JP2013525496A

JP2013525496A - ヒトｃｄ８＋ｔ細胞の樹状細胞免疫受容体（ｄｃｉｒ）媒介クロスプライミング

Info

Publication number: JP2013525496A
Application number: JP2013509233A
Authority: JP
Inventors: ジャックエフ．バンチェレイア; イナーヴクレシェヴスキー; ジェラルドズラウスキ; サンドラズラウスキ
Original assignee: Baylor Research Institute
Current assignee: Baylor Research Institute
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2013-06-20
Also published as: KR20130036246A; US20110274653A1; EP2566518A1; CA2798616A1; TW201200150A; WO2011140255A1; EP2566518A4; AR081462A1; CN103153338A; RU2012152828A; MX2012012833A; BR112012028522A2

Abstract

強力な交差提示を媒介するＩＴＩＭモチーフ含有ＤＣ免疫受容体（ＤＣＩＲ）を含む免疫賦活組成物及び方法が、本明細書に記載されている。本発明者らは、様々なレクチン受容体を介した樹状細胞（ＤＣ）に対する抗原の標的化によって生起されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した。低用量の抗ＤＣＩＲ−抗原コンジュゲートに１回曝露すると、エキソビボで生成したＤＣ、皮膚で単離したランゲルハンス細胞並びに血液ｍＤＣ及びｐＤＣを包含する全ヒトＤＣサブセットによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を生起させた。ＦｌｕＭＰ、ＭＡＲＴ−１、ウイルス（ＨＩＶｇａｇ）等のような抗原が、ＤＣＩＲによりＤＣへと送達されると、遊離型抗原若しくは対照ｍＡｂとコンジュゲートした抗原により誘導される、又は別のレクチン受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮにより送達される応答と比較して、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強が観察された。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７／８アゴニストの添加は、ＤＣＩＲ媒介***差提示並びに交差刺激を増強した。このように、ヒトＤＣＩＲ受容体による抗原標的化は、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の活性化を可能にする。

Description

本発明は、概して免疫学の分野に関し、より詳細には、強力なクロスプレゼンテーション（crosspresentation）を媒介するヒト樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）による抗原標的化に関する。

本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を、ワクチン及び抗原提示における有効性増加を包含する免疫賦活方法及び組成物に関連して説明する。

免疫賦活の組み合わせの一例は、Noelle et al. 2008発行の米国特許第７，３８７，２７１号明細書に教示されている。Noelleの発明は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、ＣＤ４０と直接的に結合する少なくとも１種類のＣＤ４０アゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む、免疫療法を必要とするヒト対象への投与に適した免疫賦活組成物について開示する。Noelleの発明に記載されているＴＬＲアゴニスト及びＣＤ４０アゴニストは、免疫療法を必要とするヒト対象に投与すると、もう一方と組み合わせたときに、抗原に対する免疫応答の相乗的増加を生じるのに有効となるような量でそれぞれ存在する。

米国特許出願公開第２００８０２６７９８４号明細書（Banchereau et al. 2008）は、免疫細胞におけるＬＯＸ−１受容体を標的化するための組成物及び方法並びに抗ＬＯＸ−１抗体の使用を開示する。Banchereauの発明は、抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を標的化及び使用するための新規組成物及び方法を包含し、その生物学的機能を特徴づけた。抗ＬＯＸ−１ｍＡｂ及びその断片は、免疫細胞の標的化、特性評価及び活性化に有用である。

米国特許出願公開第２００８０２４１１７０号明細書（Zurawski and Banchereau, 2008）は、抗原が付着して抗体−抗原コンジュゲートを形成するＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を用いて、抗原提示の有効性を増加させるための組成物及び方法を包含し、該抗原は、該抗体−抗原コンジュゲートと接触した樹状細胞によりプロセシングされて提示される。

最後に、Deluciaにより出願された米国特許出願公開第２００８０２４１１３９号明細書は、微生物ＴＬＲアゴニストと、ＣＤ４０又は４−１ＢＢアゴニストとを含み、抗原を含んでいてもよいアジュバント組み合わせと、細胞免疫の相乗的な増強を誘導するためのその使用に関する。即ち、この出願は、ウイルス、細菌若しくは酵母全体又は膜、スフェロプラスト、細胞質体若しくは赤血球ゴースト等、それらの一部等、少なくとも１種類の微生物ＴＬＲアゴニストと、ＣＤ４０又は４−１ＢＢアゴニストとを含み、抗原を含んでいてもよいアジュバント組み合わせを教示するものであり、全３成分が別個であっても、同じ組換え微生物又はウイルスを含んでいてもよいアジュバント組み合わせが開示されている。癌やＨＩＶ感染症等、様々な慢性疾患の治療のためのこれら免疫アジュバントの使用も提供されている。

本発明者らにより、樹状細胞に付着した抗原を含むワクチンが以前に記載されている。米国特許出願公開第２０１００１３５９９４号明細書（Banchereau et al. 2009）は、最大化されたＧａｇ及びＮｅｆの樹状細胞に対する標的化に基づくＨＩＶワクチンを開示する。１又は２以上のタンパク分解部位を排除することによりタンパク分解に対する感受性が低くなるよう工学的に作製されたＧａｇ抗原が付着して抗体−抗原コンジュゲートを形成した、ＤＣ特異的抗体又はその断片を単離及び精製し、抗体−抗原コンジュゲートがプロセシングされＴ細胞認識のために提示される条件下で抗原提示細胞と接触させることにより、抗原提示細胞による抗原提示の有効性が増加された。抗原提示細胞は樹状細胞を含み、ＤＣ特異的抗体又はその断片は、コヘリン（Coherin）／ドッケリン（Dockerin）ペアの片方と結合している、或いはＤＣ特異的抗体又はその断片は、コヘリン／ドッケリンペアの片方と結合し、工学的に作製されたＧａｇ抗原は、該コヘリン／ドッケリンペアの相補的な片割れと結合して、コンジュゲートを形成する。米国特許出願公開第２０１１００８１３４３号明細書（Banchereau et al. 2009）において、本発明者らは、高親和性抗ランゲリンモノクローナル抗体及びその融合タンパク質を用いて抗原を標的化し、抗原提示のためにランゲルハンス細胞へと送達するための組成物及び方法についても記載した。

米国特許第７，３８７，２７１号明細書米国特許出願公開第２００８０２６７９８４号明細書米国特許出願公開第２００８０２４１１７０号明細書米国特許出願公開第２００８０２４１１３９号明細書米国特許出願公開第２０１００１３５９９４号明細書米国特許出願公開第２０１１００８１３４３号明細書

本発明は、強力なクロスプレゼンテーションを媒介するＩＴＩＭモチーフ含有ＤＣ免疫受容体（ＤＣＩＲ）を含む免疫賦活組成物及び方法について記載する。第一の実施形態において、本発明は、ヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生起（generating）させるための免疫賦活組成物であって、免疫応答、予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせが望ましい疾患又は状態に関係又は関与する１又は２以上の抗原の１又は２以上のエピトープを代表する１又は２以上の抗原ペプチドをロード（load）又は化学的にカップリングした、１又は２以上の抗樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、薬学的に許容される担体とを含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、免疫賦活を必要とするヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために前記免疫応答を生じさせる（produce）のに有効となるような量でそれぞれ含まれる組成物を提供する。本明細書における組成物は、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される作用物質を含んでいてもよい。

一態様において、抗ＤＣ特異的抗体又は断片は、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン（Langerin）、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される。別の一態様において、抗ＤＣ特異的抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である。別の一態様において、ＤＣＩＲは、免疫受容体のチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。

本発明の組成物において用いられる抗原ペプチドは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ（KLQCVDLHV）四量体（配列番号１０）、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）四量体（配列番号１）及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム（C. thermocellum）由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原又はそれらの組み合わせ及び改変物を含む。抗原ペプチドは、癌ペプチドを含むこともでき、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸部、子宮、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌等の尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍又は***、上咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病由来の抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される。

さらに別の一態様において、ＤＣ特異的抗体はヒト化され、組成物は、経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は注射（皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内又は静脈内）としてヒト又は動物対象へと投与される。

一実施形態において、本発明は、１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングした１又は２以上の抗樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントとを含み、前記抗体及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、ヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチンについて記載する。本発明のワクチンは、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む。

一態様において、抗ＤＣ特異的抗体又は断片は、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される。別の一態様において、抗ＤＣ特異的抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である。別の一態様において、抗原ペプチドは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ（KLQCVDLHV）四量体（配列番号１０）、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）四量体（配列番号１）及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原又はそれらの組み合わせ及び改変物を含む。さらに別の一態様において、抗原ペプチドは、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原を含む癌ペプチドである。ワクチン組成物の特定の態様において、ＤＣ特異的抗体はヒト化され、組成物は、経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は注射としてヒト又は動物対象へと投与される。

別の一実施形態において、本発明は、抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増加させるための方法であって、（ｉ）１又は２以上の樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップと、（ii）１又は２以上の天然型又は工学的に作製された抗原ペプチドを前記ＤＣ特異的抗体にロード又は化学的にカップリングして、抗体−抗原コンジュゲートを形成するステップと、（iii）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを、前記コンジュゲートに添加するステップと、（iv）抗原提示細胞を前記コンジュゲート及び前記ＴＬＲアゴニストと接触させるステップとを含み、前記抗体−抗原コンジュゲートがプロセシングされ、Ｔ細胞認識のために提示される方法を開示する。

上述の方法は、（ｉ）抗原提示細胞を接触させるステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、抗体−抗原コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加する任意選択のステップと、（ii）ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定する任意選択のステップとを含み、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化は、前記抗原提示細胞による抗原提示の有効性の増加を示す。

一態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）を含む。別の一態様において、抗ＤＣ特異的抗体又はその断片は、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１及びＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される。別の一態様において、抗ＤＣ特異的抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である。さらに別の一態様において、抗原ペプチドは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ（KLQCVDLHV）四量体（配列番号１０）、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）四量体（配列番号１）及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原若しくはそれらの組み合わせ及び改変物、又はＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原を含む癌ペプチドを含む。特定の一態様において、ＤＣ特異的抗体はヒト化されている。

さらに別の一実施形態は、１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントとを含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、それを必要とするヒト又は動物対象において１又は２以上の疾患又は状態に対する予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチンについて記載する。上文に記載されているワクチンは、ヒト対象におけるインフルエンザ、ＨＩＶ、癌及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせにおける使用に適合される。上文に記載されているワクチンに関係する態様において、１又は２以上の抗原ペプチドは、ＦｌｕＭＰペプチド（配列番号１）、配列番号２を含むＭＡＲＴ−１ペプチド及びＨＩＶｇａｇｐ２４ペプチド（配列番号３）である。

一態様において、本ワクチンは、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む。別の一態様において、ワクチンは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片をさらに含む。

本発明は、ヒト対象における１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせのための方法であって、１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせを必要とするヒト対象を同定するステップと、（ｉ）前記予防法、治療法又はその両方が望ましい前記１又は２以上の疾患又は状態に関係又は関与する１又は２以上の抗原の１又は２以上のエピトープを代表する１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む、抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、（ii）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、（iii）１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントとを含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、前記ヒト対象において前記１又は２以上の疾患又は状態に対する前記予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチン組成物を投与するステップとを含む方法をさらに開示する。

上文に開示されている方法によって治療される１又は２以上の疾患又は状態は、インフルエンザ、癌、ＨＩＶ又はそれらのいかなる組み合わせをも含み、癌は、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸部、子宮、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌等の尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍又は***、上咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病からなる群から選択される。

一態様において、本ワクチンは、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む。別の一態様において、ワクチンは、経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は注射としてヒト対象に投与される。さらに別の一態様において、ワクチンは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片をさらに含む。上文の方法に記載されているワクチンと関係する態様において、１又は２以上の抗原ペプチドは、ＦｌｕＭＰペプチド（配列番号１）、配列番号２を含むＭＡＲＴ−１ペプチド及びＨＩＶｇａｇｐ２４ペプチド（配列番号３）である。

本発明は、また、ヒト対象において１又は２以上の樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示の有効性を増加させるための方法であって、１又は２以上のＤＣをヒトから単離するステップと、前記単離されたＤＣを、１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む活性化量の組成物又はワクチンに曝露して、活性化されたＤＣコンジュゲートを形成するステップと、前記活性化されたＤＣコンジュゲートを前記ヒト対象へと再導入するステップとを含む方法を提供する。その方法は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定するステップであって、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化が、１又は２以上のＤＣの有効性の増加を示す任意選択のステップと、ＤＣを曝露するステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加する任意選択のステップをさらに含む。

一態様において、本方法は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される１又は２以上の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片を添加するステップをさらに含む。本方法の別の一態様において、抗原ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、１又は２以上の癌ペプチド及び腫瘍関連抗原又はその両方を含む。

本発明は、１又は２以上の樹状細胞（ＤＣ）の活性化により、１又は２以上のウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原虫性、寄生虫性疾患及びアレルギー性障害に対する予防法、治療法又はそれらの組み合わせのためにヒト対象に免疫賦活をもたらす方法であって、（ｉ）ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原虫性、寄生虫性疾患及びアレルギー性障害に対する予防法、治療法又はそれらの組み合わせのために免疫賦活を必要とするヒト対象を同定するステップと、（ii）前記ヒト対象から１又は２以上のＤＣを単離するステップと、（iii）前記単離されたＤＣを、１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む活性化量の組成物又はワクチンに曝露して、活性化されたＤＣコンジュゲートを形成するステップと、（iv）前記活性化されたＤＣコンジュゲートを前記ヒト対象へと再導入するステップとを含む方法をさらに提供する。免疫賦活方法は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定する任意選択のステップをさらに含み、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化は、免疫賦活を示す。

一態様において、本方法は、ＤＣを曝露するステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加するステップをさらに含む。

別の一態様において、本方法は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される、１又は２以上の任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片を添加するステップをさらに含む。

抗原ペプチドは、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ及びその他の百日咳細菌性抗原コンポーネント、ジフテリア細菌性抗原、ジフテリア毒素又はトキソイドその他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント、破傷風細菌性抗原、破傷風毒素又はトキソイドその他の破傷風細菌性抗原コンポーネント、連鎖球菌細菌性抗原、グラム陰性桿菌細菌性抗原、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）細菌性抗原、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌性抗原コンポーネント、肺炎球菌細菌性抗原、インフルエンザ菌（haemophilus influenza）細菌性抗原、炭疽菌細菌性抗原及びリケッチア細菌性抗原から選択される細菌性抗原、カンジダ真菌性抗原コンポーネント、ヒストプラズマ真菌性抗原、クリプトコッカス真菌性抗原、コクシジオイデス（coccidiodes）真菌性抗原及び白癬真菌性抗原から選択される真菌性抗原、熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期（blood-stage）抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、トキソプラズマ、住血吸虫（schistosomae）抗原、森林型熱帯リーシュマニア（leishmania major）及びその他のリーシュマニア（leishmaniae）抗原、及びトリパノソーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原から選択される原虫性及び寄生虫性抗原、糖尿病、真性糖尿病、関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎及び間質性肺線維症から選択される自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原並びにスギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原、動物由来抗原、イエダニ抗原、ネコ抗原、組織適合性（histocompatiblity）抗原及びペニシリンその他の治療薬から選択されるアレルギー性障害に関与する抗原を含むことができる。さらに別の一態様において、ＤＣ特異的抗体はヒト化されている。

本発明の特色及び利点のより完全な理解のため、次に、添付の図面と併せて本発明の詳細な説明を記す。
ＤＣＩＲの細胞分布を示す図である：（図１Ａ）末梢血単核細胞におけるＤＣＩＲ発現のフローサイトメトリー解析。循環単核細胞を１０μｇ／ｍｌの抗ＤＣＩＲｍＡｂ、続いてＰＥをコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。ＦＩＴＣをコンジュゲートした抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８（リンパ球のため）、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ５６（ＮＫ細胞のため）、抗ＣＤ１４ｍＡｂ（単球のため）と共に、或いは抗ＣＤ１１ｃ、抗ＨＬＡ−ＤＲ及び抗ＣＤ１２３ｍＡｂ（ｐＤＣ又はｍＤＣのため）と共に細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。提示されているデータは、３名の異なるドナーにおいて行われた３回の独立したランの代表例である。（図１Ｂ）皮膚由来のＤＣサブセット、表皮ＬＣ、真皮ＣＤ１ａ^＋ＤＣ及び真皮ＣＤ１４^＋ＤＣにおけるフローサイトメトリーによるＤＣＩＲの発現解析。（図１Ｃ）ヒト表皮シートを抗ＤＣＩＲで染色し、蛍光顕微鏡により解析し、ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＬＣにおけるＤＣＩＲの発現を明らかにした。（図１Ｄ）フローサイトメトリーによるＣＤ３４^＋由来のＤＣサブセット、ＣＤ１ａ^＋ＬＣ及びＣＤ１４^＋ＤＣにおけるＤＣＩＲの発現解析。Ｉ：標的抗原ＦｌｕＭＰと架橋したマウスＩｇＧ１の線図、II〜III：ｃｏｈ．抗原とコンジュゲートしたキメラｍＡｂ（ＩｇＧ４）．ｄｏｃの線図（ＦｌｕＭＰ（II）又はＭＡＲＴ−１（III））、IV〜Ｖ：キメラ融合ｍＡｂＩｇＧ４−抗原の線図（ＨＩＶｇａｇＭＡＲＴ−１（IV）又はｐ２４（Ｖ））を示す図である。抗ＤＣＩＲコンジュゲートｍＡｂによるＦｌｕＭＰタンパク質のクロスプレゼンテーションを示す図である：（図２Ｂ）化学的架橋した抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰ、架橋した対照ＩｇＧ−ＦｌｕＭＰタンパク質又は遊離型ＦｌｕＭＰと共に培養したＣＤ１ａ^＋ＬＣによる、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＦｌｕＭＰのクロスプレゼンテーションの増強。ドットプロットは、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を示す。データは、３回の独立した試験の代表例である。（図２Ｃ）架橋したｍＡｂ−ＦｌｕＭＰコンストラクト又は遊離型ＦｌｕＭＰの減少濃度による標的化に応答した、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。グラフは、２回複製の平均値を示す。標的化タンパク質のＤＣＩＲｍＡｂへの工学的作製及び特性評価を示す図である：（図２Ｄ）マウス抗ＤＣＩＲｍＡｂ（クローン９Ｅ８及び２４Ａ５）、キメラマウス／ヒト抗ＤＣＩＲ（ＩｇＧ４）及びドッケリンドメインと融合した対照ＩｇＧ４（ｍＡｂ．Ｄｏｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル。コヒーシンドメインと融合したＦｌｕＭＰ及びＭＡＲＴ−１（ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ及びｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１）、並びに融合タンパク質抗ＤＣＩＲ−ｐ２４及び対照ＩｇＧ４−ｐ２４。ゲルをクーマシーブルー（comassee blue）で染色した。タンパク質の分子量は、図面の左に表示されている。（図２Ｅ）抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂと単球由来のＤＣとの結合解析。５０ｎＭのビオチン化抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰ及び対照ＩｇＧ４−ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより、６日目の未熟ＧＭ−ＩＬ４ＤＣを処理した。フィコエリトリンをコンジュゲートしたストレプトアビジンによりコンジュゲートを検出した。抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂはＤＣと結合し（黒ヒストグラム）、一方、その対照コンジュゲートｍＡｂはＤＣと結合しなかった（灰色ヒストグラム）。パルスなし（対照ＤＣ、灰色ヒストグラム）又は５０ｎＭＤＣＩＲ標的化ＦｌｕＭＰによるパルスありのＣＤ３４^＋由来のＤＣにおける、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰコンジュゲートの染色を表す図である。５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０ｍＡｂ（１２Ｅ１２、Baylor Research Institute；ＢＩＩＲ）により細胞を活性化し、２４時間後にＰＥで標識した四量体化抗ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰＦａｂ（Ｍ１Ｄ１２）により染色した（Noy R, Eppel M, Haus-Cohen M, et al. T-cell receptor-like antibodies: novel reagents for clinical cancer immunology and immunotherapy. Expert Rev Anticancer Ther. 2005;5:523-536）。８ｎＭ（上パネル）又は０．８ｎＭ（下パネル）の抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂと共に培養した自己ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ＣＤ３４^＋由来のＬＣによる、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＦｌｕＭＰのクロスプレゼンテーションを示す図である。ドットプロットは、１０日後のＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を示す。８ｎＭ抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又は対照ＩｇＧ２ａ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより１８時間パルスされたＤＣによって誘導し、洗浄し、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に１０日間培養した、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率のグラフ表示の図である。グラフは、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞、平均値±ｓｄ、Ｎ＝３の比率を示す。ＤＣＩＲが、ＬＣによるタンパク質のクロスプレゼンテーションを可能にすることを示す図である：（図３Ａ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られた皮膚由来のＬＣを、それぞれ８ｎＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂで標的化し、ＣＤ４０Ｌにより成熟化し、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体染色により評価した。データは、２名の異なるドナーから得られた細胞により行われた２回の独立した実験の代表例である。（図３Ｂ）Luminexにより測定した、抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより標的化した自己皮膚ＬＣにより１０日間増殖させたＣＤ８^＋Ｔ細胞の培養上清におけるＩＦＮ−γレベル。グラフは、平均値±ｓｄ、Ｎ＝３を示す。ＤＣＩＲが、血液ＤＣ全サブセットに対する網羅的な標的であることを示す図である：（図４Ａ）ＨＬＡ−Ａ２０１ドナーから得られた血液由来のｍＤＣを、それぞれ８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（クローン２４Ａ５）、ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂ又は遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰにより標的化し、ＣＤ４０Ｌにより成熟化し、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体染色により評価した。データは、３回の独立した試験の代表例である。（図４Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２０１ドナーから得られた血液由来のｐＤＣを、それぞれ８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（クローン２４Ａ５）、ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又は遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰにより標的化し、ＣＤ４０Ｌにより成熟化し、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、Ｔ細胞増殖を特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体染色により評価した。データは、３回の独立した試験の代表例である。（図４Ｃ）８ｎＭＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより標的化されたｍＤＣ又はｐＤＣにより誘導されたＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ。グラフは、２種の異なるＤＣＩＲｍＡｂクローンを用いた３回の独立した試験の結果を示す。ｐ＝０．０２。抗ＤＣＩＲ融合ｍＡｂによるＭａｒｔ−１及びＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質のクロスプライミングを示す図である：（図５Ａ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られた皮膚由来のＬＣを精製し、３０ｎＭ抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１コンジュゲートｍＡｂの存在下で自己精製Ｔ細胞と共に１０日間培養した。ＤＣをＣＤ４０Ｌにより活性化した。ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）四量体により測定した。（図５Ｂ）抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１（２５ｎＭ）融合タンパク質を用いて、単球由来のＩＦＮ−α ＤＣを標的化した。ＤＣをＣＤ４０Ｌにより活性化し、ナイーブ自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に培養した。１０日後、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来するペプチドをロードした新鮮ＤＣ又は対照として無ロードＤＣにより、細胞を２４時間再刺激した。プロットは、特異的ＭＡＲＴ−１ペプチドクラスターに応答してＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａを同時発現する、初回刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。（図５Ｃ）ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又は対照ＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質によりＣＤ３４^＋由来のＬＣを標的化し、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に９日間培養した。グラフは、フローサイトメトリーによる、培養の終わりに解析されたグランザイムＢ及びパーフォリンを同時発現する細胞のパーセンテージを示す。（図５Ｄ）抗ＤＣＩＲ−ｐ２４又は対照ＩｇＧ４−ｐ２４（２５ｎＭ）融合タンパク質を用いて、ＣＤ３４^＋由来のＬＣを標的化した。ＤＣをＣＤ４０Ｌにより活性化し、ナイーブ自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に培養した。２回連続した刺激の後、増殖細胞を選別し、新鮮ＬＣ及びＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質により２４時間再刺激して、LuminexによりＩＦＮ−γ分泌を評価した。タンパク質なしによる細胞は対照とした。数値は２回複製の平均である。データは、２回の独立した試験の代表例である。ＴＬＲ７／８シグナル伝達が、ｍＤＣによるＤＣＩＲ媒介性二次ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を増強することを示す図である：（図６Ａ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られた血液由来のｍＤＣを、１２ｎＭ、２ｎＭ又は２００ｐＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより標的化し、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４又はＴＬＲ７／８アゴニスト（ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ又はＣＬ０７５）のいずれかにより活性化し、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に１０日間共培養した。グラフは、各量の抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂに対する特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体により、また検査した各ＤＣ活性化因子により測定したＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。活性化なしのＤＣは、対照として用いた（活性化なし（−−）、ＴＬＲ７／８アゴニスト（◆）、ＴＬＲ３アゴニスト（＊）、ＴＬＲ４アゴニスト（○）；それぞれＣＬ０７５、ポリＩ：Ｃ及びＬＰＳ）。データは、４名の異なるドナーによる４回の独立した実験の代表例である。グラフは、平均値±ｓ．ｄ、Ｎ＝３を示す。（図６Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られた血液由来のｍＤＣが、８ｎＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂにより標的化された、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４アゴニスト（それぞれＣＬ０７５、ポリＩ：Ｃ及びＬＰＳ）のいずれかにより活性化され、自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と１０日間共培養されたことを示す図である。グラフは、特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体により測定されたＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。グラフに表示されている条件は、活性化なし、ＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）である。グラフは、平均値±ｓ．ｄ、Ｎ＝３を示す。（図６Ｃ）図６Ｂと同一の試験。グラフは、特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体により測定したＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の平均値パーセンテージを示す。グラフに表示されている条件は、活性化なし、ＣＬ０７５（０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（５μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）である。ＴＬＲ７／８シグナル伝達が、ｍＤＣによるＤＣＩＲ媒介性一次ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を増強することを示す図である：（図７Ａ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られたＩＦＮα−ＤＣを１７ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又は対照ＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質により標的化し、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（５μｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかにより活性化し、自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と１０日間共培養した。ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）四量体により測定した。データは、２名の異なるドナーによる２回の独立した実験のものである。（図７Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られた血液由来のｍＤＣを３０ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質又は抗ＤＣＩＲ−ｐ２４により標的化し、ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲ７／８アゴニストのいずれかにより活性化し、自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と１０日間共培養した。上パネルは、抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質と共に培養し、ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲ７／８アゴニストのいずれかにより活性化した精製血液ｍＤＣにより増殖した、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）ペプチド四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を示す。下パネルは、抗ＤＣＩＲ−ｐ２４融合タンパク質により標的化され、ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲ７／８アゴニストのいずれかにより活性化した精製血液ｍＤＣにより増殖されたＨＬＡ−Ａ２０１−ＨＩＶｇａｇｐ２４（１５１〜１５９）ペプチド四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を示す。データは、２名の異なるドナーによる２回の独立した試験のものである。（図７Ｃ）細胞内エフェクター分子グランザイムＢ及びパーフォリンの発現を、１０ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質により標的化し、ＣＤ４０Ｌ、ＣＬ０７５又はＣＤ４０ＬとＣＬ０７５の組み合わせにより活性化したＩＦＮα−ＤＣにより初回刺激し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーにより評価したことを示す図である。対応するＨＬＡ−Ａ２０１四量体との共染色により、抗原特異的ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）陽性細胞における発現を解析した。データは、２回の独立した試験の代表例である。（図７Ｄ）ＣＤ４０Ｌ、ＴＬＲ７／８リガンド又はＣＤ４０ＬとＴＬＲ７／８リガンドの組み合わせにより活性化された抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１標的化ＤＣ、対照ＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１又は抗原なしにより増殖した後に、特異的ＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）四量体により測定された、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。各ドットは１回の試験を表す。（図７Ｅ）上パネル：ＩＦＮα−ＤＣを１７ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又は対照ＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質により標的化し、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかにより活性化し、自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する１５ｍｅｒ重複ペプチドをロードした新鮮ＤＣにより、細胞を再刺激した。プロットは、モネンシンの存在下で５時間刺激した後の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞による細胞質内ＩＦＮ−γのレベルを示す。下パネル：抗ＤＣＩＲ−ｐ２４又は対照ＩｇＧ４−ｐ２４融合タンパク質をモデル抗原として用いた。（図７Ｆ）ＩＦＮα−ＤＣを１１３ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質により標的化し、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）のいずれかにより活性化し、自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する１５ｍｅｒ重複ペプチドをロードした新鮮ＤＣにより細胞を再刺激した。２４時間後の培養上清におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０のレベルをLuminexにより測定した。グラフは、平均値±ｓ．ｄ、Ｎ＝３を示す。（図７Ｇ）ＩＦＮα−ＤＣを１０ｎＭの抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質により標的化し、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）若しくはＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）、又はＣＤ４０ＬとＣＬ０７５の組み合わせのいずれかにより活性化し、自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する１５ｍｅｒ重複ペプチドをロードした新鮮ＤＣ又は無ロードＤＣにより、細胞を再刺激した。プロットは、モネンシンの存在下で５時間刺激した後の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞による細胞質内ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのレベルを示す。抗ＤＣＩＲ抗体が、阻害シグナルをヒトＤＣへと送達できないことを示す図である：（図８Ａ及び図８Ｂ）ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下における、ＤＣＩＲをライゲーションしたＣＤ１ａ^＋ＬＣ又は対照ＣＤ１ａ^＋ＬＣの表面におけるＣＤ８６の発現を示す例示的なフローサイトメトリーデータ。（図８Ｃ）ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲ７／８アゴニストで２４時間活性化したＤＣＩＲ又は対照をライゲーションした皮膚ＤＣサブセットから得られた上清において、ＩＬ−６のLuminexアッセイを行った。２回の独立した試験のうち一方を示す。ＤＣＩＲライゲーションが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞初回刺激を阻害しないことを示す図である：（図９Ａ）ＤＣＩＲをライゲーションしたＤＣは、ＣＤ４０活性化あり又はなしにおける［^３Ｈ］−チミジン取り込みによって決定された通り、対照ＤＣと比較して類似レベルの同種異系ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を誘導する。グラフは、平均値±ｓ．ｄ、Ｎ＝３を示す。（図９Ｂ）ＤＣＩＲをライゲーションしたＤＣ（青線）又は対照ＤＣ（赤線）により初回刺激した同種異系ＣＤ８^＋Ｔ細胞における、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４又はＣＤ２８発現のフローサイトメトリー解析。（図９Ｃ）グラフは、同種異系ＤＣＩＲをライゲーションしたＤＣ又は対照ＤＣにより初回刺激した、活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０のレベルを示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ刺激に応答したサイトカインを測定し、２４時間後Luminexにより解析した。（図９Ｄ）フローサイトメトリー（右パネル）により評価した、ＤＣＩＲをライゲーションした又は対照ＭＡＲＴ−１ペプチドロードＬＣにより初回刺激したＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞における、エフェクター分子、グランザイムＡ、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現。データは、３回の独立した試験の代表例である。

本発明の様々な実施形態の実施及び使用を詳細に後述するが、本発明が、多種多様な特定の文脈において具体化され得る多くの適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書に記されている特定の実施形態は、本発明を実施及び使用する特定の仕方を単に例証するものであり、本発明の範囲を定めるものではない。

本発明の理解を容易にするため、多数の用語を下に定義する。本明細書に定義されている用語は、本発明に関連する分野の当業者に一般に理解されている意義を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」の用語は、単数形の構成要素のみを指すことを目的とせず、特定の例を例証のために用いてよいその一般分類を包含する。本明細書における用語法は、本発明の特定の実施形態を説明するために用いられるが、その用法は、特許請求の範囲に概略されている場合を除き本発明の範囲を定めない。

本発明はまた、抗体（又は「Ａｂ」）又はその断片のバリアント及び他の改変物、例えば、抗ＣＤ４０融合タンパク質を包含する（抗体は、用語「免疫グロブリン」と互換的に用いられる）。本明細書において、用語「抗体又はその断片」は、抗体全体又は抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ及び単鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）又は例えばＣＤ４０と特異的に結合する免疫グロブリンのいかなる生物学的に有効な断片も包含する。ヒト起源に由来する抗体又はヒト化抗体は、ヒトにおける免疫原性が低い又は免疫原性がなく、非ヒト抗体と比較して免疫原性エピトープの数が少ない又はない。一般に、ヒトにおける抗原性レベルの低下した又は抗原性がない抗体及びその断片が選択されるであろう。

本明細書において、用語「Ａｇ」又は「抗原」は、免疫グロブリン分子の抗原結合領域との結合、或いは主要組織適合抗原（ＭＨＣ）細胞タンパク質における抗原提示による免疫応答、例えばＴ細胞媒介性免疫応答の誘発のいずれかが可能な物質を指す。本明細書における「抗原」として、ペプチド、小分子、炭水化物、脂質、核酸又はそれらの組み合わせであってよい抗原決定基、ハプテン及び免疫原が挙げられるがこれらに限定されるものではない。熟練の免疫学者であれば、Ｔ細胞に対する提示のためにプロセシングされる抗原について記してある場合、用語「抗原」が、ＭＨＣによってＴ細胞受容体に対し提示されるＴ細胞エピトープである抗原の部分（例えば、ペプチド断片）を指すことを認識するであろう。「抗原」特異的な抗体の形態におけるＢ細胞媒介性免疫応答の文脈において用いる場合、抗体の可変ドメイン（軽及び重）の相補性決定領域と結合する抗原の部分である結合部分は、線状であっても三次元エピトープであってもよい。本発明の文脈において、用語「抗原」は、両方の文脈において用いられる。即ち、抗体は、タンパク質抗原（ＣＤ４０）特異的であるが、ＭＨＣによるＴ細胞に対する提示のための１又は２以上のペプチドエピトープも有する。場合により、本発明のワクチン又は融合タンパク質により送達された抗原は、内部移行し、提示の前に、抗原提示細胞により例えば、抗体又は融合タンパク質の１又は２以上の部分の開裂によりプロセシングされる。

本明細書において、用語「コンジュゲート」は、１又は２以上の標的化ドメインを有するタンパク質、例えば抗体と、少なくとも１種類の抗原、例えば小分子ペプチド又はタンパク質を指す。このようなコンジュゲートは、融合タンパク質等、組換え方法により産生されたコンジュゲート、化学的カップリング、例えば、スルフヒドリル基とのカップリング等により、化学的方法により産生されたコンジュゲート、及び直接的に又はリンカー（複数可）を介して標的化作用物質へと間接的に、１又は２以上の抗体標的化ドメインと少なくとも１種類の抗原を連結する他のいずれかの方法により産生されたコンジュゲートを包含する。リンカーの例は、コヒーシン−ドッケリン（ｃｏｈ−ｄｏｃ）ペア、ビオチン−アビジンペア、Ｚｎにより結合したヒスチジンタグ等である。

本発明に用いるためのウイルス抗原の例として、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素並びに他のＨＩＶコンポーネント等、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来のレトロウイルス抗原等、レトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの前Ｓ（pre-S）抗原並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ等、他の肝炎、例えば、Ａ、Ｂ及びＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等、肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等、インフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルスコンポーネント等、麻疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルスコンポーネント等、風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルスコンポーネント等、ロタウイルス抗原；外被糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原コンポーネント等、サイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原コンポーネント等、呼吸器合胞体ウイルス抗原；最初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ及び他の単純ヘルペスウイルス抗原コンポーネント等、単純ヘルペスウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐＩＩ及び他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原コンポーネント等、水痘帯状疱疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原コンポーネント等、日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原コンポーネント等、狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原のさらなる具体例のため、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。少なくとも１種類のウイルス抗原は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（flavirvirus）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（papilomavirus）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドとなることができる。ある特定の非限定的な例において、少なくとも１種類のウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ、Ｂ及びＣ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、天然痘、風疹、呼吸器合胞体、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹、エプスタイン・バー、日本脳炎、狂犬病、ｆｌｕ及び／又は感冒ウイルスのうち少なくとも１種類から得られたペプチドである。

本明細書に開示されているＤＣＩＲと共に用いるための細菌性抗原として、例えば、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ及び他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等、細菌性抗原；ジフテリア毒素又はトキソイド及び他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等、ジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド及び他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等、破傷風細菌性抗原；Ｍタンパク質及び他の連鎖球菌細菌性抗原コンポーネント等、連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖及び他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等、グラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ及び他のマイコバクテリア抗原コンポーネント等、結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類及び他の肺炎球菌細菌性抗原コンポーネント等、肺炎球菌細菌性抗原；莢膜多糖類及び他のインフルエンザ菌細菌性抗原コンポーネント等、インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌感染防御抗原及び他の炭疽菌細菌性抗原コンポーネント等、炭疽菌細菌性抗原；ｒｏｍｐＡ及び他のリケッチア細菌性抗原コンポーネント等、リケッチア細菌性抗原が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載されている細菌性抗原と共に、その他の細菌性、マイコバクテリア性、マイコプラズマ性、リケッチア性又はクラミジア性抗原も包含されている。病原体の一部又は全体は、インフルエンザ菌；熱帯熱マラリア原虫；髄膜炎菌（neisseria meningitidis）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（streptococcus pneumoniae）；淋菌（neisseria gonorrhoeae）；サルモネラ菌血清型チフス；赤痢菌（shigella）；コレラ菌（vibrio cholerae）；デング熱；脳炎；日本脳炎；ライム病；ペスト菌（Yersinia pestis）；ウエストナイルウイルス；黄熱；野兎病；肝炎（ウイルス性；細菌性）；ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）；ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３；アデノウイルス；天然痘；アレルギー並びに癌となることができる。

本発明の組成物及び方法と共に用いるための真菌性抗原として、例えば、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラズマ真菌性抗原コンポーネント等、ヒストプラズマ真菌性抗原；莢膜多糖類及び他のクリプトコッカス真菌性抗原コンポーネント等、クリプトコッカス真菌性抗原；小球抗原及び他のコクシジオイデス真菌性抗原コンポーネント等、コクシジオイデス真菌性抗原；並びにトリコフィチン及び他のコクシジオイデス真菌性抗原コンポーネント等、白癬真菌性抗原が挙げられるがこれらに限定されない。

原虫性及び他の寄生虫性抗原の例として、例えば、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ及び他のマラリア原虫抗原コンポーネント等、熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ性抗原コンポーネント等、トキソプラズマ抗原；グルタチオンＳ−転移酵素、パラミオシン及び他の住血吸虫性抗原コンポーネント等、住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リポホスホグリカン及びその関連タンパク質並びに他のリーシュマニア性抗原コンポーネント等、森林型熱帯リーシュマニア及び他のリーシュマニア抗原；並びに７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ性抗原コンポーネント等、トリパノソーマ・クルージ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。

送達のための細胞表面上の標的抗原は、通常、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来するであろう腫瘍抗原に特徴的な抗原を包含する。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例は、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃又は結腸癌等の胃腸腫瘍、肝癌、膵癌、子宮頸部、子宮、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌等の尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍又は***、上咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病等、血液の癌を限定することなく包含する。

単独で、或いは抗原提示のための免疫細胞と組み合わせて、本発明を用いて送達され得る抗原の例として、腫瘍タンパク質、例えば、変異型癌遺伝子；腫瘍に関連するウイルスタンパク質；並びに腫瘍ムチン及び糖脂質が挙げられる。抗原は、上に記すウイルスのクラス由来の腫瘍に関連するウイルスタンパク質となることができる。ある特定の抗原は、腫瘍に特徴的となることができる（腫瘍前駆細胞により通例発現しないタンパク質である１サブセット）、或いは腫瘍前駆細胞において正常に発現するが、腫瘍に特徴的な変異を有するタンパク質となることができる。他の抗原は、活性又は細胞内分布が変化した正常タンパク質の変異体バリアント（複数可）、例えば、腫瘍抗原を生じる遺伝子の変異を包含する。

自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法に用いることができる。例えば、次の自己免疫疾患又は障害のうちいずれか１又は２以上に関与する抗原を、本発明において用いることができる。糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を包含する）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を包含する）、乾癬、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を包含するシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎、並びに間質性肺線維症。自己免疫疾患に関与する抗原の例として、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、サイログロブリン及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。

アレルギーに関与する抗原の例として、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原等の花粉抗原、イエダニ抗原及びネコ抗原等の動物由来抗原、組織適合性抗原並びにペニシリン及び他の治療薬が挙げられる。移植片拒絶に関与する抗原の例として、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓及び神経移植片コンポーネント等、移植片レシピエントに移植される移植片の抗原性コンポーネントが挙げられる。抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な変化したペプチドリガンドとなることができる。

本明細書において、用語「抗原ペプチド」は、Ｂ細胞又はＴ細胞のいずれかによって特異的に認識されるポリペプチド抗原の部分を指す。Ｂ細胞は、抗体産生により外来性抗原決定基に応答し、一方、Ｔリンパ球は、細胞免疫を媒介する。よって、抗原ペプチドは、抗体により、或いはＭＨＣの文脈においてはＴ細胞受容体により認識される抗原の一部である。

本明細書において、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンと特異的に結合できる、或いは主要組織適合抗原コンジュゲート（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、クラスＩ又はクラスII）によりＴ細胞受容体に対し提示され得るいかなるタンパク質決定基をも指す。エピトープ決定基は、一般に、例えば、溝、ペプチド側鎖及びＴ細胞受容体の特異的電荷特徴による、Ｔ細胞受容体に対しある特定のアミノ酸側鎖を提示し、溝にある特定の他の残基を有するＭＨＣ分子の溝内に適合する５〜３０アミノ酸長の短いペプチドである。一般に、抗体は、解離定数が１ｍＭ、１００ｎＭ又はいっそ１０ｎＭである場合、抗原と特異的に結合する。

本明細書において、用語「ベクター」は、２通りの異なる文脈において用いられる。用語「ベクター」をワクチンに関して用いる場合、ベクターは、ワクチンの抗原部分の方向付け又は送達に用いられる非抗原部分の説明に用いられている。例えば、抗体又はその断片は、免疫応答を誘発する抗原を有する融合タンパク質と結合又はこれを形成することができる。細胞ワクチンに関し、抗原の送達及び／又は提示のためのベクターは、抗原をロードした細胞により送達される抗原提示細胞である。場合により、細胞ベクターそれ自体が、抗原（複数可）をプロセシングし、Ｔ細胞に提示して、抗原特異的免疫応答を活性化してもよい。核酸の文脈において用いる場合、「ベクター」は、１又は２以上の所望の遺伝子又はポリヌクレオチド配列を送達し、好ましくは宿主細胞において発現することができるコンストラクトを言う。ベクターの例として、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、陽イオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター及び産生細胞等のある特定の真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、用語「安定」及び「不安定」は、タンパク質について言及する場合、その三次元構造及び／又は活性を維持する（安定）、或いはその三次元構造及び／又は活性を直ちに又は時間と共に失う（不安定）ペプチド又はタンパク質の説明に用いられている。本明細書において、用語「不溶性」は、細胞において産生される場合（例えば、真核若しくは原核細胞において又はインビトロで発現される組換えタンパク質）、変性条件又は作用物質（例えば、それぞれ熱又は化学的変性剤）の使用なしでは溶液に可溶性でないタンパク質を指す。本明細書に教示されている抗体又はその断片及びリンカーは、不溶性及び／又は不安定由来のペプチドを有する抗体融合タンパク質を、安定及び／又は可溶性タンパク質に変換することが判明した。安定性対不安定性の別の一例は、安定的な立体構造を有するタンパク質のドメインが、同一の溶液において測定したときにタンパク質の不安定ドメインよりも高い融解温度（Ｔ_ｍ）を有する場合である。ドメインは、Ｔ_ｍの差異が、同一の溶液において測定したときに少なくとも約２℃、より好ましくは約４℃、さらにより好ましくは約７℃、なおより好ましくは約１０℃、なお一層より好ましくは約１５℃、さらにより好ましくは約２０℃、さらになおより好ましくは約２５℃、最も好ましくは約３０℃である場合、別のドメインと比較して安定的である。

本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、一本鎖又は二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの鎖を指す（天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する）。二本鎖の核酸配列は、相補的配列を包含するであろう。ポリヌクレオチド配列は、１又は２以上のリンカーを備える融合タンパク質へと形成される免疫グロブリンの可変及び／又は定常領域ドメインをコードし得る。本発明と使用するため、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を、抗体の重及び／又は軽鎖のカルボキシ末端の終端位置へと工学的に作製して、ペプチドをリンカー間で発現するためのインフレーム挿入を可能にしてもよい。本明細書において、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源のポリヌクレオチド又はそれらのある組み合わせを指す。その起源が理由で、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に存在するポリヌクレオチドの全体又は一部と関連せず、（２）天然では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結し、或いは（３）より長い配列の一部として天然では発生しない。当業者であれば、ベクターの設計及び実行は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその関連する部分を援用するCurrent Protocols in Molecular Biology, 2007 by John Wiley and Sonsに教示されている技法等、本技術分野で公知の技法を用いることにより核酸レベルで操作できることを認識するであろう。即ち、コード核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド又はポリメラーゼ連鎖反応断片の、発現ベクターとなり得るベクターへの酵素による挿入を用いて挿入することができる。抗体軽鎖、重鎖又はその両方のカルボキシ末端におけるインサートの挿入を容易にするため、多重クローニング部位（ＭＣＳ）は、抗体配列を有する配列において工学的に作製することができる。

本明細書において、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さの産物を指す訳ではない。よって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の内に包含されている。この用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を指さない、或いは除外する。この定義の内に包含されているものとして、例えば、１又は２以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸等を包含する）を含有するポリペプチド、連結が置換されたポリペプチド並びに本技術分野で公知の自然発生及び非自然発生両方の他の修飾を有するポリペプチドが挙げられる。用語「ドメイン」又は「ポリペプチドドメイン」は、その天然立体構造の単一の球状領域へとフォールディングし、別個の結合又は機能的性質を示し得るポリペプチド配列を指す。

指定の核酸配列「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列は、配列にコードされているポリペプチドの配列と同一のアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドを指し、該一部は、少なくとも３〜５アミノ酸、好ましくは少なくとも４〜７アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、なお一層より好ましくは少なくとも１１〜１５アミノ酸からなる、或いは配列にコードされるポリペプチドにより免疫学的に同定可能である。この用語法は、指定の核酸配列から発現されるポリペプチドも包含する。

本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、本発明の免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質と組み合わせたとき、Ｉｇが生物学的活性を保有でき、一般に対象の免疫系と非反応性であるいかなる材料も指す。例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン及び様々な種類の湿潤剤等、標準医薬担体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、エアロゾル又は非経口投与のために、ある特定の希釈剤を本発明と共に用いることができ、これはリン酸緩衝食塩水又は正常（０．８５％）生理食塩水となることができる。

樹状細胞（ＤＣ）は、適応免疫応答の惹起並びに規模及び質の制御において重大な役割を果たす（Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998;392:245-252、Steinman RM, Banchereau J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 2007;449:419-426）。ＤＣは、このようなシグナルを解読し、統合し、この情報を適応免疫系の細胞へと運ぶ。ＤＣは、特化した機能と共有機能を保有するサブセットで構成される（Ueno H, Klechevsky E, Morita R, et al. Dendritic cell subsets in health and disease. Immunol Rev. 2007;219:118-142、Shortman K, Naik SH. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 2007;7:19-30、Klechevsky E, Morita R, Liu M, et al. Functional specializations of human epidermal langerhans cells and CD14+ dermal dendritic cells. Immunity. 2008;29:497-510）。微生物は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 2003;21:335-376）、細胞表面Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Engering A, t Hart BA, van Kooyk Y. Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2004;22:33-54）及び細胞質内ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）（Ye Z, Ting JP. NLR, the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing gene family. Curr Opin Immunol. 2008;20:3-9、Meylan E, Tschopp J, Karin M. Intracellular pattern recognition receptors in the host response. Nature. 2006;442:39-44）等、種々のパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して、ＤＣを直接的に活性化することができる。ヒトにおいて、ある特定のＣＬＲは、ＢＤＣＡ２を発現する形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）（Dzionek A, Sohma Y, Nagafune J, et al. BDCA-2, a novel plasmacytoid dendritic cell-specific type II C-type lectin, mediates antigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/beta induction. J Exp Med. 2001;194:1823-1834）、ランゲリンを発現するランゲルハンス細胞（ＬＣ）（Valladeau J, Ravel O, Dezutter-Dambuyant C, et al. Langerin, a novel C-type lectin specific to Langerhans cells, is an endocytic receptor that induces the formation of Birbeck granules. Immunity. 2000;12:71-81）及びＤＣ−ＳＩＧＮを発現する間質性ＤＣ（Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, et al. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell. 2000;100:575-585）によりＤＣサブセットを識別する。他のＣ型レクチンは、内皮細胞及び好中球を包含する他の細胞型において発現される。ＤＣ−ＳＩＧＮ（Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Engering A, t Hart BA, van Kooyk Y. Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2004;22:33-54）等、ＣＬＲは、多数の微生物のためのアンカーとして作用し、その内部移行を可能にし得る。その上、ＣＬＲは、ＤＣと、内皮細胞、Ｔ細胞及び好中球を包含する他の細胞型との間の接着分子としても作用する（Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, et al. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell. 2000;100:575-585、van Gisbergen KP, Sanchez-Hernandez M, Geijtenbeek TB, van Kooyk Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. J Exp Med. 2005;201:1281-1292）。機能未知のレクチンであるＤＥＣ−２０５／ＣＤ２０５は、リガンドを形質膜陥入するその能力に関し、マウスにおいて広範に研究されている。ＤＣ活性化非存在下におけるＤＥＣ−２０５によるマウスＤＣに対する抗原の標的化は、寛容性誘導をもたらす（Hawiger D, Inaba K, Dorsett Y, et al. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J Exp Med. 2001;194:769-779、Kretschmer K, Apostolou I, Hawiger D, Khazaie K, Nussenzweig MC, von Boehmer H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nat Immunol. 2005;6:1219-1227）。対照的に、ＤＣ活性化（ＣＤ４０及びＴＬＲ３アゴニスト）の存在下における抗原の標的化は、種々の抗原に対する免疫の生成をもたらす（Hawiger D, Inaba K, Dorsett Y, et al. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J Exp Med. 2001;194:769-779、Bonifaz LC, Bonnyay DP, Charalambous A, et al. In Vivo Targeting of Antigens to Maturing Dendritic Cells via the DEC-205 Receptor Improves T Cell Vaccination. J Exp Med. 2004;199:815-824）。ＤＥＣ−２０５により送達された抗原に対するＣＤ４^＋Ｔ細胞応答又は一次ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の誘導を立証する多くの研究は、トランスジェニックマウスＯＴ−Ｉ／II系に限定されている。

抗原は、ＬＯＸ−１（ＨＳＰ７０と結合するII型Ｃ型レクチン受容体（Delneste Y, Magistrelli G, Gauchat J, et al. Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. Immunity. 2002;17:353-362））、マンノース受容体（Tan MC, Mommaas AM, Drijfhout JW, et al. Mannose receptor-mediated uptake of antigens strongly enhances HLA class II-restricted antigen presentation by cultured dendritic cells. Eur J Immunol. 1997;27:2426-2435）、デクチン−１（Carter RW, Thompson C, Reid DM, Wong SY, Tough DF. Preferential induction of CD4+ T cell responses through in vivo targeting of antigen to dendritic cell-associated C-type lectin-1. J Immunol. 2006;177:2276-2284）、デクチン−２（Carter RW, Thompson C, Reid DM, Wong SY, Tough DF. Induction of CD8+ T cell responses through targeting of antigen to Dectin-2. Cell Immunol. 2006;239:87-91）、ＣＤ４０（Schjetne KW, Fredriksen AB, Bogen B. Delivery of antigen to CD40 induces protective immune responses against tumors. J Immunol. 2007;178:4169-4176）、ランゲリン（Idoyaga J, Cheong C, Suda K, et al. Cutting Edge: Langerin/CD207 Receptor on Dendritic Cells Mediates Efficient Antigen Presentation on MHC I and II Products In Vivo. J Immunol. 2008;180:3647-3650）、Ｇｂ３（志賀毒素の受容体（Vingert B, Adotevi O, Patin D, et al. The Shiga toxin B-subunit targets antigen in vivo to dendritic cells and elicits anti-tumor immunity. Eur J Immunol. 2006;36:1124-1135））、ＤＥＣ−２０５（Bozzacco L, Trumpfheller C, Huang Y, et al. HIV gag protein is efficiently cross-presented when targeted with an antibody towards the DEC-205 receptor in Flt3 ligand-mobilized murine DC. Eur J Immunol;40:36-46）及び近年、マウスにおけるナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を初回刺激すると記載されたＣＬＥＣ９Ａ（Huysamen C, Willment JA, Dennehy KM, Brown GD. CLEC9A is a novel activation C-type lectin-like receptor expressed on BDCA3+ dendritic cells and a subset of monocytes. J Biol Chem. 2008;283:16693-16701、Caminschi I, Proietto AI, Ahmet F, et al. The dendritic cell subtype-restricted C-type lectin Clec9A is a target for vaccine enhancement. Blood. 2008;112:3264-3273、Sancho D, Mourao-Sa D, Joffre OP, et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. J Clin Invest. 2008;118:2098-2110）を包含する他の表面分子を介してマウスＤＣに対し標的化されてきた。異なるネズミＤＣサブセットにおいて発現した受容体を介した抗原の標的化は、異なる機能的成果をもたらす（Dudziak D, Kamphorst AO, Heidkamp GF, et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 2007;315:107-111、Soares H, Waechter H, Glaichenhaus N, et al. A subset of dendritic cells induces CD4+ T cells to produce IFN-gamma by an IL-12-independent but CD70-dependent mechanism in vivo. J Exp Med. 2007;204:1095-1106）。ヒトＤＣに対する抗原の標的化のため、抗ＤＣ−ＳＩＧＮとＫＬＨ（Tacken PJ, de Vries IJ, Gijzen K, et al. Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody. Blood. 2005;106:1278-1285）、抗ＤＥＣ−２０５とＨＩＶｇａｇ（Bozzacco L, Trumpfheller C, Siegal FP, et al. DEC-205 receptor on dendritic cells mediates presentation of HIV gag protein to CD8+ T cells in a spectrum of human MHC I haplotypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:1289-1294）及び抗マンノース受容体とヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧｂ）（He LZ, Crocker A, Lee J, et al. Antigenic targeting of the human mannose receptor induces tumor immunity. J Immunol. 2007;178:6259-6267）とのコンジュゲートは、それぞれ血液ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に対し、或いはＴ細胞クローンに対し提示／クロスプレゼンテーションされることが示されてきた。

本発明者らは、血液由来のＤＣを包含する様々な種類のＤＣにおいて広く発現されるレクチンＤＣＩＲ（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983）に着目する。実際に、ＤＣＩＲは、当初は、血液単球、Ｂ細胞、好中球、顆粒球及び真皮ＤＣにおいて発現されるが、ＬＣにおいては発現されないと説明されており、また近年、ｐＤＣにおいて発現されることが判明した（Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）。機能的に、これはＨＩＶの受容体として働くことができる（Lambert AA, Gilbert C, Richard M, Beaulieu AD, Tremblay MJ. The C-type lectin surface receptor DCIR acts as a new attachment factor for HIV-1 in dendritic cells and contributes to trans- and cis-infection pathways. Blood. 2008;112:1299-1307）。ヒトゲノムは、単一のＤＣＩＲ遺伝子のみをコードするが、一方マウスゲノムは、４種のＤＣＩＲ様遺伝子、ＤＣＩＲ２、ＤＣＩＲ３、ＤＣＩＲ４及びＤＣＡＲ１を示す。ＤＣＩＲ及びＤＣＡＲは、それらの細胞外ドメインにおいて実質的な配列相同性を共有する。しかし、ＤＣＡＲは、免疫受容ファミリー活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するＦｃＲγ鎖と関連し、それに対しＤＣＩＲは、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２ホスファターゼをリクルートする免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Kanazawa N, Okazaki T, Nishimura H, Tashiro K, Inaba K, Miyachi Y. DCIR acts as an inhibitory receptor depending on its immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Invest Dermatol. 2002;118:261-266）。マウスＤＣＡＲのヒトホモログは、現在のところ同定されていない。

本発明は、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロスプレゼンテーション及びクロスプライミング（crosspriming）をもたらす、抗ＤＣＩＲコンジュゲートｍＡｂによる幅広いＤＣサブセットへの抗原送達の成功を報告する。ＤＣＩＲ特異的抗体の例として、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全ての内容を援用する（米国特許出願公開第２００８０２４１１７０号明細書及び第２００８０２０６２６２号明細書に以前に記載された受託番号ＰＴＡ１０２４６及びＰＴＡ１０２４７）、関連する部分、配列を包含する）が挙げられる。

ＤＣサブセット：前駆細胞を動員するためにＧ−ＣＳＦを与えられた健常志願者の血液から単離されたＣＤ３４^＋−ＨＰＣから、ＣＤ３４^＋由来ＤＣをインビトロで生成した。５％自己血清、５０μＭ β−メルカプトエタノール、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Berlex社）、Ｆｌｔ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ；R&D社）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D社）を補充したYsselの培地（Irvine Scientific社、カリフォルニア州）において、０．５×１０^６細胞／ｍｌのＨＰＣを９日間培養した。培地及びサイトカインは、培養５日目に新しく換えた。次に、ＤＣのサブセット、ＣＤ１ａ^＋ＣＤ１４⁻−ＬＣ及びＣＤ１ａ⁻ＣＤ１４^＋ＤＣを選別し、９５〜９９％の純度を得た。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，fetal bovine serum）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；Immunex Corp. 社）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ、R&D社）を補充したＲＰＭＩにおいて５日間、或いはＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；Immunex Corp. 社）及びＩＦＮ−α２ｂ（５００Ｕ／ｍｌ；イントロンＡ；Schering-Plough社）補充で３日間単球を培養することにより単球由来のＤＣを生成した。新鮮ＰＢＭＣから、それぞれＬｉｎ⁻ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１２３⁻及びＬｉｎ⁻ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ１２３^＋としてｍＤＣ及びｐＤＣを選別した。

正常ヒト皮膚標本から表皮ＬＣ、真皮ＣＤ１ａ^＋ＤＣ及び真皮ＣＤ１４^＋ＤＣを精製した。細菌のプロテアーゼであるディスパーゼ２型において１８時間４℃にて、続いて２時間３７℃にて標本をインキュベートした。次に、表皮及び真皮シートを分離し、小片（ほぼ１〜１０ｍｍ）に刻み、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０に置いた。２日後、培地へと遊走した細胞を収集し、密度１．０７７ｇ／ｄｌのFicoll−ジアトリゾ酸を用いてさらに濃縮した。抗ＣＤ１ａＦＩＴＣ（DAKO社）及び抗ＣＤ１４ＡＰＣｍＡｂ（Invitrogen社）で染色した後、細胞選別によりＤＣを精製した。全プロトコールは、治験審査委員会（institutional review board）により審査され、承認された。

ＤＣ／Ｔ細胞共培養における抗原特異的Ｔ細胞の増殖：ＦｌｕＭＰ又はＭＡＲＴ−１に由来する抗原の提示におけるＤＣの機能を評価するため、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られたＤＣを用いた。コンジュゲートｍＡｂと細胞を表示濃度で培養した。抗原でパルスしたＤＣと共に同一遺伝子の（syngeneic）精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＤＣ／Ｔ比１：２０で培養した。２４時間後にＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ；R&D社）を培養物に添加し、ＤＣによる交差提示を増強させた（Delamarre L, Pack M, Chang H, Mellman I, Trombetta ES. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 2005;307:1630-1634）。共培養物を３７℃で８〜１０日間インキュベートした。３日目に１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。必要に応じて、ＴＬＲアゴニスト、ＬＰＳ（１０、５０又は２００ｎｇ／ｍｌ；Invivogen社）、ポリＩ：Ｃ（５、１０又は２５μｇ／ｍｌ）又はチアゾロキノリン（Thiazoloquinoline）化合物ＣＬ０７５（０．２、１又は２μｇ／ｍｌ；Invivogen社）によりＤＣを活性化した。それぞれＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）（配列番号１）、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）ペプチド（ELAGIGILTV）（配列番号２）及びＨＬＡ−Ａ２０１−ｐ２４（１５１〜１５５）ペプチド（TLNAWVKVV）（配列番号３）四量体（Beckman Coulter社）を用いて、ＦｌｕＭＰ、ＭＡＲＴ−１及びＨＩＶｇａｇｐ２４特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を評価した。複数のＣＤ８^＋Ｔ細胞特異的エピトープに対する交差刺激の評価のため、抗ＤＣＩＲ−ｐ２４又はＩｇＧ４−ｐ２４融合ｍＡｂと共にＣＤ３４^＋由来のＤＣをインキュベートし、ＣＦＳＥ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共にＤＣ／Ｔ比１：３０で培養した。抗原でパルスしたＤＣをＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）により活性化した。２回連続した刺激の後、ＣＦＳＥ^ｌｏｗ増殖細胞を選別し、ＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質（２μｇ／ｍｌ）をロードした新鮮ＤＣにより２４時間再刺激した。培養上清に分泌されたＩＦＮ−γをLuminexにより測定した。或いは、抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質によりｍＤＣ又はＩＦＮ−α ＤＣを標的化し、表示の通りに活性化し、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に１０日間培養した。必要に応じて、タンパク質輸送阻害剤モネンシン（GolgiStop；BD Biosciences社）の存在下で、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する１５アミノ酸重複ペプチド（２．５μＭ）をロードした新鮮自己ＤＣによる再刺激の５時間後に、細胞内ＩＦＮ−γの産生と、ＣＤ１０７ａ（BD Biosciences社）の動員を測定した。４０時間後の上清におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の分泌をLuminexにより測定した。

本発明の追加的な方法は、抗ＤＣＩＲｍＡｂの生成及び組換えＤＣＩＲの産生、キメラマウス／ヒトＩｇＧ４組換えｍＡｂのクローニング及び発現、ＡＰＣにおけるＤＣＩＲ発現解析、ＤＣ表現型及び機能におけるＤＣＩＲシグナル伝達効果、融合タンパク質ｍＡｂのクローニング及び産生、ＤＣにおけるペプチド−ＭＨＣコンジュゲート検出、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の精製並びに化学的に連結した抗ＤＣＩＲｍＡｂによるＦｌｕＭＰタンパク質の交差提示に関する、本明細書で後述する詳細を包含する。

抗ＤＣＩＲｍＡｂの生成及び組換えＤＣＩＲの産生：従来の細胞融合技術によりマウスｍＡｂを生成した。即ち、６週齡のＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０μｇの受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質とRibiアジュバントにより腹腔内で免疫化し、続いて１０日及び１５日後に２０μｇの抗原で追加免疫した。３ヶ月後、脾臓採取の３日前に、マウスを再度追加免疫した。或いは、Ribiアジュバントにおける１〜１０μｇの抗原を３〜４日毎に３０〜４０日間の期間にわたりマウスの足蹠に注射した。脾臓から得られたＢ細胞又はリンパ節細胞を、従来の技法を用いてＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（Shulman M, Wilde CD, Kohler G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 1978;276:269-270）と融合した。ＥＬＩＳＡを用いて、融合パートナー単独又はＡＰ融合受容体外部ドメインと比較しつつ受容体外部ドメイン融合タンパク質に対しハイブリドーマ上清をスクリーニングした（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983）。次に、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いたフローサイトメトリーにより、陽性ウェルをスクリーニングした。選択されたハイブリドーマはクローニングされ、CELLineフラスコ（Intergra社）において増殖された単一の細胞である。ハイブリドーマ上清を、等容量の１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８（結合バッファー）と混合し、MabSelect樹脂（eBiosciences社）（８００μｌ／５ｍｌ上清）と共に転倒混和した。樹脂を洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２ＭＴｒｉｓで中和した後、ｍＡｂをＰＢＳに対し透析した。抗ＤＣＩＲ抗体ＡＢ８−２６．９Ｅ８．１Ｅ３（ＨＳ８５４）、寄託番号ＰＴＡ−１０２４６又は抗ＤＣＩＲ抗体寄託番号ＰＴＡ１０２４７をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection，ＡＴＣＣ）に寄託した。

キメラマウス／ヒト組換えＩｇＧ４ｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現。ハイブリドーマ細胞（RNeasy kit、Qiagen社）から全ＲＮＡを調製し、付属の５’プライマー並びに遺伝子特異的３’プライマーｍＩｇＧκ（5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'）（配列番号４）及びｍＩｇＧ１（5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3'）（配列番号５）によるｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ（SMART RACE kit、BD Biosciences社）に用いた。次に、ＰＣＲ産物をクローニングし（pCR2.1 TA kit、Invitrogen社）、ＤＮＡ配列決定により特徴づけた。マウス重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域ｃＤＮＡの派生した配列を用いて、特異的プライマーを用いて、下流ヒトＩｇＧκ又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクターへのクローニングのためのフランキング制限部位を取り込みつつ、シグナルペプチド及びＶ領域をＰＣＲ増幅した。Xho I及びNot I部位に隣接する残基４０１〜７３１（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、これをベクターpIRE7A-DsRed2（BD Biosciences社）のXho I−Not I区間に挿入することにより、キメラｍＶκ−ｈＩｇＧκの発現のためのベクターを構築した。ＰＣＲを用いて、Nhe I又はSpe I部位、続いてCACCを、Xho I部位を付加するコード領域（例えば、ｇｉ｜７６７７９２９４｜の残基１２６）に付加しつつ、開始コドンからｍＡｂＶκ領域増幅した。次に、ＰＣＲ断片を上述のベクターのNhe I−Not I区間にクローニングした。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、７Ａ２９Ｐ及びＬ２３６Ｅが置換された（ジスルフィド結合を安定化し、残存ＦｃＲ相互作用を抑止する（Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, et al. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000;164:1925-1933））ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基１２〜１４７３に対応し、終止コドンの代わりに配列5'−gctagctgattaattaa−3'（配列番号６）を加えつつ、pIRE7A-DsRed2（BD Biosciences社）のBgl II及びNot I部位間に挿入される。ＰＣＲを用いて、CACC、続いてBgl II部位をｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基４７３をコードする領域に付加しつつ、開始コドンからｍＡｂＶＨ領域を増幅した。次に、ＰＣＲ断片を上述のベクターのBgl II−Apa I区間にクローニングした。配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3'（配列番号７）を上述のベクターのNhe I−Apa I区間に挿入することにより、ｍＳＬＡＭリーダーを用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４配列のためのベクターを構築した。ＰＣＲを用いて、5'tcgtacgga3'を付加しつつ予測成熟Ｎ末端コドンとｍＶＨ領域の終端との間の区間を増幅した。Bsi WI及びApa Iで消化した断片を、上述のベクターの対応する部位に挿入した。近位Nhe I部位及び遠位Not I部位に隣接し、終止コドンに続く抗原コード配列を、各Ｈ鎖ベクターのNhe I−Pac I−Not I区間に挿入した。近位Nhe I部位及び遠位Not I部位を有するｇｉ｜４０６７１｜クロストリジウム・サーモセラムＣｅｌＤ残基１９２３〜２１５０に、ドッケリン（Ｄｏｃ）をコードさせた。近位Nhe I部位を有するｇｉ｜７７４１６８７８｜残基１３３〜３６３及び遠位Not I部位とｇｉ｜１２５４８９０２０｜残基６０〜７５由来の配列に、ＨＩＶｇａｇｐ２４をコードさせた。FreeStyle（商標）293又はCHO-S Expression Systems（Invitrogen社）を用いて、メーカーのプロトコールに従って（それぞれ１ｍｇの全プラスミドＤＮＡと１．３ｍｌの293 Fectin試薬、或いは１ｍｇの全プラスミドＤＮＡと１ｍｌのFREESTYLE MAX試薬／Ｌのトランスフェクション）組換え抗体を産生した。Ｈ及びＬ鎖をコードする等量のベクターを同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３日間培養し、次に、培養上清を回収し、０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Biosource社）の入った新鮮培地を添加し、続いて２日間インキュベーションした。プールした上清を濾過により清澄化し、１ｍｌ HiTrap MabSelect（商標）カラムにローディングし、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７により溶出し、２ｍＭＴｒｉｓで中和し、続いてＣａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋含ＰＢＳに対して透析した。２８０ｎｍの吸光度によりタンパク質を定量化した。

ＤＣＩＲ発現解析：ＰＢＭＣ、インビトロで生成した又は皮膚由来のＤＣにおいてＤＣＩＲ発現を評価した。細胞を抗ＤＣＩＲｍＡｂ（追加の方法において記載されている通りに生成）又はマウスＩｇＧ１（BD社）で染色し、洗浄し、続いてＰＥをコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（BD Pharmingen社）で染色し、次に洗浄し、ＦＩＴＣ又はＡＰＣをコンジュゲートした抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１６（BD Pharmingen社）、抗ＣＤ１ａ（DAKO社）又は抗ＣＤ１４（Invitrogen社）ｍＡｂと共にインキュベートすることにより二重染色を行った。補足の方法において詳述する通り、表皮シートを染色して、未熟ＬＣにおけるＤＣＩＲ発現を評価した。

未熟ＬＣにおけるＤＣＩＲの発現のため、表皮シートをおよそ１０ｍｍ平方に刻み、４％パラホルムアルデヒドに３０分間置いた。シートをＰＢＳにおいて洗浄し、Background Buster（Innovex社）で３０分間ブロッキングした。次に、表皮シートを０．５μｇの精製マウス抗ＤＣＩＲ（クローン９Ｅ８）又は対照ＩｇＧ１と一晩インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％サポニンで２回洗浄し、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５６８（Molecular Probes社）（１：５００希釈）と共に１時間インキュベートした。核を１：５０００のＤＡＰＩ（Invitrogen社；Molecular Probes社）で染色し、続いて抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣと共に２時間インキュベートした。シートをＰＢＳでリンスし、Vectamount（Vector Laboratories社）にマウントした。全抗体は、CytoQ希釈剤及びブロッキング剤（Innovex社）で希釈し、全インキュベーションは４℃にて一定且つ穏やかな揺動をしつつ行った。Olympus社製Planapo 20/0.7, Coolsnap HQカメラを用いて画像を取得し、Metamorphソフトウェアを用いて解析した。

ＤＣ機能におけるＤＣＩＲシグナル伝達効果：抗ＤＣＩＲ（クローン２４Ａ５又は９Ｅ８）又はアイソタイプ対照をコーティングしたプレートにおいて、ＣＤ４０Ｌ（R&D社；１００ｎｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（Invivogen社；５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下でＣＤ３４^＋由来のＤＣを培養した。２４時間後、細胞を回収し、表面表現型のために染色した。マルチプレックスビーズアッセイ（Luminex）により、分泌されたサイトカインを解析した。網羅的遺伝子シグネチャー解析のため、正常ヒト皮膚から精製された０．５×１０^６個の表皮細胞を、可溶性、架橋型又はプレート被覆形態の５μｇ／ｍｌの抗ＤＣＩＲ（クローン２４Ａ５又は９Ｅ８）、抗ＣＤ４０（クローン１２Ｅ１２）又はＩｇＧ１アイソタイプマッチ対照のいずれかに２４時間曝露した。２００ｎｇの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを得て、メーカーの説明書に従ってインビトロ転写後の増幅及び標識ステップを行った。１．５μｇの増幅されたビオチン標識ｃＲＮＡを、Illumina（Ambion, Inc社、テキサス州オースティン）の推奨する試料標識手順に従ってIllumina Sentrix Hu6 BeadChipsとハイブリダイズさせた。BeadChipsは、４８，６８７プローブを表す、ガラス製スライド表面上のマイクロウェル内の３μｍビーズに付着した５０ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブからなる。Illumina BeadStation 500においてスライドをスキャンし、Beadstudioソフトウェアを用いて蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを評価した。同種異系ＣＤ８^＋Ｔ細胞初回刺激におけるＤＣＩＲシグナル伝達の効果を試験するため、抗ＤＣＩＲｍＡｂ又はＩｇＧ１対照（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートにおいて、ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で、ＬＣを同種異系ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞とＤＣ：Ｔ比１：２０で培養した。６日間培養の最後の１２時間における［^３Ｈ］−チミジン取り込みを測定することにより、Ｔ細胞増殖応答をアッセイした。その表現型と、ＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂ刺激後のそのサイトカイン分泌パターンに関して、増殖しているＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ）を解析した。自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞初回刺激におけるＤＣＩＲシグナル伝達の効果を試験するため、ＣＤ３４^＋由来のＤＣサブセットに、ＨＬＡ−Ａ２０１制限ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）ペプチドをロードし、可溶性形態の抗ＤＣＩＲｍＡｂ又はＩｇＧ１対照（１０μｇ／ｍｌ）及びＣＤ４０Ｌの存在下でナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、細胞を回収し、特異的四量体によりＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度に関して、また、エフェクター分子グランザイムＡ（BD Pharmingen社）、グランザイムＢ（eBiosciences社）及びパーフォリン（Fitzgerald社）の発現に関して解析した。

融合タンパク質ｍＡｂのクローニング及び産生：スルホスクシンイミジル（sulfosuccinimidyl）６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸塩（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ；Pierce社）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＦｌｕＭＰをｍＡｂと化学的架橋した。キメラマウス／ヒト組換えｍＡｂ抗ＤＣＩＲ及び対照ＩｇＧ４を、ｒＡｂＨ鎖を有するほぼ９．５ｋＤＡのドッケリンドメインインフレームと融合した。免疫優性ＨＬＡ−Ａ２０１制限ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）（配列番号１）を含有するＦｌｕＭＰ全体と、周囲に天然ＭＡＲＴ−１残基：

を有するメラノーマＭＡＲＴ−１抗原由来の免疫優性ＨＬＡ−Ａ２０１制限ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）ペプチド（ELAGIGILTV）（配列番号２）をコードする配列は、それぞれほぼ１７．５ｋＤａのコヒーシンドメインと融合し、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社）又はT7 Express（NEB社）において発現させた。ｒＡｂ．Ｄｏｃ融合タンパク質を２モル濃度相当のコヒーシン．抗原融合タンパク質と混合することにより、組換えｍＡｂ（ｒＡｂ）−抗原コンジュゲートを形成した。ドッケリン及びコヒーシンドメインは、自己会合して、安定的［ｒＡｂ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．抗原］コンジュゲートを形成する（Flamar et al.に記載）。キメラｒＡｂ抗ＤＣＩＲ又はＩｇＧ４対照抗体を、ＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質（Trumpfheller C, Finke JS, Lopez CB, et al. Intensified and protective CD4+ T cell immunity in mice with anti-dendritic cell HIV gag fusion antibody vaccine. J Exp Med. 2006;203:607-617）又は組換え型のＭＡＲＴ−１タンパク質の一部と融合した。使用した抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１（クローン９Ｅ８）融合タンパク質は、Ｈ鎖Ｃ末端に付加した次のペプチド単位［各単位はＡＳ残基に隣接］を有していた。バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）セルロソーム繋留スキャフォールディンＢ前駆体［ｇｂ｜ＡＡＴ７９５５０．１｜］残基６５１〜６７７、Ｔ６７２Ｎ置換；ＭＡＲＴ−１｜ｇｂ｜ＢＣ０１４４２３．１｜残基１〜３８；ｇｂ｜ＡＡＴ７９５５０．１｜残基１１７５〜１１９９；ＭＡＲＴ−１残基７８〜１１８。ｍＡｂ−ＦｌｕＭＰコンジュゲートの細胞表面染色のため、EZ-Link NHS-SS-PEO₄-Biotin（Pierce社）を用いて、メーカーの手順に従ってｃｏｈ．ＦｌｕＭＰをビオチン化（biotinilated）した。単球由来のＤＣを１０μｇ／ｍｌｒＡｂ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ．ビオチンコンジュゲートにより氷上にて２０分間染色した。ＰＥをコンジュゲートしたストレプトアビジン（１：２００；BD Biosciences社）を用いて細胞表面結合を検出し、フローサイトメトリーにより解析した。

ＤＣにおけるペプチド−ＭＨＣコンジュゲート検出：１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αを補充した培養培地において、ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られたＣＤ３４^＋由来のＤＣを、５０ｎＭＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲート又は遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ融合タンパク質とインキュベートした。２時間後に５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４０ｍＡｂ（１２Ｅ１２、ＢＩＩＲ）を添加した。２４時間後に、ＰＥをコンジュゲートした四量体化Ｍ１Ｄ１２モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド（GILGFVFTL）−ＨＬＡ−Ａ２０１コンジュゲートに関し細胞を評価した（Biddison WE, Turner RV, Gagnon SJ, Lev A, Cohen CJ, Reiter Y. Tax and M1 peptide/HLA-A2-specific Fabs and T cell receptors recognize nonidentical structural features on peptide/HLA-A2 complexes. J Immunol. 2003;171:3064-3074）。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞の精製：ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６及びＣＤ４磁気ビーズを用いてＰＢＭＣから陰性として選択した、或いはナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec社）を用いて精製した。一部の実験において、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣＤ８^＋ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋として選別し、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣＤ８^＋ＣＣＲ７⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻として選別した。必要に応じて、細胞を５μＭカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ，carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester；Invitrogen社）で標識した。

化学的に連結した抗ＤＣＩＲｍＡｂによるＦｌｕＭＰタンパク質の交差提示：ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られたＣＤ３４^＋由来のＬＣを、精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞と、増加濃度の抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ１−ＦｌｕＭＰ及び遊離型ＦｌｕＭＰタンパク質を包含する対照のいずれかと共に８日間培養した。単独で送達されると、ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）特異的ＨＬＡ−Ａ２０１四量体による染色によって評価される通り、ＦｌｕＭＰは、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の非常に限定的な増殖しか誘導しなかった（図２Ｂ）。ＩｇＧ１−ＦｌｕＭＰは、遊離型ＦｌｕＭＰタンパク質よりも効率的であり、この結果はＦｃ媒介性の取り込み（uptake）を示唆した（Regnault A, Lankar D, Lacabanne V, et al. Fcgamma receptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation after immune complex internalization. J Exp Med. 1999;189:371-380）。図２Ｃに図解する用量滴定曲線は、抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰが、対照ＩｇＧ１−ＦｌｕＭＰ又は遊離型ＦｌｕＭＰよりも少なくとも５０倍少ない抗原で応答を誘発したことを示し、従って、実際の抗原標的化を立証する。遊離型抗原が、抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰに観察された高頻度のＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導しなかったことに留意されたい（図２Ｃ）。

表１は、ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で抗ＤＣＩＲ又はアイソタイプ対照で２４時間刺激した、ＣＤ１ａ^＋ＬＣの表面におけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲの平均蛍光発現を表示する。図２Ｂは、架橋抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰ、架橋対照ＩｇＧ−ＦｌｕＭＰタンパク質又は遊離型ＦｌｕＭＰと培養したＣＤ１ａ^＋ＬＣにより増殖したＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を示す。図２Ｃは、減少濃度の架橋ｍＡｂ−ＦｌｕＭＰコンストラクト又は遊離型ＦｌｕＭＰに応答したＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図２Ｄは、マウス及びキメラ抗ＤＣＩＲｍＡｂと、本試験に用いたタンパク質抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルを示す。図２Ｅは、抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂと単球由来のＤＣ表面との結合を示す。図８Ａは、ＣＤ１ａ^＋ＬＣ（Ｓ３Ａ）表面におけるＣＤ８６発現のフローサイトメトリー解析を示し、Luminexによる、ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で抗ＤＣＩＲ又はアイソタイプ対照で２４時間刺激した皮膚単離ＤＣ（ＬＣ、真皮ＣＤ１ａ^＋ＤＣ及び真皮ＣＤ１４^＋ＤＣ）によるＩＬ−６分泌（図８Ｂ）を示す。データは、抗ＤＣＩＲ抗体が、培養ＤＣの表現型を変化させず、ＣＤ４０又はＣＬ０７５誘導の活性化を阻害しないことを示す。図８Ｃは、ＤＣＩＲライゲーションではなくＣＤ４０ライゲーションのみが、可溶性、架橋型又はプレート被覆型ｍＡｂに曝露された表皮皮膚細胞により網羅的活性化遺伝子シグネチャーを誘導したことを示す。図９Ａは、抗ＤＣＩＲ抗体が、同種異系ＣＤ１ａ^＋ＬＣによって誘発されたナイーブＴ細胞の増殖を変化させなかったことを示す。図９Ｂ及び図９Ｃは、抗ＤＣＩＲ抗体の添加が、同種異系ＤＣにより活性化されたナイーブＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞の表現型（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８）及びサイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）を変化させなかったことを示す。図９Ｄは、特異的四量体（teteramer）を用いたフローサイトメトリー及びエフェクター分子（グランザイムＡ、グランザイムＢ及びパーフォリン）のレベルによって解析された通り、抗ＤＣＩＲ抗体が、ＭＡＲＴ−１特異的エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞を初回刺激するＭＡＲＴ−１ペプチドロードＤＣの能力を変化させなかったことを示す。

表１：ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で抗ＤＣＩＲ又はアイソタイプ対照で２４時間刺激したＣＤ１ａ^＋ＬＣ表面におけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲの平均蛍光発現。

ＤＣＩＲは、単球、Ｂ細胞及びあらゆるＤＣサブセットにより発現される：試験を通じて２種のモノクローナル抗ＤＣＩＲクローン、９Ｅ８及び２４Ａ５を用いた。表面プラズモン共鳴解析により評価される通り、両者は高親和性（それぞれ、ほぼ８５０ｐＭ及びほぼ５６０ｐＭ）であることを証明した。これらは、ＰＢＭＣの比較可能な染色を示し（図１Ａ）、本試験を通じて比較可能な機能的結果を生じた。

ＤＣＩＲは、ＨＬＡ−ＤＲ発現によって表示される通り、あらゆる循環ＡＰＣによって発現されることが判明した。これらＡＰＣは、ＣＤ１４^＋単球（ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻及びＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋サブセットの両方）、ＬＩＮ⁻ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ^＋血液骨髄系ＤＣ（ｍＤＣ）、ＬＩＮ⁻ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ１２３^＋形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）及びＣＤ１９^＋Ｂリンパ球を包含する。ＤＣＩＲは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（図１Ａ）又はＣＤ１６^＋及びＣＤ５６^＋ＮＫ細胞（図示せず）において検出されなかった。ＤＣＩＲは、精製表皮ＬＣ、真皮ＣＤ１４⁻ＣＤ１ａ^＋及び真皮ＣＤ１４^＋ＣＤ１ａ⁻ＤＣにおいて発現した（図１Ｂ）。表皮シートの免疫蛍光解析は、ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＬＣにおけるＤＣＩＲの発現をインサイチュ（in situ）でさらに確認した（図１Ｃ）。ＤＣＩＲは、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）と、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−Ｌ及びＴＮＦ−αの組み合わせとの９日間の培養によりインビトロで生成したＣＤ１ａ^＋ＬＣ及びＣＤ１４^＋間質性ＤＣにおいて（Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med. 1996;184:695-706）（図１Ｄ）、また、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、或いはＧＭ−ＣＳＦ及びＩ型ＩＦＮと培養した単球由来のＤＣにおいて（図示せず）発現した。

このように、本発明の知見は、単球、Ｂ細胞、真皮ＤＣ、ｍＤＣ及びｐＤＣにおけるＤＣＩＲ発現に関する以前の知見（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983、Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）を確認し、皮膚ＬＣにおけるその発現をさらに示す。

抗ＤＣＩＲコンジュゲートによるＦｌｕＭＰタンパク質の交差提示：抗ＤＣＩＲ抗体と化学的にカップリングしたＦｌｕＭＰタンパク質（図２Ａ、コンストラクトＩ）を用いた試験により、ＤＣＩＲは、抗原と連結されると、免疫優性ＨＬＡ−Ａ２０１制限ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチドの交差提示ができることを立証した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。この結果から、本出願人らは、組換え抗ＤＣＩＲ（又は対照ＩｇＧ４抗体）及びＦｌｕＭＰに基づく融合タンパク質を構築したが、これらをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞から効率的に分泌させることができなかった。従って、本出願人らは、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）由来のセルロソームの２種のタンパク質（Flamar et al.）であるコヒーシン及びドッケリン間の高親和性相互作用（ほぼ３０ｐＭ）に基づく戦略を練った。ｍＡｂ．ドッケリン融合タンパク質（ｍＡｂ．ｄｏｃ）（図２Ａ、コンストラクトII及び図２Ｄ）は、トランスフェクトした哺乳類細胞から容易に分泌され、プロテインＡ親和性カラムにおいて精製された。対照ｈＩｇＧ４Ｈ及び組換え抗ＤＣＩＲ抗体はそれぞれ、ジスルフィド結合を安定化し、残存ＦｃＲ相互作用を抑止するＳ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅ置換を保有する（Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, et al. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000;164:1925-1933）。可溶性コヒーシン融合タンパク質（ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ）として、大腸菌においてＦｌｕＭＰを産生した（図２Ａ、コンストラクトII及び図２Ｄ）。ＤＣへと送達する前に等モル量のｍＡｂ．ｄｏｃ及びｃｏｈ．ＦｌｕＭＰを１５分間インキュベートすることにより、標的化コンジュゲートを生成した。組換え抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂ（黒矢印）は、ヒト単球由来のＤＣ表面と結合したが、対照コンジュゲートＩｇＧ４−ＦｌｕＭＰ（白矢印）は、細胞を結合しなかった（図２Ｅ）。

組換え抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂが、ＤＣによってプロセシング及び提示されたか決定するため、ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ドナーから得られたＤＣを５０ｎＭコンジュゲートｍＡｂと共に２４時間培養し、ＨＬＡ−Ａ２０１と結合したＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチドを検出するモノクローナル抗体（Ｍ１Ｄ１２）で染色した。抗ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂに曝露されたＤＣは、その表面にＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチドコンジュゲートを示す（黒ヒストグラム）（図２Ｆ）。

精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞への抗原提示を評価するため、２種の濃度（８ｎＭ及び０．８ｎＭ）の組換えコンジュゲートｍＡｂをＣＤ３４^＋ＨＰＣ由来のＬＣに与えた。８ｎＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰは、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖の誘導において、ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰよりも強力であった（１０．５％四量体陽性細胞対０．９％）（図２Ｇ、上パネル）。より低いコンジュゲートｍＡｂ濃度（０．８ｎＭ）におけるＤＣＩＲによる標的化の効力を確認したが、この濃度では対照コンジュゲートｍＡｂは殆ど交差提示しなかった（２．８％対０．２％陽性細胞）（図２Ｇ、下パネル）。ＤＣをコンジュゲートｍＡｂ（８ｎＭ）に１８時間しか曝露せず、ＣＤ８^＋Ｔ細胞との培養前に洗浄した場合における、抗原をＤＣに対し標的化するＤＣＩＲの能力をさらに図解した（４．１２±２．１３％対０．０５±０．０２％四量体陽性細胞）（図２Ｈ）。

このように、ＤＣＩＲによるエキソビボで生成されたＤＣに対し標的化された抗原の送達は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するタンパク質の効率的な交差提示を可能にする。

抗ＤＣＩＲコンジュゲートは、皮膚ランゲルハンス細胞血液ｍＤＣ及び血液ｐＤＣによるタンパク質の交差提示を可能にする：これらの融合タンパク質は、ワクチンとして用いられることを目的とするため、本出願人らは、コンストラクトが、皮膚又は血液のいずれかから単離されたヒトＤＣサブセットにより交差提示されるか評価した。よって、８ｎＭの組換え抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートを、５×１０^３個の選別された表皮ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ＬＣ及び１×１０^５個の精製された血液ＣＤ８^＋Ｔ細胞の培養物に１０日間添加した（図３）。この結果、ＩｇＧ４対照コンジュゲートｍＡｂと比較した場合、ＤＣＩＲ標的化ＬＣによるＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をもたらした（３．４％対０．７％）。遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（１％）又はＬＣにより発現しないレクチンに対するコンジュゲート、即ちＤＣ−ＳＩＧＮ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（０．６％）（図３Ａ）は、仮にあるとしても非常に弱く交差提示された。ランゲルハンス細胞特異的レクチンであるランゲリンに対する抗体−抗原コンジュゲートは、ＬＣによるＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（８．２％）。四量体特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図３Ａ）の増殖は、培養上清において測定されたＩＦＮ−γのレベルと相関した（図３Ｂ）。

血液ＤＣの両方のサブセットであるＣＤ１１ｃ^＋ｍＤＣ及びＢＤＣＡ２^＋ｐＤＣは、ＤＣＩＲを発現する（図１Ａ）。よって、同一細胞吸着除去療法試料から精製されたｍＤＣ及びｐＤＣ（Di Pucchio T, Chatterjee B, Smed-Sorensen A, et al. Direct proteasome-independent cross-presentation of viral antigen by plasmacytoid dendritic cells on major histocompatibility complex class I. Nat Immunol. 2008;9:551-557）を、ＤＣＩＲにより送達されたＦｌｕＭＰを交差提示するその能力に関して検査した。５×１０^３個のＤＣを、１×１０^５個の自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と、減少濃度の遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ、ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲート又は抗ＤＣＩＲｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートのいずれかと共に培養した。

抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂ（図４Ａ）は、８０ｐＭもの低濃度で１．８％四量体陽性細胞が得られたため、ｍＤＣに対しＦｌｕＭＰを効率的に標的化した。Ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰそれ自体及び対照ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートは、８ｎＭでやっと抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導することができた。

ｐＤＣは、８ｎＭの濃度で３種の型の組換えＦｌｕＭＰを交差提示することができた。０．８ｎＭ及び８０ｐＭにおいて、抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂは、ＦｌｕＭＰ抗原の交差提示を可能にしたが、遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートは、交差提示されなかった（図４Ｂ）。ｐＤＣと比較すると、８ｎＭの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂで標的化したｍＤＣは、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のより堅調な増殖を誘導することができた（特異的ＨＬＡ−Ａ２０１四量体により測定）（図４Ｃ）（ｐ＝０．０２）。

総括すると、これらのデータは、抗ＤＣＩＲｍＡｂが、皮膚ランゲルハンス細胞、血液ｍＤＣ及びｐＤＣによる交差提示のためにタンパク質を強力に標的化することを表示する。

抗ＤＣＩＲコンジュゲートによるＭＡＲＴ−１及びＨＩＶｇａｇタンパク質の交差刺激：本発明者らは、ＤＣＩＲが、ｉ）抗ＤＣＩＲ．ドッケリンと、１０ｍｅｒＭＡＲＴ−１（２６〜３５）ＨＬＡ−Ａ２０１制限ペプチド（EAAGIGILTV）（図２Ａ、III）（配列番号９）と融合したコヒーシン、ii）ＭＡＲＴ−１組換えタンパク質（図２Ａ、IV）又はＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質（図２Ａ、Ｖ）と直接的に融合した抗ＤＣＩＲを用いてナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を交差刺激できるかさらに検査した。表皮ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ＬＣを、自己Ｔ細胞と、３０ｎＭ抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１コンジュゲートｍＡｂと共に培養した。１０日後、ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）−ＨＬＡ−Ａ２０１^＋四量体の結合は、抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１コンジュゲートｍＡｂが、皮膚由来のＬＣにＣＤ８^＋Ｔ細胞を初回刺激させ、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させたことを表示した（図５Ａ）。

抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質（図２Ａ、IV）の発現の成功により、本出願人らは、ＭＡＲＴ−１タンパク質の他のエピトープに対する交差刺激をさらに評価した。よって、ＤＣを抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質のいずれか、或いはタンパク質なしで曝露し、ＣＤ４０Ｌにより活性化し、自己精製ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と培養した。１０日後、細胞を、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する個々のペプチドのクラスターをロードしたＤＣ又は無ロードＤＣで５時間再刺激した。細胞傷害活性決定のマーカーである、ＣＤ１０７ａの細胞表面への動員と、細胞質内ＩＦＮ−γの発現を測定して、特異的ＣＴＬ応答を評価した。抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質は、ＭＡＲＴ−１タンパク質のクラスター１、クラスター４及びクラスター５由来のペプチドへとＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（図５Ｂ）。ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質によるＤＣの標的化は、高レベルのエフェクター分子グランザイムＢ及びパーフォリンを発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（図５Ｃ）。

抗ＤＣＩＲ−ｐ２４及びＩｇＧ４−ｐ２４融合タンパク質（図２Ａ、Ｖ）も、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞から十分に分泌された。よって、健常個体から得られた精製ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＤＣと、これら融合タンパク質のいずれか又はタンパク質なしとの２回連続した７日間培養により初回刺激した。増殖しているＣＦＳＥ^ｌｏｗＣＤ８^＋Ｔ細胞を選別し、ＨＩＶｇａｇｐ２４（ｐ２４）タンパク質をロードしたＤＣにより再度ロードした。抗ＤＣＩＲ−ｐ２４融合タンパク質により初回刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞（黒バー）は、ｐ２４ロードに応答してＩＦＮ−γを分泌することができたが、対照融合タンパク質はできなかった（灰色のバー）（図５Ｄ）。この結果は、抗ＤＣＩＲ−ｐ２４融合タンパク質によるナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の特異的な初回刺激を表示する。

本発明の本試験の知見は、ＤＣＩＲによる抗原の標的化が、自己及び非自己抗原両方に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の初回刺激を可能にすることを立証する。

ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＤＣＩＲ媒介***差提示を増強する：ＴＬＲ誘発（triggering）は、ＤＣを活性化するため、本出願人らは、ＴＬＲリガンドが、抗ＤＣＩＲコンジュゲートにより標的化されたｍＤＣによって誘導される抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を増強するか解析した。５×１０^３個の精製血液ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ｍＤＣを、増加量の抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂと、ＴＬＲ３（ポリＩ：Ｃ；５μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４（ＬＰＳ；５０ｎｇ／ｍｌ）又はＴＬＲ７／８（ＣＬ０７５；１μｇ／ｍｌ）のアゴニストと、１×１０^５個の自己精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に培養した。ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）四量体を用いて、８〜１０日後に特異的ＦｌｕＭＰＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を測定した。ＴＬＲ３アゴニスト（ポリＩ：Ｃ）は、低濃度の標的化コンジュゲート（２ｎＭ及び０．２ｎＭ）でＦｌｕＭＰ特異的応答を増強したが、ＴＬＲ４による活性化は増強しなかった。ＴＬＲ７／８アゴニスト（ＣＬ０７５）は、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖において最も強力であることが判明した（図６Ａ）。検査した全濃度の抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートにおいて、ＣＬ０７５により増強された応答が観察され、これはｍＡｂ標的化コンジュゲートの存在に依存した（図６Ａ及び図６Ｂ）。ポリＩ：Ｃの５μｇ／ｍｌから２５μｇ／ｍｌへの又はＬＰＳの５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌへの濃度増加は、ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂに応答した抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を有意に増強しなかった。しかし、ＴＬＲ３活性化は、ＴＬＲ４活性化よりも高度なＦｌｕＭＰ特異的応答をもたらした（図６Ｃ）。低濃度の０．２μｇ／ｍｌのＴＬＲ７／８アゴニストは、ＦｌｕＭＰ特異的応答の増強に十分であった（図６Ｃ）。ＴＬＲアゴニストに加えて可溶性ＣＤ４０Ｌを添加しても、有意な相乗効果は見られなかった（図示せず）。

検査濃度又は検査した活性化因子の組み合わせ毎に、抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰに対するＦｌｕＭＰ特異的応答は、対照ＩｇＧ４．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（図６Ｂ及び図６Ｃ）又は遊離型ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰ（図示せず）により誘導された応答よりも常に有意に高かった。このように、ＴＬＲ７／８活性化は、ｍＤＣによるタンパク質抗原のＤＣＩＲ依存***差提示を増強する。

ＴＬＲ７／８アゴニストは、ＤＣＩＲ媒介***差刺激を増強する：本発明者らは、ＴＬＲ７／８リガンドもＤＣＩＲ媒介性一次ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を増強するかさらに調査した。血液ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ｍＤＣを、抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又はＩｇＧ４−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質（図２Ａ、コンストラクトIV）のいずれかと培養した。ＤＣをＣＤ４０Ｌ、ＴＬＲ３−Ｌ、ＴＬＲ４−Ｌ又はＴＬＲ７／８−Ｌにより活性化し、精製ＣＦＳＥ標識ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。１０日後、特異的四量体を用いてＭＡＲＴ−１（２６〜３５）−ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＦＳＥ^ｌｏｗＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を評価した（図７Ａ）。ＴＬＲ７／８で活性化したＤＣは、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の最高の増殖を誘導した（０．１８％）（図７Ａ）。血液ｍＤＣと、単回投与の抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１又は抗ＤＣＩＲ−ｐ２４融合タンパク質（図２Ａ、コンストラクトIV及びＶ）両方を、ＴＬＲ７／８アゴニストと共に用いたが、ＣＤ４０Ｌを用いない第二の実験において、ＭＡＲＴ−１及びＨＩＶｇａｇｐ２４−ＨＬＡ−Ａ２０１四量体結合ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（０．１８％対０．０１％と、０．１５％対０．０１％）（図７Ｂ）。しかし、二次応答とは異なり、ＣＤ４０及びＴＬＲ７／８両方による同時シグナル伝達は、相乗効果と、ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲ７／８アゴニスト単独と比較して四量体結合ＣＤ８^＋Ｔ細胞のより大規模な増殖をもたらした（０．３％対０．３７％対０．８３％）（図７Ｃ及び図７Ｄ）。よって、ＴＬＲ７／８アゴニストは、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の交差刺激及び交差提示を増強する。

ＴＬＲ７／８リガンドは、ＣＴＬエフェクター分子を増加し、２型サイトカイン産生を減少する：次の試験設定は、ＤＣＩＲ標的化におけるＴＬＲ７／８誘発が、誘発された応答の質を変化させるか決定するよう設計した。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、自己ＨＬＡ−Ａ２０１^＋ｍＤＣと、活性化なし又はＣＤ４０Ｌ若しくはＣＬ０７５単独で活性化又はＣＤ４０Ｌ＋ＣＬ０７５で活性化した抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質と共に培養した。１０日後、細胞をＨＬＡ−Ａ２０１−ＭＡＲＴ−１（２６〜３５）四量体及びグランザイムＢ又はパーフォリン特異的ｍＡｂで染色した。各活性化因子単独と比較すると、ＣＤ４０Ｌ及びＴＬＲ７／８アゴニストの組み合わせは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖によるエフェクター分子グランザイムＢ（図７Ｃ；左パネル）及びパーフォリン（図７Ｃ；右パネル）のより高い発現を誘導した。

ＣＤ４０Ｌ、ポリＩ：Ｃ又はＬＰＳ馴化ＤＣと比較すると、抗ＤＣＩＲ−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質及びＴＬＲ７／８アゴニストにより標的化されたＤＣにより初回刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＭＡＲＴ−１タンパク質由来のペプチドをロードした自己ＤＣによる特異的再刺激に応答してより多量のＩＦＮ−γを発現した（図７Ｅ；上パネル）。第二のモデル抗原であるＨＩＶｇａｇｐ２４により、本出願人らは、初回刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞の質におけるＴＬＲ７／８リガンドの効果をさらに立証できた。よって、抗ＤＣＩＲ−ｐ２４融合タンパク質標的化ＤＣにより初回刺激され、ＴＬＲ７／８アゴニストにより活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質由来の１５アミノ酸重複ペプチドをロードした自己ＤＣによる特異的再刺激に応答したＣＤ４０Ｌ、ポリＩ：Ｃ又はＬＰＳにより活性化されたＤＣと比較して、より多量のＩＦＮ−γを発現した（図７Ｅ；下パネル）。予想通り、細胞質内ＩＦＮ−γのレベルは、抗原がＤＣＩＲにより送達される場合、対照ＩｇＧ４ｍＡｂと比較してより高かった（図７Ｅ）。興味深いことに、ＤＣＩＲで初回刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌ又はＣＬ０７５で誘発したＤＣのいずれかに最初に曝露されたかに応じて、ＭＡＲＴ−１ペプチドロードＤＣによる再活性化に応答して異なるセットのサイトカインを産生した（図７Ｆ）。ＣＤ４０Ｌ成熟化ＩＦＮ−α ＤＣは、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導して、多量の２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）を発現させたが、ＴＬＲ７／８に曝露したＤＣは、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を教育して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを優先的に分泌させ、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の量を顕著に低下させた（図７Ｆ）。その上、細胞内染色により観察される通り、各活性化因子単独と比較すると、ＴＬＲ７／８及びＣＤ４０Ｌの組み合わせは、ＭＡＲＴ−１タンパク質に由来する１５アミノ酸重複ペプチドによる再刺激に応答して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の最も堅調な増殖を誘導した（図７Ｇ）。このように、ＴＬＲ７／８活性化は、ＩＦＮ−γ分泌を増強し、２型サイトカイン分泌を低下させることにより、ＤＣＩＲ標的化ｍＤＣによる一次ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の質を変化させる。

上文に示す試験は、ＩＴＩＭモチーフを発現する表面レクチンであるＤＣＩＲのライゲーションが、ＤＣ活性化の不活性化又は防止をもたらすであろうことを前提として開始された。以前に記載された通り、ＤＣＩＲは、血液単球において高密度で発現され、Ｂ細胞においてより低レベルで発現される（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983）。ＤＣＩＲは、また、精製真皮ＣＤ１４^＋ＤＣにおいて高密度で発現されるが、この結果は以前の免疫組織化学データと一致する（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983）。しかし、これらのデータと矛盾することに、ＤＣＩＲは、表皮ランゲルハンス細胞においてその精製後に発現され、またインタクト表皮シートにおいて発現されることが判明した。ＤＣＩＲ発現は、ＣＤ３４^＋ＨＰＣをＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αと培養することによりインビトロで生成されたＬＣでも観察されるため、ＬＣに関するこの２試験の矛盾は興味深い（Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med. 1996;184:695-706）。本出願人ら及び他の研究者らは、血液骨髄系ＤＣ（Meyer-Wentrup F, Cambi A, Joosten B, et al. DCIR is endocytosed into human dendritic cells and inhibits TLR8-mediated cytokine production. J Leukoc Biol. 2009;85:518-525）及び血液形質細胞様ＤＣ（Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）において高密度で発現されるＤＣＩＲも見出した。このように、ＤＣＩＲは、血液及び皮膚ＤＣの全ヒトＤＣサブセットによって発現される。

ＤＣＩＲと１２種の異なる抗ＤＣＩＲ抗体の会合は、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現又はサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２等）の分泌のいずれかにより測定される通り、ＤＣ活性化を阻害も増強もしない。ＤＣＩＲ架橋は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のＤＣ媒介性増殖を増強も阻害もしない。加えて、マイクロアレイ解析によって評価される通り、ＤＣＩＲのライゲーションは、ＣＤ４０とは対照的に、単離された表皮細胞による活性化遺伝子シグネチャーを明らかにしなかった（データ図示せず）。しかし、ＤＣＩＲの阻害的役割の証拠は、コラーゲン誘導性関節炎に対する応答の増悪を示し、活性化されたＤＣ及び活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の数が増加したｄｃｉｒ欠損マウスにおいて実証された（Fujikado N, Saijo S, Yonezawa T, et al. Dcir deficiency causes development of autoimmune diseases in mice due to excess expansion of dendritic cells. Nat Med. 2008;14:176-180）。しかし、マウスゲノムが４種のＤＣＩＲ様分子、ＤＣＩＲ−２、ＤＣＩＲ−３、ＤＣＩＲ−４及びＤＣＡＲ−１をコードするのに対し、ヒトゲノムは１種類しかコードしないため、マウスとヒトは、ＤＣＩＲ遺伝子コンジュゲートのレベルが相当に異なることに留意されたい。これに代わる説明として、本出願人らが生成したｍＡｂが、陰性シグナルを生じ得ない、或いは、本出願人らの抗体が、これまで未同定のヒトのマウス活性化受容体ＤＣＡＲカウンターパートであるａｓと交差反応する可能性が挙げられる。別の可能性は、ＤＣＩＲの阻害シグナルが、ＤＣ以外の細胞、即ち、単球又はＢ細胞において送達されることとなり得る（Kanazawa N, Okazaki T, Nishimura H, Tashiro K, Inaba K, Miyachi Y. DCIR acts as an inhibitory receptor depending on its immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Invest Dermatol. 2002;118:261-266）。ヒトにおいて、近年の研究（Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）は、同時刺激分子の発現に影響を及ぼすことのないｐＤＣによるＴＬＲ９誘導のＩＦＮ−γ産生の僅かな阻害と、ＴＬＲ８活性化ｍＤＣによるＩＬ−１２及びＴＮＦ−α産生の低下を立証した（Meyer-Wentrup F, Cambi A, Joosten B, et al. DCIR is endocytosed into human dendritic cells and inhibits TLR8-mediated cytokine production. J Leukoc Biol. 2009;85:518-525）。最後に、ＢＤＣＡ−２（Dzionek A, Sohma Y, Nagafune J, et al. BDCA-2, a novel plasmacytoid dendritic cell-specific type II C-type lectin, mediates antigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/beta induction. J Exp Med. 2001;194:1823-1834）及びＤＣＡＬ−２（Chen CH, Floyd H, Olson NE, et al. Dendritic-cell-associated C-type lectin 2 (DCAL-2) alters dendritic-cell maturation and cytokine production. Blood. 2006;107:1459-1467）等、他のレクチンに関し立証される通り、細胞の背景に応じて、ＩＴＩＭは、細胞の活性化を抑制するのではなく、時に刺激することができる（Barrow AD, Trowsdale J. You say ITAM and I say ITIM, let's call the whole thing off: the ambiguity of immunoreceptor signalling. Eur J Immunol. 2006;36:1646-1653）。

受容体ＤＣＩＲを介して送達された抗原は、メモリーＴ細胞に対し効率的に交差提示されることが判明した。８０ｐＭもの低さの抗ＤＣＩＲ．ｄｏｃ−ｃｏｈ．ＦｌｕＭＰコンジュゲートｍＡｂの濃度は、ＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の有意な増殖の誘導に十分であった。この結果は、固有の抗原提示能のおよそ１００倍の増強を表す。このような効果は、ＤＥＣ−２０５融合タンパク質によるネズミの試験において以前に報告された（Bonifaz LC, Bonnyay DP, Charalambous A, et al. In Vivo Targeting of Antigens to Maturing Dendritic Cells via the DEC-205 Receptor Improves T Cell Vaccination. J Exp Med. 2004;199:815-824）。検査したＤＣサブセットの全てがＤＣＩＲ融合タンパク質により標的化され、特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘導すると判明したことは、注目すべき発見である。実際に、以前の研究（Bates EE, Fournier N, Garcia E, et al. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol. 1999;163:1973-1983、Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）とは異なり、抗ＤＣＩＲは、血液ｐＤＣと表皮ランゲルハンス細胞へと抗原を効率的に送達することができ、特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の生起を可能にした。ＤＣＩＲを介した抗原送達は、メモリーＦｌｕＭＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を可能にするだけではなく、メラノーマ分化抗原ＭＡＲＴ−１及びＨＩＶｇａｇｐ２４タンパク質に対するナイーブＣＤ８^＋Ｔの初回刺激をもたらした。その上、ＤＣＩＲ媒介性応答は幅広く、ＭＡＲＴ−１タンパク質の複数のエピトープに特異的である。近年、ＤＣＩＲ２に対するモノクローナル抗体は、マウスにおけるＣＤ８−ＤＣＩＲ２^＋サブセットを優先的に標的化し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＨＣクラスII制限再活性化の優先的誘導をもたらすことが判明した（Dudziak D, Kamphorst AO, Heidkamp GF, et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 2007;315:107-111）。同様に、抗ＤＣＩＲは、ヒトｐＤＣに対しＫＬＨを標的化し、これによりＫＬＨ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞株の増殖を可能にすることが示された（Meyer-Wentrup F, Benitez-Ribas D, Tacken PJ, et al. Targeting DCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN-alpha production. Blood. 2008;111:4245-4253）。本発明は、ＤＣＩＲが、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を確立し再活性化するための強力な手段でもあることを立証する。皮膚ランゲルハンス細胞、血液ｍＤＣ及びｐＤＣを包含する全ＤＣは、ＤＣＩＲを介して送達された抗原の交差提示において効率的であった。同時に、これらのデータは、ＤＥＣ−２０５等、ＤＣＩＲを介した抗原送達が、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII制限免疫応答の両方の誘導をもたらし得ることを表示する。

将来的なワクチンは、アジュバントと共にこれらの標的化抗原で構成される可能性が高くなるため、本出願人らは、微生物（ＴＬＲ）刺激が、ｍＤＣによるＤＣＩＲ媒介性抗原交差提示を改善するかについても取り組んだ。検査した全活性化因子のうち、ＴＬＲ７／８アゴニストは、一次及び二次応答の両方において、特に、一次応答の場合において、ＣＤ４０シグナルと共に送達される場合、このプロセスにおいて最も有効であり、抗原特異的エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞の最高増殖を誘導したことを証明した。特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の増幅に加えて、ＴＬＲ７／８誘発も、ＩＦＮ−γ並びにグランザイムＡ、グランザイムＢ及びパーフォリン等、エフェクター分子の高発現を促進することにより、誘導されたＴ細胞の質に影響を及ぼした。その上さらに、ＤＣＩＲ標的化ＩＦＮ−αＤＣは、ＣＤ４０Ｌ初回刺激ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化して、多量の２型（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）サイトカインを産生したが、ＴＬＲ７／８アゴニストは、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生増強と関連する１型応答に向けてバランスをシフトし、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のレベルを顕著に低下させた。本出願人らの知見は、ＴＬＲ７／８誘発に対する増強されたタンパク質に基づくワクチンにより誘導されたＴ細胞応答に起因する以前の観察と一致する（Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, et al. HIV Gag protein conjugated to a Toll-like receptor 7/8 agonist improves the magnitude and quality of Th1 and CD8+ T cell responses in nonhuman primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15190-15194、Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, et al. Toll-like receptor agonists influence the magnitude and quality of memory T cell responses after prime-boost immunization in nonhuman primates. J Exp Med. 2006;203:1249-1258）。ＳＩＶの非ヒト霊長類モデルにおいて、ＴＬＲ７／８リガンドと共に送達されたタンパク質抗原は、Ｔｈ１応答と、多機能性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増強された耐久性のある増殖の誘導を促進した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を同時に産生するこれらの細胞は、ＨＩＶ発症感染者（progressor）と比べて未発症感染者（nonprogressor）に豊富であり、長期防御と関連する。従って、ＴＬＲ７／８アゴニストと標的化タンパク質に基づくワクチンとの組み合わせは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞がエフェクター機能を媒介する慢性疾患の治療に有益となるべきである。

本発明の設定において、本出願人らが用いたＴＬＲアゴニストが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞における直接的な効果を有した可能性も除外できない。一部の研究が以前に立証した通り、ＣＤ４^＋Ｔ細胞における直接的なＴＬＲ誘発は、同時刺激分子の上方制御を誘導し、その増殖を調節できる（Caron G, Duluc D, Fremaux I, et al. Direct stimulation of human T cells via TLR5 and TLR7/8: flagellin and R-848 up-regulate proliferation and IFN-gamma production by memory CD4+ T cells. J Immunol. 2005;175:1551-1557、Simone R, Floriani A, Saverino D. Stimulation of Human CD4 T Lymphocytes via TLR3, TLR5 and TLR7/8 Up-Regulates Expression of Costimulatory and Modulates Proliferation. Open Microbiol J. 2009;3:1-8）。にもかかわらず、抗原が、個々に送達されるのではなくアジュバントと融合される場合、多くの有効な多機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が誘導されることが立証され（Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, et al. HIV Gag protein conjugated to a Toll-like receptor 7/8 agonist improves the magnitude and quality of Th1 and CD8+ T cell responses in nonhuman primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15190-15194）、これは、ＮＹ−ＥＳＯ及び局所的ＴＬＲ７アゴニストをワクチン接種したメラノーマ患者におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の欠如を説明できる知見である（Adams S, O'Neill DW, Nonaka D, et al. Immunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ESO-1 protein using TLR7 agonist imiquimod as vaccine adjuvant. J Immunol. 2008;181:776-784）。このように、本出願人らの独自データは、抗原及びアジュバントをＤＣへと直接的に送達するための最も効率的な方法として、ＴＬＲアゴニストをＤＣＩＲ等、標的化抗原ワクチンとコンジュゲートするアプローチを支持する。しかし、いずれの活性化因子又は活性化因子の組み合わせ、またいずれのワクチン製剤が、最も強力な持続性のＣＤ８^＋Ｔ細胞応答をインビボで生じるか公式に結論するために、より多くの試験が必要とされる。

要約すると、様々なＤＣサブセットに対する臨床関連抗原のＤＣＩＲを介した標的化は、慢性疾患の予防及び治療に必須の強い細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の誘導を可能にするであろう。

本明細書に記されているいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬又は組成物に関しても実行でき、その逆もまた同じであることが企図される。その上、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。

本明細書に記載されている特定の実施形態が、本発明を限定するものとしてではなく、例証するために示されていることが理解されるであろう。本発明の主要な特色は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、本明細書に記載されている特定の手順に対し多くの均等物を認識するであろう、或いは単なるルーチン実験により確定できるであろう。このような均等物は、本発明の範囲内にあると考慮され、特許請求の範囲の対象となる。

本明細書において言及されているあらゆる刊行物及び特許出願は、本発明が属す分野の当業者の技能レベルを示す。あらゆる刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願それぞれが、特別に且つ個々に援用されていると示されているのと同じ程度まで、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全ての内容を援用する。

特許請求の範囲及び／又は本明細書において、語句「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、用語「含む（comprising）」と併せて用いた場合、「１」を意味し得るが、「１又は２以上」、「少なくとも１」及び「１又は１を超える」の意義とも矛盾しない。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、他の意義のみを指すと明らかに示されない限り、或いは、他の意義が相互排他的でない限り、「及び／又は（and/or）」を意味するよう用いられるが、本開示は、他の意義及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本願を通じて、用語「約（about）」は、値が、デバイス、値を決定するために用いられる方法の誤差の固有の変動又は試験対象に存在する変動を包含することを示すよう用いられる。

本明細書及び請求項（複数可）において、語句「含む（comprising）」（並びに「comprise」及び「comprises」等、含む（comprising）のいかなる形態も）、「有する（having）」（並びに「have」及び「has」等、有する（having）のいかなる形態も）、「包含する（including）」（並びに「includes」及び「include」等、包含する（including）のいかなる形態も）又は「含有する（containing）」（並びに「contains」及び「contain」等、含有する（containing）のいかなる形態も）は、包括的又はオープンエンドであり、追加的な言及されていない要素又は方法ステップを除外しない。

本明細書において、用語「又はそれらの組み合わせ（or combinations thereof）」は、この用語に先行する列挙されている品目のあらゆる並べ替え及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣ、特定の文脈において順番が重要である場合は、それに加えてＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢのうち少なくとも１種類を包含することを目的とする。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢその他等、１又は２以上の品目又は用語の繰り返しを含有する組み合わせが明確に包含される。当業者であれば、文脈からそうでないことが明らかでない限り、通常、いかなる組み合わせの品目又は用語も数に制限がないことを理解するであろう。

本明細書において開示及び主張されているあらゆる組成物及び／又は方法は、過度の実験をすることなく、本開示を踏まえて実行及び実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物及び／又は方法に、また方法のステップ又は一連のステップにおいて変更を適用できることが明らかであろう。当業者にとって明らかなこのような類似の置換及び修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明の精神、範囲及び概念に含まれると考慮される。
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Claims

ヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生起させるための免疫賦活組成物であって、
前記免疫応答、予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせが望ましい疾患又は状態に関係又は関与する１又は２以上の抗原の１又は２以上のエピトープを代表する１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングした、１又は２以上の抗樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片と、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、
薬学的に許容される担体と
を含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、免疫賦活を必要とするヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために前記免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれる組成物。
アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む、請求項１に記載の組成物。
抗ＤＣ特異的抗体又は断片が、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される、請求項１に記載の組成物。
抗ＤＣ特異的抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である、請求項１に記載の組成物。
抗原ペプチドが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ四量体、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原又はそれらの組み合わせ及び改変物を含む、請求項１に記載の組成物。
抗原ペプチドが癌ペプチドであり、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸部、子宮、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌等の尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は***、上咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病由来の抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される、請求項１に記載の組成物。
腫瘍関連抗原が、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される、請求項６に記載の組成物。
抗ＤＣ特異的抗体がヒト化されている、請求項１に記載の組成物。
経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内及び静脈内からなる群から選択される注射としてヒト又は動物対象へと投与される、請求項１に記載の組成物。
１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングした１又は２以上の抗樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片と、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、
１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントと
を含み、前記抗体及び前記アゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、ヒト又は動物対象において予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチン。
アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む、請求項１０に記載のワクチン。
抗ＤＣ特異的抗体又は断片が、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される、請求項１０に記載のワクチン。
抗ＤＣ特異的抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である、請求項１０に記載のワクチン。
抗原ペプチドが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ四量体、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原又はそれらの組み合わせ及び改変物を含む、請求項１０に記載のワクチン。
抗原ペプチドが、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原を含む癌ペプチドである、請求項１０に記載のワクチン。
抗ＤＣ特異的抗体がヒト化されている、請求項１０に記載のワクチン。
組成物が、経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は注射としてヒト又は動物対象に投与される、請求項１０に記載のワクチン。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示の有効性を増加させるための方法であって、
１又は２以上の抗樹状細胞（ＤＣ）特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップと、
１又は２以上の天然型又は工学的に作製された抗原ペプチドを前記ＤＣ特異的抗体にロード又は化学的にカップリングして、抗体−抗原コンジュゲートを形成するステップと、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを、前記コンジュゲートに添加するステップと、
抗原提示細胞（ＡＰＣ）を前記コンジュゲート及び前記ＴＬＲアゴニストと接触させるステップと
を含み、前記抗体−抗原コンジュゲートがプロセシングされ、Ｔ細胞認識のために提示される方法。
抗原提示細胞を接触させるステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、抗体−抗原コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加する任意選択のステップと、
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定する任意選択のステップと
をさらに含み、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化が、前記抗原提示細胞による抗原提示の有効性の増加を示す、請求項１８に記載の方法。
ＡＰＣが、樹状細胞（ＤＣ）を含む、請求項１８に記載の方法。
抗ＤＣ特異的抗体又は断片が、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される、請求項１８に記載の方法。
抗ＤＣ特異的抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ１０２４６又はＰＴＡ１０２４７から選択される抗ＤＣＩＲ抗体である、請求項１８に記載の方法。
抗原ペプチドが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、一連のＨＩＶペプチド（Ｈｉｐｏ５）、ＰＳＡ四量体、ＨＩＶｇａｇ由来のｐ２４−ＰＬＡＨＩＶｇａｇｐ２４（ｇａｇ）及び他のＨＩＶコンポーネントからなる群から選択されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、肝炎ウイルス抗原、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕ株由来のインフルエンザＡ赤血球凝集素ＨＡ−１、ＨＬＡ−Ａ２０１−ＦｌｕＭＰ（５８〜６６）ペプチド四量体及びトリインフルエンザ（ＨＡ５−１）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス抗原及びペプチド、クロストリジウム・サーモセラム由来のドッケリンドメイン、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ロタウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原又はそれらの組み合わせ及び改変物を含む、請求項１８に記載の方法。
抗原ペプチドが、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１−４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２等）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、ＭＡＲＣＯ−ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマ遍在性変異型遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２−１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）１−６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７から選択される腫瘍関連抗原を含む癌ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
抗ＤＣ特異的抗体がヒト化されている、請求項１８に記載の方法。
１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、
１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントと
を含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、それを必要とするヒト又は動物対象において１又は２以上の疾患又は状態に対する予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチン。
ヒト対象におけるインフルエンザ、ＨＩＶ、癌及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせにおける使用に適合される、請求項２６に記載のワクチン。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号１を含むＦｌｕＭＰペプチドである、請求項２６に記載のワクチン。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号２を含むＭＡＲＴ−１ペプチドである、請求項２６に記載のワクチン。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号３を含むＨＩＶｇａｇｐ２４ペプチドである、請求項２６に記載のワクチン。
アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む、請求項２６に記載のワクチン。
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片をさらに含む、請求項２６に記載のワクチン。
ヒト対象における１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせのための方法であって、
１又は２以上の疾患又は状態に対する治療、予防法又はそれらの組み合わせを必要とするヒト対象を同定するステップと、
前記予防法、治療法又はその両方が望ましい前記１又は２以上の疾患又は状態に関係又は関与する１又は２以上の抗原の１又は２以上のエピトープを代表する１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む、抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、
１又は２以上の任意選択の薬学的に許容される担体及びアジュバントと
を含み、前記コンジュゲート及びアゴニストが、もう一方と組み合わせたときに、前記ヒト対象において前記１又は２以上の疾患又は状態に対する前記予防法、治療法又はそれらのいずれかの組み合わせのために免疫応答を生じさせるのに有効となるような量でそれぞれ含まれるワクチン組成物を投与するステップと
を含む方法。
１又は２以上の疾患又は状態が、インフルエンザ、癌、ＨＩＶ又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
癌が、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸部、子宮、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌等の尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍又は***、上咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号１を含むＦｌｕＭＰペプチドである、請求項３３に記載の方法。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号２を含むＭＡＲＴ−１ペプチドである、請求項３３に記載の方法。
１又は２以上の抗原ペプチドが、配列番号３を含むＨＩＶｇａｇｐ２４ペプチドである、請求項３３に記載の方法。
ワクチンが、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を含む、請求項３３に記載の方法。
ワクチンが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される、任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
ワクチンが、経口経路、経鼻経路により、局所的に、又は注射としてヒト対象に投与される、請求項３３に記載の方法。
ヒト対象において１又は２以上の樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示の有効性を増加させるための方法であって、
１又は２以上のＤＣをヒトから単離するステップと、
前記単離されたＤＣを、
１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、
薬学的に許容される担体と
を含む活性化量の組成物又はワクチンに曝露して、活性化されたＤＣ複合体を形成するステップと、
前記活性化されたＤＣ複合体を前記ヒト対象へと再導入するステップと
を含む方法。
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定する任意選択のステップをさらに含み、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化が、１又は２以上のＤＣの有効性の増加を示す、請求項４２に記載の方法。
ＤＣを曝露するステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される１又は２以上の任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片を添加するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
抗原ペプチドが、１又は２以上のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原及び遺伝子産物、１又は２以上の癌ペプチド及び腫瘍関連抗原又はその両方を含む、請求項４２に記載の方法。
１又は２以上の樹状細胞（ＤＣ）の活性化により、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原虫性、寄生虫性疾患及びアレルギー性障害の１又は２以上に対する予防法、治療法又はそれらの組み合わせのためにヒト対象に免疫賦活をもたらす方法であって、
前記ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原虫性、寄生虫性疾患及びアレルギー性障害の１又は２以上に対する予防法、治療法又はそれらの組み合わせのために、免疫賦活を必要とするヒト対象を同定するステップと、
前記ヒト対象から１又は２以上のＤＣを単離するステップと、
前記単離されたＤＣを、１又は２以上の抗原ペプチドをロード又は化学的にカップリングしたＤＣＩＲモノクローナル抗体又はその断片を含む抗樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）モノクローナル抗体コンジュゲートと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む活性化量の組成物又はワクチンに曝露して、活性化されたＤＣ複合体を形成するステップと、
前記活性化されたＤＣ複合体を前記ヒト対象へと再導入するステップと
を含む方法。
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３からなる群から選択される１又は２以上の作用物質のレベルを測定する任意選択のステップをさらに含み、前記１又は２以上の作用物質のレベルの変化が免疫賦活を示す、請求項４７に記載の方法。
ＤＣを曝露するステップの前に、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢ抗体断片、４−１ＢＢリガンドポリペプチド、４−１ＢＢリガンドポリペプチド断片、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１型サイトカイン、２型サイトカイン又はそれらの組み合わせ及び改変物からなる群から選択される１又は２以上の任意選択の作用物質を、コンジュゲート及びＴＬＲアゴニストに添加するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、デクチン−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１並びにＡＳＰＧＲと特異的に結合する抗体から選択される１又は２以上の任意選択の抗ＤＣ特異的抗体又はその断片を添加するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
抗原ペプチドが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼその他の百日咳細菌性抗原コンポーネント、ジフテリア細菌性抗原、ジフテリア毒素又はトキソイドその他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント、破傷風細菌性抗原、破傷風毒素又はトキソイドその他の破傷風細菌性抗原コンポーネント、連鎖球菌細菌性抗原、グラム陰性桿菌細菌性抗原、結核菌細菌性抗原、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント、肺炎球菌細菌性抗原、インフルエンザ菌細菌性抗原、炭疽菌細菌性抗原及びリケッチア細菌性抗原から選択される細菌性抗原を含む、請求項４７に記載の方法。
抗原ペプチドが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント、ヒストプラズマ真菌性抗原、クリプトコッカス真菌性抗原、コクシジオイデス真菌性抗原及び白癬真菌性抗原から選択される真菌性抗原を含む、請求項４７に記載の方法。
抗原ペプチドが、熱帯熱マラリア原虫抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、トキソプラズマ、住血吸虫抗原、森林型熱帯リーシュマニアその他のリーシュマニア抗原及びトリパノソーマ・クルージ抗原から選択される原虫性及び寄生虫性抗原を含む、請求項４７に記載の方法。
抗原ペプチドが、糖尿病、真性糖尿病、関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎及び間質性肺線維症から選択される自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原を含む、請求項４７に記載の方法。
抗原ペプチドが、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原、動物由来抗原、イエダニ抗原、ネコ抗原、組織適合性抗原及びペニシリンその他の治療薬から選択されるアレルギー性障害に関与する抗原を含む、請求項４７に記載の方法。
ＤＣ特異的抗体がヒト化されている、請求項４７に記載の方法。