JP2013528370A - Gene signature in HIV-1 subtype C envelope glycoprotein - Google Patents

Gene signature in HIV-1 subtype C envelope glycoprotein Download PDF

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ガオ，フェン
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Abstract

本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１に、そして特に、ＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ糖タンパク質に対する広域中和抗体を誘発する免疫原に、そして該免疫原を含む組成物に関する。本発明はさらに、被験体においてこうした抗体の産生を誘導する方法に関する。  The present invention relates generally to HIV-1, and in particular to immunogens that elicit broadly neutralizing antibodies against HIV-1 subtype C envelope glycoproteins and compositions comprising said immunogens. The invention further relates to a method of inducing production of such antibodies in a subject.

Description

本出願は、全内容が本明細書に援用される、２０１０年５月７日出願の米国仮出願第６１／３３２，２６２号に優先権を請求する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第Ａ１０６７８５４号、第Ａ１３５３５１号および第Ａ１６４５１８号のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。 This application claims priority to US Provisional Application No. 61 / 332,262, filed May 7, 2010, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
This invention was made with government support under grant numbers A1067854, A135351, and A164518 awarded by the National Institutes of Health. The US government has certain rights in this invention.

技術分野
本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１に、そして特に、ＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ糖タンパク質に対する広域中和抗体を誘発する免疫原に、該免疫原を含む組成物に、そして被験体においてこうした抗体の産生を誘導する方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates generally to HIV-1, and in particular to immunogens that induce broadly neutralizing antibodies against HIV-1 subtype C envelope glycoproteins, to compositions containing the immunogens, and to subjects. It relates to a method for inducing the production of such antibodies in the body.

広域交差反応性中和抗体（Ｎａｂ）を誘発する能力は、ＨＩＶ−１ワクチンに関する重要な目標である［１、２］。ＨＩＶ−１は、９つの遺伝的に関連する系譜（サブタイプＡ〜Ｋ）を有し、そして単一のサブタイプが流行を支配する世界の地域においてワクチンが有用であるためには、ＨＩＶワクチンにおいて、最低限、少なくとも１つのクレードが有効にターゲティングされなければならない［３］。サブタイプＣは世界中のすべてのＨＩＶ−１感染のうちおよそ５０％を占め［４］、そして南アフリカおよびインドの広い地域のＨＩＶ流行は、ほぼ完全にサブタイプＣ感染によって支配されるため、該ウイルスのサブタイプＣ変異体をターゲティングすることが可能なＮａｂは、特に有用であろう。したがって、自然感染におけるサブタイプＣ抗体反応に重点を置く必要がある。交差反応性Ｎａｂを生成する試みは限られた成功しか収めてきておらず、そして新規アプローチが緊急に必要とされる［１、５］。ヒトモノクローナルＡｂ［６、７、８、９、１０］のサブセットおよびＨＩＶ−１感染個体由来の血清サンプル［１１、１２、１３、１４、１５、１６］で見られる強力な交差反応性中和活性は、免疫原設計の改善が可能でありうる証拠である。   The ability to elicit broadly cross-reactive neutralizing antibodies (Nab) is an important goal for HIV-1 vaccines [1,2]. HIV-1 has nine genetically related lineages (subtypes AK), and in order for the vaccine to be useful in regions of the world where a single subtype dominates the epidemic, the HIV vaccine In at least, at least one clade must be effectively targeted [3]. Subtype C accounts for approximately 50% of all HIV-1 infections worldwide [4], and the widespread HIV epidemic in South Africa and India is almost entirely dominated by subtype C infection, Nabs capable of targeting viral subtype C variants would be particularly useful. Therefore, it is necessary to focus on the subtype C antibody response in natural infection. Attempts to generate cross-reactive Nabs have had limited success and new approaches are urgently needed [1, 5]. Strong cross-reactive neutralizing activity found in a subset of human monoclonal Abs [6, 7, 8, 9, 10] and serum samples from HIV-1 infected individuals [11, 12, 13, 14, 15, 16] Is evidence that an improved immunogen design may be possible.

こうした改善をどのように行うかに関する洞察は、ＨＩＶ−１陽性血清サンプルにおける自己および異種Ｎａｂを研究することによって探し求められている。最近の結果によって、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位中およびその周囲のエピトープが、広域中和ＨＩＶ−１陽性血清の重要なターゲットを含み、そして実質的な役割を果たす他の重要なターゲットがなお同定されないままであることが示されている［１３、１４、１５］。自己ウイルス中和の研究によって、ｇｐ１２０の多数の領域、最も顕著にはＶ１／Ｖ２中のエピトープ［１７］ならびにＣ３およびＶ４間の相互作用を必要とするエピトープ［１７、１８、１９、２０］を、反応がターゲティングすることが示されてきている。最近の研究によって、ウイルスのマルチサブタイプパネルの中和感受性に関連する、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の１９のアミノ酸シグネチャーが同定された［２１］。Ｗａｌｋｅｒらは、最近、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖのコンホメーション決定因子に結合し、そして試験したウイルスの約３分の２を広域中和する２つのｍＡｂを発見した［２２］。   Insights on how to make such improvements are sought by studying autologous and heterologous Nabs in HIV-1 positive serum samples. Recent results indicate that epitopes in and around the CD4 binding site of gp120 contain important targets of broadly neutralizing HIV-1 positive sera and other important targets that play a substantial role have not yet been identified [13, 14, 15]. Autologous virus neutralization studies have identified multiple regions of gp120, most notably epitopes in V1 / V2 [17] and epitopes that require an interaction between C3 and V4 [17, 18, 19, 20]. The reaction has been shown to be targeted. Recent studies have identified 19 amino acid signatures of gp120 and gp41 that are associated with the neutralization sensitivity of a multi-subtype panel of viruses [21]. Walker et al. Recently discovered two mAbs that bind to the conformational determinants of HIV-1 Env and globally neutralize about two-thirds of the tested viruses [22].

ＨＩＶ−１感染における自己および異種Ｎａｂ反応の先の研究は、中和感受性を特徴付けるために、各個体から１つまたは限定された数の代表的なｅｎｖ遺伝子しか利用しなかった［２３、２４、２５、２６］。ｅｎｖは、慢性ＨＩＶ−１感染（ＣＨＩ）において非常に可変性であるため、そしてわずかな配列変化もエンベロープ糖タンパク質の生物学的機能および抗原性に影響を及ぼしうるため［２７、２８、２９、３０、３１、３２］、各感染個体由来の単一のｅｎｖ遺伝子の研究は、ｉｎ ｖｉｖｏのウイルス集団の最小限の代表しか提供しない。したがって、これらの状況下では、研究設計に応じて、中和エピトープに関する重要な情報が失われる可能性がある。   Previous studies of autologous and heterologous Nab responses in HIV-1 infection utilized only one or a limited number of representative env genes from each individual to characterize neutralization sensitivity [23, 24, 25, 26]. Since env is very variable in chronic HIV-1 infection (CHI) and because slight sequence changes can affect the biological function and antigenicity of envelope glycoproteins [27, 28, 29, 30, 31, 32], studies of a single env gene from each infected individual provides only a minimal representation of the in vivo viral population. Thus, under these circumstances, depending on the study design, important information about neutralizing epitopes can be lost.

以前の研究の別の制約は、大部分が、単一ゲノム増幅（ＳＧＡ）ではなく、Ｅｎｖクローニングのため伝統的なバルクＰＣＲ方法論に頼っていたことである［２３、２４、２５、２６、３３］。バルクＰＣＲによって得られる擬似種集団由来のウイルス配列は、人工的な組換えおよび再サンプリング、ならびに低忠実度Ｔａｑポリメラーゼによるヌクレオシド誤取り込みを生じうる［３４、３５、３６］。ＳＧＡ方法論は、感染個体由来の真実のウイルスゲノムを得ることを可能にする［３３、３６、３７、３８］。ＳＧＡによって得られるウイルス配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するものをより正確に反映するため［３７］、ＳＧＡを用いると、ウイルス遺伝子機能をよりよく特徴付けることも可能である。   Another limitation of previous work was that most relied on traditional bulk PCR methodologies for Env cloning rather than single genome amplification (SGA) [23, 24, 25, 26, 33]. ]. Viral sequences derived from a pseudo-species population obtained by bulk PCR can result in artificial recombination and resampling, as well as nucleoside misincorporation by low fidelity Taq polymerase [34, 35, 36]. The SGA methodology makes it possible to obtain a true viral genome from an infected individual [33, 36, 37, 38]. Since the viral sequences obtained by SGA more accurately reflect those present in vivo [37], it is also possible to better characterize viral gene function using SGA.

本研究は、広域Ｎａｂ反応に関連するクレードＣウイルス配列において明らかな共通の中和シグネチャーが存在するかどうかという疑問を探究するため、ハイスループット形式で、機能するＥｎｖを発現させる、ＳＧＡおよび新規プロモーターＰＣＲ法の使用［３８］から、少なくとも部分的に生じる。３７人のＨＩＶ−１感染個体各々から多数のｅｎｖ遺伝子を得て、そして感染性ならびに自己および異種血漿サンプルによる中和に対する感受性に関して特徴付けた。サブタイプＣ ＨＩＶ−１感染個体における強力なＮａｂ反応に関連するシグネチャー配列が、ｇｐ１２０の第四可変領域（Ｖ４）近くに見出された。   The present study explores the question of whether there is a clear common neutralization signature in the clade C virus sequence associated with the broad spectrum Nab reaction, in order to express a functional Env in a high-throughput format and a novel promoter At least partly arises from the use of the PCR method [38]. A number of env genes were obtained from each of 37 HIV-1 infected individuals and characterized for infectivity and susceptibility to neutralization by autologous and heterologous plasma samples. A signature sequence associated with a strong Nab response in subtype C HIV-1 infected individuals was found near the fourth variable region (V4) of gp120.

一般的に、本発明は、ＨＩＶ−１に関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１サブタイプＣエンベロープ糖タンパク質に対する広域中和抗体を誘発する免疫原に、そして該免疫原を含む組成物に関する。本発明はさらに、被験体において広域中和抗体の産生を誘導する方法に関する。   In general, the present invention relates to HIV-1. More specifically, the present invention relates to an immunogen that elicits broadly neutralizing antibodies against HIV-1 subtype C envelope glycoprotein and to a composition comprising said immunogen. The invention further relates to a method for inducing production of broadly neutralizing antibodies in a subject.

本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。   Objects and advantages of the present invention will be apparent from the description that follows.

本特許出願ファイルは、カラーで作成した図を少なくとも１つ含有する。カラー図（単数または複数）を含む本特許出願公報のコピーは、要望し、そして必要な料金を支払うと、庁（Ｏｆｆｉｃｅ）によって提供されるであろう。
新規に特徴付けられた全長ｅｎｖ遺伝子配列の系統樹分析。近隣結合法［５４］および木村２パラメータモデル［５５］を用い、全長ｅｎｖ遺伝子配列で、無根系統樹を構築した。２つの系譜を持つウイルスを下線で示し；単系統のｅｎｖ配列を標準文字で示す。枝の長さを一定の縮尺で描く（スケールバーは、部位あたり０．０２ヌクレオチド置換を示す）。 クローン増殖ｅｎｖ遺伝子配列の系統樹分析。近隣結合法および木村２パラメータモデルを用い、クローン増殖ウイルスを宿する各個体由来のすべてのｅｎｖ配列で、中点根（ｍｉｄｐｏｉｎｔ−ｒｏｏｔｅｄ）系統樹を構築した。水平方向の枝の長さを一定の縮尺で描き（スケールバーは、部位あたり０．００５ヌクレオチド置換を示す）；垂直方向の分離は明確にするためのみである。アスタリスクはブートストラップ値を示し、ここで右に向かうクラスターは、反復実験の８５％またはそれより多く（１，０００のうち）で支持されている。同一性または近同一性パターンを、末端の葉の黒点で示す。 Ｅｎｖ偽ウイルスの感染性。３７人の個体由来の４７４の偽ウイルスの感染性をＴＺＭ−ｂｌ細胞において決定した。ルシフェラーゼ活性ＲＬＵ値がＳＧ３Δｅｎｖ主鎖対照由来のものより１０倍大きかった場合、ｅｎｖ遺伝子を陽性と見なした。点線はこのカットオフを示す。 組換えｅｎｖ遺伝子を用いて生成された偽ウイルスの感染性。 Ｅｎｖ偽ウイルスのウイルス負荷および感染性の間の相関。各ＨＩＶ−１感染個体由来の多数のＥｎｖ偽ウイルスの平均ルシフェラーゼ活性の幾何平均をプロットし、そしてケンドールのタウ順位相関係数法によって分析した。 トランスフェクション細胞におけるＨＩＶ−１タンパク質発現のウェスタンブロット分析。ｐＰＣＲ産物およびｐＳＧ３Δｅｎｖでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション４８時間後に溶解した。ウイルスタンパク質を４〜１２％勾配還元ゲル上で分離し、ニトロセルロースにトランスファーし、そしてＨＩＶ−１陽性血清およびＥｎｖタンパク質に対するマウスｍＡｂ １３Ｄ５と反応させた。ＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外画像化系を用いて、二次抗体、ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化ヤギ抗ヒトおよびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ６８０ヤギ抗マウスで、ウイルスタンパク質を視覚化した。Ｅｎｖタンパク質（ｇｐ１２０およびｇｐ４１）の量をＥｎｖ（ｇｐ１６０＋ｇｐ１２０）：Ｐ２４比として表す。各Ｅｎｖ偽ウイルスの感染性を相対光単位（ＲＬＵ）として示す。アスタリスクは、成熟前の停止コドンまたは非インフレーム欠失によるより小さいＥｎｖを示す。 ｅｎｖ配列の最尤系統樹。分析のため、１５人のＨＩＶ−１感染個体由来のすべてのＳＧＡ ｅｎｖ配列を含んだ。中和アッセイに用いたものは、系統樹の枝先端の着色した印で示した。サンプル中の多様性の代表であるようにエンベロープを選択した。低多様性（単系統）サンプル由来の配列を黒で示し；２つの特徴的な系統樹クラスターを持つサンプル由来の配列は、一方のクラスター由来のものが赤であり、そしてもう一方由来のものが青であり；そして２つのクラスター間の組換え体に相当する配列が紫であるように着色した。 自己および異種血漿を用いたＥｎｖ偽ウイルスの中和分析。ＴＺＭ−ｂｌ細胞における単回感染アッセイにおいて、自己および異種血漿に対する感受性に関して、１５人の患者由来の６０のＥｎｖ偽ウイルスを分析した。精製ＨＩＶＩｇおよび両種性ネズミ白血病Ｅｎｖ偽ウイルス（ＭＬＶ−ＳＶＡ）を、それぞれ、陽性対照および非特異的中和対照として含めた。同時期血漿での自己中和を黒いボックスによって示す。各細胞における値は、血漿不含対照に比較して、ウイルス複製が５０％減少した血漿希釈である。力価＜２０には１０の値を割り当てた。赤：＞１，０００；橙：５００〜１０００；緑：１００〜４９９；黄：２０〜９９；白：＜２０（１０として示す）またはｎｔ（未試験）。 中和力価に基づく、ウイルスおよび血清の階層的クラスター化。中和能にしたがって血清をクラスター化する。対角に沿って、黒いボックス中に自己反応を示す。多様性にしたがって、ｅｎｖ ＳＧＡ番号を色づけする：低多様性（黒）、２つの別個の群（赤および青）、および組換え体（紫）。視覚化を容易にするため、階層的クラスター化ではなく、個体にしたがって列（Ｅｎｖ偽ウイルス）を配置し、Ｅｎｖ偽ウイルスの階層的クラスター化パターンを図の右側にデンドログラムとして示すように、ヒートマップを構築する。高いおよび低い中和血漿のクラスター化は統計的に支持され、下平によって開発された、近似的に不偏なマルチステップ・マルチスケール・ブートストラップ再サンプリング法［４３］を用いると、特徴的な低中和クラスターはロバストであり、確率は０．９６であった。このグループ分けを例示するため、図の上部に示すクラスター化階層に基づいて、偽ウイルスに対するありうる反応にしたがって、段を示す。低（Ｌ）または高（Ｈ）ＮＡｂ力価を持つ血漿セットをグループ分けした。右のクラスター化パターンは、９５またはそれより大きい有意な不偏マルチステップ・マルチスケール・ブートストラップ再サンプリング値に相当する。クラスター化階層に基づく偽ウイルスに対するありうる反応にしたがって、段を示す。低（Ｌ）または高（Ｈ）ＮＡｂ力価を持つ血漿セットをグループ分けし、そして各個体由来のコンセンサス・エンベロープ配列を分類し、そして続いて個体の抗体反応の中和強度を予測しうるシグネチャー部位に関して検索した。 血漿中の高レベルの中和活性と関連するシグネチャーアミノ酸配列。Ｈは、異種ウイルスに対する高中和活性を持つ血漿サンプル群における配列に相当し、一方、Ｌは弱い中和活性を示す配列に相当する。数値を用いて、ＨＸＢ２参照株における対応する位置を示す。ダッシュ記号は、参照配列中に存在するのと同一のアミノ酸を示す。整列を維持するためのギャップを指定するのにピリオドを用いる。強力な中和に関連するシグネチャー部位を赤で示す。重要な位での非シグネチャーアミノ酸を青で示す。 シグネチャーアミノ酸を含む連結ｇｐ１２０の結晶構造。図は、連結した（ｌｉｇａｎｄｅｄ）ｇｐ１２０（ＰＤＢ：２Ｂ４Ｃ）［５６］の結晶構造上の３つのシグネチャー部位、３９３（橙）、３９７（赤紫）および４１３（赤）を示す。明確にするため、Ｖ４ループおよびアルファ−２らせんを異なる色で示す。Ｖ４上のこれらのシグネチャー部位と有意な接触を示すＣ３の位もまた、シグネチャー部位と同じ色で示す。 低いおよび高い異種中和血漿サンプル間の自己中和活性の比較。低異種中和血漿（６）または高異種中和血漿（９）由来のＮａｂ力価を比較した。Ｙ軸の値は、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）がウイルス対照ウェルに比較して５０％減少した血漿希釈逆数である。 The patent application file contains at least one drawing created in color. Copies of this patent application publication with color chart (s) will be provided by the Office upon request and payment of the necessary fee.
Phylogenetic analysis of the newly characterized full-length env gene sequence. Using the neighborhood joining method [54] and the Kimura two-parameter model [55], a rootless phylogenetic tree was constructed with the full length env gene sequence. Viruses with two lineages are underlined; single line env sequences are shown in standard letters. The length of the branches is drawn to scale (scale bars indicate 0.02 nucleotide substitutions per site). Phylogenetic analysis of clonal propagation env gene sequences. A midpoint-rooted phylogenetic tree was constructed with all env sequences from each individual harboring the clonal propagation virus using the neighbor-joining method and the Kimura two-parameter model. Draw horizontal branch lengths to scale (scale bar indicates 0.005 nucleotide substitutions per site); vertical separation is for clarity only. The asterisk indicates the bootstrap value, where the cluster pointing to the right is supported by 85% or more (out of 1,000) of the replicates. Identity or near-identity patterns are indicated by black spots on the terminal leaves. Infectivity of Env pseudovirus. Infectivity of 474 pseudoviruses from 37 individuals was determined in TZM-bl cells. If the luciferase activity RLU value was 10 times greater than that from the SG3Δenv backbone control, the env gene was considered positive. The dotted line indicates this cutoff. Infectivity of pseudoviruses generated using the recombinant env gene. Correlation between viral load and infectivity of Env pseudovirus. The geometric mean of the average luciferase activity of multiple Env pseudoviruses from each HIV-1 infected individual was plotted and analyzed by Kendall's tau rank correlation coefficient method. Western blot analysis of HIV-1 protein expression in transfected cells. 293T cells transfected with pPCR product and pSG3Δenv were lysed 48 hours after transfection. Viral proteins were separated on a 4-12% gradient reducing gel, transferred to nitrocellulose, and reacted with mouse mAb 13D5 against HIV-1 positive serum and Env protein. Viral proteins were visualized with secondary antibodies, IRDye800 conjugated goat anti-human and Alexa-Fluor 680 goat anti-mouse using the LiCor Odyssey infrared imaging system. The amount of Env protein (gp120 and gp41) is expressed as the Env (gp160 + gp120): P24 ratio. The infectivity of each Env pseudovirus is shown as relative light units (RLU). The asterisk indicates a smaller Env due to a stop codon before maturation or a non-in-frame deletion. Maximum likelihood phylogenetic tree of env sequence. For analysis, all SGA env sequences from 15 HIV-1 infected individuals were included. The one used for the neutralization assay is indicated by a colored mark on the branch tip of the phylogenetic tree. The envelope was chosen to be representative of the diversity in the sample. Sequences from low diversity (single line) samples are shown in black; sequences from samples with two characteristic phylogenetic tree clusters are red in one cluster and from the other Blue; and colored so that the sequence corresponding to the recombinant between the two clusters is purple. Neutralization analysis of Env pseudovirus using autologous and heterologous plasma. Sixty Env pseudoviruses from 15 patients were analyzed for susceptibility to autologous and heterologous plasma in a single infection assay in TZM-bl cells. Purified HIV Ig and amphotropic murine leukemia Env pseudovirus (MLV-SVA) were included as positive and non-specific neutralization controls, respectively. Self-neutralization in plasma at the same time is indicated by a black box. The value in each cell is the plasma dilution with a 50% reduction in viral replication compared to the plasma free control. A value of 10 was assigned to titers <20. Red:>1,000; orange: 500-1000; green: 100-499; yellow: 20-99; white: <20 (shown as 10) or nt (untested). Hierarchical clustering of viruses and sera based on neutralization titers. Serum is clustered according to neutralizing capacity. Along the diagonal, self-reaction is shown in a black box. Color env SGA numbers according to diversity: low diversity (black), two distinct groups (red and blue), and recombinant (purple). To facilitate visualization, arrange the columns (Env pseudoviruses) according to the individual rather than hierarchical clustering, and the hierarchical clustering pattern of Env pseudoviruses is shown as a dendrogram on the right side of the figure. Build a map. Clustering of high and low neutralized plasma is statistically supported, and using the approximately unbiased multi-step multi-scale bootstrap resampling method developed by Shimohira [43] The sum cluster was robust with a probability of 0.96. To illustrate this grouping, the stages are shown according to possible responses to pseudoviruses based on the clustering hierarchy shown at the top of the figure. Plasma sets with low (L) or high (H) NAb titers were grouped. The right clustering pattern corresponds to a significant unbiased multi-step multi-scale bootstrap resampling value of 95 or greater. The stages are shown according to possible responses to pseudoviruses based on the clustering hierarchy. Signatures that can group plasma sets with low (L) or high (H) NAb titers and classify consensus envelope sequences from each individual and subsequently predict the neutralizing intensity of an individual's antibody response The site was searched. Signature amino acid sequence associated with high levels of neutralizing activity in plasma. H corresponds to a sequence in a plasma sample group having high neutralizing activity against a heterologous virus, while L corresponds to a sequence exhibiting weak neutralizing activity. Numerical values are used to indicate corresponding positions in the HXB2 reference strain. The dash symbol indicates the same amino acid as present in the reference sequence. Use a period to specify a gap to maintain alignment. Signature sites associated with strong neutralization are shown in red. Nonsignature amino acids at key positions are shown in blue. Crystal structure of linked gp120 containing signature amino acids. The figure shows three signature sites, 393 (orange), 397 (red purple) and 413 (red) on the crystal structure of ligated gp120 (PDB: 2B4C) [56]. For clarity, the V4 loop and alpha-2 helix are shown in different colors. C3 positions that show significant contact with these signature sites on V4 are also shown in the same color as the signature sites. Comparison of autoneutralization activity between low and high heterogeneous neutralized plasma samples. Nab titers from low heterogeneous neutralized plasma (6) or high heterogeneous neutralized plasma (9) were compared. The Y-axis value is the reciprocal plasma dilution in which luciferase activity (RLU) is reduced by 50% compared to virus control wells.

ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）の分子および抗原性構造の知識が増加することによって、ワクチン設計に関する重要な新たな洞察が得られてきているが、この情報を広域中和抗体を誘発する免疫原に関する情報に変換するのは困難であった。本発明は、少なくとも部分的に、広域Ｎａｂ反応に関連するクレードＣウイルス配列において明らかな共通の中和シグネチャーが存在するかどうかという疑問を探究するため、ハイスループット形式で、機能するＥｎｖを発現させる、ＳＧＡおよび新規プロモーターＰＣＲ法の使用［３８］に基づく。以下の実施例に記載するように、３４人の慢性感染個体由来のＨＩＶ−１クレードＣ擬似種における、自己および異種の多数の真正のそして機能性ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子に対する血清抗体の中和特性を特徴付けた。単一ゲノム増幅によって、総数４７４の全長ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子（被験体あたり５〜２３）を得た。これらの個体の１／３は、総ウイルス集団の９％〜３８％を占める同一のまたは類似の遺伝子配列を持つクローン増殖ウイルスの集団を宿した。Ｅｎｖ偽型ウイルスとしてのこれらのｅｎｖ遺伝子の機能分析によって、広範囲のウイルス感染性が示された。感染性におけるこの変動は、血漿ウイルス負荷と相関したが、トランスフェクション細胞におけるタンパク質発現レベルとは相関せず、より機能的なｅｎｖ遺伝子が、ＨＩＶ−１感染個体においてより高いウイルス負荷を導きうることが示唆された。   While increasing knowledge of the molecular and antigenic structure of HIV-1 envelope glycoprotein (Env) has provided important new insights into vaccine design, this information can be used to immunize global neutralizing antibodies. It was difficult to convert it into information about the original. The present invention expresses functional Env in a high-throughput format to explore the question of whether there is a clear common neutralization signature in clade C virus sequences associated with the broad spectrum Nab reaction, at least in part. , Based on the use of SGA and the novel promoter PCR method [38]. As described in the examples below, the neutralizing properties of serum antibodies against a number of both authentic and heterologous authentic and functional HIV-1 env genes in HIV-1 clade C pseudospecies from 34 chronically infected individuals Characterized. Single genome amplification yielded a total of 474 full-length HIV-1 env genes (5-23 per subject). One third of these individuals harbored a population of clonal propagation viruses with identical or similar gene sequences that accounted for 9% to 38% of the total virus population. Functional analysis of these env genes as Env pseudotyped viruses showed a wide range of viral infectivity. This variation in infectivity correlated with plasma viral load but not with protein expression levels in transfected cells, and a more functional env gene could lead to higher viral load in HIV-1 infected individuals Was suggested.

以下の実施例はまた、１５人の個体各々由来の多数のＥｎｖ（３〜６）に関する、自己および異種血漿サンプル中の抗体に対する中和感受性の決定を記載する。自己ウイルスに関しては中和減少が観察されたが、異種中和が検出され、そしてこれを２つの別個の群：広域交差反応性中和を伴う血漿（Ｎ＝９）および交差反応性中和が劣っている血漿（Ｎ＝６）に分けることが可能であった。異種ウイルスに対してより強い中和活性を持つ血漿は、同時期の自己ウイルスをより強力に中和した。両群由来の血漿中のＥｎｖ配列の分析によって、Ｖ４領域中の共受容体結合部位近位に、より高い中和強度および幅と関連する、３つのアミノ酸シグネチャーが明らかになった。   The following examples also describe the determination of neutralization sensitivity to antibodies in autologous and heterologous plasma samples for multiple Env (3-6) from each of 15 individuals. Although reduced neutralization was observed for the autovirus, heterogeneous neutralization was detected, and this was divided into two distinct groups: plasma with broad cross-reactive neutralization (N = 9) and cross-reactive neutralization. It was possible to divide into inferior plasma (N = 6). Plasma with stronger neutralizing activity against heterologous viruses more strongly neutralized concomitant autoviruses. Analysis of Env sequences in plasma from both groups revealed three amino acid signatures associated with higher neutralization strength and width proximal to the co-receptor binding site in the V4 region.

したがって、本発明は、強力な抗体反応に関連するシグネチャー（例えばシグネチャー部位３９３、３９７、および４１３）を保持するＨＩＶ−１サブタイプＣ Ｅｎｖ、および該Ｅｎｖをワクチン免疫原として用いる方法に関する。本発明はさらに、診断試験における診断ターゲットとして使用するためのこうしたＥｎｖに関する。本発明はさらに、多価ＨＩＶ−１ワクチンの調製における野生型（ＷＴ）ウイルス配列の使用に関する（２０１０年２月２５日出願の米国仮出願第６１／２８２，５２６号）。Ｂ細胞反応のためのこうした多価ワクチンに含まれうる配列には、ｅｎｖが含まれ、そしてＴヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞反応のためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆおよびｔａｔ配列が含まれる（２００６年８月２３日出願の米国出願第１１／９９０，２２２号）。   Accordingly, the present invention relates to HIV-1 subtype C Env that retains signatures associated with strong antibody responses (eg, signature sites 393, 397, and 413), and methods of using the Env as a vaccine immunogen. The invention further relates to such an Env for use as a diagnostic target in a diagnostic test. The present invention further relates to the use of wild type (WT) virus sequences in the preparation of multivalent HIV-1 vaccines (US provisional application 61 / 282,526, filed February 25, 2010). Sequences that can be included in such multivalent vaccines for B cell responses include env, and for T helper and cytotoxic T cell responses include gag, pol, nef and tat sequences ( US application Ser. No. 11 / 990,222 filed Aug. 23, 2006).

当該技術分野に周知の方法を用いて、本発明のワクチン抗原（免疫原）（例えば強力な抗体反応に関連するシグネチャーを保持するＥｎｖ配列）を化学的に合成しそして精製することも可能である。また、周知の組換えＤＮＡ技術によって免疫原を合成してもよい。本発明の免疫原をコードする核酸を、例えばＤＮＡワクチンの構成要素として用いてもよく、ここでコーディング配列を裸のＤＮＡとして投与し、または例えば、ウイルスベクター中に免疫原をコードするミニ遺伝子が存在してもよい。コード配列は、例えば、複製または非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ベクター、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニアまたは修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種細菌ベクター、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種細菌ベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列はまた、例えばＣＭＶプロモーターなどの活性プロモーターを含むＤＮＡプラスミドとして発現させてもよい。本発明の配列を発現するのに、他の生存ベクターもまた使用可能である。好ましくはヒト細胞における発現を最適化したコドンおよびプロモーターを用いて、免疫原をコードする核酸を細胞内に導入することによって、患者自身の細胞において、本発明の免疫原の発現を誘導してもよい。ＤＮＡワクチンを作製し、そして用いる方法の例は、例えば米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号および第５，７０３，０５５号に開示される。   It is also possible to chemically synthesize and purify the vaccine antigens (immunogens) of the invention (eg, Env sequences that retain a signature associated with a strong antibody response) using methods well known in the art. . Alternatively, immunogens may be synthesized by well-known recombinant DNA techniques. Nucleic acids encoding the immunogens of the present invention may be used, for example, as a component of a DNA vaccine, where the coding sequence is administered as naked DNA or, for example, a minigene encoding the immunogen in a viral vector is May be present. Coding sequences can be, for example, replicating or non-replicating adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, Mycobacterium tuberculosis vectors, Bacilli Calmette Guerin (BCG) vectors, vaccinia or modified vaccinia Ankara (MVA) vectors, Pox virus vectors, recombinant polio and other enteric virus vectors, Salmonella spp. Bacterial vectors, Shigella spp. Bacterial vectors, Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vectors, Semliki Forest virus vectors, or tobacco It may be present in a mosaic virus vector. The coding sequence may also be expressed as a DNA plasmid containing an active promoter, such as a CMV promoter. Other survival vectors can also be used to express the sequences of the invention. Preferably, the expression of the immunogen of the present invention is induced in the patient's own cell by introducing a nucleic acid encoding the immunogen into the cell, preferably using a codon and promoter optimized for expression in human cells. Good. Examples of methods for making and using DNA vaccines are disclosed, for example, in US Pat. Nos. 5,580,859 and 5,589,466 and 5,703,055.

本発明には、本発明の免疫原（例えばｇｐ１６０またはｇｐ１４０）またはその断片（例えば、単独のまたは脂質と会合したｇｐ４１、ｇｐ１２０、あるいはｇｐ１２０の断片）、あるいは該免疫原をコードする核酸配列の免疫学的有効量を、薬学的に許容されうる送達系中に含む組成物が含まれる。免疫不全ウイルス感染の防止および／または治療に該組成物を用いてもよい（例えばヒトにおいて）。アジュバント（例えばミョウバン、ＡＳ０２１（ＧＳＫより）、オリゴＣｐＧ、ＭＦ５９またはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ）、乳化剤、薬学的に許容されうるキャリアーまたはワクチン組成物中にルーチンに提供される他の成分を用いて、本発明の組成物を配合してもよい。一般の当業者は、最適な配合物を容易に設計可能であり、そしてこれには、即時放出用のおよび／または徐放用の、そして全身免疫誘導および／または局所粘膜免疫誘導用の配合物が含まれうる（例えば鼻内投与用の配合物を設計してもよい）。皮下、鼻内、直腸内、膣内、経口、筋内、または他の非経口もしくは経腸経路、あるいはその組み合わせを含む、任意の好適な経路によって、本発明の組成物を投与してもよい。免疫反応を誘導するのに十分な量で、例えば単回用量または多数回用量として、免疫原を投与してもよい。一般の当業者は、最適な免疫スケジュールを容易に決定可能であり、そしてこれは患者、組成物および求めている効果に応じて多様でありうる。   The invention includes immunization of an immunogen of the invention (eg, gp160 or gp140) or a fragment thereof (eg, a gp41, gp120, or gp120 fragment alone or associated with a lipid), or a nucleic acid sequence encoding the immunogen. Compositions comprising a pharmaceutically effective amount in a pharmaceutically acceptable delivery system are included. The composition may be used for prevention and / or treatment of immunodeficiency virus infection (eg in humans). Compositions of the invention using adjuvants (eg alum, AS021 (from GSK), oligo CpG, MF59 or Emulsigen), emulsifiers, pharmaceutically acceptable carriers or other ingredients routinely provided in vaccine compositions You may mix things. One of ordinary skill in the art can readily design an optimal formulation and includes formulations for immediate release and / or sustained release and for induction of systemic and / or local mucosal immunity (Eg, formulations for intranasal administration may be designed). The compositions of the invention may be administered by any suitable route, including subcutaneous, intranasal, rectal, vaginal, oral, intramuscular, or other parenteral or enteral routes, or combinations thereof. . The immunogen may be administered in an amount sufficient to induce an immune response, eg, as a single dose or multiple doses. One of ordinary skill in the art can readily determine an optimal immunization schedule and can vary depending on the patient, the composition and the effect sought.

本発明の組成物および投与措置の例には、例えばＤＮＡプライム組換え水疱性口内炎ウイルスブーストおよび抗体用の組換えＥｎｖタンパク質ブースト、ＮＹＶＡＣなどのポックスウイルスプライムおよびタンパク質Ｅｎｖオリゴマーブースト、またはその断片、あるいはＤＮＡプライム組換えアデノウイルスブーストおよびＥｎｖタンパク質ブースト、あるいは単に抗体誘導のため、アジュバント中のタンパク質としての組換えエンベロープｇｐ１２０またはｐｇ１４０として発現される、コンセンサスまたはモザイクｇａｇ遺伝子、およびコンセンサスまたはモザイクｎｅｆ遺伝子、およびコンセンサスまたはモザイクｐｏｌ遺伝子、および上記シグネチャーを保持するＥｎｖを含むコンセンサスＥｎｖまたは上記シグネチャーを保持するＥｎｖを含むモザイクＥｎｖが含まれる（米国出願第１０／５７２，６３８号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７、米国出願第１１／９９０，２２２号および第１２／１９２，０１５号を参照されたい）。   Examples of compositions and dosage regimens of the invention include, for example, DNA prime recombinant vesicular stomatitis virus boost and recombinant Env protein boost for antibodies, poxvirus prime and protein Env oligomer boosts such as NYVAC, or fragments thereof, or A consensus or mosaic gag gene and a consensus or mosaic nef gene expressed as a recombinant envelope gp120 or pg140 as a protein in an adjuvant for DNA prime recombinant adenovirus boost and Env protein boost, or simply for antibody induction, and Consensus or mosaic pol gene and consensus Env or Ensign holding Env that retains the signature It includes mosaic Env containing Env (U.S. Ser. No. 10 / 572,638, PCT / US2006 / 032907, see US Application No. 11 / 990,222 and No. 12 / 192,015).

本発明は、本発明の免疫原および／または該免疫原をコードする核酸、ならびに／あるいは上に示すベクター中のミニ遺伝子として発現される免疫原の両方の直接使用を意図する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子をプライムおよび／またはブーストとして用いてもよい。   The present invention contemplates the direct use of both the immunogen of the present invention and / or the nucleic acid encoding the immunogen and / or the immunogen expressed as a minigene in the vector shown above. For example, a minigene encoding an immunogen may be used as a prime and / or boost.

本開示を読むと、全エンベロープ遺伝子またはその一部（すなわちミニ遺伝子として）が使用可能であることが認識されるであろう。発現されたタンパク質の場合、タンパク質サブユニットが使用可能である。   It will be appreciated from reading this disclosure that the entire envelope gene or a portion thereof (ie, as a minigene) can be used. In the case of expressed proteins, protein subunits can be used.

上記に示すように、本発明はまた、診断ターゲットおよび診断試験にも関する。例えば、哺乳動物細胞の一過性または安定トランスフェクションによって、本発明のシグネチャー保持Ｅｎｖを発現させてもよい（またはこれらを例えば組換えワクシニアウイルスタンパク質として発現させてもよい）。タンパク質をＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ試験、または他の診断試験で用いて、ＨＩＶ感染の最も初期の段階で、患者由来の生物学的サンプル中の伝染／創始者ウイルスに対する抗体を検出することも可能である。   As indicated above, the present invention also relates to diagnostic targets and diagnostic tests. For example, transient or stable transfection of mammalian cells may express the signature-bearing Envs of the present invention (or they may be expressed, for example, as recombinant vaccinia virus proteins). Proteins can also be used in ELISA, Luminex bead tests, or other diagnostic tests to detect antibodies to infectious / founder viruses in patient-derived biological samples at the earliest stages of HIV infection .

本発明はまた、本発明のシグネチャー保持Ｅｎｖに特異的な抗体に、そしてこうした抗体の断片に、そして該抗体を用いて、ＨＩＶ−１による被験体の細胞の感染を阻害する方法にも関する。該方法は、被験体（例えばヒト被験体）に、ＨＩＶ−１特異的抗体またはその断片を、該抗体またはその断片が感染を阻害するような量および条件下で投与する工程を含む。   The present invention also relates to antibodies specific to the signature-carrying Env of the present invention, and to fragments of such antibodies, and methods of using the antibodies to inhibit infection of a subject's cells by HIV-1. The method includes administering to a subject (eg, a human subject) an HIV-1 specific antibody or fragment thereof in an amount and under conditions such that the antibody or fragment thereof inhibits infection.

本発明にしたがって、被験体または被験体の免疫系／細胞とＨＩＶ−１が接触する前に、あるいは脆弱細胞の感染後に、抗体を投与してもよい。接触前または接触直後の投与は、被験体の脆弱細胞（例えばＴ細胞）の感染阻害を最大限にしうる。   In accordance with the present invention, the antibody may be administered before HIV-1 is contacted with the subject or the subject's immune system / cell or after infection of vulnerable cells. Administration before or immediately after contact may maximize the inhibition of infection of the subject's vulnerable cells (eg, T cells).

上に示すように、本発明の方法において、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体またはその断片（例えば抗原結合性断片）のいずれを用いてもよい。例示的な機能性断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。一本鎖抗体もまた使用可能である。適切な断片および一本鎖抗体を調製するための技術が当該技術分野に周知である（例えばＵＳＰ ５，８５５，８６６； ５，８７７，２８９； ５，９６５，１３２； ６，０９３，３９９； ６，２６１，５３５； ６，００４，５５５； ７，４１７，１２５および７，０７８，４９１ならびにＷＯ９８／４５３３１を参照されたい）。 As indicated above, either intact antibodies or fragments thereof (eg, antigen binding fragments) may be used in the methods of the invention. Exemplary functional fragments (regions) include scFv, Fv, Fab ′, Fab and F (ab ′) 2 fragments. Single chain antibodies can also be used. Techniques for preparing appropriate fragments and single chain antibodies are well known in the art (eg, USP 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,093,399; 6 , 261,535; 6,004,555; see 7,417,125 and 7,078,491 and WO 98/45331).

上記抗体およびその断片を組成物（例えば薬学的組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解されるかまたは分散された抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は、無菌であってもよいし、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ペーストまたはエアロゾルの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。***後膣洗浄として、またはコンドームとともに投与するように、抗体を配合してもよい。   The antibody and fragments thereof may be formulated as a composition (eg, a pharmaceutical composition). A suitable composition may comprise an antibody (or antibody fragment) dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier (eg, an aqueous medium). The composition may be sterile and may be injectable. The antibody (and fragments thereof) may also be formulated as a composition suitable for topical administration to the skin or mucosa. Such compositions may take the form of liquids, ointments, creams, gels, pastes or aerosols. Standard formulation techniques may be used in preparing the appropriate composition. The antibody may be formulated for vaginal lavage after sexual intercourse or for administration with a condom.

本発明の抗体および抗体断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合性断片）を、消毒剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる性感染の環境において生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、そして
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合性断片）を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよい。 The antibodies and antibody fragments of the invention show the utility of the antibodies for prevention, for example, in the following environment:
i) In an environment where the expected exposure to HIV-1 infection is known, an antibody (or binding fragment thereof) described herein can be prophylactically (eg, IV or topically) as a disinfectant (microbioside). ) May be administered,
ii) antibodies described herein in environments where exposure is known or suspected, such as those occurring in rape victims, commercial sex shop employees, or any sexually transmitted environment without condom protection Or a fragment thereof) may be administered as a post-exposure prophylactic agent, eg, IV or topically, and iii) in the setting of acute HIV infection (AHI), the antibody (or binding fragment thereof) described herein May be administered as a treatment for AHI that controls the initial viral load and retains the CD4 + T cell pool and prevents CD4 + T cell destruction.

適切な用量範囲は、例えば、抗体、そして配合物の性質および投与経路に依存しうる。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる。   The appropriate dosage range can depend, for example, on the antibody and the nature of the formulation and the route of administration. Persons of ordinary skill in the art can determine optimum dosages without undue experimentation. Antibody doses ranging from 10 ng to 20 μg / ml may be appropriate.

本発明にはまた、本明細書記載の抗体またはその断片をコードする核酸配列も含まれる。核酸配列は、プロモーターに機能可能であるように連結されて、発現ベクター中に存在することも可能である。本発明はさらに、こうしたベクターを含む単離細胞に、そして抗体またはその断片を作製する方法であって、核酸配列が発現され、そして抗体または断片が産生されるような条件下で、こうした細胞を培養する工程を含む前記方法に関する。   The invention also includes nucleic acid sequences that encode the antibodies or fragments thereof described herein. The nucleic acid sequence can be operably linked to a promoter and present in the expression vector. The invention further provides a method of making an antibody or fragment thereof in an isolated cell containing such a vector, under conditions such that the nucleic acid sequence is expressed and the antibody or fragment is produced. The method includes the step of culturing.

本発明の特定の側面を、以下の限定されない実施例により詳細に記載することも可能である（米国出願第６１／３２２，７２５号、第６１／３２２，８２１号、および第６１／３２２，６６３号が本明細書に援用される）。   Certain aspects of the invention can also be described in more detail by the following non-limiting examples (US Application Nos. 61 / 322,725, 61 / 322,821, and 61 / 322,663). No. is hereby incorporated by reference).

ＨＩＶ−１に対する広域でそして強力な中和抗体の誘発は困難であった。しかし、近年の研究によって、ＨＩＶ−１感染を有効に制御するＡＩＤＳワクチンには、中和抗体が必要であることが示されている。ＨＩＶ−１が自然感染中に中和抗体を誘導する能力を理解するため、サブタイプＣ感染個体各々由来の多数のＥｎｖ偽ウイルスを用いて、包括的な自己および異種中和アッセイを行い、そしてＶ４領域中の共受容体結合部位近位に、より高い中和強度および幅と関連する、３アミノ酸シグネチャーを同定した。広域反応性中和抗体反応を誘発するためのシグネチャーの同定は、ＨＩＶ−１に対する中和抗体を誘導可能なワクチン候補の開発のために重要な意味を有する。これらの結果はまた、異種ウイルスに対するより強い中和活性を持つ同時期血漿における自己中和の存在、慢性感染個体の大部分におけるウイルスのクローン増殖、ならびにＥｎｖ偽ウイルスの感染性および感染個体におけるウイルス負荷の間の正の相関も示した。   Induction of broad and potent neutralizing antibodies against HIV-1 has been difficult. However, recent studies have shown that AIDS vaccines that effectively control HIV-1 infection require neutralizing antibodies. To understand the ability of HIV-1 to induce neutralizing antibodies during natural infection, a comprehensive self and heterologous neutralization assay was performed using multiple Env pseudoviruses from each subtype C infected individual, and A 3 amino acid signature was identified proximal to the co-receptor binding site in the V4 region, associated with higher neutralization strength and width. Identification of a signature to elicit a broadly reactive neutralizing antibody response has important implications for the development of vaccine candidates capable of inducing neutralizing antibodies against HIV-1. These results also indicate the presence of self-neutralization in concomitant plasma with stronger neutralizing activity against heterologous viruses, viral clonal growth in the majority of chronically infected individuals, and Env pseudovirus infectivity and virus in infected individuals. A positive correlation between the loads was also shown.

実験詳細
ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の増幅。ザンビア・ヌドーラにおける同時期ＨＩＶ−１株の研究において登録された３７人のＨＩＶ−１陽性個体から、血漿サンプルを収集した。該研究は、熱帯病研究センター倫理委員会、デューク大学施設審査委員会、および米国国立衛生研究所によって認可された。ウイルスＲＮＡを血漿から抽出し、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。先に記載されるように、単一ゲノム増幅（ＳＧＡ）の後、ｐＰＣＲ技術を用いて、ＳＧＡ産物の５’端にＣＭＶプロモーターを付加することによって、各個体から多数のｒｅｖ／ｅｎｖ遺伝子を得た。 Experimental details Amplification of HIV-1 env gene. Plasma samples were collected from 37 HIV-1 positive individuals enrolled in a study of concomitant HIV-1 strains in Zambia Nudola. The study was approved by the Center for Tropical Diseases Ethics Committee, Duke University Facility Review Board, and the National Institutes of Health. Viral RNA was extracted from plasma and reverse transcribed into cDNA using Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). As described above, after single genome amplification (SGA), a number of rev / env genes are obtained from each individual by adding a CMV promoter to the 5 'end of the SGA product using pPCR technology. It was.

単回感染アッセイ。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて、２４ウェルプレート中、ｐＰＣＲ産物をｅｎｖ不全ＨＩＶ−１主鎖プラスミド（ｐＳＧ３Δｅｎｖ）と２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした。簡潔には、ｐＰＣＲ ＤＮＡ（１５０ｎｇ）およびｐＳＧ３Δｅｎｖ ＤＮＡ（１５０ｎｇ）を１．２μｌのＦｕＧＥＮＥ６と（ＦｕＧＥＮＥ：ＤＮＡ比 ３μｌ：１μｇ）、血清不含ＤＭＥＭを含めて２０μｌの総体積中で混合し、３０分間インキュベーションし、そして前日にウェルあたり５ｘ１０４に植え付けた２９３Ｔ細胞（７０％集密）に添加した。トランスフェクション４８時間後、上清を採取した。９６ウェルプレート（２００μｌ）中、等体積の偽ビリオンをＤＥＡＥ（５μｇ／ｍｌ）とともに、ＴＺＭ−ｂｌ細胞に添加した。培養を、５％ＣＯ２とともに、３７℃で４８時間インキュベーションした。感染ＴＺＭ−ｂｌ細胞から上清（１００μｌ）を除去し、そして１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質を緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州マディソン）とともに細胞に添加した。２分間インキュベーションした後、１００μｌの細胞溶解物を黒一色の９６ウェルプレートに添加した。Ｗａｌｌａｃ １４２０マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ：マサチューセッツ州ウォルサム）で発光を測定した。先に記載されるように［３９］、ＴＣＩＤ５０を決定した。 Single infection assay. The pPCR product was cotransfected with env-deficient HIV-1 backbone plasmid (pSG3Δenv) and 293T cells in 24-well plates using FuGENE6 transfection reagent (Roche Diagnostics; Indianapolis, Ind.). Briefly, pPCR DNA (150 ng) and pSG3Δenv DNA (150 ng) are mixed in 1.2 μl FuGENE6 (FuGENE: DNA ratio 3 μl: 1 μg) in a total volume of 20 μl including serum-free DMEM for 30 minutes. Incubated and added to 293T cells (70% confluence) seeded 5 × 10 4 per well the previous day. Supernatants were collected 48 hours after transfection. In a 96-well plate (200 μl), an equal volume of pseudovirion was added to TZM-bl cells along with DEAE (5 μg / ml). Cultures were incubated for 48 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 . Supernatant (100 μl) was removed from infected TZM-bl cells and 100 μl of Bright-Glo luciferase assay substrate was added to the cells along with buffer (Promega; Madison, Wis.). After a 2 minute incubation, 100 μl of cell lysate was added to a black 96-well plate. Luminescence was measured with a Wallac 1420 multilabel counter (PerkinElmer: Waltham, Mass.). TCID 50 was determined as previously described [39].

中和アッセイ。先に記載されるように［３９、４０］、ＴＺＭ−ｂｌ細胞の単回感染後、ルシフェラーゼ活性の減少としてＨＩＶ−１中和を測定した。等量の偽ビリオン（２００ ＴＣＩＤ５０）を各反応に用いた。１６の血漿サンプル（試験したＥｎｖ偽ウイルスに対して、１５の自己および１の異種）および１つのＨＩＶ−１陽性血清対照に関して、ｐＰＣＲ偽ビリオンに対する中和力価を決定した。両種性ネズミ白血病Ｅｎｖ偽ウイルスもまた、非特異的中和対照として含めた。 Neutralization assay. As previously described [39, 40], HIV-1 neutralization was measured as a decrease in luciferase activity after a single infection of TZM-bl cells. An equal amount of pseudovirion (200 TCID 50 ) was used for each reaction. Neutralization titers against pPCR pseudovirions were determined for 16 plasma samples (15 autologous and 1 xenogeneic for the Env pseudovirus tested) and 1 HIV-1 positive serum control. Amphotropic murine leukemia Env pseudovirus was also included as a non-specific neutralization control.

ウェスタンブロット。ｐＰＣＲ産物およびｐＳＧ３Δｅｎｖの同時トランスフェクション４８時間後、２９３Ｔ細胞を２５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）で溶解した。細胞溶解物を６ｘ変性サンプル緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１２ｍＭ ＥＤＴＡ、１２％ＳＤＳ、８６４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。サンプルを１０分間煮沸し、そして次いでＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）に装填した。サンプルをニトロセルロース膜にトランスファーした後、１％カゼインおよび０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で膜を１時間ブロッキングした。ブロットをＨＩＶ−１陽性血清（１：５００）およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質に対するマウスｍＡｂ １３Ｄ５（１μｇ／ｍｌ）と反応させた。最後に、ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；ペンシルバニア州ギルバーツビル）、およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６８０コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）と膜を反応させた。蛍光を検出し、そしてＥｎｖタンパク質およびｐ２４バンドの密度をＯｄｙｓｓｅｙ赤外画像化系（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ネブラスカ州リンカーン）で決定した。トランスフェクション細胞におけるＥｎｖタンパク質のレベルを同じ細胞におけるｐ２４ Ｇａｇ抗原の量を越える倍相違として表した。 Western blot. 48 hours after co-transfection of pPCR product and pSG3Δenv, 293T cells were lysed with 250 μl lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% Triton-X100, 0.1% SDS, pH 7.4). did. The cell lysate was mixed with 6 × denatured sample buffer (300 mM Tris-HCl pH 6.8, 12 mM EDTA, 12% SDS, 864 mM 2-mercaptoethanol, 60% glycerol, 0.05% bromophenol blue). Samples were boiled for 10 minutes and then loaded onto a NuPAGE Novex 4-12% Bis-Trisge (Invitrogen; Carlsbad, CA). After transfer the sample onto a nitrocellulose membrane, membranes were blocked for 1 hour with PBS containing 1% casein and 0.01% NaN 3. The blots were reacted with HIV-1 positive serum (1: 500) and mouse mAb 13D5 (1 μg / ml) against HIV-1 Env protein. Finally, the membrane was reacted with an IRDye800 conjugated affinity purified goat anti-human IgG antibody (Rockland Immunochemicals; Gilbertsville, PA) and Alexa-Fluor 680 conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Invitrogen; Carlsbad, CA) . Fluorescence was detected and the density of the Env protein and p24 band was determined with an Odyssey infrared imaging system (LiCor Biosciences; Lincoln, Nebraska). The level of Env protein in the transfected cells was expressed as a fold difference over the amount of p24 Gag antigen in the same cells.

配列分析。ＳＧＡ ｅｎｖアンプリコンの配列を、ＡＢＩ ３７３０ｘ１遺伝子分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）で、サイクル配列決定およびダイターミネーター法によって得た。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒプログラム４．７（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ；ミシガン州アナーバー）を用いて、各ｅｎｖ ＳＧＡの個々の配列断片を組立て、そして編集した。シグネチャー分析に使用可能なコドン整列ファイルを得るため、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ［４１］およびＧｅｎｅｃｕｔｔｅｒ（ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）を用いて、ｅｎｖ配列を整列させた。レジェンドに明記するように、近隣結合法または最尤法のいずれかを用いて系統樹を構築した。 Sequence analysis. The sequence of the SGA env amplicon was obtained by cycle sequencing and dye terminator method on an ABI 3730x1 gene analyzer (Applied Biosystems; Foster City, CA). Individual sequence fragments of each env SGA were assembled and edited using the Sequencher program 4.7 (Gene Codes; Ann Arbor, MI). The env sequence was aligned using CLUSTAL W [41] and Genecutter ( www.hiv.lanl.gov ) to obtain a codon alignment file that can be used for signature analysis. As specified in the legend, phylogenetic trees were constructed using either the neighborhood join method or the maximum likelihood method.

階層的クラスター化分析。血漿の中和能力（対数逆数希釈ＩＤ５０スコア）は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂのウェブに基づくヒートマップインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＥＡＴＭＡＰ／ｈｅａｔｍａｐ．ｈｔｍｌ）および統計パッケージＲ［４２］を用いて、本研究で用いたエンベロープのパネルに対して試験した際、類似の中和強度パターンに組織化された。無作為復元ブートストラップ戦略を用いて、エンベロープの試験パネルを１０，０００回再サンプリングし、そしてこれによって、ブートストラップサンプルの９６％で反復される、ロバストでそして特徴的な２つのクラスター：低い交差中和能力を持つ１つの群、および多数の異種Ｃクレードウイルスを交差中和する能力を有する別の群［４３］が同定された。これらの２群を、続くシグネチャー分析に用いた。同じ戦略を用いて、同様の中和感受性を持つＥｎｖの統計的にロバストなクラスターを同定した。高いブートストラップ値を持つクラスターは、典型的には、各々２、３のＥｎｖしか含まず、そしてこれらのＥｎｖクラスターは、典型的には、単一の被験体内に見られた。したがって、本発明者らは、ヒートマップ図において、個体によるＥｎｖ偽ウイルスを体系化する一方、図に重ね合わせて示すように、有意なブートストラップクラスターに関する情報を保持することを決定した。 Hierarchical clustering analysis. Plasma neutralization capacity (log reciprocal dilution ID 50 score) was calculated using the Los Alamos National Lab web-based heat map interface ( http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HEATAMAP/heatmap.html ) and The statistical package R [42] was organized into a similar neutralization intensity pattern when tested against the envelope panels used in this study. Using a random restoration bootstrap strategy, resampling the envelope test panel 10,000 times, thereby repeating two robust and characteristic clusters: 96% of the bootstrap samples: low crossing One group with the ability to neutralize and another group [43] with the ability to cross-neutralize multiple heterologous C cladeviruses were identified. These two groups were used for subsequent signature analysis. The same strategy was used to identify statistically robust clusters of Env with similar neutralization sensitivity. Clusters with high bootstrap values typically contain only a few Env each, and these Env clusters were typically found in a single subject. Therefore, we decided to organize Env pseudovirus by individuals in the heat map diagram, while retaining information about significant bootstrap clusters as shown superimposed on the diagram.

シグネチャー分析。本発明者らはまず、交差反応性中和プロファイルまたは弱い中和プロファイルを有する血漿を持つ個体からエンベロープ配列を得たかどうかを示す、ヒートマップ・クラスター化パターンに基づいて、エンベロープ配列を２つの群に分けた。系統樹分析のため、コドン整列されたＤＮＡを提供する、ＧｅｎｅＣｕｔｔｅｒ（ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）を用いて、シグネチャー分析に用いる整列を生成した。系統発生補正法を用いて、すべてのシグネチャー部位を同定した。データ中で観察されるパターンは、ウイルス系譜の最初の歴史的発生によって課された相関（創始者効果）から生じるか、またはＨＩＶ−１の場合、最近の生物学的相互作用の結果であるかいずれである可能性もあるため、系統発生補正が非常に重要である。創始者効果を説明しないと、誤った統計結果を導きうる［４４］。ウイルスの配列は全進化歴に依存する一方、原因となる相関は、最近の変化との相関に明らかである。２つの効果の分離、すなわち系統発生補正によって、表現型に対する最近の変化による影響を概算することが可能になる。これには、ウイルスおよびウイルスの祖先状態の概算の間の系譜的な関連の統計的再構築が必要である。本発明者らは、これを、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら［４４］が最初に開発した、系統発生補正したフィッシャーの厳密法を適応させて、最尤系統樹を通じて実行し、そして最近の共通の祖先に比較した際、所定のアミノ酸における変化または静止に基づく突然変異パターンと表現型の関連に関して試験した。本発明者らは、整列中のすべての段に見られる各アミノ酸の突然変異パターンをスクリーニングした。多数の試験に関して補正するため、本発明者らは、ｑ値を用いて、偽発見率を評価した［４５］。各々で見出された４つの最強の関連は、０．０３のｐ値および０．２７のｑ値を有し、したがって同定されたシグネチャーの少なくとも１つは偽陽性であるようであり、そして全体として、境界線の有意性しか得られず、したがってこれらのシグネチャーは、仮説を生じさせるフレームワークで、さらなる研究に値する潜在的に興味深い部位と見なされるべきである。   Signature analysis. We first grouped the envelope sequences into two groups based on a heatmap clustering pattern that indicates whether envelope sequences were obtained from individuals with plasma having a cross-reactive neutralization profile or a weak neutralization profile. Divided into. For phylogenetic analysis, GeneCutter (www.hiv.lanl.gov), which provides codon-aligned DNA, was used to generate the alignment used for signature analysis. All signature sites were identified using a phylogenetic correction method. Do the patterns observed in the data arise from correlations (founder effects) imposed by the first historical occurrence of the viral lineage or, in the case of HIV-1, are the result of recent biological interactions? Because it can be either, phylogenetic correction is very important. Failure to explain the founder effect can lead to erroneous statistical results [44]. While viral sequences depend on the overall evolutionary history, the causal correlation is evident in the correlation with recent changes. Separation of the two effects, ie phylogenetic correction, makes it possible to approximate the impact of recent changes on the phenotype. This requires statistical reconstruction of the lineage between the virus and the estimation of the virus ancestry status. We have adapted this to the Phylogenetic Corrected Fisher's exact method originally developed by Bhattacharya et al. [44], performed through a maximum likelihood phylogenetic tree, and compared it to recent common ancestors In the meantime, mutations based on changes or quiescence in a given amino acid were tested for phenotype association. We screened the mutation pattern of each amino acid found in all stages in the alignment. To correct for a number of tests, we evaluated the false discovery rate using q-values [45]. The four strongest associations found in each have a p-value of 0.03 and a q-value of 0.27, so at least one of the identified signatures appears to be false positives and As such, only the significance of the borderline can be obtained, so these signatures should be considered as potentially interesting sites worthy of further study in the framework for generating hypotheses.

ヌクレオチド配列寄託番号。すべてのｅｎｖ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号は、ＧＵ３２９０４８−ＧＵ３２９５２３である。
結果
全長ｅｎｖ遺伝子の遺伝子分析。２００５年、ザンビア・ヌドーラにおいて、５０人のＣＨＩ個体から血漿サンプルを収集した。ＳＧＡによって、５０人の被験体のうち３７人から総数４７４の完全ｅｎｖ遺伝子を得た。残った１３人の被験体に関する陰性のＰＣＲ結果は、血漿ウイルス負荷が低いかまたは検出不能であるかいずれかのためであった。３７人のＰＣＲ陽性被験体各々から、平均して１３のｅｎｖ ＳＧＡ（５〜２３の範囲）を配列決定した（表１）。系統発生分析は、被験体の大部分（ｎ＝３４）がＨＩＶ−１サブタイプＣに感染していることを示した（図１）。他の３人は、サブタイプＤ、Ａ／Ｃ組換え体（大部分の中央領域がＣ）またはＧ／Ｊ組換え体のいずれかに感染していた。単系統樹が１１人の個体で観察され（タイプＩ）、一方、２６人の個体（７０％）では、２つの別個のｅｎｖ系譜（タイプＩＩ）が発見された（図１）。２つの別個の系譜のこの頻度は、先に記載された急性ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＣ感染で［３７、４６］、そしてサブタイプＢのＣＨＩ個体（未公表データ）で観察された２０％〜３０％の頻度よりもはるかに高い。 Nucleotide sequence deposit number. The GenBank accession numbers for all env gene sequences are GU329048-GU329523.
Results Genetic analysis of the full-length env gene. In 2005, plasma samples were collected from 50 CHI individuals in Nubia, Zambia. A total of 474 complete env genes were obtained from 37 of the 50 subjects by SGA. Negative PCR results for the remaining 13 subjects were either due to low plasma viral load or undetectability. On average, 13 env SGAs (range 5-23) were sequenced from each of the 37 PCR positive subjects (Table 1). Phylogenetic analysis showed that the majority of subjects (n = 34) were infected with HIV-1 subtype C (FIG. 1). The other three were infected with either subtype D, A / C recombinants (most central region C) or G / J recombinants. A single phylogenetic tree was observed in 11 individuals (type I), while in 26 individuals (70%), two separate env lineages (type II) were found (FIG. 1). This frequency of two distinct lineages is 20% observed in acute HIV-1 subtype B and C infections previously described [37, 46] and in subtype B CHI individuals (unpublished data) Much higher than ~ 30% frequency.

同一のまたは緊密に関連するｅｎｖ配列が、３７人の被験体のうち１３人（３５％）で同定され（表２）、ＨＩＶ−１感染個体における少数派ウイルス集団のクローン増殖が示唆された。これらの被験体において、クローン増殖Ｅｎｖは、サンプリングされたｅｎｖ集団の９〜３８％を構成した。クローン増殖されたエンベロープの各集団における配列は、系統樹においてゼロまたは限定された枝長さの緊密なクラスターを形成し（図２）；この緊密なクラスター化は、高いブートストラップ値によって支持された（＞８５％）。９人の被験体は、１つのクローン増殖されたｅｎｖ変異体を有し（図２Ａ〜Ｉ）、一方、さらなる４人の被験体（ＺＭ３７７、ＺＭ４０５、ＺＭ４１４、およびＺＭ４１５）は、２つの独立のクローン増殖集団を有した（図２Ｊ〜Ｍ）。２人の被験体（ＺＭ４０２およびＺＭ４０５）におけるクローン増殖された変異体は新規系譜を形成した（図２Ｅおよび２Ｊ）。緊密に関連しているが、クローン増殖変異体から分岐し始めている配列が４人の被験体（ＺＭ３７７、ＺＭ４０１、ＺＭ４１４、およびＺＭ４１５）で観察された（図２Ｄ、Ｊ、ＬおよびＭ）。ＺＭ３９４において、クローン増殖ウイルスおよび他のウイルスの間の組換え体ｅｎｖ配列を検出した（図２Ｉ）。これらの後者の組換え体は、この被験体におけるウイルス集団の多様性の実質的な増加に寄与した。組換え体配列が系統樹から排除される場合、クローン増殖ウイルスは、被験体における新規ウイルス系譜の発生に相当した（図２Ｉ）。   The same or closely related env sequences were identified in 13 (35%) of 37 subjects (Table 2), suggesting clonal expansion of the minority virus population in HIV-1 infected individuals. In these subjects, the clonal expansion Env comprised 9-38% of the sampled env population. Sequences in each population of clonal propagated envelopes formed a tight cluster of zero or limited branch length in the phylogenetic tree (FIG. 2); this tight clustering was supported by high bootstrap values ( > 85%). Nine subjects have one clonal expanded env mutant (FIGS. 2A-I), while an additional four subjects (ZM377, ZM405, ZM414, and ZM415) are two independent Had a clonal expanded population (FIGS. 2J-M). Clonally propagated mutants in two subjects (ZM402 and ZM405) formed a new lineage (FIGS. 2E and 2J). Closely related, but sequences starting to diverge from clonal growth mutants were observed in 4 subjects (ZM377, ZM401, ZM414, and ZM415) (FIGS. 2D, J, L, and M). In ZM394, a recombinant env sequence between clonal propagation virus and other viruses was detected (FIG. 2I). These latter recombinants contributed to a substantial increase in the diversity of the viral population in this subject. When the recombinant sequence was excluded from the phylogenetic tree, the clonal propagation virus represented the development of a new viral lineage in the subject (FIG. 2I).

感染個体におけるｅｎｖ擬似種の機能分析。各感染個体由来の多数のｅｎｖ遺伝子のハイスループット機能スクリーニングのため、ＳＧＡアンプリコンにＣＭＶプロモーターを付加するｐＰＣＲ法［３８］を用いた。２９３Ｔ細胞をｐＰＣＲ産物およびＥｎｖ不全主鎖プラスミド（ＳＧ３Δｅｎｖ）で同時トランスフェクションすることによって、Ｅｎｖ偽型ウイルスを生成した。ＴＺＭ−ｂｌ細胞において、ルシフェラーゼ活性によって感染性を測定した。調べた総数４７４のＥｎｖのうち、３７７（８０％）が機能的であることが見出された（表１）。すべての新規に特徴付けられたｅｎｖ遺伝子が、８人の被験体において機能性であり、一方、数人の被験体において、ｅｎｖ遺伝子のわずかの割合のみが機能性であった（ＺＭ４１９およびＺＭ３９３に関して、それぞれ１０％および１８％）。３人の個体（ＺＭ３７３、ＺＭ３８０およびＺＭ３８２）において、すべてのＥｎｖ偽型ウイルスが非常に感染性であり、そして感染性の相違はわずか数倍であった（図３）。これらの後者のｅｎｖ配列は、各被験体における単系統ウイルス群を構成した。特に、大部分の他の個体由来のＥｎｖ偽型ウイルスの感染性は、非常に可変性であった（ルシフェラーゼ活性において１〜２対数相違）。   Functional analysis of env pseudospecies in infected individuals. For high-throughput functional screening of a large number of env genes from each infected individual, the pPCR method [38] in which a CMV promoter was added to the SGA amplicon was used. Env pseudotyped virus was generated by co-transfecting 293T cells with pPCR product and Env-deficient backbone plasmid (SG3Δenv). Infectivity was measured by luciferase activity in TZM-bl cells. Of the total 474 Env examined, 377 (80%) were found to be functional (Table 1). All newly characterized env genes were functional in 8 subjects, while in a few subjects only a small percentage of the env genes were functional (for ZM419 and ZM393) , 10% and 18% respectively). In 3 individuals (ZM373, ZM380 and ZM382), all Env pseudotyped viruses were very infectious and the infectious differences were only a few fold (Figure 3). These latter env sequences constituted a single lineage virus group in each subject. In particular, the infectivity of Env pseudotyped viruses from most other individuals was very variable (1-2 log differences in luciferase activity).

６人の個体由来の１１のｅｎｖ配列において、組換え遺伝子が見出された。これらの機能性を調べると、８つ（７３％）が生物学的に機能性である一方、他の３つは機能性でなかった（図４）。ＺＭ４２０．９は、１ヌクレオチド挿入によって引き起こされる読み枠シフトのため、機能性でなかった。この結果は、いくつかの組換え体が生物学的利点を獲得する可能性がある一方、他のものは致死性であり、そして非機能性遺伝子を生じうることを示唆した。例えば、ＺＭ３９４において、クローン増殖ウイルスおよび他のウイルス間の組換え体ウイルスは、非機能性から非常に感染性までの範囲の異なるレベルの感染性を生じた（図２Ｉおよび４）。しかし、組換え体配列は、非組換え体に比較して、不活性ウイルスが特に濃縮されてはいなかった（フィッシャーの厳密検定、ｐ＝０．４）。２６人の個体を、系統樹分析において互いに分離されている２つの系譜のウイルスに感染させた（図１）。しかし、同じ患者において、異なる系譜のウイルス間で、Ｅｎｖ偽ウイルスの感染性には有意な相違は観察されなかった（データ未提示）。   Recombinant genes were found in 11 env sequences from 6 individuals. When examining these functionalities, 8 (73%) were biologically functional while the other 3 were not functional (FIG. 4). ZM420.9 was not functional due to the reading frame shift caused by the 1 nucleotide insertion. This result suggested that some recombinants may gain biological benefits while others are lethal and can yield non-functional genes. For example, in ZM394, recombinant viruses between clonal propagated viruses and other viruses produced different levels of infectivity ranging from non-functional to very infectious (FIGS. 2I and 4). However, the recombinant sequence was not particularly enriched for inactive virus compared to the non-recombinant (Fisher exact test, p = 0.4). Twenty-six individuals were infected with two lineage viruses that were separated from each other in the phylogenetic tree analysis (FIG. 1). However, no significant difference was observed in the infectivity of Env pseudovirus between viruses of different lineages in the same patient (data not shown).

Ｅｎｖ機能における可変性の範囲を考慮すると、偽ウイルスアッセイにおけるＥｎｖ感染性のレベルが、タンパク質発現レベル、または血漿ウイルスＲＮＡ負荷のいずれかと関連するかどうかに関心が持たれた。図５に示すように、偽ウイルス感染性およびウイルス負荷の間には、正の相関に向かう傾向が見られた（ｐ＝０．０５）。Ｅｎｖクローンがかなりの範囲の感染性を示す３人の被験体（ＺＭ４００、ＺＭ４１３およびＺＭ４１４）由来の多数のｅｎｖ ＳＧＡに関するウェスタンブロットによって、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞におけるタンパク質発現を定量化した。独立のトランスフェクション間の変動に関して調節するため、Ｅｎｖ発現を同じ細胞におけるｐ２４ Ｇａｇタンパク質発現に対して標準化した。サイズおよびｇｐ１６０のｇｐ１２０へのプロセシング切断効率は、試験したｅｎｖ遺伝子間で異なった。すべてのＥｎｖはＺＭ４１４ではほとんどサイズ変動を示さず（未成熟に一部切除されたものを除く）、一方、他のものはＺＭ４００およびＺＭ４１３の両方で多様であった（図６）。外部ドメインｇｐ１２０は、ＺＭ４００においてすべての発現されたＥｎｖに関して観察されたが、ＺＭ４１３およびＺＭ４１４では、大部分が未切断ｇｐ１６０であった。Ｅｎｖ偽ウイルスの感染性は、各個体におけるＥｎｖ発現のレベルに相関しないことが見出された。   Given the range of variability in Env function, we were interested in whether the level of Env infectivity in the pseudoviral assay was associated with either protein expression levels or plasma viral RNA load. As shown in FIG. 5, there was a trend towards a positive correlation between pseudoviral infectivity and viral load (p = 0.05). Protein expression in transfected 293T cells was quantified by Western blot on a number of env SGAs from three subjects (ZM400, ZM413 and ZM414) where the Env clone showed a significant range of infectivity. To regulate for variability between independent transfections, Env expression was normalized to p24 Gag protein expression in the same cells. The size and efficiency of processing cleavage of gp160 to gp120 differed between the env genes tested. All Envs showed little size variation in ZM414 (except those that were partially excised immature), while others were diverse in both ZM400 and ZM413 (FIG. 6). The ectodomain gp120 was observed for all expressed Env in ZM400, but in ZM413 and ZM414, it was mostly uncleaved gp160. It was found that the infectivity of Env pseudovirus did not correlate with the level of Env expression in each individual.

これらの結果は、感染性における変動が、トランスフェクション細胞における発現レベル、タンパク質サイズまたはｇｐ１６０の切断効率によっては決定されないことを示唆した。成熟ＨＩＶ−１粒子上には少数のＥｎｖスパイクしか存在しないため、トランスフェクション細胞における感染に十分なＥｎｖの量が、完全に感染性の偽ウイルスの産生に必要な閾値よりも高かった可能性がある［４７、４８］。非感染性偽ウイルスは、Ｅｎｖ発現の非存在または一部切除Ｅｎｖ発現のいずれかと関連した；これらの場合は、配列分析によって、未成熟停止コドンまたはフレームシフト欠失のいずれかによって説明された。   These results suggested that variability in infectivity was not determined by expression level, protein size or gp160 cleavage efficiency in transfected cells. Since there are only a few Env spikes on mature HIV-1 particles, it is possible that the amount of Env sufficient for infection in the transfected cells was higher than the threshold required for production of fully infectious pseudovirus. Yes [47, 48]. Non-infectious pseudoviruses were associated with either absence of Env expression or partially excised Env expression; in these cases, sequence analysis explained either by immature stop codons or frameshift deletions.

自己および異種中和。各被験体由来の多数の代表的なＥｎｖ偽型ウイルスに対する血漿サンプルをアッセイすることによって、自己および異種血漿サンプルにおける中和活性のチェッカーボードスタイルのデータセットを生成した。血漿供給が限定されていたため、１５人の被験体（１４のサブタイプＣおよび１つのＡ／Ｃ組換え体）由来の血漿サンプルに加えて１つのさらなる血漿サンプル（ＺＭ３８３）を用いて、これらの１５人の被験体由来の６０のＥｎｖ偽型ウイルスを用いて中和アッセイを実行することが可能であるのみであった。最尤系統樹分析に見られるように、ウイルス集団を代表する、各被験体由来の多数のｅｎｖ遺伝子（３〜６の範囲）を選択した（図７）。単系統ウイルスに関しては、３または４のｅｎｖ遺伝子を選択する一方、多数のＥｎｖ系譜を持つ個体において、各系譜から１〜３のｅｎｖ遺伝子を選択した。   Self and heterogeneous neutralization. A checkerboard style data set of neutralizing activity in autologous and heterologous plasma samples was generated by assaying plasma samples against a number of representative Env pseudotyped viruses from each subject. Due to the limited plasma supply, in addition to plasma samples from 15 subjects (14 subtypes C and 1 A / C recombinant), one additional plasma sample (ZM383) was used to It was only possible to perform a neutralization assay with 60 Env pseudotyped viruses from 15 subjects. As seen in the maximum likelihood phylogenetic tree analysis, a number of env genes (range 3-6) from each subject representing the virus population were selected (FIG. 7). For single strain viruses, 3 or 4 env genes were selected, while in individuals with multiple Env lineages, 1 to 3 env genes were selected from each lineage.

中和結果を図８に要約する。大部分のウイルス／血漿組み合わせ（７５％）は、２０〜３，７６９の中和力価で陽性であり、ここで、組み合わせのおよそ１／３は、＞１００の中和力価を生じた（図８）。１人の被験体（ＺＭ３８０）を除きすべてで、同時期血漿（すなわちＥｎｖと同じ時点で得られた血漿）による多様なレベルの自己ウイルス中和が検出された。大部分の場合で、中和強度は比較的低かった；が、７人の被験体（ＺＭ３７８、ＺＭ３７９、ＺＭ４０１、ＺＭ４０８、ＺＭ４１３、ＺＭ４１６およびＺＭ４１７）の自己ウイルス擬似種において、少なくとも１つの変異体に対して、＞１００の力価が検出された。いくつかの場合で、同じ被験体由来の多数のｅｎｖ遺伝子間で、実質的な相違が見られた。例えば、被験体ＺＭ４０８における多数のｅｎｖ変異体に対する自己中和の力価は、２４〜５９８の範囲であり、そして被験体ＺＭ４１６において、これらは３７〜４４９の範囲であった。   The neutralization results are summarized in FIG. Most virus / plasma combinations (75%) were positive with neutralization titers between 20 and 3,769, where approximately 1/3 of the combinations yielded> 100 neutralization titers ( FIG. 8). All but one subject (ZM380) detected varying levels of autoviral neutralization by concomitant plasma (ie, plasma obtained at the same time as Env). In most cases, the neutralization intensity was relatively low; but in at least one variant in the autoviral pseudospecies of 7 subjects (ZM378, ZM379, ZM401, ZM408, ZM413, ZM416 and ZM417) In contrast, a titer of> 100 was detected. In some cases, substantial differences were seen between multiple env genes from the same subject. For example, the titer of autoneutralization against a number of env variants in subject ZM408 ranged from 24 to 598, and in subject ZM416 these ranged from 37 to 449.

異種血漿によって、中和感受性に関して、すべてのＥｎｖ偽型ウイルスをアッセイした。ヒートマップ分析によって、血漿サンプルを、低い（Ｌ）および高い（Ｈ）中和強度群に分離した（図９）。血漿サンプルの統計的に支持されるクラスター化が観察され、特徴的な低活性クラスターを左側に囲む。全体として、７つの血漿サンプルは、限定された交差中和活性を有した。しかし、他の９つの血漿サンプルは、中程度から強度の交差反応性中和活性（図８および図９）を所持した。いくつかの血漿（ＺＭ４０８、ＺＭ３７８、ＺＭ３９５およびＺＭ３７９）は１５の感染個体由来の６０の偽ウイルスのほぼすべてを中和した。   All Env pseudotyped viruses were assayed for neutralization sensitivity by heterologous plasma. Plasma samples were separated into low (L) and high (H) neutralization strength groups by heat map analysis (FIG. 9). Statistically supported clustering of the plasma sample is observed, surrounding the characteristic low activity cluster on the left. Overall, seven plasma samples had limited cross-neutralizing activity. However, the other nine plasma samples possessed moderate to strong cross-reactive neutralizing activity (FIGS. 8 and 9). Some plasma (ZM408, ZM378, ZM395 and ZM379) neutralized almost all of the 60 pseudoviruses from 15 infected individuals.

中和シグネチャー分析。強力でそして交差反応性のＮａｂを含む血漿サンプルの同定によって、本発明者らは、これらの被験体由来のＥｎｖの間に、強力な中和活性に関連するシグネチャー配列が存在するかどうか疑問を抱いた。各血漿サンプルは個体あたり１つの値に相当するため、本発明者らはシグネチャー研究のため、個体内のすべての変異体のコンセンサス配列のみを用い、それによって、各被験体に見られる各位の最も共通のアミノ酸を捕捉した。本発明者らは、先に記載された最尤系統樹補正法［４４］を用いて、ヒートマップに示される２つの別個のクラスターに基づき、強いまたは弱いサブタイプＣ交差反応性中和反応のいずれかと関連するアミノ酸を探した（図９）。多数の試験課題があるため（Ｅｎｖのすべての部位に関して試験を行った）、本発明者らは、ｐ値の分布に基づいて、ｑ値を用いて、偽発見率を概算した［４５］。   Neutralization signature analysis. By identifying plasma samples containing strong and cross-reactive Nabs, we wondered if there is a signature sequence associated with strong neutralizing activity among Env from these subjects. embraced. Since each plasma sample corresponds to one value per individual, we use only the consensus sequence of all variants within the individual for signature studies, so that the highest of each position found in each subject. A common amino acid was captured. We have used the maximum likelihood phylogenetic correction method described previously [44] based on two separate clusters shown in the heat map for strong or weak subtype C cross-reactive neutralization reactions. Amino acids related to either were searched (FIG. 9). Due to the large number of testing challenges (tested on all sites of Env), we approximated the false discovery rate using q values based on the distribution of p values [45].

４つのシグネチャー部位が同定された：３つはｇｐ１２０中であり、そして１つはｇｐ４１中であった。各部位は０．０３のｐ値を有したが、０．２７のｑ値を有し；したがって、同定されたシグネチャーの１またはそれより多くが偽陽性であった可能性もある（図１０）。本発明者らは、これらが有意性に向かう最強の傾向を示したため、本明細書において、仮説を生じさせる様式で、これらを含めた。興味深いことに、４つのシグネチャー部位のうち３つがＶ４領域で見られた（３９３Ｇ、３９７Ｇ、および４１３Ｎ）。Ｖ４領域は、Ｃ３アルファ−２らせんドメインと関連して、サブタイプＣウイルスにおける中和感受性パターンに寄与すると考えられる［１８、４９、５０］（図１１）。第４のシグネチャーは、ｇｐ４１細胞質ドメインの末端で見られ、そして８５６位のリジン（Ｌ）からなった。最も興味深いシグネチャーは４１３Ｎ位であり、これは弱い反応を有するものに対して、特に強力な中和抗体を誘発する個体から単離されたエンベロープのマルチサブタイプ研究において、優れた血清学的Ｎａｂ幅と関連して独立に同定された、Ｎ連結グリコシル化部位シグネチャーの一部である（投稿準備中、ＳＧ、ＢＨ、ＦＧ、ＤＭおよびＢＫ）。したがって、より交差反応性のＮａｂを刺激するＥｎｖは、４１３位においてＡｓｎ（Ｎ）に突然変異している傾向があった。これらはまた、３９３位および３９７位でＧｌｙ（Ｇ）に向かう突然変異を有する傾向があったが、３９７位は非常に変動性である領域中にあり、信頼性を持って整列させるのが困難であった。   Four signature sites were identified: three in gp120 and one in gp41. Each site had a p value of 0.03 but a q value of 0.27; therefore, one or more of the identified signatures could have been false positives (FIG. 10). . We have included them in a manner that gives rise to hypotheses, as they showed the strongest trend towards significance. Interestingly, three of the four signature sites were found in the V4 region (393G, 397G, and 413N). The V4 region is thought to contribute to the neutralization sensitivity pattern in subtype C virus in association with the C3 alpha-2 helical domain [18, 49, 50] (FIG. 11). The fourth signature was found at the end of the gp41 cytoplasmic domain and consisted of lysine (L) at position 856. The most interesting signature is position 413N, which is superior to those with weak responses, especially in enveloped multi-subtype studies isolated from individuals that elicit strong neutralizing antibodies. Are part of an N-linked glycosylation site signature that was independently identified in relation to (SG, BH, FG, DM and BK in preparation for submission). Therefore, Env that stimulates more cross-reactive Nab tended to be mutated to Asn (N) at position 413. They also tended to have mutations at positions 393 and 397 towards Gly (G), but position 397 is in a region that is highly variable and difficult to align reliably Met.

興味深いことに、自己中和活性は、異種中和強度のＬ血漿群よりもＨ血漿群において、有意により高かった（ｐ＝０．００１６）（図１２）。言い換えると、異種ウイルスに対してより強い中和活性を所持する血漿は、同時期自己ウイルスをより強力に中和した。さらに、３９３位、３９７位、および４１３位は、単一の個体内で非常に可変性であることが見出され、これらの部位に対して、異なる感染において反復性の免疫圧があることが示された。総合すると、これらのデータは、Ｖ４ループにおけるシグネチャーパターンが、サブタイプＣウイルスに対する強力でそして交差反応性の中和抗体の刺激に重要でありうることを示唆する。   Interestingly, self-neutralizing activity was significantly higher in the H plasma group than in the L plasma group of different neutralizing strength (p = 0.016) (FIG. 12). In other words, plasma possessing stronger neutralizing activity against heterologous viruses more neutralized concomitant autoviruses. Furthermore, positions 393, 397, and 413 were found to be very variable within a single individual, and there may be repetitive immune pressure in these infections against these sites. Indicated. Taken together, these data suggest that the signature pattern in the V4 loop may be important for stimulation of strong and cross-reactive neutralizing antibodies against subtype C virus.

要約すると、本発明者らは、ＳＧＡおよびｐＰＣＲ法を用いて、３７人の個体各々において、多数のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子を特徴付けた。各個体におけるｅｎｖ遺伝子擬似種の配列および機能分析によって、ウイルスの多数の系譜、頻繁なクローン増殖、ウイルス負荷およびＥｎｖ偽ウイルスの感染性の間の正の相関に向かう傾向、ｅｎｖ遺伝子擬似種集団間の非常に多様な感染性、ならびに高レベルの中和活性を持つ血漿における配列のＶ４領域中のシグネチャーアミノ酸が示された。こうした中和シグネチャーの同定は、有効なＨＩＶ−１ワクチンの開発に関する意味を有しうる。   In summary, we characterized a number of HIV-1 env genes in each of 37 individuals using SGA and pPCR methods. Sequence and functional analysis of env gene pseudospecies in each individual tends to a positive correlation between multiple lineages of virus, frequent clonal growth, viral load and infectivity of Env pseudovirus, between env gene pseudospecies populations Signature amino acids in the V4 region of the sequence in plasma with a very diverse infectivity of as well as a high level of neutralizing activity. The identification of such neutralization signatures can have implications for the development of effective HIV-1 vaccines.

慢性ＨＩＶ−１感染に関して予期されるように、本明細書の本研究において、非常に多様なウイルス擬似種集団が検出された。被験体内ｅｎｖ遺伝子多様性は、この研究においては８％もの高さであった。本発明者らが最近確立したｐＰＣＲ法を用いて、本発明者らは、ＳＧＡ ＰＣＲ産物をクローニングすることなく、偽ウイルスを生成することによって、ＨＩＶ−１感染個体各々から、多数のｅｎｖ遺伝子の表現型的特性を特徴付け可能であった。３７人の個体由来の４７４のＥｎｖ偽ウイルスの感染性を分析すると、高い割合（８０％）のｅｎｖ遺伝子が機能性であることが明らかになった。これは、より少数のｅｎｖ遺伝子を用いた本発明者らの先の報告［３８］と一致するが、ＰＢＭＣからバルクＰＣＲによって特徴付けられたｅｎｖ遺伝子集団から報告される率（１０％）よりもはるかにより高い［２５］。率が異なるのは、ｅｎｖ遺伝子を得るのに用いた方法およびサンプル供給源が異なるためである可能性が高かった。機能分析によって、同じ個体由来のＥｎｖ偽ウイルスの感染性が大部分の個体において有意に多様である（１〜２対数）ことが示された。これは、１人の個体由来の血漿から得られたｅｎｖ遺伝子［５１］に類似であるが、同じ個体から均一の感染性を示す、ＰＢＭＣ由来ｅｎｖ遺伝子［２５］とは異なる。トランスフェクションされた細胞におけるＥｎｖタンパク質の検査によって、各個体中のＥｎｖ偽ウイルス間の感染性の変動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現レベルとは相関しないことが示された。損なわれていないｅｎｖオープンリーディングフレームがある場合、ｅｎｖ遺伝子の非機能性は、ウイルス粒子内への取り込み、またはターゲット細胞上のＣＤ４および共受容体との劣った相互作用に影響を及ぼす突然変異によって、引き起こされうる。興味深いことに、Ｅｎｖ偽ウイルスの感染性レベルおよびドナー被験体におけるウイルス負荷の間で、正の相関傾向が観察され、ｉｎ ｖｉｖｏで、より感染性であるｅｎｖ遺伝子が、高レベルのウイルス負荷を導きうることが示唆された。   As expected for chronic HIV-1 infection, a very diverse population of virus pseudospecies was detected in this study herein. In-vivo env gene diversity was as high as 8% in this study. Using the pPCR method we have recently established, we have generated a number of env genes from each HIV-1 infected individual by generating pseudoviruses without cloning SGA PCR products. It was possible to characterize phenotypic characteristics. Analysis of the infectivity of 474 Env pseudoviruses from 37 individuals revealed that a high percentage (80%) of the env gene was functional. This is consistent with our previous report with a smaller number of env genes [38] but more than the rate reported from the env gene population characterized by bulk PCR from PBMC (10%). Much higher [25]. The different rates were likely due to different methods and sample sources used to obtain the env gene. Functional analysis showed that the infectivity of Env pseudoviruses from the same individual is significantly diverse (1-2 log) in most individuals. This is similar to the env gene [51] obtained from plasma from one individual, but different from the PBMC-derived env gene [25], which shows uniform infectivity from the same individual. Examination of the Env protein in the transfected cells showed that the infectivity variation between Env pseudoviruses in each individual did not correlate with the in vitro expression level. If there is an intact env open reading frame, the non-functionality of the env gene is caused by mutations that affect uptake into the virion or poor interaction with CD4 and co-receptors on target cells. Can be caused. Interestingly, a positive correlation trend was observed between the infectivity level of Env pseudovirus and viral load in donor subjects, and the env gene that is more infectious in vivo leads to high levels of viral load. It was suggested that

３７人の個体のうち１３人（３５％）が擬似種ウイルス集団の間の緊密に関連する配列の１または２のクラスターを所持した。各個体にユニークであり、そして個体内で保存されるこれらの配列は、互いに同一であるかまたはほぼ同一であった。各配列は、ＳＧＡによって独立のＰＣＲから得られるため、これらはｉｎ ｖｉｖｏ由来の独立のウイルスゲノムに相当する。関連しているが、同一のまたはほぼ同一の配列から分岐し始めているｅｎｖ配列、ならびにこれらの保存されるセットおよびその個体由来のより多様なウイルスの間の組換え体によって、感染個体において、いくつかのウイルスのクローン増殖があることが示される。全体として、これらはウイルス集団の９〜３８％を占めた。いくつかのウイルス種のクローン増殖が、ＨＩＶ−１感染個体において、異なる組織で見られた［５２］。血漿におけるクローン増殖ウイルスの供給源が何かは明らかでない。クローン増殖ウイルスが、複製適合または免疫回避突然変異のため、利点を有する可能性がある。クローン増殖ウイルスは、主要なウイルス集団におけるウイルスのものとは異なるアミノ酸を含有するため、そしてこれらは他のウイルスと組換え可能であるため（図２Ｉ）、これらは、主な集団のウイルスによって誘発される免疫反応の回避に役割を果たす可能性もある。この仮説を試験するには、多数の時点のサンプルの長期的な研究が必要であろう。   Of the 37 individuals, 13 (35%) possessed one or two clusters of closely related sequences between the pseudospurious virus population. These sequences that are unique to each individual and conserved within the individual were identical or nearly identical to each other. Since each sequence is obtained from an independent PCR by SGA, they correspond to an independent viral genome derived in vivo. The number of env sequences that are related but are beginning to diverge from the same or nearly the same sequence, as well as recombinants between these conserved sets and more diverse viruses from that individual, It is shown that there is clonal growth of some viruses. Overall, these accounted for 9-38% of the virus population. Clonal growth of several viral species was seen in different tissues in HIV-1 infected individuals [52]. It is not clear what is the source of clonal propagation virus in plasma. Clonal propagated viruses may have advantages due to replication compatible or immune escape mutations. Because clonal propagation viruses contain different amino acids than those of viruses in the main virus population, and because they are recombinable with other viruses (FIG. 2I), they are induced by viruses of the main population It may also play a role in avoiding the immune response that occurs. Testing this hypothesis may require long-term studies of a number of time points.

自己および異種血漿サンプルを用いた、各個体由来の多数の代表的なｅｎｖ遺伝子を含むチェックボード中和データの分析によって、強力な中和血漿と関連する３アミノ酸のシグネチャーが明らかになった。ｇｐ１２０のＶ４ループ中のシグネチャー部位３９３および３９７と関連するグリシンは、いくつかの方式で抗体中和に影響を及ぼしうる。まず、側鎖に関連する静電電荷の喪失が、同族エピトープの静電ポテンシャルを調節することによって、抗体結合を妨害する可能性もある。第二に、側鎖を欠くため、グリシンはより高い柔軟性を示し、Ｖ４ループ中のコンホメーション運動に影響を及ぼす可能性もある。３９３位および３９７位のグリシンによる柔軟性およびより少ない電荷反発によって、Ｖ４が非常に多様なコンホメーションをサンプリングすることが可能になりうる。対照的に、シグネチャー４１３Ｎは、Ｎ連結グリコシル化を仲介し、そして立体障害によって潜在的にＶ４ループ運動を阻害することによって、役割を果たしうる。   Analysis of checkboard neutralization data containing a number of representative env genes from each individual using autologous and heterologous plasma samples revealed a signature of 3 amino acids associated with strong neutralizing plasma. Glycine associated with signature sites 393 and 397 in the V4 loop of gp120 can affect antibody neutralization in several ways. First, the loss of electrostatic charge associated with the side chain may interfere with antibody binding by modulating the electrostatic potential of the cognate epitope. Secondly, because of the lack of side chains, glycine is more flexible and may affect conformational movement in the V4 loop. The flexibility and less charge repulsion due to glycine at positions 393 and 397 may allow V4 to sample a very wide variety of conformations. In contrast, signature 413N may play a role by mediating N-linked glycosylation and potentially inhibiting V4 loop movement through steric hindrance.

部位４１３は、１７ｂおよびＣＣＲ５結合部位に近位であり、そして近位結合モチーフＲＩＫＱ（ＨＸＢ２残基４１９〜４２２）に隣接する。最近の糖ペプチド質量分析（ＭＳ）研究によって、Ｍ群コンセンサスＨＩＶ−１エンベロープ、ＣＯＮ−Ｓ ｇｐ１４０において、この部位でグリカンが実際に付着していることが見出された［５３］。高解像度法、オンライン高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ）およびオフラインＨＰＬＣ後のマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）の両方によって、潜在的なグリコシル化部位４１３が実際にグリコシル化されていることが決定された。しかし、この位のグリコシル化が、ｉｎ ｖｉｖｏでのより高いレベルの中和抗体力価の誘導とどのように関連しているかは不明である。この位は非常に可変性であり；実際、強い反応を誘発するのに必要であるのではなく、強い反応によって反対に選択される（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ）ため、グリコシル化部位が、強力な中和活性と関連するＥｎｖにおいて濃縮される可能性もある。   Site 413 is proximal to the 17b and CCR5 binding sites and is adjacent to the proximal binding motif RIKQ (HXB2 residues 419-422). Recent glycopeptide mass spectrometry (MS) studies found that glycans were actually attached at this site in the M group consensus HIV-1 envelope, CON-S gp140 [53]. Potential glycosylation by both high resolution methods, online high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (HPLC / ESI-MS) and matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) after offline HPLC It was determined that site 413 was indeed glycosylated. However, it is unclear how this level of glycosylation is associated with the induction of higher levels of neutralizing antibody titers in vivo. This position is very variable; in fact, it is not necessary to elicit a strong response, but is selected against by a strong response, so that the glycosylation site has a strong neutralizing activity. It may also be enriched in Env associated with

最近の研究において、５つのサブタイプＢおよび５つのＣサブタイプウイルスのパネルに対して、３６の血清を用いて、サブタイプＣ血清において中和シグネチャーが調べられた［２０］。シグネチャーパターンの追跡を可能にする、血清学的パターンの明らかなクラスター化は見出されなかった。しかし、Ｖ１〜Ｖ４ループの長さおよび交差サブタイプ中和能力の間の相関が観察された。本研究において、本発明者らは、ウィルコクソン順位統計を用いて、高いおよび低い中和血漿によってグループ化された各個体由来のコンセンサスＥｎｖの長さを比較することによって、Ｖ１〜Ｖ４の全長またはＶ１、Ｖ２、およびＶ４の長さを別個に比較した際、こうした相関に関する証拠を発見しなかった。これは単に、サンプルの数がこの効果を示すには不足していたためである可能性もある。他の可能性は、本研究におけるすべてのサンプルが、免疫回避の発展中に、可変ループの長さがすでに長くなっているＣＨＩ個体由来のものであることである。   In a recent study, neutralization signatures were examined in subtype C sera using 36 sera against a panel of 5 subtype B and 5 C subtype viruses [20]. No apparent clustering of serological patterns was found that allowed the tracking of signature patterns. However, a correlation was observed between V1-V4 loop length and cross-subtype neutralizing ability. In this study, we used Wilcoxon rank statistics to compare the length of V1-V4 or V1 by comparing the length of consensus Env from each individual grouped by high and low neutralized plasma. When comparing the lengths of V, V2 and V4 separately, we found no evidence for such a correlation. This may simply be because the number of samples was insufficient to show this effect. Another possibility is that all samples in this study are from CHI individuals whose variable loop length has already increased during the development of immune evasion.

先の研究はまた、アルファ−２らせんが強い選択圧の下にあることを示し［５０］、そしてこの領域がサブタイプＣウイルスの自己中和に対する耐性と関連することが見出された［４９］。Ｖ４領域は、アルファ−２らせんのすぐ下流であり、そしてこれらは構造的に互いに近い。Ｃ３Ｖ４領域が、自己および異種Ｎａｂの誘導に関与する可能性があることもまた見出された［１８］。新規に同定された３つのシグネチャーアミノ酸は、Ｎａｂによってターゲティングされる先に報告された領域の近位に位置し、三次構造がサブタイプＣウイルスに対するＮａｂの誘導に重要な役割を果たしうることが示唆される。この潜在的なシグネチャーの同定は、少なくとも、世界中に最も蔓延しているＨＩＶ−１サブタイプであるサブタイプＣに対する、強力で、そして広く反応性であるＮａｂを誘発する新世代Ｅｎｖ免疫原の設計を補助しうる。   Previous studies have also shown that the alpha-2 helix is under strong selective pressure [50], and this region was found to be associated with resistance to subtype C virus self-neutralization [49] ]. The V4 region is immediately downstream of the alpha-2 helix and they are structurally close to each other. It was also found that the C3V4 region may be involved in the induction of self and heterologous Nabs [18]. Three newly identified signature amino acids are located proximal to the previously reported region targeted by Nab, suggesting that tertiary structure may play an important role in the induction of Nab against subtype C virus Is done. The identification of this potential signature is a new generation of Env immunogens that induces Nab that is potent and broadly reactive, at least against subtype C, the most prevalent HIV-1 subtype worldwide. Can assist with design.

参考文献   References

表
表１．ＨＩＶ−１感染個体由来のＳＧＡおよび機能性ｅｎｖ遺伝子の要約 Table Table 1. Summary of SGA and functional env genes from HIV-1 infected individuals

表２．ＨＩＶ−１感染個体におけるクローン増殖ｅｎｖ配列の特徴付け   Table 2. Characterization of clonal expansion env sequences in HIV-1 infected individuals

注：＊停止コドン；Ｉ−系統樹クラスターＩ；ＩＩ−系統樹クラスターＩＩ
本明細書に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。 Notes: * Stop codon; I-phylogenetic cluster I; II-phylogenetic cluster II
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Claims (14)

ＺＭ３７８、ＺＭ３７９、ＺＭ３９５、ＺＭ４０１、ＺＭ４０５、ＺＭ４０８、ＺＭ４１５、ＺＭ４１６、およびＺＭ４１７のシグネチャーアミノ酸を含む、ＨＩＶエンベロープタンパク質。   An HIV envelope protein comprising signature amino acids of ZM378, ZM379, ZM395, ZM401, ZM405, ZM408, ZM415, ZM416, and ZM417. ＺＭ３７８のシグネチャーアミノ酸を含む、請求項１記載のタンパク質。   2. The protein of claim 1 comprising the signature amino acid of ZM378. ｇｐ１６０またはｇｐ１４０タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。   2. The protein of claim 1 which is a gp160 or gp140 protein. 図１０に示すＺＭ３７８のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のタンパク質。   The protein according to claim 1, comprising the amino acid sequence of ZM378 shown in FIG. 請求項１記載のタンパク質をコードする単離された核酸。   An isolated nucleic acid encoding the protein of claim 1. ベクター中に存在する、請求項５記載の核酸。   6. The nucleic acid of claim 5, present in a vector. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項６記載の核酸。   The nucleic acid according to claim 6, wherein the vector is a viral vector. 請求項１記載のタンパク質若しくは請求項５記載の核酸およびキャリアーを含む、組成物。   A composition comprising the protein of claim 1 or the nucleic acid of claim 5 and a carrier. アジュバントをさらに含む、請求項８記載の組成物。   9. The composition of claim 8, further comprising an adjuvant. 哺乳動物において、免疫反応を誘導する方法であって、請求項１記載の前記タンパク質または請求項５記載の前記核酸を、前記反応を誘導するのに十分な量で、前記哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。   A method for inducing an immune response in a mammal, comprising administering the protein of claim 1 or the nucleic acid of claim 5 to the mammal in an amount sufficient to induce the response. Said method. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１０記載の方法。   The method of claim 10, wherein the mammal is a human. 請求項１記載の前記タンパク質に特異的な単離された抗体、またはその抗原結合性断片。   An isolated antibody specific for the protein of claim 1 or an antigen-binding fragment thereof. ＨＩＶ−１による哺乳動物細胞の感染を阻害する方法であって、請求項１２記載の前記抗体または前記のその断片と前記細胞を、前記阻害が達成される条件下で接触させる工程を含む、前記方法。   13. A method of inhibiting infection of mammalian cells with HIV-1, comprising contacting the cells with the antibody or fragment thereof according to claim 12 under conditions that achieve the inhibition. Method. 前記細胞がヒト細胞である、請求項１３記載の方法。   14. The method of claim 13, wherein the cell is a human cell.
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