群XIが、Z.モビリス(Z.mobilis)中でII群XIよりも実際により良く機能することを実証する。
Claims (15)
- キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含んでなる、ザイモモナス(Zymomonas)およびザイモバクター(Zymobacter)からなる群から選択される組換え細菌株であって、前記ポリペプチドがI群キシロースイソメラーゼでありEC5.3.1.5によって同定される酵素クラスに含まれ、前記株が炭素源としてキシロースを利用する組換え細菌株。
- 配列番号2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137、および142を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが1E−15以下のE値スコアを与え;前記クエリーがZパラメータを10億に設定したhmmsearchアルゴリズムを使用して実施される、請求項1に記載の組換え細菌株。
- キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、
1)配列番号66の参照アミノ酸配列と比較して、以下
a)位置226のロイシン、
b)位置223のメチオニン、
c)位置191のイソロイシン、
d)位置195のスレオニン、セリン、またはバリン、
e)位置88のメチオニン、スレオニンまたはグアニン、
f)位置290のヒスチジン、
g)位置221のグルタミン酸またはアスパラギン酸、
h)位置242のフェニルアラニン、バリン、またはロイシン、
i)位置243のヒスチジン、
j)位置193のロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニン、
k)位置256のグルタミン、
l)位置213のグリシン、
m)位置288のプロリン、チロシン、アラニン、またはセリン、および
n)位置249のグルタミン
の保存されたアミノ酸を有するか、または
2)パート(1)の保存されたアミノ酸の少なくとも90%を有する、請求項1に記載の組換え細菌株。 - 前記キシロースイソメラーゼが、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用した、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、および147からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組換え細菌株。
- 前記キシロースイソメラーゼが、アクチノプラーネス(Actinoplanes)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ストレプトミセス(Streptomyces)、サーマス(Thermus)、サーモバキュラム(Thermobaculum)、ヘルペトシフォン(Herpetosiphon)、アシドバクテリア(Acidobacteria)、ロゼイフレクサス(Roseiflexus)、メイオサーマス(Meiothermus)、デイノコッカス(Deinococcus)、メイオサーマス(Meiothermus)、スタッケブランドチア(Stackebrandtia)、クリベラ(Kribbella)、キシラニモナス(Xylanimonas)、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)、カテヌリスポラ(Catenulispora)、ストレプトスポランギウム(Streptosporangium)、ゲオデルマトフィルス(Geodermatophilus)、アクチノシネマ(Actinosynnema)、サッカロモノスポラ(Saccharomonospora)、アシドサーマス(Acidothermus)、サーモビフィダ(Thermobifida)、ノカルジオイデス(Nocardioides)、ジャニバクター(Janibacter)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、レイフソニア(Leifsonia)、クラビバクター(Clavibacter)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)、サリニスポラ(Salinispora)、セルロモナス(Cellulomonas)、ジョネシア(Jonesia)、ナカムレラ(Nakamurella)、アクチノミセス(Actinomyces)、モビルンカス(Mobiluncus)、ブラキバクテリウム(Brachybacterium)、ボイテンベルギア(Beutenbergia)、フランキア(Frankia)、およびアクチノバクテリウム(Actinobacterium)からなる群から選択される微生物から単離される、請求項1に記載の組換え細菌株。
- 前記キシロースイソメラーゼがアクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)から単離される、請求項5に記載の組換え細菌株。
- 前記キシロースイソメラーゼ活性を有するI群ポリペプチドが、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1、およびGonnet250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用した、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24、66、134、140、143、145、および147からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項4に記載の組換え細菌株。
- a)キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、および場合によりI群に属さないキシロースイソメラーゼを含んでなる、ザイモモナス(Zymomonas)およびザイモバクター(Zymobacter)からなる群から選択される、組換え細菌株を提供するステップと;
b)I群キシロースイソメラーゼでありキシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップを含んでなり;
I群に属さないキシロースイソメラーゼを含有する同一株と比較してキシロース利用が改善される、組換え細菌細胞中でキシロース利用を改善する方法。 - 配列番号2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137、および142を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、前記キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが1E−15以下のE値スコアを与え;前記クエリーがZパラメータを10億に設定したhmmsearchアルゴリズムを使用して実施される、請求項8に記載の方法。
- 前記キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、
1)配列番号66の参照アミノ酸配列と比較して、以下
a)位置226のロイシン、
b)位置223のメチオニン、
c)位置191のイソロイシン、
d)位置195のスレオニン、セリン、またはバリン、
e)位置88のメチオニン、スレオニンまたはグアニン、
f)位置290のヒスチジン、
g)位置221のグルタミン酸またはアスパラギン酸、
h)位置242のフェニルアラニン、バリン、またはロイシン、
i)位置243のヒスチジン、
j)位置193のロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニン、
k)位置256のグルタミン、
l)位置213のグリシン、
m)位置288のプロリン、チロシン、アラニン、またはセリン、および
n)位置249のグルタミン
の保存されたアミノ酸を有するか、または
2)パート(1)の保存されたアミノ酸の少なくとも90%を有する、請求項8に記載の方法。 - a)請求項1に記載の組換え細菌株を提供するステップと;
b)それによって株がエタノールを産生する条件下で、(a)の株をキシロースと接触させるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法。 - 配列番号2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137、および142を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、1E−15以下のE値スコアを与え;前記クエリーがZパラメータを10億に設定したhmmsearchアルゴリズムを使用して実施される、請求項11に記載の方法。
- 前記キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、
1)配列番号66の参照アミノ酸配列と比較して、以下
a)位置226のロイシン、
b)位置223のメチオニン、
c)位置191のイソロイシン、
d)位置195のスレオニン、セリン、またはバリン、
e)位置88のメチオニン、スレオニンまたはグアニン、
f)位置290のヒスチジン、
g)位置221のグルタミン酸またはアスパラギン酸、
h)位置242のフェニルアラニン、バリン、またはロイシン、
i)位置243のヒスチジン、
j)位置193のロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニン、
k)位置256のグルタミン、
l)位置213のグリシン、
m)位置288のプロリン、チロシン、アラニン、またはセリン、および
n)位置249のグルタミン
の保存されたアミノ酸を有するか、または
2)パート(1)の保存されたアミノ酸の少なくとも90%を有する、請求項11に記載の方法。 - 前記キシロースイソメラーゼが、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1、およびGonnet250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用した、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、2、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、および147からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記キシロースイソメラーゼが、アクチノプラーネス(Actinoplanes)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ストレプトミセス(Streptomyces)、サーマス(Thermus)、サーモバキュラム(Thermobaculum)、ヘルペトシフォン(Herpetosiphon)、アシドバクテリア(Acidobacteria)、ロゼイフレクサス(Roseiflexus)、メイオサーマス(Meiothermus)、デイノコッカス(Deinococcus)、メイオサーマス(Meiothermus)、スタッケブランドチア(Stackebrandtia)、クリベラ(Kribbella)、キシラニモナス(Xylanimonas)、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)、カテヌリスポラ(Catenulispora)、ストレプトスポランギウム(Streptosporangium)、ゲオデルマトフィルス(Geodermatophilus)、アクチノシネマ(Actinosynnema)、サッカロモノスポラ(Saccharomonospora)、アシドサーマス(Acidothermus)、サーモビフィダ(Thermobifida)、ノカルジオイデス(Nocardioides)、ジャニバクター(Janibacter)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、レイフソニア(Leifsonia)、クラビバクター(Clavibacter)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)、サリニスポラ(Salinispora)、セルロモナス(Cellulomonas)、ジョネシア(Jonesia)、ナカムレラ(Nakamurella)、アクチノミセス(Actinomyces)、モビルンカス(Mobiluncus)、ブラキバクテリウム(Brachybacterium)、ボイテンベルギア(Beutenbergia)、フランキア(Frankia)、およびアクチノバクテリウム(Actinobacterium)からなる群から選択される微生物から単離される、請求項11に記載の方法。
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