JP2013520989A - Methods for genome cloning and manipulation - Google Patents

Abstract

異種宿主細胞中で合成または半合成ドナーゲノムをクローニングするための組成物および方法を、本明細書中に開示する。一つの態様においては、ドナーゲノムを、宿主細胞内でさらに改変することができる。改変したゲノムまたは未改変のゲノムを、さらに宿主細胞から単離し、かつレシピエント細胞に移入することができる。本明細書中に開示する方法は、扱いにくいドナー細胞由来のドナーゲノムを、より扱いやすい宿主細胞の中で変化させるために使用することができる。Disclosed herein are compositions and methods for cloning synthetic or semi-synthetic donor genomes in heterologous host cells. In one embodiment, the donor genome can be further modified in the host cell. The modified or unmodified genome can be further isolated from the host cell and transferred to the recipient cell. The methods disclosed herein can be used to alter donor genomes from unwieldy donor cells in more manageable host cells.

Description

配列表の組み入れ
本出願は、2010年5月19日に作成した配列表テキストファイル「SGI1270-2WO_ST25.txt」（ファイルのサイズ106,496バイト）として、EFS-Web経由で本明細書と同時に提出するアミノ酸配列および/または核酸配列への参照を含む。上記配列表は、37C.F.R.§1.52（e）（5）に従ってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。 Incorporation of Sequence Listing This application is a sequence listing text file “SGI1270-2WO_ST25.txt” (file size 106,496 bytes) created on May 19, 2010. The amino acid file submitted simultaneously with this specification via EFS-Web Includes references to sequences and / or nucleic acid sequences. The above sequence listing is incorporated herein by reference in its entirety according to 37C.FR §1.52 (e) (5).

背景
様々な種から単離された核酸分子のための宿主として、高度な遺伝子システムを持つ生物を使用することにより、該単離された核酸配列を該宿主中で操作することができる。しかし、外因性の宿主中で染色体およびゲノムをクローニングならびに改変することにより生物を変更する能力は、扱いやすい遺伝学を持つ酵母のような種に移入することができる核酸分子についてサイズの制限があることにより限定される。 Background By using organisms with advanced genetic systems as hosts for nucleic acid molecules isolated from various species, the isolated nucleic acid sequences can be manipulated in the host. However, the ability to alter organisms by cloning and modifying chromosomes and genomes in an exogenous host has size limitations for nucleic acid molecules that can be transferred to species such as yeast with manageable genetics It is limited by.

従来の方法によりクローニングされた核酸は、一般的には、数種類を超える遺伝子を含むことはないが、より大きな核酸（例えば、DNA）が宿主細胞に移入されている。例えば、16kbのマウスのミトコンドリアのゲノムが、大腸菌（E.coli）（Itaya et al, Nat Methods 5, 41（2008）（非特許文献1）;Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407（2003）（非特許文献2））、枯草菌（Bacillus subtilis）（Itaya et al, Nat Methods 5, 41（2008）（非特許文献1）;Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407（2003）（非特許文献2））、および酵母（Wheeler et al, Gene 198, 203（1997）（非特許文献3））にクローニングされている。139kbのトウモロコシの葉緑体のゲノムが酵母にクローニングされており（Gupta and Hoo, Plant Mol Biol 17, 361（1991）（非特許文献4）、そして135kbのイネの葉緑体のゲノムが枯草菌（B.subtilis）（Itaya et al, Nat Methods 5, 41（2008）（非特許文献1））にクローニングされている。1.8Mbのヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）のゲノムの約10％が、大腸菌の中に、エピソームエレメントとしてクローニングされている（Smailus et al, Syst Synth Biol;1, 139（2007）（非特許文献5））。3.5Mbのシネコシスティス（Synechocystis）PCC6803のゲノムは、2つのリボソームRNAオペロンを除く、枯草菌のゲノムの3つの不連続な領域に挿入された（Itaya et al, PNAS USA 102, 15971（2005）（非特許文献6））。完全な合成の0.6Mbのマイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）のゲノムが、環状の酵母セントロメアプラスミド（YCp）として酵母の中でアセンブリされている（Gibson et al, Science 319, 1215（2008）（非特許文献7）;Gibson et al., PNAS USA, 105（51）:20404-9（2008）（非特許文献8））。   Nucleic acids cloned by conventional methods generally do not contain more than a few genes, but larger nucleic acids (eg, DNA) have been transferred into host cells. For example, the 16 kb mouse mitochondrial genome is E. coli (Itaya et al, Nat Methods 5, 41 (2008) (Non-patent Document 1); Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407 (2003). (Non-patent document 2)), Bacillus subtilis (Itaya et al, Nat Methods 5, 41 (2008) (non-patent document 1); Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407 (2003) (non-patent document) Document 2)), and yeast (Wheeler et al, Gene 198, 203 (1997) (non-patent document 3)). A 139 kb corn chloroplast genome has been cloned in yeast (Gupta and Hoo, Plant Mol Biol 17, 361 (1991)), and a 135 kb rice chloroplast genome is Bacillus subtilis. (B. subtilis) (Itaya et al, Nat Methods 5, 41 (2008)), about 10% of the 1.8 Mb Haemophilus influenzae genome, It has been cloned as an episomal element in E. coli (Smailus et al, Syst Synth Biol; 1, 139 (2007)). The 3.5 Mb Synechocystis PCC6803 genome consists of two ribosomes. Inserted into three discontinuous regions of the Bacillus subtilis genome, excluding the RNA operon (Itaya et al, PNAS USA 102, 15971 (2005)). Genitalium (Mycoplasma genitalium) Geno Has been assembled in yeast as a circular yeast centromere plasmid (YCp) (Gibson et al, Science 319, 1215 (2008) (7); Gibson et al., PNAS USA, 105 (51) : 20404-9 (2008) (non-patent document 8)).

米国特許第6,670,154号（特許文献1）には、細菌を、改変されたゲノムを直線化する酵母と融合させることによる、改変された細菌のゲノムを酵母人工染色体に転換するための方法が記載されている。米国特許出願公開第2005/0019924号（特許文献2）には、原核生物のゲノムを環状分子として真核細胞に導入し、人工染色体に変換するための、核酸および方法が記載されている。WO02/057437（特許文献3）には、サイトメガロウイルス（CMV）ゲノムを含有しているYACベクターが記載されている。米国特許第7,083,971号（特許文献4）には、大きな核酸セグメントをクローニングする、操作する、および送達するための組換えによるアプローチならびにシステムが記載されている。米国特許出願公開第2005/0003511号（特許文献5）、およびBradshaw et al, Nucleic Acids Research, 23, 4850-56（1995）（非特許文献9）には、相同組換えによりDNAのより大きな領域をクローニングするための酵母-細菌シャトルベクターが記載されている。   US Pat. No. 6,670,154 describes a method for converting a modified bacterial genome to a yeast artificial chromosome by fusing the bacteria with yeast that linearizes the modified genome. ing. US Patent Application Publication No. 2005/0019924 (Patent Document 2) describes nucleic acids and methods for introducing prokaryotic genomes into eukaryotic cells as circular molecules and converting them into artificial chromosomes. WO02 / 057437 (Patent Document 3) describes a YAC vector containing a cytomegalovirus (CMV) genome. US Pat. No. 7,083,971 describes a recombinant approach and system for cloning, manipulating, and delivering large nucleic acid segments. US Patent Application Publication No. 2005/0003511 (Patent Document 5) and Bradshaw et al, Nucleic Acids Research, 23, 4850-56 (1995) (Non-Patent Document 9) describe a larger region of DNA by homologous recombination. Yeast-bacteria shuttle vectors for cloning are described.

しかし、開示されているクローニング方法および操作方法は、宿主細胞に移入することができるドナー核酸の大きさにより制限され、宿主細胞中で増殖（propagate）させた核酸分子を操作するおよび/または宿主細胞中で増殖させた核酸分子をドナーと関係があるレシピエント細胞に移入して戻す操作を提供しないだけではなく、外来核酸に関してクローニングにおいて使用する様々な細胞型の間での不適合の問題にも対処できていない。染色体またはゲノムのようなより大きな核酸を別の異種宿主にクローニングするため、別の宿主の中で大きな核酸の配列を操作するため、および操作したゲノムを、ドナー生物と類似するレシピエント生物（例えば、同じ属の生物）に移入して戻す（例えば、原核細胞から真核細胞へ、およびその反対）ためには、さらなる方法が必要である。   However, the disclosed cloning and manipulation methods are limited by the size of the donor nucleic acid that can be transferred into the host cell, manipulate the nucleic acid molecule propagated in the host cell, and / or the host cell. Not only does it provide for the transfer of nucleic acid molecules grown in them back to recipient cells associated with the donor, but it also addresses incompatibility issues between the various cell types used in cloning for foreign nucleic acids. Not done. To clone larger nucleic acids such as chromosomes or genomes into another heterologous host, to manipulate sequences of larger nucleic acids in another host, and to manipulate the engineered genome into a recipient organism similar to the donor organism (e.g. , Organisms of the same genus), additional methods are needed to transfer them back (eg from prokaryotic cells to eukaryotic cells and vice versa).

これまでのところ、様々な種または様々な属の生物間で染色体およびゲノムのような大きな核酸を移入することについての障壁は克服されていない。例えば、種間での核酸の移入は、宿主、ドナー、および/またはレシピエント細胞にとって有毒である可能性がある。異なる種、属、または群の生物の中での、ならびに原核細胞から真核細胞への、およびその逆の核酸の操作と増殖はまた、核酸の不安定性の原因となり得、核酸からの遺伝子の発現のようなそれらの活性化を阻害する可能性がある。   To date, the barriers to transferring large nucleic acids such as chromosomes and genomes between organisms of different species or genera have not been overcome. For example, transfer of nucleic acids between species can be toxic to host, donor, and / or recipient cells. Manipulation and propagation of nucleic acids in organisms of different species, genera, or groups, and from prokaryotic cells to eukaryotic cells and vice versa, can also cause nucleic acid instability, and It may inhibit their activation such as expression.

米国特許第6,670,154号U.S. Patent 6,670,154 米国特許出願公開第2005/0019924号US Patent Application Publication No. 2005/0019924 WO02/057437WO02 / 057437 米国特許第7,083,971号U.S. Patent No. 7,083,971 米国特許出願公開第2005/0003511号US Patent Application Publication No. 2005/0003511

Itaya et al, Nat Methods 5, 41（2008）Itaya et al, Nat Methods 5, 41 (2008) Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407（2003）Yoon and Koob, Nucleic Acids Res 31, 1407 (2003) Wheeler et al, Gene 198, 203（1997）Wheeler et al, Gene 198, 203 (1997) Gupta and Hoo, Plant Mol Biol 17, 361（1991）Gupta and Hoo, Plant Mol Biol 17, 361 (1991) Smailus et al, Syst Synth Biol;1, 139（2007）Smailus et al, Syst Synth Biol; 1, 139 (2007) Itaya et al, PNAS USA 102, 15971（2005）Itaya et al, PNAS USA 102, 15971 (2005) Gibson et al, Science 319, 1215（2008）Gibson et al, Science 319, 1215 (2008) Gibson et al., PNAS USA, 105（51）:20404-9（2008）Gibson et al., PNAS USA, 105 (51): 20404-9 (2008) Bradshaw et al, Nucleic Acids Research, 23, 4850-56（1995）Bradshaw et al, Nucleic Acids Research, 23, 4850-56 (1995)

概要
ドナー核酸の宿主細胞への移入（クローニング）のための、ドナー核酸の（例えば、宿主細胞内での）操作（例えば、改変）のための、および改変したドナー核酸のレシピエント細胞への移植のための方法、核酸、ならびにシステムを本明細書中で提供する。本提供の方法および他の組成物は、真核生物宿主細胞中での原核生物核酸の操作、およびその核酸を原核生物レシピエントに移植して戻すことのような、生命の分岐（branches of life）を超えた核酸の移入ならびに操作に有用である。 Summary For transfer (cloning) of a donor nucleic acid into a host cell, for manipulation (eg, modification) of the donor nucleic acid (eg, within the host cell), and for transplantation of the modified donor nucleic acid into a recipient cell Methods, nucleic acids, and systems for providing are provided herein. The provided methods and other compositions are useful for branching of life, such as manipulation of a prokaryotic nucleic acid in a eukaryotic host cell and transplanting the nucleic acid back into a prokaryotic recipient. It is useful for the transfer and manipulation of nucleic acids exceeding).

上記方法は、酵母のような、強力な十分に特性決定された遺伝子システムを持つ宿主への移入による、乏しい（poor）遺伝子システムを持つ生物のドナー核酸の操作に有用である。したがって、上記方法、核酸、およびシステムは、扱いにくい生物の核酸を改変するために、ならびに、ゲノムを含む大きな核酸を操作および変更するために、例えば、研究室に以前から存在しているものでもなく、または自然界に存在しているものでもない細胞およびゲノムのような合成のゲノムおよび細胞を得るために使用することができる。本提供の方法は、全ゲノムおよび少なくも最小ゲノム、細胞ゲノム、ウイルスゲノム、および細胞小器官ゲノムを含むゲノムのような、300キロベース（kb）より大きい核酸およびゲノムを、クローニングする、改変する、および移植するために有用である。それにより、ドナーゲノムを宿主細胞中で改変して、そうでなければ天然のドナーゲノムが示すことがない一つまたは複数の表現型を付与した改変ドナーゲノムを得ることができる。これらの方法は、このように改変したドナーゲノムを、ドナーゲノムを持つもとの細胞型の中で生じさせることが困難である場合、または対象となる表現型もしくは産物の産生のために、改変したゲノムをもとの所望の細胞型に移植して戻す前に、合成ゲノムを宿主細胞の中で迅速にアセンブリしかつ改変することができる場合には、特に有用である。   The above method is useful for the manipulation of donor nucleic acids of organisms with poor gene systems by transfer into a host with a powerful well-characterized gene system, such as yeast. Thus, the above methods, nucleic acids, and systems may be used, for example, those that have previously existed in laboratories, for example, to modify difficult nucleic acid nucleic acids, and to manipulate and modify large nucleic acids, including genomes. It can be used to obtain synthetic genomes and cells such as cells and genomes that are not or are not present in nature. The provided methods clone and modify nucleic acids and genomes larger than 300 kilobases (kb), such as genomes including whole genomes and at least minimal genomes, cellular genomes, viral genomes, and organelle genomes , And useful for transplantation. Thereby, the donor genome can be modified in the host cell to obtain a modified donor genome imparted with one or more phenotypes that would otherwise not be exhibited by the native donor genome. These methods are modified when it is difficult to generate a donor genome thus modified in the original cell type with the donor genome, or for production of the phenotype or product of interest. It is particularly useful if the synthetic genome can be rapidly assembled and modified in the host cell before transplanting it back into the original desired cell type.

本出願において同定および記載する組成物および方法により、扱いにくいドナー細胞由来の核酸分子およびゲノムを宿主細胞に移入する新しい方法が可能となる。ここでは、扱いにくいドナー細胞由来の核酸分子およびゲノムは、遺伝子型が変化するように、そしてそれにより表現型が変化するように、上記核酸分子またはゲノムが変化するように改変することができる。改変したゲノムは、宿主細胞の遺伝学的機構を使用する一つまたは複数の方法において改変することができる。本提供の方法はまた、改変した核酸分子またはゲノムを宿主細胞から単離するための方法も提供する。単離した改変核酸分子またはゲノムを、エクスビボでメチル化することができる。レシピエント細胞は、改変した核酸分子またはゲノムを細胞に移入できるように、本明細書中に記載する方法で処理することができる。改変した核酸分子またはゲノムを、その後、さらにレシピエント細胞に移入し、それにより、レシピエント細胞の表現型を、改変した核酸分子またはゲノムの表現型に変えることができる。   The compositions and methods identified and described in this application enable new methods for transferring cumbersome donor cell-derived nucleic acid molecules and genomes into host cells. Here, cumbersome donor cell-derived nucleic acid molecules and genomes can be modified to change the nucleic acid molecule or genome such that the genotype changes and thereby the phenotype. The modified genome can be modified in one or more ways using the genetic machinery of the host cell. The provided methods also provide methods for isolating modified nucleic acid molecules or genomes from host cells. The isolated modified nucleic acid molecule or genome can be methylated ex vivo. Recipient cells can be treated by the methods described herein so that the modified nucleic acid molecule or genome can be transferred into the cell. The modified nucleic acid molecule or genome can then be further transferred to a recipient cell, thereby changing the phenotype of the recipient cell to the modified nucleic acid molecule or genome phenotype.

以下の工程を含む、ドナーゲノムをクローニングするための方法を本明細書中で提供する:一つまたは複数の断片としてドナーゲノムを合成するか、またはドナー細胞からドナーゲノムを得る工程;およびドナーゲノムと宿主ベクターとを異種宿主細胞に導入する工程。ここで、上記宿主細胞への導入の前に上記ドナーゲノムと上記宿主ベクターとを任意で連結し、それにより、上記宿主ベクターを含む上記ドナーゲノムを含む宿主細胞を作製し、さらに、上記ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さである。一つの態様においては、上記ドナーゲノムは、本質的に全細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムである。   Provided herein is a method for cloning a donor genome comprising the steps of: synthesizing a donor genome as one or more fragments or obtaining a donor genome from donor cells; and a donor genome And introducing a host vector into a heterologous host cell. Here, prior to introduction into the host cell, the donor genome and the host vector are optionally ligated, thereby producing a host cell containing the donor genome containing the host vector, and further, the donor genome. Is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least the smallest genome and is more than about 300 kb in length. In one embodiment, the donor genome is essentially a whole cell genome, a viral genome, or an organelle genome.

本明細書中に記載する方法においては、ドナーゲノムと宿主ベクターとを、同時に、または連続して宿主細胞に導入することができる。ドナーゲノムと宿主ベクターとを宿主細胞に連続して導入する場合は、導入はいずれの順序で行うこともできる。したがって、一つの態様においては、ドナーゲノムを宿主細胞に導入し、続いて宿主ベクターを導入することができる。あるいは、宿主ベクターを宿主細胞に導入し、続いて、ドナーゲノムを導入することができる。別の態様においては、宿主ベクターは、ドナーゲノムを含むドナー細胞を宿主ベクターで形質転換することにより、宿主細胞への導入の前に、ドナーゲノムと連結する。   In the methods described herein, the donor genome and host vector can be introduced into the host cell simultaneously or sequentially. When the donor genome and the host vector are continuously introduced into the host cell, the introduction can be performed in any order. Thus, in one embodiment, the donor genome can be introduced into the host cell followed by the host vector. Alternatively, the host vector can be introduced into the host cell followed by the donor genome. In another embodiment, the host vector is linked to the donor genome prior to introduction into the host cell by transforming a donor cell containing the donor genome with the host vector.

ドナーゲノムは単一の分子であり得る。一つの態様においては、ドナーゲノムと宿主ベクターとを含む核酸分子は、環状のセントロメアプラスミドとして存在し得る。あるいは、ドナーゲノムは、重複しているDNA断片として存在し得る。ドナーゲノムは、宿主細胞への導入前に、直線化しても、また断片化してもよい。   The donor genome can be a single molecule. In one embodiment, the nucleic acid molecule comprising the donor genome and the host vector can exist as a circular centromere plasmid. Alternatively, the donor genome can exist as overlapping DNA fragments. The donor genome may be linearized or fragmented prior to introduction into the host cell.

本提供の方法の特定の態様は、ドナーゲノムと宿主ベクターとを宿主細胞から回収する工程をさらに含む。   Certain embodiments of the provided methods further comprise recovering the donor genome and host vector from the host cell.

他の態様においては、上記方法はさらに、ドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程を含む。   In other embodiments, the method further comprises introducing a donor genome into the recipient cell.

なお他の態様においては、本提供の方法はさらに、レシピエント細胞のゲノムを分解するかまたは除去する工程を含む。   In still other embodiments, the provided methods further comprise degrading or removing the genome of the recipient cell.

本明細書中で企図されるドナーゲノムとしては、真菌ゲノム、古細菌ゲノム、シアノバクテリアゲノム、藻類ゲノム、ウイルスゲノム、バクテリオファージゲノム、細胞小器官ゲノム、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム（例えば、トウモロコシの葉緑体ゲノム、またはイネの葉緑体ゲノム）、細胞小器官ゲノム、あるいは合成ゲノムが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。   Donor genomes contemplated herein include fungal genomes, archaeal genomes, cyanobacterial genomes, algal genomes, viral genomes, bacteriophage genomes, organelle genomes, mitochondrial genomes, chloroplast genomes (eg, maize) Chloroplast genome, or rice chloroplast genome), organelle genome, or synthetic genome, but is not limited thereto.

宿主細胞としては、本明細書中では、真核細胞、または原核細胞が企図される。宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。宿主細胞としてはまた、酵母細胞も挙げられる。   As host cells, eukaryotic cells or prokaryotic cells are contemplated herein. Host cells include, but are not limited to, bacterial cells, fungal cells, insect cells, plant cells, or algal cells. Host cells also include yeast cells.

本明細書中に記載する宿主ベクターは、セントロメアプラスミドであり得る。一つの好ましい態様においては、宿主ベクターは酵母セントロメアプラスミドであり、宿主細胞は酵母細胞である。   The host vector described herein can be a centromere plasmid. In one preferred embodiment, the host vector is a yeast centromere plasmid and the host cell is a yeast cell.

本明細書中に記載する宿主ベクターは、相同組換えに有用なベクターである。   The host vectors described herein are useful vectors for homologous recombination.

本明細書中に記載する方法のうちの任意のものはさらに、宿主細胞の中でドナーゲノムを改変する工程を含み得る。   Any of the methods described herein can further comprise modifying the donor genome in the host cell.

さらに、本明細書中に記載する方法のうちの任意のものはさらに、宿主細胞から、宿主ベクターを含むドナーゲノムを回収する工程を含み得る。任意で、宿主ベクターをドナーゲノムから除去することができる。一つの局面においては、上記方法はさらに、回収したドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程を含む。   Further, any of the methods described herein can further comprise recovering the donor genome containing the host vector from the host cell. Optionally, the host vector can be removed from the donor genome. In one aspect, the method further comprises the step of introducing the recovered donor genome into a recipient cell.

本明細書中に記載する方法はさらに、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程を含み得る。上記方法が最初の、レシピエント細胞へのドナーゲノムの導入を含む場合は、レシピエント細胞の内因性ゲノムは、天然のゲノムである。多数回の改変を行う場合（例えば、図1および図16を参照のこと）は、レシピエント細胞の内因性ゲノムは、予め改変したゲノムであってよく、また、合成のゲノムであってもよい。したがって、一つの態様においては、本提供の方法はさらに、反復様式でドナーゲノムを改変する工程を含む。   The methods described herein can further comprise the step of degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. If the method involves the first introduction of a donor genome into a recipient cell, the recipient cell's endogenous genome is the native genome. When multiple modifications are made (see, eg, FIGS. 1 and 16), the recipient cell's endogenous genome may be a pre-modified genome or a synthetic genome. . Thus, in one embodiment, the provided methods further comprise modifying the donor genome in an iterative manner.

回収したドナーゲノムを、ドナーゲノム中の一つまたは複数のヌクレオチドをメチル化することにより、レシピエント細胞への導入前にメチル化してもよい。   The recovered donor genome may be methylated prior to introduction into the recipient cell by methylating one or more nucleotides in the donor genome.

レシピエント細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞であり得る。一つの局面においては、レシピエント細胞の制限エンドヌクレアーゼ機能は、存在しないか、ドナーゲノムの導入前に除去されているか、または不活化されている。例えば、制限修飾酵素は、これを不活性にするためにレシピエント細胞中で突然変異させることができる。   The recipient cell can be, for example, a bacterial cell, a yeast cell, a fungal cell, an insect cell, a plant cell, or an algal cell. In one aspect, the restriction endonuclease function of the recipient cell is absent, removed prior to introduction of the donor genome, or inactivated. For example, a restriction modifying enzyme can be mutated in a recipient cell to make it inactive.

好ましい態様においては、ドナーゲノムは、原核細胞（天然のものまたは合成のもののいずれか）に由来し、かつ真核細胞にクローニングされる。ここで、ドナーゲノムを任意で改変することができ、その後、回収し、原核細胞に導入して戻すことができる。特定の好ましい態様においては、ドナーゲノムは、細菌細胞（天然のものかまたは合成のもののいずれか）に由来し、酵母細胞にクローニングされる。ここで、ドナーゲノムを任意で改変することができ、その後、回収し、細菌細胞に導入して戻すことができる。   In a preferred embodiment, the donor genome is derived from a prokaryotic cell (either natural or synthetic) and cloned into a eukaryotic cell. Here, the donor genome can optionally be modified and then recovered and introduced back into prokaryotic cells. In certain preferred embodiments, the donor genome is derived from a bacterial cell (either natural or synthetic) and cloned into a yeast cell. Here, the donor genome can optionally be modified and then recovered and introduced back into the bacterial cell.

本明細書中に提供する方法はさらに、第2のドナーゲノムを宿主細胞に導入し（ここでは、上記第2のドナーゲノムは第1のドナーゲノムとは異なる）、それにより、2つの異なるドナーゲノムを含有する宿主細胞を得る工程を含む。第2のドナーゲノムを導入する工程は、第1のドナーゲノムを含有している宿主細胞と、第2のドナーゲノムを含有している第2の宿主細胞とを接合させることにより行うことができる。回収したドナーゲノムをレシピエント細胞へ導入することにより、レシピエント細胞の表現型を、任意の改変を組み入れているドナーゲノムに対応する表現型へと形質転換することができる。   The methods provided herein further introduce a second donor genome into the host cell (wherein the second donor genome is different from the first donor genome), thereby providing two different donors Obtaining a host cell containing the genome. The step of introducing the second donor genome can be performed by joining a host cell containing the first donor genome with a second host cell containing the second donor genome. . By introducing the recovered donor genome into a recipient cell, the recipient cell's phenotype can be transformed into a phenotype corresponding to the donor genome incorporating any modification.

ドナーゲノムによりコードされる表現型を示す細胞を作製するためのプロセスを本明細書中で提供する。上記プロセスは以下の工程を含む:（a）宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物が得られるように、宿主細胞に、ドナーゲノムと、宿主細胞中での上記ドナーゲノムのクローニングに適している宿主ベクターとを導入する工程;（b）工程（a）で得た宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物を宿主細胞から回収する工程;（c）（b）の産物を、レシピエント細胞が上記産物によりコードされる表現型を示すようになる条件下で、レシピエント細胞に導入する工程;および（d）工程（c）により生じた細胞を回収する工程。ここでは、上記ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さであり、かつ上記ドナーゲノムは、該ドナーゲノムによりコードされる表現型をレシピエント細胞が示すのに必要な核酸材料の最小限の構成要素を含む。一つの局面においては、上記方法はさらに、宿主細胞中で（a）のドナーゲノムを改変する工程を含む。別の局面においては、上記方法はさらに、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程を含む。なお別の局面においては、上記方法はさらに、宿主細胞中で（a）のドナーゲノムを改変する工程と、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程とを含む。特定の態様においては、そのようなプロセスは自動化することができる。   Provided herein are processes for generating cells that exhibit the phenotype encoded by the donor genome. The process includes the following steps: (a) a host cell, suitable for cloning the donor genome in the host cell, and the donor genome so as to obtain a product comprising the donor genome comprising the host vector. A step of introducing a vector; (b) a step of recovering a product containing a donor genome containing the host vector obtained in step (a) from a host cell; (c) the product of (b) Introducing into a recipient cell under conditions that will result in the phenotype encoded by; and (d) recovering the cell produced by step (c). Here, the donor genome is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least a minimal genome and is more than about 300 kb in length, and the donor The genome contains the minimum components of nucleic acid material necessary for the recipient cell to exhibit the phenotype encoded by the donor genome. In one aspect, the method further comprises modifying (a) the donor genome in a host cell. In another aspect, the method further comprises degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. In yet another aspect, the method further comprises modifying the donor genome of (a) in the host cell and degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. In certain embodiments, such a process can be automated.

ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す細胞を本明細書中で提供する。ここでは、細胞は、本明細書中に記載するプロセスにより産生される。   Provided herein are cells that exhibit the desired phenotype that is encoded by the donor genome and otherwise not exhibited by the cells. Here, the cells are produced by the processes described herein.

ドナーゲノムを含む細胞であって、ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す細胞もまた、本明細書中で提供する。ここでは、ドナーゲノムは、300kbを上回る外来ゲノムの核酸材料と、所望の表現型を細胞が示すのに必要なゲノムの最小限の構成要素とを含む。所望の表現型としては、もとの細胞にとって天然のものではない発現産物の産生、あるいは、既存の発現産物の改変された発現（例えば、選択的発現もしくは調節された発現）またはアップレギュレーションを挙げることができる。   Also provided herein are cells comprising a donor genome that exhibit the desired phenotype encoded by the donor genome and otherwise not exhibited by the cell. Here, the donor genome includes foreign genomic nucleic acid material greater than 300 kb and the minimal components of the genome necessary for the cell to exhibit the desired phenotype. Desired phenotypes include production of an expression product that is not native to the original cell, or altered expression (eg, selective or regulated expression) or upregulation of an existing expression product. be able to.

本提供の方法はまた、複数の宿主細胞中への複数のゲノムのクローニングを含む。複数のゲノムはゲノムの変異体であり得る。一つの態様においては、複数のゲノムを宿主細胞に導入する工程は、宿主ベクターと、複数の変異体である重複している断片とを宿主細胞に導入し、それにより、変異体ゲノムのコンビナトリアルライブラリーを作製する工程を含む。   The provided methods also include cloning of multiple genomes into multiple host cells. The multiple genomes can be genomic variants. In one embodiment, the step of introducing a plurality of genomes into a host cell introduces a host vector and overlapping fragments that are a plurality of variants into the host cell, thereby combinatorial live of the variant genomes. A step of producing a rally.

一つの局面においては、本提供の方法は、宿主細胞からのドナーゲノムの回収の後、ドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程を含み、上記レシピエント細胞は、ドナーゲノムからの遺伝子発現を、宿主細胞よりも大きな程度でサポートする。   In one aspect, the provided method comprises the step of introducing the donor genome into a recipient cell after recovery of the donor genome from the host cell, wherein the recipient cell comprises gene expression from the donor genome, Support to a greater extent than the host cell.

一つの局面においては、本提供の方法は、宿主細胞中でドナーゲノムを改変する工程を含み、かつドナーゲノムを改変する工程は、ドナーゲノムに、一つまたは複数の置換、一つまたは複数の欠失、一つまたは複数の挿入、一つまたは複数の再構成、一つまたは複数の組換え、一つまたは複数の相同組換え、あるいはそれらの組み合わせを誘導することを含む。   In one aspect, the provided method comprises modifying the donor genome in a host cell, and modifying the donor genome comprises replacing the donor genome with one or more substitutions, one or more Inducing a deletion, one or more insertions, one or more rearrangements, one or more recombination, one or more homologous recombination, or a combination thereof.

別の局面においては、上記方法は、ドナーゲノムを改変する工程を含み、ドナーゲノムの改変は、改変前のドナーゲノムと比較してドナーゲノムの特性に影響を及ぼすか、または特性を改善する。   In another aspect, the method includes the step of modifying the donor genome, wherein the modification of the donor genome affects or improves the properties of the donor genome relative to the donor genome prior to modification.

上記提供の方法はまた、レシピエント細胞への移植を含む。ここでは、移植は、ポリエチレングリコール（PEG）の存在下で行うことができる。本発明の方法において使用することができるPEGの様々な大きさとして、PEG 4,000からPEG 20,000までの範囲の大きさを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。一つの態様においては、大きさはPEG 8,000である。例えば、約1％〜約20％などのPEGの様々な濃度を、本開示の方法において使用することができる。一つの態様においては、約5％の濃度のPEGを使用する。   The provided methods also include transplantation into recipient cells. Here, transplantation can be performed in the presence of polyethylene glycol (PEG). Various sizes of PEG that can be used in the method of the present invention can include, but are not limited to, sizes ranging from PEG 4,000 to PEG 20,000. In one embodiment, the size is PEG 8,000. For example, various concentrations of PEG, such as about 1% to about 20%, can be used in the disclosed methods. In one embodiment, a concentration of about 5% PEG is used.

少なくとも最小ゲノムである原核生物のゲノム、原核生物の複製起点、原核生物の選択マーカー、トランスポザーゼおよび逆位反復配列、真核細胞中での分離および複製をサポートすることができる一つまたは複数の核酸配列、ならびに真核生物の選択マーカーを含む、全ゲノムの改変のためのベクターを本明細書中で提供する。本提供の方法の一つの局面においては、真核細胞は酵母細胞である。原核生物のゲノム、原核生物の複製起点、および選択マーカーは、細菌のものであり得る。一つの態様においては、真核細胞中での分離と複製をサポートする核酸は、CEN核酸およびARS核酸の一つまたは複数を含む。別の態様においては、原核生物のゲノムは、少なくとも、または約300kbの長さを含む。別の態様においては、ベクターは、真核細胞中で、および原核細胞中で安定である。複数のベクターを含有するコンビナトリアルライブラリーを、本明細書中で提供する。ここでは、原核生物のゲノムは、ゲノム変異体であり得る。   Prokaryotic genome, which is at least the smallest genome, prokaryotic origin of replication, prokaryotic selectable marker, transposase and inverted repeats, one or more nucleic acids that can support separation and replication in eukaryotic cells Provided herein are vectors for whole genome modification, including sequences, as well as eukaryotic selectable markers. In one aspect of the provided methods, the eukaryotic cell is a yeast cell. The prokaryotic genome, prokaryotic origin of replication, and selectable marker can be bacterial. In one embodiment, the nucleic acid that supports separation and replication in eukaryotic cells comprises one or more of CEN nucleic acid and ARS nucleic acid. In another embodiment, the prokaryotic genome comprises at least or about 300 kb in length. In another embodiment, the vector is stable in eukaryotic cells and in prokaryotic cells. Combinatorial libraries containing multiple vectors are provided herein. Here, the prokaryotic genome may be a genomic variant.

本明細書中に記載する方法のうちの任意のものにより調製した外来のドナーゲノムを含む、単離した細胞、合成の細胞、または組換え細胞を、本明細書中で提供する。   Provided herein are isolated, synthetic, or recombinant cells comprising a foreign donor genome prepared by any of the methods described herein.

標的核酸中の標的領域のシームレスな改変（seamless modification）のための酵母核酸構築物を、本明細書中で提供する。この酵母核酸構築物は、標的核酸の長さに沿って標的領域の上流または下流にある、標的核酸の一部分に対する相同性を含む第1の相同部分;誘導性プロモーターの制御下にあるエンドヌクレアーゼをコードする核酸;エンドヌクレアーゼが認識するヌクレオチド配列;酵母の選択マーカー;標的領域の5'部分に対する相同性を含む第2の相同部分;および標的領域の3'部分に対する相同性を含む第3の相同部分を含む。一つの態様においては、第2および第3の相同部分は、第1の相同部分、エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および酵母の選択マーカーの側方にある。エンドヌクレアーゼ認識部位は、第2または第3の相同部分に隣接し得、かつ第1の相同部分に対して構築物の反対側の末端に存在し得る。第2および第3の相同領域のうちの一方または両方が、標的核酸中の相同部分と比較して、一つまたは複数の置換、一つまたは複数の欠失、一つまたは複数の挿入、一つまたは複数の再構成、一つまたは複数の組換え、一つまたは複数の相同組換え、あるいはそれらの一つまたは複数の組み合わせを含む。   Yeast nucleic acid constructs for seamless modification of target regions in target nucleic acids are provided herein. This yeast nucleic acid construct encodes a first homologous portion containing homology to a portion of the target nucleic acid upstream or downstream of the target region along the length of the target nucleic acid; encodes an endonuclease under the control of an inducible promoter A nucleotide sequence recognized by the endonuclease; a yeast selectable marker; a second homologous portion that includes homology to the 5 ′ portion of the target region; and a third homologous portion that includes homology to the 3 ′ portion of the target region including. In one embodiment, the second and third homologous portions are lateral to the first homologous portion, the nucleic acid encoding the endonuclease, and the yeast selectable marker. The endonuclease recognition site can be adjacent to the second or third homologous portion and can be at the opposite end of the construct relative to the first homologous portion. One or both of the second and third homologous regions has one or more substitutions, one or more deletions, one or more insertions, one or more compared to the homologous portion in the target nucleic acid. Including one or more rearrangements, one or more recombination, one or more homologous recombination, or one or more combinations thereof.

以下の工程を含む、標的核酸分子中に改変をシームレスに導入するための方法を、本明細書中で提供する:突然変異誘発構築物（mutagenesis construct）と宿主ベクターとを宿主細胞に導入し、それにより、上記宿主細胞中で宿主ベクターと突然変異誘発構築物との組換えが生じる工程（ここでは、突然変異誘発構築物は、改変の上流にある標的核酸分子の5'部分に対する第1の相同部分;エンドヌクレアーゼ認識部位、プロモーター、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、および選択マーカー;標的遺伝子座の上流にあるゲノムの配列に対して相同である第2の反復相同部分;ならびに改変の下流にある標的領域の3'部分に対して相同である第3の相同部分を含む）;ならびに、上記第1の相同部分と上流もしくは下流の部分との間で組換えが起こり、それにより、上記構築物の部分をシームレスに除去し、上記構築物を含む標的部位に近い核酸分子中での一つまたは複数の二本鎖の断裂切断（break cleavage）を促進する条件下で、細胞をインキュベーションする工程であって、それにより、標的核酸分子中に改変がシームレスに導入される、工程。   Provided herein is a method for seamlessly introducing modifications into a target nucleic acid molecule comprising the steps of: introducing a mutagenesis construct and a host vector into a host cell; A step in which recombination of the host vector with the mutagenesis construct occurs in the host cell, wherein the mutagenesis construct is a first homologous portion to the 5 ′ portion of the target nucleic acid molecule upstream of the modification; An endonuclease recognition site, a promoter, a gene encoding the endonuclease, and a selectable marker; a second repetitive homologous portion homologous to a genomic sequence upstream of the target locus; and a target region downstream of the modification A third homologous portion that is homologous to the 3 ′ portion); and recombination occurs between the first homologous portion and the upstream or downstream portion, To seamlessly remove portions of the construct and incubate cells under conditions that promote break cleavage of one or more double strands in the nucleic acid molecule close to the target site containing the construct And wherein the alterations are seamlessly introduced into the target nucleic acid molecule.

二本鎖の断裂切断を促進する処理としては、上記構築物を含む標的核酸分子を一つの認識部位で切断して二本鎖の断裂を生じるエンドヌクレアーゼの発現を挙げることができる。一つの局面においては、本提供の方法はさらに、標的核酸から酵母の選択マーカーが除去された細胞を選択する選択工程の実行を含む。   Examples of the treatment that promotes double-strand breaks include expression of an endonuclease that cleaves a target nucleic acid molecule containing the above-described construct at one recognition site to cause double-strand breaks. In one aspect, the provided methods further comprise performing a selection step of selecting cells from which the yeast selectable marker has been removed from the target nucleic acid.

本提供の方法は、レシピエント細胞への移植を含む。ここでは、移植は、アガロースの存在下でドナーゲノムを単離する工程;メチルトランスフェラーゼの存在下でドナーゲノムをインキュベーションし、それにより、ドナーゲノムをメチル化する工程;アガロースを溶かす工程;およびドナーゲノムをレシピエント細胞とともにインキュベーションする工程により行う。メチルトランスフェラーゼとのインキュベーションは、粗細胞抽出物とのインキュベーションであり得る。   The provided methods include transplantation into recipient cells. Here, transplantation includes isolating the donor genome in the presence of agarose; incubating the donor genome in the presence of methyltransferase, thereby methylating the donor genome; dissolving the agarose; and donor genome By incubating with recipient cells. Incubation with methyltransferase can be incubation with a crude cell extract.

本提供の方法はさらに、メチルトランスフェラーゼとのインキュベーション後に、プロテイナーゼの存在下でドナーゲノムをインキュベーションし、それにより、タンパク質を除去する工程を含み得る。   The provided methods may further comprise the step of incubating the donor genome in the presence of the proteinase after incubation with the methyltransferase, thereby removing the protein.

典型的には、本明細書中で企図されるドナーゲノムおよび改変ゲノムは、大きな核酸である。一つの態様において、ドナーゲノムは、少なくとも以下の長さであるか、またはほぼ以下の長さであるか、または以下を上回る長さであるか、あるいは、それらの間の任意の数である:約100kb、約150kb、約200kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約550kb、約600kb、約600kb、約650kb、約700kb、約750kb、約800kb、約850kb、約900kb、約1メガベース（MB）、約1.1MB、約1.2MB、約1.3MB、約1.4MB、約1.5MB、約1.6MB、約1.7MB、約1.8MB、約1.9MB、約2MB、約2.5MB、約3MB、約3.5MB、約4MB、4、約5MB、あるいはそれ以上。   Typically, the donor and modified genomes contemplated herein are large nucleic acids. In one embodiment, the donor genome is at least less than, or less than, or greater than, or any number in between: About 100 kb, about 150 kb, about 200 kb, about 250 kb, about 300 kb, about 350 kb, about 400 kb, about 450 kb, about 500 kb, about 550 kb, about 600 kb, about 600 kb, about 650 kb, about 700 kb, about 750 kb, about 800 kb, about 850 kb , About 900kb, about 1 megabase (MB), about 1.1MB, about 1.2MB, about 1.3MB, about 1.4MB, about 1.5MB, about 1.6MB, about 1.7MB, about 1.8MB, about 1.9MB, about 2MB, About 2.5MB, about 3MB, about 3.5MB, about 4MB, 4, about 5MB, or more.

図1は、ドナーゲノムと宿主ベクターとを一つの宿主細胞に導入する（形質転換または同時形質転換による）ことができる様々な態様を説明する。一つまたは複数のゲノム改変を、宿主細胞中で作製することができる。その後、改変したゲノムを単離し、レシピエント細胞に移植することができる。FIG. 1 illustrates various embodiments in which a donor genome and a host vector can be introduced into a single host cell (by transformation or co-transformation). One or more genomic modifications can be made in the host cell. The modified genome can then be isolated and transplanted into recipient cells. 図2A〜2Cは、酵母中で細菌ゲノムをクローニングするための3種類の方法を説明する。（A）形質転換の際に酵母により増殖させるために、宿主ベクターを、細菌の形質転換により細菌のゲノムに組込むことができる。組換えたゲノムと宿主ベクターとを単離し、酵母宿主細胞を形質転換するために使用することができる。あるいは、（B）全ゲノムと、任意で直線化した宿主ベクターとで、酵母宿主細胞を同時形質転換することができる。この場合、酵母宿主細胞は、ベクターと細菌のゲノムとを、ゲノムの相同組換えにより組み合わせる。別のシナリオ（C）においては、多数の重複している断片をアセンブリしかつ宿主ベクターとともに用いて酵母宿主細胞を同時形質転換することにより、細菌のゲノムをクローニングすることができる。この場合、細菌のゲノム断片と宿主ベクターとを、酵母宿主細胞中での相同組換えにより組み合わせる。2A-2C illustrate three methods for cloning bacterial genomes in yeast. (A) For propagation by yeast during transformation, the host vector can be integrated into the bacterial genome by bacterial transformation. The recombinant genome and host vector can be isolated and used to transform yeast host cells. Alternatively, (B) yeast host cells can be co-transformed with the entire genome and optionally a linearized host vector. In this case, the yeast host cell combines the vector and the bacterial genome by homologous recombination of the genome. In another scenario (C), the bacterial genome can be cloned by assembling a large number of overlapping fragments and co-transforming yeast host cells with a host vector. In this case, the bacterial genomic fragment and the host vector are combined by homologous recombination in the yeast host cell. 3A〜3Fは、図2Aのアプローチを使用する、M.ゲニタリウム（M.genitalium）、M.ミコイデス（M.mycoides）LC、およびM.ニューモニエ（M.pneumoniae）のゲノムそれぞれの中での酵母ベクターの挿入を説明する。図3A、3B、および3Eは、実験に使用した2種類のシャトルベクターを説明する。図3C、3D、および3Fは、それぞれのゲノム中でのベクターの挿入位置を説明する。マイコプラズマのマーカーは、スピラリン（spiralin）プロモーター、tetM、およびlacZである。酵母ベクターの特徴は、CEN、ARS、およびHIS3である。大腸菌プラスミドの骨格は、アンピシリン耐性（ampR）とpUC19起点（ori）である。BAC配列はBACである。そしてトランスポゾンエレメントは、IS256外部逆位反復配列（IR）、IS256内部逆位反復配列（IR）、およびトランスポザーゼ（tnp）である。3A-3F are yeast vectors in each of the genomes of M. genitalium, M. mycoides LC, and M. pneumoniae using the approach of FIG. 2A. The insertion of will be described. Figures 3A, 3B, and 3E illustrate the two types of shuttle vectors used in the experiments. Figures 3C, 3D and 3F illustrate the insertion position of the vector in the respective genome. Mycoplasma markers are the spiralin promoter, tetM, and lacZ. Yeast vectors are characterized by CEN, ARS, and HIS3. The backbone of the E. coli plasmid is ampicillin resistance (ampR) and pUC19 origin (ori). The BAC sequence is BAC. The transposon elements are IS256 external inverted repeat (IR), IS256 internal inverted repeat (IR), and transposase (tnp). 図4A〜4Bは、酵母ベクター配列を含むマイコプラズマの全ゲノムクローンの分析を示す。図4Aは、M.ゲニタリウムcl16-2ゲノムのマップを提供する。酵母ベクターの挿入位置に印をつける。バーは、PCRアンプリコンの位置を示し、数字はアンプリコンのサイズを示す。制限断片に番号をつけ、それらの大きさを凡例中に提供する。EagIでの消化が制限断片1に対応し、BssHIIでの消化が制限断片2〜6に対応する。図4Bは、M.ニューモニエのゲノムのマップを提供する。酵母ベクターの挿入位置に印をつける。バーはPCRアンプリコンの位置を示し、数字はPCRアンプリコンのサイズを示す。制限断片に番号をつけ、それらの大きさを凡例中に提供する。NotIでの消化が制限断片1〜4に対応し、SbfIでの消化が制限断片5と6に対応する。4A-4B show analysis of whole mycoplasmal clones of mycoplasma containing yeast vector sequences. Figure 4A provides a map of the M. genitalium cl16-2 genome. Mark the insertion position of the yeast vector. The bar indicates the position of the PCR amplicon, and the number indicates the size of the amplicon. Number the restriction fragments and provide their sizes in the legend. Digestion with EagI corresponds to restriction fragment 1 and digestion with BssHII corresponds to restriction fragments 2-6. Figure 4B provides a map of the genome of M. pneumoniae. Mark the insertion position of the yeast vector. The bar indicates the position of the PCR amplicon, and the number indicates the size of the PCR amplicon. Number the restriction fragments and provide their sizes in the legend. Digestion with NotI corresponds to restriction fragments 1-4, and digestion with SbfI corresponds to restriction fragments 5 and 6. 図5は、M.ミコイデスLC cl1.1のゲノムのマップを提供する。矢印は、IS1296エレメントを示す。バーは、PCRアンプリコンの位置を示し、数字はPCRアンプリコンのサイズを示す。Figure 5 provides a map of the genome of M. mycoides LC cl1.1. The arrow indicates the IS1296 element. The bar indicates the position of the PCR amplicon, and the number indicates the size of the PCR amplicon. 図6A〜Dは、4種類の代替え方法としての、相同組換えを使用する酵母ベクターのターゲティング挿入（targeted insertion）を説明する。酵母ベクターの挿入を、挿入点での二本鎖の断裂を用いて、およびそれを用いずに試みた。図6A:インタクトなゲノムおよび直鎖状ベクター。図6B:重複しているゲノム断片、および上記断片のうちの一つに対して内部に相同性を持つベクター。図6C:組込み標的で切断したゲノム、および直鎖状ベクター。図6D:重複しているゲノム、および上記断片のうちの2つに対して相同性を持つベクター断片。FIGS. 6A-D illustrate targeted insertion of yeast vectors using homologous recombination as four alternative methods. Yeast vector insertion was attempted with and without double-strand breaks at the point of insertion. FIG. 6A: Intact genome and linear vector. FIG. 6B: Overlapping genomic fragment and vector with internal homology to one of the above fragments. FIG. 6C: Genome cleaved with integrative target and linear vector. Figure 6D: Overlapping genome and vector fragment with homology to two of the above fragments. 図7A〜7Cは、宿主の制限修飾システムと形質転換の効率の向上とにより、粗抽出物がドナープラスミドDNAを保護したが、ゲノムの移植を阻害したことを示す。図7Aは、メチル化工程を用いたアガロースプラグの処理、または処理を行わなかった場合の結果を説明する。図7Bは、点状のパターンを示した（レシピエント細胞への移植が可能であることが示された）粗抽出物の非存在下で処理した天然のゲノムDNAを示し（右側のパネル）、一方、（移植を阻害することが示された）粗抽出物の存在下で処理した内因性ゲノムDNAは、大きな凝集を形成した（左側の2つのパネル）。図7Cは、アガロースプラグ中でのゲノムDNAとのインキュベーション後のプロテイナーゼKでの処理による粗抽出物の除去により、未処理のゲノムDNAを用いた場合に最初に観察した点状のパターンを回復したことを示す。FIGS. 7A-7C show that the crude extract protected donor plasmid DNA but inhibited genome transfer, due to the host's restriction modification system and improved transformation efficiency. FIG. 7A illustrates the agarose plug treatment using the methylation process or the results when no treatment was performed. FIG. 7B shows native genomic DNA treated in the absence of the crude extract (shown to be capable of transplantation into recipient cells) showing a punctate pattern (right panel) On the other hand, endogenous genomic DNA treated in the presence of crude extract (shown to inhibit transplantation) formed large aggregates (left two panels). Figure 7C shows that removal of the crude extract by treatment with proteinase K after incubation with genomic DNA in an agarose plug restored the originally observed punctate pattern when using untreated genomic DNA. It shows that. 図8は、使用できる3種類の代替えの全ゲノムの移植法を示す。第1のアプローチ（1）は、ゲノムDNAを含有するアガロースプラグの消化（例えば、β-アガラーゼを用いる（融解工程））、これに続くレシピエント細胞への直接の移植を含む。第2のアプローチ（2）は、レシピエント細胞を、制限酵素遺伝子（ΔRE）を突然変異させるように改変したことを除き、第1の方法と同じである。第3のアプローチ（3）では、ゲノムDNA試料をインビトロでメチル化し、除タンパク質工程（プロテイナーゼKでの処理）を行い、その後、融解工程（β-アガラーゼでの消化）とレシピエント細胞への移植を行う。FIG. 8 shows three alternative whole genome transfer methods that can be used. The first approach (1) involves digestion of agarose plugs containing genomic DNA (eg, using β-agarase (melting step)) followed by direct transplantation into recipient cells. The second approach (2) is the same as the first method, except that the recipient cells have been modified to mutate the restriction enzyme gene (ΔRE). In the third approach (3), genomic DNA samples are methylated in vitro, subjected to a deproteinization step (treatment with proteinase K), followed by a thawing step (digestion with β-agarase) and transplantation into recipient cells. I do. 図9A〜9Cは、非特異的欠失または再構成に関する従来の改変法に伴う問題点を説明する。CEN6＝構築物中に含まれるラウンドサークル（round circle）。図9Aは、URA3が挿入されているM.ゲニタリウムを保有している酵母への野生型断片の導入、これに続くFOAを含有するSD-HISプレート上での選択を説明し、これにより、2つの異なるタイプの組換え事象（図9Bに示すような、Pl（野生型断片とゲノムとの間での組換え）とP2（ゲノム内の反復間での組換え））の選択が生じる。これらの事象が、図9Cに説明する代替えの産物を持つ細胞をもたらすと考えられる。FIGS. 9A-9C illustrate the problems associated with conventional modifications related to non-specific deletions or rearrangements. CEN6 = round circle included in the structure. Figure 9A illustrates the introduction of wild-type fragments into yeast harboring M. genitalium into which URA3 has been inserted, followed by selection on SD-HIS plates containing FOA. A selection of two different types of recombination events (Pl (recombination between the wild-type fragment and the genome) and P2 (recombination between repeats within the genome), as shown in FIG. 9B) occurs. These events are thought to result in cells with alternative products illustrated in FIG. 9C. 図10A〜1ODは、代替えのシームレスな改変方法を説明する。図1OAは、完全欠失（diletto perfetto）突然変異誘発カセットの作製を模式的に示す。上記カセットを、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換（lithium acetate integrative transformation）を使用して、M.ゲニタリウムゲノムを含有する酵母株に導入した。Ura⁺形質転換体を個別に選択し、診断用プライマーSeq-FおよびSeq-R（挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示す）を使用して、PCRにより分析した。URA3マーカーと、標的遺伝子座のすぐ上流にある部分に対して相同である358bpの断片（「反復」断片）（「反復」と記した大きい矢印）を含む融合産物を作製した。最終的な突然変異誘発カセット（図10B）を作製するために、上記融合産物をPCRにより再度増幅した。得られたカセットは、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（一塩基欠失の上流）、URA3マーカー、反復カセット、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性を含んでいた。上記カセットで酵母宿主細胞を形質転換すると、M.ゲニタリウムのゲノムのCDS139遺伝子座内の450塩基対の標的領域のこのカセットでの（HRによる）置き換えにより、URA3選択マーカーの側方に2つのタンデム反復配列（「反復」と記した大きい矢印）を含む一つの領域がゲノム中に生じるように、上記カセットをこの方向で設計した。図1OC:TREC（エンドヌクレアーゼ切断を伴うタンデム反復（Tandem Repeat with Endonuclease Cleavage）突然変異誘発構築物は、（GAL1/I-SceI）-URA3融合産物を、標的遺伝子座の上流に位置する358bpの「反復」断片と融合させることにより作製した。得られたTRECカセットは、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の上流）、コア（CORE）カセット（18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーター、I-SceIエンドヌクレアーゼおよびURA3マーカーをコードする遺伝子からなる）、「反復」（標的であるwt遺伝子の遺伝子座のすぐ上流にあるゲノムの配列に対して相同である358bpの部分）、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の下流が修正されている）を含んでいた。得られたLoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE突然変異誘発カセット（図10D）は、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の上流）、第1のloxP部位（loxP-RE）、GAL1プロモーター、Creリコンビナーゼ遺伝子のORF、URA3マーカー、第2のloxP部位（loxP-LE）、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の下流）を含んでいた。10A-1OD illustrate an alternative seamless modification method. FIG. 1OA schematically illustrates the creation of a complete deletion (diletto perfetto) mutagenesis cassette. The cassette was introduced into a yeast strain containing the M. genitalium genome using lithium acetate integrative transformation. Ura ⁺ transformants were individually selected and analyzed by PCR using diagnostic primers Seq-F and Seq-R (shown as small unidirectional arrows to the side of the insertion site). A fusion product was made containing the URA3 marker and a 358 bp fragment (“repeat” fragment) (large arrow labeled “repeat”) that is homologous to the portion immediately upstream of the target locus. To make the final mutagenesis cassette (FIG. 10B), the fusion product was amplified again by PCR. The resulting cassette has 50 bp homology to the 5 ′ portion of the target region (upstream of a single base deletion), URA3 marker, repeat cassette, and 50 bp homology to the 3 ′ portion of the target region in the following order: Included. When yeast host cells were transformed with the above cassette, replacement of the 450 base pair target region within the CDS139 locus of the M. genitalium genome with this cassette (by HR) resulted in two tandems to the side of the URA3 selectable marker. The cassette was designed in this direction so that one region containing the repetitive sequence (large arrow marked “repeat”) occurs in the genome. Figure 1OC: TREC (Tandem Repeat with Endonuclease Cleavage) mutagenesis construct, a (GAL1 / I-SceI) -URA3 fusion product, a 358 bp “repeat” located upstream of the target locus The TREC cassette obtained was fused in the following order with a 50 bp homology to the 5 ′ portion of the target region (upstream of a single base deletion), a core (CORE) cassette (18 bp It consists of a gene encoding the I-SceI recognition site, GAL1 promoter, I-SceI endonuclease and URA3 marker, and “repeat” (homogeneous to the genomic sequence immediately upstream of the target wt gene locus) And a 50 bp homology to the 3 'portion of the target region (modified downstream of the one base deletion) .LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP -LE mutagenesis cassette (Figure 10D) 50bp homology to the 5 'part of the target region (upstream of 1 base deletion), first loxP site (loxP-RE), GAL1 promoter, Cre recombinase gene ORF, URA3 marker, second The loxP site (loxP-LE), and the 50 bp homology to the 3 'portion of the target region (downstream of the one base deletion). 図11は、III型制限酵素欠失の作製を説明する。酵母の中でM.ミコイデスLC III型制限酵素遺伝子（typeIIIres）欠失を作製するために、直鎖状のDNA断片であるノックアウトカセット（KOC）を、2種類のPCR産物であるコアとタンデム反復配列（TRS）とを融合させることにより構築した。その後、このカセットで、M.ミコイデスLCゲノム-YCpを持っている酵母W303a株を形質転換して、タイプR IIIのORFを、標的部位に対する50bpの相同配列を介して置き換えた（ΔtypeIIIres::URA3）。ガラクトース誘導により、18bpのI-SceI部位（アスタリスク）を切断して、2つのタンデム反復配列の間での相同組換え（赤色の矢印）を促進する二本鎖の断裂を作製する、I-SceIエンドヌクレアーゼの発現が生じる。TRS間での組換えにより、typeIIIres遺伝子のシームレスな欠失が生じる（ΔtypeIIIR）。FIG. 11 illustrates the generation of a type III restriction enzyme deletion. To create the M. mycoides LC III type III restriction enzyme deletion in yeast, a linear DNA fragment, the knockout cassette (KOC), and two PCR products, core and tandem repeats. It was constructed by fusing the sequence (TRS). This cassette was then transformed into yeast strain W303a carrying the M. mycoides LC genome-YCp, replacing the type R III ORF via a 50 bp homologous sequence to the target site (Δtype IIIres :: URA3 ). Galactose induction cuts the 18 bp I-SceI site (asterisk), creating a double-strand break that promotes homologous recombination (red arrow) between the two tandem repeats, I-SceI Endonuclease expression occurs. Recombination between TRS results in a seamless deletion of the typeIIIres gene (ΔtypeIIIR). 図12A〜12Bは、合成のM.ゲニタリウムのゲノムのMG259遺伝子座での点突然変異の変更を説明する。図12Aは、2つの連続する相同組換えによる突然変異の修正のスキームを説明する。2種類のプライマー（矢印）Seq-FとSeq-Rは、MG259遺伝子座において0.4kb離れており、1.1kbのURA3マーカーの挿入により、1.3kbのPCR DNA断片の産生を生じる。図12Bは、M.ゲニタリウムYACからのURA3マーカーの喪失の可能性を説明する。5-FOA耐性クローンは、野生型のDNA断片でのURA3マーカーの置き換えによるか（R1）、または2つの反復配列間での組換えによるか（R2）のいずれかで誘導することができる。反復配列の大きさと位置は概略である。12A-12B illustrate the alteration of point mutations at the MG259 locus of the synthetic M. genitalium genome. FIG. 12A illustrates a mutation correction scheme by two consecutive homologous recombination. The two primers (arrows) Seq-F and Seq-R are 0.4 kb apart at the MG259 locus, and insertion of a 1.1 kb URA3 marker results in the production of a 1.3 kb PCR DNA fragment. FIG. 12B illustrates the potential loss of the URA3 marker from M. genitalium YAC. 5-FOA resistant clones can be induced either by replacement of the URA3 marker with a wild-type DNA fragment (R1) or by recombination between two repeat sequences (R2). The size and position of the repetitive sequence is approximate. 図13は、例示的なTREC法の概要を説明する。標的領域を、ノックアウトコア（18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーターの制御下にあるI-SceI遺伝子、およびURA3遺伝子）と、標的部位の上流に対して同一であるDNA断片（矢印で示す）とからなる突然変異誘発カセットで置き換える。この置き換えにより、コアを含むタンデム反復配列が生じる。ガラクトースにより、I-SceI部位で二本鎖の断裂（DSB）を生じるI-SceIの発現を誘導する。DSBは、反復配列間での分子内相同組換えを促進して、コアの除去を導く。FIG. 13 outlines an exemplary TREC method. The target region is a DNA fragment (indicated by an arrow) that is identical to the knockout core (18 bp I-SceI recognition site, I-SceI gene under the control of the GAL1 promoter, and URA3 gene) upstream of the target site. Replace with a mutagenesis cassette consisting of This replacement results in a tandem repeat containing the core. Galactose induces the expression of I-SceI resulting in a double-strand break (DSB) at the I-SceI site. DSB promotes intramolecular homologous recombination between repetitive sequences, leading to core removal. 図14Aおよび14Bは、完全欠失（delitto perfetto）法（図14A）またはタンデム反復ポップアウト法（tandem repeat pop-out method）（図14B）により、同じ遺伝子座を変更し、それぞれ、点変異または450bpの欠失を生じる2種類の他の方法を説明する。FIGS. 14A and 14B show the same locus altered by the deletto perfetto method (FIG. 14A) or the tandem repeat pop-out method (FIG. 14B), respectively, with point mutations or Two other ways of generating a 450 bp deletion are described. 図15は、最終的な突然変異誘発カセット構築物の例示的な作製を説明する。FIG. 15 illustrates an exemplary generation of the final mutagenesis cassette construct. 図16は、宿主細胞へのドナーゲノムの移動、その変更、およびこれを、ゲノムの移植によりレシピエントにインストール（installing）して戻すことを説明する。一つの例示的な方法においては、酵母ベクターとともに細菌のゲノムを酵母にクローニングした後、酵母の遺伝学的方法のレパートリーを使用して、細菌のゲノム中で挿入、欠失、再構成、または複数の改変の任意の組み合わせを作製する。その後、この変更したゲノムを単離し、レシピエント細胞に移植して、変更した細菌を作製する。これをレシピエント細胞の制限システムから保護するためは、レシピエント細胞に戻す移植の前に、ドナーDNAをメチル化することが必要である場合がある。このサイクルは、新しく変更したゲノム（点線の矢印）から出発して繰り返すことができる。FIG. 16 illustrates the transfer of the donor genome to the host cell, its modification, and its installation back into the recipient by genome transfer. In one exemplary method, a bacterial genome is cloned into yeast along with a yeast vector and then inserted, deleted, rearranged, or multiple in the bacterial genome using a repertoire of yeast genetic methods. Any combination of the modifications is made. The altered genome is then isolated and transplanted into recipient cells to produce the altered bacteria. To protect this from the recipient cell restriction system, it may be necessary to methylate the donor DNA prior to transplantation back into the recipient cell. This cycle can be repeated starting from the newly modified genome (dotted arrow). 図17は、YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres M.ミコイデスのゲノムの移植のシームレスな欠失領域の核酸配列を提供し、設計したとおりに、III型制限遺伝子が除去されたことを確認した。イタリック体の配列テキストは、遺伝子マップ図19の「typeIIImod」領域の領域に対応する。下線をひいた配列テキストは、「typeIIIres」領域に対応する。太字のテキストは「IGR」領域に対応する。typeIIImod遺伝子とtypeIIIres遺伝子との間での重複が原因で、typeIIIres遺伝子の小さい部分が欠失後も残った。typeIIIres遺伝子の開始コドンと終結コドンに、拡大したフォントで下線をひいた。typeIIImod遺伝子の終結コドンを、下線をひいた、イタリック体の、太字の拡大したフォントで説明する。図17は、SEQ ID NO:195を開示する。FIG. 17 provided the nucleic acid sequence of the seamless deletion region of YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres M. mycoides genome transfer, confirming that the type III restriction gene was removed as designed. The italicized sequence text corresponds to the region of the “type III mod” region of the gene map FIG. The underlined sequence text corresponds to the “type IIIres” region. Bold text corresponds to the “IGR” region. Due to duplication between the typeIIImod and typeIIIres genes, a small portion of the typeIIIres gene remained after the deletion. The start and end codons of the typeIIIres gene are underlined with an enlarged font. The termination codon of the typeIIImod gene is illustrated in italicized, bold font with underline. FIG. 17 discloses SEQ ID NO: 195. 図18A〜18Cは、酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスYCpMmyc1.1ゲノムの安定性を示す。図18Aは、YCpMmyc1.1ゲノムの概略図を提供する。組込んだYCpの位置を示す。PCR増幅に使用した9種類の個々のプライマー対を、ゲノム中のそれらのおおよその位置に示し、図18B中でアンプリコンに対応する番号をつける。図18B。酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスゲノムの安定性を2種類の方法により試験した。最初に、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のコロニーを新しいプレート上に継いだ（patch）。第2に、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を飽和状態にまで増殖させ、1/100の割合に希釈し、再び飽和状態にまで増殖させた。その後、培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のコロニーを新しいプレート上に継いだ。いずれの方法においても、ゲノムDNAを単離し、Aに示した9種類の個別のプライマー対を使用したマルチプレックスPCR増幅（multiplex PCR amplification）において鋳型として使用した。得られたアンプリコンをゲル電気泳動により分析した。ゲルの右側の数字は、Aに示した個別のプライマー対のアンプリコンに対応する。レーンGはポジティブコントロールであり、レーンNは、ゲノムを含まないネガティブコントロールである。分子量マーカーはレーンMである。示す結果は、分析した40個の試料の典型となるものである。40個のクローン全てが完全なゲノムを含むように見え、細菌のゲノムが酵母の中での繰り返される増殖の間、安定であることを示している。図18Cは、M.ミコイデスYCpMmyc1.1のゲノムの概略図を提供する。組込まれたYCpの位置を示す。PCR増幅において使用した9種類の個別のプライマー対を、ゲノムの中のそれらのおおよその位置に示し、図18Bにより識別したアンプリコンに対応する番号をつける。斜線は、クローン3においてはアンプリコンが欠けていることを示す。URA3を含むカセットでのM.ミコイデスYCpMmyc1.1酵母クローンの形質転換後、Ura+クローンのゲノムをマルチプレックスPCRにより評価し、得られたアンプリコンをゲル電気泳動により分析した（現時点で示されるデータ）。アンプリコン5〜8は、クローン3においては欠けており、このことは、このゲノムの中に大きな欠失が存在することを示唆している。他の4つのクローンは、完全なゲノムを含むようであった。Figures 18A-18C show the stability of the M. mycoides YCpMmyc1.1 genome during growth in yeast. FIG. 18A provides a schematic representation of the YCpMmyc1.1 genome. Indicates the position of the incorporated YCp. The nine individual primer pairs used for PCR amplification are shown at their approximate location in the genome and numbered corresponding to amplicons in FIG. 18B. FIG. 18B. The stability of the M. mycoides genome during growth in yeast was tested by two methods. Initially, clonal yeast cultures containing the genome were seeded on solid synthetic medium without histidine for 2 days, after which individual colonies were patched onto new plates. Second, the clone-containing yeast culture containing the genome was grown to saturation, diluted 1/100, and grown again to saturation. The cultures were then seeded on solid synthetic medium without histidine for 2 days, after which individual colonies were passaged onto new plates. In both methods, genomic DNA was isolated and used as a template in multiplex PCR amplification using the 9 individual primer pairs shown in A. The resulting amplicon was analyzed by gel electrophoresis. The numbers on the right side of the gel correspond to the individual primer pair amplicons shown in A. Lane G is a positive control, and lane N is a negative control without a genome. The molecular weight marker is lane M. The results shown are representative of the 40 samples analyzed. All 40 clones appear to contain the complete genome, indicating that the bacterial genome is stable during repeated growth in yeast. Figure 18C provides a schematic representation of the genome of M. mycoides YCpMmyc1.1. Indicates the position of the incorporated YCp. The nine individual primer pairs used in PCR amplification are shown at their approximate location in the genome and numbered corresponding to the amplicon identified by FIG. 18B. The diagonal line indicates that clone 3 lacks an amplicon. After transformation of the M. mycoides YCpMmyc1.1 yeast clone with a cassette containing URA3, the genome of the Ura + clone was evaluated by multiplex PCR, and the resulting amplicon was analyzed by gel electrophoresis (data shown at present) . Amplicons 5-8 are missing in clone 3, suggesting that there is a large deletion in this genome. The other four clones appeared to contain the complete genome. 図19は、III型制限酵素欠失の作製を説明する。酵母の中でM.ミコイデス III型制限酵素遺伝子（typeIIIres）欠失を作製する（iii）ために、直鎖状のDNA断片であるノックアウトカセットを、2つのPCR産物コアとタンデム反復配列（TR）とを融合させることにより構築した（i）。その後、このカセットで、YCpMmyc1.1 M.ミコイデスゲノムを持っている酵母W303a株を形質転換した（ii）。（-）His（-）Ura培地上での増殖により、標的部位に対して相同である50塩基対（bp）の配列を介した上記カセットによるIII型制限酵素オープンリーディングフレーム（ORF）の置き換え（ΔtypeIIIres::URA3）について選択した。ガラクトース誘導により、I-SceIエンドヌクレアーゼの発現が生じる。I-SceIエンドヌクレアーゼは、2つのタンデム反復配列（TR）（構築物の上の説明をつけていない線）の間での相同組換えを促進する二本鎖の断裂を作製するために18bpのI-SecI部位（アスタリスク）を切断する。TR間での組換えにより、typeIIIres遺伝子のシームレスな欠失（ΔtypeIIIres）を作製し、これを、URA3遺伝子、IGR、遺伝子間領域に対する5-フルオロオロチン酸（5-FOA）対抗選択の後に単離した。それぞれのアンプリコンについて予想した大きさが得られた（データ示さず）。FIG. 19 illustrates the generation of a type III restriction enzyme deletion. To create a M. mycoides type III restriction gene (typeIIIres) deletion in yeast (iii), a linear DNA fragment, a knockout cassette, two PCR product cores and a tandem repeat (TR) (I). Thereafter, this cassette was used to transform the yeast strain W303a having the YCpMmyc1.1 M. mycoides genome (ii). Replacement of type III restriction enzyme open reading frame (ORF) with the above cassette via a 50 base pair (bp) sequence homologous to the target site by growth on (-) His (-) Ura medium ( Δtype IIIres :: URA3) was selected. Galactose induction results in the expression of I-SceI endonuclease. The I-SceI endonuclease is an 18 bp I to create a double-strand break that promotes homologous recombination between two tandem repeats (TR) (the undescripted line of the construct). -Cut the SecI site (asterisk). Recombination between TR creates a seamless deletion of the typeIIIres gene (ΔtypeIIIres), which is isolated after 5-fluoroorotic acid (5-FOA) counter-selection against the URA3 gene, IGR, and intergenic region did. Expected sizes were obtained for each amplicon (data not shown). 図20は、酵母での合成M.ミコイデスゲノムのアセンブリを示した概略図を提供する。1,078個の重複DNAカセットから3段階で1,077,947bpの合成M.ミコイデスゲノムをアセンブリした。第1段階において、重複する合成オリゴヌクレオチドから生成された、1,080bpのカセット(橙色の矢印)を10セットで再結合させて、109個のおよそ10kbのアセンブリ(青色の矢印)を生成した。次いでこれらを10セットで再結合させて、11個のおよそ100kbのアセンブリ(緑色の矢印)を生成した。アセンブリの最終段階において、これらの11個の断片を完全なゲノム(赤色の環)へ再結合した。インビトロで酵素によりつなぎ合わされた2つの構築物(白色の矢印)を除き、酵母におけるインビボでの相同組換えによってアセンブリを行った。天然ゲノムとの主な差異を黄色の環として示す。これらには4つの透かし領域(watermarked regions) (WM1〜WM4)、意図的に欠失された4kbの領域(94D)、ならびに酵母での増殖およびゲノム移植のためのエレメントが含まれる。さらに、ヌクレオチド多型を有する20箇所の位置(星印)が存在する。ゲノムの座標は天然M.ミコイデス配列の最初のヌクレオチドに相対する。AscIおよびBssHII制限部位の位置が示されている。カセット1および800〜810は不必要であり、アセンブリ戦略から除かれた。カセット2はカセット1104と重複し、カセット799はカセット811と重複する。FIG. 20 provides a schematic showing the assembly of the synthetic M. mycoides genome in yeast. A synthetic M. mycoides genome of 1,077,947 bp was assembled in three steps from 1,078 overlapping DNA cassettes. In the first step, the 1080 bp cassettes (orange arrows) generated from overlapping synthetic oligonucleotides were recombined in 10 sets to produce 109 approximately 10 kb assemblies (blue arrows). These were then recombined in 10 sets to generate 11 approximately 100 kb assemblies (green arrows). In the final stage of assembly, these 11 fragments were recombined into the complete genome (red circle). Assembly was performed by in vivo homologous recombination in yeast, with the exception of the two constructs joined together by enzymes in vitro (white arrows). Major differences from the natural genome are shown as yellow circles. These include four watermarked regions (WM1-WM4), a 4 kb region that was intentionally deleted (94D), and elements for growth and genome transfer in yeast. In addition, there are 20 positions (stars) with nucleotide polymorphisms. Genomic coordinates are relative to the first nucleotide of the native M. mycoides sequence. The positions of AscI and BssHII restriction sites are indicated. Cassettes 1 and 800-810 were unnecessary and were removed from the assembly strategy. Cassette 2 overlaps with cassette 1104, and cassette 799 overlaps with cassette 811. 図21は、PCRおよびインビトロ組換えを用いた誤りの修正を図解した概略図を提供する。プライマー(BH pUC骨格順方向1および逆方向1)を用いて、組換え反応で用いるためのプラスミド骨格を増幅した。骨格プライマーの相補鎖(BH挿入断片順方向1および逆方向1)を誤り修正用のプライマー(カセット修正順方向1および逆方向1)とともに用いて、相互に相同性の領域およびBH骨格アンプリコンと相同性の領域を有するアンプリコンを生成した。3つのPCR産物をインビトロ組換えで用いて、修正されたカセットを作製した。FIG. 21 provides a schematic diagram illustrating error correction using PCR and in vitro recombination. Primers (BH pUC backbone forward 1 and reverse 1) were used to amplify the plasmid backbone for use in the recombination reaction. Using the complementary strands of the backbone primer (BH insert forward 1 and reverse 1) together with the error correction primers (cassette correction forward 1 and reverse 1), the region of homology with each other and the BH backbone amplicon Amplicons with regions of homology were generated. Three PCR products were used in in vitro recombination to create a modified cassette.

発明の詳細な説明
A.定義
特に明記しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。 Detailed Description of the Invention
A. Definitions Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

本明細書中で言及する特許、公開されている特許出願、他の刊行物、ならびにGenBankおよび他のデータベースによる配列は全て、関連する技術に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。   Patents, published patent applications, other publications, and sequences from GenBank and other databases referred to herein are all incorporated herein by reference in their entirety with respect to the relevant technology.

特に明記しない限りは、当業者の能力の範囲内にある本提供の態様の実施では、分子生物学などの従来技術を利用する。そのような技術は、文献の中に十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,（J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）;Current Protocols in Molecular Biology（F.Ausubel et al.eds., 1987、および最新版）;Essential Molecular Biology（Brown ed., IRL Press 1991）;Gene Expression Technology（Goeddel ed., Academic Press 1991）;Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes（Bothwell et al.eds., Bartlett Publ.1990）;Gene Transfer and Expression（Kriegler, Stockton Press 1990）;Recombinant DNA Methodology（R.Wu et al.eds., Academic Press 1989）;PCR:A Practical Approach（M.McPherson et al, IRL Press at Oxford University Press 1991）;Cell Culture for Biochemists（R.Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990）;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（Miller & M.Calos eds., 1987）;Mammalian Cell Biotechnology（M.Butler ed., 1991）;Animal Cell Culture（Pollard et al.eds., Humana Press 1990）;Culture of Animal Cells, 第2版（Freshney et al.eds., Alan R.Liss 1987）。   Unless otherwise stated, implementation of the provided embodiments within the ability of one skilled in the art will utilize conventional techniques such as molecular biology. Such techniques are explained fully in the literature. For example, see: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al. Eds). 1987, and the latest edition); Essential Molecular Biology (Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (Bothwell et al. Eds. , Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al. Eds., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al, IRL) Press at Oxford University Press 1991); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler) ed., 1991); Animal Cell Culture (Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, No. Second edition (Freshney et al. Eds., Alan R. Liss 1987).

本明細書中で使用する場合は、「一つ（a）」または「一つ（an）」は、「一つ（one）」、「少なくとも一つ」、あるいは「一つまたは複数」を意味する。   As used herein, “one” or “an” means “one”, “at least one”, or “one or more”. To do.

本明細書中で使用する場合は、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用し、これには、リボ核酸（RNA）とデオキシリボ核酸（DNA）の両方、および改変された核酸分子（例えば、ペプチド核酸（PNA）、ロックされた核酸（LNA）、および他の改変された核酸分子（cDNA、ゲノムDNA、およびmRNAを含むがこれらに限定されない）、ならびに合成の核酸分子（例えば、化学合成されるもの、または組換えにより産生されるもの）が含まれる。核酸分子は二本鎖であっても、また一本鎖であってもよい。一本鎖の場合は、核酸分子はセンス鎖であっても、またアンチセンス鎖であってもよい。加えて、核酸分子は環状であっても、また直鎖状であってもよい。   As used herein, “nucleic acid”, “nucleic acid molecule”, “nucleic acid sequence”, “oligonucleotide”, and “polynucleotide” are used interchangeably and include ribonucleic acid (RNA) And deoxyribonucleic acid (DNA), and modified nucleic acid molecules (eg, peptide nucleic acids (PNA), locked nucleic acids (LNA), and other modified nucleic acid molecules (including cDNA, genomic DNA, and mRNA) As well as synthetic nucleic acid molecules (eg, chemically synthesized or recombinantly produced) The nucleic acid molecule may be double-stranded or single-stranded. In the case of a single strand, the nucleic acid molecule may be a sense strand or an antisense strand, and in addition, the nucleic acid molecule may be circular or linear. May be.

本明細書中で使用する場合は、「制限エンドヌクレアーゼ部位」は、制限酵素により認識され、切断される標的核酸配列をいう。制限酵素は、当技術分野で周知である。   As used herein, a “restriction endonuclease site” refers to a target nucleic acid sequence that is recognized and cleaved by a restriction enzyme. Restriction enzymes are well known in the art.

本明細書中で使用する場合は、「ゲノム」には、全（完全な）ゲノム（例えば、全細胞ゲノム、全ウイルスゲノム、および細胞小器官の全ゲノム）が含まれ、これには、少なくとも1セットの環境条件下で、細胞の生存能力を達成するおよび/または維持するために十分な核酸配列を有している全ゲノムの一部（最小の細胞ゲノム）、生存能力を宿主細胞に依存する生物の、宿主細胞内での生存能力を達成するおよび/または維持するために十分な核酸配列を有している全ゲノムの一部（例えば、最小のウイルスゲノム）、あるいは、宿主細胞内での細胞小器官の機能を達成するおよび/または維持するために十分な核酸配列を有している全ゲノムの一部（最小の細胞小器官のゲノム）が含まれる。したがって、用語ゲノムは、全ゲノム、および少なくとも最小ゲノムであるその一部をいう。特定の環境条件と、ゲノムにより生じるかまたは維持される特性は特別なものであり得る。細胞小器官もしくはウイルスゲノム、または増殖および生存能力を宿主に依存する他のゲノムの場合には、環境条件に、適している機能性の宿主細胞の環境が含まれ得る。したがって、用語ゲノムには、最小ゲノムおよび最小複製性ゲノム（minimal replicative genome）、ならびに、そのような最小ゲノムの中で見られる核酸配列より長いさらなる核酸配列を含むが、全ゲノムの中に存在する核酸配列を全て含むわけではないさらなる核酸配列を含むゲノムが含まれる。用語「ゲノム」には、自然界に存在している自然界に存在しているゲノムおよび合成のゲノムが含まれ、自然界には、または研究室にはこれまでは存在していなかったゲノムのような遺伝学的に変更された（改変されたゲノム、および2種類以上の種に由来する核酸および/またはゲノムの一部を含むハイブリッドゲノムを含む）ゲノムが含まれる。用語「ゲノム」には、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノム）、自己複製する生物（原核生物および真核生物、真菌、酵母、細菌（例えば、マイコプラズマ）、古細菌、脊椎動物、哺乳動物、ならびに他の生物を含む）のゲノム（細胞ゲノム）、ならびに、ウイルスゲノムおよび増殖を宿主に依存する他のゲノムが含まれる。ゲノムにはさらに、任意の公知のLinneanカテゴリーには入らない生物のゲノム、および合成の生物のゲノムが含まれる。例示的なゲノムは、細菌および酵母を含む単細胞生物のゲノムのような微生物のゲノムであり得る。   As used herein, “genome” includes whole (complete) genomes (eg, whole cell genomes, whole virus genomes, and whole genomes of organelles), including at least A portion of the entire genome (smallest cell genome) that has sufficient nucleic acid sequences to achieve and / or maintain cell viability under a set of environmental conditions, viability depends on host cell A portion of the entire genome (eg, the smallest viral genome) having sufficient nucleic acid sequence to achieve and / or maintain viability of the organism in the host cell, or in the host cell A portion of the entire genome (smallest organelle genome) that has sufficient nucleic acid sequence to achieve and / or maintain the function of the organelle is included. Thus, the term genome refers to the entire genome and a portion thereof that is at least the smallest genome. Specific environmental conditions and the properties generated or maintained by the genome can be special. In the case of organelles or viral genomes, or other genomes that depend on the host for growth and viability, the environmental conditions may include a suitable functional host cell environment. Thus, the term genome includes, but is present in, the entire genome, including minimal and minimal replicative genomes, as well as additional nucleic acid sequences that are longer than those found in such minimal genomes. Included are genomes that include additional nucleic acid sequences that do not include all of the nucleic acid sequences. The term “genome” includes naturally occurring and synthetic genomes that exist in nature, such as genomes that have never existed in nature or in the laboratory. Included are genetically altered genomes (including modified genomes and hybrid genomes containing nucleic acids and / or parts of genomes derived from two or more species). The term “genome” includes organelle genomes (eg, mitochondrial and chloroplast genomes), self-replicating organisms (prokaryotes and eukaryotes, fungi, yeast, bacteria (eg, mycoplasma), archaea, spine The genome (including the animal, mammal, and other organisms) (cell genome) and other genomes that depend on the host for viral genome and propagation. The genome further includes the genome of an organism that does not fall into any known Linnean category, and the genome of a synthetic organism. Exemplary genomes can be microbial genomes, such as unicellular organisms including bacteria and yeast.

本明細書中で使用する場合は、「細胞ゲノム」は、細胞の生存性を生じるおよび/または維持するために十分な核酸配列を含むゲノムをいう。そのような核酸配列には、複製、転写、翻訳、エネルギー生産、輸送、膜および細胞質成分の産生、ならびに細胞***に必要な分子をコードする核酸配列が含まれる。細胞ゲノムとしては、最小の細胞ゲノム、全細胞ゲノム、および最小の細胞ゲノムに加えてさらなる核酸を有しているが、全細胞ゲノムの核酸の全てではないゲノムが挙げられる。少なくとも、細胞ゲノムは、細胞の複製および/または生存能力に十分な核酸を含むが、ウイルスゲノムおよび細胞小器官ゲノムは、例えば、宿主細胞の中でウイルスもしくは細胞小器官を維持するかまたは複製するために必要な核酸を含むが、宿主細胞の生存能力もしくは複製を維持するための核酸を含まない点で、細胞ゲノムは、「ウイルスゲノム」および「細胞小器官ゲノム」とは異なる。   As used herein, “cell genome” refers to a genome that contains sufficient nucleic acid sequences to produce and / or maintain cell viability. Such nucleic acid sequences include nucleic acid sequences that encode molecules necessary for replication, transcription, translation, energy production, transport, production of membrane and cytoplasmic components, and cell division. Cell genomes include a minimal cell genome, a whole cell genome, and a genome that has additional nucleic acids in addition to the smallest cell genome, but not all of the nucleic acids of the whole cell genome. At least the cell genome contains nucleic acids sufficient for cell replication and / or viability, while the viral genome and organelle genome maintain or replicate, for example, the virus or organelle in the host cell Cell genomes differ from “viral genomes” and “organelle genomes” in that they contain the nucleic acids necessary for them, but do not contain nucleic acids to maintain the viability or replication of the host cell.

本明細書中で使用する場合は、「最小ゲノム」は、少なくとも1セットの環境条件下で、細胞の生存能力を達成するおよび/または維持するために十分な核酸の最小のセット（最小の細胞ゲノム）、生存能力を宿主細胞に依存する生物の、宿主細胞内での生存能力を達成するおよび/または維持するために十分な核酸の最小のセット（例えば、最小のウイルスゲノム）、あるいは、宿主細胞内での細胞小器官の機能を達成するおよび/または維持するために十分な核酸の最小のセット（最小の細胞小器官のゲノム）からなるか、あるいは本質的にそれらからなるゲノムをいう。さらに、細胞小器官の全ゲノムが、必ずしも細胞小器官を持続させるために必要な全てのタンパク質をコードするというわけではないこと、そしてそれらのタンパク質のうちのいくつかが、細胞小器官を含む細胞の核内の遺伝子によりコードされることが理解される。したがって、最小の細胞小器官のゲノムには、細胞の環境内での細胞小器官の機能に必要なそのような遺伝子だけが必要である。同様に、ウイルスは、生存能力を宿主細胞に依存すること、したがって、必要な最小のウイルスゲノムは、宿主細胞内のウイルスの生存能力をサポートするにすぎないことが理解される。「最小の複製性ゲノム」は、生存のために十分な最小の核酸配列に加えて、さらに、細胞または生物の自己複製のために十分な核酸配列を含む最小ゲノムである。   As used herein, a “minimal genome” is a minimal set of nucleic acids (smallest cells sufficient to achieve and / or maintain cell viability under at least one set of environmental conditions. Genome), a minimal set of nucleic acids (eg, a minimal viral genome) sufficient to achieve and / or maintain viability in the host cell of an organism whose viability depends on the host cell, or the host A genome that consists of, or consists essentially of, a minimal set of nucleic acids sufficient to achieve and / or maintain the function of an organelle within a cell. Furthermore, the entire genome of the organelle does not necessarily encode all the proteins necessary to sustain the organelle, and some of those proteins contain cells that contain the organelle It is understood that it is encoded by a gene in the nucleus. Thus, the smallest organelle genome requires only such genes necessary for the function of the organelle within the cellular environment. Similarly, it is understood that viruses depend on the host cell for viability, and thus the minimum viral genome required only supports the viability of the virus in the host cell. A “minimal replicating genome” is a minimal genome that, in addition to the minimal nucleic acid sequence sufficient for survival, further comprises sufficient nucleic acid sequence for the self-replication of a cell or organism.

本明細書中で使用する場合は、合成のゲノムまたはその全体もしくは一部を含む合成の核酸配列は、インビトロで化学合成された遺伝学的成分またはそのような成分のコピーから構築する。上記コピーは、当技術分野で公知であるように、多数の方法のうちの任意のものにより産生することができ、これには、インビボまたはインビトロでの方法によるクローニングおよび増幅が含まれる。完全に合成の核酸配列またはゲノムは、核酸全体もしくはゲノム全体がインビトロで化学合成されたもの、あるいは、そのようなインビトロで化学合成された核酸のコピーから産生されたかまたはアセンブリされたものである。対照的に、「半合成」ゲノムは、一部が合成の核酸配列またはゲノムをいい、これは、遺伝学的成分の一部が、自然界に存在している核酸からクローニングした核酸を含む自然界に存在しているものである、合成のゲノムである。   As used herein, a synthetic nucleic acid sequence comprising a synthetic genome, or all or part thereof, is constructed from genetic components synthesized in vitro or copies of such components. The copy can be produced by any of a number of methods, as is known in the art, including cloning and amplification by in vivo or in vitro methods. A fully synthetic nucleic acid sequence or genome is one in which the entire nucleic acid or the entire genome is chemically synthesized in vitro, or produced or assembled from a copy of such in vitro chemically synthesized nucleic acid. In contrast, a “semi-synthetic” genome refers to a partially synthetic nucleic acid sequence or genome, which is a naturally occurring part of a genetic component, including nucleic acids cloned from naturally occurring nucleic acids. It is a synthetic genome that exists.

本明細書中で使用する場合は、外来または異種のゲノムまたは核酸配列は、宿主細胞中に存在するが、宿主細胞とは異なる種のものであるドナー生物に由来する、ゲノムまたは核酸配列である。ドナー生物は、様々な属、目、界、または他の遺伝学的分類のものであり得るか、あるいは単純に、同じ属の異なる種であり得る。   As used herein, a foreign or heterologous genomic or nucleic acid sequence is a genomic or nucleic acid sequence that is present in a host cell but is derived from a donor organism that is of a different species than the host cell. . The donor organism can be of various genera, eyes, kingdoms, or other genetic classifications, or can simply be different species of the same genus.

本明細書中で使用する場合は、「標的核酸配列」は、例えば、本明細書中に記載する、当技術分野で公知の改変方法による改変のために標的化される核酸配列をいう。標的核酸配列の一つまたは複数の改変は、標的核酸配列中への一つまたは複数の突然変異、一つまたは複数の欠失、一つまたは複数の置換、および/または一つまたは複数の挿入の導入を含む。標的領域は、改変の対象である単一の遺伝子座、多数の遺伝子座、またはその一部のような標的核酸配列の特定の領域である。一つの例においては、標的領域は、例えば、相同組換えによるように、別の核酸配列で置き換えた標的核酸配列の領域を含む。標的核酸配列の改変後に、改変した核酸配列中の標的領域全体が、もとの標的領域と比較して改変されていることは必ずしも必要ではない。例えば、標的領域の改変には、標的領域の中の一つの標的位置/残基での単一の挿入、欠失、または置換が含まれていてもよく、また、標的領域の一つまたは複数の標的部分の中の多数の位置/残基の改変が含まれていてもよい。   As used herein, a “target nucleic acid sequence” refers to a nucleic acid sequence that is targeted for modification by, for example, modification methods known in the art, as described herein. One or more modifications of the target nucleic acid sequence may include one or more mutations, one or more deletions, one or more substitutions, and / or one or more insertions into the target nucleic acid sequence. Including the introduction of. A target region is a specific region of a target nucleic acid sequence, such as a single locus, multiple loci, or portions thereof that are to be modified. In one example, the target region includes a region of the target nucleic acid sequence that has been replaced with another nucleic acid sequence, such as by homologous recombination. After modification of the target nucleic acid sequence, it is not always necessary that the entire target region in the modified nucleic acid sequence is modified as compared to the original target region. For example, modification of a target region may include a single insertion, deletion, or substitution at one target position / residue within the target region, and one or more of the target regions Numerous position / residue modifications within the target portion of may be included.

B.ゲノムおよび大きな核酸のクローニングおよび操作のための方法
ドナーゲノムと他のドナー核酸配列とを異種宿主細胞に導入するための、ドナーゲノムと核酸配列とを宿主細胞の中で改変するための、ドナーゲノムと核酸配列とを宿主細胞から回収するための、および回収したドナーゲノムと核酸配列とをレシピエント細胞に導入するための、核酸、方法、ならびにシステムを本明細書中で提供する。ドナー、宿主、およびレシピエントの核酸配列、細胞、および遺伝子システムの間での不和合性、および/または例えば、それらの間での毒性を最小限にする局面が、提供する核酸配列、方法、およびシステムの範囲に含まれる。本提供の方法の一つの例示的な態様を図1に説明する。ここでは、上記方法を、酵母宿主細胞を細菌のドナーゲノムで形質転換するために、上記細菌のドナーゲノムを、酵母宿主ベクターと連結し、酵母宿主細胞の中でドナーゲノムを改変し、そしてこの改変したドナーゲノムを細菌のレシピエント細胞に移植し、それによって変更した細菌を作製することにより使用する。図1に示すように、変更した細菌中に存在する改変したゲノムを単離し、これに続いて行う反復様式での一連の方法においてドナーゲノムとすることができる。この態様の多数のバリエーションを検討し、これらは本明細書中に記載するように、本出願の範囲に含まれる。本提供の方法の別の例示的な方法を図16に説明する。ここでは、上記方法を、宿主酵母ベクターを細菌のゲノムに挿入するため、組込み型酵母ベクターを用いてゲノムを単離するため、細菌のゲノム/酵母ベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換するため、細菌のゲノムを改変するため、改変したゲノムを単離するため、任意で、上記ゲノムをメチル化するため、そしてドナーゲノムをレシピエント細胞に移植するために使用する。 B. Methods for cloning and manipulation of genomes and large nucleic acids For introducing donor genomes and other donor nucleic acid sequences into heterologous host cells, for modifying donor genomes and nucleic acid sequences in host cells, Provided herein are nucleic acids, methods, and systems for recovering donor genomes and nucleic acid sequences from host cells and for introducing recovered donor genomes and nucleic acid sequences into recipient cells. Nucleic acid sequences, methods, wherein aspects that minimize incompatibility and / or toxicity between, for example, donor, host, and recipient nucleic acid sequences, cells, and genetic systems provide And included in the scope of the system. One exemplary embodiment of the provided method is illustrated in FIG. Here, in order to transform the yeast host cell with the bacterial donor genome, the method is ligated with a yeast host vector, the donor genome is modified in the yeast host cell, and the The modified donor genome is used by transplanting into a bacterial recipient cell, thereby creating a modified bacterium. As shown in FIG. 1, a modified genome present in a modified bacterium can be isolated and made a donor genome in a series of methods in a subsequent iterative manner. Numerous variations of this embodiment are contemplated and are within the scope of the present application, as described herein. Another exemplary method of the provided method is illustrated in FIG. Here, the above method is used to insert a host yeast vector into the bacterial genome, to isolate the genome using an integrative yeast vector, or to transform a yeast host cell using a bacterial genome / yeast vector. Used to modify the bacterial genome, to isolate the modified genome, optionally to methylate the genome, and to transfer the donor genome to recipient cells.

実施例5は、ドナーである細菌のゲノムで酵母宿主細胞を形質転換すること、ドナーゲノムを酵母細胞の中で改変すること、その後、得られた改変したドナーゲノムをレシピエント細胞に移植することによる（その際、改変したドナーゲノムからの遺伝子発現が誘導された）、新しい細菌生物を作製するための本提供の方法の優れた組み合わせを記載する。結果を、ネガティブコントロールと、レシピエント細胞中のゲノムの配列決定により確認した。この実験は、その利用できる天然の遺伝子システムを使用する当技術分野の方法の最新技術を使用してもマイコプラズマの中で作製することができなかった、III型制限酵素遺伝子のシームレスな欠失を含むM.ミコイデスLCゲノムの作製の成功を明らかにした。移植により、研究室にも、また自然界にもこれまでに存在していなかったM.ミコイデスLC株が得られた。したがって、本提供の方法は、変更しようとするゲノムをコードする細胞の外での遺伝学的変更をうまく行うために使用することができる。   Example 5 involves transforming a yeast host cell with a donor bacterial genome, modifying the donor genome in a yeast cell, and then transplanting the resulting modified donor genome into a recipient cell. Describes an excellent combination of the provided methods for producing new bacterial organisms, in which gene expression from a modified donor genome has been induced. Results were confirmed by negative control and sequencing of the genome in recipient cells. This experiment demonstrates the seamless deletion of a type III restriction enzyme gene that could not be produced in mycoplasma using the state-of-the-art methods of the art using its available natural gene system. The successful production of the M. mycoides LC genome was clarified. The transplant yielded a M. mycoides LC strain that had never existed in the laboratory or in nature. Thus, the provided methods can be used to successfully make genetic changes outside the cell that encodes the genome to be altered.

例えば、有用な化合物（例えば、ワクチン、薬物、生物学的に産生したタンパク質または化学物質、およびバイオ燃料）を産生できるように生物を変更し、変化させるための、ゲノムおよび大きな核酸を操作するための方法およびツール、ならびに得られる細胞を提供する。特に、これらの方法は、エネルギー生産および医薬剤に有用な産物などの新しい遺伝子産物を産生する改変した遺伝子、ゲノム、および生物を生じさせるための、扱いにくい生物などの乏しい遺伝子システムを有している生物のゲノムおよび染色体の操作に必要である。   For example, to manipulate genomes and large nucleic acids to alter and change organisms to be able to produce useful compounds (eg, vaccines, drugs, biologically produced proteins or chemicals, and biofuels) Methods and tools, and the resulting cells. In particular, these methods have poor genetic systems, such as modified genes, genomes, and cumbersome organisms to produce new gene products, such as those useful for energy production and pharmaceutical agents. Necessary for manipulation of the genome and chromosomes of living organisms.

本出願の以前は、ゲノムおよび他の大きな核酸の操作に利用できる方法は限られていた。望ましい特性/特徴/表現型（例えば、有用な化合物を産生する能力および厳しい環境で機能する能力）を持つ多くの生物（原核生物のような単細胞生物を含む）は、極めて乏しい遺伝子システムを有するか、または存在しない遺伝子システム（研究室において生物の核酸の改変を可能にするシステム）を有する。したがって、本開示は、これらのゲノムおよび核酸を、より望ましい遺伝子システムを有する他の細胞（宿主細胞）に移入するために、ならびに、望ましいシステムを使用してゲノムおよび核酸をこれらの他の細胞の中で改変するために必要な方法とツールを提供する。   Prior to this application, there were limited methods available for the manipulation of genomes and other large nucleic acids. Do many organisms (including unicellular organisms such as prokaryotes) with desirable properties / features / phenotypes (eg, ability to produce useful compounds and function in harsh environments) have very poor genetic systems? Or a non-existent genetic system (a system that allows modification of a nucleic acid of an organism in a laboratory). Accordingly, the present disclosure provides for transferring these genomes and nucleic acids into other cells (host cells) having a more desirable genetic system, and using the desired system to transfer the genome and nucleic acids of these other cells. Provides the methods and tools needed to make changes in it.

改変した核酸から新しい遺伝子産物を産生させるために、本発明はまた、改変した核酸を、宿主細胞から遺伝子産物を発現することができる環境（例えば、適切なレシピエント細胞）に移植するための方法も提供する。宿主細胞中での発現が十分である場合もあるが、例えば、ドナーゲノムを宿主細胞から、天然のまたは合成のドナーゲノムが由来するもとのドナー細胞または生物のものにより近いように複製する細胞環境を有するレシピエント細胞へと移植することが所望される場合がある。一般的には、ゲノムおよび他の核酸（特に、大きな核酸）を操作し、変更するために使用することができる、改良した移入、クローニング、改変、および移植の方法、核酸、ならびにシステムを、本明細書中で提供する。   In order to produce a new gene product from the modified nucleic acid, the present invention also provides a method for transplanting the modified nucleic acid into an environment capable of expressing the gene product from a host cell (eg, an appropriate recipient cell). Also provide. In some cases, expression in the host cell may be sufficient, but for example, the donor genome replicates from the host cell so that it is closer to that of the original donor cell or organism from which the natural or synthetic donor genome is derived. It may be desirable to transplant into a recipient cell having an environment. In general, improved transfer, cloning, modification, and transplantation methods, nucleic acids, and systems that can be used to manipulate and modify genomes and other nucleic acids, particularly large nucleic acids, are described in this book. Provided in the specification.

同様に、本出願の以前は、利用できる方法による、宿主細胞への大きな核酸（ゲノムを含む）の移入は限られていた。核酸をクローニングするための従来の方法は周知である（優れた遺伝子システムを有している細菌および酵母を、多数の生物から核酸セグメントをクローニングするための宿主として使用する）が、これらの方法に伴う限界により、これらは、ゲノムおよび大きな核酸の操作および変更に望ましくないものとなり得る。例えば、従来の方法を使用して宿主細胞にクローニングすることができる核酸の大きさは限られている。従来の方法によりクローニングした核酸は、一般的には、数種類より多くの遺伝子を含まない。   Similarly, prior to this application, the transfer of large nucleic acids (including genomes) into host cells by available methods was limited. Conventional methods for cloning nucleic acids are well known (bacteria and yeasts that have a superior genetic system are used as hosts for cloning nucleic acid segments from a large number of organisms). Due to the limitations involved, these can be undesirable for the manipulation and modification of genomes and large nucleic acids. For example, the size of nucleic acids that can be cloned into host cells using conventional methods is limited. Nucleic acids cloned by conventional methods generally do not contain more than a few genes.

不和合性と毒性の問題もまた、利用できるクローニング方法を限定し得る。例えば、ドナー核酸は宿主細胞にとって毒性であり得（例えば、毒性タンパク質がドナー核酸により発現される場合）、そして宿主の遺伝子システムを使用する宿主細胞の複製および/または改変のような事象の間に不安定になる可能性がある。そのような事象は、宿主細胞の中で核酸を操作する能力を限定し得る。さらに、改変プロセスの間に起こり得る、ドナーゲノムにとって望ましくない改変が、多くの場合に、宿主細胞の生存能力に対してネガティブな影響を有さないという事実は、宿主細胞中のドナーゲノムおよび他の核酸を不安定にする可能性がある。   Incompatibility and toxicity issues can also limit the available cloning methods. For example, the donor nucleic acid can be toxic to the host cell (eg, when a toxic protein is expressed by the donor nucleic acid) and during events such as replication and / or modification of the host cell using the host genetic system. May become unstable. Such an event may limit the ability to manipulate the nucleic acid in the host cell. Furthermore, the fact that alterations that can occur during the modification process and that are undesirable for the donor genome often have no negative impact on the viability of the host cell is due to the fact that the donor genome in the host cell and other May destabilize the nucleic acid.

不和合性の問題もまた、宿主細胞から、遺伝子産物の発現のためのより自然な環境へと（例えば、ドナーと同じ種またはより近い関係にある種のレシピエント細胞へと）ドナーゲノムを戻す効率的な移植を損なう可能性がある。中でも、遺伝学的に異なる宿主細胞（例えば、もとのドナーゲノムの種とはより異なるレシピエント細胞への移植のための酵母宿主細胞）の中でドナー核酸（ゲノムを含む）の増殖および改変をうまく行うためにそのような問題を克服する改変方法が、提供する態様である。   Incompatibility issues also return the donor genome from the host cell to a more natural environment for expression of the gene product (eg, to a recipient cell of the same species or a closer relationship with the donor) Efficient porting can be compromised. Among other things, propagation and modification of donor nucleic acids (including genomes) in genetically different host cells (eg, yeast host cells for transplantation into recipient cells that are different from the species of the original donor genome) A modified method that overcomes such problems in order to successfully perform is a provided aspect.

宿主細胞からのドナーゲノムの回収と、ドナーゲノムのレシピエント細胞へのさらなる導入（ドナー、宿主、およびレシピエント細胞は、あまり近い関係にはない（例えば、生命の異なる分岐に由来する）場合）は、さらなる課題を引き起こす場合がある。例えば、原核生物レシピエントへの真核生物宿主中で増殖させたドナーゲノムの導入は、不和合性と毒性の問題により限定され得る。レシピエント細胞中に存在する（ドナー細胞中にもおそらく存在する）が、宿主細胞中には存在しない制限修飾システムは、ドナーゲノムを宿主細胞の中で増殖させると、移植の際に不和合性を引き起こす可能性がある。一部の宿主細胞（例えば、酵母）は制限修飾システムを含まないが、これらは、宿主細胞中で増殖されつつあるドナー核酸を修飾することができるDNAメチルトランスフェラーゼを発現することがあり、それにより、ドナー核酸（例えば、ゲノム）は、レシピエント細胞に移植されると活性化が阻害される。宿主細胞中での増殖および改変後に単離したドナーゲノムの構造と立体構造もまた、ドナー生物とより近い関係にある細胞の中で増殖させた同じゲノムの立体構造および構造とは異なる可能性がある。このような差異は移植にネガティブな影響を及ぼし得る。   Recovery of the donor genome from the host cell and further introduction of the donor genome into the recipient cell (if the donor, host, and recipient cell are not closely related (eg, derived from different branches of life)) Can cause further challenges. For example, introduction of a donor genome grown in a eukaryotic host into a prokaryotic recipient can be limited by incompatibility and toxicity issues. Restriction modification systems that are present in the recipient cell (possibly also in the donor cell) but not in the host cell are incompatible upon transplantation when the donor genome is propagated in the host cell. May cause. Some host cells (eg, yeast) do not contain a restriction modification system, but they may express a DNA methyltransferase that can modify the donor nucleic acid being grown in the host cell, thereby Donor nucleic acids (eg, genomes) are inhibited from activation when transplanted into recipient cells. The structure and conformation of a donor genome isolated after growth and modification in a host cell may also differ from the conformation and structure of the same genome grown in a cell that is more closely related to the donor organism. is there. Such differences can have a negative impact on transplantation.

ドナーゲノムのクローニング、宿主細胞中でのドナーゲノムの改変および/または増殖、ドナーゲノムの回収、ならびにレシピエント細胞へのドナーゲノムの導入をうまく行うことについてのそのような制限を克服する方法を、本明細書中に記載する。一つの局面においては、宿主細胞から回収したドナーゲノムを、遺伝学的に異なるレシピエント細胞に（例えば、真核生物宿主から原核生物レシピエントに）導入する。   Methods to overcome such limitations for successful cloning of donor genomes, modification and / or propagation of donor genomes in host cells, recovery of donor genomes, and successful introduction of donor genomes into recipient cells, It is described in this specification. In one aspect, the donor genome recovered from the host cell is introduced into a genetically different recipient cell (eg, from a eukaryotic host to a prokaryotic recipient).

ドナー核酸配列（例えば、ドナーゲノム）を選択し、合成し、アセンブリし、および/または単離し（例えば、ドナー細胞から）、そして宿主細胞にクローニングする。これらの方法は、一つまたは複数の断片としてドナーゲノムを合成するか、またはドナー細胞からドナーゲノムを得る工程、およびドナーゲノムと宿主ベクターとを異種宿主細胞に導入する工程を含む。ここで、上記宿主細胞への導入の前に上記ドナーゲノムと上記宿主ベクターとを任意で連結し、それにより、上記宿主ベクターを含む上記ドナーゲノムを含む宿主細胞を作製する。さらに、上記ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さである。   A donor nucleic acid sequence (eg, donor genome) is selected, synthesized, assembled, and / or isolated (eg, from a donor cell) and cloned into a host cell. These methods include synthesizing a donor genome as one or more fragments or obtaining a donor genome from a donor cell, and introducing the donor genome and a host vector into a heterologous host cell. Here, the donor genome and the host vector are optionally ligated before introduction into the host cell, thereby producing a host cell containing the donor genome containing the host vector. Furthermore, the donor genome is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least the smallest genome and is greater than about 300 kb in length.

第1の態様は、典型的には、ドナーゲノムを含有している細胞への宿主ベクターの導入、ドナーゲノムの宿主ベクターへの連結、宿主ベクターを含むドナーゲノムの回収、および宿主細胞の形質転換を含む。その結果、宿主ベクターを含むドナーゲノムは、宿主細胞の複製の間、宿主細胞の中で維持される。   The first aspect typically involves introduction of a host vector into cells containing the donor genome, ligation of the donor genome to the host vector, recovery of the donor genome containing the host vector, and transformation of the host cell. including. As a result, the donor genome containing the host vector is maintained in the host cell during host cell replication.

第2の態様においては、宿主ベクターと直線化したドナーゲノムとで宿主細胞を同時形質転換する。この場合、宿主ベクターとドナーゲノムは、宿主細胞の中で相同組換えにより連結される。   In a second embodiment, host cells are co-transformed with a host vector and a linearized donor genome. In this case, the host vector and the donor genome are linked by homologous recombination in the host cell.

第3の態様においては、重複しているDNA断片（天然のものまたは合成のもの）と宿主ベクターとで宿主細胞を同時形質転換する。この場合、宿主ベクターとDNA断片は、宿主細胞の中で相同組換えにより連結される。   In a third embodiment, host cells are co-transformed with overlapping DNA fragments (natural or synthetic) and a host vector. In this case, the host vector and the DNA fragment are ligated by homologous recombination in the host cell.

本発明の方法で使用しようとするドナーゲノムは、本質的に、全細胞ゲノム、全ウイルスゲノム、または細胞小器官の全ゲノムであり得る。   The donor genome to be used in the methods of the invention can be essentially the whole cell genome, the whole virus genome, or the whole genome of an organelle.

ドナーゲノムと宿主ベクターとを、同時に、またはいずれかの順序で連続して宿主細胞に導入することができる。一つの態様においては、宿主ベクターは、ドナーゲノムを含むドナー細胞を宿主ベクターで形質転換することにより、宿主細胞への導入の前に、ドナーゲノムと連結させる。   The donor genome and host vector can be introduced into the host cell simultaneously or sequentially in any order. In one embodiment, the host vector is linked to the donor genome prior to introduction into the host cell by transforming a donor cell containing the donor genome with the host vector.

本発明の態様で使用するための宿主細胞は、真核細胞であってよく、また原核細胞であってもよい。宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞としてはまた、酵母細胞も挙げられる。   A host cell for use in embodiments of the present invention may be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell. Host cells include, but are not limited to, bacterial cells, fungal cells, insect cells, plant cells, or algal cells. Host cells also include yeast cells.

宿主ベクターは、相同組換えに有用なベクターである。本発明の態様で使用するための宿主ベクターは、セントロメアプラスミドであり得る。一つの態様においては、宿主ベクターは酵母セントロメアプラスミドであり、宿主細胞は酵母細胞である。   A host vector is a vector useful for homologous recombination. A host vector for use in embodiments of the invention can be a centromere plasmid. In one embodiment, the host vector is a yeast centromere plasmid and the host cell is a yeast cell.

本発明の態様での使用について企図されるドナーゲノムは、例えば、細菌ゲノム、真菌ゲノム、酵母ゲノム、古細菌ゲノム、シアノバクテリアゲノム、藻類ゲノム、バクテリオファージゲノム、ミトコンドリアゲノム、葉緑体のゲノム、ウイルスゲノム、細胞小器官ゲノム、または合成ゲノムであり得る。   Donor genomes contemplated for use in embodiments of the invention include, for example, bacterial genomes, fungal genomes, yeast genomes, archaeal genomes, cyanobacterial genomes, algal genomes, bacteriophage genomes, mitochondrial genomes, chloroplast genomes, It can be a viral genome, an organelle genome, or a synthetic genome.

別の局面においては、上記方法はさらに、ドナーゲノムを宿主細胞内で改変する工程を含む。   In another aspect, the method further comprises modifying the donor genome in the host cell.

別の局面においては、上記方法はさらに、宿主細胞から宿主ベクターを含むドナーゲノム回収する工程を含む。   In another aspect, the method further comprises recovering the donor genome containing the host vector from the host cell.

別の局面においては、上記方法はさらに、回収したドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程を含む。   In another aspect, the method further comprises the step of introducing the recovered donor genome into a recipient cell.

なお別の局面においては、上記方法はさらに、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するまたは除去する工程を含む。   In yet another aspect, the method further comprises degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell.

任意で、回収したドナーゲノムを、レシピエント細胞への導入の前にメチル化することができる。   Optionally, the recovered donor genome can be methylated prior to introduction into the recipient cell.

任意で、レシピエント細胞の制限エンドヌクレアーゼ機能は、存在しないか、除去されているか、または不活化されている。   Optionally, the restriction endonuclease function of the recipient cell is absent, removed, or inactivated.

本発明の態様での使用について企図されるレシピエント細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞であり得る。   Recipient cells contemplated for use in embodiments of the present invention can be, for example, bacterial cells, yeast cells, fungal cells, insect cells, plant cells, or algal cells.

なお別の局面においては、上記方法はさらに、第2のドナーゲノムを宿主細胞に導入し（ここでは、第2のドナーゲノムは第1のドナーゲノムとは異なる）、それにより、2種類の異なるドナーゲノムを含有している宿主細胞を得る工程を含む。第2のドナーゲノムの導入には、第1のドナーゲノムを含有している宿主細胞と、第2のドナーゲノムを含有している第2の宿主細胞とを接合させることが含まれ得る。回収したドナーゲノムをレシピエント細胞へ導入することにより、レシピエント細胞の表現型を、任意の改変を組み入れているドナーゲノムに対応する表現型へと形質転換することができる。   In yet another aspect, the method further introduces a second donor genome into the host cell (where the second donor genome is different from the first donor genome), thereby two different types Obtaining a host cell containing the donor genome. The introduction of the second donor genome can include mating a host cell containing the first donor genome with a second host cell containing the second donor genome. By introducing the recovered donor genome into a recipient cell, the recipient cell's phenotype can be transformed into a phenotype corresponding to the donor genome incorporating any modification.

本明細書中に記載する方法のいずれかにより産生した、単離した細胞、合成の細胞、または組換え細胞を、本明細書中で提供する。   Isolated, synthetic, or recombinant cells produced by any of the methods described herein are provided herein.

ドナーゲノムによりコードされる表現型を示す細胞を作製するためのプロセスを本明細書中で提供する。上記プロセスは、以下の工程を含む:（a）宿主ベクターを含むドナーゲノムを含有している産物が得られるように、宿主細胞に、ドナーゲノムと、上記宿主細胞中での上記ドナーゲノムのクローニングに適している宿主ベクターとを導入する工程;（b）工程（a）で得た宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物を宿主細胞から回収する工程;（c）（b）の産物を、レシピエント細胞が上記産物によりコードされる表現型を示すようになる条件下で、レシピエント細胞に導入する工程;および（d）工程（c）により得られた細胞を回収する工程。ここでは、ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さであり、かつドナーゲノムは、該ドナーゲノムによりコードされる表現型をレシピエント細胞が示すのに必要な核酸材料の最小限の構成要素を含む。一つの局面においては、上記方法はさらに、宿主細胞中で（a）のドナーゲノムを改変する工程を含む。別の局面においては、上記方法はさらに、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程を含む。なお別の局面においては、上記方法はさらに、宿主細胞中で（a）のドナーゲノムを改変する工程と、レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程とを含む。   Provided herein are processes for generating cells that exhibit the phenotype encoded by the donor genome. The process includes the following steps: (a) cloning a donor genome into the host cell and the donor genome in the host cell so as to obtain a product containing the donor genome comprising the host vector. (B) a step of recovering a product containing a donor genome containing the host vector obtained in step (a) from a host cell; (c) a product of (b) A step of introducing the recipient cell into a recipient cell under conditions such that the ent cell exhibits a phenotype encoded by the product; and (d) a step of recovering the cell obtained by step (c). Here, the donor genome is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least a minimal genome and is longer than about 300 kb, and the donor genome is , Which contains the minimal components of the nucleic acid material necessary for the recipient cell to exhibit the phenotype encoded by the donor genome. In one aspect, the method further comprises modifying (a) the donor genome in a host cell. In another aspect, the method further comprises degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. In yet another aspect, the method further comprises modifying the donor genome of (a) in the host cell and degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell.

ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す細胞を本明細書中で提供する。ここでは、上記細胞は、本明細書中に記載するプロセスにより産生される。   Provided herein are cells that exhibit the desired phenotype that is encoded by the donor genome and otherwise not exhibited by the cells. Here, the cells are produced by the processes described herein.

ドナーゲノムを含む細胞であって、ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す細胞もまた、本明細書中で提供する。ここでは、上記ドナーゲノムは、300kbより大きい外来ゲノムの核酸材料と、所望の表現型を細胞が示すのに必要なゲノムの最小限の構成要素とを含む。   Also provided herein are cells comprising a donor genome that exhibit the desired phenotype encoded by the donor genome and otherwise not exhibited by the cell. Here, the donor genome includes foreign genomic nucleic acid material larger than 300 kb and the minimal components of the genome necessary for the cell to exhibit the desired phenotype.

上記改変方法およびツールは、改変の間の宿主細胞内でのドナー核酸配列の不安定性のリスクを最小限にする局面を含む。第3の態様においては、ドナー核酸配列を、宿主細胞からレシピエント細胞に移植する。レシピエント細胞は、ドナー細胞および宿主細胞とは異なる種および/または異なる生命の分岐のものであり得るか、あるいは、ドナー細胞と同じ種のものであり得る。移植方法は、ドナーゲノム、宿主細胞、およびレシピエント細胞間での不和合性ならびに毒性のリスクを最小限にする局面を含む。   The modification methods and tools include aspects that minimize the risk of donor nucleic acid sequence instability within the host cell during modification. In a third embodiment, the donor nucleic acid sequence is transplanted from the host cell into the recipient cell. The recipient cell can be of a different species and / or a different branch of life from the donor cell and the host cell, or can be of the same species as the donor cell. Transplantation methods include aspects that minimize the risk of incompatibility and toxicity between the donor genome, host cells, and recipient cells.

移入方法、改変方法、および移植方法は別々に行うことができ、また、組み合わせて連続して行うこともできる。したがって、一つの態様においては、ドナーゲノムを宿主細胞に移入し、宿主細胞内で改変し、レシピエント細胞に移植して新しい細胞を作製し、それにより、研究室にも、また自然界にもこれまでは存在しなかったゲノムまたは細胞を作製する方法において、3つの工程を組み合わせることができる。レシピエント細胞を、これまでには存在しなかった非ヒト生物になるように増殖させることができ、また、これまでには存在しなかった非ヒト生物に導入することもできる。したがって、本提供の方法、核酸、およびシステムを、新しい生物を産生するために使用することができる。新しく作製した生物およびその核酸配列もまた提供する。   The transfer method, the modification method, and the transplantation method can be performed separately or in combination. Thus, in one embodiment, the donor genome is transferred into a host cell, modified within the host cell, and transplanted into the recipient cell to create a new cell, thereby creating both a laboratory and nature. The three steps can be combined in a method of making a genome or cell that did not exist before. Recipient cells can be grown to become non-human organisms that have not existed before and can be introduced into non-human organisms that have not previously existed. Thus, the provided methods, nucleic acids, and systems can be used to produce new organisms. Also provided are newly created organisms and their nucleic acid sequences.

本提供の方法および組成物は、遺伝学的に扱いにくい生物由来のゲノムを操作および変更するために特に有用である。一つの例においては、上記方法、核酸配列、およびシステムは、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、およびマイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）LC由来の細菌の全ゲノムを、酵母の中で環状のセントロメアプラスミドとしてクローニングするために、不和合性を最小にする改変を有している酵母の遺伝子システムを使用して酵母の中でドナーゲノムを改変するために、およびさらに、改変した細菌のゲノムを、異なる種のレシピエント細胞に移植し、それにより、研究室にも、また自然界にもこれまでは存在していなかったゲノムおよび生物を作製するために、使用する。   The provided methods and compositions are particularly useful for manipulating and modifying genomes from genetically tractable organisms. In one example, the methods, nucleic acid sequences, and systems described above circularize the entire genome of bacteria from Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, and Mycoplasma mycoides LC in yeast. To modify the donor genome in yeast using a yeast genetic system having a modification that minimizes incompatibility, and further to clone as a centromere plasmid of Are transplanted into different species of recipient cells, thereby creating genomes and organisms that have never existed in the laboratory or in nature.

本提供の方法、核酸配列、システム、および生物は、バイオ燃料を合成するように生物を変更するために使用することができる。例えば、細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli））を遺伝学的に改変することができるが、産業的に有用な化合物を産生するか、または厳しい環境で機能する可能性を有している多くの原核生物は、極めて乏しい遺伝子システムを持つか、または遺伝子システムが存在しない。中でも、プロクロロコッカス・マリヌス（Prochlorococcus marinus）は、地球上に最も豊富に存在する光合成生物である。バイオ燃料を産生するようにこの生物および他のそのような生物を操作および変更することが望ましいが、そのような生物を操作および変更する能力は、それらを遺伝学的に変化させるために利用できる方法がないことにより限定される。本提供の方法を、そのような操作を実行するために使用することができる。例えば、一つの態様においては、新しい代謝経路の成分をコードする核酸配列を、宿主細胞への導入およびその中での改変により、そのような生物のゲノムに導入することができる。そのように再度変更したゲノムを、新しい細胞（例えば、太陽光と二酸化炭素をバイオ燃料に転換することができる新しい細胞）を得るために、適切なレシピエント細胞に移植することができる。そのように変更した細胞および生物もまた、本明細書中で提供する。   The provided methods, nucleic acid sequences, systems, and organisms can be used to modify an organism to synthesize biofuel. For example, many bacteria (eg, Escherichia coli) can be genetically modified, but produce industrially useful compounds or have the potential to function in harsh environments Prokaryotes have a very poor genetic system or no genetic system. Among them, Prochlorococcus marinus is the most abundant photosynthetic organism on the earth. Although it is desirable to manipulate and modify this organism and other such organisms to produce biofuels, the ability to manipulate and modify such organisms can be used to genetically change them Limited by lack of method. The provided method can be used to perform such operations. For example, in one embodiment, a nucleic acid sequence encoding a component of a new metabolic pathway can be introduced into the genome of such an organism by introduction into a host cell and modification therein. Such re-modified genomes can be transplanted into appropriate recipient cells to obtain new cells (eg, new cells capable of converting sunlight and carbon dioxide into biofuel). Such modified cells and organisms are also provided herein.

本提供の方法はまた、古細菌の変更、真核生物への新しい細胞小器官のクローニング、ならびに、細胞および生物への染色体の付加にも有用であり得る。例えば、真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体は、それらの宿主の中に捕捉された内共生細菌の名残である。本提供の方法は、相同組換えを使用して、宿主の中でそのような細胞小器官のゲノムを変更するために（例えば、プラスミドを使用して酵母中で）使用することができ、それにより、例えば、酵母または藻類の中で、エネルギー生産効率および/または代謝が改善された新しいミトコンドリアおよび葉緑体のゲノムを作製することができる。   The provided methods can also be useful for altering archaea, cloning new organelles into eukaryotes, and adding chromosomes to cells and organisms. For example, eukaryotic mitochondria and chloroplasts are the remnants of endosymbiotic bacteria trapped in their hosts. The provided methods can be used to modify the genome of such organelles in a host using homologous recombination (eg, in yeast using a plasmid), which Thus, for example, new mitochondrial and chloroplast genomes with improved energy production efficiency and / or metabolism can be generated in yeast or algae.

別の態様においては、本提供の方法は、ウイルス（例えば、単純なプラスミドの中での操作には大きすぎる大きなゲノムを持つもの）を、治療上の用途を有しているウイルスおよびバクテリオファージが得られるように操作するために使用することができる。一つの局面においては、ウイルスゲノムをクローニングし、操作して、それらの免疫原性および他の治療上の利点を改善する。   In another aspect, the methods provided provide for the use of viruses (eg, those with large genomes that are too large for manipulation in simple plasmids), for viruses and bacteriophages that have therapeutic uses. Can be used to manipulate as obtained. In one aspect, viral genomes are cloned and manipulated to improve their immunogenicity and other therapeutic benefits.

別の態様においては、本提供の方法は、例えば、ワイン、パン、ビール、および医薬剤の産生に有用な真菌が得られるように、真菌を操作するために使用することができる。一つの局面においては、真菌のゲノムを、それらの温度に対する耐性、病原生物、および他の利点を改善するように、クローニングし、操作する。別の態様においては、本提供の方法は、エタノール燃料、栄養補助剤、プロバイオティックに有用な酵母、飲料（アルコール飲料および非アルコール飲料）の産生のためのまたはパン焼きにおける使用のための醗酵に有用な酵母が得られるように、酵母を操作するために使用することができる。   In another aspect, the provided methods can be used to manipulate fungi, for example, to obtain fungi useful for the production of wine, bread, beer, and pharmaceutical agents. In one aspect, fungal genomes are cloned and manipulated to improve their resistance to temperature, pathogenic organisms, and other benefits. In another aspect, the provided methods can be used for fermentation for the production of ethanol fuel, nutritional supplements, yeast useful for probiotics, beverages (alcoholic and non-alcoholic beverages) or for use in baking. It can be used to manipulate yeast so that useful yeast is obtained.

特定の態様を本明細書中に提供するが、本発明の方法およびプロセスは、対象となる任意の所望の表現型または産物を得るために使用することができる普遍的なツールである。   Although certain aspects are provided herein, the methods and processes of the present invention are universal tools that can be used to obtain any desired phenotype or product of interest.

本発明の方法およびプロセスは、自動化しやすく、また、ハイスループット法にも適応しやすく、例えば、ヒトの介入が必要ないコンピューターに媒介される方法および/またはロボットによる方法により、多数の核酸分子を連結し、宿主またはレシピエント細胞を同時に形質転換することができる。   The methods and processes of the present invention are easy to automate and are amenable to high-throughput methods, e.g., large numbers of nucleic acid molecules can be obtained by computer-mediated methods and / or robotic methods that do not require human intervention. Ligate and transform host or recipient cells simultaneously.

したがって、本発明は、ゲノムを含む核酸分子の、ハイスループット様式での効率的かつ広範囲に及ぶアセンブリ、クローニング、改変、および形質転換を可能にし、ロボットによる実行に容易に適応することができる、体系的方法とその産物に関する。別の態様においては、核酸のアセンブリ反応を、マイクロ流体工学を使用した反応チューブの中で（例えば、チップ上で）の反応に対抗するものとして、固体上表面で行うことができる。   Thus, the present invention allows for efficient and extensive assembly, cloning, modification, and transformation of nucleic acid molecules, including genomes, in a high-throughput manner, and can be easily adapted for robotic execution. The method and its products. In another embodiment, the nucleic acid assembly reaction can be performed on a solid top surface as opposed to the reaction (eg, on a chip) in a reaction tube using microfluidics.

C.ドナーゲノムおよび核酸の選択および単離
本提供の方法の最初の工程において、ドナーゲノムまたは他の核酸配列を、移入、改変、および/または移植のために選択する。本明細書中に記載する方法により移入する、改変する、移植する、そして作製する核酸配列は、任意の天然または合成の生物のものであり得る。したがって、ドナーゲノムは、任意の所望の細胞、またはその任意の核酸を含むサブユニットからの、単離または化学合成のいずれかに由来する。例えば、核酸配列としては、ゲノム（例えば、全ゲノム、全ゲノムの一部分（例えば、少なくとも最小ゲノムおよび/または少なくとも最小の複製性ゲノム、細胞ゲノム、細胞小器官ゲノム、およびウイルスゲノム））、染色体、および既知の生物および新しい生物由来の他の大きな核酸配列が挙げられる。ゲノムを含む核酸配列は、生物の中にある任意の供給源のものであり得、これには、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノム）、染色体、植物および動物、藻類である供給源のゲノムまたは染色体の一部分、ならびに、細胞の生存能力をサポートする任意の遺伝学的材料（細菌および他の原核生物および真核生物の全細胞ゲノムならびに最小の細胞ゲノムを含む）が含まれる。 C. Selection and Isolation of Donor Genome and Nucleic Acid In the first step of the provided method, the donor genome or other nucleic acid sequence is selected for transfer, modification and / or transplantation. The nucleic acid sequence that is transferred, modified, transplanted and generated by the methods described herein can be of any natural or synthetic organism. Thus, the donor genome is derived either from isolation or chemical synthesis from any desired cell or subunit containing any nucleic acid thereof. For example, nucleic acid sequences include genomes (e.g., whole genome, part of whole genome (e.g., at least minimal genome and / or at least minimal replicating genome, cellular genome, organelle genome, and viral genome)), chromosome, And other large nucleic acid sequences from known and new organisms. Nucleic acid sequences, including genomes, can be of any source in an organism, including organelle genomes (eg, mitochondrial and chloroplast genomes), chromosomes, plants and animals, algae Includes a source's genome or part of a chromosome, and any genetic material that supports cell viability, including whole and minimal cell genomes of bacteria and other prokaryotes and eukaryotes It is.

以下の実施例の概要と、本明細書中に提供する考察から、本記載の方法の適用性が、自然界に存在しているものを模倣する合成のゲノムを構築することに限定されないことが明らかである。上記方法は、例えば、自然界にも、また研究室にもこれまでは存在していなかった新しいゲノムおよび生物を作製するために、同じDNA分子において様々な生物のゲノムの部分を連結するために使用することができる。ドナーゲノムおよび他の核酸をクローニングし、増殖させ、および/または細胞（例えば、細胞または組織（遺伝学的に変更された生物を含む））から単離することができるか、あるいは、インビトロで化学合成することができる。核酸およびゲノムを単離し、調製するための方法を以下に記載する。   From the summary of the following examples and the considerations provided herein, it is clear that the applicability of the described method is not limited to constructing a synthetic genome that mimics what exists in nature. It is. The above method can be used, for example, to join parts of the genomes of different organisms in the same DNA molecule to create new genomes and organisms that have never existed in nature or in the laboratory. can do. The donor genome and other nucleic acids can be cloned, propagated, and / or isolated from cells (eg, cells or tissues, including genetically modified organisms), or chemistry in vitro Can be synthesized. Methods for isolating and preparing nucleic acids and genomes are described below.

i.ドナー生物、ゲノム、および他の核酸
本提供の方法で使用し、作製するゲノムおよび他の核酸配列（例えば、ドナー核酸）としては、真菌、酵母、細菌、他の原核生物、および藻類に由来するものが挙げられるが、そのような生物に限定されない。これらは、任意の生物の、天然のものであっても、合成のものであってもよい。例えば、原生生物界、古細菌界、真正細菌界、真菌界、植物界、および動物界の生物、ならびに、バクテリオファージを含むウイルスのものであり得る。 i. Donor organisms, genomes, and other nucleic acids Genomic and other nucleic acid sequences (eg, donor nucleic acids) used and generated in the methods provided herein include fungi, yeast, bacteria, other prokaryotes, and algae. Although what originates is mentioned, it is not limited to such an organism. These may be natural or synthetic of any organism. For example, it can be from organisms of the protozoan, archaea, eubacteria, fungi, plant and animal kingdoms, and viruses including bacteriophages.

例示的な核酸配列は、細菌、古細菌、シアノバクテリア（例えば、プロクロロコッカス・マリヌス、シネコシスティスPCC6803など）、藻類、ウイルス（例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼのゲノム）、真菌（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロミセス・ボウラディ（Saccharomyces boulardii）、アカパンカビ（Neurospora crassa）など）、およびバクテリオファージ由来の核酸配列である。例示的なマイコプラズマ株としては、以下が挙げられる:マイコプラズマ・ゲニタリウム（例えば、実施例1に記載するM.ゲニタリウムMS5株、M.ゲニタリウムG37（GenBank No.L43967））、マイコプラズマ・ミコイデス（例えば、M.ミコイデス亜種ミコイデスラージコロニー（LC）GM12株（実施例1）、マイコプラズマ・カプリコルム（Mycoplasma capricolum）亜種カプリコルム（California Kid（商標）株）（ATCC 27343）、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス（GM12株）（Damassa et al., 1983）、マイコプラズマ・カプリコルム亜種カプリコルム（M.カプリコルム（M.capricolum））（例えば、野生型M.カプリコルムおよびM.カプリコルム突然変異体（M.カプリコルム-ΔRE）、およびマイコプラズマ・ニューモニエ（例えば、M.ニューモニエM129-B170株（ATCC 29343）;M.ニューモニエM129, GenBankアクセッション番号U00089.2（GI:26117688））、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）（ATCC 15302）、マイコプラズマ・ニューモニエEaton（ATCC15531）、ならびにそれらの派生物。   Exemplary nucleic acid sequences include bacteria, archaea, cyanobacteria (eg, Prochlorococcus marinus, Synechocystis PCC6803, etc.), algae, viruses (eg, the genome of Haemophilus influenzae), fungi (eg, Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae), Saccharomyces bayanus, Saccharomyces boulardii, Neurospora crassa and the like, and bacteriophage nucleic acid sequences. Exemplary mycoplasma strains include: Mycoplasma genitalium (eg, M. genitalium MS5 strain, M. genitalium G37 (GenBank No. L43967) described in Example 1), Mycoplasma mycoides (eg, M Mycoides subspecies Mycoides large colony (LC) GM12 strain (Example 1), Mycoplasma capricolum subspecies Capricolum (California Kid ™ strain) (ATCC 27343), Mycoplasma mycoides subspecies Mycoides (GM12) Strain (Damassa et al., 1983), Mycoplasma capricolum subsp. Capricolum (for example, wild type M. capricolum and M. capricolum mutant (M. capricolum-ΔRE), And Mycoplasma pneumoniae (for example, M. pneumoniae M129-B170 strain (ATCC 29343); M. pneumoniae) M129, GenBank accession number U00089.2 (GI: 26117688)), Mycoplasma gallisepticum (Mycoplasma gallisepticum) (ATCC 15302), Mycoplasma pneumoniae Eaton (ATCC15531), and derivatives thereof.

例示的なゲノムおよび核酸としては、そのゲノム配列を公に入手することができ、本開示の方法とともに使用することができる多数の生物の全ゲノムおよび部分的なゲノムが挙げられる。例えば、以下の生物の核酸であるが、これらに限定されるわけではない:アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）;アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）;アナベナ（Anabaena）;ガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）;ミツバチ（Apis mellifera）;アクイフェクス・エオリクス（Aquifex aeolicus）;シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）;アルカエオグロブス・フルギドゥス（Archaeoglobus fulgidus）;アシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossypii）;炭疽菌（Bacillus anthracis）;セレウス菌（Bacillus cereus）;バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）;バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）;枯草菌（Bacillus subtilis）;バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）;バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）;バルトネラ・ヘンセラ（Bartonella henselae）;バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）;ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス（Bdellovibrio bacteriovorus）;ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）;ブロヒマニア・フロリダヌス（Blochmannia floridanus）;ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）;ボルデテラ・パラペルツッシス（Bordetella parapertussis）;ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）;ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）;ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）;マルタ熱菌（Brucella melitensis）;ブルセラ・スイス（Brucella suis）;ブフネラ・ アフィディコラ（Buchnera aphidicola）;バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）;バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）;ブリグサ線虫（Caenorhabditis briggsae）;線虫（Caenorhabditis elegans）;カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）;カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）;イエイヌ（Canis familiaris）;カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）;クラミジア・ムリダルム（Chlamydia muridarum）;クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）;クラミドフィラ・カビアエ（Chlamydophila caviae）;クラミドフィラ・ニューモニエ（Chlamydophila pneumoniae）;クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）;クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）;ユウレイボヤ（Ciona intestinalis）;クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）;ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）;破傷風菌（Clostridium tetani）;ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）;コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）;コクシエラ・バーネッティイ（Coxiella burnetii）;クリプトスポリジウム・ホミニス（Cryptosporidium hominis）;クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）;シアニディオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）;デバリオミセス・ ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）;デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）;デスルホタレア・サイクロフィラ（Desulfotalea psychrophila）;デスルホビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）;キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）;エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）;エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）;エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）;大腸菌（Escherichia coli）;フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）;ニワトリ（Gallus gallus）;ゲオバクター・スルフレデュセンス（Geobacter sulfurreducens）;グロエオバクター・ビオラセウス（Gloeobacter violaceus）;ギラルディア・テータ（Guillardia theta）;ヘモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）;ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）;ハロバクテリウム（Halobacterium）;ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）;ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）;ヒト（Homo sapiens）;クリヴェロミセス・ワルチ（Kluyveromyces waltii）;ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）;ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）;レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）;レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）;ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）;レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）;リステリア・イノキュア（Listeria innocua）;リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）;マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）;マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens）;メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）;メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）;メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）;メタノコッコイデス・ブルトニ（Methanococcoides burtonii）;メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）;メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）;メタノゲニウム・フリギダム（Methanogenium frigidum）;メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）;メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）;メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）;メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）;マウス（Mus musculus）;ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）;ライ菌（Mycobacterium leprae）;パラ結核菌（Mycobacterium paratuberculosis）;ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）;マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）;マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）;マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）;マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）;マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）;マイコプラズマ・プルモニス（Mycoplasma pulmonis）;マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）;ナノアルカエウム・エクゥィタンス（Nanoarchaeum equitans）;髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）;アカパンカビ（Neurospora crassa）;ニトロソモナス・ユウロペア（Nitrosomonas europaea）;ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）;オセアノバチルス・イヘイエンシス（Oceanobacillus iheyensis）;タマネギ萎黄病ファイトプラズマ（Onions yellows phytoplasma）;イネ（Oryza sativa）;チンパンジー（Pan troglodytes）;パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）;ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）;フォトラブダス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens）;ピクロフィルス・トリダス（Picrophilus torridus）;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）;プラスモディウム・ヨエリ・ヨエリ（Plasmodium yoelii yoelii）;ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）;ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）;プロクロロコッカス・マリヌス（Prochlorococcus marinus）;プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）;プロトクラミジア・アモエボフィリア（Protochlamydia amoebophila）;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）;シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）;シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）;ピロバキュラム・アエロフィラム（Pyrobaculum aerophilum）;パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）;パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）;パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）;ピロロブス・フマリイ（Pyrolobus fumarii）;ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）;ラット（Rattus norvegicus）;ロドピレルーラ・バルティカ（Rhodopirellula baltica）;ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）;リケッチア・コノリイ（Rickettsia conorii）;リケッチア・チフィ（Rickettsia typhi）;リケッチア・プロワツェキイ（Rickettsia prowazekii）;リケッチア・シビリカ（Rickettsia sibirica）;サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）;サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）;サッカロミセス・ボウラディ（Saccharomyces boulardii）;サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）;サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）;サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）;シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）;シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）;シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneria）;シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）;黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）;表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）;ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）;ミュータンス連鎖球菌（Streptococcus mutans）;肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）;化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）;ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）;ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）;ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）;スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）;スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）;シネココッカス（Synechococcus）;シネコシスティス（Synechocystis）;トラフグ（Takifugu rubripes）;ミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）;タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）;サーモアネロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）;サーモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）;サーモプラズマ・ウォルカニウム（Thermoplasma volcanium）;サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）;サーモトガ・マリティマ（Thermotagoa maritima）;サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）;トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）;トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）;トロフェリマ・ウィッペリ（Tropheryma whipplei）;ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）;コレラ菌（Vibrio cholerae）;腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）;ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）;ウィグレスウォルシア・グロッシニディア（Wigglesworthia glossinidia）;ボルバキア・ピピエンティス（Wolbachia pipientis）;ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）;ザントモナス・アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）;ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）;キシレラ・ファスティディオーサ（Xylella fastidiosa）;ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）;エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）;およびエルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）の核酸。   Exemplary genomes and nucleic acids include whole and partial genomes of numerous organisms whose genomic sequences are publicly available and can be used with the methods of the present disclosure. For example, but not limited to nucleic acids from the following organisms: Aeropyrum pernix; Agrobacterium tumefaciens; Anabaena; Anopheles gambiae; Bees (Apis mellifera); Aquifex aeolicus; Arabidopsis thaliana; Archaeoglobus fulgidus; Ashbya gossisis cil Bacillus halodurans; Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis; Bacteroides fragilis; Bacteroides thetaiotaomicron; Bartonella henselae; Bartonella quintana; Bdellovibrio bacteriovorus; Bifidobacterium longum; Blochmannia floridanus et ella Bornetella parapertussis; Bordetella pertussis; Borrelia burgdorferi; Bradyrhizobium japonicum; Bratyrhizobium japonicum; Switzerland (Brucella suis); Buchnera aphidicola; Burkholderia mallei; Burkholderia pseudomallei; Caenorhabditis briggsae; Caenorhabditis elegans; Campylobacter jejuni; Candida glabrata; Canis familiaris; Caulobacter crescenty; dia・ Chlamydia trachomatis; Chlamydophila caviae; Chlamydophila pneumoniae; Chlorobium tepidum; Chromobacterium violaceinalis (Clostridium acetobutylicum); Clostridium perfringens; Clostridium tetani; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficien (Corynebacterium efficiens); Coxiella burnetii; Cryptosporidium hominis; Cryptosporidium parvum; Cyanidioschyzon merolaes; Deinococcus radiodurans; Desulfotalea psychrophila; Desulfovibrio vulgaris; Drosophila melanogaster; Encephalitonic ito zozo Enterococcus faecalis); Erwinia carotovora; Escherichia coli; Fusobacterium nucleatum; Bird (Gallus gallus); Geobacter sulfurreducens; Gloeobacter violaceus; Guillardia theta; Haemophilus ducreyi; Haemophilus emophile influenza Halobacterium; Helicobacter hepaticus; Helicobacter pylori; Homo sapiens; Kluyveromyces waltii; Lactobacillus johnsonii;・ Lactobacillus plantarum; Legionella pneumophila; Leifsonia xyli; Lactococcus lactis; Leptospira interrogans Leptospira interrogans); Listeria innocua; Listeria monocytogenes; Magnaporthe grisea; Mannheimia succiniciproducens; Mesoplasma florum (Mesoplasma florum) Mesorhizobium loti; Methanobacterium thermoautotrophicum; Methanococcoides burtonii; Methanococcus jannaschii; Methanococcus jannaschii;・ Methanogenium frigidum; Methanopyrus kandleri; Methanosarcina acetivorans; Methanosarcina acetivorans; Met hanosarcina mazei); Methylococcus capsulatus; Mouse (Mus musculus); Mycobacterium bovis; Mycobacterium leprae; Mycobacterium paratuberculosis; Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma genitalium; Mycoplasma mycoides; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma pneumoniais pulmonum;・ Mycoplasma mobile; Nanoarchaeum equitans; Neisseria meningitidis; Neurospora crassa; Nitrosomonas europa ea); Nocardia farcinica; Oceanobacillus iheyensis; Onions yellows phytoplasma; Rice (Oryza sativa); Chimpanzee (Pan troglodyur); ; Phanerochaete chrysosporium; Photorhabdus luminescens; Picrophilus torridus; Plasmodium falciparum; Plasmodium foliciparum; Plasmodium yoelii i Black cotton wood (Populus trichocarpa); Porphyromonas gingivalis; Prochlorococcus marinus; Propionibacterium acnes; Proto Protochlamydia amoebophila; Pseudomonas aeruginosa; Pseudomonas putida; Pseudomonas syringae; Pyrobaculum ac Pyrococcus furiosus; Pyrococcus horikoshii; Pyrolobus fumarii; Ralstonia solanacearum; Rottus norveellus; Rhodopseudomonas palustris; Rickettsia conorii; Rickettsia typhi; Rickettsia prowazekii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia sibirica; Saccharomyces cerevisiae; Saccharomyces bayanus; Saccharomyces boulardii; Saccharomyces boulardii; Saccharomyces boulardii; Saccharomyces boulardii;・ Salmonella typhimurium; Schizosaccharomyces pombe; Shewanella oneidensis; Shigella flexneria; Siloticus aureus Staphylococcus epidermidis; Streptococcus agalactiae; Streptococcus mutans; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Streptococcus thermophilus; Streptomyces avermitilis; Streptomyces coelicolor; (Sulfolobus tokodaii); Synechococcus; Synechocystis; Takifugu rubripes; Tetraodon nigroviridis; Thalassiosira pseudonana; Thalassiosira pseudonana;・ Acid film (Thermoplasma acidophilum); Thermoplasma volcanium (Thermosynechococcus elongatus); Thermotagoa maritima; Thermus thermophilus; Treponema denticola; Treponema pallidum; Tropheryma whipplei; Ureaplasmum rea Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnificus; Wigglesworthia glossinidia; Wolbachia pipientis; Wolbachia pipientis; Xanthomonas axonopodis; Xanthomonas campestris; Xylella fastidiosa; Yarrowia lipolytica (Ya) rrowia lipolytica); Yersinia pseudotuberculosis; and Yersinia pestis nucleic acids.

用語「藻類」としては、シアノバクテリア（ラン藻綱（Cyanophyceae））、緑色の藻類（緑藻綱（Chlorophyceae））、黄緑色の藻類（黄緑藻綱（Xanthophyceae））、金色の藻類（黄金色藻綱（Chrysophyceae））、茶色の藻類（褐藻綱（Phaeophyceae））、赤色の藻類（紅藻綱（Rhodophyceae））、珪藻類（珪藻綱（Bacillariophyceae））、ならびに「ピコプランクトン」（プラシノ藻綱（Prasinophyceae）および真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae））が挙げられる。用語藻類にはまた、渦鞭毛藻綱（Dinophyceae）、クリプト藻綱（Cryptophyceae）、ユーグレナ藻綱（Euglenophyceae）、灰色藻綱（Glaucophyceae）、およびプリムネシウム藻綱（Prymnesiophyceae）の分類学上のクラスのメンバーも含まれる。微細藻類は、顕微鏡を用いた時のみ単一の生物として観察することができる、単細胞の藻類またはコロニー状の藻類である。微細藻類には、真核生物および原核生物の両方の藻類（例えば、シアノバクテリア）が含まれる。光合成細菌としては、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、および緑色非硫黄細菌が挙げられる。   The term "algae" includes cyanobacteria (Cyanophyceae), green algae (Chlorophyceae), yellow-green algae (Xanthophyceae), golden algae (golden algae) (Chrysophyceae)), brown algae (Phaeophyceae), red algae (Rhodophyceae), diatoms (Bacillariophyceae), and "Picoplankton" (Prasinophyceae) And Eustigmatophyceae). The term algae also includes taxonomic classes of Dinophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Glaucophyceae, and Prymnesiophyceae. Members are also included. Microalgae are unicellular or colony algae that can be observed as a single organism only when using a microscope. Microalgae include both eukaryotic and prokaryotic algae (eg, cyanobacteria). Photosynthetic bacteria include cyanobacteria, green sulfur bacteria, red sulfur bacteria, red non-sulfur bacteria, and green non-sulfur bacteria.

例示的なゲノムおよび核酸としては、そのゲノム配列を公に入手することができ、本開示の方法とともに使用することができる、多数の藻類生物の全ゲノムまたは部分的なゲノムが挙げられる。例えば、以下の種が挙げられるが、これらに限定されるわけではない:アクナンテス（Achnanthes）、アンフィプロラ（Amphiprora）、アンフォラ（Amphora）、アンキストロデスムス（Ankistrodesmus）、アルテロモナス（Asteromonas）、ボエケロヴィア（Boekelovia）、ボロディネラ（Borodinella）、ボトリオコッカス（Botryococcus）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、キートケロス（Chaetoceros）、カルテリア（Carteria）、クラミドモナス（Chlamydomonas）、クロロコックム（Chlorococcum）、クロロゴニウム（Chlorogonium）、クロレラ（Chlorella）、 クロオモナス（Chroomonas）、クリソスファエラ（Chrysosphaera）、クロコスファエラ（Cricosphaera）、クリプテコディニウム（Crypthecodinium）、クリプトモナス（Cryptomonas）、キクロテラ（Cyclotella）、ドナリエラ（Dunaliella）、エリプソイドン（Ellipsoidon）、エミリアニア（Emiliania）、エレモスフェラ（Eremosphaera）、エルノデスミウス（Ernodesmius）、ユーグレナ（Euglena）、フランケイア（Franceia）、フラギラリア（Fragilaria）、グロエオサムニオン（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス（Haematococcus）、ハロカフェテリア（Halocafeteria）、ヒメノモナス（Hymenomonas）、イソクリシス（Isochrysis）、レポキンクリス（Lepocinclis）、ミクラクティニウム（Micractinium）、モノラフィディウム（Monoraphidium）、ナンノクロリス（Nannochloris）、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）、ナヴィクラ（Navicula）、ネオクロリス（Neochloris）、ネフロクロリス（Nephrochloris）、ネフロセルミス（Nephroselmis）、ニッチア（Nitzschia）、オクロモナス（Ochromonas）、オエドゴニウム（Oedogonium）、 オオキスティス（Oocystis）、オストレオコッカス（Ostreococcus）、パブロバ（Pavlova）、パラクロレラ（Parachlorella）、パスケリア（Pascheria）、ファエオダクチラム（Phaeodactylum）、ファガス（Phagus）、プラチモナス（Platymonas）、プレウロクリシス（Pleurochrysis）、プレウロコッカス（Pleurococcus）、プロトテカ（Prototheca）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ピラミモナス（Pyramimonas）、ピロボツリス（Pyrobotrys）、セネデスムス（Scenedesmus）、シゾキトリウム（Schizochytrium）、スケレトネマ（Skeletonema）、スピロギラ（Spyrogyra）、スティココッカス（Stichococcus）、テトラセルミス（Tetraselmis）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）、タラシオシラ（Thalassiosira）、ビリジエラ（Viridiella）、またはボルボックス（Volvox）。いくつかの態様においては、例えば、緑色硫黄細菌、紅色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、またはシアノバクテリアを含む光合成細菌を使用することができる。使用することができるシアノバクテリア種としては、以下の種が挙げられるが、これらに限定されるわけではない:アグメネルム（Agmenellum）、アナベナ（Anabaena）、アナベノプシス（Anabaenopsis）、アナシスティス（Anacystis）、アファニゾメノン（Aphanizomenon）、アルスロスピラ（Arthrospira）、アステロカプサ（Asterocapsa）、ボルジア（Borzia）、カロスリックス（Calothrix）、カマエシフォン（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス（Chlorogloeopsis）、クロオコッキディオプシス（Chroococcidiopsis）、クロオコッカス（Chroococcus）、クリナリウム（Crinalium）、シアノバクテリウム（Cyanobacterium）、シアノビウム（Cyanobium）、シアノシスティス（Cyanocystis）、シアノスピラ（Cyanospira）、シアノセイス（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルムム（Cylindrospermum）、ダクティロコッコプシス（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ（Dermocarpella）、フィッシェレラ（Fischerella）、フレミエラ（Fremyella）、ゲイトレリア（Geitleria）、ゲイトレリネマ（Geitlerinema）、グロエオバクター（Gloeobacter）、グロエオカプサ（Gloeocapsa）、グロエオセイス（Gloeothece）、ハロスピルリナ（Halospirulina）、エンガリエーラ（Iyengariella）、レプトリングビア（Leptolyngbya）、リムノスリックス（Limnothrix）、リングビア（Lyngbya）、ミクロコレアス（Microcoleus）、ミクロシスティス（Microcystis）、ミクソサルシナ（Myxosarcina）、ノドゥラリア（Nodularia）、ネンジュモ（Nostoc）、ノストコプシス（Nostochopsis）、ユレモ（Oscillatoria）、フォルミジウム（Phormidium）、プランクトスリックス（Planktothrix）、プレウロカプサ（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス（Prochlorococcus）、プロクロロン（Prochloron）、プロクロロスリックス（Prochlorothrix）、シュードアナベナ（Pseudanabaena）、リブラリア（Rivularia）、シゾスリックス（Schizothrix）、スキトネマ（Scytonema）、スピルリナ（Spirulina）、スタニエリア（Stanieria）、スタリア（Starria）、スティゴネマ（Stigonema）、シンプロカ（Symploca）、シネココッカス（Synechococcus）、シネコシスティス（Synechocystis）、トリポスリックス（Tolypothrix）、トリコデスミウム（Trichodesmium）、チコネマ（Tychonema）、またはゼノコッカス（Xenococcus）の種。   Exemplary genomes and nucleic acids include whole or partial genomes of a number of algal organisms whose genomic sequences are publicly available and can be used with the methods of the present disclosure. Examples include, but are not limited to, the following species: Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Alteromonas, Boekelovia ), Borodinella, Botryococcus, Bracteococcus, Keetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorogonium, Chlorogonium, Chlorogonium Chromonas, Chrysosphaera, Crocosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipso Don (Ellipsoidon), Emiliania (Emiliania), Eremosphaera (Eremosphaera), Ernodesmius (Ernodesmius), Euglena (France), Fragiaria (Fragilaria), Gloeothamnion (Gloeothamnion), Hematococcus (ae) (Halocafeteria), Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, NannochloropsisNa ), Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis, Oocystis Streococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Phaeodactylum, Phagus, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurochrysis, Pleurochrysis Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizothytrium, octopus, octopus Tetraselmis, Thraustochytrium, Thalassiosira, Viridiella, or Volvox. In some embodiments, photosynthetic bacteria can be used, including, for example, green sulfur bacteria, red sulfur bacteria, green non-sulfur bacteria, red non-sulfur bacteria, or cyanobacteria. Cyanobacterial species that can be used include, but are not limited to, the following species: Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Afanizomenon ( Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcidiopsis , Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Lindylospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitblerio, loe G , Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Microcystis Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Preuro Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Livularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina ), Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Trichodesmium, Ticonema ), Or Xenococcus species.

ゲノムおよび他の核酸配列としては、そのようなゲノムに由来する、改変した核酸配列、および合成の核酸配列が挙げられる。本明細書中に記載する方法は、これらを利用できる限りは、高等植物（例えば、トウモロコシおよびイネ）、哺乳動物（例えば、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギなど）、ブタ、ウシ、雄牛、ウマ、霊長類、ヒツジ、およびペット（例えば、イヌ、ネコなど）などの多細胞生物の特徴である核酸配列を含む、まだ公開されていない核酸配列にも同様に適応する。一つの態様においては、ヒトから単離した細胞を、ドナーゲノムを得るために使用することができる。これらの多くを現在利用することができる。核酸配列およびゲノムには、自然界に存在しているものを模倣しないものが含まれる。   Genome and other nucleic acid sequences include modified and synthetic nucleic acid sequences derived from such genomes. The methods described herein are, as long as they are available, higher plants (eg, corn and rice), mammals (eg, rodents (mouse, rats, rabbits, etc.), pigs, cows, bulls. The same applies to nucleic acid sequences that have not yet been published, including nucleic acid sequences that are characteristic of multicellular organisms such as horses, primates, sheep, and pets (eg, dogs, cats, etc.). Can be used to obtain donor genomes, many of which are currently available, nucleic acid sequences and genomes do not mimic what exists in nature Things are included.

一つの態様においては、上記方法による操作のために選択したゲノムおよび他の核酸配列は、扱いにくい生物、または乏しい遺伝子システムもしくは宿主生物のものよりも望ましくない遺伝子システムを持つ他の生物に由来する。そのような生物としては、特定の原核生物および他の酵母以外の生物（ダブル・クロスオーバー（double crossover）相同組換えおよびトランスポゾン突然変異誘発のような一般的な遺伝学的技術が有効ではないもの）が挙げられる。これらの技術は、例えば、特定の細菌生物（例えば、マイコプラズマ種）においては有効ではない。M.ミコイデスLCの中での遺伝子の標的化した付加および破壊のために、1回のクロスオーバー事象によるプラスミドDNAの組込みが行われている（Janis, C, et al.2005, Appl Environ Microbiol 71:2888-93）が、この生物は選択マーカーを少数しか含まず、一つのM.ミコイデスLC細胞の中で行うことができる遺伝学的改変の数は限られている。   In one embodiment, the genome and other nucleic acid sequences selected for manipulation by the above method are derived from difficult organisms or other organisms that have a genetic system that is less desirable than that of a poor or host organism. . Such organisms include certain prokaryotes and other non-yeast organisms (for which common genetic techniques such as double crossover homologous recombination and transposon mutagenesis are not effective) ). These techniques are not effective, for example, in certain bacterial organisms (eg, mycoplasma species). For targeted addition and disruption of genes in M. mycoides LC, plasmid DNA integration has occurred through a single crossover event (Janis, C, et al. 2005, Appl Environ Microbiol 71 : 2888-93), but this organism contains only a few selectable markers, and the number of genetic modifications that can be made in a single M. mycoides LC cell is limited.

産業上有用な化合物を産生する能力および/または厳しい環境（例えば、高温、高圧など）で機能する能力を有している、乏しい遺伝子システムを有しているものを含む、原核生物のような生物が対象である。例示的な生物として、バイオ燃料を産生するために使用することができる生物が挙げられる。他の例示的な生物としては、光合成プロセスを受ける生物が挙げられる。ゲノムおよび生物は、本明細書中に記載する、バイオ燃料の産生のための新規のゲノムおよび生物を作製するための、当技術分野で公知の方法を使用して遺伝学的に改変することができる。例えば、光合成および他の代謝プロセスに関係している遺伝子を、グルコースまたは別の炭素源の代わりに油（例えば、バイオ燃料）を産生する生物を生じるように改変することができる。したがって、日光と二酸化炭素をバイオ燃料に転換する能力を持つように操作された生物のゲノムは、本明細書中に含まれるゲノムである。一つのそのような例示的な生物は、プロクロロコッカス・マリヌスであり、これは中でも、地球上に最も豊富に存在する光合成生物であるが、非効率的な遺伝子システムを有する。   Organisms such as prokaryotes, including those with poor genetic systems, capable of producing industrially useful compounds and / or capable of functioning in harsh environments (eg, high temperature, high pressure, etc.) Is the target. Exemplary organisms include organisms that can be used to produce biofuel. Other exemplary organisms include organisms that undergo a photosynthesis process. Genomes and organisms may be genetically modified using methods known in the art to create new genomes and organisms for biofuel production as described herein. it can. For example, genes involved in photosynthesis and other metabolic processes can be modified to yield organisms that produce oil (eg, biofuel) instead of glucose or another carbon source. Thus, the genome of an organism that has been engineered to have the ability to convert sunlight and carbon dioxide into biofuel is a genome included herein. One such exemplary organism is Prochlorococcus marinus, which is among the most abundant photosynthetic organisms on Earth, but has an inefficient genetic system.

一つの態様においては、上記方法は、ゲノム（例えば、全（完全な）ゲノム（例えば、全細胞ゲノム、全ウイルスゲノム、および細胞小器官の全ゲノム）、および全ゲノムの一部分（少なくとも1セットの環境条件下で、細胞の生存性を達成するおよび/または維持するために十分な遺伝学的材料（最小の細胞ゲノム）、生存能力を宿主細胞に依存する生物の、宿主細胞内での生存能力を達成するおよび/または維持するために十分な遺伝学的材料（例えば、最小のウイルスゲノム）、または宿主細胞内での細胞小器官の機能を達成するおよび/または維持するために十分な遺伝学的材料（最小の細胞小器官のゲノム）を含む）を改変および変更するために行う。一つの局面においては、ゲノムは、最小ゲノムまたは最小の複製性ゲノムである。別の局面においては、上記ゲノムは、最小ゲノム中で、または全ゲノム中で見られる核酸配列に加えて、さらなる核酸配列を含む。   In one embodiment, the method comprises a genome (eg, a whole (complete) genome (eg, a whole cell genome, a whole virus genome, and a whole genome of an organelle), and a portion of the whole genome (at least one set). Sufficient genetic material (minimum cell genome) to achieve and / or maintain cell viability under environmental conditions, viability within the host cell for organisms that depend on host cell viability Sufficient genetic material to achieve and / or maintain sufficient genetic material (eg, minimal viral genome), or to achieve and / or maintain organelle function within the host cell In one aspect, the genome is the smallest genome or the smallest replicating genome. In this aspect, the genome includes additional nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences found in the minimal genome or in the entire genome.

ゲノムは、自然界に存在しているものであってもよく、または、遺伝学的に変更したゲノム（2種類以上の種に由来する複数の核酸配列および/またはゲノムの複数の部分を含む、改変されたゲノムおよびハイブリッドゲノムを含む）のような、合成のものであってもよい。   The genome may be naturally occurring, or genetically altered genome (including multiple nucleic acid sequences and / or multiple portions of the genome derived from two or more species) Synthetic genomes and hybrid genomes).

一つの局面においては、ゲノムは、細胞の生存性を生じるおよび/または維持するために十分な核酸配列（例えば、複製、転写、翻訳、エネルギー生産、輸送、膜および細胞質成分の産生、ならびに細胞***に必要な分子をコードする核酸配列）を含む細胞ゲノムである。   In one aspect, the genome has sufficient nucleic acid sequences (eg, replication, transcription, translation, energy production, transport, production of membrane and cytoplasmic components, and cell division to produce and / or maintain cell viability. A nucleic acid sequence encoding a molecule necessary for the cell genome).

別の局面においては、ゲノムは、ウイルスゲノムまたは細胞小器官ゲノムである。   In another aspect, the genome is a viral genome or an organelle genome.

一つの態様においては、核酸配列は、細胞小器官の核酸配列、例えば、プラスミドのような細胞小器官のゲノム（例えば、葉緑体のゲノムおよびミトコンドリアのゲノム）である。真核生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）は、それらの宿主の中に捕捉された内共生細菌の名残であると考えられる、細胞質DNAを含有している膜結合区画である。一般的には、ミトコンドリアは、全ての真核細胞の中に自然界において見られ、葉緑体および他のプラスチドは、植物および藻類の中に、自然界において見られる。プラスチドゲノムは、35kb〜217kbの大きさで変化し、大部分が115kb〜165kbの間である。ミトコンドリアゲノムは、様々な種の間で大きさが大きく変化し、20kb未満〜350kbを超えるまでであり得る。本出願の方法により、宿主細胞内の核酸および遺伝子システムを使用して、宿主細胞の中で細胞小器官のゲノムを変更することができる。例えば、細胞小器官を、酵母プラスミドおよび相同組換えを使用して酵母宿主の中で改変することができる。本提供の方法は、例えば、真核細胞（例えば、酵母および藻類）の中でエネルギー生産または代謝を増大させる目的で、新規のミトコンドリアゲノムまたは葉緑体のゲノムを作製するために使用することができる。   In one embodiment, the nucleic acid sequence is an organelle nucleic acid sequence, eg, an organelle genome such as a plasmid (eg, a chloroplast genome and a mitochondrial genome). Eukaryotic organelles (eg, mitochondria and chloroplasts) are membrane-bound compartments containing cytoplasmic DNA that are thought to be the remnants of endosymbiotic bacteria trapped in their hosts . In general, mitochondria are found in nature in all eukaryotic cells, and chloroplasts and other plastids are found in nature in plants and algae. The plastid genome varies in size from 35 kb to 217 kb and is mostly between 115 kb and 165 kb. The mitochondrial genome varies greatly in size between various species and can range from less than 20 kb to more than 350 kb. The methods of the present application allow the organelle genome to be altered in a host cell using nucleic acid and gene systems in the host cell. For example, organelles can be modified in yeast hosts using yeast plasmids and homologous recombination. The provided methods can be used, for example, to create new mitochondrial or chloroplast genomes for the purpose of increasing energy production or metabolism in eukaryotic cells (eg, yeast and algae). it can.

別の態様においては、核酸は、ウイルス核酸およびバクテリオファージ核酸（例えば、ウイルスゲノムおよびバクテリオファージゲノム）である。例えば、ウイルスおよび細菌の核酸ならびにゲノムを、治療上の用途を有するウイルスを作製するために、本提供の方法により改変し、変更することができる。別の例として、ウイルスゲノムを、本明細書中に記載する方法を使用してクローニングし、操作することができる。ウイルスは、遺伝子治療に、ワクチンに、および医学的用途においてトロイの木馬（Trojan horses）として、使用されている。しかし、ウイルスゲノムは、単純なプラスミドの中で操作するには大きすぎる。同様に、バクテリオファージが、数十年前から抗生物質として使用されている。それにもかかわらず、T-ファージのゲノムは、簡単に作業するには大きすぎる。   In another aspect, the nucleic acids are viral nucleic acids and bacteriophage nucleic acids (eg, viral genomes and bacteriophage genomes). For example, viral and bacterial nucleic acids and genomes can be modified and altered by the provided methods to produce viruses with therapeutic uses. As another example, the viral genome can be cloned and manipulated using the methods described herein. Viruses are used for gene therapy, in vaccines, and as Trojan horses in medical applications. However, the viral genome is too large to manipulate in a simple plasmid. Similarly, bacteriophages have been used as antibiotics for decades. Nevertheless, the T-phage genome is too large to work easily.

別の態様においては、本提供の方法により改変した核酸配列、変更した核酸配列、および作製した核酸配列は、ゲノムではない。例えば、上記核酸としては、染色体および他の核酸配列が挙げられる。   In another embodiment, the nucleic acid sequence modified, altered nucleic acid sequence, and generated nucleic acid sequence by the provided methods are not genomic. For example, the nucleic acids include chromosomes and other nucleic acid sequences.

典型的には、上記核酸配列およびゲノムは大きい核酸配列である。一つの局面においては、上記ゲノムまたは他の核酸配列は、少なくとも、または約100kb、150kb、200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、800kb、850kb、900kb、950kb、1メガベース（MB）、1.1MB、1.2MB、1.3MB、1.4MB、1.5MB、1.6MB、1.7MB、1.8MB、1.9MB、2MB、2.1MB、2.2MB、2.3MB、2.4MB、2.5MB、2.6MB、2.7MB、2.8MB、2.9MB、3MB、3.1MB、3.2MB、3.3MB、3.4MB、3.5MB、3.6MB、3.7MB、3.8MB、3.9MB、4MB、4.5MB、5MB、6MB、7MB、8MB、9MB、10MB、15MB、または20MBの長さ、あるいはこれらの中の任意の特定の数または範囲である。本提供の方法はまた、例えば、約100kb未満の核酸配列などの、より小さな核酸配列の操作およびクローニングにも有用である。   Typically, the nucleic acid sequence and genome are large nucleic acid sequences. In one aspect, the genome or other nucleic acid sequence is at least or about 100 kb, 150 kb, 200 kb, 250 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 450 kb, 500 kb, 550 kb, 600 kb, 650 kb, 700 kb, 750 kb, 800 kb, 850 kb , 900 kb, 950 kb, 1 megabase (MB), 1.1 MB, 1.2 MB, 1.3 MB, 1.4 MB, 1.5 MB, 1.6 MB, 1.7 MB, 1.8 MB, 1.9 MB, 2 MB, 2.1 MB, 2.2 MB, 2.3 MB, 2.4 MB, 2.5MB, 2.6MB, 2.7MB, 2.8MB, 2.9MB, 3MB, 3.1MB, 3.2MB, 3.3MB, 3.4MB, 3.5MB, 3.6MB, 3.7MB, 3.8MB, 3.9MB, 4MB, 4.5MB , 5MB, 6MB, 7MB, 8MB, 9MB, 10MB, 15MB, or 20MB in length, or any particular number or range thereof. The provided methods are also useful for the manipulation and cloning of smaller nucleic acid sequences, for example, nucleic acid sequences of less than about 100 kb.

ii.ドナーゲノムおよび他の核酸の増幅、単離、および合成
移入の前に、上記核酸配列を増幅させる、および/または細胞もしくは組織から単離することができる。ドナー核酸配列は、ドナー細胞もしくは組織（例えば、ドナー生物由来の細胞および組織）から単離することができるか、または、周知のクローニング、細胞、およびプラスミド技術と、システムとを使用して、他の細胞を形質転換し、その中で増殖させることができる。細胞の中の核酸配列は、天然のものであっても、また、合成のもの（一部が合成のものを含む）であってもよい。いくつかの場合には、核酸配列を、細胞または組織からの単離の後で、（例えば、PCRにより）増幅する。 ii. Amplification, isolation and synthesis of donor genomes and other nucleic acids Prior to transfer, the nucleic acid sequences can be amplified and / or isolated from cells or tissues. Donor nucleic acid sequences can be isolated from donor cells or tissues (eg, cells and tissues from donor organisms) or others using well known cloning, cell, and plasmid techniques and systems. Cells can be transformed and grown therein. The nucleic acid sequence in the cell may be natural or synthetic (including partly synthetic). In some cases, the nucleic acid sequence is amplified (eg, by PCR) after isolation from the cell or tissue.

ドナー核酸はまた、化学合成およびアセンブリ方法を使用してインビトロで化学合成することもできる。この場合、ドナー核酸は、本記載の方法で使用する前に任意の特定の組織または細胞から単離されることはない。DNAおよびRNAの化学合成、ならびに核酸のアセンブリのための方法は公知であり、これには、本明細書中に記載し、そして2008年10月7日に提出されたGibson et alの米国特許出願第12/247,126号に記載されている方法のような、オリゴヌクレオチドの合成、アセンブリ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および他の増幅方法（例えば、ローリングサークル増幅、全ゲノム増幅のような方法）が含まれる。例えば、DNAの合成は、DNAから行うことができ（例えば、PCRによる）、または、RNAから行うこともできる（例えば、逆転写による）。中でも、上記核酸は合成のゲノムである。合成のゲノムは、例えば、本明細書中に記載し、そして2008年10月7日に提出されたGibson et alの米国特許出願第12/247,126号に記載されているように産生することができる。   Donor nucleic acids can also be chemically synthesized in vitro using chemical synthesis and assembly methods. In this case, the donor nucleic acid is not isolated from any particular tissue or cell prior to use in the methods described herein. Methods for the chemical synthesis of DNA and RNA, and the assembly of nucleic acids are known and include the US patent application of Gibson et al described herein and filed on Oct. 7, 2008. Includes oligonucleotide synthesis, assembly, polymerase chain reaction (PCR) and other amplification methods (eg, methods such as rolling circle amplification, whole genome amplification), such as the methods described in 12 / 247,126 It is. For example, DNA synthesis can be performed from DNA (eg, by PCR) or RNA (eg, by reverse transcription). Above all, the nucleic acid is a synthetic genome. Synthetic genomes can be produced, for example, as described herein and as described in Gibson et al. US patent application Ser. No. 12 / 247,126 filed Oct. 7, 2008. .

iii.核酸配列、ベクター-宿主システム、および培養条件
上記核酸配列は、様々な供給源から単離することができる、遺伝学的に変更することができる、増幅することができる、および/または組換えにより発現させる/作製することができる。これらの核酸配列から作製した組換えポリペプチドを、個別に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、真菌、酵母、昆虫、または植物細胞の発現システムを含む任意の組換え発現システムを使用することができる。 iii. Nucleic acid sequences, vector-host systems, and culture conditions The nucleic acid sequences can be isolated from various sources, genetically altered, amplified, and / or assembled. It can be expressed / produced by replacement. Recombinant polypeptides made from these nucleic acid sequences can be individually isolated or cloned and tested for the desired activity. Any recombinant expression system can be used, including bacterial, mammalian, fungal, yeast, insect, or plant cell expression systems.

あるいは、上記核酸配列を、インビトロで、例えば、周知の化学合成技術により合成することができる、および/または商業的供給源から得ることができる。そして任意で、例えば、2008年10月7日に提出されたGibson et alの米国特許出願第12/247,126号に記載されているように、例えば、大きな核酸およびゲノムにアセンブリすることができる。   Alternatively, the nucleic acid sequence can be synthesized in vitro, for example by well-known chemical synthesis techniques, and / or obtained from commercial sources. And optionally, for example, can be assembled into large nucleic acids and genomes, as described, for example, in Gibson et al, US patent application Ser. No. 12 / 247,126, filed Oct. 7, 2008.

例えば、サブクローニング、プローブの標識（例えば、Klenowポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用するランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどのような、核酸配列の操作のための技術は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。   Techniques for manipulation of nucleic acid sequences such as subcloning, probe labeling (eg, Klenow polymerase, nick translation, random primer labeling using amplification), sequencing, hybridization, etc. are well known in the scientific literature and patents. It is well documented in the literature.

本提供の方法を実施するために使用する核酸配列を得て、かつ操作する別の有用な手段は、ゲノム試料からクローニングすること、および所望される場合には、例えば、ゲノムクローンもしくはcDNAクローンから単離または増幅した挿入断片をスクリーニングおよび再クローニングすることである。記載するシステムおよび方法で使用する核酸配列の供給源としては、例えば、哺乳動物の人工染色体（MAC）（例えば、米国特許第5,721,118号;同第6,025,155号を参照のこと）;ヒトの人工染色体（例えば、Rosenfeld（1997）Nat.Genet.15:333-335を参照のこと）;酵母の人工染色体（YAC）;細菌の人工染色体（BAC）;P1人工染色体（例えば、Woon（1998）Genomics 50:306-316を参照のこと）;P1由来のベクター（PAC;例えば、Kern（1997）Biotechniques 23:120-124を参照のこと）;コスミド、組換えウイルス、ファージ、またはプラスミドの中に含まれる、ゲノムライブラリーあるいはcDNAライブラリーが挙げられる。   Another useful means of obtaining and manipulating nucleic acid sequences for use in practicing the provided methods is to clone from a genomic sample and, if desired, for example from a genomic or cDNA clone Screening and recloning the isolated or amplified insert. Sources of nucleic acid sequences for use in the described systems and methods include, for example, mammalian artificial chromosomes (MAC) (see, eg, US Pat. Nos. 5,721,118; 6,025,155); human artificial chromosomes ( See, eg, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335); yeast artificial chromosome (YAC); bacterial artificial chromosome (BAC); P1 artificial chromosome (eg, Woon (1998) Genomics 50: 306-316); P1-derived vectors (PAC; see, eg, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124); contained in cosmids, recombinant viruses, phages, or plasmids; Examples include genomic libraries and cDNA libraries.

核酸配列（例えば、ゲノムDNA）の単離のための方法は周知である。当業者に明らかであるように、単離方法は、単離する配列のタイプと大きさ、生物のタイプ、および配列が単離される組織または細胞のタイプに依存する。様々な生物からの遺伝学的材料の単離のための方法は周知であり、ドナー核酸配列（ゲノム）を単離するために本発明の態様において使用することができる。例えば、DNAの単離のための従来の方法は周知であり、大きさに応じて本提供の方法とともに使用することができ、核酸配列の単離のための多数の市販されているキットを用いて行うことができる。例えば、市販されているキットは、細胞からのゲノムDNAの単離のために使用することができる。   Methods for isolation of nucleic acid sequences (eg, genomic DNA) are well known. As will be apparent to those skilled in the art, the isolation method will depend on the type and size of the sequence to be isolated, the type of organism, and the type of tissue or cell from which the sequence is isolated. Methods for isolation of genetic material from various organisms are well known and can be used in embodiments of the present invention to isolate donor nucleic acid sequences (genomes). For example, conventional methods for DNA isolation are well known and can be used with the provided methods depending on size, using a number of commercially available kits for nucleic acid sequence isolation. Can be done. For example, commercially available kits can be used for the isolation of genomic DNA from cells.

天然の核酸配列および合成の核酸配列を複製する、例えば、増幅によりコピーすることができる。増幅はまた、提供する核酸配列をクローニングまたは改変するためにも使用することができる。したがって、提供する核酸配列を増幅するための増幅プライマー配列の対を提供する。当業者は、これらの配列の任意の部分または全長について、増幅プライマー配列の対を設計することができる。増幅により、試料中の核酸配列の量（例えば、宿主細胞中のドナーゲノムの量）を定量化することもできる。   Natural and synthetic nucleic acid sequences can be replicated, eg, copied by amplification. Amplification can also be used to clone or modify the provided nucleic acid sequence. Accordingly, a pair of amplification primer sequences for amplifying the provided nucleic acid sequence is provided. One skilled in the art can design amplification primer sequence pairs for any portion or the full length of these sequences. Amplification can also quantify the amount of nucleic acid sequence in the sample (eg, the amount of donor genome in the host cell).

適切な増幅プライマーを選択し、設計することができる。増幅方法もまた当技術分野で周知であり、これには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写増幅（例えば、Kwoh（1989）Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:1173を参照のこと）;および自家持続配列複製法（例えば、Guatelli（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874を参照のこと）;Qβレプリカーゼ増幅（例えば、Smith（1997）J.Clin.Microbiol.35:1477-1491を参照のこと）、自動Qβレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Burg（1996）Mol.Cell.Probes 10:257-271を参照のこと）、および他のRNAポリメラーゼに媒介される技術（例えば、NASBA、Cangene、Mississauga、Ontario）が含まれる。Berger（1987）Methods Enzymol.152:307-316;Sambrook;Ausubel;米国特許第4,683,195号、および同第4,683,202号;ならびにSooknanan（1995）Biotechnology 13:563-564もまた参照のこと。   Appropriate amplification primers can be selected and designed. Amplification methods are also well known in the art and include, for example, polymerase chain reaction, PCR, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification (eg, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 1173); and self-sustained sequence replication (see, eg, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874); Qβ replicase amplification (see, eg, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491), automated Qβ replicase amplification assays (see, eg, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271), and other RNA polymerase mediated Technologies (eg, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario). See also Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202; and Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.

一つの態様においては、核酸配列は、細菌細胞（例えば、大腸菌（例えば、大腸菌DH1OB［F^--mcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ（ara, leu）7697 galU galKλ^- rpsL nupG］（Invitrogen）））中、プラスミドを使用してクローニングし、増殖させる。大腸菌および他の研究室株の中での核酸のクローニングおよび増殖のための方法ならびにプラスミドは周知であり、本提供の方法と組み合わせて使用することができる。一つの例においては、大腸菌細胞を、培地（例えば、Luria-Bertani（LB）培養液培地）中またはLB寒天中で、37℃で増殖させる。 In one embodiment, the nucleic acid sequence is a bacterial cell (eg, E. coli (eg, E. coli DH1OB [F ⁻ -mcrAΔ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ (ara, leu) 7697 galU galKλ ⁻ rpsL nupG) (Invitrogen))) and cloned using a plasmid. Methods and plasmids for cloning and propagation of nucleic acids in E. coli and other laboratory strains are well known and can be used in combination with the methods provided. In one example, E. coli cells are grown at 37 ° C. in medium (eg, Luria-Bertani (LB) culture medium) or in LB agar.

核酸配列は、例えば、マイコプラズマ細胞中で増殖させることができる。マイコプラズマ細胞は、自然界においてドナー核酸を含有するドナーマイコプラズマ細胞、またはドナー核酸（例えば、合成のゲノム）で形質転換されたマイコプラズマ細胞のいずれかであり得る。例示的なマイコプラズマ種としては、例えば、マイコプラズマ・カプリコルム亜種カプリコルム（California Kid（商標）株）（ATCC 27343）およびマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス（GM12株）（Damassa et al., 1983）、マイコプラズマ・カプリコルム亜種カプリコルム（M.カプリコルム）（例えば、野生型M.カプリコルム、および実施例において以下に記載するように野生型M.カプリコルム中のCCATC制限酵素遺伝子の不活化により得たM.カプリコルム突然変異体（M.カプリコルム-ΔRE）が挙げられる。これらおよび他のマイコプラズマ細胞ならびに他の細胞の増殖のための方法は公知である。一つの例においては、マイコプラズマドナーを、17％のウシ胎児血清（Invitrogen）を含有している液体または固体のSP4培地（Tully et al.1977）の中で37℃で増殖させる。   The nucleic acid sequence can be propagated, for example, in mycoplasma cells. A mycoplasma cell can be either a donor mycoplasma cell that naturally contains the donor nucleic acid, or a mycoplasma cell transformed with a donor nucleic acid (eg, a synthetic genome). Exemplary mycoplasma species include, for example, Mycoplasma capricolum subsp. Capricolum (California Kid ™ strain (ATCC 27343)) and Mycoplasma mycoides subsp. Capricorum subsp. Caplicorum (M. capricorum) (eg, wild-type M. capricolum, and M. capricolum mutations obtained by inactivation of the CCATC restriction enzyme gene in wild-type M. capricolum as described below in the Examples) The body (M. capricolum-ΔRE), and methods for the growth of these and other mycoplasma cells and other cells are known.In one example, the mycoplasma donor is treated with 17% fetal bovine serum ( Invitrogen) grown in liquid or solid SP4 medium (Tully et al. 1977) at 37 ° C. That.

細胞培養物およびプラスミドシステムは、公知の方法を使用してクローニングし、増殖させた所望の核酸を含有している細胞の選択を容易にするために変更することができる。一つの例においては、細菌細胞（例えば、大腸菌）の増殖を、クローニングおよび増殖に使用した核酸（例えば、プラスミド）の中に存在する耐性遺伝子に応じた抗生物質または他の選択試薬（例えば、50μg/mlのアンピシリン、5μg/mlのテトラサイクリン、または125μg/mlのピューロマイシン）を補充した培地の中で行う。同様に、プラスミド、ドナーゲノム、または他の核酸で形質転換されたマイコプラズマ細胞を、培地（例えば、5μg/mlのテトラサイクリンまたは8μg/mlのピューロマイシンを補充したSP4培地）中で増殖させることができる。   Cell culture and plasmid systems can be modified to facilitate selection of cells containing the desired nucleic acid cloned and propagated using known methods. In one example, the growth of bacterial cells (eg, E. coli) can be performed using antibiotics or other selection reagents (eg, 50 μg depending on the resistance gene present in the nucleic acid (eg, plasmid) used for cloning and propagation. / ml ampicillin, 5 μg / ml tetracycline, or 125 μg / ml puromycin). Similarly, mycoplasma cells transformed with plasmids, donor genomes, or other nucleic acids can be grown in medium (eg, SP4 medium supplemented with 5 μg / ml tetracycline or 8 μg / ml puromycin). .

細胞内での所望の遺伝子産物の発現は、周知の方法を使用して検出することができる。例えば、β-ガラクトシダーゼ活性を、150μg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal、Promega）を含有している固体培地上にマイコプラズマまたは他のタイプの細胞を播種することにより検出することができる。当業者は、遺伝子産物の発現が可能である他の条件および方法が、従来技術を使用して本明細書中で意図されることを理解すると考えられる。   Expression of the desired gene product in the cell can be detected using well-known methods. For example, β-galactosidase activity can be determined on a solid medium containing 150 μg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, Promega) or It can be detected by seeding other types of cells. Those skilled in the art will appreciate that other conditions and methods that allow expression of the gene product are contemplated herein using conventional techniques.

a.アガロースプラグ中での核酸配列の単離
核酸配列は、損傷を最小限にするためにアガロースプラグの中で単離することができる。大きな核酸配列（例えば、数千塩基対〜10MBの範囲のDNA、およびそれより大きいDNA（例えば、ゲノム））は、従来の単離手順の間に機械力（例えば、ピペッティング）により剪断されることがあり、これによって損傷が生じる。そのような核酸配列のアガロース中での単離は、損傷を最小限にすることができる。この態様においては、ドナーDNAを含有している細胞をアガロースに包埋し、溶解させる。アガロース（例えば、低融点アガロース）中でゲノム核酸配列を単離するための方法もまた周知であり、市販されているキット（例えば、CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit（カタログ番号170-3591）、CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit（カタログ番号170-3592）、およびCHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit（カタログ番号170-3593）（全て、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）による）を使用して行うことができる。このようなキットを使用するDNAの調製は、供給業者が推奨する条件とプロトコールを使用して行うことができる。 a. Isolation of nucleic acid sequences in agarose plugs Nucleic acid sequences can be isolated in agarose plugs to minimize damage. Large nucleic acid sequences (eg, DNA ranging from a few thousand base pairs to 10 MB, and larger DNA (eg, genome)) are sheared by mechanical forces (eg, pipetting) during conventional isolation procedures This can cause damage. Isolation of such nucleic acid sequences in agarose can minimize damage. In this embodiment, cells containing donor DNA are embedded in agarose and lysed. Methods for isolating genomic nucleic acid sequences in agarose (eg, low melting point agarose) are also well known and are commercially available kits (eg, CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit (Catalog Number 170-3591), CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit (Catalog No. 170-3592) and CHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit (Catalog No. 170-3593) (all from Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) can be used. Preparation of DNA using such a kit can be performed using conditions and protocols recommended by the supplier.

ドナー核酸配列（例えば、細菌、マイコプラズマ、酵母、または藻類のゲノム）もまた、低融点アガロースとBio-Rad CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kitとを使用し、製造業者が推奨するプロトコールに従って、アガロースプラグ中で単離することができる。一つの例においては、細胞を、血清を含まない培地またはPBS中に懸濁し、多数の細胞（例えば、5×10⁷または5×10⁸個/mLのアガロースになるようにする）を遠心分離し、作製しようとするアガロースの最終容量の2分の1に再懸濁する。それと同時に、低融点アガロース（例えば、Bio-Radの2％のCleanCut（商標）アガロース）を、滅菌水中に調製し、融解させ、50℃で平衡化させる。この細胞懸濁液を同じ温度で平衡化させ、アガロースとともに穏やかに混合する。上記混合物をプラグ型（plug mold）に移し、固化させる。一つの例においては、溶解のために、プロテイナーゼKを含有する混合物を添加し（例えば、プラグ1mLあたり、100mMのEDTA、pH8、0.2％のデオキシコール酸ナトリウム、1％のラウリルサルコシンナトリウム、および1mg/mLのプロテイナーゼKを含有する5MLのプロテイナーゼK反応緩衝液中）、そして50℃で一晩インキュベーションする。別の例においては、溶解のために、アガロース中の細胞を、一晩から2日間の期間にわたり、50℃で、0.4MのEDTA、0.4％のN-ラウリルサルコシン、2mg/mLのプロテイナーゼKの中でインキュベーションし、続いて、緩衝液を交換し、同じ時間の間、同じ条件下で2回目の処理を行う。 Donor nucleic acid sequences (eg, bacterial, mycoplasma, yeast, or algae genomes) are also used in agarose plugs using low melting point agarose and Bio-Rad CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit, following the protocol recommended by the manufacturer. It can be isolated. In one example, the cells are suspended in serum-free medium or PBS and a large number of cells (eg, 5 × 10 ⁷ or 5 × 10 ⁸ cells / mL agarose) are centrifuged. And resuspend in half the final volume of agarose to be made. At the same time, low melting point agarose (eg, Bio-Rad 2% CleanCut ™ agarose) is prepared in sterile water, melted and equilibrated at 50 ° C. The cell suspension is equilibrated at the same temperature and gently mixed with agarose. The mixture is transferred to a plug mold and solidified. In one example, a mixture containing proteinase K is added for lysis (eg, 100 mM EDTA, pH 8, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, and 1 mg per mL of plug 5 ml proteinase K reaction buffer containing / mL proteinase K), and incubate overnight at 50 ° C. In another example, for lysis, cells in agarose were treated with 0.4 M EDTA, 0.4% N-lauryl sarcosine, 2 mg / mL proteinase K at 50 ° C. for a period of overnight to 2 days. Incubate in followed by buffer exchange and a second treatment under the same conditions for the same time.

溶解後、ドナー核酸を含有するアガロースプラグを、10mMのTris（pH 8.0）（任意で、1mMまたは50mMのEDTAを含有する）に対して、例えば、1時間透析することができる。一つの例においては、この透析に続いて、2回の、それぞれ2時間の、10mMのTris、50mMのETDA、0.1mMのPMSF中での透析と、保存のための、10mMのTris、50mMのEDTAの中での再透析を行う。別の例においては、その後、試料を、移入の前に、Katsura et al., Electrophoresis 21, 171（2000年1月）により記載されているように、10mM（6％）のPEG6000（United States Biochemical）、0.6MのNaClに対して、数時間透析する。一つの例においては、プラグをさらに、65℃で5分間融解させ、続いて、2倍容量の65℃のTEを添加し、穏やかに撹拌し、その後、65℃で5分間インキュベーションする。   After lysis, the agarose plug containing the donor nucleic acid can be dialyzed against, for example, 1 hour against 10 mM Tris (pH 8.0) (optionally containing 1 mM or 50 mM EDTA). In one example, this dialysis is followed by two, 2 hours each, 10 mM Tris, 50 mM ETDA, 0.1 mM PMSF, and 10 mM Tris, 50 mM for storage. Re-dialyze in EDTA. In another example, the sample is then subjected to 10 mM (6%) PEG6000 (United States Biochemical) prior to transfer, as described by Katsura et al., Electrophoresis 21, 171 (January 2000). ) Dialyze against 0.6 M NaCl for several hours. In one example, the plug is further melted at 65 ° C. for 5 minutes, followed by the addition of 2 volumes of 65 ° C. TE, gently agitated, and then incubated at 65 ° C. for 5 minutes.

いくつかの局面においては、プラグを融解させ、例えば、β-アガラーゼを使用して、宿主細胞の形質転換の前に消化する。一つの例においては、プラグを、CHEF（Bio-Rad）により2回（例えば、最初は1％のパルスフィールドアガロースゲル上で、0.5×TBEおよび50秒〜90秒のスイッチ時間を用いて、20時間にわたり、2回目は、1％の低融点ゲル上で、1×TAEおよび60秒〜120秒のスイッチ時間を用いて、24時間にわたり）電気泳動して、分解したDNAを除去してインタクトなゲノムを残し、続いて、滅菌の1×TAEに対する透析、73℃での融解、42℃での平衡化、およびβ-アガラーゼ（New England Biolabs）での、例えば、1.5時間の消化を行う。   In some aspects, the plug is thawed and digested prior to transformation of the host cell, for example using β-agarase. In one example, plugs are washed 20 times with CHEF (Bio-Rad) (eg, initially on a 1% pulsed field agarose gel, using 0.5 × TBE and a switch time of 50-90 seconds). Over time, the second time is electrophoresed on a 1% low melting point gel using 1 × TAE and a switch time of 60 seconds to 120 seconds (for 24 hours) to remove degraded DNA and intact The genome is left, followed by dialysis against sterile 1 × TAE, thawing at 73 ° C., equilibration at 42 ° C., and digestion with β-agarase (New England Biolabs), for example, 1.5 hours.

b.細胞小器官ゲノムの単離
ドナー核酸配列は、細胞小器官のゲノム（例えば、ドナー細胞から単離した細胞小器官のゲノム）であり得る。細胞小器官のゲノムを単離するための方法は当技術分野で公知である。細胞からの細胞小器官の単離のためのキットは、Pierce（Rockford, Ill.）、Sigma-Aldrich（St.Louis, Mo.）などを含む様々な製造業者から入手することができる。 b. Isolation of the Organelle Genome The donor nucleic acid sequence can be the genome of an organelle (eg, the genome of an organelle isolated from a donor cell). Methods for isolating the organelle genome are known in the art. Kits for the isolation of organelles from cells are available from a variety of manufacturers including Pierce (Rockford, Ill.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.) and others.

細胞小器官のゲノムおよび他の核酸は、様々なタイプの細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、藻類、および哺乳動物細胞を含む真核細胞および原核細胞）から単離することができる。当技術分野で公知であるように、細胞小器官の核酸を単離される細胞の生物、および単離される細胞小器官のタイプに応じて、単離手順が変わり得ることが理解される。細胞小器官の核酸の単離手順には、全ゲノムDNA試料中の核DNAからの細胞小器官のDNAの分離（例えば、分画またはゲル上での分離による分子量に基づく）が含まれ得る。特定の態様においては、細胞小器官を、DNAを抽出する前に全細胞性画分から精製することができる。   Organelle genomes and other nucleic acids can be isolated from various types of cells (eg, eukaryotic and prokaryotic cells, including yeast cells, plant cells, algae, and mammalian cells). As is known in the art, it is understood that the isolation procedure may vary depending on the organism of the cell from which the organelle nucleic acid is isolated and the type of organelle to be isolated. Organelle nucleic acid isolation procedures can include separation of organelle DNA from nuclear DNA in a total genomic DNA sample (eg, based on molecular weight by fractionation or separation on a gel). In certain embodiments, the organelles can be purified from the whole cellular fraction before extracting the DNA.

植物からの葉緑体（および他のプラスチド）ゲノムの単離のための方法は公知である。単離は、典型的には、（1）プラスチドを他の細胞小器官から分離すること、（2）葉緑体を溶解させること、および（3）核酸を精製することにより行う。一つの例においては、スクロースまたはPercollの段階的勾配を、細胞溶解物から葉緑体を得るために使用し、これをその後溶解させて、DNAを回収するために使用する。特定の例においては、植物を、葉緑体のデンプンレベルを下げるために暗所に置き、緑色の葉を水道水で洗浄し、予め冷却しておいたブレンダーの中でのホモジナイゼーションのために単離緩衝液に入れ（10g〜100g）、続いて、チーズクロスを通して濾過し、遠心分離する。ペレットを、18mLの52％スクロースを用いる一つの一段階の勾配に充填（load）し、7mLの30％スクロースを重層し、任意で、200gの出発材料を含む少なくとも6つのスクロース勾配のような、収量を増大させるためのさらなるスクロース勾配にかける。上記段階的勾配を遠心分離し（例えば、4℃、25,000rpmで30分〜60分間）、そして葉緑体のバンドを、wide-boreピペットを使用して30％〜52％の界面から取り出す。その後、葉緑体を記載するように溶解させ、遠心分離して破片を取り除く。その後、DNAを、例えば、CsCl勾配を使用して記載するように精製する。DNAseIでの処理を、スクロース勾配法を改変するため、および核DNAを分解するために使用することができる。あるいは、当技術分野で公知であるように、高塩濃度（例えば、NaCl 1.25M）法を、段階的勾配遠心分離を伴わない単離に使用することができる。葉緑体は、蛍光活性化セルソーター（FACS）分離を使用して、ミトコンドリアおよび核から選別することができる。   Methods for the isolation of chloroplast (and other plastid) genomes from plants are known. Isolation is typically performed by (1) separating plastids from other organelles, (2) lysing chloroplasts, and (3) purifying nucleic acids. In one example, a step gradient of sucrose or Percoll is used to obtain chloroplasts from cell lysates, which are then lysed and used to recover DNA. In a particular example, the plant is placed in the dark to lower the starch level of the chloroplast, the green leaf is washed with tap water and for homogenization in a pre-cooled blender. In isolation buffer (10 g to 100 g), followed by filtration through cheesecloth and centrifugation. The pellet is loaded into a single step gradient using 18 mL of 52% sucrose and overlaid with 7 mL of 30% sucrose, optionally at least 6 sucrose gradients containing 200 g of starting material, Apply an additional sucrose gradient to increase yield. The step gradient is centrifuged (eg, 4 ° C., 25,000 rpm for 30-60 minutes) and the chloroplast band is removed from the 30% -52% interface using a wide-bore pipette. The chloroplast is then dissolved as described and centrifuged to remove debris. The DNA is then purified as described using, for example, a CsCl gradient. Treatment with DNAseI can be used to modify the sucrose gradient method and to degrade nuclear DNA. Alternatively, as is known in the art, the high salt concentration (eg, NaCl 1.25M) method can be used for isolation without step gradient centrifugation. Chloroplasts can be sorted from mitochondria and nuclei using fluorescence activated cell sorter (FACS) separation.

ミトコンドリアDNA（mtDNA）（高度に精製されたmtDNAを含む）の単離のための方法は公知であり、ミトコンドリアゲノムを単離するために、本提供の方法と組み合わせて使用することができる。高度に精製されたmtDNAは、スクロースパッド勾配と塩化セシウム勾配を使用して、脊椎動物または無脊椎動物の組織から調製することができる。一般的には、組織（例えば、脊椎動物の脳、精巣、卵巣、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、および無脊椎動物の胚）を、必要に応じて、組織をホモジナイズすること、続いて、細胞の破片と核を取り除くために低速での遠心分離を繰り返すこと、これに続く、高速での遠心分離とペレットの溶解により、生物から調製する。スクロースの段階的勾配を、4℃で1時間の、25,000rpmでの超遠心分離によりペレットにかける。この場合、上記勾配は、10mLの、TE緩衝液中の1.5Mスクロースパッドと、10mLの1Mスクロースの層を含む。このプロセスのために、上記ペレットをTE緩衝液中に再度懸濁し、勾配上に層を重ね、続いて、4℃、27,000rpmで1〜2時間遠心分離する。1Mおよび1.5Mのスクロースパッドの界面に乳白色のバンドとして現れる高度に精製されたミトコンドリアを、パスツールピペットを用いて収集し、高速遠心分離（例えば、4℃で13,000rpm）によるさらなる濃縮のためにチューブに入れる。   Methods for the isolation of mitochondrial DNA (including highly purified mtDNA) are known and can be used in combination with the provided methods to isolate the mitochondrial genome. Highly purified mtDNA can be prepared from vertebrate or invertebrate tissue using a sucrose pad gradient and a cesium chloride gradient. In general, tissue (e.g., vertebrate brain, testis, ovary, liver, kidney, heart, skeletal muscle, and invertebrate embryo) is optionally homogenized, followed by Prepare from organisms by repeated low speed centrifugation to remove cell debris and nuclei, followed by high speed centrifugation and pellet lysis. A stepwise gradient of sucrose is applied to the pellet by ultracentrifugation at 25,000 rpm for 1 hour at 4 ° C. In this case, the gradient includes 10 mL of a 1.5 M sucrose pad in TE buffer and 10 mL of 1 M sucrose layer. For this process, the pellet is resuspended in TE buffer, layered on a gradient, and subsequently centrifuged at 27,000 rpm for 1 to 2 hours. Highly purified mitochondria that appear as milky white bands at the interface of 1M and 1.5M sucrose pads are collected using a Pasteur pipette for further concentration by high-speed centrifugation (eg 13,000 rpm at 4 ° C.) Put in a tube.

その後、ペレット状にしたミトコンドリアを、例えば、TE緩衝液中に再度懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（例えば、TE 1mLあたり0.3mLの10％SDS）を添加することにより、溶解させる。この溶液が透明になった後、飽和CsClを添加し、この混合物を氷上で20分間インキュベーションし、続いて、12,000rpmで10分間遠心分離し、上清をとっておく。DNAを、CsCl-ヨウ化プロピジウム（PI）（または臭化エチジウム）勾配（例えば、8mLの上清あたり、8gのCsClおよび0.6mLの2mg/ml PI、混合し、1.56g/mLになるように密度を調整する）を用いて精製する。36,000rpmでの遠心分離後、上のバンドは、核DNAを含有しており、そして下のバンドは、mtDNAを含有しており、これらを収集することができ、任意で、この後、さらにCsCl勾配にかける。mtDNAの単離のためのキットは、市販されている。一つの例においては、ミトコンドリアDNAを、哺乳動物組織（例えば、筋肉または肝臓組織）から、mtDNA Extractor CT Kit（Wako, Osaka Japan, カタログ番号291-55301）を使用して調製する。真菌（例えば、酵母）のミトコンドリアDNA（これは、通常、スーパーコイル状の環状DNAであるので、細胞のホモジネートになるように効率よくほぐすことができない）の単離のためのプロトコールも公知である。一つの例においては、粗DNA調製物のCsCl密度勾配遠心分離を、ATを多く含むDNAに優先的に結合する色素（例えば、DAPIまたはビス-ベンズイミド）の存在下で行う。別の例においては、mtDNAを、単離したミトコンドリアから抽出し、これを、200Ogで20分間の溶解物の遠心分離、これに続く、スクロース勾配上での上清の分離（例えば、2mLの60％スクロース、4mLの50％スクロースを重層し、4mLの44％スクロースを重層し、続いて、スイング・アウト・ローターでの120,00Ogで90分間の遠心分離、および44/55％界面からのミトコンドリアの収集）により、核と細胞の破片をペレット状にすることにより単離する。   The pelleted mitochondria are then resuspended, for example, in TE buffer and lysed by adding sodium dodecyl sulfate (SDS) (eg, 0.3 mL of 10% SDS per mL of TE). After the solution becomes clear, saturated CsCl is added and the mixture is incubated on ice for 20 minutes, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes and the supernatant is saved. Mix the DNA with a CsCl-propidium iodide (PI) (or ethidium bromide) gradient (eg, 8 g CsCl and 0.6 mL 2 mg / ml PI per 8 mL supernatant to 1.56 g / mL) To adjust the density). After centrifugation at 36,000 rpm, the upper band contains nuclear DNA, and the lower band contains mtDNA, which can be collected and optionally further CsCl Apply to the gradient. Kits for isolation of mtDNA are commercially available. In one example, mitochondrial DNA is prepared from mammalian tissue (eg, muscle or liver tissue) using the mtDNA Extractor CT Kit (Wako, Osaka Japan, catalog number 291-55301). Protocols for isolation of fungal (eg, yeast) mitochondrial DNA (which is usually supercoiled circular DNA and cannot be efficiently dissociated to become a cell homogenate) are also known . In one example, CsCl density gradient centrifugation of the crude DNA preparation is performed in the presence of a dye (eg, DAPI or bis-benzimide) that preferentially binds to AT-rich DNA. In another example, mtDNA is extracted from isolated mitochondria, which is centrifuged at 200 Og for 20 minutes followed by centrifugation of the supernatant on a sucrose gradient (eg, 2 mL of 60 Overlay with 4% 50% sucrose, 4mL of 44% sucrose, followed by centrifugation at 120,00Og for 90 minutes in a swing-out rotor, and mitochondria from the 44/55% interface To collect nuclei and cell debris by pelleting.

D.ドナーゲノムおよび核酸配列の宿主細胞への導入
中でも、例えば、宿主細胞の機構を使用する宿主細胞内での改変のための、ドナー核酸（ドナーゲノムを含む）を宿主細胞に導入するための方法と核酸が、提供する態様である。上記宿主細胞は、ドナーゲノムの起源である細胞の中には通常存在しない所望の能力（例えば、組換え機構）を提供する異種宿主細胞である。上記のように、ドナー核酸は、移入の前に細胞もしくは組織から単離してもよく、またはインビトロで化学合成および/もしくはアセンブリしてもよく、ならびに/またはインビトロもしくはインビボでの方法により単離もしくは合成した核酸からコピーしてもよい。 D. Introduction of a donor genome and nucleic acid sequence into a host cell Among other things, for introduction of a donor nucleic acid (including the donor genome) into the host cell, eg, for modification within the host cell using the host cell mechanism Methods and nucleic acids are embodiments provided. The host cell is a heterologous host cell that provides a desired ability (eg, a recombination mechanism) that is not normally present in the cell from which the donor genome is derived. As noted above, the donor nucleic acid may be isolated from the cell or tissue prior to transfer, or may be chemically synthesized and / or assembled in vitro, and / or isolated or by in vitro or in vivo methods. You may copy from the synthesized nucleic acid.

典型的には、ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）の宿主細胞への移入は、宿主細胞内で増殖させ、改変することができる、ドナー核酸と宿主ベクターとを含む核酸を作製するために、最初に、ドナー核酸（環状であっても、直線化されていても、または断片化されていてもよい）を宿主核酸（これは、典型的には宿主ベクターである）に連結させることにより行う。ドナー核酸と宿主ベクターとの連結は、ドナー細胞中もしくは宿主細胞中で、インビトロまたはインビボで行うことができる。一つの例においては、宿主ベクターでドナー細胞を形質転換し、ここで宿主ベクターをドナーゲノムと組換え、続いて、ベクターが挿入されたゲノムを単離する（例えば、図2Aを参照のこと）。別の例においては、ドナーゲノムと宿主ベクターとで、別々に宿主細胞を同時形質転換し、ドナー核酸と宿主核酸とを宿主細胞内で組換える。上記ドナーゲノムは、ベクターによる宿主細胞の同時形質転換の前に、直線化されても（例えば、図2Bを参照のこと）、または断片化されてもよい（例えば、図2Cを参照のこと）。   Typically, transfer of a donor nucleic acid (eg, a donor genome) into a host cell is performed first to create a nucleic acid comprising a donor nucleic acid and a host vector that can be propagated and modified in the host cell. First, a donor nucleic acid (which may be circular, linearized or fragmented) is linked to a host nucleic acid (which is typically a host vector). Ligation of the donor nucleic acid and the host vector can be performed in vitro or in vivo in the donor cell or in the host cell. In one example, a host cell is transformed with a host vector, where the host vector is recombined with the donor genome, followed by isolation of the genome into which the vector has been inserted (see, eg, FIG. 2A). . In another example, a host cell is separately co-transformed with a donor genome and a host vector, and the donor nucleic acid and the host nucleic acid are recombined within the host cell. The donor genome may be linearized (eg, see FIG. 2B) or fragmented (eg, see FIG. 2C) prior to co-transformation of host cells with the vector. .

i.宿主細胞
宿主細胞は任意の宿主細胞であり得、かつ典型的には、研究室での核酸の改変のために望ましい遺伝子システム（例えば、ドナー生物または細胞と比較して改良された遺伝子システム）を有している異種細胞である。所望される遺伝子システムの例示的な局面は、相同組換え（ダブル・クロスオーバー相同組換えおよびトランスポゾン突然変異誘発を含む）をサポートする能力、定義した十分に特性決定されている選択マーカーおよび他のマーカーのセット、ならびに、大きな核酸をクローニングする能力である。宿主細胞が、それを、宿主細胞内での核酸のクローニング、増殖、および改変の際にドナー核酸と適合するようにする特性を有することもまた望ましい。 i. Host cells A host cell can be any host cell and is typically a genetic system desired for nucleic acid modification in the laboratory (eg, an improved genetic system compared to a donor organism or cell). ). Exemplary aspects of the desired genetic system include the ability to support homologous recombination (including double crossover homologous recombination and transposon mutagenesis), defined well-characterized selectable markers and other A set of markers, as well as the ability to clone large nucleic acids. It is also desirable for the host cell to have properties that make it compatible with the donor nucleic acid during cloning, propagation, and modification of the nucleic acid within the host cell.

例えば、特定の宿主細胞を、遺伝子の毒性を最小限にするために選択することができる。宿主/ドナーの組み合わせを、ドナー核酸からの遺伝子発現が宿主細胞の中で起こらないように、またはドナー核酸からの遺伝子発現が、ドナー細胞中と比較して宿主細胞中で低下するように選択することができる。一つのそのような局面においては、宿主とドナーが、異なる翻訳および/または転写シグナルならびに/あるいは機構を含む（例えば、酵母生物と細菌生物）。別の局面においては、一つまたは複数のコドンが、ドナーによってはアミノ酸として翻訳されるが、細胞機構によっては終結コドンとして処理される。一つの例においては、ドナーは、コドン（例えば、UAG）をアミノ酸（例えば、トリプトファン）として翻訳するが、宿主細胞は、同じコドンを終結コドンと読む（例えば、マイコプラズマ対真核生物）。これらの局面においては、ドナーゲノムおよび他の核酸を、ドナーゲノムによりコードされる遺伝子産物を発現することなく（または最小限にしか発現せず）望ましい遺伝子システムを有している宿主細胞の中で、維持する、複製する、および改変することができる。   For example, a particular host cell can be selected to minimize gene toxicity. Select the host / donor combination so that gene expression from the donor nucleic acid does not occur in the host cell, or gene expression from the donor nucleic acid is reduced in the host cell compared to in the donor cell. be able to. In one such aspect, the host and donor contain different translation and / or transcription signals and / or mechanisms (eg, yeast and bacterial organisms). In another aspect, one or more codons are translated as amino acids by some donors, but are treated as termination codons by some cellular machinery. In one example, the donor translates a codon (eg, UAG) as an amino acid (eg, tryptophan), but the host cell reads the same codon as a termination codon (eg, mycoplasma vs. eukaryote). In these aspects, the donor genome and other nucleic acids are within a host cell having the desired gene system without (or minimally expressing) the gene product encoded by the donor genome. Can be maintained, replicated, and modified.

宿主細胞としては、クローニングしたドナーゲノムまたは核酸と適合する任意の細胞を挙げることができる。したがって、例えば、藻類由来のゲノムを酵母にクローニングし、同じまたは異なる藻類のレシピエント細胞に再度導入する際により好ましい特徴を提供するように操作することができる。システムが適合する程度で、これらの藻類の遺伝子を操作し、植物細胞培養物を提供することもできる。同様の操作が、脊椎動物および無脊椎動物の細胞についても実現可能である。   Host cells can include any cell that is compatible with the cloned donor genome or nucleic acid. Thus, for example, an algal-derived genome can be cloned into yeast and engineered to provide more favorable characteristics upon reintroduction into recipient cells of the same or different algae. To the extent the system is compatible, these algal genes can be manipulated to provide plant cell cultures. Similar manipulations are feasible for vertebrate and invertebrate cells.

一つの好ましい態様においては、宿主細胞は酵母細胞である。酵母宿主としては、「役に立つ種」、サッカロミセス・セレビジエ、および他の酵母種（例えば、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）（これは、さらに大きなゲノムをクローニングするために使用することができる））が挙げられる。酵母宿主は、それらの特有の遺伝子操作ツールのセットの理由から、ドナーゲノム材料の操作に特に適している。酵母細胞の天然の能力と数十年に及ぶ研究により、酵母の中でDNAを操作するためのツールの恵まれた（rich）セットが作製された。これらの利点は当技術分野で周知である。例えば、恵まれた遺伝子システムを持つ酵母は、相同組換え（多くの容易に利用できる生物が共通して持つものではない能力）により、ヌクレオチド配列をアセンブリおよび再アセンブリすることができる。酵母細胞は、他の生物の中ではクローニングすることができないDNAの大きな断片（例えば、全細胞ゲノム、細胞小器官の全ゲノム、および全ウイルスゲノム）をクローニングするために使用することができる。したがって、本記載の方法の一つの態様は、扱いにくい生物および他の生物のゲノム、ならびに合成のゲノムの操作のための宿主として酵母を使用することにより、合成生物学および合成ゲノミクスを進歩させるために、酵母の遺伝学的な計り知れない能力を利用する。   In one preferred embodiment, the host cell is a yeast cell. Yeast hosts include “useful species”, Saccharomyces cerevisiae, and other yeast species such as Saccharomyces pombe, which can be used to clone larger genomes. It is done. Yeast hosts are particularly suitable for manipulation of donor genomic material because of their unique set of genetic manipulation tools. Yeast cells' natural capabilities and decades of research have created a rich set of tools for manipulating DNA in yeast. These advantages are well known in the art. For example, yeast with a privileged genetic system can assemble and reassemble nucleotide sequences by homologous recombination (an ability not shared by many readily available organisms). Yeast cells can be used to clone large pieces of DNA that cannot be cloned in other organisms (eg, whole cell genome, whole organelle genome, and whole virus genome). Accordingly, one embodiment of the described method is to advance synthetic biology and genomics by using yeast as a host for manipulation of cumbersome and other organism genomes, and synthetic genomes. And take advantage of the immense genetic ability of yeast.

酵母宿主細胞の例は、もとの株よりも高い形質転換効率を持つように開発された酵母VL6-48N株:VL6-48株（ATCC番号MYA-3666TM））、W303a株、および組換え欠損（recombination-deficient）酵母株（例えば、RAD54遺伝子欠損株、VL6-48-Δ54G（MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14 rad54-Δ1::kanMX）（これは、酵母人工染色体（YAC）の中での様々な組換え事象の発生を減少させる可能性がある）である。   Examples of yeast host cells are yeast VL6-48N strain: VL6-48 strain (ATCC number MYA-3666TM)), W303a strain, and recombination deficiency developed to have higher transformation efficiency than the original strain (Recombination-deficient) yeast strain (for example, RAD54 gene-deficient strain, VL6-48-Δ54G (MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14 rad54-Δ1 :: kanMX) (this is a yeast artificial chromosome) (YAC) may reduce the occurrence of various recombination events).

酵母宿主細胞の中での多数回（無限の反復回）のシームレスな核酸の変更を行うことを可能にする、酵母突然変異体の選択および対抗選択のための、検証され、実証された、信頼できる選択マーカーの大きなセットが存在する。したがって、酵母を、多数の様々な遺伝学的改変（単一のヌクレオチド変化（例えば、挿入、欠失、突然変異）を含む）を導入するため、標的核酸部分および領域の改変、ならびに完全に新しい染色体の構築のために使用することができる。そうでなければ扱いにくいゲノムまたは他の大きな核酸のクローニングしたコピーについての連続的な改変を、間断なく酵母の中で行うことができる。酵母の接合能力が、ゲノムおよび他の大きな核酸を改変するために好ましい。酵母の組換え機構は、酵母の接合の間に活性化されると、ライブラリー（例えば、クローニングしたゲノムまたは核酸の変異体を含有しているコンビナトリアルライブラリー）を作製するために使用することができる。   Validated, proven, and reliable for yeast mutant selection and counter-selection that allows multiple (infinite repeat) seamless nucleic acid changes in yeast host cells There is a large set of selectable markers that can be. Thus, yeast introduces a number of different genetic modifications (including single nucleotide changes (eg, insertions, deletions, mutations)) to modify target nucleic acid portions and regions, and completely new Can be used for chromosome construction. Otherwise, continuous modifications to cloned copies of otherwise cumbersome genomes or other large nucleic acids can be made in yeast without interruption. The conjugation ability of yeast is preferred for modifying genomes and other large nucleic acids. The yeast recombination machinery, when activated during yeast conjugation, can be used to create libraries (eg, combinatorial libraries containing cloned genomic or nucleic acid variants). it can.

例えば、酵母人工染色体（YAC）ライブラリーが、いくつかの異なる細菌について構築されている（Azevedo et al., PNAS USA 90, 6047（1993）;Heuer et al., Electrophoresis 19, 486（1998）;Kuspa et al., PNAS USA 86, 8917（1989））。原核生物の大きなDNAセグメントを、普遍的遺伝子コードを使用して酵母にクローニングすることができる。毒性の遺伝子の発現は、典型的には、酵母の中でドナー核酸をクローニングすることに対する障壁ではない。細菌および古細菌のゲノムを用いる実験は、例えば、真核生物が、これらの細菌とは異なるタンパク質発現機構を使用するので、クローニングしたゲノムから発現されるタンパク質により酵母宿主が傷つくリスクがほとんどないことを示す。酵母中の転写シグナル（Kozak, Gene 234, 187（1999））および翻訳シグナル（Kornberg, Trends Cell Biol 9, M46（1999））は、細菌のものとは異なる。実際、原核生物の遺伝子のほとんどが、酵母の中では発現されないようである。酵母の中には、制限となるような障壁は存在しない（Belfort and Roberts, Nucleic Acids Res 25, 3379（1997））。障壁が存在するとしても、遺伝子発現についての障壁ではなく、複製についての障壁であると考えられる（Stinchcomb et al., PNAS USA 77, 4559（1980））。遺伝子の毒性は、酵母のような真核生物の中での遺伝子発現の調節が原核生物の中での調節とは異なるとの理由から、最小限となる。また、マイコプラズマは、コドンUGAを、翻訳終結シグナルとしてではなくトリプトファンとして使用する。したがって、マイコプラズマ遺伝子のほとんどは、発現されると、酵母の中で短縮型のタンパク質を生じると考えられる。これにより、毒性の遺伝子産物の可能性が大幅に回避される。   For example, yeast artificial chromosome (YAC) libraries have been constructed for several different bacteria (Azevedo et al., PNAS USA 90, 6047 (1993); Heuer et al., Electrophoresis 19, 486 (1998); Kuspa et al., PNAS USA 86, 8917 (1989)). Large prokaryotic DNA segments can be cloned into yeast using the universal genetic code. Toxic gene expression is typically not a barrier to cloning donor nucleic acids in yeast. Experiments with bacterial and archaeal genomes show that, for example, eukaryotes use a different protein expression mechanism than these bacteria, so there is little risk of damaging the yeast host with proteins expressed from the cloned genome. Indicates. Transcriptional signals in yeast (Kozak, Gene 234, 187 (1999)) and translational signals (Kornberg, Trends Cell Biol 9, M46 (1999)) are different from those in bacteria. In fact, most prokaryotic genes do not appear to be expressed in yeast. There are no limiting barriers in yeast (Belfort and Roberts, Nucleic Acids Res 25, 3379 (1997)). Even if a barrier is present, it is not a barrier for gene expression, but a barrier for replication (Stinchcomb et al., PNAS USA 77, 4559 (1980)). Gene toxicity is minimal because the regulation of gene expression in eukaryotes such as yeast is different from that in prokaryotes. Mycoplasma also uses the codon UGA as tryptophan rather than as a translation termination signal. Thus, most of the mycoplasma genes are thought to produce truncated proteins in yeast when expressed. This greatly avoids the possibility of toxic gene products.

ドナーは、ドナー生物からそれらの天然の形態で得ることができ、かつ酵母の形質転換の前に酵母ベクターを用いて改変することができる。または、ドナーは、酵母細胞の形質転換の前に酵母ベクターとともに天然もしくは合成の断片からアセンブリすることも、または同時に酵母細胞を同時形質転換することもできる。新しい生物を、（所望される場合は任意で操作した）これらのゲノムを、適合するレシピエント細胞に移入することにより作製する。したがって、一つの態様は、最初に、ゲノムを酵母宿主細胞に移入するため、それらの安定性および完全性を維持したまま、宿主細胞の中でゲノムを改変するため、ならびに、酵母宿主細胞からクローニングし、操作したゲノムを、もとのドナーにより似ているレシピエント細胞に移植して戻し、それにより、これまでは存在していなかった、ならびに/あるいは利用できる遺伝子変更ツールおよびクローニングツールを用いても、それらのもとの細胞の遺伝子操作によって作製することができなかった生物を作製するために適している技術を提供する。   Donors can be obtained in their native form from donor organisms and can be modified with yeast vectors prior to yeast transformation. Alternatively, the donor can assemble from natural or synthetic fragments with the yeast vector prior to transformation of the yeast cell, or simultaneously co-transform the yeast cell. New organisms are created by transferring these genomes (optionally manipulated if desired) into compatible recipient cells. Thus, one embodiment is to first transfer the genome to a yeast host cell, to modify the genome in the host cell while maintaining their stability and integrity, and to clone from the yeast host cell. The engineered genome is then transferred back to recipient cells that are more similar to the original donor, thereby using genetic modification and cloning tools that have not previously existed and / or are available Also provide a technique suitable for producing organisms that could not be produced by genetic manipulation of their original cells.

ii.宿主ベクター
典型的には、宿主ベクターを使用してドナー核酸で宿主細胞を形質転換し、ドナー核酸を宿主細胞内で増殖させる。したがって、宿主細胞は一般的には、宿主細胞内でのドナー核酸の移入、維持、および改変のための宿主ベクターを含むか、またはその導入をサポートすると考えられる。一つの態様においては、宿主ベクターは、ドナー細胞への、ならびにドナー細胞から宿主細胞、およびレシピエント細胞、および他の細胞（例えば、クローニングおよび増殖に使用する細菌細胞（例えば、大腸菌））への、ドナー核酸の移入を容易にするための核酸配列を含む（例えば、本明細書中の実施例に記載するトリ-シャトル（tri-shuttle）ベクター（例えば、図3を参照のこと））。 ii. Host Vector Typically, a host vector is used to transform a host cell with a donor nucleic acid and the donor nucleic acid is propagated in the host cell. Thus, a host cell will generally contain or support the introduction of a host vector for transfer, maintenance, and modification of the donor nucleic acid within the host cell. In one embodiment, the host vector is to donor cells and from donor cells to host cells and recipient cells and other cells (eg, bacterial cells (eg, E. coli) used for cloning and propagation). A nucleic acid sequence to facilitate the transfer of the donor nucleic acid (eg, the tri-shuttle vector described in the Examples herein (see, eg, FIG. 3)).

一つの局面においては、ベクターは、1種類または複数種の所望の細胞のタイプの中でのベクターの複製を促進するために必要な任意の核酸（例えば、複製起点）と、異なる細胞のタイプとともに使用するための選択マーカーおよび/または耐性マーカーとを含む。   In one aspect, the vector can be used with any nucleic acid (eg, origin of replication) required to promote replication of the vector in one or more desired cell types, and different cell types. Including selectable markers and / or resistance markers for use.

耐性マーカーは周知である。当業者は、異なる宿主/ドナーの組み合わせについて適している耐性マーカーを決定することができると考えられる。いくつかの場合には、臨床的には関係がないマーカーを使用することが望ましい場合がある。他の場合は、耐性マーカーの選択は、ドナー、宿主、および/またはレシピエント細胞の特性に依存する。例えば、細胞壁を標的とする抗生物質は、細胞壁を持たないマイコプラズマおよび他の生物においては有用ではない場合がある。耐性マーカーの中には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、およびテトラサイクリン耐性）をコードする遺伝子、例えば、テトラサイクリン耐性タンパク質（TetM）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アミノグリコシド耐性タンパク質（aacA/aphD）、ならびにそれらの組み合わせがある。例えば、tet-耐性マーカーは、マイコプラズマのような細菌において有用であり、ここでは、テトラサイクリンは強い作用を有し、低いレベルの自然耐性を示す。ピューロマイシン耐性を付与する遺伝子もまた、例えば、マイコプラズマ核酸のクローニングおよび改変、ならびにマイコプラズマ細胞の使用のために、使用することができる。   Resistance markers are well known. One skilled in the art will be able to determine suitable resistance markers for different host / donor combinations. In some cases it may be desirable to use markers that are not clinically relevant. In other cases, the choice of resistance marker depends on the characteristics of the donor, host, and / or recipient cell. For example, antibiotics that target the cell wall may not be useful in mycoplasmas and other organisms that do not have a cell wall. Among resistance markers are genes encoding antibiotic resistance (eg, ampicillin resistance, kanamycin resistance, and tetracycline resistance), eg, tetracycline resistance protein (TetM), and chloramphenicol acetyltransferase (CAT), aminoglycoside resistance There are proteins (aacA / aphD), as well as combinations thereof. For example, tet-resistance markers are useful in bacteria such as mycoplasma, where tetracycline has a strong action and exhibits a low level of natural resistance. Genes that confer puromycin resistance can also be used, for example, for the cloning and modification of mycoplasma nucleic acids and the use of mycoplasma cells.

ピューロマイシンは、アミノアシル化されたtRNAの3'末端を模倣し、タンパク質合成を終結させるため、成長しつつあるタンパク質鎖のカルボキシル末端に付着する抗生物質である。ピューロマイシンは、細胞中の様々なtRNAの全てが使用するrRNA認識エレメントを徴収する（conscript）ので、自然な抗生物質耐性が、いくつかの場合には他のマーカーとともに起こり得る単純な点突然変異により獲得されうる可能性は低い。ピューロマイシンは容易に入手することができ、比較的安価であり、臨床においては使用されておらず、原核生物および真核生物の両方において翻訳の強力な阻害因子である。rRNAに基づく耐性が存在することは明らかにはなっていない。   Puromycin is an antibiotic that attaches to the carboxyl terminus of a growing protein chain to mimic the 3 'end of an aminoacylated tRNA and terminate protein synthesis. Puromycin conscripts the rRNA recognition elements used by all of the various tRNAs in the cell, so natural antibiotic resistance, in some cases with other markers, can be a simple point mutation Is unlikely to be acquired by Puromycin is readily available, is relatively inexpensive, is not used in clinical practice, and is a potent inhibitor of translation in both prokaryotes and eukaryotes. It is not clear that rRNA-based resistance exists.

コドン最適化されたカセットが、5種類のマイコプラズマ種においてピューロマイシン耐性を付与するために開発され、これは、シャトルベクター中でこれが機能するように、大腸菌の中で機能することができる。このカセットを作製するために、597bpのピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ85遺伝子（PAC）を、Smith et al, PNAS USA 100:15440-5（2003）に記載されているように、重複しているオリゴヌクレオチドを使用して合成する。簡単に説明すると、（M.ゲニタリウムの中での発現のために）コドン最適化したバージョンの両方の鎖をコードする5'リン酸化オリゴヌクレオチドを、IDT（Coralville, IA）に注文する。オリゴは、24塩基の重複を含む、48塩基88の長さである。上の鎖と下の鎖のオリゴを混合し、95℃に加熱し、ゆっくりと冷却して重複部分をアニーリングさせる。この反応物を12時間かけて連結し、PCRの鋳型として使用する。PCRアンプリコンを、pGEM-3Zf（+）（Promega, Madison, Wisconsin）にクローニングし、正確なPACクローンを同定するために配列決定する。その後、最適化したPAC遺伝子を、スピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）スピラリンプロモーター（Ps）の制御下にクローニングし、Mini-Tn4001tetの誘導体中のtetM遺伝子、ならびにpMyco1中のtetM遺伝子を置き換えるために使用する（Lartigue et al.（2003）, Nucleic Acids Res 31:6610-8）。新しいプラスミド（Mini-Tn4001PsPuro）は、M.ゲニタリウム、M.ガリセプチカム（M.gallisepticum）、およびM.ニューモニエを形質転換するために使用することができ、一方、pMycol誘導体（pMycoPuro）は、M.ミコイデスLCおよびM.カプリコルムを形質転換するために使用することができる。   A codon optimized cassette has been developed to confer puromycin resistance in five mycoplasma species, which can function in E. coli as it functions in a shuttle vector. To create this cassette, a 597 bp puromycin N-acetyltransferase 85 gene (PAC) was added to the overlapping oligos as described in Smith et al, PNAS USA 100: 15440-5 (2003). Synthesize using nucleotides. Briefly, 5 'phosphorylated oligonucleotides encoding both strands of codon optimized versions (for expression in M. genitalium) are ordered from IDT (Coralville, IA). The oligo is 48 bases 88 long, including a 24 base overlap. The upper and lower strand oligos are mixed, heated to 95 ° C. and slowly cooled to anneal the overlap. The reaction is ligated for 12 hours and used as a PCR template. PCR amplicons are cloned into pGEM-3Zf (+) (Promega, Madison, Wisconsin) and sequenced to identify the correct PAC clone. The optimized PAC gene is then cloned under the control of the Spiroplasma citri spiraline promoter (Ps) to replace the tetM gene in the derivative of Mini-Tn4001tet as well as the tetM gene in pMyco1 Used (Lartigue et al. (2003), Nucleic Acids Res 31: 6610-8). A new plasmid (Mini-Tn4001PsPuro) can be used to transform M. genitalium, M. gallisepticum, and M. pneumoniae, while the pMycol derivative (pMycoPuro) is used to transform M. mycoides. Can be used to transform LC and M. capricolum.

上記ベクターはさらに、上記ベクターとドナー核酸との連結を可能にする核酸を含む。一つの例においては、宿主ベクターは、相同組換えによる連結を容易にするための、ドナーゲノムまたは核酸の一部分に対する相同領域（例えば、ドナー核酸内の隣接領域に対して相同である直鎖状ベクターの3'および5'末端にある相同領域）を含む。別の例においては、上記宿主ベクターは、例えば、ドナー細胞内での、ドナー核酸への連結（例えば、挿入）を容易にするために、トランスポザーゼおよび/または逆位反復配列をコードする核酸を含む。宿主ベクターにはさらに、制限酵素認識部位と、宿主細胞および他の細胞内での複製および分離をサポートするための核酸とを含めることができる。   The vector further includes a nucleic acid that allows the vector and the donor nucleic acid to be linked. In one example, the host vector is a linear vector that is homologous to a donor genome or a portion of a nucleic acid (eg, a contiguous region within the donor nucleic acid) to facilitate ligation by homologous recombination. Homologous regions at the 3 ′ and 5 ′ ends of In another example, the host vector includes a nucleic acid encoding a transposase and / or inverted repeat sequence to facilitate ligation (eg, insertion) into the donor nucleic acid, eg, in a donor cell. . A host vector can further include a restriction enzyme recognition site and a nucleic acid to support replication and segregation in the host cell and other cells.

一つの局面においては、酵母宿主ベクターは、複製起点（例えば、pUC19由来の高コピーの起点）;一つまたは複数の耐性マーカーおよび/または選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子および選択可能な宿主細胞（例えば、酵母）マーカー）（例えば、宿主細胞中、ドナー細胞中、およびレシピエント細胞中での選択のためのマーカー）を含む。耐性マーカー/選択マーカーの例は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、および他の周知の抗生物質耐性遺伝子）、ならびに、他の抗生物質耐性遺伝子;選択可能な酵母もしくは他の宿主細胞のマーカー（例えば、HIS3）および/または選択マーカー;ドナー核酸への挿入を容易にするための核酸（例えば、マイコプラズマゲノムへの転位のための、トランスポザーゼおよび逆位反復配列）;宿主細胞の中での複製および分離をサポートするための核酸（例えば、自律複製配列（ARS）、セントロメア配列（CEN））である。一つの態様においては、ベクターは、テロメア配列を含む。   In one aspect, the yeast host vector is an origin of replication (eg, a high copy origin from pUC19); one or more resistance markers and / or selectable markers (eg, antibiotic resistance genes and selectable host cells). (Eg, yeast) markers) (eg, markers for selection in host cells, donor cells, and recipient cells). Examples of resistance / selection markers include antibiotic resistance genes (eg, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, and other well-known antibiotic resistance genes), as well as other antibiotic resistance genes; selectable yeast or other Host cell markers (eg, HIS3) and / or selectable markers; nucleic acids (eg, transposases and inverted repeats for translocation to the mycoplasma genome) to facilitate insertion into the donor nucleic acid; host cells Nucleic acids (eg, autonomously replicating sequences (ARS), centromere sequences (CEN)) to support replication and segregation. In one embodiment, the vector includes a telomere sequence.

例示的なベクターとしては、酵母セントロメアプラスミド（例えば、以下の実施例1A（i）（a）に記載し、図3Aに説明するpmycYACTn、および図3Bに示すように構築したminiTn-Puro-JCVI-1.7ベクターのような酵母人工染色体（YAC）ベクター）を含む酵母ベクターが挙げられる。pmycYACTnベクターの特徴としては、以下が挙げられる:（i）pUC19由来の高コピーの起点、および大腸菌中での増殖のためのアンピシリン耐性マーカー、（ii）IS256、（iii）大腸菌およびマイコプラズマの中での選択およびスクリーニングのための、いずれも、スピラリンプロモーターから発現されるtetMマーカーおよびlacZマーカー（16、17）、ならびに、（iv）酵母の中での複製および分離のためのARSおよびCEN、および選択可能な酵母マーカーとしてのHIS3。miniTn-Puro-JCVI-1.7ベクターは、以下のようにpmycYACTnとは異なる:（i）lacZを含まず、tetMがピューロマイシン耐性マーカーで置換されている。そして、（ii）大腸菌の中でのクローニングを可能にするための細菌の人工染色体（BAC）ベクターを含む。   Exemplary vectors include yeast centromere plasmids (eg, pmycYACTn described in Example 1A (i) (a) below and illustrated in FIG. 3A, and miniTn-Puro-JCVI- Yeast vectors containing yeast artificial chromosome (YAC) vectors such as 1.7 vectors). Features of the pmycYACTn vector include: (i) a high copy origin from pUC19, and an ampicillin resistance marker for growth in E. coli, (ii) IS256, (iii) in E. coli and mycoplasma Both for tetM and lacZ markers expressed from the spiraline promoter (16, 17), and (iv) ARS and CEN for replication and segregation in yeast, and HIS3 as a selectable yeast marker. The miniTn-Puro-JCVI-1.7 vector differs from pmycYACTn as follows: (i) It does not contain lacZ and tetM is replaced with a puromycin resistance marker. And (ii) a bacterial artificial chromosome (BAC) vector to enable cloning in E. coli.

iii.クローニングストラテジー:宿主核酸とドナー核酸の連結、およびドナーゲノムと核酸の宿主細胞への移入
本提供の移入方法においては、ドナーゲノムまたは他の核酸を宿主核酸（典型的には、宿主ベクター）に連結して、宿主細胞の中で増殖させ、操作することができる、ドナー核酸と宿主核酸とを含む核酸を作製する。宿主核酸とドナー核酸の連結は、周知のクローニング方法を引用して、多数のアプローチを使用して行うことができる。3つの一般的アプローチを以下にさらに詳細に記載する。 iii. Cloning Strategy: Host Nucleic Acid and Donor Nucleic Acid Ligation and Transfer of Donor Genome and Nucleic Acid to Host Cell In the provided transfer method, the donor genome or other nucleic acid is transformed into a host nucleic acid (typically a host vector). To a nucleic acid comprising a donor nucleic acid and a host nucleic acid that can be propagated and manipulated in a host cell. Linking host and donor nucleic acids can be accomplished using a number of approaches, citing well-known cloning methods. Three general approaches are described in further detail below.

上記に記載したように、酵母細胞は例示的な宿主細胞である。大きいDNA分子が、酵母セントロメア（CEN）の付加により酵母に安定にクローニングされている。酵母セントロメアは、酵母染色体に沿って分子を分離することができる。このような分子は、末端へのテロメアの付加により直鎖形態でクローニングされており、また、環状としてもクローニングされている。細菌のゲノムは一般的には環状であり、環を直鎖状の酵母染色体から容易に分離することができるので、これは、細菌のゲノムを環状のものとしてクローニングするために有利であり得る。   As described above, yeast cells are exemplary host cells. Large DNA molecules have been stably cloned into yeast by the addition of yeast centromere (CEN). Yeast centromeres can separate molecules along the yeast chromosome. Such molecules have been cloned in linear form by the addition of telomeres at the ends, and have also been cloned as circular. This can be advantageous for cloning bacterial genomes as circular, since the bacterial genome is generally circular and the circle can be easily separated from the linear yeast chromosome.

ドナーゲノムおよび核酸を宿主ベクターと連結させるための第1のアプローチにおいては、ドナーゲノムを、ドナー細胞またはドナーと類似している他のタイプの細胞の中で宿主ベクターに連結させ、続いて、ドナーゲノムと宿主ベクターとを含む核酸を単離し、その後、宿主細胞に移入する。一例を図1に説明する。このアプローチは、例えば、宿主細胞にゲノムおよび他の大きな核酸を移入するために使用することができる。一つの例においては、宿主ベクターは、細胞の中でのドナーゲノムまたは他の核酸への挿入を容易にするための、逆位反復配列および/またはトランスポザーゼをコードする核酸を含む。   In the first approach for linking a donor genome and nucleic acid to a host vector, the donor genome is linked to the host vector in a donor cell or other type of cell similar to the donor, followed by the donor Nucleic acids containing the genome and host vector are isolated and then transferred to the host cell. An example is illustrated in FIG. This approach can be used, for example, to transfer genomes and other large nucleic acids into host cells. In one example, the host vector includes a nucleic acid encoding an inverted repeat and / or transposase to facilitate insertion into the donor genome or other nucleic acid in the cell.

ドナー核酸と宿主核酸とを、ドナー細胞またはドナーと類似している細胞（例えば、同じ属の異なる種）の中で連結することは利点をもたらす。例えば、これにより、ドナー細胞の生存能力を低下させるかもしくはそうでなければドナー細胞の生存能力に影響を与えることがない、またはそのような可能性がないベクターの挿入（例えば、ドナー核酸の長さ方向に沿ったベクターの挿入の部位）を選択することができる。しかし、このアプローチには、ベクターをドナー核酸（例えば、ゲノム）に組込むことができるように、ドナーまたは類似する細胞が、外来核酸の導入（例えば、形質転換）に適していることが必要である。様々なタイプの細胞への核酸の導入のための様々なアプローチが周知である。一つの例においては、以下の実施例1Aに記載するように、酵母宿主ベクターにより、PEGの存在下で細菌細胞を形質転換する。ドナー核酸が組込まれた宿主ベクターを含有するドナー細胞を、例えば、宿主ベクター中の耐性マーカーまたは他の選択マーカーに基づいて選択する。核酸は、宿主ベクターの挿入の確認のために、例えば、上記に記載したようなアガロースプラグの中で、例えば、本明細書中に記載するようなPCRまたはサザンブロットにより、ドナー細胞から単離することができる。一つの局面においては、核酸を移植することができ、かつこの核酸が特定のレシピエント細胞と適合することを確認するために、宿主細胞への移入の前に、ドナーゲノムと宿主ベクターとを含む核酸をレシピエント細胞に移植する。例えば、一つの細菌種から別の細菌種へのゲノムDNAの移植は、Lartigue et al., Science 317, 632（2007）に記載されているように、および以下の実施例1A（ii）（b）に記載するように行うことができる。   Linking a donor nucleic acid and a host nucleic acid in a donor cell or cells similar to the donor (eg, different species of the same genus) provides advantages. For example, this may reduce the viability of the donor cell or otherwise insert the vector (eg, the length of the donor nucleic acid) that will not affect or otherwise affect the viability of the donor cell. The site of vector insertion along the length direction) can be selected. However, this approach requires that the donor or similar cell be suitable for the introduction (eg, transformation) of the foreign nucleic acid so that the vector can be integrated into the donor nucleic acid (eg, the genome). . Various approaches for introducing nucleic acids into various types of cells are well known. In one example, bacterial cells are transformed in the presence of PEG with a yeast host vector as described in Example 1A below. Donor cells containing a host vector into which the donor nucleic acid has been integrated are selected, for example, based on resistance markers or other selectable markers in the host vector. Nucleic acids are isolated from donor cells for confirmation of host vector insertion, for example, in an agarose plug as described above, eg, by PCR or Southern blot as described herein. be able to. In one aspect, the donor genome and host vector are included prior to transfer to a host cell to ensure that the nucleic acid can be transplanted and that the nucleic acid is compatible with a particular recipient cell. The nucleic acid is transplanted into the recipient cell. For example, the transfer of genomic DNA from one bacterial species to another is described as described in Lartigue et al., Science 317, 632 (2007) and in the following Example 1A (ii) (b ).

図2Aに説明する実施例においては、直鎖状の酵母宿主ベクターを、細菌細胞の中で環状の細菌ゲノムに連結する。得られる環状の核酸は、例えば、上記のようにアガロースプラグの中で単離され、これで酵母宿主細胞を形質転換する。このプロセスの一例を、以下の実施例1Aに記載する。   In the example illustrated in FIG. 2A, a linear yeast host vector is ligated into a circular bacterial genome in bacterial cells. The resulting circular nucleic acid is isolated, for example, in an agarose plug as described above, which transforms yeast host cells. An example of this process is described in Example 1A below.

第2のアプローチ（その一例を図2Bに説明する）においては、ドナーゲノムと宿主ベクターとで、宿主細胞を同時に形質転換するか、一緒に形質転換するか、または別々に形質転換する。その際、これらは宿主細胞内で、例えば、相同組換えにより連結する。このアプローチは、その単純さにおいて有利であり、これには、最小限の試料の取り扱いと、最小限の工程が伴う。典型的には、図2Bに示すように、ベクターを、相同組換えによりドナーゲノムまたは核酸に挿入する。   In the second approach (an example of which is illustrated in FIG. 2B), host cells are transformed simultaneously, together, or separately with the donor genome and the host vector. These are then ligated in the host cell, for example by homologous recombination. This approach is advantageous in its simplicity, which involves minimal sample handling and minimal steps. Typically, as shown in FIG. 2B, the vector is inserted into the donor genome or nucleic acid by homologous recombination.

図2Bに示す例においては、直鎖状の酵母宿主ベクターと、環状の細菌のゲノム（例えば、合成のゲノム、またはドナー細胞から、例えば、上記に記載するようにアガロースプラグの中で単離したもの）とで酵母宿主細胞を同時形質転換する。典型的には、宿主ベクターは、ドナーゲノムまたは核酸に対する相同領域を含む。図2Bに示す例においては、直鎖状の酵母ベクターは、それぞれの末端に、細菌のゲノムの一部分に対する相同領域を含む。一つの例においては、図2Bに示すように、細菌のゲノムは、宿主細胞の形質転換の前に、宿主ベクターに対する相同領域の近くで切断を行う制限酵素で切断する。このプロセスにより、ベクターの挿入部位の近くに二本鎖の断裂が生じ、宿主細胞内での（ゲノムへのベクターの挿入による）宿主ベクターとドナーゲノムの連結の効率が大幅に改善する。典型的には、その部位でのベクターの挿入後にゲノムまたは核酸の完全性を維持することと適合する制限酵素認識部位を、ドナーゲノムまたは他の核酸の中で選択する。このプロセスの一例を以下の実施例1Bに記載する。   In the example shown in FIG. 2B, a linear yeast host vector and a circular bacterial genome (eg, a synthetic genome, or isolated from a donor cell, eg, in an agarose plug as described above) ) And co-transform yeast host cells. Typically, the host vector contains a region of homology to the donor genome or nucleic acid. In the example shown in FIG. 2B, the linear yeast vector contains at each end a region of homology to a portion of the bacterial genome. In one example, as shown in FIG. 2B, the bacterial genome is cleaved with a restriction enzyme that cleaves near the region of homology to the host vector prior to transformation of the host cell. This process results in double-strand breaks near the insertion site of the vector and greatly improves the efficiency of ligation of the host vector and donor genome (by insertion of the vector into the genome) within the host cell. Typically, restriction enzyme recognition sites are selected in the donor genome or other nucleic acid that are compatible with maintaining the integrity of the genome or nucleic acid after insertion of the vector at that site. An example of this process is described in Example 1B below.

第2のアプローチの改変である第3のアプローチの一例を、図2Cに説明する。このアプローチは、宿主細胞を、宿主ベクターと、複数の重複している核酸断片（これらは、ドナーゲノムまたは核酸の断片である）とで同時形質転換することにより行う。言い換えると、これらの断片はそれぞれ、ドナーゲノムまたは核酸の一つの領域に対する相同性を含み、上記相同領域は、上記ドナーゲノムまたは核酸の長さ方向に沿って重複する。宿主細胞の形質転換時に、上記断片およびベクターは、例えば、相同領域を介した相同組換えにより組換わる。   An example of a third approach, which is a modification of the second approach, is illustrated in FIG. 2C. This approach is performed by co-transforming a host cell with a host vector and a plurality of overlapping nucleic acid fragments, which are donor genomes or nucleic acid fragments. In other words, each of these fragments contains homology to a region of the donor genome or nucleic acid that overlaps along the length of the donor genome or nucleic acid. Upon transformation of the host cell, the above fragments and vectors are recombined by, for example, homologous recombination via a homologous region.

図2Cに説明する例においては、環状の細菌のドナーゲノムの重複している断片と、直鎖状の酵母ベクターとで酵母宿主細胞を同時形質転換する。さらに、上記酵母ベクターは、細菌のゲノムの一部分に対する相同領域をその末端に含む。ドナーゲノムの断片と酵母宿主ベクターとを宿主細胞に導入すると、上記断片とベクターとが組換わり、これにより、ドナーゲノムと宿主ベクターが連結する。一例を、以下の実施例1Cに記載する。   In the example illustrated in FIG. 2C, yeast host cells are co-transformed with overlapping fragments of a circular bacterial donor genome and a linear yeast vector. Furthermore, the yeast vector contains at its end a region of homology to a portion of the bacterial genome. When a donor genome fragment and a yeast host vector are introduced into a host cell, the fragment and the vector are recombined, thereby connecting the donor genome and the host vector. An example is described in Example 1C below.

いくつかの態様においては、宿主ベクターとの連結の後（例えば、第1のアプローチ）または前（例えば、第2および第3のアプローチ）のいずれにおいても、上記のように、ドナー核酸をドナー細胞または類似する細胞から単離する。例えば、ゲノムを含む大きなドナー核酸は、ドナーおよび他の細胞から、上記に記載したようにアガロースプラグの中で単離することができる。単離または合成、およびアセンブリの後、ドナー核酸で宿主細胞を形質転換する。宿主ベクターは、ドナー核酸に予め連結しない場合は、同じ形質転換方法を使用して、同時に、またはいずれかの順序で連続して宿主細胞へと形質転換により導入することができる。   In some embodiments, the donor nucleic acid is transferred to the donor cell either as described above, either after (eg, the first approach) or before (eg, the second and third approaches) with the host vector. Or isolated from similar cells. For example, large donor nucleic acids containing the genome can be isolated from donors and other cells in agarose plugs as described above. After isolation or synthesis and assembly, host cells are transformed with the donor nucleic acid. If the host vector is not pre-linked to the donor nucleic acid, it can be introduced into the host cell by transformation using the same transformation method, simultaneously or sequentially in any order.

形質転換方法は当技術分野で周知であり、宿主細胞に応じて変わると考えられる。一つの例においては、宿主細胞が酵母宿主細胞である場合は、酵母スフェロプラストを、例えば、以下に記載するように酵母宿主細胞から調製し、核酸をこのスフェロプラストと混合することにより形質転換する。いくつかの場合には、形質転換は、PEGの存在下で行う。例えば、ドナー核酸および/または宿主ベクターを、室温で10分間、スフェロプラストとともにインキュベーションし、続いて、800μLのPEG 8000を添加し、室温でさらに10分間、反転させることにより穏やかに混合することができる。   Transformation methods are well known in the art and will vary depending on the host cell. In one example, if the host cell is a yeast host cell, yeast spheroplasts are prepared from the yeast host cell, eg, as described below, and the nucleic acid is mixed with the spheroplast to transform the yeast cell. Convert. In some cases, transformation is performed in the presence of PEG. For example, donor nucleic acids and / or host vectors can be incubated with spheroplasts for 10 minutes at room temperature, followed by gentle mixing by adding 800 μL of PEG 8000 and inverting for an additional 10 minutes at room temperature. it can.

一つの例においては、スフェロプラストの調製および形質転換を、Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371（2008）に記載されているように行う。増殖させる細胞のODを変更することができる。これらの方法を用いる場合は、形質転換の前に、酵母培地を、酵母宿主の単細胞コロニーとともに接種し、適切なOD660に達するまで、十分なエアレーションを確保するために激しく振盪させながら、30℃で一晩増殖させる。試料を遠心分離し、ボルテックスにより撹拌することによりソルビトール中に再度懸濁し、遠心分離し、例えば、SPE溶液（1Mのソルビトール、0.01Mのリン酸ナトリウム、0.01MのNa₂EDTA（pH 7.5））中に再度懸濁することができる。酵母の細胞壁を、例えば、Zymolase（商標）を使用して除去する。スフェロプラスト化のレベルは、2％のSDS溶液（この中でスフェロプラストを溶解させる）に対して、ソルビトール溶液中での細胞懸濁液の光学密度の比較により評価することができる。スフェロプラストを遠心分離し、極めて穏やかに振盪させることにより1Mのソルビトール中に再度懸濁し、洗浄し、そしてSTC溶液（1Mのソルビトール、0.01MのTris-HCl、0.01MのCaCl₂（pH 7.5））中に再度懸濁することができる。形質転換は、任意でPEGの存在下で、上記に記載するように、核酸をスフェロプラストと混合することにより行う。 In one example, the preparation and transformation of spheroplasts is performed as described in Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371 (2008). The OD of cells to be grown can be changed. When using these methods, prior to transformation, inoculate the yeast medium with single cell colonies of the yeast host and at 30 ° C with vigorous shaking to ensure adequate aeration until the appropriate OD660 is reached. Grow overnight. The sample is centrifuged, resuspended in sorbitol by vortexing, centrifuged, eg, SPE solution (1M sorbitol, 0.01M sodium phosphate, 0.01M Na ₂ EDTA, pH 7.5) It can be resuspended in. The yeast cell wall is removed using, for example, Zymolase ™. The level of spheroplasting can be assessed by comparing the optical density of the cell suspension in the sorbitol solution to the 2% SDS solution in which the spheroplast is dissolved. The spheroplasts are centrifuged, resuspended in 1 M sorbitol by shaking very gently, washed and STC solution (1 M sorbitol, 0.01 M Tris-HCl, 0.01 M CaCl ₂ (pH 7.5) )) Can be suspended again. Transformation is performed by mixing the nucleic acid with spheroplasts, as described above, optionally in the presence of PEG.

形質転換後、典型的には、ドナー核酸と宿主ベクターとによりうまく形質転換された細胞を選択するための選択手順を行う。例えば、上記プロセスにおいては、形質転換後に、スフェロプラストを遠心分離し、SOS溶液中に再度懸濁し、30℃で40分間、振盪させずにインキュベーションすることができる。スフェロプラストを選択培地（例えば、本明細書中に記載する融解させたSORB-TOP-His選択培地）中に入れ、50℃で平衡化させ、選択培地を含有するプレート上に播種し、形質転換体を見ることができるようになるまで、例えば、30℃で増殖させることができる。   After transformation, a selection procedure is typically performed to select cells that have been successfully transformed with the donor nucleic acid and the host vector. For example, in the above process, after transformation, spheroplasts can be centrifuged, resuspended in SOS solution, and incubated at 30 ° C. for 40 minutes without shaking. Spheroplasts are placed in selective media (eg, thawed SORB-TOP-His selective media described herein), equilibrated at 50 ° C., seeded on plates containing selective media, It can be grown, for example, at 30 ° C. until the transformants can be seen.

iv.宿主細胞からのドナー核酸の単離および分析
本提供の方法を用いて、宿主細胞を形質転換させたドナー核酸を、本提供の改変方法による宿主細胞内での改変の前および後の両方で、単離し、分析することができる。ドナー細胞および他の細胞からの単離を用いる場合は、単離方法は、細胞のタイプに応じて異なると考えられる。いくつかの例においては、例えば、ドナー核酸を単離するかまたは富化させるために、天然の宿主核酸を、単離した核酸試料から除去するかまたは減少させる。このプロセスは、染色体宿主DNAを除去するためのプレ電気泳動により、または宿主核酸を消化するがドナー核酸は消化しない制限酵素での消化により行うことができる。 iv. Isolation and Analysis of Donor Nucleic Acids from Host Cells Using the provided methods, donor nucleic acids transformed into host cells can be used both before and after modification in host cells by the provided modified methods. Can be isolated and analyzed. When using isolation from donor cells and other cells, the isolation method will vary depending on the cell type. In some examples, the native host nucleic acid is removed or reduced from the isolated nucleic acid sample, eg, to isolate or enrich the donor nucleic acid. This process can be performed by pre-electrophoresis to remove chromosomal host DNA or by digestion with a restriction enzyme that digests the host nucleic acid but not the donor nucleic acid.

一つの例においては、ドナー核酸を、例えば、Bio-Rad CHEF-DR IIIのマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用し、そして本明細書中の実施例に記載するように、アガロースプラグの中で単離する。いくつかの例においては、宿主細胞由来のDNAを含有しているアガロースプラグを、酵母宿主の染色体DNAを除去するために、数時間、一定の電圧でプレ電気泳動する。一つの局面においては、宿主DNAの除去は、最初に、AsiSI、FseI、およびRsrII、または酵母染色体を切断するがドナー核酸（例えば、M.ゲニタリウムまたはM.ミコイデスLC）中には認識部位を有さない他の酵素によって、プラグの中でDNAを消化することにより、行うことができる。   In one example, donor nucleic acid is agarose using, for example, the Bio-Rad CHEF-DR III manual protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” and as described in the Examples herein. Isolate in plug. In some examples, agarose plugs containing DNA from host cells are pre-electrophoresed at a constant voltage for several hours to remove yeast host chromosomal DNA. In one aspect, removal of host DNA initially cleaves AsiSI, FseI, and RsrII, or yeast chromosomes but has a recognition site in the donor nucleic acid (eg, M. genitalium or M. mycoides LC). This can be done by digesting the DNA in the plug with other enzymes that do not.

ドナー核酸の分析は、DNAを分析するための多数の周知の方法のうちのいずれかにより行うことができる。典型的には、核酸のサイズおよび/または配列、ならびにベクターおよび他の核酸の正確な挿入および方向を確認する（任意の改変の確認を含む）ための方法を実施することが所望される。一つの例においては、単離したDNAを、加熱および/または制限酵素消化により直線化し、続いて、ゲル電気泳動（例えば、フィールド・インバージョン電気泳動（Bio-Rad FIGE Mapper）またはパルスフィールド電気泳動（Bio-Rad CHEF-DR IIもしくはIIIシステム））による分離を行う。   Analysis of the donor nucleic acid can be performed by any of a number of well-known methods for analyzing DNA. Typically, it is desirable to implement a method for confirming the size and / or sequence of nucleic acids and the correct insertion and orientation of vectors and other nucleic acids, including confirmation of any modifications. In one example, isolated DNA is linearized by heating and / or restriction enzyme digestion followed by gel electrophoresis (eg, Field-Inversion Electrophoresis (Bio-Rad FIGE Mapper) or pulsed field electrophoresis). (Bio-Rad CHEF-DR II or III system)).

分析は、所望されるドナー核酸または改変されたドナー核酸の長さ方向に沿って様々な領域に結合するように設計したプライマーを用いるPCR（例えば、マルチプレックスPCR）により行うことができる。典型的には、プライマーはまた、宿主ベクターを認識するように設計する。他の例においては、分析は、ゲル上での単離した核酸のサイズの観察により、または制限酵素消化と、サザンブロットもしくはGibson et al., Science 319, 1215（2008）に記載されているような他のハイブリダイゼーション法とを実施することにより行う。単離したドナーゲノムのMPCRおよびサザンブロット分析の特別な例を実施例に記載する。分析方法の改変は、当業者には明らかであると考えられる。配列決定方法は周知であり、宿主細胞に導入し、増幅させたドナー核酸を分析するためにも使用することができる。   The analysis can be performed by PCR (eg, multiplex PCR) using primers designed to bind to various regions along the length of the desired or modified donor nucleic acid. Typically, the primer is also designed to recognize the host vector. In other examples, the analysis is by observation of the size of the isolated nucleic acid on a gel or by restriction enzyme digestion and as described in Southern blots or Gibson et al., Science 319, 1215 (2008). And other hybridization methods. Specific examples of MPCR and Southern blot analysis of isolated donor genomes are described in the examples. Modifications to the analytical method will be apparent to those skilled in the art. Sequencing methods are well known and can also be used to analyze donor nucleic acids introduced into host cells and amplified.

v.複数のドナーゲノムを含有している宿主細胞の作製
一つの態様においては、複数のドナー核酸（例えば、異なるドナーに由来する複数のゲノム）を、単一の宿主細胞に導入する。一つの局面においては、一つのドナーゲノムまたは他のドナー核酸を含有する宿主細胞を、異なるドナーに由来する核酸が導入された別のそのような宿主細胞と交配して、両方の核酸を含有する宿主細胞を作製する。例えば、異なるドナーに由来する2つのドナーゲノム（例えば、異なる種に由来する2つのマイコプラズマゲノム）を含有している二倍体酵母株は、それぞれが一つのドナーゲノムを持っている2つの異なる一倍体株同士を接合させることにより作製することができる。一倍体酵母株の接合は、周知の方法を使用して行うことができる。接合後に両方のゲノムを含有している細胞の選択ができるように、多数の異なる選択マーカーをそれぞれの一倍体において使用することができる。例えば、HIS3マーカーとTRPマーカーとを、異なるドナーゲノムを持っている2種類の異なる一倍体細胞にそれぞれ導入することができ、続いて、本明細書中で実施例に記載するように、ヒスチジンおよびトリプトファンを含まない培地上で二倍体細胞を選択することができる。 v. Generation of host cells containing multiple donor genomes In one embodiment, multiple donor nucleic acids (eg, multiple genomes from different donors) are introduced into a single host cell. In one aspect, a host cell containing one donor genome or other donor nucleic acid is crossed with another such host cell into which nucleic acid from a different donor has been introduced to contain both nucleic acids. Create a host cell. For example, a diploid yeast strain that contains two donor genomes from different donors (eg, two mycoplasma genomes from different species) has two different ones, each with one donor genome. It can be prepared by joining polyploid strains. Conjugation of haploid yeast strains can be performed using well-known methods. A number of different selectable markers can be used in each haploid so that cells containing both genomes can be selected after conjugation. For example, the HIS3 marker and the TRP marker can each be introduced into two different haploid cells having different donor genomes, followed by histidine, as described in the Examples herein. And diploid cells can be selected on medium without tryptophan.

E.宿主細胞中でのドナーゲノムの改変
中でも、宿主細胞の中でドナーゲノムおよび他の核酸を改変するための方法ならびに核酸が、提供する態様である。一つの態様においては、この方法は、一つまたは複数の標的化構築物をドナー核酸に導入することにより行う。上記構築物は、ドナー核酸に対する相同部分、耐性遺伝子、選択マーカー、酵素（例えば、制限酵素）をコードする核酸、制限酵素部位、ならびに/またはクローニングおよび相同組換えに使用する他の核酸を含む。典型的には、上記構築物を、ドナー核酸を含有している宿主細胞に導入する。 E. Modification of Donor Genomes in Host Cells Among other things, methods and nucleic acids are provided for modifying donor genomes and other nucleic acids in host cells. In one embodiment, the method is performed by introducing one or more targeting constructs into the donor nucleic acid. The construct includes a homologous portion to the donor nucleic acid, a resistance gene, a selectable marker, a nucleic acid encoding an enzyme (eg, a restriction enzyme), a restriction enzyme site, and / or other nucleic acids used for cloning and homologous recombination. Typically, the construct is introduced into a host cell containing a donor nucleic acid.

上記構築物を設計するために、ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）の標的領域を改変のために選択する。上記方法によって、標的領域の個々の残基を改変することは必ずしも必要ではない。例えば、標的領域内の一つもしくは複数の標的部分または標的部位を改変することができる。改変としては、標的領域内の一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、突然変異、置換、および/または他の改変が挙げられる。一つの局面においては、ドナー核酸をシームレスに改変する。   To design the construct, a target region of a donor nucleic acid (eg, donor genome) is selected for modification. It is not necessary to modify individual residues in the target region by the above method. For example, one or more target portions or target sites within the target region can be modified. Modifications include insertions, deletions, mutations, substitutions, and / or other modifications of one or more nucleotides within the target region. In one aspect, the donor nucleic acid is modified seamlessly.

典型的には、標的領域またはその一部分を、マーカー（例えば、対抗選択マーカー）を含む核酸構築物で最初に置き換える。その後、上記マーカーを上記核酸から、上記マーカーを欠失させること、または別のヌクレオチド配列で上記マーカーを置き換えることにより除去する。一つの局面においては、マーカーと周辺部分を、マーカー付近にあるかもしくはマーカーに隣接する標的領域の一部に対して相同性を有している第2の核酸構築物を導入することにより置き換える。この第2の構築物は、標的領域の一部に対して100％未満の相同である必要はない。例えば、上記構築物は、標的領域の一部分と比較して、一つもしくは複数の突然変異、欠失、または挿入を含み得、これにより、標的領域を上記構築物で置き換えて改変する。上記方法は、典型的には、一つまたは複数の相同組換え工程を含む。   Typically, the target region or a portion thereof is first replaced with a nucleic acid construct that includes a marker (eg, a counterselectable marker). The marker is then removed from the nucleic acid by deleting the marker or replacing the marker with another nucleotide sequence. In one aspect, the marker and surrounding portions are replaced by introducing a second nucleic acid construct that has homology to a portion of the target region that is near or adjacent to the marker. This second construct need not be less than 100% homologous to a portion of the target region. For example, the construct may include one or more mutations, deletions, or insertions compared to a portion of the target region, thereby modifying the target region by replacing it with the construct. Such methods typically include one or more homologous recombination steps.

一つの局面においては、マーカーの除去は、マーカーを持つ構築物を含むドナー核酸の核酸配列中に断裂（例えば、二本鎖の断裂）を導入することにより促進される。この断裂は、標的領域の近くに、例えば、標的領域に隣接して、または標的領域内に導入する。典型的には、上記断裂は、所望の核酸配列を認識し、切断する酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を誘導により発現させることによって作製する。典型的には、上記酵素は、標的領域内の、または標的領域に挿入した構築物の核酸によりコードされる。   In one aspect, removal of the marker is facilitated by introducing a break (eg, a double stranded break) into the nucleic acid sequence of the donor nucleic acid comprising the marker bearing construct. This tear is introduced near the target area, for example adjacent to or within the target area. Typically, the break is made by inducing expression of an enzyme (eg, endonuclease) that recognizes and cleaves the desired nucleic acid sequence. Typically, the enzyme is encoded by a nucleic acid of a construct within or inserted into the target region.

一つの局面においては、マーカーの除去は、ドナー核酸に核酸配列を導入することにより促進される。この場合、核酸配列の挿入により、標的領域またはその一部の側方にタンデム反復領域が生じる。典型的には、上記核酸配列は、標的化構築物の一部として含まれる。   In one aspect, marker removal is facilitated by introducing a nucleic acid sequence into the donor nucleic acid. In this case, the insertion of the nucleic acid sequence results in a tandem repeat region on the side of the target region or part thereof. Typically, the nucleic acid sequence is included as part of a targeting construct.

一つの態様においては、上記方法は、断裂の導入と、タンデム反復領域を生じる配列の導入との両方を含む。一つの局面においては、上記方法は、エンドヌクレアーゼ切断を伴うタンデム反復（Tandem Repeat with Endonuclease Cleavage）（TREC）法であり、ここでは、誘導により発現された酵素によって生じる二本鎖の断裂とタンデム反復とを、組換え事象を促進し、損傷および望ましくない突然変異を回避するために使用する。   In one embodiment, the method includes both the introduction of a break and the introduction of a sequence that produces a tandem repeat region. In one aspect, the method is a Tandem Repeat with Endonuclease Cleavage (TREC) method, where double-strand breaks and tandem repeats caused by an enzyme expressed by induction Are used to promote recombination events and avoid damage and unwanted mutations.

本提供の方法は、特に、異なる種、属、および目の宿主の中でのドナー核酸の改変のための、従来の方法および他の利用できる方法と比較して利点をもたらす。一つの局面においては、ドナー核酸（乏しい遺伝子システムを有しているドナー生物に由来し得る）を、恵まれた遺伝子システムを有している宿主（例えば、酵母宿主細胞）内で、例えば、相同組換え法により改変する。例えば、数百kbの長さの核酸断片を、周知の方法と標準的な遺伝学的ツール（直鎖状および環状の形態の酵母人工染色体（YAC））とを使用して、酵母（サッカロミセス・セレビジエ）宿主細胞にクローニングし、操作することができる。改変したドナー核酸のレシピエント細胞（もとの細胞および異なる種の細胞を含む）への移植は、例えば、遺伝子および遺伝子調節の機能的研究に、ならびに改変した遺伝子産物の産生に使用することができる。本提供の方法は、遺伝学的に扱いにくい生物に由来するゲノムを変更および改変するために、宿主細胞中でドナーゲノムの改変をうまく行うために使用することができる。   The provided methods provide advantages compared to conventional and other available methods, particularly for modification of donor nucleic acids in different species, genera, and eye hosts. In one aspect, a donor nucleic acid (which may be derived from a donor organism having a poor genetic system) is transferred into a host (eg, a yeast host cell) having a privileged genetic system, eg, a homologous set. Modify by the replacement method. For example, several hundred kb long nucleic acid fragments can be obtained using well-known methods and standard genetic tools (linear and circular forms of yeast artificial chromosomes (YACs)) using yeast (Saccharomyces cerevisiae). Cerevisiae) can be cloned into a host cell and manipulated. Transplantation of the modified donor nucleic acid into recipient cells (including the original cell and cells of different species) can be used, for example, for functional studies of genes and gene regulation and for the production of modified gene products. it can. The provided methods can be used to successfully modify a donor genome in a host cell to alter and modify a genome derived from a genetically tractable organism.

以下に記載するように、上記改変方法は、ワクチン、薬物、生物学的タンパク質、および化学物質、バイオ燃料、およびタンパク質治療薬（例えば、酵素および抗生物質）の産生のような、商業的に有用であるゲノム、生物、および商業的に有用な生物により産生される遺伝子産物を産生するために使用することができる。一つの例においては、ドナーゲノムは、免疫応答を誘発するための新しい免疫学的組成物（例えば、生存しているウイルスおよび他の免疫原）を産生するように改変する。別の例においては、ドナーゲノムは、バイオ燃料の産生のために、例えば、油の生合成経路に関与している酵素をコードするDNAを導入することにより、例えば、バイオ燃料の産生のための遺伝子で、代謝経路の遺伝子を置き換えることにより改変する。一つの例においては、ドナーゲノム（例えば、光合成細菌のドナーゲノム）は、レシピエント細胞に移植すると、レシピエント細胞が、通常の光合成産物（例えば、グルコース）の代わりにバイオ燃料を産生するように改変する。他の用途を本明細書中以下で考察する。したがって、本提供の方法を、合成の細菌のゲノムをインビボで（例えば、酵母宿主細胞中で）直接変更するまたは再設計し直すために使用することができる。   As described below, the modified methods are commercially useful, such as the production of vaccines, drugs, biological proteins, and chemicals, biofuels, and protein therapeutics (eg, enzymes and antibiotics). Can be used to produce gene products produced by genomes, organisms, and commercially useful organisms. In one example, the donor genome is modified to produce new immunological compositions (eg, live viruses and other immunogens) to elicit an immune response. In another example, the donor genome is used for biofuel production, for example by introducing DNA encoding an enzyme involved in the oil biosynthetic pathway, for example for biofuel production. The gene is modified by replacing a gene in the metabolic pathway. In one example, a donor genome (eg, a donor genome of a photosynthetic bacterium) is transplanted into a recipient cell so that the recipient cell produces biofuel instead of a normal photosynthetic product (eg, glucose). Modify. Other uses are discussed herein below. Thus, the provided methods can be used to directly modify or redesign a synthetic bacterial genome in vivo (eg, in a yeast host cell).

本提供の改変方法は、そうでなければ異なる種の宿主細胞の中で操作されるドナー核酸の不安定性および望ましくない突然変異を生じる可能性がある、ドナーと異なる種の宿主生物との間での不和合性の問題を克服するための局面を含む。例えば、ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）を宿主細胞に導入する場合は、ドナー核酸は、典型的には、宿主細胞の生存能力には寄与しないか、または、クローニングベクター中に存在する個々の選択マーカーとは別に、宿主の生存能力には寄与しない。これは、ドナーと宿主とが異なるタイプの生物（例えば、異なる目または界の生物）である場合、例えば、ドナーが原核生物であり、宿主が真核生物（例えば、酵母）である場合には、特にそのとおりである。例えば、以下の実施例4に記載する実験において考察するように、酵母の中で環状YAC（ヒスチジンマーカーを持つ）として増殖させたM.ゲニタリウムのゲノムは、ヒスチジン栄養要求性を除き、その宿主との機能相補を有さない。細菌のゲノム中の任意の欠失および再構成は、酵母宿主にとってはおそらく無害（neutral）である。   The provided modification methods can be used between a donor and a different species of host organism, which can result in instability and undesirable mutations in the donor nucleic acid that would otherwise be manipulated in different species of host cells. Including aspects to overcome the problem of incompatibility. For example, when introducing a donor nucleic acid (eg, a donor genome) into a host cell, the donor nucleic acid typically does not contribute to the viability of the host cell or is an individual selection present in a cloning vector. Apart from the marker, it does not contribute to the viability of the host. This is the case when the donor and the host are different types of organisms (eg organisms of different eyes or worlds), for example when the donor is prokaryotic and the host is eukaryotic (eg yeast) That is especially true. For example, as discussed in the experiments described in Example 4 below, the genome of M. genitalium grown in yeast as a circular YAC (having a histidine marker), with the exception of histidine auxotrophy, It does not have functional complements. Any deletions and rearrangements in the bacterial genome are probably neutral to the yeast host.

利用できる方法を用いる場合は、宿主細胞は、生存能力をドナー核酸の完全性には依存しないので、これを宿主細胞中で操作する際の、ドナー核酸に対する望ましくない突然変異および損傷のリスクが高い。本提供の方法はこれらの問題を克服し、宿主細胞内でドナーゲノムを増殖させ、改変するために使用し、それと同時に、ドナーゲノム内での望ましくない突然変異のリスクを最小限にすることができる。本提供の方法は、酵母宿主細胞中にクローニングしたドナーゲノム（例えば、細菌のゲノム）を、高い効率で正確に改変することができる。   When available methods are used, the host cell is not dependent on the integrity of the donor nucleic acid, so there is a high risk of unwanted mutations and damage to the donor nucleic acid when it is manipulated in the host cell. . The provided method overcomes these problems and can be used to grow and modify the donor genome in host cells, while at the same time minimizing the risk of unwanted mutations in the donor genome. it can. The provided methods can accurately and efficiently modify a donor genome (eg, a bacterial genome) cloned into a yeast host cell.

本提供の方法はさらに、ドナー核酸の標的領域内でのヌクレオチドの突然変異、欠失、および/または挿入を含む、宿主細胞内でのドナー核酸のシームレスな改変に使用することができる。ここでは、望ましくないさらなる核酸配列は付加されないか、または除去される。   The provided methods can further be used for seamless modification of the donor nucleic acid in the host cell, including nucleotide mutations, deletions, and / or insertions within the target region of the donor nucleic acid. Here, undesired additional nucleic acid sequences are not added or removed.

i.対抗選択マーカー
典型的には、上記方法の最初の工程は、ドナー核酸への対抗選択マーカーの導入を含む。典型的には、上記マーカーを相同組換えにより挿入し、これにより、標的領域の一部分を対抗選択マーカーで置き換える。対抗選択マーカーは、マーカーの有無の両方を選択できる点で有利である。1セットの増殖条件を用いて、上記マーカーの存在を選択し、一方、存在しないことは、異なるセットの増殖条件を用いて選択する。例として、周知の対抗選択マーカーはURA3酵母遺伝子である。酵母宿主中にURA3遺伝子が存在することにより、ウラシルを含まない培地上でのその増殖が可能となる。したがって、このマーカーによるドナー核酸の標的領域の置き換えの成功は、ウラシルマイナス培地上での増殖によって選択できる。対照的に、URA3遺伝子が存在しないこと（例えば、別の相同組換え事象による置き換えの後）は、5-フルオロオロチン酸（5-FOA）を含む培地上での対抗選択により選択することができる。 i. Counter selectable marker Typically, the first step of the above method involves the introduction of a counter selectable marker into the donor nucleic acid. Typically, the marker is inserted by homologous recombination, thereby replacing a portion of the target region with a counterselectable marker. The counter-selection marker is advantageous in that it can select both with and without the marker. One set of growth conditions is used to select for the presence of the marker, while absence is selected using a different set of growth conditions. As an example, a well-known counter selectable marker is the URA3 yeast gene. The presence of the URA3 gene in the yeast host allows its growth on media without uracil. Therefore, successful replacement of the target region of the donor nucleic acid by this marker can be selected by growth on uracil minus media. In contrast, the absence of the URA3 gene (eg, after replacement by another homologous recombination event) can be selected by counter selection on media containing 5-fluoroorotic acid (5-FOA). .

例えば、遺伝子マーカーURA3は、宿主細胞中にクローニングしたドナー核酸内の標的領域に、例えば、相同組換えにより組込むことができる。上記マーカーの組込みは、ウラシルを含まない培地上での増殖により選択する。例えば、2回目の相同組換えにおけるマーカーの除去（例えば、欠失、または別のヌクレオチド配列での置き換えによる）を、例えば、5-FOA上での対抗選択により選択する。   For example, the genetic marker URA3 can be incorporated, for example, by homologous recombination into a target region in a donor nucleic acid cloned into a host cell. The integration of the marker is selected by growth on medium without uracil. For example, marker removal (eg, by deletion or replacement with another nucleotide sequence) in the second homologous recombination is selected, for example, by counter selection on 5-FOA.

対抗選択マーカーを利用する方法は、これらをシームレスな改変に使用できる点で望ましい。さらに、対抗選択マーカーの置き換えまたは除去により栄養要求性（auxotrophy）（例えば、ウラシルに対する依存性）が回復し、その結果、宿主細胞を、さらなる回の改変において同じ方法を使用して改変することができる。   A method using a counter selection marker is desirable in that these can be used for seamless modification. Furthermore, replacement or removal of the counterselectable marker restores auxotrophy (eg, dependence on uracil), so that host cells can be modified using the same method in further rounds of modification. it can.

多くの方法を、酵母宿主細胞中での対抗選択マーカーの導入および置き換えに利用できる。例えば、1回目の相同組換えによるURA3マーカーの導入、および2回目の相同組換えの際の上記マーカーの置き換えのための方法が公知である。そのような方法の一例を、以下の実施例4Aに記載する。ここでは、部位特異的突然変異誘発を、2回の連続的な相同組換え事象を含むこの従来法を使用して酵母の中に維持したドナーである合成のM.ゲニタリウムゲノムのCDS139遺伝子座の中に見られる単一塩基のシチジン欠失（309、388）を修正するために行った。この実施例に記載するように、突然変異体である細菌ドナーゲノムを含有している酵母宿主を、URA3マーカーと、標的領域の一部分に対して相同である50bpの末端部分を含むカセットで形質転換して、一塩基欠失CDS139遺伝子座を含む標的領域を置き換えた。2回目の形質転換により、突然変異体ではないDNA配列を含む構築物を同じ遺伝子座に導入して戻して、マーカーを置き換えた。   Many methods are available for the introduction and replacement of counter selectable markers in yeast host cells. For example, methods for introducing the URA3 marker by the first homologous recombination and replacing the marker at the second homologous recombination are known. An example of such a method is described in Example 4A below. Here, the CDS139 locus of the synthetic M. genitalium genome, a donor maintained in yeast using this conventional method involving two consecutive homologous recombination events, is included. Was performed to correct the single base cytidine deletion (309, 388) found in. As described in this example, a yeast host containing a mutant bacterial donor genome was transformed with a cassette containing a URA3 marker and a 50 bp end portion homologous to a portion of the target region. Thus, the target region containing the single base deletion CDS139 locus was replaced. A second transformation introduced a construct containing a non-mutant DNA sequence back into the same locus, replacing the marker.

対抗選択マーカーを利用する従来法には、特定の宿主細胞中で特定のドナー核酸を効率よく改変するそれらの能力に限界がある。例えば、これらの方法は、生存能力をドナーゲノムの完全性に依存しない宿主細胞内でドナーゲノムを改変するためには不十分である場合がある。宿主細胞がドナーゲノムの完全性に依存しない場合は、多数の自発的な欠失が改変の間に起こる可能性がある。これらの欠失は、典型的に、対抗選択マーカーの喪失を生じ、これにより、これらの欠失を選択する。本提供の方法はこの問題を克服し、従来法と比較して効率の向上をもたらす。   Conventional methods that utilize counterselectable markers are limited in their ability to efficiently modify specific donor nucleic acids in specific host cells. For example, these methods may be insufficient to alter the donor genome in a host cell whose viability does not depend on the integrity of the donor genome. If the host cell does not depend on the integrity of the donor genome, a large number of spontaneous deletions can occur during the modification. These deletions typically result in the loss of the counterselectable marker, thereby selecting these deletions. The provided method overcomes this problem and provides improved efficiency compared to the conventional method.

ii.誘導することができる酵素発現および断裂の導入
一つの態様においては、選択マーカーを導入した後、断裂（例えば、二本鎖の断裂（DSB））を、標的領域の近くに（例えば、標的領域に隣接して）または標的領域内に導入する。このプロセスは、典型的には、標的領域の近位もしくは標的領域内にあるヌクレオチド配列を認識し、切断する酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、I-SceI）を誘導により発現させることによって行う。典型的には、上記酵素は、エンドヌクレアーゼであるか、または二本鎖の断裂を生じる他の酵素である。相同組換えの部位付近への二本鎖の断裂の導入が、相同組換えの効率を約20倍増大させることが報告されている（Leem et al, Nucleic Acids Res 31, e29（2003））。したがって、標的領域付近での二本鎖の断裂の導入は、上記改変方法の効率を高めるため、および望ましくないバックグラウンドの突然変異を減少させるために行う。 ii. Introduction of enzyme expression and breaks that can be induced In one embodiment, after the introduction of a selectable marker, a break (eg, a double-strand break (DSB)) is placed near the target region (eg, the target Adjacent to the region) or into the target region. This process is typically performed by inducibly expressing an enzyme (eg, an endonuclease, eg, I-SceI) that recognizes and cleaves a nucleotide sequence proximal to or within the target region. Typically, the enzyme is an endonuclease or other enzyme that causes double-strand breaks. It has been reported that the introduction of double-strand breaks near the site of homologous recombination increases the efficiency of homologous recombination approximately 20-fold (Leem et al, Nucleic Acids Res 31, e29 (2003)). Therefore, the introduction of double-strand breaks near the target region is done to increase the efficiency of the modified method and to reduce unwanted background mutations.

典型的な例においては、選択マーカーを含む標的化構築物はさらに、誘導性プロモーターの制御下に酵素をコードする遺伝子を含む。典型的には、上記構築物はさらに、上記酵素の認識配列を含む。この構築物を、宿主細胞内でドナー核酸に導入する。上記酵素の発現を、誘導性プロモーターからの発現を誘導する特定の条件下で、宿主細胞の増殖により誘導する。一つの例においては、上記プロモーターはGAL1プロモーターであり、このGAL1プロモーターからの発現は、唯一の炭素源としてガラクトースを含有している培地上での増殖により誘導することができる。   In a typical example, a targeting construct that includes a selectable marker further includes a gene that encodes the enzyme under the control of an inducible promoter. Typically, the construct further comprises a recognition sequence for the enzyme. This construct is introduced into the donor nucleic acid within the host cell. Expression of the enzyme is induced by growth of the host cell under specific conditions that induce expression from an inducible promoter. In one example, the promoter is a GAL1 promoter and expression from the GAL1 promoter can be induced by growth on a medium containing galactose as the sole carbon source.

利用できる方法としては、酵母の中での組換えに基づく改変の効率を改善する目的のための二本鎖の断裂の誘導による導入が挙げられる。一つのそのような方法である完全欠失（Delitto perfetto）が、Storici et al., Nat Biotechnol, 19, 773-776（2001）に記載されている。この方法の例を、以下の実施例4B（i）に記載する。この方法は、標的核酸の中での二本鎖の断裂（DSB）の導入が組換えを桁違いに刺激することが示されていること（Storici et.al, PNAS USA, 100, 14994-99（2003））に基づく。実施例4B（i）においては、完全欠失（Dilletto perfetto）を、M.ゲニタリウムドナーゲノムのCDS139遺伝子座の中の同じ一塩基欠失を修正する試みにおいて使用した。このプロセスを図1OAに説明する。   Available methods include introduction by induction of double-strand breaks for the purpose of improving the efficiency of recombination-based modification in yeast. One such method, complete deletion (Delitto perfetto), is described in Storici et al., Nat Biotechnol, 19, 773-776 (2001). An example of this method is described in Example 4B (i) below. This method has been shown that the introduction of double-strand breaks (DSB) in target nucleic acids stimulates recombination by orders of magnitude (Storici et.al, PNAS USA, 100, 14994-99). (2003)). In Example 4B (i), a complete deletion (Dilletto perfetto) was used in an attempt to correct the same single base deletion in the CDS139 locus of the M. genitalium donor genome. This process is illustrated in Figure 1OA.

酵母の中での従来の組換え方法と組み合わせたDSBの誘導による導入が、特定のドナー核酸の改変については限定されることを本明細書中で明らかにする。以下の実施例4B（i）を参照のこと。この限定は、ネガティブ（対抗）選択マーカーの自発的喪失の高いバックグラウンドが原因である。本提供の方法は、効率を改善し、そして望ましくないバックグラウンドの突然変異（例えば、自発的欠失）を減少させる。   It is clarified herein that the introduction by induction of DSB in combination with conventional recombination methods in yeast is limited for the modification of specific donor nucleic acids. See Example 4B (i) below. This limitation is due to a high background of spontaneous loss of negative (counter) selectable markers. The provided methods improve efficiency and reduce unwanted background mutations (eg, spontaneous deletions).

iii.タンデム反復
一つの態様においては、相同組換えによる選択マーカーの除去を、マーカーを含む領域の側方にあるタンデム反復領域の存在により促進する。一つの局面においては、マーカーを導入するための標的化構築物はさらに、その導入により、挿入されたマーカーを含む標的領域またはその一部分の側方にタンデム反復領域を生じる核酸配列を含む。上記構築物を最初に、標的領域またはその一部分の上流あるいは下流のいずれかに挿入する。そして上記構築物は、標的領域またはその一部分の下流あるいは上流部分に対してそれぞれ相同性を有している核酸部分を含む。標的核酸中のこの相同部分付近へのこの部分の挿入により、タンデム反復が生じる。 iii. Tandem repeats In one embodiment, removal of a selectable marker by homologous recombination is facilitated by the presence of a tandem repeat region beside the region containing the marker. In one aspect, the targeting construct for introducing a marker further comprises a nucleic acid sequence that, upon introduction, results in a tandem repeat region on the side of the target region or portion thereof that includes the inserted marker. The construct is first inserted either upstream or downstream of the target region or a portion thereof. The construct includes a nucleic acid portion having homology with the downstream or upstream portion of the target region or a part thereof. Insertion of this part in the vicinity of this homologous part in the target nucleic acid results in a tandem repeat.

一つの例においては、上記構築物の挿入により、標的領域の3'部分に対して相同性を有している部分が、上記マーカーの5'に、標的核酸内に生じる。別の例においては、上記構築物の挿入により、標的領域の5'部分に対して相同性を有している部分が、上記マーカーの3'に、標的核酸内に生じる。したがって、導入すると、上記改変したドナー核酸（例えば、改変したドナーゲノム）は、選択マーカーを含む核酸の側方にあるタンデム反復配列を含む。   In one example, insertion of the construct results in a portion having homology to the 3 ′ portion of the target region in the target nucleic acid 5 ′ of the marker. In another example, insertion of the construct results in a portion of the target nucleic acid 3 ′ of the marker that has homology to the 5 ′ portion of the target region. Thus, upon introduction, the modified donor nucleic acid (eg, the modified donor genome) contains a tandem repeat sequence flanking the nucleic acid containing the selectable marker.

タンデム反復配列の存在は、例えば、対抗選択マーカーを含む構築物の一部分の除去のための、2つの配列間での相同組換えを促進する。このような方法は周知であり、2つのタンデム反復配列間での相同組換え（HR）による核酸セグメントの正確な除去に基づく。「タンデム反復ポップアウト」法として知られている一例が、Akada, R.et al, Yeast, 23, 399-405（2006）に記載されている。このようなアプローチの例を、以下の実施例4B（ii）に記載し、M.ゲニタリウムのドナーゲノム中のCDS139遺伝子座の一つの領域を欠失させるために使用する。このプロセスを図1OBに説明する。この技術は、遺伝子の置き換えにおける使用に適応させることができる。   The presence of a tandem repeat sequence facilitates homologous recombination between the two sequences, eg, for removal of a portion of the construct containing the counterselectable marker. Such methods are well known and are based on the precise removal of nucleic acid segments by homologous recombination (HR) between two tandem repeats. An example known as the “tandem iterative pop-out” method is described in Akada, R. et al, Yeast, 23, 399-405 (2006). An example of such an approach is described in Example 4B (ii) below and is used to delete one region of the CDS139 locus in the donor genome of M. genitalium. This process is illustrated in FIG. 1OB. This technique can be adapted for use in gene replacement.

選択マーカーを使用するより一般的な相同組換えとは異なり、タンデム反復により誘導したHRを使用する方法は、1回の形質転換事象により、対抗選択マーカーを含むカセットを導入し、続いて除去することができる。例えば、対抗選択マーカーと、タンデム配列を生じる配列とを保有しているカセットを、形質転換と、これに続く、カセットとゲノムとにおける相同領域の間での自発的な相同組換えについての選択とにより、酵母宿主の中のドナーゲノムに導入することができる。   Unlike the more common homologous recombination using a selectable marker, the method using HR induced by tandem repeats introduces and subsequently removes the cassette containing the counterselectable marker in a single transformation event. be able to. For example, a cassette carrying a counter selectable marker and a sequence that produces a tandem sequence can be transformed and subsequently selected for spontaneous homologous recombination between homologous regions in the cassette and the genome. Can be introduced into the donor genome in the yeast host.

上記マーカーの最初の導入についての選択は、上記に記載したように、例えば、URA3の場合にはヒスチジンの非存在下での増殖により、行うことができる。これに続く、対抗選択培地（例えば、5-FOA）への細胞の導入により、タンデム反復配列間での相同組換えによるマーカーの自発的な「ポップアウト」を選択する。このような方法は、標的核酸と相同性を共有しているカセットの部分を変化させることにより、欠失、点突然変異、および遺伝子の置き換えに適応させることができる。   Selection for the initial introduction of the marker can be performed as described above, for example, in the case of URA3, by growth in the absence of histidine. This is followed by the introduction of cells into the counter selection medium (eg, 5-FOA) to select the spontaneous “pop-out” of the marker by homologous recombination between tandem repeats. Such methods can be adapted to deletions, point mutations, and gene replacements by changing the portion of the cassette that shares homology with the target nucleic acid.

従来の組換え方法と組み合わせた、「ポップアウト」のためのタンデム反復の導入が、酵母の中の特定のドナー核酸の改変については限定されることを本明細書中で明らかにする。以下の実施例4B（ii）を参照のこと。この限定は、ネガティブ（対抗）選択マーカーの自発的喪失の高いバックグラウンドが原因である。本提供の方法は、効率を改善し、そして望ましくないバックグラウンドの突然変異（例えば、自発的欠失）を減少させ、酵母宿主細胞中で細菌のゲノムを改変するために使用することができる。   It is demonstrated herein that the introduction of tandem repeats for “pop-out” in combination with conventional recombination methods is limited for the modification of specific donor nucleic acids in yeast. See Example 4B (ii) below. This limitation is due to a high background of spontaneous loss of negative (counter) selectable markers. The provided methods can be used to improve efficiency and reduce unwanted background mutations (eg, spontaneous deletions) and to alter the bacterial genome in yeast host cells.

iv.タンデム反復-エンドヌクレアーゼ切断（TREC）
タンデム反復と標的領域付近での酵素による切断との両方を、選択マーカーの除去を促進するために使用することができる。「タンデム反復エンドヌクレアーゼ切断」（TREC）法と考える一つのそのような態様は、対抗選択マーカーを使用する従来の相同組換えによる置き換え、エンドヌクレアーゼの発現による標的領域付近または標的領域への二本鎖の断裂の誘導による導入、およびマーカーを含む核酸配列の側方にあるタンデム反復配列の導入と組み合わせる。上記方法は、高い効率で、酵母宿主細胞中にクローニングした細菌のドナーゲノムおよび大きな核酸を正確に改変するために使用することができる。 iv. Tandem repeat-endonuclease cleavage (TREC)
Both tandem repeats and enzymatic cleavage near the target region can be used to facilitate removal of the selectable marker. One such embodiment, considered a “tandem repetitive endonuclease cleavage” (TREC) method, is the replacement by conventional homologous recombination using a counter-selectable marker, two near or to the target region by expression of the endonuclease. Combined with the introduction by induction of strand breaks and the introduction of tandem repeats on the side of the nucleic acid sequence containing the marker. The method can be used with high efficiency to accurately modify bacterial donor genomes and large nucleic acids cloned into yeast host cells.

TREC法を用いる場合は、側方にあるタンデム反復配列と、近位または隣接する二本鎖の断裂との組み合わせにより、標的特異的組換えの効率が大幅に高まり、酵母宿主の中での細菌ゲノムの遺伝学的変更が可能となる。この方法を、酵母の中で増殖させたM.ゲニタリウムゲノム中のCD 139遺伝子座をシームレスにうまく欠失させるために使用した例を、以下の実施例4Cに記載する。この方法を図1OCに説明する。   When using the TREC method, the combination of lateral tandem repeats with proximal or adjacent double-strand breaks greatly increases the efficiency of target-specific recombination, allowing bacteria in yeast hosts Allows genetic modification of the genome. An example of using this method to seamlessly successfully delete the CD139 locus in the M. genitalium genome grown in yeast is described in Example 4C below. This method is illustrated in FIG. 1OC.

本明細書中に記載する方法は、宿主細胞中のドナー核酸（例えば、酵母宿主細胞中の細菌ゲノム）の標的領域に対して任意の改変（例えば、点突然変異（例えば、保存的置換および非保存的置換を含む核酸ならびにコドンの置換）、欠失、挿入、および他の改変）を導入するために使用することができる。   The methods described herein include any modification (eg, point mutations (eg, conservative substitutions and non-conversions) to a target region of a donor nucleic acid (eg, a bacterial genome in a yeast host cell) in a host cell. Nucleic acids including conservative substitutions and codon substitutions), deletions, insertions, and other modifications) can be used to introduce.

v.標的化カセット、およびそのカセットの作製
上記改変方法での使用のための核酸（例えば、標的化カセット）を設計し、作製するための方法を提供する。上記方法での使用のための構築物および他の核酸も提供する。典型的には、選択マーカーを導入するための標的カセットは、ドナー標的領域の一部分に対する相同部分（これは、任意で、上記相同部分と比較して、一つまたは複数の突然変異、欠失、挿入、置換、または他の改変を含む）および選択マーカー（典型的には、URA3のような対抗選択マーカー）を含む。典型的には、上記カセットは、標的領域の5'部分に対して相同である部分と、標的領域の3'部分に対して相同である部分とを含む。 v. Targeting cassettes and production of the cassettes Provided are methods for designing and creating nucleic acids (eg, targeting cassettes) for use in the modified methods. Constructs and other nucleic acids for use in the above methods are also provided. Typically, the target cassette for introducing a selectable marker comprises a homologous portion to a portion of the donor target region (which optionally includes one or more mutations, deletions, Including insertions, substitutions, or other modifications) and selectable markers (typically counter selectable markers such as URA3). Typically, the cassette comprises a portion that is homologous to the 5 ′ portion of the target region and a portion that is homologous to the 3 ′ portion of the target region.

いくつかの態様においては、標的核酸に対して相同性を有している核酸で選択マーカーを置き換えるための第2の標的化構築物を作製する。この第2の標的化構築物は、標的領域またはその一部に対する相同性を含み、任意で、標的領域内の相同部分と比較して、一つまたは複数の突然変異、欠失、挿入、置換、または他の改変を含む。   In some embodiments, a second targeting construct is created to replace the selectable marker with a nucleic acid having homology to the target nucleic acid. This second targeting construct comprises homology to the target region or part thereof, optionally with one or more mutations, deletions, insertions, substitutions, compared to the homologous portion within the target region, Or other modifications.

いくつかの態様においては、標的領域付近、その中、またはそれに隣接する二本鎖の断裂の導入のために、上記標的化カセットはさらに、特定の配列でdsDNAのような核酸を切断するエンドヌクレアーゼのような酵素をコードする遺伝子を含み、さらに、典型的には、上記カセットの末端または末端付近に、上記酵素により認識されるヌクレオチド配列を含む。典型的には、上記遺伝子の発現を特定の環境条件（例えば、唯一の炭素源としてのガラクトースの存在下）で宿主細胞の増殖を誘導することができるように、上記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、誘導性プロモーター（例えば、GAL1プロモーター）の制御下にある。   In some embodiments, the targeting cassette further cleaves a nucleic acid such as dsDNA at a specific sequence for the introduction of a double-strand break near, in, or adjacent to the target region. In addition, a nucleotide sequence recognized by the enzyme is typically included at or near the end of the cassette. Typically, the gene encoding the endonuclease is such that the expression of the gene can induce the growth of the host cell under certain environmental conditions (eg in the presence of galactose as the sole carbon source). , Under the control of an inducible promoter (eg, GAL1 promoter).

いくつかの態様においては、タンデム反復配列の作製のために、上記標的化カセットは、上記標的核酸に対するさらなる相同部分を含む。これは、相同組換えにより上記カセットが組込まれると、タンデム反復配列が標的核酸中に存在するように、標的核酸の長さに沿って、標的領域の上流または下流に存在する。   In some embodiments, for the generation of tandem repeats, the targeting cassette includes an additional homologous portion to the target nucleic acid. This is upstream or downstream of the target region along the length of the target nucleic acid so that when the cassette is incorporated by homologous recombination, a tandem repeat is present in the target nucleic acid.

切断とタンデム反復配列とを使用する場合は、上記カセットは、（タンデム反復を作製するための）標的核酸の長さに沿って標的領域の上流または下流にある標的核酸の一部分に対する第1の相同部分と、（相同組換えによるカセットの挿入のための）それぞれ標的領域の3'部分および5'部分に対する第2および第3の相同部分と、誘導性プロモーターの制御下にある酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）をコードする核酸と、エンドヌクレアーゼにより認識されるヌクレオチド配列と、選択マーカー（典型的には、対抗選択マーカー）とを含む。典型的には、（標的領域の3'および5'部分に対する）第2および第3の相同部分は、第1の相同部分（タンデム反復を生じる）を含む配列の側方にある。一つの局面においては、第2および第3の相同部分はさらに、酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）をコードする核酸を含む配列の側方にある。これらはまた、典型的には、選択マーカーを含む配列の側方に存在する。   When using cleavage and tandem repeats, the cassette is the first homology to a portion of the target nucleic acid that is upstream or downstream of the target region along the length of the target nucleic acid (to create a tandem repeat). A portion, a second and a third homologous portion for the 3 'and 5' portions of the target region (for insertion of a cassette by homologous recombination), respectively, and an enzyme under the control of an inducible promoter (eg endo A nucleic acid encoding a nuclease), a nucleotide sequence recognized by the endonuclease, and a selectable marker (typically a counter-selectable marker). Typically, the second and third homologous parts (relative to the 3 ′ and 5 ′ parts of the target region) are lateral to the sequence containing the first homologous part (resulting in a tandem repeat). In one aspect, the second and third homologous portions are further to the side of the sequence comprising the nucleic acid encoding the enzyme (eg, endonuclease). They are also typically on the side of the sequence containing the selectable marker.

一つの局面においては、酵素により認識されるヌクレオチド配列は、第2または第3の相同部分に隣接して配置し、これは、第1の相同部分（タンデム反復領域を生じる）に対して構築物の反対側の末端上にある。   In one aspect, the nucleotide sequence recognized by the enzyme is placed adjacent to the second or third homologous portion, which is relative to the first homologous portion (resulting in a tandem repeat region) of the construct. On the opposite end.

一つの局面においては、（カセットの組込みのための）第2または第3の相同部分の一方または両方が、上記標的核酸中の相同部分と比較して、一つまたは複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失を含む。   In one aspect, one or both of the second or third homologous parts (for cassette integration) is a mutation of one or more nucleotides compared to the homologous part in the target nucleic acid, Includes insertions or deletions.

以下の実施例においてTREC中で使用した例示的な標的化カセットを、図1OCに説明する。この例示的な構築物は、I-SceI認識部位、GAL-1プロモーターの制御下にあるI-SceIエンドヌクレアーゼをコードする核酸、URA3対抗選択マーカー、および標的領域の上流の標的核酸配列の一部分（標的核酸の中で「反復」と表示し、また図示する）に対して相同である部分（「反復」と表示する）を含む。上記カセットはさらに、I-SceI部位の5'である標的領域に対する50bpの相同部分と、「反復」相同部分の3'である上記標的領域に対する50bpの相同部分とを含む。認識部位、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子および誘導性プロモーター、ならびに選択マーカーを含む標的化カセットの部分を、「コア」カセットと呼ぶ。このカセットを、ゲノムの標的領域の450塩基対部分を欠失させることにより、本提供の方法を使用して酵母宿主に移入したM.ゲニタリウムドナーゲノムを宿主細胞内で改変するために、以下の実施例4Cに記載するように使用した。類似する構築物を、本提供の方法を使用して酵母宿主細胞内でM.ミコイデスLCゲノム中のII型制限酵素遺伝子を欠失させるために使用した。   An exemplary targeting cassette used in TREC in the following examples is illustrated in FIG. 1OC. This exemplary construct comprises an I-SceI recognition site, a nucleic acid encoding an I-SceI endonuclease under the control of the GAL-1 promoter, a URA3 counterselectable marker, and a portion of the target nucleic acid sequence upstream of the target region (target It includes a portion of a nucleic acid that is homologous to a “repeat” (shown and illustrated) (shown as “repeat”). The cassette further comprises a 50 bp homology to the target region 5 ′ of the I-SceI site and a 50 bp homology to the target region 3 ′ of the “repeat” homology. The portion of the targeting cassette that includes the recognition site, the gene encoding the endonuclease and the inducible promoter, and the selectable marker is referred to as the “core” cassette. In order to modify this cassette in a host cell, the M. genitalium donor genome transferred to the yeast host using the method provided by deleting the 450 base pair portion of the target region of the genome, the following: Used as described in Example 4C. A similar construct was used to delete the type II restriction enzyme gene in the M. mycoides LC genome in yeast host cells using the method provided.

図10A〜Dに記載し、本明細書中の別の場所に記載するもののようなこれらの標的化カセットのバリエーションもまた、本提供の方法とともに使用することができる。例えば、カセットのバリエーションは、標的核酸に、突然変異、置換、挿入、および他の改変（例えば、修飾ヌクレオチド）を導入するために使用することができる。提供するカセットおよび方法のこのような改変は当業者に明らかであろう。   Variations of these targeting cassettes, such as those described in FIGS. 10A-D and described elsewhere herein, can also be used with the methods provided. For example, cassette variations can be used to introduce mutations, substitutions, insertions, and other modifications (eg, modified nucleotides) into the target nucleic acid. Such modifications of the provided cassettes and methods will be apparent to those skilled in the art.

上記カセットは、本明細書中に記載する方法および市販されている方法のような、多数の周知の核酸合成方法、増幅方法、連結方法、ならびにアセンブリ方法のうちの任意のものを使用して作製することができる。一つの態様においては、上記カセットは、上記カセットの一部分を構成する核酸断片の増幅および/またはアセンブリによる。上記断片は、周知の方法（例えば、化学合成または所望のヌクレオチド配列を含むプラスミド、ゲノムDNA、もしくは他の核酸からの増幅（例えば、PCR））を使用して作製することができる。   The cassette is made using any of a number of well-known nucleic acid synthesis, amplification, ligation, and assembly methods, such as those described herein and commercially available methods. can do. In one embodiment, the cassette is by amplification and / or assembly of nucleic acid fragments that form part of the cassette. Such fragments can be made using well-known methods (eg, chemical synthesis or amplification (eg, PCR) from plasmids, genomic DNA, or other nucleic acids containing the desired nucleotide sequence).

一つの局面においては、上記断片を、融合PCRを使用し、組換えPCR技術を使用して、Shevchuk, N.A.et al, Nucleic Acids Res, 32, e19（2004）に記載されているように、カセットを形成するようにアセンブリする。   In one aspect, the fragment is used in a cassette as described in Shevchuk, NA et al, Nucleic Acids Res, 32, e19 (2004) using fusion PCR and using recombinant PCR techniques. Assemble to form

この方法を用いる場合は、キメラ融合プライマーを、連結させようとする2つの異なる断片を増幅するために使用し、これを次いで、プライマーレスポリメラーゼ反応（primer-less polymerase reaction）（例えば、プライマーレスPCR）において連結させる。キメラプライマーはそれぞれ、連結させようとする第1の断片に対する相同部分と、連結させようとする第2の断片に対する相同部分とを含む。したがって、プライマーを使用して両方の断片を増幅させることにより、増幅産物の間に重複する相同領域（例えば、産物の末端にある40bpの相同性）が生じる。   When using this method, a chimeric fusion primer is used to amplify two different fragments to be ligated, which is then used as a primer-less polymerase reaction (eg, primerless PCR). ). Each chimeric primer includes a homologous portion for the first fragment to be ligated and a homologous portion for the second fragment to be ligated. Thus, amplifying both fragments using primers results in a region of homology overlapping between amplified products (eg, 40 bp homology at the end of the product).

次に、これらの産物を、重複部分の伸長により産物を連結させるために、プライマーの非存在下で、低いアニーリング温度（例えば、56℃でまたは約56℃で）を用いる多数回（例えば、10回、11回、12回、13回、またはそれ以上）のサイクルのPCRに使用する。この様式で連結させた多数の産物を、その後、続く融合PCR工程において連結させることができる。典型的には、上記融合産物を、さらなるPCR反応（例えば、所望のカセットの末端に付加しようとするさらなる配列を含むプライマーを用いて）において再度増幅する。   These products are then used a number of times (eg, 10 ° C.) using a low annealing temperature (eg, at 56 ° C. or at about 56 ° C.) in the absence of primers to join the products by extension of the overlap. Used for PCR of 11 times, 12 times, 13 times, or more cycles. Multiple products ligated in this manner can then be ligated in subsequent fusion PCR steps. Typically, the fusion product is reamplified in a further PCR reaction (eg, using a primer containing additional sequences to be added to the end of the desired cassette).

他のアセンブリ方法が公知であり、カセットを作製するために使用することができる。例えば、上記カセットは、記載するような従来の合成方法を使用して調製することができ、また、商業的な供給業者から購入することもできる。他のアセンブリ方法を使用することができ、例えば、5'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、およびDNAリガーゼの協調した作用による、1工程の等温DNAアセンブリ法（isothermal DNA assembly method）が、Gibson et al, Nature Methods 6, 343-345（2009）に、および2009年2月19日に提出された米国特許出願第12/371,543号に記載されている。この方法を用いる場合は、DNA断片に、最初に、5'エキソヌクレアーゼによって凹みを作り（recess）、これにより、一本鎖の突出を生じさせる。次に、これを特異的にアニーリングさせ、続いてギャップを埋め、ポリメラーゼとリガーゼを使用して共有結合により連結させる。他のアセンブリ方法は、米国特許出願公開第US2007/0037197A1号および同第US2007/0037196A1号に記載されている。   Other assembly methods are known and can be used to make cassettes. For example, the cassette can be prepared using conventional synthetic methods as described, or can be purchased from commercial suppliers. Other assembly methods can be used, for example, the one-step isothermal DNA assembly method with the coordinated action of 5 'exonuclease, DNA polymerase, and DNA ligase is described in Gibson et al, Nature Methods 6, 343-345 (2009), and in US patent application Ser. No. 12 / 371,543 filed Feb. 19, 2009. When using this method, a DNA fragment is first recessed with a 5 ′ exonuclease, thereby producing a single-stranded overhang. This is then annealed specifically, followed by filling the gap and covalently ligating using polymerase and ligase. Other assembly methods are described in US Patent Application Publication Nos. US2007 / 0037197A1 and US2007 / 0037196A1.

vi.形質転換および改変の分析
改変のために、上記カセットにより、ドナーゲノム（例えば、本提供の方法に従って産生したもの）を含有している宿主細胞を形質転換する。形質転換方法は周知である。一つの例においては、上記カセットを、2μg〜3μgのPCR産物と25μgのキャリアDNA（サケの精巣DNA, Sigma, St.Louis, MO）とを用いて、公開されている方法（Gietz, D.et al., Nucleic Acids Res, 20, 1425（1992））にしたがって、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用してドナーゲノムを含有している酵母宿主細胞に導入する。 vi. Analysis of Transformation and Modification For modification, a host cell containing a donor genome (eg, produced according to the provided methods) is transformed with the cassette. Transformation methods are well known. In one example, the cassette is prepared using published methods (Gietz, D., et al.) Using 2 μg-3 μg PCR product and 25 μg carrier DNA (salmon testis DNA, Sigma, St. Louis, MO). et al., Nucleic Acids Res, 20, 1425 (1992)) is introduced into yeast host cells containing the donor genome using integrative transformation with lithium acetate.

カセットが標的核酸に組込まれた細胞を選択するために、細胞をウラシルを含まない培地中で増殖させ、個々のURA⁺形質転換体を選択し、任意で、カセットが挿入される領域の側方にある標的ドナー核酸の一部に特異的に結合する診断用プライマーを使用して、PCRにより分析する。カセットが正確に挿入されているかどうかを、カセットが挿入されているかどうかに応じて異なるサイズのアンプリコンを生じるそのようなプライマーを使用してアンプリコンの存在とサイズとを評価することにより決定する。例を、以下の実施例4C（ii）に記載する。正確な挿入を含む細胞を、次回の相同組換えに使用する。 To select cells with the cassette integrated in the target nucleic acid, grow the cells in medium without uracil, select individual URA ⁺ transformants, and optionally lateral to the region where the cassette is inserted. Analysis by PCR using a diagnostic primer that specifically binds to a portion of the target donor nucleic acid. Determine whether the cassette is correctly inserted by evaluating the presence and size of amplicons using such primers that produce amplicons of different sizes depending on whether the cassette is inserted . An example is described in Example 4C (ii) below. Cells containing the correct insertion are used for the next homologous recombination.

dsの断裂を生じる酵素の誘導性発現を行う場合は、その後、対抗選択マーカーを含有している細胞を、誘導性プロモーターからの酵素の発現を誘導する条件下で増殖させる（例えば、ガラクトースを含有している培地中での増殖）。一つの例においては、dsの断裂を導入する酵素の発現を誘導するために、細胞を、唯一の炭素源としてガラクトースを含有しているSG（合成ガラクトース）-His培地上で、例えば、4時間または24時間増殖させる。ガラクトース含有培地上での増殖を、対照として行うことができる。   When performing inducible expression of an enzyme that results in ds cleavage, cells containing the counter selectable marker are then grown under conditions that induce expression of the enzyme from the inducible promoter (eg, containing galactose Growth in the culture medium). In one example, to induce expression of an enzyme that introduces a ds rupture, cells are placed on SG (synthetic galactose) -His medium containing galactose as the sole carbon source, eg, 4 hours. Or let it grow for 24 hours. Growth on galactose-containing media can be performed as a control.

いくつかの態様においては、選択マーカーを置き換えようとする、標的核酸に対して相同である配列を含む第2の核酸を、細胞に形質導入する。いくつかの場合には、この第2の核酸は、標的核酸と比較して、一つまたは複数の突然変異、欠失、挿入、または置換を含む。実施例4Aおよび4Bを参照のこと。他の場合は、第2の相同組換え事象が、ベクターの挿入後に標的核酸中に生じたタンデム反復を介して、自発的に起こる。TREC法を用いる場合は、これらの方法の組み合わせを、選択マーカーの除去のために使用する。   In some embodiments, the cell is transduced with a second nucleic acid comprising a sequence that is homologous to the target nucleic acid that is to replace the selectable marker. In some cases, this second nucleic acid contains one or more mutations, deletions, insertions, or substitutions compared to the target nucleic acid. See Examples 4A and 4B. In other cases, a second homologous recombination event occurs spontaneously via a tandem repeat that occurs in the target nucleic acid after insertion of the vector. When using the TREC method, a combination of these methods is used to remove the selectable marker.

対抗選択マーカーの喪失を、喪失に有利である条件下での増殖により選択する。いくつかの局面においては、URA3をマーカーとして使用する場合は、そのような選択の前（例えば、2回目の形質転換の後）に、細胞を、URA3遺伝子を失った酵母細胞中に残っているオロチジン-5'-ホスフェートデカルボキシラーゼ（URA3遺伝子によりコードされる）を枯渇させるために、ウラシルの存在下で30℃で一晩増殖させる。その後、対抗選択マーカーを失った細胞を、URA3遺伝子の喪失を選択するために、喪失に有利である環境下（例えば、5-FOAの存在下、例えば、5-FOAを含有しているHISプレート上）で選択する。挿入部位の側方にある同じまたは異なる診断用プライマーを使用するPCR分析を、上記カセットの欠失を確認するために行うことができる。   The loss of the counterselectable marker is selected by growth under conditions that favor the loss. In some aspects, when URA3 is used as a marker, cells remain in yeast cells that have lost the URA3 gene prior to such selection (eg, after the second transformation). To deplete orotidine-5′-phosphate decarboxylase (encoded by the URA3 gene), grow overnight at 30 ° C. in the presence of uracil. The cells that have lost the counterselection marker are then selected in an environment that favors the loss (eg, in the presence of 5-FOA, eg, an HIS plate containing 5-FOA, in order to select for loss of the URA3 gene. Select with (above). PCR analysis using the same or different diagnostic primers on the side of the insertion site can be performed to confirm the deletion of the cassette.

マルチプレックスPCRを、本提供の改変方法を使用して改変したドナー核酸（例えば、ゲノム）の完全性を分析するために行うことができる。例えば、マルチプレックスPCR（MPCR）は、D.G.Gibson et al, PNAS USA, 105:20404-9（2008）に記載されているように行うことができる。   Multiplex PCR can be performed to analyze the integrity of a modified donor nucleic acid (eg, genome) using the provided modification methods. For example, multiplex PCR (MPCR) can be performed as described in D.G. Gibson et al, PNAS USA, 105: 20404-9 (2008).

PCRおよびMPCR分析のための、宿主細胞からの全DNAの単離は、宿主細胞のタイプに応じて、本明細書中に記載する単離方法を使用して行うことができる。一つの例においては、酵母宿主細胞からのゲノムDNAの単離を、実施例3に記載するように行う。それぞれのアンプリコンの存在を確認できるように、ドナーゲノムの長さに沿った（例えば、酵母の中の環状の細菌ゲノムの周囲の）様々な部分に対する相同性を持ち、様々なサイズを有しているMPCRプライマーのセットを設計することができる。例えば、D.G.Gibson et al, PNAS USA, 105:20404-9（2008）を参照のこと。マルチプレックスPCRは、Qiagen Multiplex PCR Kitのような市販されているキットを含む周知の方法を使用して行うことができる。例示的な反応を以下の実施例4Aに記載する。各アンプリコンの存在は、改変したゲノムが完全であることを示し、これは、典型的には、自発的な望ましくない組換え事象が起こらず、望ましくない改変が生じないことを確実にするために行う。   Isolation of total DNA from host cells for PCR and MPCR analysis can be performed using the isolation methods described herein, depending on the type of host cell. In one example, the isolation of genomic DNA from yeast host cells is performed as described in Example 3. Have homology to different parts along the length of the donor genome (eg around the circular bacterial genome in yeast) and have different sizes so that the presence of each amplicon can be confirmed A set of MPCR primers can be designed. For example, see D.G. Gibson et al, PNAS USA, 105: 20404-9 (2008). Multiplex PCR can be performed using well-known methods including commercially available kits such as the Qiagen Multiplex PCR Kit. An exemplary reaction is described in Example 4A below. The presence of each amplicon indicates that the modified genome is complete, typically to ensure that no spontaneous undesirable recombination events occur and no undesirable modifications occur. To do.

ドナー、宿主、およびレシピエント細胞のタイプに応じて、他の改変方法を、本提供の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、周知のCre-LoxPシステムを使用することができる。Cre-loxPシステムは、多数の様々な生物の中の選択マーカーおよび大きなゲノムDNAセグメントを除去するためにうまく使用されている、公知の効率的な部位特異的組換え法である。突然変異体loxP遺伝子を持つCre-loxP突然変異誘発構築物を、他の方法について記載するように例えば2回のPCR反応により産生することができる。loxPの突然変異は、Araki, K.et al, Nucleic Acids Res, 25, 868-872（1997）に記載されているように、逆の組換え事象を妨げる。例を以下の実施例4Dに記載する。一つの例においては、上記改変方法は、Cre-LoxPシステムによる改変と同じく効率的であるか、実質的に同じく効率的であるか、または改変よりもさらに効率的である。   Depending on the type of donor, host, and recipient cell, other modification methods can be used in combination with the methods provided. For example, the well-known Cre-LoxP system can be used. The Cre-loxP system is a known and efficient site-specific recombination method that has been successfully used to remove selectable markers and large genomic DNA segments in many different organisms. A Cre-loxP mutagenesis construct with a mutant loxP gene can be produced, for example, by two PCR reactions as described for other methods. The loxP mutation prevents reverse recombination events as described in Araki, K. et al, Nucleic Acids Res, 25, 868-872 (1997). An example is described in Example 4D below. In one example, the modification method is as efficient, substantially as efficient, or even more efficient than modification with the Cre-LoxP system.

F.改変したドナーゲノムおよび核酸の、レシピエント細胞への移植
宿主細胞またはレシピエント細胞へのドナー核酸（ドナーの染色体および/またはドナーゲノムを含む）の移植のための方法を本明細書中で提供する。ドナー核酸は、宿主細胞からレシピエント細胞へと移植することができる。ドナー核酸には、宿主細胞内で改変したものが含まれる。別の態様においては、上記ドナーゲノムを、例えば、レシピエント細胞への天然のゲノムの移植により、ドナー細胞からレシピエント細胞に直接移植する。複数の移植方法が、宿主細胞内で増殖させ、改変したドナーゲノムを、遺伝子産物をゲノムから発現させることができる環境に移植により効率よく戻すために有用である。レシピエント細胞は、ドナー細胞または生物と比較して、同じ種の細胞であっても、また近い関係にある種の細胞であってもよい。 F. Transplantation of Modified Donor Genomes and Nucleic Acids into Recipient Cells Methods herein for transplantation of donor nucleic acids (including donor chromosomes and / or donor genomes) into host cells or recipient cells are described herein. provide. The donor nucleic acid can be transplanted from the host cell to the recipient cell. Donor nucleic acids include those modified in the host cell. In another embodiment, the donor genome is transplanted directly from the donor cell to the recipient cell, eg, by transplanting the native genome into the recipient cell. Multiple transplantation methods are useful for efficiently returning a modified donor genome in a host cell to an environment in which the gene product can be expressed from the genome by transplantation. The recipient cell may be a cell of the same species or a closely related species of cells as compared to the donor cell or organism.

小さい核酸断片（例えば、遺伝子セグメント）を宿主細胞にクローニングし、それらを、もとの細胞もしくは近い関係にある細胞に移植して戻すための方法は公知であるが、一般的には、その後で単離し、もとのドナー細胞のゲノムに挿入して戻す小さい核酸の操作（例えば、一つの核酸断片の改変）に限定される。Lartigue et al., Science 317, 632（2007）により記載されているように、マイコプラズマの全ゲノムが、ドナーであるマイコプラズマ細胞から、異なる種の近い関係にあるレシピエントであるマイコプラズマ細胞に直接うまく移植されており、この移植には遺伝子産物の発現の成功が伴っていた。   Methods for cloning small nucleic acid fragments (eg, gene segments) into host cells and transplanting them back to the original or closely related cells are known, but generally Limited to manipulation of small nucleic acids (eg, modification of a single nucleic acid fragment) that is isolated and inserted back into the genome of the original donor cell. As described by Lartigue et al., Science 317, 632 (2007), the entire genome of mycoplasma is successfully transferred directly from a donor mycoplasma cell to a closely related recipient of mycoplasma cells. This transplant was accompanied by successful expression of the gene product.

しかし、利用できる移植方法は、大きな核酸（例えば、ゲノムおよび染色体）を、宿主細胞からあまり近い関係にはないレシピエント細胞（例えば、その中でゲノムを増殖させる宿主細胞と比較して、異なる生命の分岐の細胞）に移植するそれらの能力に関して限定される。例えば、利用できる方法は、真核生物宿主から原核生物レシピエントへの移植に限定される。   However, the available transplantation methods allow large nucleic acids (eg, genomes and chromosomes) to have a different life compared to recipient cells (eg, host cells in which the genome is propagated) that are not closely related to the host cells. Limited in terms of their ability to engraft cells. For example, available methods are limited to transplantation from a eukaryotic host to a prokaryotic recipient.

例えば、真核生物宿主中で増殖させた原核生物のドナーゲノムを原核生物のレシピエントへと移植することは、核酸の回収、メチル化、不和合性および毒性の問題により限定され得る。移植されたドナー核酸（検出可能数）を含有している十分な数のレシピエント細胞を生じさせるためには、十分な量の精製した、インタクトなドナー核酸を宿主細胞から回収する方法が必要である。   For example, transplantation of a prokaryotic donor genome grown in a eukaryotic host into a prokaryotic recipient can be limited by nucleic acid recovery, methylation, incompatibility and toxicity issues. In order to generate a sufficient number of recipient cells containing the transplanted donor nucleic acid (detectable number), a method of recovering a sufficient amount of purified, intact donor nucleic acid from the host cell is required. is there.

レシピエント細胞中に存在する（おそらく、ドナー細胞中にも存在する）が、宿主細胞中には存在しない制限修飾システムによって、宿主細胞内で増殖させたドナー核酸を移植すると不和合性を生じる可能性がある。例えば、サッカロミセス・セレビジエ酵母宿主細胞は、いくつかの細菌細胞の中に存在する制限修飾システムを含まないので、酵母宿主中での増殖後に単離した細菌のゲノムは、細菌のレシピエント細胞の制限修飾システムの影響を受ける可能性がある（Holt et al., Bioessays 29, 580（2007））。したがって、酵母細胞中で改変し、増殖させた細菌のゲノムを、ドナー遺伝子産物をその中で発現させることができる細胞（例えば、ドナー細胞および他の細菌のレシピエント細胞）へと移植することには、移植したゲノムがレシピエント細胞と不和合性であるというリスクがある。   A restriction modification system that is present in the recipient cell (probably also in the donor cell) but not in the host cell can cause incompatibility when transplanted with the donor nucleic acid grown in the host cell There is sex. For example, since the Saccharomyces cerevisiae yeast host cell does not contain the restriction modification system present in some bacterial cells, the bacterial genome isolated after growth in the yeast host is a restriction of bacterial recipient cells. It may be affected by the modification system (Holt et al., Bioessays 29, 580 (2007)). Thus, transplanting bacterial genomes modified and grown in yeast cells into cells (eg, donor cells and recipient cells of other bacteria) in which the donor gene product can be expressed. Is at risk of the transplanted genome being incompatible with the recipient cells.

さらに、制限修飾システムを含まないそのような酵母宿主は、それにもかかわらず、ドナー核酸（例えば、細菌のゲノム）を修飾することができるDNAメチルトランスフェラーゼを発現することがあり、それにより、ドナー核酸は、レシピエント細胞（例えば、細菌）に移植されるとそれらの活性化（例えば、遺伝子産物の発現）が阻害される。   Further, such yeast hosts that do not include a restriction modification system may nevertheless express a DNA methyltransferase that can modify the donor nucleic acid (eg, bacterial genome), thereby causing the donor nucleic acid to be expressed. Are inhibited in their activation (eg, expression of gene products) when transplanted into recipient cells (eg, bacteria).

さらに、宿主細胞中での増殖および改変後に単離したドナーゲノムの構造と立体構造は、ドナー生物とより近い関係にある細胞中で増殖させた同じゲノムの立体構造および構造とは異なる可能性がある。このような差異は、ドナー核酸をレシピエント細胞に移植により戻すことにネガティブな影響を及ぼし得る。本明細書中に記載する移植方法は、宿主細胞中で改変したおよび/または増殖させたドナーゲノムの、遺伝学的に異なるレシピエント細胞への（例えば、真核生物宿主から原核生物レシピエントへの）移植の成功についてのそのような限定を克服する局面を含む。中でも、これらの局面は、インビトロでのメチル化、宿主細胞のタンパク質を分解させるための酵素での処理、および制限修飾システムを欠いている（例えば、レシピエント細胞中でのこれらのシステムの突然変異による）レシピエント細胞への移植である。本提供の移植方法の成功を示している例示的な研究を、以下の実施例3および実施例5に詳細に記載する。   Furthermore, the structure and conformation of a donor genome isolated after growth and modification in a host cell may differ from the structure and structure of the same genome grown in a cell that is more closely related to the donor organism. is there. Such differences can have a negative impact on returning the donor nucleic acid to the recipient cell by transplantation. The transplantation methods described herein can be used to transfer a modified and / or expanded donor genome in a host cell to a genetically different recipient cell (eg, from a eukaryotic host to a prokaryotic recipient). Including aspects of overcoming such limitations on the success of transplantation). Among other things, these aspects lack methylation in vitro, treatment with enzymes to degrade host cell proteins, and restriction modification systems (eg, mutation of these systems in recipient cells). Transplantation into recipient cells). Exemplary studies demonstrating the success of the provided transplantation methods are described in detail in Example 3 and Example 5 below.

図8は、本提供の移植方法の3つの局面を模式的に説明する。第1のアプローチ（「1」と表示する矢印で示す）においては、ドナーDNAを、例えば、β-アガラーゼでの処理を用いて、融解させたアガロースプラグの中で単離し、レシピエント細胞に直接移植する。この第1のアプローチは、通常、核酸を、類似する細胞間で移植し、不和合性の問題が懸念されない場合に使用する。第2のアプローチ（「2」と示す）においては、第1の方法と同様に、レシピエント細胞を、ドナー核酸の移植の前に制限酵素を突然変異させるよう改変する。第3のアプローチ（「3」と示す）においては、レシピエントのR-Mシステムと立体構造の変化とからドナー核酸を保護するために、アガロースプラグ中のドナー核酸について、メチル化反応と除タンパク質反応を行い、その後、融解と移植を行う。別の局面においては、メチル化は、除タンパク質を伴わずに行う。   FIG. 8 schematically illustrates three aspects of the presently provided transplantation method. In the first approach (indicated by the arrow labeled “1”), donor DNA is isolated in a thawed agarose plug, eg, using treatment with β-agarase, and directly to recipient cells. Transplant. This first approach is typically used when nucleic acids are transplanted between similar cells and incompatibility issues are not a concern. In the second approach (denoted “2”), as in the first method, recipient cells are modified to mutate the restriction enzyme prior to transplantation of the donor nucleic acid. In the third approach (denoted “3”), methylation and deproteinization reactions are performed on the donor nucleic acid in the agarose plug to protect the donor nucleic acid from the recipient's RM system and conformational changes. Followed by thawing and transplantation. In another aspect, methylation is performed without deproteinization.

図16は、本提供の移植方法のさらなる局面を模式的に説明する。細菌のゲノムを酵母に移動させ、変更し、そしてゲノムの移植により細菌にインストールして戻すことができる。酵母ベクターは、形質転換により細菌のゲノムに挿入することができる。この細菌のゲノムを酵母にクローニングする。クローニング後、酵母の遺伝学的方法のレパートリーを、細菌のゲノムの中に一つまたは複数の挿入、欠失、再構成、またはそれらの任意の組み合わせを作製するために使用する。この変更したゲノムを、その後、単離し、変更した細菌を作製するためにレシピエント細胞に移植することができる。いくつかの場合は、移植前に、レシピエント細胞の制限システムからドナーである細菌DNAを保護するために、ドナーである細菌DNAをメチル化することが必要であり得る。このサイクルは、新しく変更したゲノム（点線の矢印）から出発する反復様式において繰り返すことができる。   FIG. 16 schematically illustrates a further aspect of the provided transplantation method. The bacterial genome can be transferred to yeast, modified, and installed back into the bacteria by genome transfer. Yeast vectors can be inserted into the bacterial genome by transformation. The bacterial genome is cloned into yeast. After cloning, a repertoire of yeast genetic methods is used to create one or more insertions, deletions, rearrangements, or any combination thereof in the bacterial genome. This altered genome can then be isolated and transplanted into recipient cells to produce altered bacteria. In some cases, it may be necessary to methylate the donor bacterial DNA prior to transplantation in order to protect the donor bacterial DNA from the recipient cell restriction system. This cycle can be repeated in an iterative fashion starting from the newly modified genome (dotted arrow).

i.宿主細胞またはドナー細胞からのドナー核酸の単離
第1の工程において、ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）を宿主細胞またはドナー細胞から単離する。細胞からの核酸の単離のための方法は周知であり、これには、ゲノムDNA（全ゲノムを含む）の単離のための方法、および細胞小器官のゲノムを単離するための方法が含まれる。本明細書中に記載する方法を含む任意のそのような方法を、ドナー核酸を単離するために使用することができる。当業者は、方法の選択が、単離しようとする核酸のタイプ、およびそれを単離する細胞のタイプに依存することを理解すると考えられる。 i. Isolation of Donor Nucleic Acid from Host Cell or Donor Cell In a first step, a donor nucleic acid (eg, donor genome) is isolated from the host cell or donor cell. Methods for isolation of nucleic acids from cells are well known and include methods for isolation of genomic DNA (including whole genomes) and methods for isolating organelle genomes. included. Any such method can be used to isolate the donor nucleic acid, including the methods described herein. One skilled in the art will appreciate that the choice of method will depend on the type of nucleic acid to be isolated and the type of cell from which it is isolated.

典型的には、大きな核酸（例えば、ゲノム）の単離は、以下の実施例に記載するように、アガロースプラグの中で行う。   Typically, isolation of large nucleic acids (eg, genomes) is performed in agarose plugs as described in the examples below.

記載する移植方法のいくつかの局面は、効率と、多量の質の高い移植した核酸とを提供する。一つの局面においては、ドナー核酸を含有している細胞を、ドナー核酸の単離の前に、クロラムフェニコールまたは類似する物質の存在下で増殖させる。クロラムフェニコールは、単離した核酸試料（例えば、アガロースプラグ）中でコンパクトな、完全に複製されたドナーゲノムおよび染色体を得るために使用する。進行中の複製の回と同調させるために、さらなる回の複製を阻害すること（Drakulic and Errera, Biochim Biophys Acta 31, 459（1959）;Skarstad et al, EMBO J 5, 1711（1986）;Bernander et al., J Bacteriol 177, 1670（1995）;Skarstad et al., Flow cytometry applications in cell culture A.N.E.Mohamed Al-Rubeai, Ed.（CRC Press, New York, 1996）pp.241-255）、およびコンパクトな核様体を阻害すること（Murphy and Zimmerman, J Struct Biol 133, 75（2001）;Seto and Miyata, J Bacteriol 181, 6073（1999））が公知である。マイコプラズマ培養物中のクロラムフェニコールの存在は、アガロースプラグ中でコンパクトな、完全に複製されたゲノムを得るための手助けとなり得る。   Some aspects of the described transplantation methods provide efficiency and large quantities of high quality transplanted nucleic acids. In one aspect, cells containing the donor nucleic acid are grown in the presence of chloramphenicol or similar material prior to isolation of the donor nucleic acid. Chloramphenicol is used to obtain compact, fully replicated donor genomes and chromosomes in isolated nucleic acid samples (eg, agarose plugs). Inhibiting further rounds of replication to synchronize with ongoing rounds of replication (Drakulic and Errera, Biochim Biophys Acta 31, 459 (1959); Skarstad et al, EMBO J 5, 1711 (1986); Bernander et al., J Bacteriol 177, 1670 (1995); Skarstad et al., Flow cytometry applications in cell culture ANEMohamed Al-Rubeai, Ed. (CRC Press, New York, 1996) pp.241-255), and compact It is known to inhibit nucleoids (Murphy and Zimmerman, J Struct Biol 133, 75 (2001); Seto and Miyata, J Bacteriol 181, 6073 (1999)). The presence of chloramphenicol in mycoplasma cultures can help to obtain a compact, fully replicated genome in an agarose plug.

a.宿主細胞からの単離
ドナー核酸を宿主細胞から単離する場合は、ドナー核酸を、宿主細胞と適合するプロトコールを使用して、アガロースプラグ中で単離することができる。一つの局面においては、宿主細胞が酵母である場合は、アガロースプラグを、酵母DNAの抽出のために製造業者が推奨する説明書にしたがって、任意の改変を加えて、例えば、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit（Bio-Rad）を用いて調製することができる。一つの非限定的な例においては、細菌のドナー核酸を含有している酵母宿主細胞の培養物を、OD₆₀₀がおよそ1.5に達するまで、選択培地中で30℃で増殖させる。一つの例においては、プラグあたりに利用できるドナー核酸の量を増大させるために、（製造業者が推奨する6×lO⁸個の細胞の代わりに）6×lO⁹個の酵母細胞を、1mLのプラグあたりに使用する。アガロースプラグ中に包埋した酵母宿主の細胞壁を消化する。細胞壁の消化は、CHEFキットの製造業者が推奨するように、リチカーゼ（lyticase）（Biorad）を使用して、または1OOT（β-1,3-グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼ（β-1,3-glucan laminaripentaohydrolase）;USB, Cleveland, OH）を使用して行うことができる。一つの例においては、Zymolase（商標）酵素を、5mg/mLの濃度でプラグの中および外に添加する。上記混合物を、37℃で2時間置いておくことができる。 a. Isolation from the Host Cell When the donor nucleic acid is isolated from the host cell, the donor nucleic acid can be isolated in an agarose plug using a protocol compatible with the host cell. In one aspect, if the host cell is yeast, the agarose plug can be modified with any modifications according to the manufacturer's recommended instructions for extracting yeast DNA, for example, CHEF mammalian Genomic DNA Plug. It can be prepared using Kit (Bio-Rad). In one non-limiting example, a culture of yeast host cells containing a bacterial donor nucleic acid is grown at 30 ° C. in selective media until the OD ₆₀₀ reaches approximately 1.5. In one example, in order to increase the amount of donor nucleic acid available per plug, instead of 6 × 10 ⁸ cells recommended by the manufacturer, 6 × 10 ⁹ yeast cells, 1 mL Use per plug. Digest the cell walls of the yeast host embedded in an agarose plug. Cell wall digestion can be performed using lyticase (Biorad) as recommended by the manufacturer of the CHEF kit, or 1OOT (β-1,3-glucan laminaripentahydrolase (β-1,3- glucan laminaripentaohydrolase); USB, Cleveland, OH). In one example, Zymolase ™ enzyme is added in and out of the plug at a concentration of 5 mg / mL. The mixture can be left at 37 ° C. for 2 hours.

一つの例においては、1×TE緩衝液（20mMのTris-HCl（pH 8）;50mMのEDTA）での洗浄後、包埋した酵母細胞を溶解させ、1mLのプラグあたり200μlのプロテイナーゼKを補充した、5mlのプロテイナーゼK反応緩衝液［100mMのEDTA;0.2％のデオキシコール酸ナトリウム;1％のラウリルサルコシンナトリウム;pH 8.0]とともに50℃で24時間の2回のインキュベーションにより、タンパク質を消化する。上記アガロースプラグを、40mLの1×TE緩衝液を用いて撹拌しながら室温で4回、それぞれ1時間洗浄する。その後、試料を、同じ緩衝液中で4℃で保存する。いくつかの場合には、（例えば、宿主DNAの除去またはドナーゲノムを直線化するための）続く工程において単離した核酸を消化することが所望される。そのような場合は、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオライド（PMSF）を、2回目の洗浄の間に添加する。   In one example, after washing with 1 × TE buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8); 50 mM EDTA), the embedded yeast cells are lysed and supplemented with 200 μl proteinase K per 1 mL plug. The protein is digested by two incubations at 50 ° C. with 5 ml proteinase K reaction buffer [100 mM EDTA; 0.2% sodium deoxycholate; 1% sodium lauryl sarcosine; pH 8.0]. The agarose plug is washed 4 times at room temperature for 1 hour with stirring using 40 mL of 1 × TE buffer. Samples are then stored at 4 ° C. in the same buffer. In some cases, it is desirable to digest the isolated nucleic acid in a subsequent step (eg, to remove host DNA or linearize the donor genome). In such cases, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) is added during the second wash.

ドナー核酸が細胞小器官のゲノムである場合は、単離プロトコールを、本明細書中で考察する細胞小器官のゲノムの単離方法と同様に、細胞小器官のゲノムを単離するように改変する。   If the donor nucleic acid is an organelle genome, the isolation protocol is modified to isolate the organelle genome, similar to the method of organelle genome isolation discussed herein. To do.

b.宿主核酸の除去
宿主細胞からのドナー核酸の単離のためには、宿主核酸を除去することが所望される場合がある。一つの例においては、酵母宿主細胞からの細菌ドナーゲノムの単離のために、酵母のゲノムDNAもまた、宿主細胞から抽出する細菌の核酸とともに単離される。一つの局面においては、単離には「浄化」工程が含まれる。ここでは、混入している宿主核酸を、例えば、宿主核酸を認識するが、ドナー核酸は認識しない制限酵素を用いて除去する。一つの例においては、混入している酵母のゲノムDNAを除去するために、プラグを、酵母のゲノムDNAを特異的に消化する制限酵素のカクテルで処理する。 b. Removal of Host Nucleic Acid For isolation of donor nucleic acid from host cells, it may be desirable to remove the host nucleic acid. In one example, for the isolation of a bacterial donor genome from a yeast host cell, the yeast genomic DNA is also isolated along with the bacterial nucleic acid extracted from the host cell. In one aspect, the isolation includes a “purification” step. Here, the contaminating host nucleic acid is removed using a restriction enzyme that recognizes the host nucleic acid but does not recognize the donor nucleic acid. In one example, the plug is treated with a cocktail of restriction enzymes that specifically digest the yeast genomic DNA to remove contaminating yeast genomic DNA.

一つの例においては、内因性の宿主DNAプラグの除去を、宿主のゲノムDNAを特異的に切断するが、ドナーのDNAはインタクトなまま残す制限酵素（例えば、500μLの反応容量中の50ユニットのAsiSI、RsrII、およびFseI酵素（New England Biolabs, Ipswich, MA））とともに、37℃で一晩のプラグのインキュベーションすることにより行う。その後、プラグを、1mLの1×TE緩衝液で1時間、室温で洗浄し、プラグから消化した宿主DNA断片を除去するために、1％のTAEアガロースゲル上に充填する（120分間、120ボルト）。   In one example, removal of endogenous host DNA plugs specifically restricts the genomic DNA of the host but leaves the donor DNA intact (eg, 50 units in a 500 μL reaction volume). Perform by overnight plug incubation at 37 ° C. with AsiSI, RsrII, and FseI enzymes (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). The plug is then washed with 1 mL of 1 × TE buffer for 1 hour at room temperature and loaded onto a 1% TAE agarose gel (120 minutes, 120 volts to remove digested host DNA fragments from the plug. ).

宿主のゲノムDNAが直鎖状であり、ドナーのゲノムが環状である別の例においては、宿主のゲノムDNAを、パルスフィールドアガロースゲル電気泳動により除去し、これによって、宿主のゲノムDNAをウェルの中に留め、ドナーのゲノムDNAを電気泳動によりウェルの外に流し出す（Lartigue et al., Science 317, 632（2007））。一つのそのような例においては、酵母のプラグについて、外形クランプ均一電界電気泳動（contour-clamped homogenous electric field）（Chu et al, Science 234, 1582（1986））を用いて、Bio-RadによるCHEF DR IIIIを使用して、1×TAE緩衝液中の1％のLMPゲルの中で電気泳動を行う。典型的には、パルス時間を、3.5V/cmで、24時間かけて60秒から120秒までの傾斜をつける。電気泳動後、プラグをウェルから取り出し、1×TE緩衝液中で4℃で保存する。   In another example where the host genomic DNA is linear and the donor genome is circular, the host genomic DNA is removed by pulsed field agarose gel electrophoresis, thereby removing the host genomic DNA from the wells. The donor genomic DNA is flushed out of the well by electrophoresis (Lartigue et al., Science 317, 632 (2007)). In one such example, for yeast plugs, CHEF by Bio-Rad was used using contour-clamped homogenous electric field (Chu et al, Science 234, 1582 (1986)). Electrophoresis is performed in 1% LMP gel in 1 × TAE buffer using DR IIII. Typically, the pulse time is 3.5 V / cm and ramps from 60 to 120 seconds over 24 hours. After electrophoresis, the plug is removed from the well and stored at 4 ° C. in 1 × TE buffer.

いずれかの方法による宿主DNAの分離後、さらなる処理のために、アガロースプラグをウェルから取り出すことができる。一つの例においては、取り出したプラグを、1mLの0.1×TE緩衝液中、1時間を2回洗浄し、BSA（100μg/mL）を補充した1mLの1×NEB緩衝液2（New England Biolabs, Ipswich, MA）中で1時間、平衡化させる。ドナーゲノムDNAを、これをアガロースゲル上で泳動するために直線化するためには、プラグを制限酵素とともにインキュベーションすることがある。一つの例においては、プラグを、50ユニットのPspXI制限酵素とともに37℃で一晩インキュベーションする。インキュベーション後、プラグを、1mLの1×TE緩衝液で室温で1時間洗浄し、パルスフィールドゲル上に充填する。   After separation of the host DNA by either method, the agarose plug can be removed from the well for further processing. In one example, the removed plug is washed twice in 1 mL of 0.1 × TE buffer for 1 hour and supplemented with 1 mL of 1 × NEB buffer 2 (New England Biolabs, supplemented with BSA (100 μg / mL)). Ipswich, MA) for 1 hour. In order to linearize the donor genomic DNA in order to run it on an agarose gel, the plug may be incubated with a restriction enzyme. In one example, the plug is incubated overnight at 37 ° C. with 50 units of PspXI restriction enzyme. After incubation, the plug is washed with 1 mL of 1 × TE buffer for 1 hour at room temperature and loaded onto a pulse field gel.

別の例においては、宿主DNAを、形質転換の前に除去しない。   In another example, host DNA is not removed prior to transformation.

c.ドナー細胞からの単離
ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）を、ドナー細胞からレシピエント細胞に直接移植する別の態様においては、ドナー細胞と適合する単離方法を使用する。一つの例においては、ドナー細胞からのドナー細菌ゲノムの単離のために、ゲノムDNAを含有しているアガロースプラグを、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit（Bio-Rad）を改変を加えて使用して調製する。 c. Isolation from Donor Cells In another embodiment where donor nucleic acid (eg, donor genome) is transplanted directly from donor cells to recipient cells, an isolation method compatible with the donor cells is used. In one example, for isolation of donor bacterial genomes from donor cells, an agarose plug containing genomic DNA is used with a modified CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad). Prepare.

一つの例においては、細胞（例えば、ドナーゲノムを含有しているM.ミコイデスLC細胞またはドナーゲノムを含有している酵母細胞）を、所望のODまで、適切な培地の中で増殖させ、その後、90分間、100μg/μlのクロラムフェニコールとともにインキュベーションし、この後、回収する。   In one example, cells (eg, M. mycoides LC cells containing the donor genome or yeast cells containing the donor genome) are grown in a suitable medium to the desired OD and then Incubate with 100 μg / μl chloramphenicol for 90 minutes and then collect.

マイコプラズマドナー細胞からのインタクトな全ゲノムDNAの単離のための例示的なプロトコールを、任意の改変（例えば、単離前の細胞培養物に対する改変）を加えて、Lartigue et al, Science 317, 632（2007）に記載されているように行う。一つのそのような例を実施例2B（ii）に記載する。   An exemplary protocol for isolation of intact total genomic DNA from mycoplasma donor cells, with any modifications (eg, modifications to cell culture prior to isolation), Lartigue et al, Science 317, 632 (2007). One such example is described in Example 2B (ii).

d.単離したドナー核酸の定量化
単離したドナー核酸の量は、移植の前に定量化または推定することができる。一つの態様においては、宿主細胞から単離したドナー核酸をアガロースゲル上に泳動し、既知の量のドナー細胞から単離したドナー核酸と比較する。例を実施例2Bに記載する。別の態様においては、単離したドナー核酸の量を、例えば、UV分光光度法により定量化する。一つのそのような例を実施例2B（iv）に記載する。 d. Quantification of isolated donor nucleic acid The amount of isolated donor nucleic acid can be quantified or estimated prior to transplantation. In one embodiment, donor nucleic acid isolated from host cells is run on an agarose gel and compared to donor nucleic acid isolated from a known amount of donor cells. An example is described in Example 2B. In another embodiment, the amount of isolated donor nucleic acid is quantified, for example, by UV spectrophotometry. One such example is described in Example 2B (iv).

ii.単離したドナーゲノムおよび/またはレシピエント細胞の処理
本提供の方法は、宿主、ドナー、およびレシピエント細胞/核酸の間での不和合性の障害を克服するための工程を含む。このような障壁は、本明細書中に記載され、宿主細胞由来のドナーゲノムのような大きな核酸を、その中でドナーの遺伝子産物を発現させることができるレシピエント細胞へと移植することを制限し得る。これは特に、宿主細胞がドナーおよびレシピエント生物と近い関係にはない（例えば、異なる生命の分岐に由来する）場合にそうである。このような障壁は、真核生物宿主中で増殖させた原核生物のゲノムの、原核生物レシピエントへの移植に関係する。 ii. Treatment of Isolated Donor Genome and / or Recipient Cells The provided methods include steps for overcoming incompatibility obstacles between the host, donor, and recipient cell / nucleic acid. Such barriers are described herein and limit the transfer of large nucleic acids, such as donor genomes from host cells, into recipient cells in which the donor gene product can be expressed. Can do. This is especially true when the host cell is not closely related to the donor and recipient organisms (eg, derived from a different bifurcation of life). Such barriers involve the transfer of prokaryotic genomes grown in eukaryotic hosts to prokaryotic recipients.

上記障壁は、不和合性および毒性を含む多数の要因により起こり得る。例えば、レシピエント細胞中に（およびおそらくはドナー細胞中にも）存在するが、宿主細胞中には存在しない制限修飾（R-M）システムが、宿主細胞の中で増殖させたドナー核酸を移植する際に不和合性を引き起こす可能性がある。制限修飾システムは周知であり、外来DNAから生物を防御するために、通常は細菌生物により使用される。制限修飾システムは、一般的に、外来DNA中の特定の核酸配列を認識および切断するためのタンパク質と、修飾（例えば、メチル化）のための酵素を含み、これにより、上記生物自身の核酸中のそのような配列を保護する。制限修飾システムとしては、I型システム、II型システム、およびIII型システムが挙げられる。I型システムは、一般に、核酸配列を個別に認識する（特異性）、切断する（制限）、および修飾する（修飾）3つのタンパク質の複合体を含む。したがって、同じ複合体がDNAをメチル化し、そして切断する。II型システムは、一般に、それぞれ、DNA配列をメチル化する、および切断する、2つの別々の修飾酵素と制限酵素を含む。III型システムは、修飾および切断のためのヘテロ二量体複合体を形成する、制限酵素と修飾酵素とを含む。上記修飾酵素はまた、それら自身のDNAをメチル化することもできる。   The barrier can be caused by a number of factors including incompatibility and toxicity. For example, a restriction modification (RM) system that is present in recipient cells (and possibly also in donor cells) but not in host cells is responsible for transplanting donor nucleic acid grown in host cells. May cause incompatibility. Restriction modification systems are well known and are commonly used by bacterial organisms to protect them from foreign DNA. Restriction modification systems generally include a protein for recognizing and cleaving a specific nucleic acid sequence in the foreign DNA and an enzyme for modification (eg, methylation), thereby allowing the organism in its own nucleic acid. Protect such sequences. Restriction modification systems include type I systems, type II systems, and type III systems. Type I systems generally comprise a complex of three proteins that individually recognize (specificity), cleave (restrict), and modify (modify) nucleic acid sequences. Thus, the same complex methylates and cleaves DNA. Type II systems generally include two separate modification enzymes and restriction enzymes that methylate and cleave DNA sequences, respectively. Type III systems include restriction enzymes and modifying enzymes that form heterodimeric complexes for modification and cleavage. The modifying enzymes can also methylate their own DNA.

さらに、宿主細胞（制限修飾システムを含まないものを含む）によるDNAメチルトランスフェラーゼの発現は、ドナー核酸を修飾し、レシピエント細胞への移植後のそれらの活性化（例えば、遺伝子産物の発現）を阻害し得る。宿主細胞中での増殖および改変後のドナー核酸の構造および立体構造の変化は、ドナー核酸をレシピエント細胞に移植により戻すことにネガティブな影響を及ぼす可能性がある。   In addition, expression of DNA methyltransferases by host cells (including those that do not include restriction modification systems) modifies donor nucleic acids and activates them (eg, expression of gene products) after transplantation into recipient cells. Can inhibit. Changes in the structure and conformation of the donor nucleic acid after growth and modification in the host cell can negatively affect returning the donor nucleic acid to the recipient cell by transplantation.

本提供の移植方法は、宿主細胞中で改変および/または増殖されたドナーゲノムを、遺伝学的に異なるレシピエント細胞に（例えば、真核生物宿主から原核生物レシピエントへ）うまく移植するために、そのような制限を克服するための工程を含む。上記工程としては、（1）単離したドナー核酸の処理、および（2）レシピエント細胞の改変が挙げられる。   The presently provided transplantation method is used to successfully transplant a donor genome that has been modified and / or propagated in a host cell into a genetically different recipient cell (eg, from a eukaryotic host to a prokaryotic recipient). Including steps to overcome such limitations. The steps include (1) treatment of isolated donor nucleic acid and (2) modification of recipient cells.

a.制限修飾システムの不和合性を評価するためのインビトロアッセイ
インビトロでのアッセイを、宿主細胞、ドナー核酸、およびレシピエント細胞間に、例えば、様々な生物間での制限修飾システムの不一致が原因である不和合性の問題が存在するかどうかを決定するために利用することができる。ドナーゲノムにより、またはレシピエント細胞により発現される制限修飾システムは、宿主細胞へのドナーゲノムの移植および活性化の成功を損なう可能性を有し得る。 In vitro assays for assessing incompatibility of restriction modification systems In vitro assays are due to mismatches of restriction modification systems between host cells, donor nucleic acids, and recipient cells, eg, between different organisms. Can be used to determine if there is an incompatibility problem. Restriction modification systems expressed by the donor genome or by the recipient cell may have the potential to impair successful transplantation and activation of the donor genome into host cells.

異なるタイプの生物の宿主細胞中で増殖させたドナーゲノム（例えば、酵母の中で増殖させた細菌ゲノム）について起こり得る制限修飾の問題を試験するために、ドナー、宿主、および/またはレシピエント細胞を、制限修飾システムに関して評価する。ドナーおよび/またはレシピエント中の制限修飾システム（ならびに、上記システムの認識部位特異性）の存在は、公知の方法を使用してドナーゲノムの配列から同定することができる。World Wide Webアドレス:rebase.neb.com/rebase/rebase.html.で入手することができるREBASE（The Restriction Enzyme Database）もまた参照のこと。   Donor, host, and / or recipient cells to test for possible restriction modifications for donor genomes grown in host cells of different types of organisms (eg, bacterial genomes grown in yeast) Are evaluated with respect to the restriction modification system. The presence of the restriction modification system (and the recognition site specificity of the system) in the donor and / or recipient can be identified from the donor genome sequence using known methods. See also REBASE (The Restriction Enzyme Database) available at the World Wide Web address: rebase.neb.com/rebase/rebase.html.

R-Mシステムの存在をさらに確認するために、修飾酵素の存在をインビトロで試験することができる。この目的のために、予想した部位を認識する市販されている制限酵素を使用して、予想した認識部位のメチル化状態をプローブすることができる。例えば、予想した制限酵素システムに対応している市販されている制限酵素アイソシゾマーを、ドナーゲノムおよびレシピエントゲノムが、適切な制限酵素部位でメチル化されるかどうかを決定するために、消化反応において使用することができる。予想した部位でメチル化されるゲノムDNAを、複数の部位を認識する市販されている酵素による切断から保護することができる。レシピエントゲノムDNAが切断から保護されている場合は、R-Mシステムの修飾酵素の存在が確認される。このプロセスはまた、ドナーゲノムが上記システムから保護される可能性が高いかどうかを評価するために、ドナー細胞から単離したゲノムDNAについて行うこともできる。一例を以下の実施例2Dに記載する。   To further confirm the presence of the R-M system, the presence of the modifying enzyme can be tested in vitro. For this purpose, a commercially available restriction enzyme that recognizes the predicted site can be used to probe the methylation status of the predicted recognition site. For example, a commercially available restriction enzyme isoschizomer corresponding to the expected restriction enzyme system can be used in a digestion reaction to determine whether the donor and recipient genomes are methylated at the appropriate restriction enzyme sites. Can be used. Genomic DNA that is methylated at the predicted site can be protected from cleavage by commercially available enzymes that recognize multiple sites. If the recipient genomic DNA is protected from cleavage, the presence of a modifying enzyme in the RM system is confirmed. This process can also be performed on genomic DNA isolated from donor cells to assess whether the donor genome is likely to be protected from the system. An example is described in Example 2D below.

さらに、レシピエント細胞およびドナー細胞から調製した、細胞を含まない抽出物を、予想した制限酵素が細胞中に存在するかどうか、および細胞中で活性であるかどうかを決定するために使用することができる。細胞を含まない抽出物を作製するための方法は周知であり、細胞のタイプに応じて任意のものを、本提供の方法とともに使用することができる。一つの非限定的な例においては、マイコプラズマ細胞を含まない抽出物を、以下の実施例2D（ii）（b）に記載するように調製する。予想した制限酵素部位を含むDNAを、その配列でDNAを認識して切断する酵素が抽出物中に存在することを決定するために、制限消化において、細胞を含まない抽出物とともにインキュベーションする。消化した試料を、切断を決定するためにアガロースゲル上で泳動する。所望する場合は、特定の部位でメチル化したDNAまたは特定の部位でメチル化していないDNAを、上記アッセイにおいて比較することができる。細胞を含まない抽出物はまた、ヌクレアーゼを阻害するためのEDTA（例えば、10mMのEDTA）の添加により、メチルトランスフェラーゼ活性の供給源として使用することができる。あるいは、組換えメチルトランスフェラーゼ（例えば、大腸菌のdamメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を、消化アッセイの前にDNAをメチル化するために使用することができる。メチルトランスフェラーゼもまた精製することができる。このような消化アッセイの一例を、以下の実施例2D（ii）（b）に記載する。   In addition, cell-free extracts prepared from recipient and donor cells should be used to determine whether the expected restriction enzyme is present in the cell and whether it is active in the cell. Can do. Methods for making cell-free extracts are well known, and any can be used with the provided methods depending on the cell type. In one non-limiting example, an extract free of mycoplasma cells is prepared as described in Example 2D (ii) (b) below. DNA containing the expected restriction enzyme site is incubated with the cell-free extract in a restriction digest to determine that there is an enzyme in the extract that recognizes and cleaves the DNA at that sequence. The digested sample is run on an agarose gel to determine cleavage. If desired, DNA methylated at a specific site or DNA not methylated at a specific site can be compared in the assay. Cell free extracts can also be used as a source of methyltransferase activity by the addition of EDTA (eg, 10 mM EDTA) to inhibit nucleases. Alternatively, recombinant methyltransferases (eg, E. coli dam methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) Can be used to methylate DNA prior to digestion assays. An example of such a digestion assay is described in Example 2D (ii) (b) below.

b.ドナー核酸のメチル化
ドナー核酸は、ドナー細胞からの単離の後、レシピエント細胞への移植の前に、インビトロでメチル化することができる。ドナーゲノム（例えば、宿主細胞中で増殖させたもの）のメチル化により、宿主細胞の制限修飾システム、および/またはドナーゲノムによりコードされる制限修飾システムからそれらを保護することができる。一つの局面においては、レシピエントのR-MシステムおよびドナーによりコードされるR-Mシステムからの、宿主細胞中で増殖させたドナー核酸の保護の方法を提供する。他の局面においては、これらの生物のうちの一つのR-Mシステムからドナーゲノムを保護する方法を提供する。例えば、多くの場合は、レシピエントのR-Mシステムからドナーゲノムを保護するであろう酵素でドナーゲノムをメチル化することが可能である。これは、対応するドナー制限酵素の致死濃度に達する前に、ドナーのメチルトランスフェラーゼによりドナー核酸がメチル化される場合にそうである。 b. Methylation of donor nucleic acids Donor nucleic acids can be methylated in vitro after isolation from donor cells and prior to transplantation into recipient cells. Methylation of donor genomes (eg, those grown in host cells) can protect them from host cell restriction modification systems and / or restriction modification systems encoded by the donor genome. In one aspect, a method of protecting donor nucleic acid grown in a host cell from a recipient RM system and a donor-encoded RM system is provided. In another aspect, a method for protecting a donor genome from the RM system of one of these organisms is provided. For example, in many cases it is possible to methylate the donor genome with an enzyme that will protect the donor genome from the recipient's RM system. This is the case when the donor nucleic acid is methylated by the donor methyltransferase before the lethal concentration of the corresponding donor restriction enzyme is reached.

以下の実施例2に記載するように、M.カプリコルムレシピエント細胞に移植する際には、M.ミコイデスLCドナーゲノムDNAをそれ自身の制限システムから保護する必要はなかった。このことは、制限酵素活性が致死レベルに達する前にドナーゲノムがメチル化されることを暗に意味している。ほとんどのエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチルトランスフェラーゼ遺伝子の対を、大腸菌の中で同時にクローニングできるので、これは驚くべきことではない。Holt et al, Bioessays 29, 580（2007）を参照のこと。当業者は、ドナー細胞、宿主細胞、およびレシピエント細胞を、ドナーゲノムを移植前に保護すべきかどうかを評価するために、それらの制限修飾システムに関して評価できることを理解すると考えられる。   As described in Example 2 below, it was not necessary to protect the M. mycoides LC donor genomic DNA from its own restriction system when transplanted into M. capricolum recipient cells. This implies that the donor genome is methylated before the restriction enzyme activity reaches a lethal level. This is not surprising since most endonuclease and methyltransferase gene pairs can be cloned simultaneously in E. coli. See Holt et al, Bioessays 29, 580 (2007). One skilled in the art will appreciate that donor cells, host cells, and recipient cells can be evaluated with respect to their restriction modification system to assess whether the donor genome should be protected prior to transplantation.

酵母由来の他の細菌ゲノムを移植する場合は、その自身の制限酵素からドナーゲノムを保護するために、（例えば、以下に記載するように、ドナー由来の細胞を含まない抽出物もしくは精製したメチルトランスフェラーゼを使用するインビトロでのメチル化によるか、または、ドナーゲノム中での制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の不活化により）インビトロでドナーゲノムをメチル化することが必要な場合がある。インビトロでのメチル化および制限消化は、以下に記載するように、どのメチル化反応が特定の移植研究に必要であり得るかを決定するために使用することができる。   When transplanting other bacterial genomes from yeast, to protect the donor genome from its own restriction enzymes (eg, as described below, a donor-free cell-free extract or purified methyl It may be necessary to methylate the donor genome in vitro (by in vitro methylation using a transferase or by inactivation of a restriction endonuclease gene in the donor genome). In vitro methylation and restriction digestion can be used to determine which methylation reactions may be necessary for a particular transplantation study, as described below.

典型的には、メチル化は、それからの保護が所望されるR-Mシステムのものと同じ、またはそれと類似するメチルトランスフェラーゼを使用して行う。メチル化は、細胞抽出物（例えば、レシピエント細胞抽出物）から単離したメチラーゼ、または組換えにより産生し、精製したメチラーゼを使用して行うことができる。   Typically, methylation is performed using a methyltransferase that is the same as or similar to that of the R-M system for which protection is desired. Methylation can be performed using methylases isolated from cell extracts (eg, recipient cell extracts) or recombinantly produced and purified methylases.

一つの局面においては、レシピエントおよび/またはドナー細胞のR-Mシステムのメチラーゼを、組換え法を使用して外生的に発現させ、精製する。R-Mの予想により同定した全てのメチルトランスフェラーゼのコード配列を、酵母細胞または細菌細胞のような所望するシステムの中での発現のために、コドン最適化することができる。コード配列を含む断片を、本明細書中に記載する方法のような、多数の周知の合成合法および/またはアセンブリ方法のうちの任意のものを使用して構築することができる。一つの非限定的な例を実施例2E（i）（a）に記載する。ここでは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸を、1工程の等温DNAアセンブリ法を使用して作製した。構築後、選択した細胞中での発現のために、この断片を発現ベクターにクローニングする。   In one aspect, the methylase of the RM system of the recipient and / or donor cell is exogenously expressed and purified using recombinant methods. All methyltransferase coding sequences identified by R-M prediction can be codon-optimized for expression in the desired system, such as yeast cells or bacterial cells. Fragments containing coding sequences can be constructed using any of a number of well-known synthetic methods and / or assembly methods, such as the methods described herein. One non-limiting example is described in Example 2E (i) (a). Here, a nucleic acid encoding methyltransferase was prepared using a one-step isothermal DNA assembly method. After construction, this fragment is cloned into an expression vector for expression in selected cells.

複数のベクターを、遺伝子産物の発現のために細胞を形質転換するために使用することができる。例示的な発現システムとしては、BL21（DE3）コドンプラス（codon plus）細胞（Stratagene, La Jolla, CA）が挙げられる。メチルトランスフェラーゼの発現は、例えば、IPTGとのインキュベーションにより、細胞の中で誘導することができる。メチルトランスフェラーゼを、周知の方法を使用して細胞から精製することができる。一つの例においては、細胞溶解物を明澄化し、カラムで精製し、そしてメチルトランスフェラーゼを含有している画分を次のメチル化反応に使用する酵素緩衝液（例えば、50mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、10％のグリセロール）に対して透析する。その後、必要に応じて試料を濃縮することができる。例示的な発現プロトコールおよび精製プロトコールを、以下の実施例2E（i）（b）に詳細に記載する。   Multiple vectors can be used to transform cells for expression of the gene product. Exemplary expression systems include BL21 (DE3) codon plus cells (Stratagene, La Jolla, CA). The expression of methyltransferase can be induced in cells by, for example, incubation with IPTG. Methyltransferase can be purified from cells using well-known methods. In one example, the cell lysate is clarified, purified on a column, and the fraction containing methyltransferase is used in an enzyme buffer (eg, 50 mM HEPES-NaOH ( Dialyze against pH 7.2), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol. Thereafter, the sample can be concentrated as needed. Exemplary expression and purification protocols are described in detail in Example 2E (i) (b) below.

別の局面においては、R-Mシステムを有している細胞（例えば、レシピエント細胞またはドナー細胞）由来の粗抽出物を、宿主細胞から単離したドナー核酸をメチル化するために使用する。この局面は、レシピエント細胞または宿主細胞のR-Mシステム全てが決定されているかどうか不明である場合に有利であり得る。例えば、レシピエント細胞のR-Mシステムが明らかにはなっていない場合は、レシピエント細胞由来の粗抽出物を使用するメチル化により、全ての関連するメチルトランスフェラーゼがメチル化反応の中に存在することを確実にできると考えられる。適切な細胞抽出物を調製するための任意の周知の方法を使用することができる。マイコプラズマレシピエント細胞由来のメチルトランスフェラーゼを含有している粗細胞抽出物の調製の一例を、以下の実施例2E（ii）に記載する。細胞抽出物中のヌクレアーゼを、メチル化反応でそれらを使用できるようにするために、例えば、10mMのEDTAの添加により阻害することができる。   In another aspect, a crude extract from a cell having an RM system (eg, a recipient cell or donor cell) is used to methylate donor nucleic acid isolated from a host cell. This aspect may be advantageous when it is unclear whether all of the recipient cell or host cell R-M system has been determined. For example, if the recipient cell's RM system is not clear, methylation using a crude extract from the recipient cell confirms that all relevant methyltransferases are present in the methylation reaction. It can be surely done. Any well-known method for preparing a suitable cell extract can be used. An example of the preparation of a crude cell extract containing methyltransferase from mycoplasma recipient cells is described in Example 2E (ii) below. Nucleases in cell extracts can be inhibited, for example, by the addition of 10 mM EDTA so that they can be used in methylation reactions.

精製したメチルトランスフェラーゼまたはメチルトランスフェラーゼを含有している粗細胞抽出物を、宿主細胞から単離したドナー核酸をメチル化するために使用することができる。一つの例においては、ドナー核酸を含有しているアガロースプラグを洗浄し、メチル化緩衝液（例えば、100mMのTris-HCL（pH 7.5）;10mMのEDTA;3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン（SAM））中で平衡状態とすることができる。その後、プラグを、メチル化緩衝液と、粗細胞抽出物または精製したメチルトランスフェラーゼのいずれかを含有しているメチル化反応においてインキュベーションすることができる。SAMを含めずに並行して行った反応を対照として使用することができる。一つの局面においては、メチル化反応は、damメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）の存在下で行うことができる。メチル化後、各酵母プラグを、40μlのプロテイナーゼKを補充した1mlのプロテイナーゼK反応緩衝液中で、50℃で4時間インキュベーションすることができる。このプラグを、その後、45分間を4回、それぞれ1mLの1×TE緩衝液で洗浄し、そして、30分間を2回、それぞれ0.1×TE緩衝液上で、室温で穏やかに撹拌しながら洗浄することができる。最後の洗浄緩衝液を除去した後、プラグを融解させることができる。例を実施例3A（iii）に記載する。レシピエントR-Mシステムからのドナー核酸の保護についてのメチル化反応の有効性は、移植研究の前にインビトロで試験することができる。R-Mシステムの評価の結果に基づいて調整を行うことができる。このプロセスは、ドナーゲノムDNAまたはドナー核酸を含むプラスミドについてメチル化反応を実施することにより行うことができる。メチル化反応に続いて、メチル化によりドナー核酸を確実に保護するために、レシピエント細胞の制限酵素を使用して制限消化反応を行うことができる。一例を実施例2Eに記載する。   Purified methyltransferase or crude cell extract containing methyltransferase can be used to methylate donor nucleic acids isolated from host cells. In one example, the agarose plug containing the donor nucleic acid is washed and methylated buffer (eg, 100 mM Tris-HCL (pH 7.5); 10 mM EDTA; 3 μM DTT, 200 μM S-adenosyl). It can be equilibrated in methionine (SAM). The plug can then be incubated in a methylation reaction containing methylation buffer and either the crude cell extract or purified methyltransferase. Reactions performed in parallel without SAM can be used as a control. In one aspect, the methylation reaction can be performed in the presence of dam methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA). After methylation, each yeast plug can be incubated for 4 hours at 50 ° C. in 1 ml proteinase K reaction buffer supplemented with 40 μl proteinase K. The plug is then washed four times for 45 minutes each with 1 mL of 1 × TE buffer, and twice for 30 minutes, each on 0.1 × TE buffer, with gentle agitation at room temperature. be able to. After removing the last wash buffer, the plug can be thawed. An example is described in Example 3A (iii). The effectiveness of the methylation reaction for protecting donor nucleic acids from the recipient RM system can be tested in vitro prior to transplantation studies. Adjustments can be made based on the results of the R-M system evaluation. This process can be performed by performing a methylation reaction on a plasmid containing donor genomic DNA or donor nucleic acid. Following the methylation reaction, a restriction digestion reaction can be performed using the recipient cell's restriction enzymes to ensure protection of the donor nucleic acid by methylation. An example is described in Example 2E.

c.除タンパク質
粗抽出物とともにインキュベーションすることにより、続いて、移植の際に不和合性を起こす可能性があるドナーDNAの立体構造を変化させることができる。このような立体構造の変化は、実施例2B（iv）に記載するように、細胞抽出物の存在下または非存在下でインキュベーションしたドナーゲノムDNAを視覚化することにより評価することができる。したがって、いくつかの態様においては、ドナー核酸について、メチル化の後、移植の前に、粗抽出物中のタンパク質を除去するための除タンパク質工程を行うことができる。一つの局面においては、タンパク質は、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼK）を使用して除去することができる。例示的な処理においては、メチル化反応を行ったアガロースプラグを、プロテイナーゼK反応緩衝液およびプロテイナーゼK中で、50℃で4時間、さらにインキュベーションすることができる。プラグは、そのプラグの融解および移植に進む前に洗浄することができる。実施例2B（iv）および3A（iii）を参照のこと。 c. Deproteinization Incubation with the crude extract can subsequently change the conformation of the donor DNA that can cause incompatibility during transplantation. Such conformational changes can be assessed by visualizing donor genomic DNA incubated in the presence or absence of cell extracts, as described in Example 2B (iv). Thus, in some embodiments, the donor nucleic acid can be subjected to a deproteinization step to remove the protein in the crude extract after methylation and prior to transplantation. In one aspect, the protein can be removed using a proteinase (eg, proteinase K). In an exemplary treatment, a methylated agarose plug can be further incubated for 4 hours at 50 ° C. in proteinase K reaction buffer and proteinase K. The plug can be cleaned before proceeding with melting and implantation of the plug. See Examples 2B (iv) and 3A (iii).

d.レシピエント細胞のR-Mシステムの遺伝学的改変
いくつかの場合は、レシピエント細胞の制限修飾システムを、ドナー核酸またはゲノムの移植の前に不活化させることが必要であり得る。R-Mシステムの改変は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビトロでのメチル化の代わりに、制限修飾システムを少なくともレシピエント細胞（およびおそらく、ドナーゲノムまたは核酸）から除去するか、または不活化させることができる。 d. Genetic Modification of Recipient Cell RM System In some cases, it may be necessary to inactivate the recipient cell restriction modification system prior to donor nucleic acid or genome transfer. Modification of the RM system can be done in vitro or in vivo. As an alternative to in vitro methylation, the restriction modification system can be removed or inactivated at least from the recipient cell (and possibly the donor genome or nucleic acid).

レシピエント細胞のR-Mシステムの一つまたは複数の制限酵素を、酵素をコードする遺伝子の突然変異により不活化させることができる。このプロセスは、典型的には、移植前のドナー核酸のインビトロでのメチル化の代わりとして使用することができる。   One or more restriction enzymes of the recipient cell's RM system can be inactivated by mutation of the gene encoding the enzyme. This process can typically be used as an alternative to in vitro methylation of donor nucleic acids prior to transplantation.

しかし、ドナーゲノムの制限修飾システムの不活化は、いくつかの場合には実用的でない場合がある。例えば、移植の直後のドナーゲノムによりコードされる制限エンドヌクレアーゼの発現は、レシピエント細胞の常在性ゲノムを分解することにより、移植の駆動に役立ち得る。したがって、ドナーの制限修飾システムの除去はそのような場合には望ましくなく、メチル化を使用すべきである。当業者は、ドナー細胞、宿主細胞、およびレシピエント細胞のそれぞれを、R-Mシステムの不活化のための最良のシステムを同定するために、移植の前にこれに関して評価できることを理解すると考えられる。   However, inactivation of the donor genome restriction modification system may not be practical in some cases. For example, expression of a restriction endonuclease encoded by the donor genome immediately after transplantation can help drive the transplant by degrading the resident genome of the recipient cell. Thus, removal of the donor restriction modification system is undesirable in such cases and methylation should be used. One skilled in the art will understand that each of the donor, host and recipient cells can be evaluated in this regard prior to transplantation to identify the best system for inactivation of the RM system.

任意の突然変異プロセスを、R-Mシステムを不活化させるために使用することができる。一例を以下の実施例2Fに記載する。ここでは、マイコプラズマレシピエント細胞中の単一の制限酵素をコードする遺伝子を、ドナー核酸の移植前に不活化した。その例においては、上記遺伝子を、ピューロマイシン耐性マーカーを割り込ませることにより突然変異させ、突然変異した遺伝子を含有している細胞の選択を可能にした。他の不活化方法を本明細書中で検討し、これには、突然変異した遺伝子を含有している細胞の選択にも使用することができる様々な耐性マーカーが含まれる。そのようなマーカーを本明細書中に記載し、これらは当技術分野でも公知である。そのような突然変異体レシピエント細胞から調製した細胞抽出物は、本明細書中に記載するようにメチル化反応において対照として使用することができる。   Any mutation process can be used to inactivate the RM system. An example is described in Example 2F below. Here, a gene encoding a single restriction enzyme in mycoplasma recipient cells was inactivated prior to donor nucleic acid transplantation. In that example, the gene was mutated by interrupting a puromycin resistance marker, allowing selection of cells containing the mutated gene. Other inactivation methods are discussed herein, including various resistance markers that can also be used to select cells containing the mutated gene. Such markers are described herein and are also known in the art. Cell extracts prepared from such mutant recipient cells can be used as controls in methylation reactions as described herein.

あるいは、ドナーゲノムを、インビボで、例えば、宿主細胞中に留めたままメチル化することができる。宿主細胞内でのインビボでのメチル化は、宿主ベクターにクローニングしたドナーまたはレシピエントのメチラーゼの発現により行うことができる。この局面は、ドナーゲノム中で望ましくない変化を起こす可能性があるので、あまり望ましくない場合がある。例えば、酵母の中での細菌のメチラーゼの発現は、酵母人工染色体（YAC）または酵母セントロメアプラスミド（YCp）のいずれかの中に入れたドナーである細菌ゲノムの変更を導く可能性がある、酵母の相同組換えを増加させることが示されている。この結果は、酵母宿主細胞が、上記細菌ゲノム（細菌のゲノムの、挿入された酵母ベクター配列の領域を除く）の完全性を維持するための選択圧下にはないという理由から起こり得る。当業者には、インビトロでのメチル化、インビボでのメチル化、または例えば、耐性マーカーの挿入によるR-Mシステムの不活化を、レシピエント細胞のR-Mシステムを不活化するために使用すべきかどうかを評価できることが理解されるであろう。   Alternatively, the donor genome can be methylated in vivo, for example while remaining in the host cell. In vivo methylation in host cells can be accomplished by expression of donor or recipient methylase cloned into a host vector. This aspect may be less desirable because it can cause undesirable changes in the donor genome. For example, expression of bacterial methylase in yeast can lead to alterations in the bacterial genome that is a donor placed in either a yeast artificial chromosome (YAC) or a yeast centromere plasmid (YCp), Has been shown to increase homologous recombination. This result can occur because the yeast host cell is not under selective pressure to maintain the integrity of the bacterial genome (excluding the region of the inserted yeast vector sequence of the bacterial genome). Those skilled in the art will assess whether in vitro methylation, in vivo methylation, or inactivation of the RM system, eg, by insertion of a resistance marker, should be used to inactivate the RM system of recipient cells. It will be understood that it can be done.

iii.レシピエント細胞への移植
単離および処理の後、ドナー核酸を、本明細書中に記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用して、レシピエント細胞にさらに移植することができる。一つの例示的な移植プロトコールを、以下の実施例3に記載する。ドナーからマイコプラズマレシピエントにマイコプラズマゲノムを移植するために使用する一つの方法は、Lartigue et al, Science 317, 632（2007）に記載されている。このような方法は、ドナーゲノムに特別な特性を付与するために、扱いにくい細胞もしくは生物に由来するゲノムまたは核酸を、別の宿主の中で改変するために使用することができる。その後、この改変したゲノムを、同じドナー細胞に、またはある一定のドナー細胞に移植して戻し、それにより、レシピエント細胞に改変したゲノムの表現型を付与することができる。 iii. Transplantation into recipient cells After isolation and processing, the donor nucleic acid can be further transplanted into recipient cells using the methods described herein or methods known in the art. . One exemplary transplant protocol is described in Example 3 below. One method used to transfer the mycoplasma genome from a donor to a mycoplasma recipient is described in Lartigue et al, Science 317, 632 (2007). Such methods can be used to modify in another host a genome or nucleic acid derived from a cumbersome cell or organism in order to confer special properties to the donor genome. This modified genome can then be transplanted back into the same donor cell or into certain donor cells, thereby conferring the modified genome phenotype to the recipient cell.

レシピエント細胞は、典型的には、ドナー核酸（例えば、ドナーゲノム）からの遺伝子発現をサポートするそれらの能力に基づいて選択する。真核生物宿主への細菌ゲノムの移入を、例示的な方法として本明細書中で提供するが、これは限定とは意図されない。例えば、細菌ゲノムを、好ましい遺伝子操作システムを有している真核生物宿主細胞（例えば、酵母）に移入し、その中で改変した後、改変したゲノムから遺伝子産物を発現させるために、上記ゲノムを細菌のレシピエント細胞に移植して戻す必要がある場合がある。本明細書中で考察するように、他のエレメントの中でも、翻訳および転写の差異、ならびに異なるコドン使用法が、宿主細胞内でのドナー遺伝子産物の発現を妨げる可能性がある。したがって、上記レシピエント細胞は、ドナー細胞もしくは生物と同じ種または類似する種のものであり得る。これは、多くの場合は、ドナーと同じ目または界のものである。当業者は、そこからの発現が所望されるドナーゲノムまたは他の核酸に基づいて、適切なレシピエント細胞を決定することができると考えられる。   Recipient cells are typically selected based on their ability to support gene expression from a donor nucleic acid (eg, a donor genome). Transfer of a bacterial genome to a eukaryotic host is provided herein as an exemplary method, but this is not intended to be limiting. For example, to transfer a bacterial genome into a eukaryotic host cell (eg, yeast) having a preferred genetic engineering system, modify in it, and then express the gene product from the modified genome May need to be transplanted back into bacterial recipient cells. As discussed herein, among other elements, translational and transcriptional differences, as well as different codon usage, can interfere with the expression of the donor gene product in the host cell. Thus, the recipient cell can be of the same or similar species as the donor cell or organism. This is often of the same eye or field as the donor. One of skill in the art will be able to determine the appropriate recipient cell based on the donor genome or other nucleic acid from which expression is desired.

アガロースプラグ中でのドナー核酸の単離後、宿主DNAを任意で除去する（例えば、消化および/または電気泳動による）ことができ、任意で、メチルトランスフェラーゼおよび/またはプロテイナーゼで処理することもできる。   Following isolation of the donor nucleic acid in an agarose plug, the host DNA can optionally be removed (eg, by digestion and / or electrophoresis) and optionally treated with methyltransferase and / or proteinase.

アガロースプラグは、例えば、以下の実施例3A（ii）（b）に記載するように、β-アガラーゼI（New England Biolabs）とのインキュベーションにより融解させることができる。   The agarose plug can be thawed by incubation with β-agarase I (New England Biolabs), for example, as described in Example 3A (ii) (b) below.

移植は、形質転換を促進するために、ポリエチレングリコール（PEG）（例えば、PEG-6000もしくはPEG-8000、または他のPEG）の存在下で行うことができる。最適なPEGを決定するために、PEGの供給源、量、およびサイズを変えることができる。一つの例においては、PEGは、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000などである。PEGの濃度は、移植の条件に応じて変えることができる。濃度としては、例えば、5％もしくは約5％、または10％もしくは約10％が挙げられる。一例を以下の実施例3A（ii）（c）に記載する。融解させたプラグを、ゆっくりと振盪させながら、PEGの存在下にあるレシピエント細胞に添加して混合物とすることができる。細胞を回収することができ、遠心分離し、そして移植されたドナー核酸を含有しているレシピエント細胞を選択するための適切な選択培地を含有している培地中で増殖させることができる。一つの局面においては、細胞を培地上に播種し、コロニーが現れるまで、そのレシピエント細胞のタイプに適している条件下で増殖させる。コロニーを、突いて採取し（picked）、移植したゲノムまたは他のドナー核酸を含有しているレシピエント細胞の望ましい量が得られるまで、選択培地の中でさらに増殖させることができる。   Transplantation can be performed in the presence of polyethylene glycol (PEG) (eg, PEG-6000 or PEG-8000, or other PEG) to facilitate transformation. The source, amount, and size of PEG can be varied to determine the optimal PEG. In one example, the PEG is PEG-2000, PEG-4000, PEG-6000, PEG-8000, PEG-10000, PEG-20000, or the like. The concentration of PEG can be changed according to the conditions of transplantation. Concentrations include, for example, 5% or about 5%, or 10% or about 10%. An example is described in Example 3A (ii) (c) below. The thawed plug can be added to the recipient cells in the presence of PEG with slow shaking to form a mixture. Cells can be harvested, centrifuged, and grown in media containing appropriate selective media for selecting recipient cells containing the transplanted donor nucleic acid. In one aspect, the cells are seeded on culture medium and grown under conditions appropriate for the recipient cell type until colonies appear. Colonies can be picked and further grown in selective media until the desired amount of recipient cells containing the transplanted genome or other donor nucleic acid is obtained.

必要に応じて、ドナー核酸に対するレシピエント細胞の特定の割合を維持することができる。一つの例においては、2μgのゲノムDNAあたり、10⁷もしくは約10⁷から10⁸もしくは約10⁸個のレシピエント細胞の割合を維持することができる。本提供の移植方法を、200ngの内因性ゲノムDNAについておよそ30の形質転換体、または一つの反応あたり500から1500の移植体、あるいは、宿主またはドナー細胞から得た他の適切な量となるように使用することができる。一つの非限定的な例においては、移植は、〜10⁷個のレシピエント細胞、100ng/μlでドナーゲノムを含有している20μlの融解させたアガロースプラグを用いて行う。当業者は、ドナー核酸に対するレシピエント細胞の割合を、細胞のタイプに応じて変えることができ、実験的評価をこの比を最適化するために使用できることを理解すると考えられる。 If desired, a specific ratio of recipient cells to donor nucleic acid can be maintained. In one example, a proportion of 10 ⁷ or about 10 ⁷ to 10 ⁸ or about 10 ⁸ recipient cells can be maintained per 2 μg of genomic DNA. Use the provided transplantation method to yield approximately 30 transformants for 200 ng endogenous genomic DNA, or 500 to 1500 transplants per reaction, or other suitable amount obtained from a host or donor cell Can be used for In one non-limiting example, transplantation is performed using ˜10 ⁷ recipient cells, 20 μl of a thawed agarose plug containing the donor genome at 100 ng / μl. One skilled in the art will appreciate that the ratio of recipient cells to donor nucleic acid can vary depending on the cell type, and experimental evaluation can be used to optimize this ratio.

例示的な移植方法を図8（「3」）に説明する。この方法では、宿主細胞およびレシピエント細胞中での増殖に適しているマーカーおよびエレメントを含むゲノムDNAを、アガロースプラグ中で宿主細胞から単離し、粗抽出物または精製したメチルトランスフェラーゼでメチル化し、そしてプロテイナーゼKで除タンパク質処理する。アガロースプラグを融解させ、DNAをレシピエント細胞とともにインキュベーションし、これをその後、選択培地上に播種する。例として、YCpエレメント、テトラサイクリンマーカー、およびβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むインタクトな全M.ミコイデスLCドナーゲノムDNAを、アガロースプラグ中で酵母宿主から単離し、M.ミコイデスLC粗抽出物でメチル化し、その後、プロテイナーゼKで除タンパク質処理することができる。メチル化されたゲノムDNAを含有しているアガロースプラグを融解させ、M.カプリコルムレシピエント細胞とともにインキュベーションし、その後、形質転換体を選択するために、テトラサイクリンを含有しているSP4培地上に播種した。   An exemplary implantation method is illustrated in FIG. 8 (“3”). In this method, genomic DNA containing markers and elements suitable for growth in host cells and recipient cells is isolated from the host cells in an agarose plug, methylated with a crude extract or purified methyltransferase, and Deproteinize with proteinase K. The agarose plug is thawed and the DNA is incubated with the recipient cells, which are then seeded on selective media. As an example, intact whole M. mycoides LC donor genomic DNA containing a YCp element, a tetracycline marker, and a β-galactosidase gene was isolated from a yeast host in an agarose plug, methylated with a M. mycoides LC crude extract, and then The protein can be deproteinized with proteinase K. Thaw an agarose plug containing methylated genomic DNA and incubate with M. capricolum recipient cells, then seed on SP4 medium containing tetracycline to select transformants did.

G.反復方法
本明細書中に記載する方法は、反復様式での多数回のゲノムまたは他の核酸の改変に使用することができる。 G. Iterative Methods The methods described herein can be used for multiple rounds of genome or other nucleic acid modification in an iterative fashion.

一つの態様においては、上記方法により産生した変更した細胞（例えば、本提供の方法により、例えば、宿主細胞の中で改変した、移植改変ゲノムを含有しているレシピエント細胞）を、次の回の形質転換、改変、および移植においてドナー核酸の供給源として使用することができ、これにより、さらなる改変したゲノムおよび生物が得られる。   In one embodiment, altered cells produced by the above method (eg, recipient cells containing a transplantation modified genome modified in a host cell, eg, by the methods provided herein) are transferred to the next round. Can be used as a source of donor nucleic acid in transformation, modification, and transplantation, resulting in additional modified genomes and organisms.

図1に説明するような一つの非限定的な例においては、上記方法により産生した変更細菌細胞（例えば、本提供の方法により、例えば、酵母の中で改変した、移植改変細菌ゲノムを含有しているレシピエント細胞）を、次の回の形質転換、改変、および移植においてドナー核酸の供給源として使用することができ、これにより、さらなる改変したゲノムおよび生物が得られる。   In one non-limiting example as illustrated in FIG. 1, modified bacterial cells produced by the above method (eg, containing a transplanted modified bacterial genome modified by, for example, yeast in the methods provided herein). Recipient cells) can be used as a source of donor nucleic acid in the next round of transformation, modification, and transplantation, resulting in additional modified genomes and organisms.

宿主細胞にドナーゲノムを移動させ、これを変更し、そしてこれをゲノムの移植によりドナーにインストールして戻す代替えの反復的な態様においては、宿主ベクターを、形質転換によりドナーゲノムに挿入する。そのゲノムを宿主細胞にクローニングする。クローニング後、宿主の遺伝学的方法のレパートリーを、ドナーゲノムにおいて挿入、欠失、再構成、または改変の任意の組み合わせを作製するために使用する。その後、この変更したゲノムを単離し、表現型が変化した変更したレシピエント細胞を作製するために、レシピエント細胞に移植する。移植前に、レシピエント細胞の制限システムからドナーDNAを保護するために、ドナーDNAをメチル化することが必要な場合がある。このサイクルを、新しく変更したゲノムから出発して繰り返すことができる。   In an alternative iterative embodiment that transfers the donor genome to the host cell, changes it, and installs it back into the donor by genome transfer, the host vector is inserted into the donor genome by transformation. The genome is cloned into the host cell. After cloning, a repertoire of host genetic methods is used to create any combination of insertions, deletions, rearrangements, or modifications in the donor genome. The altered genome is then isolated and transplanted into recipient cells to produce altered recipient cells with altered phenotype. Prior to transplantation, it may be necessary to methylate the donor DNA to protect it from the recipient cell restriction system. This cycle can be repeated starting from the newly modified genome.

細菌のゲノムを酵母に移動させ、これを変更し、そしてこれをゲノムの移植により細菌にインストールして戻し、酵母ベクターを形質転換により細菌のゲノムに挿入する非限定的な例を、図16に提供する。そのゲノムを酵母にクローニングする。クローニング後、酵母の遺伝学的方法のレパートリーを、細菌のゲノムにおいて挿入、欠失、再構成、または改変の任意の組み合わせを作製するために使用する。その後、この変更したゲノムを単離し、変更した細菌を作製するためにレシピエント細胞に移植する。移植前に、レシピエント細胞の制限システムからドナーDNAを保護するために、ドナーDNAをメチル化することが必要な場合がある。このサイクルを、新しく変更したゲノム（点線の矢印）から出発して繰り返すことができる。   A non-limiting example of transferring a bacterial genome to yeast, modifying it, installing it back into the bacteria by genome transfer, and inserting the yeast vector into the bacterial genome by transformation is shown in FIG. provide. The genome is cloned into yeast. After cloning, the repertoire of yeast genetic methods is used to create any combination of insertions, deletions, rearrangements, or modifications in the bacterial genome. This altered genome is then isolated and transplanted into recipient cells to produce altered bacteria. Prior to transplantation, it may be necessary to methylate the donor DNA to protect it from the recipient cell restriction system. This cycle can be repeated starting from the newly modified genome (dotted arrow).

酵母突然変異体の選択および対抗選択のための多数の利用できる、確認された、実証された信頼できる選択マーカーは、酵母宿主細胞内での多数回、例えば、無限の反復回のシームレスな核酸の変更を行うために本提供の方法を使用することを可能にする。そうでなければ扱いにくいゲノムまたは他の大きな核酸のクローニングしたコピーに対する連続的な改変を、間断なく酵母の中で行うことができる。酵母の接合能力が、ゲノムおよび他の大きな核酸を改変するために好ましい。酵母の組換え機構は、酵母の接合の間に活性化されると、ライブラリー（例えば、クローニングしたゲノムまたは核酸の変異体を含有しているコンビナトリアルライブラリー）を作製するために使用することができる。本明細書中に記載する態様は宿主細胞として酵母細胞を利用するが、本提供の方法は、例えば、宿主細胞の突然変異体の選択および対抗選択のための選択マーカーに関してすでに理解されているか、あるいはこれに関して評価する他の宿主細胞を含むことが理解されるであろう。この態様の多数のバリエーションを検討し、本出願の範囲に含む。   A number of available, validated, proven and reliable selectable markers for selection and counter-selection of yeast mutants are available for multiple nucleic acid, for example, infinite repetitive rounds of seamless nucleic acids in yeast host cells. Allows the method provided to be used to make changes. Otherwise, continuous modifications to cloned copies of otherwise cumbersome genomes or other large nucleic acids can be made in yeast without interruption. The conjugation ability of yeast is preferred for modifying genomes and other large nucleic acids. The yeast recombination machinery, when activated during yeast conjugation, can be used to create libraries (eg, combinatorial libraries containing cloned genomic or nucleic acid variants). it can. Although the embodiments described herein utilize yeast cells as host cells, the provided methods are already understood with respect to, for example, selectable markers for selection and counter-selection of mutants of host cells, Alternatively, it will be understood to include other host cells to be evaluated in this regard. Many variations of this embodiment are contemplated and included within the scope of this application.

H.本提供の方法および組成物の使用
本提供の方法および組成物を、環境、エネルギー生産、および医薬剤に関する問題を解決するために使用することができる。本提供の方法および組成物は、商業的使用（例えば、免疫原、生物学的タンパク質および化学物質、ワクチン、バイオ燃料、および酵素のような有用なタンパク質）のために、ゲノムおよび生物ならびに他の産物を産生する、変更する、ならびに改変することにおいて有用である。例えば、本提供の方法を、任意の生物（特に、そのゲノムを従来の方法によっては容易には操作できない生物のような、乏しい遺伝子システムを有している生物）由来の核酸を操作および変更するために使用することができる。本提供の方法は、合成のゲノムを構築すること、および合成の細胞を作製するために上記ゲノムをレシピエント細胞に移植することにおいて有用である。したがって、上記方法を、医学的に有用なタンパク質（酵素、タンパク質、および核酸治療薬、抗体、免疫原、ワクチン、および他の細胞性の産物を含む）を産生するために使用することができる。 H. Use of the Provided Methods and Compositions The provided methods and compositions can be used to solve environmental, energy production, and pharmaceutical agent problems. The provided methods and compositions are suitable for commercial use (eg, useful proteins such as immunogens, biological proteins and chemicals, vaccines, biofuels, and enzymes) for genomes and organisms and other Useful in producing, altering, and modifying the product. For example, the provided methods manipulate and modify nucleic acids from any organism, particularly those having a poor genetic system, such as those whose genomes cannot be easily manipulated by conventional methods. Can be used for. The provided methods are useful in constructing synthetic genomes and transplanting the genome into recipient cells to create synthetic cells. Thus, the methods described above can be used to produce medically useful proteins, including enzymes, proteins, and nucleic acid therapeutics, antibodies, immunogens, vaccines, and other cellular products.

ワクチンは、一般的には、疾患と関係がある特定の微生物（細菌またはウイルス）に対する免疫性を改善する免疫原性調製物をいう。ワクチンは、典型的には、微生物と共通点がある少量の作用物質を含む。上記作用物質は、上記作用物質を外来のものとして認識し、これを崩壊させ、これを記憶する体の免疫システムを刺激する。結果として、上記免疫システムは、のちに遭遇するこれらの任意の微生物をより容易に認識し、崩壊させることができる。ワクチンは、予防用（例えば、任意の天然のもしくは「野生型」の病原体による将来の感染の作用を防ぐかまたは改善するため）であり得るか、または、治療用（例えば、癌ワクチン）であり得る。ワクチンは、一価（monovalent）（一価（univalent）ともいう）であっても、また、多価（multivalent）（多価（polyvalent）ともいう）であってもよい。一価のワクチンは、単一の抗原または1種類の微生物に対する免疫化のために設計することができる。多価（multivalent）または多価（polyvalent）のワクチンは、同じ微生物の2種類またはそれ以上の株に対して、あるいは、2種類またはそれ以上の微生物に対して免疫化するために設計することができる。特定の場合には、一価のワクチンは、強い免疫応答を迅速に生じさせるために使用することができる。ワクチンは、有用な免疫応答を誘導する能力を保ったまま、疾病のリスクを低下させようとする試みに使用する。ワクチンは、死滅した生物もしくは不活化した生物、またはそれらに由来する精製した産物を含み得る。免疫原性組成物は、ヒトおよび非ヒト集団（例えば、霊長類、獣医学上の動物など）の処置に有用である。   A vaccine generally refers to an immunogenic preparation that improves immunity against a particular microorganism (bacteria or virus) associated with a disease. A vaccine typically contains a small amount of an agent in common with a microorganism. The agent recognizes the agent as foreign, disrupts it, and stimulates the body's immune system to store it. As a result, the immune system can more easily recognize and destroy any of these microorganisms that are encountered later. The vaccine can be prophylactic (eg, to prevent or ameliorate the effects of future infection by any natural or “wild-type” pathogen) or is therapeutic (eg, a cancer vaccine) obtain. The vaccine may be monovalent (also referred to as univalent) or multivalent (also referred to as polyvalent). Monovalent vaccines can be designed for immunization against a single antigen or a single type of microorganism. Multivalent or polyvalent vaccines can be designed to immunize against two or more strains of the same microorganism or against two or more microorganisms it can. In certain cases, monovalent vaccines can be used to quickly generate a strong immune response. Vaccines are used in an attempt to reduce the risk of disease while retaining the ability to induce a useful immune response. Vaccines can include dead or inactivated organisms, or purified products derived therefrom. The immunogenic compositions are useful for the treatment of human and non-human populations (eg, primates, veterinary animals, etc.).

本提供の技術は、生物から免疫応答を誘発するための免疫学的組成物（例えば、以下を含むが、これらに限定されない生存している細胞およびウイルスを含有しているものなどの免疫原性組成物）の産生に有用である:改変したアデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）、ピコルナウイルス科（例えば、コクサッキーウイルス、A型肝炎ウイルス、ポリオウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、様々なタイプの単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、B型肝炎ウイルス）、フラビウイルス科（C型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルスなど）、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV））、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルスなど）、パピローマウイルス科（例えば、パピローマウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）、およびパルボウイルス科（例えば、ヒトボカウイルス、パルボウイルスB19）、インフルエンザ（例えば、H1N1インフルエンザ、B型ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae type B）など）、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、パラミクソウイルス、ならびにBCG。   The techniques provided provide immunogenic compositions for eliciting an immune response from an organism (eg, those containing living cells and viruses including, but not limited to: Useful in the production of compositions: modified adenoviridae (eg adenovirus), picornaviridae (eg coxsackie virus, hepatitis A virus, poliovirus), herpesviridae (eg various types of Herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, human cytomegalovirus), hepadnaviridae (eg, hepatitis B virus), flaviviridae (hepatitis C virus, yellow fever virus, dengue virus, West Nile virus, etc.) , Retroviridae (eg, human immunodeficiency virus (HIV)), orthomyxovirus Family (eg influenza virus), paramyxoviridae (eg measles virus, mumps virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, human metapneumovirus), papillomaviridae (eg papillomavirus), rhabdo Virology (eg, rabies virus), Togaviridae (eg, rubella virus), and Parvoviridae (eg, human bocavirus, parvovirus B19), influenza (eg, H1N1 influenza, type B hemophilus influenzae (Haemophilus influenzae) influenzae type B)), poliovirus, vaccinia virus, varicella-zoster virus, reovirus, retrovirus, poxvirus, parvovirus, picornavirus, paramyxovirus, and BCG.

本提供の技術は、生物から免疫応答を誘発するための免疫学的組成物（例えば、以下を含むがこれらに限定されない生存している細胞および細菌を含有しているものなどの免疫原性組成物）の産生に有用である:改変したボルデテラ属（Bordetella）（例えば、ボルデテラ・ペルツッシス）、ボレリア属（Borrelia）（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ）、ブルセラ属（Brucella）（例えば、ウシ流産菌（Brucella abortus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、マルタ熱菌、およびブルセラ・スイス）、カンピロバクター属（Campylobacter）（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、クラミジア属（Chlamydia）（例えば、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumonia）、クラミジア・シタッシ（Chlamydia psittaci）、およびクラミジア・トラコマチス）、クロストリジウム属（Clostridium）（例えば、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌、および破傷風菌）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（例えば、ジフテリア菌）、エンテロコッカス属（Enterococcus）（エンテロコッカス・フェカーリス、およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecum））、エシェリキア属（Escherichia）（例えば、大腸菌）、フランシセラ属（Francisella）（例えば、野兎病菌（Francisella tularensis））、ヘモフィルス属（Haemophilus）（例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenza））、ヘリコバクター属（Helicobacter）（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）、レジオネラ属（Legionella）（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ）、レプトスピラ属（Leptospira）（例えば、レプトスピラ・インテロガンス）、リステリア属（Listeria）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）（例えば、ライ菌、およびヒト型結核菌）、マイコプラズマ属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ）、ナイセリア属（Neisseria）（例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、および髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、シュードモナス属（Pseudomonas）（例えば、緑膿菌）、リケッチア属（Rickettsia）（例えば、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii））、サルモネラ属（Salmonella）（例えば、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、およびサルモネラ・チフィムリウム）、赤痢菌属（Shigella）（例えば、ソンネ菌（Shigella sonne））、ブドウ球菌属（Staphylococcus）（例えば、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）、表皮ブドウ球菌、およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus））、連鎖球菌属（Streptococcus）（例えば、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌、および化膿連鎖球菌）、トレポネーマ属（Treponema）（例えば、トレポネーマ・パリダム）、ビブリオ属（Vibrio）（例えば、コレラ菌）、およびエルシニア属（Yersinia）（例えば、エルシニア・ペスチス）は、これらを魅力的なワクチン候補にする免疫原性の特徴を有する。   The technology provided provides an immunogenic composition for eliciting an immune response from an organism (eg, an immunogenic composition such as one containing living cells and bacteria including, but not limited to: Are useful for the production of modified: Bordetella (for example Bordetella pertussis), Borrelia (for example Borrelia burgdorferi), Brucella (for example bovine abortion bacteria) (Brucella abortus), canine abortion (Brucella canis), malus fever, and Brucella swiss), Campylobacter (eg Campylobacter jejuni), Chlamydia (eg Chlamydia pneumonia) ), Chlamydia psittaci, and Chlamydia trachomatis), Clostri Clostridium (eg Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium cerevisiae, and tetanus), Corynebacterium (eg diphtheria), Enterococcus (Enterococcus faecum and Enterococcus faecum), Escherichia (eg, E. coli), Francisella (eg, Francisella tularensis), Haemophilus (eg, Haemophilus influenza), Helicobacter (eg, Helicobacter pylori), Legionella (eg, Legionella pneumophila), Leptospira (Leptospira) ) (E.g., Leptospira interrogans), Listeria (e.g., Listeria monocytogenes), Mycobacterium (e.g., Rye and Mycobacterium tuberculosis), Mycoplasma (e.g., Mycoplasma) Pneumoniae, Neisseria (eg, Neisseria gonorrhoeae), and Neisseria meningitides, Pseudomonas (eg, Pseudomonas), Rickettsia (eg, Rickettsia) Rickettsia rickettsii), Salmonella (eg, Salmonella typhi, and Salmonella typhimurium), Shigella (eg, Shigella sonne), Staphylococcus (Staphylococcus) (eg, Staphylococcus aureus, pneumonia) Streptococcus pneumonia, Staphylococcus epidermidis, and Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus (eg, Streptococcus agaractie, Streptococcus pneumoniae, and Streptococcus pyogenes), Reponema (Eg, Treponema Paridam), Vibrio (eg, Vibrio cholerae), and Yersinia (eg, Yersinia pestis) have immunogenic characteristics that make them attractive vaccine candidates. Have.

利用できるワクチンの調製方法では、それらの免疫原性を保ったまま、多くの生物のそれらの病原性を効率よく取り除くことはできていない。大きな核酸および遺伝子を変更および操作するために（例えば、組み合わせて）使用することができる本提供の方法ならびに組成物は、そのようなワクチンを変更するために使用することができる。   Available vaccine preparation methods have not been able to efficiently remove their pathogenicity in many organisms while retaining their immunogenicity. The provided methods and compositions that can be used to modify and manipulate large nucleic acids and genes (eg, in combination) can be used to modify such vaccines.

本明細書中に記載する方法は、以下の生物学的影響を処置する、予防する、または実質的に減少させるために有効な組成物を産生するために使用することができる:水疱瘡、帯状疱疹、インフルエンザ、ポリオ、麻疹、ムンプス、風疹、毒性ショック、コレラ、腺ペスト、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、黄熱病、マラリア、結核、破傷風、脳炎、後天性免疫不全症候群（AIDS）、ライ病、イヌジステンパー、イヌパルボウイルス、感染性イヌ肝炎、アデノウイルス-2、レプトスピラ症、百日咳、イヌパラインフルエンザウイルス、デング熱、ライム病、ならびに、ワクチンが一つまたは複数の症状の処置および/または管理に有用である別の他の疾患。   The methods described herein can be used to produce a composition effective to treat, prevent, or substantially reduce the following biological effects: chicken pox, shingles Flu, polio, measles, mumps, rubella, toxic shock, cholera, gland plague, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, yellow fever, malaria, tuberculosis, tetanus, encephalitis, acquired immune deficiency syndrome (AIDS) , Ley disease, canine distemper, canine parvovirus, infectious canine hepatitis, adenovirus-2, leptospirosis, whooping cough, canine parainfluenza virus, dengue fever, Lyme disease, and vaccine treatment of one or more symptoms and / or Or another other disease that is useful in management.

本明細書中に記載する方法での使用について企図されるさらなるウイルスのタイプ、ファミリー、および関連する疾患を、以下の表に提供する。

Additional viral types, families, and related diseases contemplated for use in the methods described herein are provided in the table below.

本明細書中に記載する方法での使用が企図されるさらなる細菌種および関連する疾患を、以下の表に提供する。

Additional bacterial species and associated diseases contemplated for use in the methods described herein are provided in the table below.

本明細書中に記載する方法はまた、細菌であるマイコプラズマ・ミコイデススモールコロニーにより起こる疾患である牛肺疫（CBPP）を処置または予防するために有効な組成物を産生するためにも使用することができる。この疾患は肺ペストとしても知られており、ウシ、ヤク、バッファロー、およびゼブの主要な病原体である。この疾患は、アフリカ、中東、南ヨーロッパ、ならびにアジアの一部に広まっている。改良型のワクチンが真に求められている。病原生物は、本提供の方法の局面を明らかにするために本明細書中で使用する細菌M.ミコイデスラージコロニー株GM12とは系統発生学的に近い。M.ミコイデススモールコロニー細菌の抗原遺伝子および/またはゲノムを、生ワクチンとして機能する細胞（例えば、突然変異体）を作製するために、本提供の技術を使用してクローニングし、操作することができる。   The methods described herein are also used to produce a composition effective to treat or prevent bovine pneumonia (CBPP), a disease caused by the bacterium Mycoplasma mycoides small colony. be able to. This disease, also known as lung plague, is the major pathogen of cattle, yaks, buffalo, and zeb. The disease is widespread in Africa, the Middle East, Southern Europe, and parts of Asia. There is a real need for improved vaccines. The pathogenic organism is phylogenetic close to the bacterial M. mycoides large colony strain GM12 used herein to elucidate aspects of the provided methods. The antigen gene and / or genome of M. mycoides small colony bacteria can be cloned and manipulated using the provided technology to create cells (eg, mutants) that function as live vaccines. it can.

本提供の方法は、マイコプラズマの病原性および生物学を調査するためのモデルシステムとして、例えば、M.ミコイデスLCおよび近い関係にある種とともに使用することができる。マイコプラズマのミコイデスグループは、反芻動物の主要な病気を引き起こし、ワクチンが緊急に求められている。本提供の方法は、生ワクチン株の構築を加速することができる。上記方法はまた、特に、M.ミコイデスゲノムのような小さいゲノムの中での生存に必要な最小の遺伝子相補体(gene complement)を決定するために使用することができる。   The provided methods can be used as a model system for investigating the pathogenicity and biology of mycoplasmas, for example, with M. mycoides LC and closely related species. Mycoplasma's Mycoides group causes major illnesses in ruminants and vaccines are urgently needed. The provided methods can accelerate the construction of live vaccine strains. The method can also be used to determine the minimal gene complement necessary for survival, particularly in small genomes such as the M. mycoides genome.

ワクチンの投与方法は当技術分野で公知であり、これには、免疫原性ワクチン組成物の被検体への注射およびエアゾール送達が含まれる。組成物は、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤とともに処方し、投与することができる。本明細書中で同定した疾患または症状の処置のための医薬剤の中に処方した免疫原性ワクチンを含む組成物もまた、本明細書中で提供する。被検体への投与後の免疫原性ワクチン組成物の効果は、免疫応答の一つまたは複数の局面に関して測定することができる。免疫応答としては、例えば、抗体応答の誘導（増大した抗体力価）、サイトカイン応答、Tヘルパー（T_H1およびT_H2）細胞の分化および増殖の誘導などが挙げられる。このような応答のそれぞれを定量化することができる。免疫応答はまた、患者の全細菌量またはウイルス量の減少を含む。 Methods of administering vaccines are known in the art and include injection of an immunogenic vaccine composition into a subject and aerosol delivery. The composition can be formulated and administered with any pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Also provided herein are compositions comprising an immunogenic vaccine formulated in a pharmaceutical agent for the treatment of a disease or condition identified herein. The effect of the immunogenic vaccine composition after administration to a subject can be measured with respect to one or more aspects of the immune response. The immune response includes, for example, induction of antibody response (increased antibody titer), cytokine response, induction of T helper (T _H 1 and T _H 2) cell differentiation and proliferation. Each such response can be quantified. The immune response also includes a reduction in the patient's total bacterial or viral load.

本明細書中で開示する方法はまた、バイオ燃料の開発にも有用である。   The methods disclosed herein are also useful for biofuel development.

バイオ原油（biocrude）は、原油もしくは石油の他の形態の代用またはそれらを補うものとして製油所で原料として使用される生物学的に産生された化合物、あるいは様々な生物学的に産生された化合物の混合物である。必ずしもそうではないが、一般的には、これらの原料は、石油精製への導入に適している液体状態になるように、生物学的、化学的、機械的、または熱処理により前処理されている。   Biocrude is a biologically produced compound used as a feedstock in a refinery as a substitute for or supplementing crude oil or other forms of petroleum, or various biologically produced compounds It is a mixture of In general, but not necessarily, these feedstocks have been pre-treated by biological, chemical, mechanical, or heat treatment so as to be in a liquid state suitable for introduction into petroleum refining. .

微生物は、バイオ燃料組成物にするためにさらに処理されうるバイオ原油を産生するように、本明細書中に記載する方法を使用して改変することができる。その後、バイオ燃料を、仕上げた燃料（finished fuel）または燃料添加剤とすることができる。   Microorganisms can be modified using the methods described herein to produce bio-crude oil that can be further processed into a biofuel composition. The biofuel can then be a finished fuel or fuel additive.

「仕上げた燃料」は、優れた燃料または燃料添加剤としてエンジンにおいて直接使用しようとする適切な化学的および物理的状態である、（化学的、熱化学的、または生物学的経路を通じて産生された）化学的化合物または化学的化合物の混合物をいう。常にそうではないが、多くの場合は、エンジンでの用途における使用についての仕上げた燃料の適合性は、満たされなければならない必要な物理的および化学的特性を記載している規格により決定される。エンジンのいくつかの例は以下である:内燃機関、ガスタービン、蒸気タービン、外燃機関、および蒸気ボイラー。仕上げた燃料のいくつかの例としては、以下が挙げられる:圧縮点火（ディーゼル）内燃機関で使用されるディーゼル燃料、航空用タービンで使用されるジェット燃料、蒸気を生じさせるためにボイラーの中で、または外燃機関で使用する燃料油、flex-fuelエンジンで使用するエタノール。燃料規格の例は、ASTM基準（主に米国で使用されている）およびEN基準（主に欧州で使用されている）である。   A “finished fuel” is a suitable chemical and physical state that is intended to be used directly in an engine as an excellent fuel or fuel additive (produced through a chemical, thermochemical, or biological route ) Refers to a chemical compound or a mixture of chemical compounds. In many cases, but not always, the suitability of the finished fuel for use in engine applications is determined by standards describing the necessary physical and chemical properties that must be met. . Some examples of engines are: internal combustion engines, gas turbines, steam turbines, external combustion engines, and steam boilers. Some examples of finished fuels include: diesel fuels used in compression ignition (diesel) internal combustion engines, jet fuels used in aviation turbines, in boilers to produce steam Fuel oil for use in external combustion engines, ethanol for flex-fuel engines. Examples of fuel standards are ASTM standards (mainly used in the United States) and EN standards (mainly used in Europe).

「燃料添加剤」は、様々な理由（バイオ燃料の使用の指令書（mandate）に従うこと、化石燃料由来の産物の消費量を減少させること、または燃料もしくはエンジンの性能を向上させることを含むがこれらに限定されない）のために別の燃料と組み合わせて使用される化合物あるいは組成物をいう。例えば、燃料添加剤を、凝固点/ゲル化点、曇り点、潤滑性、粘性、酸化安定性、発火性、オクタンレベル、および引火点を変えるために使用することができる。添加剤はさらに、抗酸化剤、解乳化剤、含酸素添加剤（oxygenate）、熱安定性向上剤（thermal stability improver）、セタン価向上剤、安定剤、低温流動性向上剤、燃料油助燃剤、消泡剤、ヘイズ防止（anti-haze）添加剤、氷結防止剤、インジェクター清浄添加剤（injector cleanliness additives）、防煙剤、抗力減少添加剤、金属不活性化剤、分散剤、界面活性剤、解乳化剤、色素、マーカー、静電気拡散剤（static dissipater）、殺生物剤、および/または防蝕剤として機能し得る。   “Fuel additives” include various reasons (including following the mandate for the use of biofuels, reducing the consumption of products derived from fossil fuels, or improving the performance of a fuel or engine. (But not limited to) a compound or composition used in combination with another fuel. For example, fuel additives can be used to change the freezing / gelling point, cloud point, lubricity, viscosity, oxidative stability, ignitability, octane level, and flash point. Additives further include antioxidants, demulsifiers, oxygenates, thermal stability improvers, cetane improvers, stabilizers, low temperature fluidity improvers, fuel oil aids, Antifoaming agent, anti-haze additive, anti-icing agent, injector cleanliness additives, smoke-proofing agent, drag reduction additive, metal deactivator, dispersant, surfactant, It can function as a demulsifier, pigment, marker, static dissipater, biocide, and / or corrosion inhibitor.

いくつかの真核生物である藻類は、それらの乾燥重量の70％ほどの量の油を合成する。光合成の産物であるこれらの油は、理想的なバイオ燃料の候補である。これらの油を産生する生物は、耕作地がバイオ燃料の産生のために失われてしまうことがないように、荒れ地の池の中で増殖させることができる。このような藻類の使用は、典型的には、それらの遅い増殖により限定される。しかし、本提供の方法は、例えば、転写プロモーター、翻訳シグナルを操作すること、およびコドン最適化により、油の合成経路に関係している酵素を発現するように新しい生物（例えば、原核生物）を変更するために、生物のゲノムを操作するために使用することができる。上記方法は、光合成の通常の産物（グルコース）の代わりにバイオ燃料（例えば、藻類により産生された油）を産生するキメラゲノムを有している新しい細菌を変更するために、光合成細菌のゲノムを改変するために使用することができる。   Some eukaryotic algae synthesize oil as much as 70% of their dry weight. These oils, the products of photosynthesis, are ideal biofuel candidates. These oil-producing organisms can be grown in wastewater ponds so that arable land is not lost due to biofuel production. The use of such algae is typically limited by their slow growth. However, the provided methods allow new organisms (eg, prokaryotes) to express enzymes involved in the oil synthesis pathway, eg, by manipulating transcriptional promoters, translational signals, and codon optimization. To modify, it can be used to manipulate the genome of an organism. The above method changes the genome of a photosynthetic bacterium to change a new bacterium that has a chimeric genome that produces biofuel (eg, oil produced by algae) instead of the normal product of photosynthesis (glucose). Can be used to modify.

本開示の方法を使用して作製した組換え体である微生物は、リグノセルロース系バイオマスに由来するグルコースおよび他の糖をゲラニオールに転換することができる変更された生合成経路を含み得る。   Recombinant microorganisms made using the methods of the present disclosure can include altered biosynthetic pathways that can convert glucose and other sugars derived from lignocellulosic biomass to geraniol.

本開示の方法を使用して作製した組換え微生物（例えば、光合成微生物の株）を、分岐鎖のアルコール（例えば、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、およびイソブタノールを含む）を生物学的に産生するために使用することができる。一つの局面は、2-ケト分岐鎖酸（2-keto branched-chain acid）の産生および脱カルボキシル化を促進し、対応する分岐鎖のアルデヒドの産生を誘導する酵素をコードする異種遺伝子の導入による組換え体である光合成微生物の産生を含む。さらなる遺伝子導入は、その後、分岐鎖のアルデヒドを、対応する分岐鎖のアルコールに効率よく還元するために行うことができる。加えて、分岐鎖のアルコールがインビボで酵素により脱水されて様々な分岐鎖のα-オレフィンが生じるように、上記微生物を変更することができる。   Recombinant microorganisms (eg, photosynthetic microorganism strains) produced using the methods of the present disclosure are converted to branched chain alcohols (eg, 2-methyl-1-butanol, 3-methyl-1-butanol, and isobutanol). Can be used for biological production. One aspect is through the introduction of a heterologous gene encoding an enzyme that promotes the production and decarboxylation of 2-keto branched-chain acid and induces the production of the corresponding branched-chain aldehyde. Includes the production of recombinant photosynthetic microorganisms. Further gene transfer can then be performed to efficiently reduce the branched aldehyde to the corresponding branched alcohol. In addition, the microorganism can be modified such that branched chain alcohols are dehydrated by enzymes in vivo to yield various branched chain α-olefins.

植物のアシル-ACPチオエステラーゼをコードするように、組換え体である微生物を、本開示の方法を使用して作製した。このような核酸分子は、脂肪酸および脂肪酸産物（例えば、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪族エステル（蝋エステルを含む））、および炭化水素を合成するために、生物（例えば、光合成生物および原核生物）を形質転換するために使用することができる。本明細書中に提供する方法を使用して形質転換した生物もまた含まれる。   Recombinant microorganisms were produced using the methods of the present disclosure to encode plant acyl-ACP thioesterases. Such nucleic acid molecules are used to synthesize fatty acids and fatty acid products (eg, fatty aldehydes, fatty alcohols, aliphatic esters (including wax esters)), and hydrocarbons (eg, photosynthetic organisms and prokaryotes). Can be used to transform. Also included are organisms transformed using the methods provided herein.

組換え体である微生物（例えば、組換え体である光合成微生物）を、少なくとも一つの外因性のアシル-ACPチオエステラーゼを産生する少なくとも一つの組換え発現システムを含む核酸分子を含むように、本開示の方法を使用して作製した。ここでは、上記アシル-ACPチオエステラーゼは、6個〜20個の炭素を含む脂肪酸鎖を遊離状態とし、上記微生物は、アシル-ACPチオエステラーゼにより遊離状態となった脂肪酸を培地中に分泌する。チオエステラーゼは、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個の炭素を含む脂肪酸鎖を遊離状態にするために使用することができる。このように回収した脂肪酸を、合成によりさらに改変するか、またはバイオ燃料もしくは化学薬品の成分として直接使用することができる。   A microorganism that is recombinant (eg, a photosynthetic microorganism that is recombinant) includes a nucleic acid molecule comprising at least one recombinant expression system that produces at least one exogenous acyl-ACP thioesterase. Made using the disclosed method. Here, the acyl-ACP thioesterase releases a fatty acid chain containing 6 to 20 carbons, and the microorganism secretes the fatty acid released by the acyl-ACP thioesterase into the medium. Thiosesterase is 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 It can be used to free carbon-containing fatty acid chains. The fatty acids thus recovered can be further modified by synthesis or used directly as components of biofuels or chemicals.

そのような構成においては、プラスチド輸送ペプチドの領域をコードする遺伝子の部分を除去することが所望される場合がある。なぜなら、この領域は、原核生物においては不適切であるからである。あるいは、発現を真核細胞内で行う場合は、宿主生物に適しているプラスチド輸送ペプチドをコードする領域で置換することができる。好ましいコドンもまた、宿主に応じて利用することができる。   In such a configuration, it may be desirable to remove the portion of the gene that encodes the region of the plastid transit peptide. This is because this region is inappropriate in prokaryotes. Alternatively, if expression is in eukaryotic cells, it can be replaced with a region encoding a plastid transit peptide suitable for the host organism. Preferred codons can also be utilized depending on the host.

微生物のゲノムを、中鎖の長さを有しているアシル-ACPを優先的に産生するβ-ケトアシルシンターゼ（KAS）をコードする異種遺伝子の発現システムを含むようにさらに改変することができる。このようなKAS酵素は、異種の中鎖のアシル-ACP TEによる認識および切断に適している長さのアシル-ACP分子の利用可能性を増大させるために役立つと考えられる。別の例は、異種のアシル-ACP TE遺伝子を含有している光合成宿主細胞を、多機能性アセチル-CoAカルボキシラーゼをコードする異種遺伝子、またはマルチサブユニット型のアセチル-CoAカルボキシラーゼの様々なサブユニットをコードする異種遺伝子のセットについての発現システムを含むように、さらに改変することができることである。脂肪酸生合成経路のさらなる酵素または成分をコードする他の異種遺伝子もまた、アシル-ACP TEを含有している宿主細胞に導入し、その中で発現させることができる。   The microbial genome can be further modified to include a heterologous gene expression system that encodes a β-ketoacyl synthase (KAS) that preferentially produces acyl-ACP having a medium chain length. . Such a KAS enzyme would help to increase the availability of length-acyl-ACP molecules suitable for recognition and cleavage by heterogeneous medium-chain acyl-ACP TEs. Another example is that a photosynthetic host cell containing a heterologous acyl-ACP TE gene can be transformed into a heterologous gene encoding a multifunctional acetyl-CoA carboxylase, or various subunits of a multi-subunit acetyl-CoA carboxylase. Can be further modified to include an expression system for a set of heterologous genes encoding. Other heterologous genes encoding additional enzymes or components of the fatty acid biosynthetic pathway can also be introduced into and expressed in host cells containing acyl-ACP TE.

光合成微生物はまた、β-酸化経路の酵素をコードする一つもしくは複数の遺伝子を不活化するまたはダウンレギュレートするように改変することができるか、あるいは、酵素自体をアシル-ACPから遊離状態となった脂肪酸の分解を防ぐために阻害することができ、それにより、分泌された脂肪酸の収量が増加する。所望する産物が中鎖の脂肪酸である場合は、これらの鎖長を優先的に基質として使用するアシル-CoAシンターゼおよび/またはアシル-CoAオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子の不活化あるいはダウンレギュレーションが有効であると考えられる。酵素の活性を低下させるような、中鎖特異的アシル-CoAシンターゼおよび/または中鎖特異的アシル-CoAオキシダーゼ酵素をコードしている遺伝子の突然変異もまた、分泌される脂肪酸の収量を増加させることにおいて有効であると考えられる。さらなる改変は、アシル-ACPシンターゼ遺伝子を不活化またはダウンレギュレートするか、あるいは、上記遺伝子もしくはタンパク質を不活化する。   The photosynthetic microorganism can also be modified to inactivate or down-regulate one or more genes encoding enzymes in the β-oxidation pathway, or the enzyme itself can be made free from acyl-ACP. Can be inhibited to prevent degradation of the fatty acids, thereby increasing the yield of secreted fatty acids. When the desired product is a medium-chain fatty acid, inactivation or down-regulation of the gene encoding acyl-CoA synthase and / or acyl-CoA oxidase enzyme that uses these chain lengths preferentially as a substrate is effective. It is believed that there is. Mutations in genes encoding medium-chain specific acyl-CoA synthase and / or medium-chain specific acyl-CoA oxidase enzymes that reduce the activity of the enzyme also increase the yield of secreted fatty acids Is considered to be effective. Further modifications inactivate or down-regulate the acyl-ACP synthase gene or inactivate the gene or protein.

光合成微生物はまた、貯蔵炭水化物（storage carbohydrate）もしくはポリヒドロキシアルカン酸（PHA）生合成経路の酵素をコードする一つまたは複数の遺伝子を不活化またはダウンレギュレートするように改変することができるか、あるいは酵素自体を阻害することもできる。例として、グリコーゲン、デンプン、またはクリソラミナリンの合成に関与している酵素（グルカンシンターゼおよび分岐酵素を含む）が挙げられる。他の例としては、PHAの生合成に関与している酵素、例えば、アセトアセチル-CoAシンターゼおよびPHAシンターゼが挙げられる。   The photosynthetic microorganism can also be modified to inactivate or down-regulate one or more genes encoding enzymes in the storage carbohydrate or polyhydroxyalkanoic acid (PHA) biosynthetic pathway, Alternatively, the enzyme itself can be inhibited. Examples include enzymes (including glucan synthase and branching enzymes) involved in the synthesis of glycogen, starch, or chrysolaminarin. Other examples include enzymes involved in PHA biosynthesis, such as acetoacetyl-CoA synthase and PHA synthase.

本開示の方法はまた、工業用酵素および工業用生物の産生にも有用である。本開示の方法は、キメラゲノム（例えば、クロストリジウム・アセトブチリクムとクロストリジウム・セルロリチカム（Clostridium cellulolyticum）のキメラであり、グルコースからエタノールを合成するために必要な酵素をコードする前者の種に由来する遺伝子と、セルロースを効率よく分解することができるセルラーゼをコードする後者の種に由来する遺伝子を有するゲノム）を持つ新しい生物を作製するために使用することができる。したがって、本提供の方法および組成物を、エタノールを産生するために効率よくセルロースを分解する細胞および生物を得るために使用することができる。   The methods of the present disclosure are also useful for the production of industrial enzymes and industrial organisms. The method of the present disclosure is a chimeric genome (eg, a chimera of Clostridium acetobutylicum and Clostridium cellulolyticum, a gene derived from the former species encoding an enzyme required to synthesize ethanol from glucose; It can be used to create new organisms with genomes that have genes derived from the latter species that encode cellulases that can efficiently degrade cellulose. Thus, the provided methods and compositions can be used to obtain cells and organisms that efficiently degrade cellulose to produce ethanol.

他の用途を以下に記載し、本明細書中で検討する。上記方法はまた、一般的に、全ゲノムおよび部分的なゲノムのクローニングにおいても有用であり、これは、培養することが難しい生物に由来するゲノムの研究を容易にし、合成ゲノムの構築および増殖に役立つ。特定の好ましい工業的用途を本明細書中で記載するが、本発明の方法およびプロセスは、変更したゲノムからの、対象となる任意の表典型または産物の産生に広く適用可能なツールである。   Other uses are described below and are discussed herein. The above methods are also generally useful for cloning whole and partial genomes, which facilitates the study of genomes from organisms that are difficult to culture and facilitates the construction and propagation of synthetic genomes. Useful. Although certain preferred industrial applications are described herein, the methods and processes of the present invention are tools that are widely applicable to the production of any tabular representative or product of interest from an altered genome.

I.実施例
以下の実施例を、提供する態様を説明するために提供する。これらは、本出願の範囲を限定するようには意図されない。 I. Examples The following examples are provided to illustrate the aspects provided. These are not intended to limit the scope of this application.

実施例1
酵母宿主細胞への細菌ドナーゲノムの移入
本実施例は、本明細書中に提供する3種類の様々なクローニングアプローチ（図2）を使用した、酵母宿主細胞中での細菌ゲノムのクローニングの成功を記載する。以下に記載するように、それぞれのアプローチにより、酵母宿主ベクターと連結したドナーである細菌ゲノムを含む核酸を有している宿主細胞が得られた。これらのアプローチによる宿主細胞へのドナーゲノムの移入は、宿主細胞中でのドナーゲノムの増殖および改変、ならびに宿主細胞からレシピエント細胞へのドナーゲノムの移植のために、本提供の方法とともに使用することができる（図1）。 Example 1
Transfer of Bacterial Donor Genomes into Yeast Host Cells This example demonstrates the successful cloning of bacterial genomes in yeast host cells using the three different cloning approaches provided herein (Figure 2). Describe. As described below, each approach resulted in a host cell having a nucleic acid containing the bacterial genome as a donor linked to a yeast host vector. Transfer of a donor genome into a host cell by these approaches is used in conjunction with the methods provided herein for propagation and modification of the donor genome in the host cell and for transplantation of the donor genome from the host cell to the recipient cell. (Figure 1).

図2Aに示す第1のクローニングアプローチを、酵母の形質転換の前にドナーである細菌ゲノムに酵母宿主ベクターを挿入し、それにより、連結された分子（これを用いてその後、酵母を形質転換する）を得ることにより行った。それぞれ図2Bおよび図2Cに示す第2および第3のアプローチは、ドナーである細菌ゲノムと酵母ベクターとを相同組換えを使用して宿主細胞内で連結させることにより行った。第2のアプローチを用いた場合には、細菌ゲノムと酵母（宿主）ベクターとで酵母宿主細胞を同時形質転換した（図2B）。上記宿主ベクターは、細菌のドナーゲノム中の一つの部位に対して相同である末端領域を含む直鎖状の酵母ベクターであり、それにより、宿主ベクターを相同組換えにより挿入した。第3のアプローチを用いた場合（図2C）は、細菌ゲノムの多数の重複している断片と、酵母ベクターとで、酵母宿主細胞を形質転換した。酵母細胞内での相同組換えにより相同組換えが起こり、上記断片と酵母ベクターとが連結して、酵母ベクターと連結したドナーである細菌ゲノムを含む分子が得られた（図2C）。それぞれのアプローチを利用した研究を以下に詳細に記載する。   The first cloning approach shown in FIG. 2A inserts a yeast host vector into the donor bacterial genome prior to yeast transformation, thereby transforming the yeast with this ligated molecule. ). The second and third approaches shown in FIGS. 2B and 2C, respectively, were performed by ligating the donor bacterial genome and yeast vector in host cells using homologous recombination. When using the second approach, yeast host cells were co-transformed with the bacterial genome and the yeast (host) vector (FIG. 2B). The host vector is a linear yeast vector containing a terminal region that is homologous to one site in the bacterial donor genome, whereby the host vector was inserted by homologous recombination. When using the third approach (FIG. 2C), yeast host cells were transformed with a number of overlapping fragments of the bacterial genome and a yeast vector. Homologous recombination occurred by homologous recombination in yeast cells, and the above fragment and yeast vector were linked to obtain a molecule containing the bacterial genome as a donor linked to the yeast vector (FIG. 2C). The studies using each approach are described in detail below.

それぞれのアプローチを用いて、M.ゲニタリウムのゲノムを酵母宿主細胞にクローニングした。さらに、マイコプラズマ・ミコイデスLCのゲノムとマイコプラズマ・ニューモニエのゲノムを、図2Aに示すように、第1のアプローチを使用して酵母に移入した。M.ゲニタリウムのゲノムとM.ミコイデスLCのゲノムを、さらに、第1のアプローチ（図2A）を使用して、一つの酵母細胞に別々の分子（それぞれを酵母宿主ベクターと連結させた）として移入した。   Using each approach, the genome of M. genitalium was cloned into yeast host cells. In addition, the Mycoplasma mycoides LC genome and the Mycoplasma pneumoniae genome were transferred to yeast using the first approach, as shown in FIG. 2A. M. genitalium and M. mycoides LC genomes are further transferred as separate molecules (each linked to a yeast host vector) into one yeast cell using the first approach (Figure 2A) did.

実施例1A
組込み型酵母ベクターを使用した、酵母宿主細胞へのマイコプラズマ全ドナーゲノムの移入
本実施例は、ドナーゲノムの宿主細胞への導入のための第1のアプローチを使用した、3種類の異なるマイコプラズマドナーゲノム（M.ゲニタリウム株MS5;M.ミコイデス亜種ミコイデス、ラージコロニー株GM12;およびM.ニューモニエ株M129-B170（ATCC 29343））の、宿主である酵母細胞へのクローニング（移入および増殖）の成功を記載する。M.ゲニタリウム株MS5は、M.ゲニタリウムG37（GenBank No.L43967）の派生株であった。これは、Dhandayuthapani et al., J Bacteriol 183, 5645（2001）に記載されているように、G37株の中での一つの遺伝子の割り込みにより作製した。M.ミコイデス亜種ミコイデス、ラージコロニー株GM12（Genbankアクセッション番号NZ_AAZK01000004.1（GI:149364882）を有しているゲノム配列）は、DaMassa et al, Am J Vet Res 44, 322（1983）およびLartigue et al., Science 317, 632（2007）に記載されている。M.ニューモニエ株M129-B170（ATCC 29343）は、M.ニューモニエM129, GenBankアクセッション番号U00089.2（GI:26117688）の派生株であった。 Example 1A
Transfer of Mycoplasma Whole Donor Genome into Yeast Host Cells Using an Integrative Yeast Vector This example illustrates three different mycoplasma donor genomes using the first approach for introducing donor genomes into host cells (M.genitalium strain MS5; M. mycoides subspecies mycoides, large colony strain GM12; and M. pneumoniae strain M129-B170 (ATCC 29343)) to the host yeast cells (transfer and propagation) Describe. M. genitalium strain MS5 was a derivative of M. genitalium G37 (GenBank No. L43967). This was generated by interrupting one gene in the G37 strain as described in Dhandayuthapani et al., J Bacteriol 183, 5645 (2001). M. mycoides subspecies Mycoides, large colony strain GM12 (genomic sequence with Genbank accession number NZ_AAZK01000004.1 (GI: 149364882)) are DaMassa et al, Am J Vet Res 44, 322 (1983) and Lartigue et al., Science 317, 632 (2007). M. pneumoniae strain M129-B170 (ATCC 29343) was a derivative of M. pneumoniae M129, GenBank accession number U00089.2 (GI: 26117688).

それぞれのマイコプラズマドナーゲノムの移入は、ゲノムと宿主ベクターとを含む核酸分子を作製するために、ドナーゲノムに酵母ベクターを挿入し、その後、この分子を形質転換により宿主細胞に導入することにより行った。   Transfer of each mycoplasma donor genome was performed by inserting a yeast vector into the donor genome and then introducing this molecule into the host cell by transformation in order to produce a nucleic acid molecule containing the genome and the host vector. .

i.酵母の中でのマイコプラズマゲノムのクローニングのためのトリ-シャトル宿主ベクターの構築
2つのトリ-シャトル酵母宿主ベクターを、図2Aに示す方法を使用する酵母宿主細胞へのマイコプラズマゲノムのクローニングのために設計した。これらのベクター（pmycYACTnとminiTn-Puro-JCVI-1.7）を、図3に模式的に示す。 i. Construction of a tri-shuttle host vector for cloning of the mycoplasma genome in yeast
Two tri-shuttle yeast host vectors were designed for cloning the mycoplasma genome into yeast host cells using the method shown in FIG. 2A. These vectors (pmycYACTn and miniTn-Puro-JCVI-1.7) are schematically shown in FIG.

a.pmycYACTnベクターの構築
ベクターpmycYACTn（図3A）は10kbの長さであり、これには以下を含めた:（i）大腸菌中での増殖のための、pUC19由来の高コピーの複製起点（ori）およびアンピシリン耐性マーカー;（ii）マイコプラズマゲノムへの転位のための、IS256トランスポザーゼ遺伝子および逆位反復配列;（iii）Lartigue et al., J Bacteriol 164, 1094（1985）に記載されているような、大腸菌およびマイコプラズマの中での選択とスクリーニングのための、tetMマーカーおよびlacZマーカー（いずれも、スピラリンプロモーターから発現される）;ならびに（iv）酵母の中での複製および分離のための、自律複製配列（ARS）およびセントロメア配列（CEN）;ならびに（v）HIS3（選択可能な酵母マーカー）。 Construction of a.pmycYACTn Vector The vector pmycYACTn (Figure 3A) is 10 kb long and included: (i) a high copy origin of replication from pUC19 (ori) for propagation in E. coli ) And ampicillin resistance markers; (ii) IS256 transposase gene and inverted repeats for translocation to the mycoplasma genome; (iii) as described in Lartigue et al., J Bacteriol 164, 1094 (1985) TetM and lacZ markers (both expressed from the spiraline promoter) for selection and screening in E. coli and mycoplasmas; and (iv) autonomous for replication and segregation in yeast Replication sequence (ARS) and centromere sequence (CEN); and (v) HIS3 (selectable yeast marker).

上記ベクターは、図3Eに説明する重複している断片（断片1、2、および4〜7と示す）から、公開されているインビトロでのアセンブリ法（Gibson et al., Science 319, 1215（2008）、米国特許出願第12/247,126号、およびWO09/048885（全て引用により本明細書中に組み入れられる））を使用して構築した。断片1（1846塩基対（bp））には、大腸菌アンピシリン耐性（bla）、pUC19複製起点（これは、高収量のプラスミドの単離を容易にするために含めた）を含めた。断片2（1256bp）には、マイコプラズマIS256トランスポザーゼおよびプロモーター、ならびに、IS256逆位反復配列（図3Eに「3」と示す）（これは、転位によるベクターの挿入を容易にするために含めた）を含めた。断片4（2294bp）および断片5（3335bp）にはそれぞれ、マイコプラズマのスピラリンプロモーターを含め、それぞれ、マイコプラズマテトラサイクリン耐性遺伝子（tetM）およびLacZ遺伝子（これらは、ドナーゲノムへのベクターの挿入の選択を容易にするために含めた）を含めた。断片5にはさらに、IS256逆位反復配列を、転位による挿入を容易にするために含めた。断片6（847bp）には、S.セレビジエ（S.cerevisiae）HIS3遺伝子およびプロモーター（これは、宿主細胞の形質転換の選択を容易にするために含めた）を含めた。断片7（505bp）には、S.セレビジエのARSH4遺伝子とCEN6遺伝子（これは、複製と分離を容易にするために含めた）を含めた。図3Eを参照のこと。   The vector is derived from the overlapping fragments described in FIG. 3E (denoted as fragments 1, 2, and 4-7) from published in vitro assembly methods (Gibson et al., Science 319, 1215 (2008 ), U.S. Patent Application No. 12 / 247,126, and WO09 / 048885, all incorporated herein by reference. Fragment 1 (1846 base pairs (bp)) included E. coli ampicillin resistance (bla), the pUC19 origin of replication, which was included to facilitate the isolation of high yield plasmids. Fragment 2 (1256 bp) contains the mycoplasma IS256 transposase and promoter, and the IS256 inverted repeat (shown as “3” in FIG. 3E), which was included to facilitate vector insertion by transposition. included. Fragment 4 (2294bp) and Fragment 5 (3335bp) each contain the mycoplasma spiraline promoter, including the mycoplasma tetracycline resistance gene (tetM) and the LacZ gene, respectively, which facilitate selection of vector insertion into the donor genome Included) to include. Fragment 5 further included an IS256 inverted repeat to facilitate insertion by transposition. Fragment 6 (847 bp) included the S. cerevisiae HIS3 gene and promoter, which was included to facilitate selection of host cell transformations. Fragment 7 (505 bp) included the S. cerevisiae ARSH4 and CEN6 genes, which were included to facilitate replication and segregation. See Figure 3E.

これらの重複している断片を、表1に列挙するプライマーを使用して、PCRにより構築した（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）。表1においては、他の断片との重複領域に下線をつけた。IS256逆位反復配列（図3Eに「3」と示す）を太字体にする。以下のプラスミドを、個々の断片のPCRにおいて鋳型として使用した。断片1、4、および5については、鋳型は、pMYCO1PSlacZプラスミド（これは、Lartigue and Blanchard, et al.（2003）, Nucleic Acids Res 31（22）:6610-8に記載されているpMYCO1プラスミドから改変した）のpBS+（Stratagene, San Diego, CA）部分であった。断片2については、鋳型は、Pour-El et al, Plasmid 47（2）:129-37（2002）に記載されているpISM31.1ベクターの3.7kbのPciI-SalI断片であった。断片6と断片7については、鋳型は、Noskov et al., BMC Genomics 4（1）:16（2003）に記載されているpARS-VNプラスミドであった。   These overlapping fragments were constructed by PCR using the primers listed in Table 1 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). In Table 1, the overlapping area with other fragments is underlined. The IS256 inverted repeat (shown as “3” in FIG. 3E) is bold. The following plasmids were used as templates in the PCR of individual fragments. For fragments 1, 4, and 5, the template was modified from the pMYCO1 PSlacZ plasmid (which was modified from the pMYCO1 plasmid described in Lartigue and Blanchard, et al. (2003), Nucleic Acids Res 31 (22): 6610-8). PBS + (Stratagene, San Diego, CA). For fragment 2, the template was a 3.7 kb PciI-SalI fragment of the pISM31.1 vector described in Pour-El et al, Plasmid 47 (2): 129-37 (2002). For fragment 6 and fragment 7, the template was the pARS-VN plasmid described in Noskov et al., BMC Genomics 4 (1): 16 (2003).

（表１）大腸菌-マイコプラズマ-酵母シャトルベクターpmycYACTnの構築に使用した断片のPCRのためのプライマー

(Table 1) Primers for PCR of fragments used for construction of E. coli-mycoplasma-yeast shuttle vector pmycYACTn

それぞれの断片（アンプリコン）を得るために、PCRを、10ngのプラスミド鋳型を使用して100μLの反応容量の中で行った。プライマーを表1に示し、Phusion DNAポリメラーゼ、HF緩衝液（New England Biolabs, Ipswich, MA）を、製造業者のプロトコールに従う量で含め、さらなるMgCl₂を、2.0mMまたは3.0mMの最終濃度になるように添加した。サイクル条件（Cycling condition）は以下とした:98℃で30秒間、続いて、30サイクルの、98℃で10秒間のインキュベーション、30秒間のアニーリング、および72℃で90秒間のインキュベーション、その後、72℃で5分間。アニーリング温度は、以下のように、サイクル間で、そして様々な断片についてのPCRの間で変えた。アニーリング温度は、サイクル1〜5については46℃〜59℃の間とし、サイクル6〜30については5℃上昇させた（51℃〜64℃の間）。具体的には、サイクル1〜5のアニーリング温度は、断片1については56℃および59℃、断片5については46℃および48℃;断片4については46℃および50℃;断片2については46℃;そして断片6と断片7については、48℃および52℃とした。サイクル6〜30については、それぞれの温度を、サイクル1〜5についての温度よりも5℃高くした。それぞれの断片について、PCR産物をプールし、アンプリコンを、β-アガラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を使用してゲル精製した。 To obtain each fragment (amplicon), PCR was performed in a 100 μL reaction volume using 10 ng of plasmid template. Primers are shown in Table 1 and Phusion DNA polymerase, HF buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA) is included in an amount according to the manufacturer's protocol, with additional MgCl ₂ to a final concentration of 2.0 mM or 3.0 mM. Added to. The cycling conditions were as follows: 98 ° C. for 30 seconds, followed by 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds incubation, 30 seconds annealing, and 72 ° C. for 90 seconds incubation, then 72 ° C. For 5 minutes. The annealing temperature was varied between cycles and between PCRs for various fragments as follows. The annealing temperature was between 46 ° C and 59 ° C for cycles 1-5 and increased by 5 ° C for cycles 6-30 (between 51 ° C and 64 ° C). Specifically, the annealing temperatures for cycles 1-5 are 56 ° C and 59 ° C for Fragment 1, 46 ° C and 48 ° C for Fragment 5; 46 ° C and 50 ° C for Fragment 4; 46 ° C for Fragment 2 And for Fragment 6 and Fragment 7, they were set to 48 ° C and 52 ° C. For cycles 6-30, each temperature was 5 ° C. higher than the temperature for cycles 1-5. For each fragment, PCR products were pooled and amplicons were gel purified using β-agarase (New England Biolabs, Ipswich, Mass.).

鋳型pISM31.1から増幅したトランスポザーゼ遺伝子を含む断片2については、PCRプライマーのうちの一つに、所望する位置に鋳型に対して相同である標準の20塩基対を含め、さらに、これもまたプラスミドの他の部分に存在するIS256逆位反復配列の2つのさらなるコピーに対して相同である26塩基対を含めた。正確な断片の特異的な増幅を促進するために、これらのIS256コピーを、所望するpISM31.1の鋳型部分から、PciIとSalIでの二重制限酵素消化、その後の正確に生じた3.7kbの断片のアガロースゲルによる精製により分離し、その後、これを、断片2のPCR増幅において鋳型として使用した。   For fragment 2 containing the transposase gene amplified from the template pISM31.1, one of the PCR primers contains a standard 20 base pair homologous to the template at the desired position, which is also a plasmid Twenty-six base pairs that were homologous to two additional copies of the IS256 inverted repeat sequence present in the other part of were included. In order to facilitate specific amplification of the correct fragment, these IS256 copies were cloned from the desired pISM31.1 template part, double restriction enzyme digestion with PciI and SalI, followed by the exactly 3.7 kb Fragments were separated by purification on an agarose gel and then used as a template in PCR amplification of fragment 2.

精製した断片を、D.G.Gibson et al., Science 319, 1215-1220（2008）, 米国特許出願第12/247,126号、およびWO09/048885（全て引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている公開されているインビトロでのアセンブリ法を使用してpmycYACTnベクターが生じるようにアセンブリした。「チュー・バック・アセンブリ（chew back assembly）」（CBA）反応全体を、Taq DNAリガーゼおよびTaq DNAポリメラーゼとともに、5％のPEG-8000、50mMのTris-Cl（pH 7.5）、10mMのMgC12、10mMのDTT、25ug/mlのBSA、200uMの各dNTP、および1mMのNADの存在下で45℃で15分間、このアセンブリをインキュベーションすることにより、記載されている（Gibson et al., Science 319, 1215-1220（2008）;米国特許出願第12/247,126号;およびWO09/048885）ように修復した。その後、反応物をフェノール抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、再度懸濁し、そしてEPI300細胞（Epicentre Biotechnologies, Madison, WI）にエレクトロポレーションした。形質転換体を、カルベニシリンで選択した。選択したクローンに由来するDNAを、3種類の別々の制限酵素消化を使用して正確なサイズのプラスミドについてスクリーニングした。上記プラスミドの様々なエレメントの存在を、表現型について以下のように試験した。大腸菌中での増殖により、pUC19複製起点の機能性を確保した。カルベニシリンおよびテトラサイクリンでの大腸菌中での選択、ならびにX-galでのスクリーニングにより、bla、tetM、およびlacZマーカーのインタクトなコピーが存在することを確認した。そして、単離したベクターでの酵母の形質転換の成功は、HIS3、ARSH4、およびCEN6マーカーが生きていることを明らかにした。機能性のトランスポゾンの存在を、以下に記載するように、マイコプラズマの形質転換により確認した。   The purified fragment is described in DGGibson et al., Science 319, 1215-1220 (2008), US Patent Application No. 12 / 247,126, and WO09 / 048885, all incorporated herein by reference. A publicly available in vitro assembly method was used to produce the pmycYACTn vector. The entire “chew back assembly” (CBA) reaction, together with Taq DNA ligase and Taq DNA polymerase, 5% PEG-8000, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM MgC12, 10 mM Has been described by incubating this assembly for 15 minutes at 45 ° C. in the presence of 25 ug / ml BSA, 200 uM each dNTP, and 1 mM NAD (Gibson et al., Science 319, 1215 -1220 (2008); US patent application Ser. No. 12 / 247,126; and WO09 / 048885). The reaction was then phenol extracted, precipitated with isopropanol, resuspended, and electroporated into EPI300 cells (Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis.). Transformants were selected with carbenicillin. DNA from selected clones was screened for the correct size plasmid using three separate restriction enzyme digests. The presence of various elements of the plasmid was tested for phenotype as follows. Functionality of the pUC19 origin of replication was ensured by growth in E. coli. Selection in E. coli with carbenicillin and tetracycline and screening with X-gal confirmed the presence of intact copies of the bla, tetM, and lacZ markers. And the successful transformation of yeast with the isolated vector revealed that the HIS3, ARSH4, and CEN6 markers were alive. The presence of functional transposon was confirmed by mycoplasma transformation as described below.

b.miniTn-Puro-JCVI-1.7ベクターの構築
miniTn-Puro-JCVI-1.7ベクター（図3B）は14kbの長さであり、これは、以下の例外はあるものの、pmycYACTnと同じであった:（i）これにはlacZを含めなかった;（ii）tetMマーカーの代わりに、これにはピューロマイシン耐性マーカーを含めた;そして、（iii）これには、細菌の人工染色体（BAC）ベクターを含めた。 b. Construction of miniTn-Puro-JCVI-1.7 vector
The miniTn-Puro-JCVI-1.7 vector (Figure 3B) was 14 kb long and was the same as pmycYACTn with the following exceptions: (i) This did not include lacZ; ii) Instead of the tetM marker, this included a puromycin resistance marker; and (iii) it included a bacterial artificial chromosome (BAC) vector.

ii.ドナーゲノムへの宿主ベクターの挿入
a.M.ゲニタリウムMS5
M.ゲニタリウム株MS5のドナーゲノムの酵母宿主細胞への移入のための準備において、ベクターpmycYACTnベクターを、J.I.Glass et al, PNAS USA 103, 425（2006）に記載されているように、M.ゲニタリウムドナー細胞へのエレクトロポレーションによりドナーゲノムに挿入した。形質転換体を、テトラサイクリンの存在下での増殖により選択し、単一クローンをさらなる分析のために選択した。上記ベクターに対して内部にあるプライマーを使用した直接のゲノム配列決定（J.I.Glass et al., PNAS USA 103, 425（2006）に記載されている）を、ベクターの挿入部位を決定するために行った。選択したクローンは、pmycYACTnの2つのIS256逆位反復配列の間の配列と、pmycYACTnの2つのIS256逆位反復配列を含んでおり、これは、設計したとおりに、転位が起こったことを示していた（図3C）。トランスポザーゼ、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子は、転位の際に失われた。宿主ベクターを、不可欠ではないMG411遺伝子（J.I.Glass et al., PNAS USA 103, 425（2006）;C.A.Hutchison et al., Science 286, 2165（1999））内のドナーゲノムに挿入した。 ii. Insertion of the host vector into the donor genome
aM Genitalium MS5
In preparation for transfer of the donor genome of the M. genitalium strain MS5 into yeast host cells, the vector pmycYACTn vector was prepared as described in JIGlass et al, PNAS USA 103, 425 (2006). It was inserted into the donor genome by electroporation into donor cells. Transformants were selected by growth in the presence of tetracycline and single clones were selected for further analysis. Direct genomic sequencing (described in JIGlass et al., PNAS USA 103, 425 (2006)) using primers internal to the vector was performed to determine the insertion site of the vector. . The selected clone contains a sequence between two IS256 inverted repeats of pmycYACTn and two IS256 inverted repeats of pmycYACTn, indicating that a transposition has occurred as designed. (Figure 3C). The transposase, pUC19 origin of replication, and ampicillin resistance gene were lost during transposition. The host vector was inserted into the donor genome within the non-essential MG411 gene (JIGlass et al., PNAS USA 103, 425 (2006); CAHutchison et al., Science 286, 2165 (1999)).

b.M.ミコイデス亜種ミコイデス, ラージコロニー株GM12
M.ミコイデス亜種ミコイデス, ラージコロニー株GM12のゲノムの酵母宿主への移入のための準備において、マイコプラズマドナー細胞を、K.W.King and K.Dybvig, Plasmid 26, 108（1991）に記載されているように、PEGを使用してpmycYACTnで形質転換した。形質転換体を、テトラサイクリンを補充したプレート上での増殖により選択した。 bM Mycoides subspecies Mycoides, large colony strain GM12
In preparation for the transfer of the genome of the M. mycoides subspecies Mycoides, large colony strain GM12 into the yeast host, mycoplasma donor cells as described in KWKing and K. Dybvig, Plasmid 26, 108 (1991) , PEG was used to transform with pmycYACTn. Transformants were selected by growth on plates supplemented with tetracycline.

4つの選択したクローンを、ドナーゲノムへの宿主ベクターの挿入部位を位置決定するために、直接のゲノム配列決定により分析した。結果は、4つのクローンそれぞれにおいて、転位によるpmycYACTn構築物の一部分の組込みの代わりに、宿主プラスミド全体がドナーゲノムに組込まれていたことを明らかにした。4つのクローンのうちの3つにおいて、ベクター（pmycYACTn）が、pUC複製起点の中に、またはpUC複製起点の極めて近くに交叉事象により挿入されていた。4つ目のクローンにおいては、交叉が酵母のHIS3遺伝子内で起こり、したがって、これは、その後のゲノムでの酵母の形質転換には使用しなかった。全ての場合において、宿主ベクターの挿入は、IS1296エレメントに隣接する位置で起こった。   Four selected clones were analyzed by direct genome sequencing to locate the host vector insertion site into the donor genome. The results revealed that in each of the 4 clones, the entire host plasmid was integrated into the donor genome instead of integrating part of the pmycYACTn construct by transposition. In three of the four clones, the vector (pmycYACTn) was inserted into the pUC origin of replication or by a crossover event very close to the pUC origin of replication. In the fourth clone, crossover occurred within the yeast HIS3 gene and therefore it was not used for subsequent yeast transformations with the genome. In all cases, host vector insertion occurred at a position adjacent to the IS1296 element.

図3Dに模式的に説明するクローン1.1を確実に増殖させた。このクローンのゲノムを効率よく移植できることを確認するために、C.Lartigue et al., Science 317, 632（2007）に記載されている塩化カルシウム形質転換手順を、M.ゲニタリウムドナー細胞からM.カプリコルムレシピエント細胞にこれを移植するために行った。クローン1.1のゲノムは、M.カプリコルム宿主細胞に効率的に移植された。これにより、このクローンを、ドナーであるマイコプラズマから酵母宿主細胞へのゲノムの移入のために選択した。   Clone 1.1, schematically illustrated in FIG. 3D, was propagated reliably. To confirm that the genome of this clone can be efficiently transferred, the calcium chloride transformation procedure described in C. Lartigue et al., Science 317, 632 (2007) was performed from M. genitalium donor cells to M. genitalium donor cells. This was done to transplant this into Capricorum recipient cells. The genome of clone 1.1 was efficiently transferred into M. capricolum host cells. This clone was therefore selected for the transfer of the genome from the donor mycoplasma into yeast host cells.

c.M.ニューモニエ株M129-B170（ATCC 29343）
M.ニューモニエ株M129-B170のドナーゲノムの酵母宿主細胞への移入のための準備において、マイコプラズマを、J.I.Glass et al, PNAS USA 103, 425（2006）に記載されているようにエレクトロポレーションによりMiniTn-Puro-JCVI-1.7で形質転換した。ピューロマイシン耐性形質転換体のプールを、液体培地中で選択した。 cM pneumoniae strain M129-B170 (ATCC 29343)
In preparation for transfer of the donor genome of the M. pneumoniae strain M129-B170 into yeast host cells, Mycoplasma was purified by electroporation as described in JIGlass et al, PNAS USA 103, 425 (2006). -Transformed with Puro-JCVI-1.7. A pool of puromycin resistant transformants was selected in liquid medium.

iii.挿入された酵母ベクターを含むドナーゲノムの単離
断裂を最小限にするために、酵母ベクターの挿入断片を含むドナーゲノムを、低融点アガロースとBio-Rad CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）とを使用し、製造業者により推奨されているプロトコールに従って、アガロースプラグ中で単離した。挿入断片を持つマイコプラズマゲノムを含有しているアガロースプラグを、10mMのTris（pH 8.0）（場合によっては、1mMのEDTA）に対して1時間透析した。その後、プラグを、S.Katsura et al, Electrophoresis 21, 171（2000）に記載されているように、10mM（6％）のPEG 6000（United States Biochemical）、0.6MのNaClに対して、数時間透析した。このPEG/NaCl処理は、W303a細胞への移入のためのベクターを含むM.ミコイデスLCゲノムの単離について（以下を参照のこと）、またはVL6-48N細胞への移入のためのベクターを含むM.ニューモニエゲノムの単離（以下を参照のこと）については、行わなかった。 iii. Isolation of Donor Genome Containing Inserted Yeast Vector To minimize disruption, the donor genome containing the insert of the yeast vector was isolated from low melting point agarose and Bio-Rad CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit (Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA) and isolated in agarose plugs according to the protocol recommended by the manufacturer. The agarose plug containing the mycoplasma genome with the insert was dialyzed against 10 mM Tris (pH 8.0) (in some cases 1 mM EDTA) for 1 hour. The plug is then plugged for several hours against 10 mM (6%) PEG 6000 (United States Biochemical), 0.6 M NaCl, as described in S. Katsura et al, Electrophoresis 21, 171 (2000). Dialyzed. This PEG / NaCl treatment is for isolation of the M. mycoides LC genome containing the vector for transfer to W303a cells (see below), or M containing the vector for transfer to VL6-48N cells. No isolation of the pneumoniae genome (see below) was performed.

その後、プラグを65℃で5分間融解させ、その後、2倍容量の65℃のTEを添加し、混合物を穏やかに撹拌し、そして65℃でさらに5分間インキュベーションした。20μlを形質転換に使用した。   The plug was then thawed at 65 ° C. for 5 minutes, after which 2 volumes of 65 ° C. TE were added, the mixture was gently agitated and incubated at 65 ° C. for an additional 5 minutes. 20 μl was used for transformation.

iv.酵母ベクターを用いた、酵母宿主細胞へのドナーゲノムの移入
ドナーゲノムの宿主細胞への導入のために、酵母スフェロプラストを、推奨されているOD未満にしか培養物を増殖させなかった場合があったことを除き、N.Kouprina and V.Larionov, Nat Protoc 3, 371（2008）に記載されている公開されている方法を使用して、プラグ由来のDNAで形質転換した。 iv. Transfer of donor genome to yeast host cells using yeast vectors For introduction of donor genomes into host cells, yeast spheroplasts were grown in cultures below the recommended OD. Except in some cases, it was transformed with DNA from the plug using the published method described in N. Kouprina and V. Larionov, Nat Protoc 3, 371 (2008).

この方法を使用して、酵母ベクター挿入断片を含む3種類のゲノム全てを用いて、高い形質転換効率のために開発された酵母株VL6-48N（V.Larionov et al., PNAS USA 94, 7384（1997））を形質転換した。挿入断片を持つM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムおよびM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムを用いてまた、一般的に使用されているW303a株（MATa his3 leu2 ura3 trp1 ade2）も形質転換した。挿入断片を持つM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムはまた、組換え欠損酵母株VL6-48-Δ54G（これは、RAD54遺伝子が欠損している（MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14 rad54-Δ1::kanMX）））にも移入した。VL6-48-Δ54G株の形質転換は、多数のほぼ同一の1.5kbのIS1296コピー間での組換えが原因でこのゲノムが他の酵母の中で不安定である可能性に対処するために行った。RAD54遺伝子が欠損している酵母株は、酵母の人工染色体（YAC）の中での様々な組換え事象の発生を減少させることができる（Y.Le and M.J.Dobson, Nucleic Acids Res 25, 1248（1997））。rad54突然変異株（VL6-48Nとほぼ同質遺伝子型である）は、Vladimir Larionov（Laboratory of Molecular Pharmacology, National Cancer Institute, National Institutes of Health）から譲り受けた。   Using this method, the yeast strain VL6-48N (V.Larionov et al., PNAS USA 94, 7384) developed for high transformation efficiency using all three genomes including the yeast vector insert. (1997)). The commonly used strain W303a (MATa his3 leu2 ura3 trp1 ade2) was also transformed with the inserted M. genitalium cl16-2 and M. mycoides LC cl1.1 genomes. The M. mycoides LC cl1.1 genome with the insert is also a recombination-deficient yeast strain VL6-48-Δ54G (which lacks the RAD54 gene (MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2- 101 met14 rad54-Δ1 :: kanMX))). Transformation of the VL6-48-Δ54G strain was carried out to address the possibility of this genome being unstable among other yeasts due to recombination between many nearly identical 1.5 kb IS1296 copies. It was. Yeast strains deficient in the RAD54 gene can reduce the occurrence of various recombination events in the yeast artificial chromosome (YAC) (Y. Le and MJDobson, Nucleic Acids Res 25, 1248). 1997)). The rad54 mutant (almost isogenic with VL6-48N) was a gift from Vladimir Larionov (Laboratory of Molecular Pharmacology, National Cancer Institute, National Institutes of Health).

v.全ゲノムの移入の分析および確認
形質転換した酵母宿主細胞のそれぞれに由来するDNAを、完全な宿主ベクターを含むドナーゲノムの宿主細胞への移入を確認するために分析した。酵母にクローニングしたマイコプラズマゲノムを、完全性を確認するためにマルチプレックスPCR（MPCR）によりスクリーニングした。MPCRは、IDT由来のプライマーを使用し、Qiagen（Valencia, CA）によるMultiplex PCR Kitを用いて、1セットまたは2セットの10種類のアンプリコンそれぞれを使用して行った。個々の反応を以下にさらに詳細に記載する。 v. Whole Genome Transfer Analysis and Confirmation DNA from each transformed yeast host cell was analyzed to confirm transfer of the donor genome containing the complete host vector into the host cell. The mycoplasma genome cloned in yeast was screened by multiplex PCR (MPCR) to confirm its integrity. MPCR was performed using IDT-derived primers and each of one or two sets of 10 amplicons using a Multiplex PCR Kit by Qiagen (Valencia, Calif.). Individual reactions are described in more detail below.

挿入断片を含むゲノムのサイズを確認するために、マイコプラズマゲノムを含有している個々の酵母クローンから全DNAを単離し、以下に記載するようにゲル電気泳動により分析した。一般的には、DNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用してアガロースプラグ中で単離した。指示される場合、酵母の染色体DNAを除去するために、プラグを、数時間一定電圧でプレ電気泳動した。指示される場合、この工程の効率を高めるために、プラグを最初に、酵母の染色体を切断するが、M.ゲニタリウムまたはM.ミコイデスLC中には認識部位を持たないAsiSI、FseI、およびRsrIIで消化した。単離したDNAについて、（示した酵素を用いて）制限酵素消化を行い、続いて、示すように、フィールド・インバージョン電気泳動（Bio-Rad FIGE Mapper）またはパルスフィールド電気泳動（Bio-Rad CHEF-DR IIまたはIIIシステム）、あるいは、55℃で1時間の直線化を行った。指示される場合、ゲルについてサザンブロットを行った。サザンブロットは、プローブの標識と検出にAmersham AlkPhos Direct Labeling and Detection System with CDP-Star（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用したいくつかの場合を除き、D.G.Gibson et al., Science 319, 1215（2008）に記載されているとおりに行った。   To confirm the size of the genome containing the insert, total DNA was isolated from individual yeast clones containing the mycoplasma genome and analyzed by gel electrophoresis as described below. In general, DNA was isolated in agarose plugs using the protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” according to the Bio-Rad CHEF-DR III manual. When indicated, the plugs were pre-electrophoresed at a constant voltage for several hours to remove yeast chromosomal DNA. If indicated, to increase the efficiency of this process, plugs first cleave the yeast chromosome, but with AsiSI, FseI, and RsrII that do not have a recognition site in M. genitalium or M. mycoides LC. Digested. The isolated DNA is subjected to restriction enzyme digestion (using the indicated enzymes), followed by field inversion electrophoresis (Bio-Rad FIGE Mapper) or pulse field electrophoresis (Bio-Rad CHEF) as indicated. -DR II or III system) or linearization at 55 ° C for 1 hour. If indicated, Southern blots were performed on gels. Southern blots were performed in DGGibson et al., Science 319, 1215 (except in some cases using the Amersham AlkPhos Direct Labeling and Detection System with CDP-Star (GE Healthcare, Piscataway, NJ) for probe labeling and detection). 2008).

a.酵母宿主のPCRによるM.ゲニタリウムゲノムの単離および分析
酵母ベクターを含むM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した24個の個々のクローンに由来するゲノムDNAと、M.ゲニタリウムをW303a株へと移入した後に回収した8個の個々のクローンとを、アガロースプラグ中で単離し、完全性を確認するためにPCRによって分析した。M.ゲニタリウムの合成ゲノム（D.G.Gibson et al., Science 319, 1215（2008）に記載されているように作製した、sMgTARBAC37）およびM.ゲニタリウムの天然のゲノムを、ポジティブコントロールとして使用した。 Isolation and analysis of M. genitalium genome by PCR of yeast host Genome derived from 24 individual clones recovered after transfer of M. genitalium cl16-2 genome containing yeast vector into strain VL6-48N DNA and 8 individual clones recovered after transfer of M. genitalium into strain W303a were isolated in an agarose plug and analyzed by PCR to confirm integrity. The synthetic genome of M. genitalium (sMgTARBAC37, made as described in DGGibson et al., Science 319, 1215 (2008)) and the natural genome of M. genitalium were used as positive controls.

以下の表2に列挙するPCRプライマーを、酵母ベクター挿入断片を含むM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように一定の間隔をあけたアンプリコンを作製するためのMPCR反応において使用した。ゲノムの長さ方向に沿ったアンプリコンの位置を図4Aに示す。ここでは、アンプリコンを、黒色のバーで示し、数字はアンプリコンのサイズを示している。VL6-48NおよびW303a中のクローンから回収したDNAについてのPCRの結果（データは示さず）を表5にまとめる。24個のVL6-48N株から単離した24個のクローンのうちの22個、およびW303a株から単離した8個のクローンのうちの5個が完全なもの（それぞれのアンプリコンについての正確なサイズの産物）と見られることが、PCR分析により明らかになった（現時点で示されるデータ）。   The PCR primers listed in Table 2 below were used in the MPCR reaction to create amplicons spaced at regular intervals to surround the M. genitalium genome containing the yeast vector insert. The position of the amplicon along the length of the genome is shown in FIG. 4A. Here, the amplicon is indicated by a black bar, and the number indicates the size of the amplicon. The PCR results (data not shown) for DNA recovered from clones in VL6-48N and W303a are summarized in Table 5. 22 of 24 clones isolated from 24 VL6-48N strains, and 5 of 8 clones isolated from W303a strain are complete (exact exact for each amplicon) Size analysis) was revealed by PCR analysis (data shown at present).

（表２）M.ゲニタリウムのマルチプレックスPCR用プライマーの配列（セット1）

(Table 2) Sequence of M. genitalium multiplex PCR primers (Set 1)

サイズの分析
VL6-48N株由来の完全なクローン中の酵母ベクターを含むM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムが正確なサイズであることを確認するために、CHEFゲル分析を、MPCRにより完全であると考えた3つのクローン（11、16、および24）について行った。この目的のために、DNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグ中でクローンから単離した。染色体DNAを除去するために、プラグを、数時間、一定電圧でプレ電気泳動して、酵母染色体DNAを除去した。この工程の効率を高めるために、プラグを最初に、酵母染色体を切断するが、M.ゲニタリウム中には認識部位を持たないAsiSI、FseI、およびRsrIIで消化した。 Size analysis
To confirm that the M. genitalium cl16-2 genome, including the yeast vector in a complete clone from the VL6-48N strain, is the correct size, CHEF gel analysis was performed on three Clones (11, 16, and 24) were performed. For this purpose, DNA was isolated from clones in agarose plugs using the protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” according to the Bio-Rad CHEF-DR III manual. To remove chromosomal DNA, the plug was pre-electrophoresed at a constant voltage for several hours to remove yeast chromosomal DNA. To increase the efficiency of this process, the plug was first digested with AsiSI, FseI, and RsrII, which cleaves the yeast chromosome but does not have a recognition site in M. genitalium.

プレ電気泳動後、DNAを、EagIまたはBssHIIのいずれかで消化した。これらの酵素により産生される、ベクター挿入断片を持つM.ゲニタリウムゲノムの断片と、それらのサイズを、図4Aにおいてマップ上に、そしてマップに並べて示す。消化したDNAを、フィールド・インバージョンゲル電気泳動（Bio-Rad FIGE Mapper）により分離した。結果を表5にまとめる（ゲルは示さず）。これらの3つのクローンのうちの2つ（11および16）は予想したサイズであった。   After pre-electrophoresis, DNA was digested with either EagI or BssHII. Fragments of the M. genitalium genome with vector inserts produced by these enzymes and their sizes are shown on the map in FIG. 4A and side by side on the map. Digested DNA was separated by field inversion gel electrophoresis (Bio-Rad FIGE Mapper). The results are summarized in Table 5 (gel not shown). Two of these three clones (11 and 16) were the expected size.

W303a株由来の完全なクローン中の酵母ベクターを含むM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムが正確なサイズであることを確認するために、CHEFゲル分析を、5個の完全なクローンについて行った。この目的のために、これらのクローンに由来するDNAを、VL6-48N株について上記に記載したように、上記に記載した酵母ゲノムを除去するための数時間の一定電圧でのプレ電気泳動を用いて、アガロースプラグ中で単離した。その後、単離したDNAを、EagIで直鎖化した。   To confirm that the M. genitalium cl16-2 genome containing the yeast vector in complete clones from the W303a strain was the correct size, a CHEF gel analysis was performed on 5 complete clones. For this purpose, DNA from these clones was used as described above for the VL6-48N strain using pre-electrophoresis at a constant voltage for several hours to remove the yeast genome described above. And isolated in an agarose plug. The isolated DNA was then linearized with EagI.

試料をパルスフィールド電気泳動により分離した。合成のsMgTARBAC37ゲノム（上記を参照のこと）をNotIで切断し、ポジティブコントロールとして使用した。結果を表5にまとめる（ゲルは示さず）。5つのクローンのうちの4つは予想したサイズであった。クローン4は、約300kbのぼんやりとしたさらなるバンドを含んでいた。   Samples were separated by pulse field electrophoresis. A synthetic sMgTARBAC37 genome (see above) was cut with NotI and used as a positive control. The results are summarized in Table 5 (gel not shown). Four of the five clones were the expected size. Clone 4 contained a faint additional band of approximately 300 kb.

b.PCRによる酵母宿主からのM.ミコイデスcl1.1の単離および分析
酵母ベクター挿入断片を含むM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した48個の個々のクローンから単離したゲノムを、完全性を確認するために、上記のようなマルチプレックスPCRによって分析した。DNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグ中でクローンから単離した。 b. Isolation and analysis of M. mycoides cl1.1 from yeast hosts by PCR. 48 individual recovered after transfer of the M. mycoides LC cl1.1 genome containing the yeast vector insert into strain VL6-48N. The genome isolated from the clones was analyzed by multiplex PCR as described above to confirm integrity. DNA was isolated from the clones in an agarose plug using the protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” according to the Bio-Rad CHEF-DR III manual.

表3に列挙したPCRプライマーを設計し、これを、移入したM.ミコイデスゲノムの完全性を評価するためのアンプリコンを作製するために使用した。図5に示すように、アンプリコンは、IS1296エレメントのほとんどの対の間に位置しており、図5に説明する挿入断片とともにゲノムのマップ上に矢印で示した。一つのさらなる230bpのアンプリコンは、酵母ベクターのHIS3マーカーの領域であった。別のプライマーのセット（NSF1179/18およびNSR1642/16;表3を参照のこと）は464bpのアンプリコン（S.セレビジエrDNAの領域）を生じ、これをアッセイについてのポジティブコントロールとして使用した。これらのプライマーのセットと、それにより生じたアンプリコンのサイズとを表3に列挙する。   The PCR primers listed in Table 3 were designed and used to create amplicons to assess the integrity of the transferred M. mycoides genome. As shown in FIG. 5, amplicons are located between most pairs of IS1296 elements and are indicated by arrows on the genome map along with the inserts described in FIG. One additional 230 bp amplicon was a region of the HIS3 marker in the yeast vector. Another set of primers (NSF1179 / 18 and NSR1642 / 16; see Table 3) yielded a 464 bp amplicon (region of S. cerevisiae rDNA), which was used as a positive control for the assay. These primer sets and the resulting amplicon sizes are listed in Table 3.

類似する結果が、Δ54組換え欠損株を形質転換した酵母ベクター挿入断片を含むM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムのマルチプレックスPCR分析を用いて得られた（ゲルは示さず）。   Similar results were obtained using multiplex PCR analysis of the M. mycoides LC cl1.1 genome containing the yeast vector insert transformed with the Δ54 recombination deficient strain (gel not shown).

酵母ベクター挿入断片を含むM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムで形質転換したW303a細胞由来のDNAのマルチプレックスPCR分析により、15個のクローンのうちの8個が完全なものであることが明らかになった（ゲルは示さず）。   Multiplex PCR analysis of DNA from W303a cells transformed with the M. mycoides LC cl1.1 genome containing the yeast vector insert reveals that 8 out of 15 clones are complete. (Gel not shown).

（表３）M.ミコイデスLCのマルチプレックスPCR用のプライマーの配列

(Table 3) Primer sequences for M. Mycoides LC multiplex PCR

サイズの分析
VL6-48N株由来の完全なクローンの中の酵母ベクターを含むM.ミコイデスcl1.1ゲノムが正確なサイズであることを確認するために、CHEFゲル分析のサザンブロット分析を、6つの完全なクローンについて行い、6つのうちの5つが正確な大きさであることを明らかにした。 Size analysis
To confirm that the M. mycoides cl1.1 genome, including the yeast vector among the complete clones from the VL6-48N strain, is the correct size, a Southern blot analysis of CHEF gel analysis was performed on six complete clones. And made it clear that 5 out of 6 were the correct size.

酵母ベクターを含むM.ミコイデスcl1.1ゲノムでのVL6-48N株の形質転換後に回収したこれらの5個のクローンのうちの3個のCHEFゲル分析を、以下のように行った:クローン（07、14、および38）由来のDNAを、上記のようにアガロースプラグ中で、プレ電気泳動を行わずに単離した。単離したDNAをBssHIIで消化し、その後、パルスフィールドゲル電気泳動（CHEF）により分離した。それぞれのクローンについて、もとのクローンと3〜4個のサブクローンを分析した（ゲルの結果は示さず）。これらの分析において使用したマーカーおよび対照は以下であった:（1）Low Range PFG Marker（New England Biolabs, Ipswich, MA）;（2）S.セレビジエマーカー（Bio-Rad）;VL6-48N（未消化のもの（3）およびBssHIIで消化したもの（4））;ならびに、M.ミコイデスLC cl1.1（未消化のもの（5）およびBssHIIで消化したもの（6））。結果は、3つのクローン全てが正確なサイズであり、安定であることを示していた。   Of these five clones recovered after transformation of the VL6-48N strain with the M. mycoides cl1.1 genome containing the yeast vector, a CHEF gel analysis of three of these five clones was performed as follows: clone (07 , 14, and 38) were isolated without pre-electrophoresis in agarose plugs as described above. The isolated DNA was digested with BssHII and then separated by pulse field gel electrophoresis (CHEF). For each clone, the original clone and 3-4 subclones were analyzed (gel results not shown). The markers and controls used in these analyzes were: (1) Low Range PFG Marker (New England Biolabs, Ipswich, MA); (2) S. cerevisiae marker (Bio-Rad); VL6-48N ( Undigested (3) and digested with BssHII (4)); and M. mycoides LC cl1.1 (undigested (5) and digested with BssHII (6)). The results showed that all three clones were the correct size and stable.

CHEFゲル分析を、酵母ベクター挿入断片を含むM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムでのW303a細胞の形質転換後に回収した8個の完全なクローンについて、サイズを確認するために行った。この目的のために、上記クローンに由来するDNAを、上記のようにアガロースプラグ中で、酵母ゲノムを除去するための上記のプレ電気泳動を行って単離した。DNAは、未処理のままとした（-）か、またはBssHIIで消化した（+）かのいずれかとした。その後、DNAをパルスフィールドゲル電気泳動によって分離した。M.ミコイデスLC cl1.1のDNAをポジティブコントロールとした。結果を表5にまとめる（ゲルの結果は示さず）。結果は、8個のクローンのそれぞれが正確なサイズのゲノムを含むことを示した。   CHEF gel analysis was performed to confirm the size of 8 complete clones recovered after transformation of W303a cells with the M. mycoides LC cl1.1 genome containing the yeast vector insert. For this purpose, DNA derived from the clones was isolated by performing the pre-electrophoresis described above to remove the yeast genome in an agarose plug as described above. DNA was either left untreated (-) or digested with BssHII (+). Thereafter, the DNA was separated by pulsed field gel electrophoresis. M. mycoides LC cl1.1 DNA was used as a positive control. The results are summarized in Table 5 (gel results not shown). The results showed that each of the 8 clones contained the correct size genome.

c.PCRによる酵母宿主からのM.ニューモニエの単離および分析
酵母ベクターを含むM.ニューモニエゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した20個の個々のクローンから単離したゲノムを、完全性を確認するために、上記のようにマルチプレックスPCRによって分析した。2種類の異なるマルチプレックスPCRを行った。セット1およびセット2についてのプライマーと、それによって生じたアンプリコンのサイズとを、表4に列挙する（ゲルの結果は示さず）。図4Aに示すように、アンプリコン（黒色のバーと数字で示す;内側:セット1、外側:セット2）を、ベクター挿入断片を含むM.ニューモニエゲノムを取り囲むように均等な間隔をあけて配置した。結果は、20個の形質転換体のうちの13個が完全なものであることを示した。 c. Isolation and analysis of M. pneumoniae from yeast host by PCR Genomes isolated from 20 individual clones recovered after transfer of the M. pneumoniae genome containing the yeast vector into strain VL6-48N To confirm sex, analysis was performed by multiplex PCR as described above. Two different multiplex PCRs were performed. The primers for set 1 and set 2 and the resulting amplicon sizes are listed in Table 4 (gel results not shown). As shown in Figure 4A, amplicons (shown with black bars and numbers; inside: set 1, outside: set 2) are spaced evenly around the M. pneumoniae genome containing the vector insert. did. The results showed that 13 out of 20 transformants were complete.

（表４）M.ニューモニエのマルチプレックスPCR用のプライマーの配列

(Table 4) Primer sequences for M. pneumoniae multiplex PCR

サイズの分析
CHEFゲル分析を、これらの完全な形質転換体のうちの9個について行った。この目的のために、これらのクローンに由来するDNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグの中で単離した。染色体DNAを除去するために、プラグを、数時間一定電圧でプレ電気泳動して、酵母の染色体DNAを除去した。その後、DNAを、NotIまたはSbfIで消化した。これらの酵素により生じたベクター挿入断片を持つM.ニューモニエゲノムの断片（番号1〜6）を、図4Bにおいてマップ上に示し、断片とそれらのサイズとを、マップの横に並べて列挙した。 Size analysis
CHEF gel analysis was performed on 9 of these complete transformants. For this purpose, DNA from these clones was isolated in agarose plugs using the protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” according to the Bio-Rad CHEF-DR III manual. To remove chromosomal DNA, the plug was pre-electrophoresed at a constant voltage for several hours to remove yeast chromosomal DNA. DNA was then digested with NotI or SbfI. Fragments of the M. pneumoniae genome with vector inserts generated by these enzymes (numbers 1-6) are shown on the map in FIG. 4B, and the fragments and their sizes are listed next to the map.

消化したDNAを、パルスフィールド電気泳動（Bio-Rad CHEF-DR IIまたはIIIシステム）により分離した。結果を表5にまとめる（ゲルの結果は示さず）。制限断片に、図4Bのように番号をつける。酵母クローン8は完全には消化されていなかった（データは示さず）。   Digested DNA was separated by pulse field electrophoresis (Bio-Rad CHEF-DR II or III system). The results are summarized in Table 5 (gel results not shown). Number the restriction fragments as shown in Figure 4B. Yeast clone 8 was not fully digested (data not shown).

表5に実施例1（A）の結果をまとめる。ここでは、酵母ベクターが組込まれている3種類のマイコプラズマゲノムを酵母に移入した。クローンを、それぞれ10個のアンプリコンの1つのセットまたは2つのセットを用いて、マルチプレックスPCRにより完全性についてスクリーニングした。クローンを、制限酵素消化およびゲル電気泳動、いくつかの場合にはその後のサザンブロットにより、サイズについて試験した。   Table 5 summarizes the results of Example 1 (A). Here, three types of mycoplasma genomes incorporating yeast vectors were transferred to yeast. Clones were screened for integrity by multiplex PCR, using one or two sets of 10 amplicons each. Clones were tested for size by restriction enzyme digestion and gel electrophoresis, in some cases subsequent Southern blots.

（表５）酵母ベクターを含有する3種類のマイコプラズマゲノムの、酵母中でのクローニング

Table 5: Cloning of three mycoplasma genomes containing yeast vectors in yeast.

実施例1B
全ゲノムおよび酵母宿主ベクターの相同組換えによる、酵母宿主細胞へのM.ゲニタリウムゲノムの移入
M.ゲニタリウムの直線化した全ゲノムを、図2Bに示した方法を使用して、宿主細胞内での酵母ベクターを用いたゲノムの相同組換えにより、酵母細胞に導入した。M.ゲニタリウムゲノムは、3つの、1箇所で切断される制限酵素部位を含み、そのうちの2つはそのrRNAオペロンの中にある。3つ目は、tRNAコード配列の3'末端にある。クローニングを、tRNAの完全性を保存するように設計することができたため、ベクターを、AscI部位に隣接するように相同組換えにより挿入した。 Example 1B
Transfer of M. genitalium genome into yeast host cells by homologous recombination of whole genome and yeast host vectors
The linearized whole genome of M. genitalium was introduced into yeast cells by homologous recombination of the genome with a yeast vector in the host cell using the method shown in FIG. 2B. The M. genitalium genome contains three, one restriction site that is cleaved, two of which are in its rRNA operon. The third is at the 3 ′ end of the tRNA coding sequence. Since cloning could be designed to preserve the integrity of tRNA, the vector was inserted by homologous recombination adjacent to the AscI site.

酵母クローニングベクターpARS-VN（V.N.Noskov et al, BMC Genomics 4, 16（2003）に記載されている）を、一対のプライマー（それぞれが、M.ゲニタリウムゲノム中の挿入部位の側方にある領域に対する60bpの相同性と、ベクターに対する20bpの相同性とを含む）を用いたPCRのための鋳型として使用した。プライマーは、IDT PAGE精製されて供給された。これらの配列は以下であり、ベクター配列を太字体で示し、ClaI部位（第1のプライマー）またはXhoI部位（第2のプライマー）に下線をひいた:

および

。これらのプライマーを用いたベクターのPCRにより、固有のClaI制限酵素部位とXhoI制限酵素部位の間の9bpを除くベクター全体を増幅し、6.5kbの産物を得た。 The yeast cloning vector pARS-VN (described in VNNoskov et al, BMC Genomics 4, 16 (2003)) is applied to a pair of primers (each of which is lateral to the insertion site in the M. genitalium genome). Used as a template for PCR with 60 bp homology and 20 bp homology to the vector). Primers were supplied after IDT PAGE purification. These sequences are the following, the vector sequence is shown in bold, and the ClaI site (first primer) or XhoI site (second primer) is underlined:

and

. The entire vector excluding 9 bp between the unique ClaI and XhoI restriction enzyme sites was amplified by PCR of the vector using these primers, resulting in a 6.5 kb product.

この直鎖状ベクターのDNAとM.ゲニタリウム株MS5由来のDNAとの混合物を、酵母株VL6-48Nのスフェロプラストの同時形質転換のために調製した。M.ゲニタリウムのDNAを以下のようにアガロースプラグ中で単離して、断裂を最小限にした。M.ゲニタリウムのゲノムDNAを、SP-4培地中で増殖させた株MS5から、低融点アガロースプラグの中で2つのバッチ中で単離した。バッチ2の培養物には、200μg/mlになるようにゲンタマイシンを補充した。粘着細胞をPBSで2回リンスし、その後、こすり取って8.0mMのHEPES（pH 7.4）、272mMのスクロース、および10％のグリセロールを含有している緩衝液中に入れた。各プラグには、約6cm²（バッチ1）または約10cm²（バッチ2）のコンフルエント細胞由来のDNAを含めた。溶解のために、アガロース中の細胞を、0.4MのEDTA、0.4％のN-ラウリルサルコシン、および2mgs/mlのプロテイナーゼK中で50℃で一晩から2日間、インキュベーションし、続いて緩衝液を交換し、同じ条件下で同じ時間、2回目の処理を行った。プラグを、10mMのTris、50mMのEDTAに対して十分に透析し、その後、2時間を2回、それぞれ、0.1mMになるようにPMSFを補充した10mMのTris、50mMのEDTAの中で透析し、その後、10mMのTris、50mMのEDTA中で再度透析し保存した。 A mixture of this linear vector DNA and DNA from M. genitalium strain MS5 was prepared for co-transformation of spheroplasts of yeast strain VL6-48N. M. genitalium DNA was isolated in an agarose plug as follows to minimize disruption. M. genitalium genomic DNA was isolated in two batches in low melting point agarose plugs from strain MS5 grown in SP-4 medium. Batch 2 cultures were supplemented with gentamicin at 200 μg / ml. Adherent cells were rinsed twice with PBS, then scraped and placed in a buffer containing 8.0 mM HEPES (pH 7.4), 272 mM sucrose, and 10% glycerol. Each plug contained about 6 cm ² (batch 1) or about 10 cm ² (batch 2) of confluent cell-derived DNA. For lysis, cells in agarose were incubated overnight at 50 ° C. in 0.4 M EDTA, 0.4% N-lauryl sarcosine, and 2 mgs / ml proteinase K, followed by buffering. The second treatment was performed for the same time under the same conditions. The plug is dialyzed thoroughly against 10 mM Tris, 50 mM EDTA, and then dialyzed twice in 10 mM Tris, 50 mM EDTA supplemented with PMSF to 0.1 mM, 2 times each. Then, it was dialyzed again and stored in 10 mM Tris and 50 mM EDTA.

形質転換前に、プラグを融解させ、以下のようにアガラーゼで消化した。プラグの第1のバッチを、CHEF（Bio-Rad）により2回電気泳動し、これによって分解したDNAを除去し、一方、環状のゲノムはインタクトなままとした（プラグの中のインタクトな環状ゲノムの割合を増大させるため）。第1回目の電気泳動は、0.5×TBE、50〜90秒のスイッチ時間を用いて20時間にわたり、1％のパルスフィールドアガロースゲル上で行った。2回目の電気泳動は、1×TAEと60〜120秒のスイッチ時間を用いて、24時間にわたり、1％の低融点ゲル上で行った。いずれのゲルも、120°、6V/cm、14℃で泳動した。2つのバッチのそれぞれから3つのプラグを、滅菌した1×TAEに対して十分に透析し、73℃数分間融解させ、42°に平衡化し、その後、β-アガラーゼI（New England Biolabs, Ipswich, MA）で1.5時間消化した。各容量の2分の1を、新しいエッペンドルフチューブに移した。形質転換の前に、ゲノムを、20UのAscI（1×NEB緩衝液4（New England Biolabs, Ipswich, MA）中）37℃で一晩消化し、これにより、図6Aに示すように、宿主ベクターとの意図した組換え部位の付近に二本鎖の断裂が生じた。   Prior to transformation, the plugs were thawed and digested with agarase as follows. The first batch of plugs was electrophoresed twice with CHEF (Bio-Rad), thereby removing the degraded DNA, while the circular genome remained intact (the intact circular genome in the plug To increase the ratio of The first round of electrophoresis was performed on a 1% pulsed field agarose gel for 20 hours using 0.5 × TBE, 50-90 seconds switch time. The second electrophoresis was performed on a 1% low melting gel for 24 hours using 1 × TAE and a switch time of 60-120 seconds. All gels were run at 120 °, 6 V / cm, and 14 ° C. Three plugs from each of the two batches are dialyzed extensively against sterile 1 × TAE, thawed at 73 ° C. for several minutes, equilibrated to 42 °, and then β-Agarase I (New England Biolabs, Ipswich, MA) for 1.5 hours. One half of each volume was transferred to a new Eppendorf tube. Prior to transformation, the genome was digested overnight at 37 ° C. with 20 U AscI (1 × NEB buffer 4 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.)), As shown in FIG. 6A. A double-strand break occurred in the vicinity of the intended recombination site.

ドナーゲノムの（酵母ベクターを用いた同時形質転換による）宿主細胞への導入のために、酵母のスフェロプラストをプラグ由来のDNAで、場合によっては培養物を推奨されるOD未満に増殖させたことを除き、Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371（2008）に記載されている公開されている方法を使用して形質転換した。上記のようなこの公開されている方法を用いた場合は、酵母細胞を1Mのソルビトール中に懸濁し、Zymolyase（商標）（β-1,3-グルカンラミナリペンタオヒドラーゼ（β-1,3-glucan laminaripentaohydrolase））で処理し、その後、細胞壁を取り除くために形質転換した。アガロースプラグから回収したDNAを、スフェロプラストとともにインキュベーションした。増殖培地中での回収後、細胞を選択培地に播種した。   For introduction of the donor genome into the host cell (by co-transformation with a yeast vector), yeast spheroplasts were grown with DNA from the plug and in some cases the culture was grown below the recommended OD. Otherwise, transformation was performed using the published method described in Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371 (2008). When using this published method as described above, yeast cells are suspended in 1 M sorbitol and Zymolyase ™ (β-1,3-glucan laminaripentaiohydrase (β-1, 3-glucan laminaripentaohydrolase)) and then transformed to remove the cell wall. DNA recovered from the agarose plug was incubated with spheroplasts. After recovery in growth medium, cells were seeded in selective medium.

クローンを突いて採取し、1セットの代わりに2セットの10個のアンプリコンを使用したことを除き、上記実施例1A（v）（a）に記載したように、マルチプレックスPCRおよびゲル電気泳動によって評価した。第1のアンプリコンのセットを作製するために使用したプライマーは、上記の表2に列挙したものであった。アンプリコンの第2のセットを作製するために使用したプライマーと、それにより得られたアンプリコンのサイズとを、以下の表6に列挙する。   Multiplex PCR and gel electrophoresis as described in Example 1A (v) (a) above, except that clones were picked and 2 sets of 10 amplicons were used instead of 1 set. Evaluated by. The primers used to create the first amplicon set were those listed in Table 2 above. The primers used to make the second set of amplicons and the resulting amplicon sizes are listed in Table 6 below.

（表６）M.ゲニタリウムのマルチプレックスPCR用のプライマーの配列（セット2）

(Table 6) Primer sequences for M. genitalium multiplex PCR (set 2)

AscIで消化したDNAでの形質転換により、45個の形質転換体が得られた。これらを全て、上記で考察した20個のアンプリコン（表2、表6）を得るためのプライマーを用いて、マルチプレックスPCRによって試験した。21個が完全であるように思われた。これらの21個の形質転換体を、CHEFゲルのサザンブロットによって試験し、15個が正確なサイズであると思われた。未消化のM.ゲニタリウムゲノムでの形質転換により、50個の形質転換体を得た。これらを全て、同じマルチプレックスPCRによって試験し、7個が完全なものであると思われた。これらのうちの一つは正確なサイズであった。これらの結果は、認識部位での制限酵素を用いた消化、および宿主酵母ベクターでの同時形質転換、これに続く酵母宿主細胞内でのインビボでの組換えによる、マイコプラズマの全ドナーゲノムの移入の成功を示している。   Forty-five transformants were obtained by transformation with DNA digested with AscI. All of these were tested by multiplex PCR using primers to obtain the 20 amplicons discussed above (Table 2, Table 6). 21 seemed to be perfect. These 21 transformants were tested by Southern blot on a CHEF gel and 15 appeared to be the correct size. Fifty transformants were obtained by transformation with the undigested M. genitalium genome. All of these were tested by the same multiplex PCR and 7 were considered complete. One of these was the correct size. These results show the transfer of the entire donor genome of mycoplasma by digestion with restriction enzymes at the recognition site and co-transformation with the host yeast vector, followed by in vivo recombination in the yeast host cell. Shows success.

実施例1C
酵母宿主細胞中でのインビボでの組換えによる、重複しているゲノム断片と酵母宿主ベクターとのアセンブリによる酵母宿主細胞へのM.ゲニタリウムゲノムの移入
本実施例は、図2Cに説明する方法を使用した、酵母宿主細胞中へのM.ゲニタリウムドナーゲノムの導入と、その中でのその増殖の成功を記載する。この方法では、ゲノムを、多数の重複しているゲノム断片の相同組換えにより宿主細胞（酵母）の中でアセンブリする。 Example 1C
Transfer of M. genitalium genome to yeast host cells by assembly of overlapping genomic fragments and yeast host vectors by in vivo recombination in yeast host cells. This example is a method illustrated in FIG. 2C. Describes the introduction of the M. genitalium donor genome into yeast host cells and its successful growth therein. In this method, the genome is assembled in a host cell (yeast) by homologous recombination of a number of overlapping genomic fragments.

このステラテジーを、大腸菌BACクローン由来の断片を使用して行った（Gibson et al., Science 319, 1215（2008）（オンラインで補った項目（supplemental online materials）を含む;Gibson et al., PNAS USA, （2008）105:20404-9;および米国特許出願公開第12/247,126号、発明者らによるネーミング:Gibson et alを参照のこと）。   This strategy was performed using fragments from E. coli BAC clones (Gibson et al., Science 319, 1215 (2008) (including supplemental online materials; Gibson et al., PNAS USA (2008) 105: 20404-9; and U.S. Patent Application Publication No. 12 / 247,126, naming by inventors: Gibson et al).

本研究においては、合成のM.ゲニタリウムゲノムを、6つの断片から、上記に記載した公開されている第1の方法（Gibson et al, Science 319, 1215（2008）およびオンラインで補った事項に記載されている、多段階プロセス）を使用して、最初に、インビトロでの組換えを使用した3段階のアセンブリによって、クォーターゲノム（それぞれおよそ144kb）を作製し、BACベクターを使用して大腸菌中でクローニングすることにより、アセンブリした。これらの4つの「クォーターゲノム」（1〜4）を図6Bに説明する。   In this study, the synthetic M. genitalium genome was adapted from six fragments to the first published method described above (Gibson et al, Science 319, 1215 (2008) and online supplements. First, a quarter genome (approximately 144 kb each) is generated by a three-step assembly using in vitro recombination using a multi-step process, described in E. coli using a BAC vector. Assembled by cloning in These four “quarter genomes” (1-4) are illustrated in FIG. 6B.

宿主酵母細胞由来のゲノムDNAの単離を、プレ電気泳動を行わずに、そして酵母のゲノムDNAを欠失させるための酵母特異的酵素での消化も行わずに、実施例1Aに記載したように行った。試料を、上記のようにCHEF分析を使用して分析した。サザンブロットもまた行った（データは示さず）。   Isolation of genomic DNA from the host yeast cells as described in Example 1A without pre-electrophoresis and without digestion with yeast specific enzymes to delete the yeast genomic DNA. Went to. Samples were analyzed using CHEF analysis as described above. Southern blots were also performed (data not shown).

（表７）重複している断片を使用する相同組換えを使用した、酵母細胞へのM.ゲニタリウムゲノムの移入を分析するためのプライマー

Table 7. Primers for analyzing the transfer of the M. genitalium genome to yeast cells using homologous recombination using overlapping fragments.

結果は、これらの形質転換体のうちの6つが正確な配列を含んでいたことを明らかにした。消化しなかった試料を用いた場合には、わずかに2つの形質転換体しか得られなかったばかりではなく、PCRおよびサザン分析において完全なM.ゲニタリウムゲノムを示すものもなかった。AscIでの消化の代わりに、クォーター3を、このクォーター中の特有のBsmBI部位で切断したことを除いて、上記と同じプロセスを使用して、別の研究を行った。同じ形質転換および分析方法を使用した。BsmBI消化を用いたこの研究により73個の形質転換体が生じ、これらのうちの44個は、PCRによりアッセイした場合には、正確であった。サザンブロットによって試験した28個のこれらのクローンのうちの5個が正確であった。これらの結果は、ドナーゲノムを酵母宿主細胞に導入するためのこの方法（重複している断片とベクターの宿主内でのインビボでの組換えによる）が、DNAの末端での相同組換えのより高い効率がおそらく原因で、形質転換の前にこれらの断片のうちの一つを制限酵素で切断する場合にはより効率的であることを明らかにした。（Orr-Weaver et al, PNAS USA 78, 6354（1981））。   The results revealed that 6 of these transformants contained the correct sequence. When using undigested samples, not only two transformants were obtained, but none of the PCR and Southern analyzes showed a complete M. genitalium genome. Instead of digesting with AscI, another study was performed using the same process described above, except that quarter 3 was cleaved at the unique BsmBI site in this quarter. The same transformation and analysis method was used. This study using BsmBI digestion resulted in 73 transformants, 44 of which were correct when assayed by PCR. Five of 28 of these clones tested by Southern blot were correct. These results indicate that this method for introducing donor genomes into yeast host cells (by in vivo recombination of overlapping fragments and vectors in the host) is more efficient than homologous recombination at the ends of DNA. Probably due to the high efficiency, it was found that it was more efficient to cut one of these fragments with a restriction enzyme prior to transformation. (Orr-Weaver et al, PNAS USA 78, 6354 (1981)).

実施例1D
2種類のマイコプラズマ（M.ゲニタリウムおよびM.ミコイデス）ドナーゲノムを持つ二倍体酵母株の構築
本実施例は、図2Aに示す方法（上記実施例1Aを参照のこと）を使用して導入した2種類のマイコプラズマゲノムを持つ二倍体酵母宿主株の産生を記載する。このプロセスのために、それぞれが上記ゲノムのうちの一方を持つ2つの一倍体株同士を、D.C.Amberg et al., Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed.2005, 2005）, pp.230に記載されているように接合させた。 Example 1D
Construction of a diploid yeast strain with two mycoplasma (M. genitalium and M. mycoides) donor genomes This example was introduced using the method shown in Figure 2A (see Example 1A above) The production of a diploid yeast host strain with two mycoplasma genomes is described. For this process, two haploid strains, each carrying one of the above genomes, were combined with DCAmberg et al., Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2005, 2005), pp. 230.

M.ゲニタリウムcl16-2を含有しているW303a株（接合型a）を、M.ミコイデスLC cl1.1を含有しているVL6-48株（接合型α）と接合させた（上記実施例1Aおよび表1を参照のこと）。接合の前に、以下のように、M.ゲニタリウムゲノム中のHIS3マーカーをTRPマーカーで置き換えて、ヒスチジンおよびトリプトファンを含まない培地上で、両方のゲノムを持つ二倍体を選択できるようにした。   The W303a strain (mating type a) containing M. genitalium cl16-2 was conjugated with the VL6-48 strain (mating type α) containing M. mycoides LC cl1.1 (Example 1A above) And see Table 1). Prior to conjugation, the HIS3 marker in the M. genitalium genome was replaced with a TRP marker so that diploids with both genomes could be selected on medium without histidine and tryptophan as follows: .

TRP1によるHIS3マーカーの置き換えのために、1059bpのTRP1断片を、プラスミドpRS304（Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19（1989）, Genbankアクセッション番号U03436.1, gi番号416305に記載されている）からPCRにより増幅させた。M.ゲニタリウムMS5 cl16-2に対して相同性を有している断片を、以下の配列を持つプライマーを使用してプラスミドから増幅させた。

For replacement of the HIS3 marker by TRP1, a 1059 bp TRP1 fragment was PCR-derived from plasmid pRS304 (described in Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (1989), Genbank accession number U03436.1, gi number 416305) Amplified by A fragment having homology to M. genitalium MS5 cl16-2 was amplified from the plasmid using primers having the following sequences:

それぞれのプライマー配列の中で、M.ゲニタリウムcl16-2配列に対する相同部分を太字体とする。1059bpの断片で、Gietz et al, Nucleic Acids Res 20, 1425（1992）に記載されている技術を使用して酢酸リチウムを使用して酵母を形質転換した。   In each primer sequence, the homologous part to the M. genitalium cl16-2 sequence is bolded. The 1059 bp fragment was transformed into yeast using lithium acetate using the technique described in Gietz et al, Nucleic Acids Res 20, 1425 (1992).

TRP1によるHIS3の置き換えを、2つのプライマー

を用いた増幅により確認した。これらを用いた増幅により、HIS3がTRP1で置き換えられていれば1207bpの断片が、そして置き換えが起こっていなければ927bpの断片が生じた。結果は、正確な置き換えを明らかにした。 Two primers to replace HIS3 with TRP1

This was confirmed by amplification using. Amplification using these resulted in a 1207 bp fragment if HIS3 was replaced with TRP1, and a 927 bp fragment if no replacement occurred. The result revealed an exact replacement.

置き換えの後、2種類の異なるドナーゲノムを持つ一倍体株同士を、Amberg et al, Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed.2005）, pp.230に記載されているように接合させた。接合後、個々のクローンに由来するDNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグ中で単離した。プラグを、酵母の染色体DNAを取り除くために、一定電圧で数時間、プレ電気泳動した。単離したDNAを55℃で1時間の加熱により直線化を行った。対照試料は加熱しないままとした（データは示さず）。結果は、この研究において生じた5個の二倍体のうちの5個がM.ゲニタリウムゲノムとM.ミコイデスゲノムの両方を含んでいることを示し、これにより、異なる種の2つの全長のマイコプラズマドナーゲノムを含有している二倍体酵母宿主細胞の作製の成功を確認した。   After the replacement, haploid strains with two different donor genomes were transformed into Amberg et al, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed 2005), pp.230. After conjugation, DNA from individual clones was isolated in agarose plugs using the protocol “Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA” according to the Bio-Rad CHEF-DR III manual. The plugs were pre-electrophoresed at a constant voltage for several hours to remove yeast chromosomal DNA. The isolated DNA was linearized by heating at 55 ° C. for 1 hour. Control samples were left unheated (data not shown). The results show that 5 out of the 5 diploids generated in this study contain both the M. genitalium genome and the M. mycoides genome, which results in the two full lengths of different species Successful production of diploid yeast host cells containing the mycoplasma donor genome of.

実施例1E
ARS配列の存在を伴わない酵母宿主細胞中でのマイコプラズマドナーゲノムの維持
Gibson et al., Science 319, 1215（2008）に記載されており、上記実施例1Cに記載するように作製した、合成のM.ゲニタリウムゲノム中の酵母ベクターを、RNaseP遺伝子内のそのもとの部位から、必須の遺伝子を遮断しないようにMG411中の新しい部位に移動させた。この目的のために、上記実施例1Cに記載したような、合成のM.ゲニタリウムを含む酵母クローンを、2つの断片で同時形質転換した。第1の断片は1842bpの長さであり、URA3、GAL1プロモーター、およびセントロメアを含む酵母ベクター配列をMG411に挿入した。この断片は、以下の配列を持つプライマーを使用して、PCRによって作製した:

（M.ゲニタリウム配列は太字体とする;NotI部位に下線をひく）。このPCRのための鋳型は、SEQ ID NO:137（表8）に提供する配列を有している構築物であった。 Example 1E
Maintenance of the mycoplasma donor genome in yeast host cells without the presence of ARS sequences.
A yeast vector in a synthetic M. genitalium genome, as described in Gibson et al., Science 319, 1215 (2008) and prepared as described in Example 1C above, is based on its origin in the RNaseP gene. From this site, it was moved to a new site in MG411 so as not to block the essential gene. For this purpose, a yeast clone containing a synthetic M. genitalium as described in Example 1C above was cotransformed with the two fragments. The first fragment was 1842 bp in length and a yeast vector sequence containing URA3, GAL1 promoter, and centromere was inserted into MG411. This fragment was generated by PCR using primers with the following sequences:

(M. genitalium sequences are in bold font; the NotI site is underlined). The template for this PCR was a construct having the sequence provided in SEQ ID NO: 137 (Table 8).

（表８）酵母ベクター配列を作製するためのPCR鋳型の配列

Table 8: Sequence of PCR template for generating yeast vector sequences

第2の断片は302bpの長さであり、以下の配列を有していた:

。この断片を、M.ゲニタリウム配列によりRNaseP中の酵母ベクター挿入断片を置き換えるために使用し、その結果、この遺伝子のコード領域を回復させた。この断片は、以下の配列を持つプライマーを使用して、M.ゲニタリウムDNAからPCRによって作製した。

The second fragment was 302 bp long and had the following sequence:

. This fragment was used to replace the yeast vector insert in RNaseP by the M. genitalium sequence, thereby restoring the coding region of this gene. This fragment was generated by PCR from M. genitalium DNA using primers having the following sequences:

同時形質転換の前に、以下のようにTRP1をMG411に挿入した:MG411に対して相同性を有している1177bpのTRP1遺伝子断片を、プラスミドpRS304（Genbankアクセッション番号U03436.1、gi番号416305）から、以下の配列を持つ2つのプライマーを使用して増幅した

。個々のプライマー中で、M.ゲニタリウムゲノムに対する相同部分を太字体で示す。TRP1遺伝子の挿入断片を、挿入断片が存在する場合には1739bpを増幅し、存在しない場合は680bpを増幅する1セットのプライマー

を使用して、PCRにより確認した。同時形質転換体（これは、His- Trp- Ura+であった）を選択した。RNasePの回復を、配列

を持つプライマーを使用して、513bpの産物のPCR増幅により確認した。酵母ベクター配列によるTRP1の置き換えを、配列

を持つプライマーを使用して、1841bpの産物のPCR増幅により確認した。 Prior to co-transformation, TRP1 was inserted into MG411 as follows: The 1177 bp TRP1 gene fragment having homology to MG411 was transformed into plasmid pRS304 (Genbank accession number U03436.1, gi number 416305). ) Amplified using two primers with the following sequences:

. In each primer, the homologous portion to the M. genitalium genome is shown in bold font. A set of primers that amplify 1739 bp of the TRP1 gene insert if present and amplify 680 bp if not present

Was confirmed by PCR. Co-transformants (which were His-Trp-Ura +) were selected. RNaseP recovery, sequencing

Was confirmed by PCR amplification of the 513 bp product using primers with Replacing TRP1 with a yeast vector sequence

Was confirmed by PCR amplification of the 1841 bp product using primers with

新しい部位に挿入したベクターは、ARSを含んでいなかった。これらの研究の結果により、M.ゲニタリウムドナーゲノムを含むベクターが、酵母宿主細胞中での維持のためにはARS配列の存在を必要としないことを確認した。M.ゲニタリウムはATを多く含み、したがって、酵母の中でARSとして機能することができる配列を含む可能性がある。ARS様配列は、真核生物のATを多く含むDNAの中に頻繁に存在する（Montiel et al., Nucleic Acids Res 12, 1049（1984）;Stinchcomb et al., PNAS USA 77, 4559（1980）を参照のこと）。   The vector inserted at the new site did not contain ARS. The results of these studies confirmed that vectors containing the M. genitalium donor genome do not require the presence of ARS sequences for maintenance in yeast host cells. M. genitalium is rich in AT and therefore may contain sequences that can function as ARS in yeast. ARS-like sequences are frequently present in eukaryotic AT-rich DNA (Montiel et al., Nucleic Acids Res 12, 1049 (1984); Stinchcomb et al., PNAS USA 77, 4559 (1980) checking).

まとめると、本実施例に記載する研究により、3種類の異なるドナーであるマイコプラズマの全ゲノム（最も大きいものは1.1MBのサイズである）が、本提供の方法を使用して、酵母宿主細胞中にうまく移入され、増殖され、そして維持されたことを確認する。それぞれの場合において、完全なクローンを回収し、不安定性の兆候がないことを検出した。さらに、いくつかの研究においては、約2MBのような大きな分子を回収し、サザンブロッティングにより検出した。これらの分子はおそらく、コンカテマーのクローンを示し、本提供の方法が、酵母宿主細胞に大きなゲノムおよび核酸分子をクローニングならびに移入するために使用できることを明らかにする。このような方法は、ドナーゲノムを含有している宿主細胞を作製するために使用することができ、このドナーゲノムは、その後、本提供の方法を使用して、宿主細胞の中で増殖させ、改変し、そしてレシピエント細胞に移植することができる。   In summary, the study described in this example has shown that the entire genome of mycoplasma, three different donors, the largest being 1.1 MB in size, can be obtained in yeast host cells using the method provided. To ensure that it has been successfully transferred, propagated and maintained. In each case, complete clones were recovered and detected for no signs of instability. In addition, in some studies, large molecules such as about 2 MB were recovered and detected by Southern blotting. These molecules probably represent concatamer clones, demonstrating that the provided methods can be used to clone and transfer large genomic and nucleic acid molecules into yeast host cells. Such a method can be used to create a host cell containing a donor genome, which is then propagated in the host cell using the provided methods, Can be modified and transplanted into recipient cells.

実施例1F
酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスMCpMmyc1.1ゲノムの安定性および評価
酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスYCPMmyc1.1ゲノムの安定性を評価した。図18Aは、YCpMmyc1.1ゲノムの概略図を提供し、組込まれたYCpの位置を示す。PCR増幅において使用した9個の個々のプライマー対を、ゲノム中にそれらのおおよその位置に示し、図18Bにおいてアンプリコンに対応する番号をつける。酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスゲノムの安定性を、2つの方法によって試験した。第1の方法においては、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のコロニーを新しいプレート上に継いだ。第2の方法においては、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を飽和状態まで増殖させ、1/100の割合に希釈し、再び飽和状態まで増殖させた。次いで、この培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のクローンを新しいプレート上に継いだ。いずれの方法においても、ゲノムDNAを単離し、図18Aに示す9個の個々のプライマー対を使用したマルチプレックスPCR増幅において鋳型として使用した。得られたアンプリコンをゲル電気泳動により分析した。ゲルの右側の数字は、図18Bに示す個々のプライマー対のアンプリコンに対応させた。レーンGはポジティブコントロールであり、レーンNはゲノムを含まないネガティブコントロールである。分子量マーカーをレーンMに示す。示す結果は、分析した40個の試料のうちの典型となるものである。40個のクローン全てが完全なゲノムを含むと見られ、このことは、上記細菌のゲノムが酵母の中での日常的な増殖の間、安定であることを示している（図18B）。 Example 1F
Stability and evaluation of the M. mycoides MCpMmyc1.1 genome during growth in yeast The stability of the M. mycoides YCPMmyc1.1 genome during growth in yeast was evaluated. FIG. 18A provides a schematic of the YCpMmyc1.1 genome and shows the location of the integrated YCp. The nine individual primer pairs used in PCR amplification are shown in their approximate positions in the genome and numbered corresponding to amplicons in FIG. 18B. The stability of the M. mycoides genome during growth in yeast was tested by two methods. In the first method, clonal yeast cultures containing the genome were seeded on solid synthetic medium without histidine for 2 days, after which individual colonies were passaged onto new plates. In the second method, a yeast culture of clones containing the genome was grown to saturation, diluted to 1/100, and grown again to saturation. The culture was then seeded on solid synthetic medium without histidine for 2 days, after which individual clones were passaged onto new plates. In both methods, genomic DNA was isolated and used as a template in multiplex PCR amplification using the nine individual primer pairs shown in FIG. 18A. The resulting amplicon was analyzed by gel electrophoresis. The numbers on the right side of the gel corresponded to the individual primer pair amplicons shown in FIG. 18B. Lane G is a positive control, and lane N is a negative control containing no genome. Molecular weight markers are shown in lane M. The results shown are representative of the 40 samples analyzed. All 40 clones appear to contain the complete genome, indicating that the bacterial genome is stable during routine growth in yeast (FIG. 18B).

III型制限酵素遺伝子座で操作した酵母の中のM.ミコイデスYCPゲノムを評価した。M.ミコイデスYCpMmyc1.1ゲノムの概略図を図18Cに示す。組込まれたYCpの位置を示す。PCR増幅に使用した9個の個々のプライマー対を、ゲノム中のそれらのおおよその位置に示し、アンプリコンに対応させて番号をつける（ゲルの結果は示さず）。図18Cの中の斜線は、クローン3において欠失しているアンプリコンを示す（ゲルの結果は示さず）。M.ミコイデスYCpMmyc1.1酵母クローンのURA3を含有しているカセットでの形質転換の後、Ura+クローンのゲノムをマルチプレックスPCRにより評価し、得られたアンプリコンを遺伝子の電気泳動により分析した（ゲルの結果は示さず）。アンプリコン5〜8は、クローン3においては欠失しており、このことは、このゲノム中に大きな欠失が存在することを示唆していた。他の4個のクローンは完全なゲノムを含むと見られた。   The M. mycoides YCP genome in yeast engineered at the type III restriction enzyme locus was evaluated. A schematic of the M. mycoides YCpMmyc1.1 genome is shown in FIG. 18C. Indicates the position of the incorporated YCp. The nine individual primer pairs used for PCR amplification are shown at their approximate location in the genome and numbered according to the amplicon (gel results not shown). The diagonal line in FIG. 18C shows the amplicon missing in clone 3 (gel results not shown). After transformation of the M. mycoides YCpMmyc1.1 yeast clone with a cassette containing URA3, the genome of the Ura + clone was evaluated by multiplex PCR and the resulting amplicon was analyzed by gene electrophoresis (gel) Results are not shown). Amplicons 5-8 were deleted in clone 3, suggesting that there is a large deletion in this genome. The other 4 clones appeared to contain the complete genome.

実施例2
酵母宿主細胞中で増殖させたマイコプラズマの全ドナーゲノムの、マイコプラズマレシピエント細胞への移植
大きな核酸の移入のための方法を提供する。例えば、ゲノムを、様々な生物および様々なタイプの細胞（例えば、ドナー、宿主、およびレシピエント）（これは、異なる種、界、および/または目（例えば、真核生物である酵母細胞に対して、異なる細菌種および細菌）であり得る）に移入する。したがって、いくつかの態様においては、上記方法は、様々なタイプの細胞間で起こり得る不和合性を克服するための工程を含み、例えば、宿主細胞中で増殖させたドナーゲノムをレシピエント細胞にうまく移植するための方法を含む。 Example 2
Transplantation of the entire donor genome of mycoplasma grown in yeast host cells into mycoplasma recipient cells provides a method for the transfer of large nucleic acids. For example, genomes can be used for different organisms and different types of cells (eg, donors, hosts, and recipients) (for example, against yeast cells that are eukaryotes of different species, kingdoms, and / or eyes). Different bacterial species and bacteria). Thus, in some embodiments, the methods include steps for overcoming incompatibility that can occur between various types of cells, e.g., donor genomes grown in host cells are transferred to recipient cells. Includes methods for successful porting.

以下の実施例3は、酵母宿主細胞中で増殖させた全ドナーゲノム（M.ミコイデスLC（Genbankアクセッション番号NZ_AAZK00000000.1（GI:149364883）の、異なる種のレシピエント細胞（M.カプリコルム）への、本提供の方法を使用した移植の成功を記載する。本実施例は、本提供の方法を使用した、3種類の異なる生物（ドナー、宿主、およびレシピエント）の間での差異の分析、ならびに、これらの差異を克服するために使用することができる様々なプロセスの開発を記載する。   Example 3 below shows the entire donor genome (M. mycoides LC (Genbank accession number NZ_AAZK00000000.1 (GI: 149364883)) grown in yeast host cells to a different species of recipient cell (M. capricolum). This example describes the success of transplantation using the provided method, and this example analyzes the differences between three different organisms (donor, host, and recipient) using the provided method. As well as the development of various processes that can be used to overcome these differences.

実施例2Bは、精製した、インタクトな、ドナーであるマイコプラズマのゲノムDNAの十分な量を、レシピエント細胞への移植のために、酵母宿主細胞から回収することができることを明らかにする。実施例2Cは、天然の細菌のドナーゲノムを高い効率でレシピエント細胞に移植するための移植方法を提供する。実施例2Dは、宿主およびレシピエント細胞中の制限修飾システム（酵母には存在しない）の評価、ならびに、メチルトランスフェラーゼ（酵母の中で発現される）の発現、およびドナーゲノムに対するメチルトランスフェラーゼの効果、および活性化の評価を記載する。実施例2Eは、制限修飾（R-M）システムに伴う宿主-ドナー-レシピエントの不和合性の問題を克服するために本提供の方法において使用する処理を記載する。実施例2Fは、レシピエント細胞のR-Mシステムの突然変異を記載し、そして実施例2Gは、酵母宿主細胞から異なる種のレシピエント細菌への（マイコプラズマから酵母宿主細胞へと移入した）ドナーゲノムの移植の成功を明らかにする。   Example 2B demonstrates that sufficient amounts of purified, intact, donor, mycoplasma genomic DNA can be recovered from yeast host cells for transplantation into recipient cells. Example 2C provides a transplantation method for transplanting native bacterial donor genomes into recipient cells with high efficiency. Example 2D evaluates restriction modification systems (not present in yeast) in host and recipient cells, and expression of methyltransferase (expressed in yeast) and the effect of methyltransferase on the donor genome, And an assessment of activation. Example 2E describes the process used in the provided methods to overcome the host-donor-recipient incompatibility problem associated with restriction modification (R-M) systems. Example 2F describes a mutation in the RM system of the recipient cell, and Example 2G shows the donor genome from a yeast host cell to a different species of recipient bacterium (transferred from mycoplasma to the yeast host cell). Reveal the success of the transplant.

実施例2A
細菌株、培養条件、およびベクター
本実施例および以下の実施例3に記載する研究のために、大腸菌DH1OB［F^--mcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ（ara, leu）7697 galU galKλ^- rpsL nupG]（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、クローニング手順およびプラスミドの増幅のための宿主株とした。大腸菌細胞を、Luria-Bertani（LB）培養培地中またはLB寒天中で、37℃で増殖させた。所定のプラスミド中に存在する選択マーカーに応じて、大腸菌形質転換体を、50μg/mlのアンピシリン、5μg/mlのテトラサイクリン、または125μg/mlのピューロマイシンを補充したLB培地中で増殖させた。 Example 2A
Bacterial strains, culture conditions, and vectors For the studies described in this example and in Example 3 below, E. coli DH1OB [F ^-- mcrAΔ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ (ara, leu) 7697 galU galKλ ^- rpsL nupG] (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Was the host strain for cloning procedures and plasmid amplification. E. coli cells were grown at 37 ° C. in Luria-Bertani (LB) culture medium or LB agar. Depending on the selectable marker present in a given plasmid, E. coli transformants were grown in LB medium supplemented with 50 μg / ml ampicillin, 5 μg / ml tetracycline, or 125 μg / ml puromycin.

以下の2つのマイコプラズマ種を、本実施例および以下の実施例3に記載する研究において使用した:マイコプラズマ・カプリコルム亜種カプリコルム（California Kid（商標）株）（ATCC 27343）およびマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス（GM12株）（Damassa et al., 1983;上記）。マイコプラズマ細胞を、17％のウシ胎児血清（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有している液体または固体のSP4培地（Tully et al.1977）中で37℃で増殖させた。プラスミドまたは全ゲノムで形質転換したマイコプラズマを、5μg/mlのテトラサイクリンまたは8μg/mlのピューロマイシンを補充したSP4培地中で37℃で増殖させた。β-ガラクトシダーゼ活性を、150μg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal、Promega, Madison, WI）を含有している固体培地上にマイコプラズマを播種することにより検出した。   The following two mycoplasma species were used in the study described in this example and in Example 3 below: Mycoplasma capricolum subsp. (GM12 strain) (Damassa et al., 1983; above). Mycoplasma cells were grown at 37 ° C. in liquid or solid SP4 medium (Tully et al. 1977) containing 17% fetal calf serum (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Mycoplasma transformed with plasmid or whole genome was grown at 37 ° C. in SP4 medium supplemented with 5 μg / ml tetracycline or 8 μg / ml puromycin. β-galactosidase activity was measured on solid medium containing 150 μg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, Promega, Madison, Wis.) Detection was by seeding with mycoplasma.

マイコプラズマ・カプリコルム亜種カプリコルム（M.カプリコルム）の2種類の株を、以下の実施例においてレシピエント細胞として使用した:野生型（wt）M.カプリコルムおよび制限酵素を持たない（restriction-free）M.カプリコルム突然変異体（M.カプリコルム-ΔRE）（野生型M.カプリコルム中のCCATC-制限酵素遺伝子の不活化により得た（以下の実施例2Fに記載する））。移植のためのドナーゲノムDNAは、上記実施例1に記載するマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスLC（M.ミコイデスLC）クローン（cl1.1）由来のものであった。そのゲノムには、テトラサイクリン耐性マーカー、lacZ遺伝子、およびORF04334（lppA）とORF04335（IS1296のトランスポザーゼB）の間に組込まれた酵母セントロメアプラスミドが含まれていた。以下に詳細に記載するように、マイコプラズマゲノムDNAを、M.ミコイデスLC細胞クローン1.1（天然のゲノムDNA）か、または上記実施例1に記載するように作製したM.ミコイデスクローン1.1ゲノムを持っている酵母宿主細胞のいずれかから、アガロースプラグ中で調製した。   Two strains of Mycoplasma capricorum subsp. Capricorum (M. capricolum) were used as recipient cells in the following examples: wild type (wt) M. capricolum and restriction-free M Capricorum mutant (M. capricolum-ΔRE) (obtained by inactivation of the CCATC-restriction enzyme gene in wild-type M. capricolum (described in Example 2F below)). Donor genomic DNA for transplantation was derived from the Mycoplasma mycoides subspecies Mycoides LC (M. mycoides LC) clone (cl1.1) described in Example 1 above. The genome contained a tetracycline resistance marker, the lacZ gene, and a yeast centromere plasmid integrated between ORF04334 (lppA) and ORF04335 (IS1296 transposase B). As described in detail below, the Mycoplasma genomic DNA has either M. mycoides LC cell clone 1.1 (natural genomic DNA) or the M. mycoid desclone 1.1 genome produced as described in Example 1 above. Prepared in agarose plugs from any of the yeast host cells.

以下の実施例で使用したいくつかのベクターは、M.ミコイデスLC（pMYCO1（SEQ ID NO:149））中、およびM.カプリコルム（pMYCO1（SEQ ID NO:149）;pSD4（SEQ ID NO:150））（Lartigue et al, Nucleic Acids Res 31, 6610（2003））中で複製することができるoriCプラスミドから誘導した。これらのプラスミドはpBS（+）プラスミド（Stratagene）をベースとし、これには、耐性マーカーとして、スピラリンプロモーターにより駆動されるトランスポゾンTn916由来のtetM遺伝子が含まれている（Lartigue et al, Plasmid 48, 149（2002））。制限酵素緩衝液は、New England Biolabs, Ipswich, MAによるものであった。   Some vectors used in the following examples are in M. mycoides LC (pMYCO1 (SEQ ID NO: 149)) and M. capricolum (pMYCO1 (SEQ ID NO: 149); pSD4 (SEQ ID NO: 150) )) (Lartigue et al, Nucleic Acids Res 31, 6610 (2003)). These plasmids are based on the pBS (+) plasmid (Stratagene), which contains the tetM gene from transposon Tn916 driven by the spiraline promoter as a resistance marker (Lartigue et al, Plasmid 48, 149 (2002)). The restriction enzyme buffer was from New England Biolabs, Ipswich, MA.

実施例2B
宿主酵母細胞からのM.ミコイデスLCドナーゲノムの単離、回収した全ゲノムDNAの量の確認、および移植方法の開発
酵母細胞からインタクトなマイコプラズマドナーゲノムを単離し、分析するために、上記実施例1A（ii）bおよび1A（iv）に記載したようにマイコプラズマ・ミコイデスラージコロニー（M.ミコイデスLC）GM12、クローン1.1のゲノムで形質転換した酵母W303a細胞を、以下に記載するようにアガロースプラグ中に包埋した。このゲノムは、テトラサイクリン耐性遺伝子（tetM）とβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）とを有していた。このプラグからDNAを単離し、評価した。単離した、ドナーゲノムを持たない天然の酵母由来のゲノムDNAおよび天然のドナーであるマイコプラズマ細胞由来のゲノムDNAを、比較のために同様の様式で評価した。 Example 2B
Isolation of M. mycoides LC donor genome from host yeast cells, confirmation of the amount of recovered total genomic DNA, and development of transplantation method The above example was used to isolate and analyze an intact mycoplasma donor genome from yeast cells. Yeast W303a cells transformed with the genome of Mycoplasma mycoides large colony (M. mycoides LC) GM12, clone 1.1 as described in 1A (ii) b and 1A (iv) were agarose plugs as described below. Embedded in. This genome had a tetracycline resistance gene (tetM) and a β-galactosidase gene (lacZ). DNA was isolated from this plug and evaluated. Isolated genomic DNA from native yeast without donor genome and genomic DNA from natural donor mycoplasma cells were evaluated in a similar manner for comparison.

i.ドナーゲノムを含有している酵母のアガロースプラグ
酵母培養物を、OD₆₀₀がおよそ1.5に達するまで、選択培地中で30℃で増殖させた。酵母細胞をアガロースプラグ中に包埋し、DNAを、Bio-Rad Laboratories（Valencia, CA）によるCHEF mammalian Genomic DNA Plug Kitを使用し、以下の詳細/改変を用いて製造業者が推奨するプロトコールに従って、プラグから単離した。プラグ一つあたりの利用できるM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量を増大させるために、6×10⁹個の酵母細胞（6×10⁸個の細胞の代わりに）を、作製しようとするプラグ1mLあたりに使用して、一つのプラグあたり6×10⁸個の細胞を得た。プラグ中への包埋の後、リチカーゼ（Bio-Rad Laboratories）での処理ではなく、Zymolyase（商標）1OOT酵素（USB Corporation, Cleveland, OH）での消化を、酵母の細胞壁を消化するために使用した。酵素を、5mg/mLの濃度で、プラグの中および外に添加した。この混合物を37℃で2時間置いておいた。1×TE緩衝液（20mMのTris-HCL（pH 8）;50mMのEDTA）中での洗浄後、包埋した酵母細胞（スフェロプラスト）を溶解させ、タンパク質を、プラグ1mLあたり200μLのプロテイナーゼKを補充したプロテイナーゼK反応緩衝液（100mMのEDTA;0.2％のデオキシコール酸ナトリウム;1％のラウリルサルコシンナトリウム;pH 8.0）とともに、それぞれ50℃で24時間の2回のインキュベーションを使用して分解させた。その後、アガロースプラグを室温で4回、それぞれ1時間、1×TE緩衝液（20mMのTris-HCL（pH 8）;50mMのEDTA）中で撹拌しながら洗浄し、同じ緩衝液中で4℃で保存した。制限酵素（下記を参照のこと）で消化する酵母プラグについて、フェニルメタンスルホニルフルオライド（PMSF）を、1mMの最終濃度となるように2回目の洗浄の際に添加した。 i. Agarose plug of yeast containing donor genome Yeast cultures were grown at 30 ° C. in selective medium until the OD ₆₀₀ reached approximately 1.5. Yeast cells are embedded in agarose plugs and DNA is used using the CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit from Bio-Rad Laboratories (Valencia, Calif.) According to the manufacturer recommended protocol with the following details / modifications: Isolated from plug. In order to increase the amount of M. mycoides LC genomic DNA available per plug, 6 x 10 ⁹ yeast cells (instead of 6 x 10 ⁸ cells), 1 mL of plug to be made Used to obtain 6 × 10 ⁸ cells per plug. After embedding in plugs, digestion with Zymolyase ™ 1OOT enzyme (USB Corporation, Cleveland, OH), rather than treatment with lyticase (Bio-Rad Laboratories), is used to digest the yeast cell wall did. Enzyme was added in and out of the plug at a concentration of 5 mg / mL. The mixture was left at 37 ° C. for 2 hours. After washing in 1x TE buffer (20 mM Tris-HCL (pH 8); 50 mM EDTA), the embedded yeast cells (spheroplasts) are lysed and the protein is added to 200 μL proteinase K per mL of plug. Proteinase K reaction buffer supplemented with (100 mM EDTA; 0.2% sodium deoxycholate; 1% sodium lauryl sarcosine; pH 8.0) and digested using two incubations at 50 ° C for 24 hours each It was. The agarose plugs were then washed 4 times at room temperature for 1 hour each in 1 × TE buffer (20 mM Tris-HCL (pH 8); 50 mM EDTA) with stirring and at 4 ° C. in the same buffer. saved. For yeast plugs digested with restriction enzymes (see below), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) was added during the second wash to a final concentration of 1 mM.

M.ミコイデスLCのゲノムDNAを持つ酵母アガロースプラグと、対照である酵母DNAを含有している酵母アガロースプラグを、Bio-Rad（Valencia, CA）によるCHEF mammalian Genomic DNA Plug Kitを使用して分析のために調製した。3つのアガロースプラグの一つのシリーズ（A、B、およびC）を、ドナーゲノムを含有している酵母について（A2、B2、およびC2）、ならびに天然の酵母について（A1、B1、およびC1）作製した。上記プラグを室温で、1mLの1×TE緩衝液中、1時間を2回洗浄し、BSA（100μg/mL）を補充した1mLの1×NEB緩衝液2中で室温で1時間平衡化させた。   Analysis of yeast agarose plugs containing genomic DNA from M. mycoides LC and yeast agarose plugs containing yeast DNA as a control using the CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit by Bio-Rad (Valencia, CA). Prepared for. Create a series of three agarose plugs (A, B, and C) for yeast containing the donor genome (A2, B2, and C2) and for natural yeast (A1, B1, and C1) did. The plug was washed twice in 1 mL 1 × TE buffer at room temperature for 1 hour and equilibrated in 1 mL 1 × NEB buffer 2 supplemented with BSA (100 μg / mL) for 1 hour at room temperature. .

内因性の酵母ゲノムDNA（これは、以下に記載するCHEFゲル分析においてM.ミコイデスLCのゲノムDNAと同様の位置に移動した）を除去するために、プラグBおよびプラグC（酵母のそれぞれのセットについて）を、酵母のゲノムDNAを特異的に切断してドナーDNAをインタクトなまま残す50ユニットのAsiSI、RsrII、およびFseI制限酵素（New England Biolabs）とともに、500μLの反応容量の中で37℃で一晩、インキュベーションした。プラグAは、同じ条件下でこれらの酵素を含めずにインキュベーションした。その後、3つのプラグを全て、1mLの1×TE緩衝液を用いて室温で1時間洗浄し、1％のTAEアガロースゲル上に充填して（120分、120ボルト）、プラグから消化した酵母ゲノムDNA断片を除去した。   Plug B and Plug C (each set of yeasts) to remove endogenous yeast genomic DNA (which moved to the same position as M. mycoides LC genomic DNA in the CHEF gel analysis described below) With 50 units of AsiSI, RsrII, and FseI restriction enzymes (New England Biolabs) that specifically cleave the yeast genomic DNA leaving intact the donor DNA at 37 ° C in a 500 µL reaction volume Incubated overnight. Plug A was incubated without these enzymes under the same conditions. All three plugs were then washed with 1 mL of 1 × TE buffer at room temperature for 1 hour, loaded onto a 1% TAE agarose gel (120 minutes, 120 volts), and digested from the yeast genome. The DNA fragment was removed.

移動後、アガロースプラグをウェルから取り出し、1mLの0.1×TE緩衝液中、1時間を2回洗浄し、そしてBSA（100μg/mL）を補充した1mLの1×NEB緩衝液2（New England Biolabs, Ipswich, MA）の中で1時間、平衡化させた。M.ミコイデスLCのゲノムDNAを直線化するために（これによりゲルへのDNAの侵入を可能にする）、プラグCを、50ユニットのPspXI制限酵素とともに、37℃で一晩インキュベーションした。プラグAおよびプラグB（酵母のそれぞれのセットについて）を、同じ条件下で酵素を含めない疑似消化のためにインキュベーションした。インキュベーション後、全てのプラグを、1mLの1×TE緩衝液で室温で1時間洗浄し、パルスフィールドゲル上に充填した。   After transfer, the agarose plug is removed from the well, washed twice for 1 hour in 1 mL of 0.1 × TE buffer, and 1 mL of 1 × NEB buffer 2 supplemented with BSA (100 μg / mL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) for 1 hour. To linearize the genomic DNA of M. mycoides LC (which allows DNA entry into the gel), plug C was incubated overnight at 37 ° C. with 50 units of PspXI restriction enzyme. Plug A and Plug B (for each set of yeast) were incubated for mock digestion without enzyme under the same conditions. After incubation, all plugs were washed with 1 mL of 1 × TE buffer for 1 hour at room temperature and loaded onto a pulse field gel.

ii.天然のM.ミコイデスLCのアガロースプラグ
回収したDNAの量の比較のために、様々な量のゲノムDNAを含有している天然のドナーであるM.ミコイデスLCのアガロースプラグもまた、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit from Bio-Rad（Valencia, CA）を使用してM.ミコイデス細胞から調製した。M.ミコイデスLCからのインタクトな全ゲノムDNAの単離は、特に、細胞を単離前に培養した点において、いくつかの改変を加えて、Lartigue et al, Science 317, 632（2007）に記載されているとおりに行った。500mLのM.ミコイデスLC（tetM、lacZ、YCp）細胞を、10μg/μlのテトラサイクリンと1Oμg/μlのストレプトマイシンを補充したSP4培地中で、培地のpHが6.5（およそ10⁹個の細胞/mL）に達するまで増殖させた。細胞の収集の前に、100μg/μlのクロラムフェニコールを培地に添加し、進行中の回の染色体の複製を同調させて、さらなる回の複製を阻害するために、細胞を、この細胞濃度で37℃でさらに90分間インキュベーションした。 ii. Agarose plug of native M. mycoides LC For comparison of the amount of recovered DNA, the agarose plug of M. mycoides LC, a natural donor containing various amounts of genomic DNA, is also CHEF mammalian. Prepared from M. mycoides cells using the Genomic DNA Plug Kit from Bio-Rad (Valencia, Calif.). The isolation of intact total genomic DNA from M. mycoides LC is described in Lartigue et al, Science 317, 632 (2007), with some modifications, particularly in that the cells were cultured prior to isolation. Went as it was. 500 mL of M. mycoides LC (tetM, lacZ, YCp) cells in SP4 medium supplemented with 10 μg / μl tetracycline and 10 μg / μl streptomycin with a medium pH of 6.5 (approximately 10 ⁹ cells / mL) Allowed to grow. Prior to cell collection, 100 μg / μl of chloramphenicol is added to the medium to synchronize ongoing rounds of chromosomal replication and to inhibit further rounds of replication at this cell concentration. Incubated at 37 ° C for an additional 90 minutes.

細胞を、10mMのTris（pH 6.5）、0.5Mのスクロース中で1回洗浄し、2mLの同じ緩衝液中に再度懸濁した。この細胞懸濁液から、8つのシリーズのM.ミコイデスLCのゲノムDNA（MLC gDNA）のアガロースプラグを、M.ミコイデスLC細胞の2倍の段階希釈により調製した。シリーズ1のプラグには、プラグ一つあたりおよそ10¹⁰個の天然のM.ミコイデスLC細胞を含めた。シリーズ7のプラグには、プラグ一つあたりおよそ1.5×10⁸個を含めた。そしてシリーズ8のプラグには、プラグ一つあたりおよそ7×10⁷個の細胞を含めた。酵母由来のゲノムDNAに対する比較のために、天然のDNAを含有しているプラグと、酵母から単離したM.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有しているプラグ（上記を参照のこと）とを、パルスフィールドゲル上での分析のために、上記に記載したようにPspXIで消化してMLCゲノムを直線化した。 The cells were washed once in 10 mM Tris (pH 6.5), 0.5 M sucrose and resuspended in 2 mL of the same buffer. From this cell suspension, eight series of M. mycoides LC genomic DNA (MLC gDNA) agarose plugs were prepared by 2-fold serial dilution of M. mycoides LC cells. Series 1 plugs contained approximately 10 ¹⁰ natural M. mycoides LC cells per plug. Series 7 plugs included approximately 1.5 x 10 ⁸ plugs. Series 8 plugs included approximately 7 × 10 ⁷ cells per plug. For comparison to genomic DNA from yeast, a plug containing natural DNA and a plug containing genomic DNA of M. mycoides LC isolated from yeast (see above), For analysis on pulse field gels, the MLC genome was linearized by digestion with PspXI as described above.

iii.パルスフィールドゲル上での、回収したゲノムDNAの比較
酵母細胞中のM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量は、アガロースプラグ中の酵母細胞に由来する単離したゲノムDNAの量と、アガロースプラグ中のM.ミコイデスLC細胞の2倍の段階希釈物から単離した天然のゲノムDNAの様々な量とを比較することにより概算した。このプロセスのために、酵母のアガロースプラグ（実施例2B（i）、プラグA1、B1、およびC1、ならびにA2、B2、およびC2）と、8個のM.ミコイデスLCのアガロースプラグ（実施例2B（ii））とを、TAE 1×中の1％の認証されている（certified）パルスフィールドアガロースゲル（Bio-Rad, Valencia, CA）の中で、外形クランプ均一電界電気泳動（contour-clamped homogeneous electric field）（Chu et al, Science 234, 1582（1986））（CHEF DR III;Bio-Rad）を用いて電気泳動した。パルス時間を、4.5V/cmで、27時間かけて60秒から120秒までの傾斜をつけた。電気泳動後、ゲルをSYBR（登録商標）GOLD核酸染色（Invitrogen, Carlsbad, CA）（1/10,000の希釈率）で染色し、PFGEパターンを、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。S.セレビジエCHEF DNAサイズマーカーを、DNAのサイズを評価するために使用した。このマーカーは、サッカロミセス・セレビジエの染色体を含んでおり、これを、0.2Mb〜2.2Mbの範囲のサイズ決定に使用する。 iii. Comparison of recovered genomic DNA on a pulse field gel The amount of M. mycoides LC genomic DNA in yeast cells is the same as the amount of genomic DNA isolated from yeast cells in the agarose plug and the agarose plug. Estimates were made by comparing various amounts of native genomic DNA isolated from 2-fold serial dilutions of M. mycoides LC cells. For this process, yeast agarose plugs (Example 2B (i), plugs A1, B1, and C1, and A2, B2, and C2) and eight M. mycoides LC agarose plugs (Example 2B) were used. (Ii)) in a 1% certified pulsed field agarose gel (Bio-Rad, Valencia, Calif.) In TAE 1 × with contour-clamped homogeneous Electric field) (Chu et al, Science 234, 1582 (1986)) (CHEF DR III; Bio-Rad). The pulse time was 4.5 V / cm, with a slope from 60 to 120 seconds over 27 hours. After electrophoresis, the gel was stained with SYBR® GOLD nucleic acid stain (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) (1 / 10,000 dilution) and the PFGE pattern was scanned with a GE Typhoon 9410 imager. The S. cerevisiae CHEF DNA size marker was used to assess the size of the DNA. This marker contains the Saccharomyces cerevisiae chromosome, which is used for sizing ranging from 0.2 Mb to 2.2 Mb.

プラグA2〜C2（M.ミコイデスドナーゲノムを含有している酵母由来）およびプラグA1〜C1（天然の酵母）を含むレーン（実施例2B（i））を、マーカーレーンとともにゲル上で泳動した。プラグ（シリーズ7および8）には、漸増濃度のM.ミコイデスの天然のDNAを含めた（実施例2B（ii））。1.12MbのM.ミコイデスLCゲノムを、特定のレーンの中のパルスフィールドゲル上の予想した位置で検出した。M.ミコイデスのドナーゲノムを含有している酵母宿主細胞の場合は、酵素のカクテル（AsiSI、RsrII、FseI制限酵素）での酵母のゲノムDNAの選択的消化、これに続く電気泳動（試料B2およびC2;上記実施例2B（i）を参照のこと）により、M.ミコイデスドナーゲノムDNAの回収が改善された（データは示さず）。さらに、M.ミコイデスLCゲノム（C2）を直線化することにより、1.2MbのM.ミコイデス（C2）の回収が大幅に改善された。1.2Mbのバンドは、M.ミコイデスゲノム（B1、C1）を含まない天然の（野生型）酵母細胞に由来する並行して行った試料の中では検出されなかった。このことにより、1.2Mbのバンドが実際に、酵母細胞中のM.ミコイデスゲノムの存在を示すことを確認した。同じバンドは、天然のM.ミコイデスゲノムDNAを含有しているレーンの中に現れた。   Lanes (Example 2B (i)) containing plugs A2-C2 (from yeast containing the M. mycoides donor genome) and plugs A1-C1 (natural yeast) were run on a gel with marker lanes . Plugs (series 7 and 8) contained increasing concentrations of M. mycoides natural DNA (Example 2B (ii)). The 1.12 Mb M. mycoides LC genome was detected at the expected position on the pulse field gel in a particular lane. For yeast host cells containing the M. mycoides donor genome, selective digestion of yeast genomic DNA with a cocktail of enzymes (AsiSI, RsrII, FseI restriction enzymes), followed by electrophoresis (sample B2 and C2; see Example 2B (i) above) improved the recovery of M. mycoides donor genomic DNA (data not shown). Furthermore, linearization of the M. mycoides LC genome (C2) significantly improved the recovery of 1.2 Mb of M. mycoides (C2). A 1.2 Mb band was not detected in parallel samples derived from natural (wild-type) yeast cells that did not contain the M. mycoides genome (B1, C1). This confirmed that the 1.2 Mb band actually indicates the presence of the M. mycoides genome in yeast cells. The same band appeared in the lane containing natural M. mycoides genomic DNA.

酵母細胞から回収したM.ミコイデスLCゲノムDNAの量を、天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNA標準物から回収したもの（これもまた、上記のようにPspXIで処理した）と比較した。6×10⁸個の酵母細胞から得たM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量は、シリーズ7の天然のM.ミコイデスLCプラグから回収したゲノムDNAの量と同様であった（プラグ一つあたりおよそ1.5×10⁸個の天然のM.ミコイデスLC細胞）。 The amount of M. mycoides LC genomic DNA recovered from yeast cells was compared to that recovered from a native M. mycoides LC genomic DNA standard (also treated with PspXI as described above). The amount of genomic DNA of M. mycoides LC obtained from 6 x 10 ⁸ yeast cells was similar to the amount of genomic DNA recovered from series 7 native M. mycoides LC plugs (approximately per plug). 1.5 × 10 ⁸ natural M. mycoides LC cells).

iv.回収したDNAの定量化
UV分光光度計を使用して、上記実施例2B（ii）に記載したように、天然のM.ミコイデス細胞から調製した融解させたプラグの中に存在する天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量を決定した。結果を以下の表9に列挙する。この表に示すように、シリーズ7のプラグは、およそ12ng/μlのゲノムM.ミコイデスLC DNAを含んでいた（100μLのプラグあたり1.2μg）。上記のように、パルスフィールドゲルは、この試料を含むレーン（7）および酵母試料から回収したDNAを含有しているレーン（C2）において、比較可能な1.2Mbのバンドの強度を明らかにした（上記実施例2B（iii）を参照のこと）。これにより、ドナーゲノムを含有している宿主細胞から回収した100μLのプラグあたりのM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量が1μgにほぼ等しいことを決定した。 iv. Quantification of recovered DNA
Using a UV spectrophotometer, as described in Example 2B (ii) above, the genomic DNA of native M. mycoides LC present in a thawed plug prepared from native M. mycoides cells. The amount was determined. The results are listed in Table 9 below. As shown in this table, Series 7 plugs contained approximately 12 ng / μl of genomic M. mycoides LC DNA (1.2 μg per 100 μL plug). As noted above, the pulse field gel revealed a comparable 1.2 Mb band intensity in the lane containing this sample (7) and the lane containing DNA recovered from the yeast sample (C2) ( See Example 2B (iii) above). This determined that the amount of M. mycoides LC genomic DNA per 100 μL plug recovered from host cells containing the donor genome was approximately equal to 1 μg.

（表９）天然のM.ミコイデスLCゲノムDNAの定量化および移植

Table 9: Quantification and transplantation of native M. mycoides LC genomic DNA

実施例2C
プラグから回収したDNAの、レシピエント細胞への移植
融解させた天然のM.ミコイデスLCのアガロースプラグ（実施例2B（iv）;表9）のシリーズからのそれぞれの試料について、プラグの1/5（20μL）を、以下のようないくつかの改変を加えて、Lartigue et al., Science 317, 632（2007）に記載されているプロトコールと類似するプロトコールを使用して、M.カプリコルムレシピエント細胞に移植した。 Example 2C
Transplanting DNA recovered from plugs into recipient cells For each sample from the series of thawed native M. mycoides LC agarose plugs (Example 2B (iv); Table 9), 1/5 of the plug (20 μL) using a protocol similar to that described in Lartigue et al., Science 317, 632 (2007) with some modifications as follows: Transplanted into cells.

i.レシピエント細胞の培養および調製
6mLのM.カプリコルムレシピエント細胞を、ウシ胎児血清（17％）、グルコース（10g/L）、2mLのフェノールレッド（1％）、および100μlのペニシリンG（5mg/ml））を補充したSOB（+）培地（Bacto SOB培地（Becton Dickinson;Franklin Lakes, NJ）中で、培養物のpHがpH 5.7〜5.85（およそ5×10⁷個の細胞/ml）に達するまで増殖させた。レシピエント細胞を、10℃で15分間、4575gで遠心分離し、S/T緩衝液（10mMのTris-HCl（pH 6.5）;および250mMのNaCl）中で1回洗浄し、200μlのCaCl₂（0.1M）中に再度懸濁し、そして氷上で30分間インキュベーションした。 i. Culture and preparation of recipient cells
SOB supplemented with 6 mL of M. capricolum recipient cells, fetal calf serum (17%), glucose (10 g / L), 2 mL phenol red (1%), and 100 μl penicillin G (5 mg / ml)) Grown in (+) medium (Bacto SOB medium (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ)) until the pH of the culture reached pH 5.7-5.85 (approximately 5 × 10 ⁷ cells / ml). Cells are centrifuged at 4575 g for 15 min at 10 ° C., washed once in S / T buffer (10 mM Tris-HCl (pH 6.5); and 250 mM NaCl), and 200 μl CaCl ₂ (0.1 M Resuspended in) and incubated on ice for 30 minutes.

ii.アガロースプラグ中での単離したドナーゲノムDNAの調製
移植前に、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有しているアガロースプラグ（シリーズ1〜7）を、2回、それぞれ30分間、0.1×TE緩衝液［2mMのTRIS-HCl（pH 8.0）-5mMのEDTA]中で、室温で穏やかに撹拌しながら洗浄した。この緩衝液を完全に除去し、アガロースプラグを、1/10容量の1O×β-アガラーゼ緩衝液［10mMのBis Tris-HCl（pH 6.5）;1mMのNa₂EDTA]で、65℃で10分間融解させた。この融解させたアガロースを10分間かけて42℃に冷却し、この温度で、プラグ100μlあたり3ユニットのβ-アガラーゼI（New England Biolabs, Ipswich, MA）とともに一晩インキュベーションした。 ii. Preparation of isolated donor genomic DNA in an agarose plug Prior to transplantation, agarose plugs (series 1-7) containing genomic DNA of M. mycoides LC were washed twice for 30 minutes each, 0.1X Washed in TE buffer [2 mM TRIS-HCl (pH 8.0) -5 mM EDTA] with gentle agitation at room temperature. The buffer was completely removed and the agarose plug was removed with 1/10 volume of 10 × β-agarase buffer [10 mM Bis Tris-HCl (pH 6.5); 1 mM Na ₂ EDTA] at 65 ° C. for 10 minutes. Thawed. The thawed agarose was cooled to 42 ° C. over 10 minutes and incubated overnight at this temperature with 3 units of β-Agarase I (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) Per 100 μl of plug.

iii.5％のPEGを使用した移植
氷上で30分の後、200μlのレシピエント細胞を、上記実施例2B（ii）において作製した20μlの融解させたドナーゲノムDNAのアガロースプラグ（プラグの1/5）を含有している400μlのSP4（-）培地［0％のウシ胎児血清、0.45％のNaCl]とともに穏やかに混合した。すぐにプラグを添加し、その後、以下のように次の工程で処理した。 iii. Transplantation with 5% PEG After 30 minutes on ice, 200 μl of recipient cells were transformed into 20 μl of agarose plug of thawed donor genomic DNA made in Example 2B (ii) above (1/1 of the plug). Gently mixed with 400 μl of SP4 (−) medium [0% fetal calf serum, 0.45% NaCl] containing 5). The plug was added immediately and then processed in the next step as follows.

等量（620μl）の2×融合緩衝液（20mMのTris-HCl（pH 6.5）、250mMのNaCl、20mMのMgCl₂、10％のFluka PEG-6000（Sigma-Aldrich、St.Louis, MO））を、すぐにSP4（-）、ゲノムDNA、および細胞の混合物に添加し、チューブを30秒間穏やかに揺らすことにより混合物をホモジナイズした。37℃で50分の後、5mLの予め温めておいたSP4を添加し、細胞を穏やかに混合した。37℃でさらに3時間の後、細胞を、10℃で15分間、4,575gで遠心分離し、0.6mLのSP4中に再度懸濁し、4μg/mlのテトラサイクリンと150μg/mlのX-galとを含有しているSP4プレート上に播種した。3〜4日後、個々のコロニーを突いて採取し、10μg/mlのテトラサイクリンを含有している培養培地中で増殖させた。 Equal volume (620 μl) of 2 × fusion buffer (20 mM Tris-HCl (pH 6.5), 250 mM NaCl, 20 mM MgCl ₂ , 10% Fluka PEG-6000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) Was immediately added to the SP4 (−), genomic DNA, and cell mixture, and the mixture was homogenized by gently shaking the tube for 30 seconds. After 50 minutes at 37 ° C., 5 mL of pre-warmed SP4 was added and the cells were mixed gently. After an additional 3 hours at 37 ° C, the cells are centrifuged at 4,575 g for 15 minutes at 10 ° C, resuspended in 0.6 mL SP4, and 4 μg / ml tetracycline and 150 μg / ml X-gal. Seeded on containing SP4 plates. After 3-4 days, individual colonies were picked and grown in culture medium containing 10 μg / ml tetracycline.

結果を、上記の表9に示す。これは、回収した移植体（ドナーDNAを持つレシピエント細胞のコロニー）の数が、移植反応中に存在する天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量に比例して増加したことを示す。移植体の数の減少は、試験した最も高いDNA濃度で観察された（シリーズ8）。200ngのゲノムDNAを用いて、30個の移植体が得られた。1μgの天然のM.ミコイデスLCのドナーゲノムDNAあたりおよそ200個の移植体のコロニーが、その後の実験においてこの方法を使用して日常的に得られた。これらのデータは、このプロトコールの効率が非常に高く、酵母宿主細胞から得たドナーであるM.ミコイデスLC DNAの量が、この方法で使用するゲノムの移植における律速要因ではないことを明らかにした。   The results are shown in Table 9 above. This indicates that the number of recovered transplants (recipient cell colonies with donor DNA) increased in proportion to the amount of native M. mycoides LC genomic DNA present during the transplantation reaction. A decrease in the number of transplants was observed at the highest DNA concentration tested (series 8). Thirty transplants were obtained using 200 ng genomic DNA. Approximately 200 transplant colonies per 1 μg of native M. mycoides LC donor genomic DNA were routinely obtained using this method in subsequent experiments. These data revealed that the protocol was very efficient and that the amount of donor M. mycoides LC DNA from yeast host cells was not the rate-limiting factor in the transplantation of the genome used in this method. .

上記移植方法はまた、溶液中の10μgのプラスミドDNAを20μlの融解させたアガロースプラグで置換することにより、プラスミドDNAでのM.カプリコルムレシピエント細胞の形質転換（アガロースプラグ中ではない）にも使用することができる。   The transplantation method also involves transformation of M. capricolum recipient cells with plasmid DNA (not in an agarose plug) by replacing 10 μg of plasmid DNA in solution with 20 μl of a thawed agarose plug. Can be used.

実施例2D
制限修飾（R-M）システムの評価
ドナー細胞、宿主細胞、およびレシピエント細胞間での制限修飾システムの差異が、ゲノムの移植において問題を引き起こす可能性があるため、これらのシステムを調べた。本実施例は、本明細書中で移植に使用したマイコプラズマ細胞のいくつかの中に存在しその中で活性である制限修飾システムの成分を、明らかにし、かつ、移植の成功のためにこれらのシステムを妨害するように使用した本提供の方法の複数の局面を明らかにする。 Example 2D
Evaluation of restriction modification (RM) systems These systems were examined because differences in restriction modification systems between donor cells, host cells, and recipient cells can cause problems in genome transplantation. This example identifies the components of the restriction modification system that are present and active in some of the mycoplasma cells used for transplantation herein, and for successful transplantation these Several aspects of the method provided are used to disrupt the system.

i.ドナー細胞およびレシピエント細胞中での予想されるR-Mシステムの同定
M.ミコイデスLCゲノム（これは配列決定されている（Genbankアクセッション番号:NZ_AAZK00000000;GI:149364883））が、6種類の異なる制限修飾システム（5つのII型システムと一つのIII型システム）を含むと予想した。M.カプリコルムゲノム配列は、一つのII型システムの存在を示した。II型酵素の認識部位特異性を、遺伝子配列（R.Roberts博士、私信）から、Roberts RJ et al., Nucleic Acids Res.35（Database issue）:D269-70（2007）に記載されているように予想した。World Wide Webアドレス:rebase.neb.com/rebase/rebase.html.で利用できるREBASE、The Restriction Enzyme Databaseもまた参照のこと。これらの認識部位と、これらの部位を切断する市販されている制限酵素を、以下の表10に列挙する。III型システムの特異性は予想しなかった。 i. Identification of expected RM systems in donor and recipient cells
M. mycoides LC genome (which has been sequenced (Genbank accession number: NZ_AAZK00000000; GI: 149364883)), but contains six different restriction modification systems (5 type II systems and one type III system) I expected. The M. capricolum genome sequence indicated the presence of one type II system. The recognition site specificity of the type II enzyme is described from the gene sequence (Dr. Roberts, personal communication) to Roberts RJ et al., Nucleic Acids Res. 35 (Database issue): D269-70 (2007) I expected. See also REBASE, The Restriction Enzyme Database, available at the World Wide Web address: rebase.neb.com/rebase/rebase.html. These recognition sites and the commercially available restriction enzymes that cleave these sites are listed in Table 10 below. The specificity of the type III system was unexpected.

（表１０）M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLC配列から予想される制限修飾（R-M）システム

Table 10: Restriction modification (RM) systems predicted from M. capricolum and M. mycoides LC sequences

ii.R-Mシステムの確認
a.制限部位のメチル化状態
予想したII型制限酵素システムに対応している市販されている制限酵素アイソシゾマーを、M.ミコイデスLCおよびM.カプリコルムの天然のゲノムが、表10に列挙した予想した部位でメチル化されるかどうかを確認するために使用した。アイソシゾマーでのM.ミコイデスLCのゲノムDNAおよびM.カプリコルムのゲノムDNAの消化は、天然のゲノムDNAが、予想される部位でメチル化されたことを示した（データは示さず）。これらの結果は、M.カプリコルムとM.ミコイデスLCがいずれも、CCATC制限修飾システムを含むことを示していた。 ii. Check RM system
a. Restriction site methylation status The predicted restriction enzyme isoschizomers corresponding to the predicted type II restriction enzyme system were predicted by the natural genomes of M. mycoides LC and M. capricolum listed in Table 10. Used to confirm whether it was methylated at the site. Digestion of M. mycoides LC genomic DNA and M. capricolum genomic DNA with isoschizomers showed that native genomic DNA was methylated at the expected site (data not shown). These results indicated that both M. capricolum and M. mycoides LC contain a CCATC restriction modification system.

この研究のために、M.ミコイデスLCおよびM.カプリコルム由来のゲノムDNAを、Wizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（Promega, Madison, WI）を製造業者の説明に従って使用して精製した。およそ1μgの各M.ミコイデスLCのゲノムDNAおよびM.カプリコルムのゲノムDNAを、製造業者（New England Biolabs, Ipswich, MA）によって記載されているように、BccI、HinfI、HpyAV、MboI、およびSfaNIのぞれぞれとともにインキュベーションした。その後、DNAをアガロースゲル電気泳動によって分析した（データは示さず）。   For this study, genomic DNA from M. mycoides LC and M. capricolum was purified using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, Wis.) According to the manufacturer's instructions. Approximately 1 μg of each M. mycoides LC genomic DNA and M. capricolum genomic DNA was obtained from BccI, HinfI, HpyAV, MboI, and SfaNI as described by the manufacturer (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Incubated with each. The DNA was then analyzed by agarose gel electrophoresis (data not shown).

予想したR-Mシステム（表10を参照のこと）に基づいて予期したとおり、M.ミコイデスLCのゲノムDNAは、試験した5種類の制限酵素アイソシゾマー全てによる切断に対して耐性であり、これは、これらの部位のそれぞれでDNAがメチル化されたことを示していた。一方、M.カプリコルムのゲノムDNAは、両方の生物において同定された制限修飾システムである、制限酵素アイソシゾマー（BccI）による切断に対してのみ耐性があった。これらの結果により、マイコプラズマ種におけるこれらのそれぞれのR-Mシステム（表10）の存在を確認し、例えば、M.ミコイデスLCとM.カプリコルムがいずれも、CCATC制限修飾システムを含むことを示した。   As expected based on the expected RM system (see Table 10), the genomic DNA of M. mycoides LC is resistant to cleavage by all five restriction enzyme isoschizomers tested, which It was shown that DNA was methylated at each of the sites. On the other hand, the genomic DNA of M. capricolum was only resistant to cleavage by the restriction enzyme isoschizomer (BccI), a restriction modification system identified in both organisms. These results confirmed the presence of these respective RM systems (Table 10) in mycoplasma species, for example, indicating that both M. mycoides LC and M. capricolum contain a CCATC restriction modification system.

M.カプリコルムから予想した制限酵素システムに対応している市販されている制限酵素アイソシゾマーを利用できることにより、本発明者らは、2つのゲノムを適切な制限酵素部位でメチル化できるかどうかを試験することができた。M.ミコイデスおよびM.カプリコルム由来のゲノムDNAを、Wizard Genomic DNA Purification Kitを使用して精製した。およそ1μgの各M.ミコイデスのゲノムDNAおよびM.カプリコルムのゲノムDNAを、BccIとともにインキュベーションした。その後、DNAをアガロースゲル電気泳動によって分析した。予期したとおり、M.ミコイデスのゲノムDNAとM.カプリコルムのゲノムDNAはいずれも、BccI（上記2種類の生物の相同であるR-Mシステムに対応する酵素）による切断に対して耐性があった（データは示さず）。   With the availability of a commercially available restriction enzyme isoschizomer corresponding to the restriction enzyme system predicted from M. capricolum, we test whether the two genomes can be methylated at the appropriate restriction enzyme sites. I was able to. Genomic DNA from M. mycoides and M. capricolum was purified using the Wizard Genomic DNA Purification Kit. Approximately 1 μg of each M. mycoides genomic DNA and M. capricolum genomic DNA were incubated with BccI. DNA was then analyzed by agarose gel electrophoresis. As expected, both M. mycoides genomic DNA and M. capricolum genomic DNA were resistant to cleavage by BccI (an enzyme corresponding to the RM system that is homologous to the above two organisms) (data). Is not shown).

b.制限酵素活性
M.ミコイデスLCおよびM.カプリコルムから、細胞を含まない抽出物を、制限酵素がいずれの種においても活性であることを明らかにするために調製した。以下に記載するように、上記抽出物を、M.ミコイデスLC、M.カプリコルム、およびM.ゲニタリウムのゲノムDNAを切断するそれらの能力を試験するために、制限酵素アッセイにおいて使用した。 b. Restriction enzyme activity
Cell-free extracts were prepared from M. mycoides LC and M. capricolum to demonstrate that the restriction enzyme is active in any species. As described below, the extracts were used in restriction enzyme assays to test their ability to cleave genomic DNA of M. mycoides LC, M. capricolum, and M. genitalium.

c.細胞抽出物の調製
M.ミコイデスLCについては、SP4培地中の細胞の1リットルの培養物を、6.2〜6.3のpHに達するまで、37℃で増殖させた。細胞を5つの200mLの画分に分け、そしてSLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間、5,000×gで遠心分離することにより、培養物を回収した。その後、M.ミコイデスLCペレットをそれぞれ、200mLの8mM Hepes（pH 7.4）および272mMのスクロースで洗浄し、SLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間、5,000×gで遠心分離した。得られたペレットをそれぞれ、1mlの抽出緩衝液（20mMのTris-HCl（pH 7.5）、0.1mMのEDTA、150mMのNaCl、1mMのDTT、および10％のグリセロール）の中に再度懸濁し、その後、3の出力制御で、マイクロチップを使用して氷上で5回、10秒〜12秒のバーストを用いて超音波処理した。溶液それぞれを、4℃で30分間、18,000×gで微量遠心機により明澄化した。得られた各可溶性画分を合わせて一つにし、タンパク質濃度を試験し、200μlの画分にアリコートし、-80℃で保存した。この様式で調製した抽出物のタンパク質濃度は、典型的には、15mg/ml〜25mg/mlの範囲であった。 c. Preparation of cell extract
For M. mycoides LC, a 1 liter culture of cells in SP4 medium was grown at 37 ° C. until a pH of 6.2-6.3 was reached. Cultures were harvested by dividing the cells into five 200 mL fractions and centrifuging at 5,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. in an SLA-1500 Sorvall rotor. The M. mycoides LC pellets were then washed with 200 mL of 8 mM Hepes (pH 7.4) and 272 mM sucrose, respectively, and centrifuged at 5,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. in an SLA-1500 Sorvall rotor. Each resulting pellet is resuspended in 1 ml extraction buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, and 10% glycerol), then Sonicated with a burst of 10-12 seconds, 5 times on ice using a microchip, with a power control of 3. Each solution was clarified by microcentrifuge at 18,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. Each soluble fraction obtained was combined and tested for protein concentration, aliquoted into 200 μl fractions and stored at −80 ° C. The protein concentration of extracts prepared in this manner typically ranged from 15 mg / ml to 25 mg / ml.

M.カプリコルムについては、10μg/mlのテトラサイクリンを含有しているSP4培地中で1リットルの培養物を増殖させたことを除き、M.ミコイデスLCについて記載した方法と同じ方法を使用して抽出物を調製した。   For M. capricolum, the extract was used using the same method described for M. mycoides LC, except that 1 liter culture was grown in SP4 medium containing 10 μg / ml tetracycline. Was prepared.

d.制限酵素活性のアッセイ
M.ミコイデスLC抽出物の制限酵素活性を以下のように試験した。WIZARD（登録商標）Genomic DNA精製キット（Promega Corporation, Madison, WI）を使用してM.カプリコルム、M.ミコイデスLC、およびM.ゲニタリウムから、別々の反応において個別に単離した2μgのゲノムDNAを、1×NEB制限酵素緩衝液4および100μMのデオキシヌクレオチドの中で、8μgの抽出物とともに、100μlの全容量の中で37℃でインキュベーションした。タンパク質を最後に添加し、0分、5分、10分、および15分の時間間隔で、20μlのアリコートを取り出し、20μlの2×停止緩衝液（2％のSDS、20mMのEDTA）に対して添加した。この溶液を、40μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、室温で2分間、18,000×gで遠心分離した。水相を、4μlの1O×Blue Juice（Invitrogen, Carlsbad, CA）とともに新しいチューブに入れ、18μlの各溶液を、0.8％の1×TAEアガロースゲル上に充填し、そして120V、0.1〜0.6の線形、および80V、0.1〜0.6の線形のFIGE条件下で16時間泳動させた。その後、このアガロースゲルを、SYBR（登録商標）GOLD核酸染色（Invitrogen, Carlsbad, CA）（1/10,000の希釈率）で30分間染色し、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。 d. Restriction enzyme activity assay
The restriction enzyme activity of M. mycoides LC extract was tested as follows. Separately isolated 2 μg genomic DNA from M. capricolum, M. mycoides LC, and M. genitalium using the WIZARD® Genomic DNA purification kit (Promega Corporation, Madison, Wis.) Incubate at 37 ° C. in a total volume of 100 μl with 8 μg extract in 1 × NEB restriction enzyme buffer 4 and 100 μM deoxynucleotides. Add protein last and remove 20 μl aliquots at 0 min, 5 min, 10 min and 15 min time intervals and against 20 μl of 2 × Stop Buffer (2% SDS, 20 mM EDTA) Added. This solution was extracted with 40 μl phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) and centrifuged at 18,000 × g for 2 minutes at room temperature. The aqueous phase is placed in a new tube with 4 μl of 1O × Blue Juice (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 18 μl of each solution is loaded onto a 0.8% 1 × TAE agarose gel, and 120V, 0.1-0.6 linear , And 80 V, 0.1-0.6 linear FIGE conditions for 16 hours. The agarose gel was then stained with SYBR® GOLD nucleic acid stain (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) (1 / 10,000 dilution) for 30 minutes and scanned with a GE Typhoon 9410 imager.

M.カプリコルム抽出物の制限酵素活性を、1×NEB制限酵素緩衝液1と12μgのM.カプリコルム抽出物をそれぞれの反応において使用し、アリコートを、0分、15分、30分、および45分の間隔で取り出して処理したことを除き、同じ様式で試験した。   Restriction enzyme activity of M. capricolum extract, 1 × NEB restriction enzyme buffer 1 and 12 μg of M. capricolum extract were used in each reaction, and aliquots were 0, 15, 30, and 45 minutes Were tested in the same manner, except that they were removed and processed at intervals.

実施例2D（ii）（a）に記載した研究による結果（ゲルの結果は示さず）は、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを、M.カプリコルムの制限修飾システムによる切断から保護するべきであること、しかし、M.カプリコルムのゲノムDNAは、M.ミコイデスLCの制限修飾システムによって容易に切断されるはずであることを示唆していた。実際、相同である制限修飾システムにより予想したとおり、M.ミコイデスLC由来のゲノムDNAおよびM.カプリコルム由来のゲノムDNAは切断されず、一方、M.ゲニタリウム由来のゲノムDNA（これは、制限修飾システムを全く含まない）は、容易に切断された。M.ゲニタリウムのゲノムDNAの切断は、M.カプリコルム中での制限酵素の活性が原因であった。これは、M.カプリコルム株由来の粗抽出物（この中では、予想した制限酵素遺伝子が破壊されていた（実施例2Fを参照のこと））が、試験した3種類のマイコプラズマ株のいずれに由来するゲノムDNAも切断しなかったという事実から明らかであった。これもまた予期したとおり、M.カプリコルム由来のゲノムDNAは、M.ミコイデスLCの粗抽出物とともにインキュベーションした場合に切断されたが、M.ミコイデスLCは切断されなかった。これらの結果は、M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLCが、活性な制限修飾システムを含み、これが、酵母から単離したメチル化されていないM.ミコイデスLCのドナーゲノムの活性化を達成する可能性があることを示していた。λDNAを、野生型M.カプリコルム抽出物によって消化した。このDNAの、M.カプリコルムRE（-）株から作製した抽出物とのインキュベーションはバンドの出現を生じなかった。これは、この株由来の制限酵素活性が存在しないことを示していた。   The results from the study described in Example 2D (ii) (a) (gel results not shown) indicate that the genomic DNA of M. mycoides LC should be protected from cleavage by the restriction modification system of M. capricolum However, it suggested that the genomic DNA of M. capricolum should be easily cleaved by the restriction modification system of M. mycoides LC. Indeed, as expected by the homologous restriction modification system, genomic DNA from M. mycoides LC and genomic DNA from M. capricolum are not cleaved, whereas genomic DNA from M. genitalium (this is a restriction modification system). Was not easily cut off. Cleavage of the genomic DNA of M. genitalium was due to restriction enzyme activity in M. capricolum. This is a crude extract from the M. capricolum strain (in which the expected restriction enzyme gene was disrupted (see Example 2F)), but from any of the three mycoplasma strains tested It was clear from the fact that the genomic DNA was not cut. Again, as expected, genomic DNA from M. capricolum was cleaved when incubated with a crude extract of M. mycoides LC, but M. mycoides LC was not cleaved. These results indicate that M. capricolum and M. mycoides LC contain an active restriction modification system, which may achieve activation of the donor genome of unmethylated M. mycoides LC isolated from yeast Showed that there is. λDNA was digested with wild type M. capricolum extract. Incubation of this DNA with an extract made from M. capricolum RE (-) strain did not result in the appearance of bands. This indicated that there was no restriction enzyme activity from this strain.

e.M.ミコイデスドナーおよび移植体クローンのゲノムの配列決定およびゲノムの比較
2つのM.ミコイデスクローンを配列決定した。一方は、Science（317,362）に公開された2007年の論文「Genome transplantation in bacteria:changing one species to another」の中でLartigue et al.によって記載されたドナーゲノム（1,088,905bp、GenBank＃CP001621）であった。他方は、III型制限酵素遺伝子欠失を含む移植されたM.ミコイデスクローン（ΔtypeIIIres;図17）（1,084,586bp、Genbank＃CP001668）であった。2007年の論文で使用されたクローンを、Sanger DNA配列決定化学反応だけを使用して配列決定した。本明細書中に記載するIII型制限酵素遺伝子欠失クローンは、Sanger法により8倍の被覆率になるように、また、454 FLXペアード・エンド・リード・ピロシーケンシング化学反応（paired-end read pyrosequencing chemistry）を用いて配列決定した。 Sequencing and genome comparison of eM mycoides donor and transplant clones
Two M. Micoy descones were sequenced. One was the donor genome (1,088,905 bp, GenBank # CP001621) described by Lartigue et al. In the 2007 paper “Genome transplantation in bacteria: changing one species to another” published in Science (317,362). It was. The other was a transplanted M. mycoid desclone (ΔtypeIIIres; FIG. 17) (1,084,586 bp, Genbank # CP001668) containing a type III restriction enzyme gene deletion. The clone used in the 2007 paper was sequenced using only the Sanger DNA sequencing chemistry. The type III restriction enzyme gene-deleted clone described in the present specification has a coverage rate of 8 times by the Sanger method, and a 454 FLX paired-end read pyrosequencing chemistry reaction (paired-end read Sequencing using pyrosequencing chemistry).

移植体が完全なM.ミコイデスであり、酵母配列またはM.カプリコルムレシピエント細胞の配列のいずれかを含むキメラではないことを確認するため、そして細菌ゲノムが酵母にクローニングされた場合に安定であるかどうかを決定するために、2つの配列を比較した。アセンブリしたΔtypeIIIresゲノムは全て、YCpベクターとマッチするこれらの領域を除き、M.ミコイデスとマッチした。さらに、ゲノムの中に意図的に構築した差異を除き、III型制限酵素遺伝子欠失を持つ移植体であるM.ミコイデスゲノム配列は、95個の部位を除き、以前に配列決定したM.ミコイデスゲノムと同じであった。これらの95個の配列の差異は、本明細書中で使用したドナーであるM.ミコイデスと、変更したゲノムの間では異なっていないことに留意しなければならない。これらは、2007年の論文（Id.）において使用されたM.ミコイデス株（Genbank＃CP001621）の配列と、本明細書中の変更したゲノム（Genbank＃CP001668）との間では異なる。本発明者らは、M.ミコイデスYCpMmyc1.1（これを、もとのM.ミコイデス酵母クローンを作製するために使用した）の中のこれらの95個の部位のうちのそれぞれ一つを配列決定した。それぞれの場合において、移植体の配列は、この移植体の起源であるYCpMmyc1.1ドナーとマッチしていた。したがって、95個の配列の差異は全て、酵母の中でのクローニング、酵母の中での増殖および変更、または変更したM.ミコイデス株を作製するための酵母の外への移植の間に生じたものではない。2つの完全に配列決定したM.ミコイデスゲノムにおいて同じである全ての配列はまた、YCpMmyc1.1ドナー株においても同じであるとの仮定に基づき、意図的に変更したもの以外の配列変化は、酵母の中でのクローニングおよび増殖の間、ならびに細菌へと移植により戻す間には起こらなかったと結論付けた。   To confirm that the transplant is a complete M. mycoides and not a chimera containing either yeast sequences or M. capricolum recipient cell sequences, and stable when the bacterial genome is cloned into yeast To determine if there was, the two sequences were compared. All assembled ΔtypeIIIres genomes matched M. mycoides except for those regions that matched the YCp vector. In addition, except for deliberately constructed differences in the genome, the M. mycoides genome sequence, which is a graft with a type III restriction enzyme deletion, was previously sequenced except for 95 sites. It was the same as the Mycoides genome. It should be noted that these 95 sequence differences are not different between the donor M. mycoides used herein and the modified genome. These differ between the sequence of the M. mycoides strain (Genbank # CP001621) used in the 2007 paper (Id.) And the modified genome (Genbank # CP001668) herein. We sequenced each one of these 95 sites in M. mycoides YCpMmyc1.1 (which was used to create the original M. mycoides yeast clone). did. In each case, the transplant sequence matched the YCpMmyc1.1 donor from which the transplant originated. Thus, all 95 sequence differences occurred during cloning in yeast, growth and modification in yeast, or transplanting out of yeast to create a modified M. mycoides strain. It is not a thing. Based on the assumption that all sequences that are the same in two fully sequenced M. mycoides genomes are also the same in the YCpMmyc1.1 donor strain, sequence changes other than those that were intentionally altered are It was concluded that it did not occur during cloning and propagation in yeast and during transfer back to bacteria.

これらのデータは、酵母ゲノムまたはレシピエント細胞のゲノムのいずれも、M.ミコイデスのドナーゲノムとの組換えが起こらなかったこと、およびこれらの細菌のゲノム配列が、YCpとしての酵母の中での増殖、変更、および保存の間、安定であることを示す。   These data indicate that neither the yeast genome nor the recipient cell genome had recombined with the donor genome of M. mycoides, and that the genomic sequence of these bacteria was in yeast as YCp. Shows stability during growth, modification, and storage.

実施例2E
制限修飾システムの不和合性からドナーゲノムおよび核酸を保護するための方法
本実施例は、制限修飾システムによる切断からマイコプラズマ（例えば、M.ミコイデスLC）のドナーゲノムを保護するために使用した2種類のメチル化方法を記載する。メチル化アッセイは、効率を確認するために、それぞれの方法について行った。 Example 2E
Methods for Protecting Donor Genomes and Nucleic Acids from Incompatibility of Restriction Modification Systems This example illustrates the two types used to protect mycoplasma (eg, M. mycoides LC) donor genomes from cleavage by restriction modification systems The methylation method of is described. A methylation assay was performed for each method to confirm efficiency.

i.構築および精製したメチルトランスフェラーゼによるメチル化
最初に、以下に記載するように、M.ミコイデスLCゲノムの決定した配列を、同定したメチルトランスフェラーゼそれぞれ（上記表10を参照のこと）を外因的に発現させ、かつ精製するために使用した。M.カプリコルムにおいて同定したR-MシステムだけがM.ミコイデスLCにおいて同定したものと同じであったので、M.ミコイデスLCメチルトランスフェラーゼだけを、この研究のために精製した。 i. Methylation with constructed and purified methyltransferases First, as described below, the determined sequence of the M. mycoides LC genome was exogenously transferred to each of the identified methyltransferases (see Table 10 above). Used for expression and purification. Since only the RM system identified in M. capricolum was the same as that identified in M. mycoides LC, only M. mycoides LC methyltransferase was purified for this study.

a.メチルトランスフェラーゼの構築
M.ミコイデスLC中の可能性がある制限修飾システムに由来する5つの同定したメチルトランスフェラーゼ（CCATC-M、CCTTC-M、TypeIII-M、GCATC-M、およびGANTC-M）のコード配列を、酵母の中での発現のためにコドン最適化した。その後、これらの配列を、Gibson et al., Nature Methods 6, 343-345（2009）、および2009年2月19日に提出された米国特許出願第12/371,543号に記載されている、1工程の等温DNAアセンブリ法を使用して、5'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、およびDNAリガーゼの協働作用により、多数の重複している60bpのオリゴヌクレオチドから構築した。簡単に説明すると、この方法を用いる場合は、DNA断片に、最初に、5'エキソヌクレアーゼによって凹みを作り、これにより、一本鎖の突出を生じさせる。次に、これを特異的にアニーリングさせ、続いてギャップを埋め、ポリメラーゼとリガーゼを使用して共有結合させる。構築後、CCATC-M、CCTTC-M、およびTypeIII-M配列を、pTYB1発現ベクター（New England Biolabs, Ipswich, MA;SEQ ID NO:156）にクローニングした。GCATC-M配列およびGANTC-M配列を、GATEWAY（登録商標）組換えクローニング技術（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてN末端Hisタグ発現ベクターにクローニングした。 a. Construction of methyltransferase
The coding sequence of five identified methyltransferases (CCATC-M, CCTTC-M, TypeIII-M, GCATC-M, and GANTC-M) from a potential restriction modification system in M. mycoides LC Codon optimized for expression in These sequences were then transferred to a one-step process as described in Gibson et al., Nature Methods 6, 343-345 (2009), and US patent application Ser. No. 12 / 371,543 filed Feb. 19, 2009. Was constructed from a number of overlapping 60 bp oligonucleotides by the cooperative action of 5 'exonuclease, DNA polymerase, and DNA ligase. Briefly, when using this method, a DNA fragment is first recessed by a 5 ′ exonuclease, thereby producing a single-stranded overhang. This is then annealed specifically, followed by filling the gap and covalently binding using polymerase and ligase. After construction, CCATC-M, CCTTC-M, and TypeIII-M sequences were cloned into the pTYB1 expression vector (New England Biolabs, Ipswich, MA; SEQ ID NO: 156). GCATC-M and GANTC-M sequences were cloned into N-terminal His-tag expression vectors using GATEWAY® recombinant cloning technology (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

b.メチラーゼの精製
CCATC-M、CCTTC-M発現プラスミド
CCATC-M発現プラスミドとCCTTC-M発現プラスミドとで、BL21（DE3）コドンプラス細胞（Stratagene, La Jolla, CA）を形質転換し、形質転換体を使用して、100mg/mlのカルベニシリンと34mg/mlのクロラムフェニコールを含有している250mLのZYM-505培地（Studier, FW, Protein Expr Purific 41:207-34（2005））に別々に接種し、激しく撹拌しながら（315rpm）37℃で増殖させた。およそ4時間後、培養物を16℃に移し、発現を、0.3mMのIPTGの添加により、一晩誘導した。細胞をペレット状にし、50mlのIntein溶解緩衝液（25mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、500mMのNaCl、1mMのEDTA、10％のグリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤（Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN））に懸濁し、高圧ホモジナイザーに2回通過させることにより溶解させた。 b. Purification of methylase
CCATC-M, CCTTC-M expression plasmid
BL21 (DE3) codon plus cells (Stratagene, La Jolla, Calif.) Were transformed with CCATC-M expression plasmid and CCTTC-M expression plasmid, and the transformant was used to transform 100 mg / ml carbenicillin with 34 mg / ml. Separately inoculate 250 mL of ZYM-505 medium (Studier, FW, Protein Expr Purific 41: 207-34 (2005)) containing ml of chloramphenicol and with vigorous stirring (315 rpm) at 37 ° C Allowed to grow. After approximately 4 hours, the culture was transferred to 16 ° C. and expression was induced overnight by addition of 0.3 mM IPTG. Cells are pelleted and 50 ml of Intein lysis buffer (25 mM HEPES-NaOH, pH 7.2), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, and protease inhibitors (Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Suspended in Indianapolis, IN)) and dissolved by passing twice through a high-pressure homogenizer.

この溶解物を、4℃で20分間の、20,000×gでの遠心分離により明澄化させた。明澄化させた溶解物を、製造業者（New England Biolabs, Ipswich, MA）によって推奨されているように、キチンビーズの1.5mlのカラム上で精製した。適切なメチルトランスフェラーゼを含有している画分をプールし、酵素緩衝液（50mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、10％のグリセロール）に対して透析した。透析後、メチルトランスフェラーゼを、Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit（Millipore, Billerica, MA）を使用して濃縮した。   The lysate was clarified by centrifugation at 20,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. Clarified lysates were purified on a 1.5 ml column of chitin beads as recommended by the manufacturer (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Fractions containing the appropriate methyltransferase were pooled and dialyzed against enzyme buffer (50 mM HEPES-NaOH, pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol). After dialysis, methyltransferase was concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit (Millipore, Billerica, Mass.).

Type III-M
Type III-Mタンパク質を、キチンカラム上での精製後に、このタンパク質をHiTrap MonoQカラム（GE Heathcare）を使用してさらに精製したことを除き、同じプロトコールを使用して精製した。このタンパク質を緩衝液A（50mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、50mMのNaCl、1mMのEDTA、10％のグリセロール）に充填し、0％〜100％までの緩衝液B（50mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、1MのNaCl、1mMのEDTA、10％のグリセロール）の線形勾配を用いて溶離させた。Type III-Mを含有している画分をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そしてCCATC-Mタンパク質およびCCTTC-Mタンパク質について記載したように濃縮した。 Type III-M
Type III-M protein was purified using the same protocol, except that after purification on a chitin column, the protein was further purified using a HiTrap MonoQ column (GE Heathcare). This protein is loaded into buffer A (50 mM HEPES-NaOH (pH 7.2), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol) and buffer B from 0% to 100% (50 mM HEPES-NaOH Elution was performed using a linear gradient (pH 7.2), 1M NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol. Fractions containing Type III-M were pooled, dialyzed into enzyme buffer containing 100 mM NaCl, and concentrated as described for CCATC-M and CCTTC-M proteins.

GCATC-M発現プラスミドおよびGANTC-M発現プラスミド
M.GCATC発現プラスミドおよびM.GANTC発現プラスミドでBL21（DE3）コドンプラス細胞を形質転換し、形質転換体を使用して、100mg/mlのカルベニシリンを含有している2mLのZYM-505培地に別々に接種し、激しく振盪させながら37℃で一晩増殖させた。一晩培養物のうちの1ミリリットルを使用して、250mLのZYM-5052培地（Studier, FW, Protein Expr Purific 41:207-34（2005））に接種した。その後、細胞を、激しく振盪させながら27℃で20時間増殖させた。細胞をペレット状にし、50mlのNickel溶解緩衝液（50mMのHEPES-NaOH（pH 7.2）、500mMのNaCl、30mMのイミダゾール、10％のグリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤（Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN））中に懸濁し、そして高圧ホモジナイザーに2回通すことにより溶解させた。この溶解物を、4℃で20分間の、20,000×gでの遠心分離によって明澄化させた。明澄化させた溶解物を、Nickel溶解緩衝液をランニングバッファーとして、そして300mMのイミダゾールを含むNickel溶解緩衝液を溶離緩衝液として用いて、5mlのHisTrapカラムを使用して精製した。M.GCATCタンパク質をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そして上記のように濃縮した。M.GANTCタンパク質を、1mlのHiTrap MonoQヘパリンカラムを使用し、M.TypeIIIについての緩衝液AとBを利用してさらに精製した。M.GANTCを含有している画分をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そして上記に記載するように濃縮した。 GCATC-M expression plasmid and GANTC-M expression plasmid
Transform BL21 (DE3) codon plus cells with M.GCATC and M.GANTC expression plasmids and use the transformants separately in 2 mL of ZYM-505 medium containing 100 mg / ml carbenicillin And grown overnight at 37 ° C. with vigorous shaking. One milliliter of the overnight culture was used to inoculate 250 mL of ZYM-5052 medium (Studier, FW, Protein Expr Purific 41: 207-34 (2005)). The cells were then grown for 20 hours at 27 ° C. with vigorous shaking. Cells are pelleted and 50 ml of Nickel lysis buffer (50 mM HEPES-NaOH, pH 7.2), 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, 10% glycerol, and protease inhibitors (Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Suspended in Indianapolis, IN)) and dissolved by passing twice through a high-pressure homogenizer. The lysate was clarified by centrifugation at 20,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. The clarified lysate was purified using a 5 ml HisTrap column using Nickel lysis buffer as running buffer and Nickel lysis buffer containing 300 mM imidazole as elution buffer. M.GCATC proteins were pooled, dialyzed into enzyme buffer containing 100 mM NaCl, and concentrated as described above. M.GANTC protein was further purified using 1 ml HiTrap MonoQ heparin column and utilizing buffers A and B for M.Type III. Fractions containing M.GANTC were pooled, dialyzed into enzyme buffer containing 100 mM NaCl, and concentrated as described above.

c.メチルトランスフェラーゼの研究
精製したメチルトランスフェラーゼを、これらが、マイコプラズマDNAを含有しているプラスミドをメチル化できるかどうかを決定するためのメチル化アッセイにおいて使用した。メチル化アッセイは、Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370（1990年12月）に記載されている緩衝液条件を使用して行った。反応は、100μlの容量の中で37℃で行った。反応混合物には、100mMのTris-HCl（pH 7.5）、10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン（SAM）、3μgのpSmart-pMYCO1プラスミドDNA（酵母-大腸菌-マイコプラズマトリ-シャトルベクター）を含めた。 c. Methyltransferase Studies Purified methyltransferases were used in methylation assays to determine whether they can methylate plasmids containing mycoplasma DNA. Methylation assays were performed using the buffer conditions described in Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370 (December 1990). The reaction was performed at 37 ° C. in a volume of 100 μl. The reaction mixture included 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 3 μM DTT, 200 μM S-adenosylmethionine (SAM), 3 μg pSmart-pMYCO1 plasmid DNA (yeast-E. Coli-Mycoplasma tri-shuttle Vector).

精製したメチルトランスフェラーゼによりDNAがメチル化されたかどうかを評価するために、4μlの各試料を、New England Biolabsから購入した制限酵素アイソシゾマーを使用し、製造業者の説明書に従って切断した。制限酵素アイソシゾマーは、メチル化について評価する配列（BccI（認識部位、CCATC）、HinfI（GANTC）、HpyAV（CCTTC）、SfaNI（GCATC））に応じて使用した。試料を、1％の48ウェルアガロースEゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で、70Vで25分間泳動させた。ゲルを、GE Typhoon 9410イメージャー上でスキャンした。   To assess whether the DNA was methylated by purified methyltransferase, 4 μl of each sample was cleaved according to the manufacturer's instructions using a restriction enzyme isoschizomer purchased from New England Biolabs. Restriction enzyme isozymes were used depending on the sequence to be evaluated for methylation (BccI (recognition site, CCATC), HinfI (GANTC), HpyAV (CCTTC), SfaNI (GCATC)). Samples were run on a 1% 48-well agarose E gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) for 25 minutes at 70V. The gel was scanned on a GE Typhoon 9410 imager.

結果は、個々のメチルトランスフェラーゼ（表10を参照のこと）およびS-アデノシルメチオニン（SAM）とともにインキュベーションした後のプラスミドDNAを、対応する制限酵素アイソシゾマーが切断することが全くできないことにより判断すると、個々の精製したメチルトランスフェラーゼが、マイコプラズマプラスミドDNAを完全にメチル化できることを示していた（ゲルのデータは示さず）。   The results are judged by the fact that the plasmid DNA after incubation with individual methyltransferases (see Table 10) and S-adenosylmethionine (SAM) cannot be cleaved by the corresponding restriction enzyme isoschizomer at all. Individual purified methyltransferases were shown to be able to fully methylate mycoplasma plasmid DNA (gel data not shown).

別の研究においては、M.ミコイデスの粗抽出物を、SAMを伴って、または伴わずに、pMYC01プラスミドDNAを処理するために使用した。その後、このDNAをBccIによって消化して、上記抽出物中のメチルトランスフェラーゼの活性を試験した（データは示さず）。M.ミコイデスの抽出物はまた、入ってくるドナーDNAを保護した。M.ミコイデスのドナーゲノム中に存在するさらなる制限修飾システムは、移植に影響を及ぼさなかった。   In another study, a crude extract of M. mycoides was used to process pMYC01 plasmid DNA with or without SAM. This DNA was then digested with BccI and tested for methyltransferase activity in the extract (data not shown). The M. mycoides extract also protected incoming donor DNA. Additional restriction modification systems present in the donor genome of M. mycoides did not affect transplantation.

ii.粗抽出物によるメチル化
メチル化後のさらなる、ゲノム配列の中では同定されていない明らかになっていない制限修飾システム由来の酵素による（したがって、精製されたメチラーゼによっては行われない）切断の可能性を排除するために、M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLCから調製した粗抽出物を使用してDNAをメチル化するための一つのプロトコールを開発した。上記抽出物は、10mMのEDTA（これはヌクレアーゼを阻害する）の添加により、メチルトランスフェラーゼ活性の供給源として使用することができる。 ii. Methylation by the crude extract Further cleavage after methylation by an enzyme from a restriction modification system that has not been identified in the genomic sequence (and thus is not performed by purified methylase) To eliminate the possibility, a protocol was developed for methylating DNA using crude extracts prepared from M. capricolum and M. mycoides LC. The extract can be used as a source of methyltransferase activity by the addition of 10 mM EDTA (which inhibits nucleases).

a.細胞抽出物の調製
M.ミコイデスLCについては、SP4培地中の1リットルの細胞培養物を、6.2〜6.3のpHに達するまで、37℃で増殖させた。この培養物を、細胞を5×200mlの画分に分け、そしてSLA-1500 Sorvallローターの中で、4℃で15分間、5,000×gで遠心分離することにより回収した。その後、M.ミコイデスLCペレットをそれぞれ、200mLの8mMのHepes（pH 7.4）および272mMのスクロースで洗浄し、SLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間の、5,000×gでの遠心分離により明澄化した。得られたペレットをそれぞれ、1mlの抽出緩衝液（20mMのTris-HCl（pH 7.5）、0.1mMのEDTA、150mMのNaCl、1mMのDTT、および10％のグリセロール）の中に再度懸濁し、その後、3の出力制御で、マイクロチップを使用して氷上で5回、10秒〜12秒のバーストを用いて超音波処理した。溶液それぞれを、4℃で30分間、18,000×gで微量遠心機により明澄化した。得られた各可溶性画分を合わせて一つにし、タンパク質濃度を試験し、200μlの画分にアリコートし、-80℃で保存した。この様式で調製した抽出物のタンパク質濃度は、典型的には、15mg/ml〜25mg/mlの範囲であった。 a. Preparation of cell extract
For M. mycoides LC, 1 liter of cell culture in SP4 medium was grown at 37 ° C. until a pH of 6.2-6.3 was reached. The culture was harvested by dividing the cells into 5 × 200 ml fractions and centrifuging at 5,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. in an SLA-1500 Sorvall rotor. The M. mycoides LC pellets were then washed with 200 mL of 8 mM Hepes (pH 7.4) and 272 mM sucrose, respectively, and centrifuged at 5,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. in an SLA-1500 Sorvall rotor. Clarified. Each resulting pellet is resuspended in 1 ml extraction buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, and 10% glycerol), then Sonicated with a burst of 10-12 seconds, 5 times on ice using a microchip, with a power control of 3. Each solution was clarified by microcentrifuge at 18,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. Each soluble fraction obtained was combined and tested for protein concentration, aliquoted into 200 μl fractions and stored at −80 ° C. The protein concentration of extracts prepared in this manner typically ranged from 15 mg / ml to 25 mg / ml.

M.カプリコルムについては、1リットルの培養物を10μg/mlのテトラサイクリンを含有しているSP4培地中で増殖させたことを除き、抽出物を、M.ミコイデスLCについて記載した方法と同じ方法を使用して調製した。   For M. capricolum, the extract was used in the same way as described for M. mycoides LC, except that 1 liter culture was grown in SP4 medium containing 10 μg / ml tetracycline. Prepared.

b.粗抽出物によるメチル化の評価
メチル化アッセイを、以下のように、様々な宿主細胞の中で増殖させたマイコプラズマプラスミドDNAをメチル化する上記粗抽出物の能力を明らかにするために使用した。粗抽出物を使用するメチル化アッセイは、Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370（1990）に記載されている緩衝液条件を使用して行った。 b. Evaluation of methylation by crude extract The methylation assay was used to demonstrate the ability of the crude extract to methylate mycoplasma plasmid DNA grown in various host cells as follows: did. Methylation assays using crude extracts were performed using buffer conditions as described in Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370 (1990).

c.M.ミコイデスLC抽出物によるCCATC、GANTC、CCTTC、およびGCATCのメチル化の評価
M.ミコイデスLC抽出物によるCCATC、GANTC、CCTTC、およびGCATC部位のメチル化（およびそれによる保護）を評価するために、反応を、100μlの容量の中で37℃で行った。反応混合物には、100mMのTris-HCl（pH 7.5）、10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン（SAM）（示すように、対照試料中には存在しない）、大腸菌から単離した3μgのpMYC01プラスミドDNA（SEQ ID NO:149）、および20μgのM.ミコイデスLC抽出物を含めた。 Evaluation of CCATC, GANTC, CCTTC, and GCATC methylation by cM Mycoides LC extract
To assess the methylation (and thus protection) of CCATC, GANTC, CCTTC, and GCATC sites by M. mycoides LC extract, the reaction was performed at 37 ° C. in a volume of 100 μl. The reaction mixture included 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 3 μM DTT, 200 μM S-adenosylmethionine (SAM) (not present in the control sample, as indicated), single from E. coli. 3 μg of isolated pMYC01 plasmid DNA (SEQ ID NO: 149) and 20 μg of M. mycoides LC extract were included.

0時間、2時間、4時間、および16時間の時間間隔で、それぞれの反応混合物から20μlのアリコートを取り出し、2×停止緩衝液（2％のSDS、20mMのEDTA）に対して添加した。DNAの抽出を、それぞれのアリコートについて、40μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）を使用して行い、その後、室温で2分間、18,000×gで遠心分離した。それぞれの水相を新しいチューブに入れ、80μlの氷冷した100％のエタノールおよび1μlのAmbion（登録商標）GlycoBlue（商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加すること、そして-20℃で一晩インキュベーションすることにより、DNAを沈殿させた。その後、試料それぞれを、4℃で15分間、18,000×gで遠心分離し、得られたペレットをそれぞれ、100μlの氷冷した70％エタノールで洗浄した。4℃で5分間の18,000×gでの遠心分離後、上清をそれぞれ廃棄し、ペレットをそれぞれ乾燥させ、20μlのTE（pH 8.0）の中に再度懸濁した。   At time intervals of 0 hours, 2 hours, 4 hours, and 16 hours, 20 μl aliquots were removed from each reaction mixture and added to 2 × stop buffer (2% SDS, 20 mM EDTA). DNA extraction was performed on each aliquot using 40 μl phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1), followed by centrifugation at 18,000 × g for 2 minutes at room temperature. Place each aqueous phase in a new tube, add 80 μl ice-cold 100% ethanol and 1 μl Ambion® GlycoBlue ™ (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And overnight at −20 ° C. DNA was precipitated by incubation. Each sample was then centrifuged at 18,000 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the resulting pellets were each washed with 100 μl of ice-cold 70% ethanol. After centrifugation at 18,000 × g for 5 minutes at 4 ° C., each supernatant was discarded and each pellet was dried and resuspended in 20 μl TE (pH 8.0).

DNAがそれぞれのII型メチルトランスフェラーゼによってメチル化されたかどうかを評価するために、4μlの各試料を、評価する特定の配列に適しているNew England Biolabsから購入した制限酵素アイソシゾマーを、製造業者の説明書に従って使用して切断した（BccI（認識部位CCATC）、HinfI（GANTC）、HpyAV（CCTTC）、SfaNI（GCATC）。試料を、1％の48ウェルアガロースE-ゲル（Invitrogen）上で、70Vで25分間泳動させた。ゲルを、GE Typhoon 9410イメージャー上でスキャンした。   In order to assess whether the DNA was methylated by the respective type II methyltransferase, 4 μl of each sample was used with the restriction enzyme isoschizomer purchased from New England Biolabs appropriate for the particular sequence being assessed. (BccI (recognition site CCATC), HinfI (GANTC), HpyAV (CCTTC), SfaNI (GCATC). Samples were run on a 1% 48-well agarose E-gel (Invitrogen) at 70V. Run for 25 minutes The gel was scanned on a GE Typhoon 9410 imager.

d.M.ミコイデスLC抽出物によるGATC部位のメチル化の評価
M.ミコイデスLC抽出物によるGATCのメチル化を試験した場合には、上記プロトコールを、最初の工程において、M.カプリコルムから単離した3μgのpMYC01プラスミドDNAを使用すること、およびMboI制限酵素アイソシゾマーを用いて切断したことにより改変した。 Evaluation of methylation of GATC site by dM Mycoides LC extract
When testing the methylation of GATC by M. mycoides LC extract, the above protocol should be used in the first step using 3 μg of pMYC01 plasmid DNA isolated from M. capricolum, and MboI restriction enzyme isoschizomer. And modified by cutting.

e.M.カプリコルムLC抽出物によるCCATC部位のメチル化の評価
M.カプリコルム抽出物によるCCATC部位のメチル化を、それぞれ3μgの、大腸菌から単離したpSmart-pMYC01プラスミドDNA（酵母-大腸菌-マイコプラズマトリ-シャトルベクター）、ならびに、M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLCから単離したpMYC01を使用したこと、そして反応を、S-アデノシルメチオニンの存在下または非存在下で4時間行ったことを除き、上記のように試験した。その後、メチル化されたDNAを、上記のようにBccIとともにインキュベートすることによりチェックした。 Evaluation of CCATC site methylation by eM capricolum LC extract
Methylation of CCATC sites by M. capricolum extract from 3 μg each of pSmart-pMYC01 plasmid DNA (yeast-E. Coli-mycoplasma tri-shuttle vector) isolated from E. coli, and M. capricolum and M. mycoides LC The isolated pMYC01 was used and the reaction was tested as described above except that it was performed for 4 hours in the presence or absence of S-adenosylmethionine. The methylated DNA was then checked by incubating with BccI as described above.

f.結果
M.カプリコルム粗抽出物は、対応する制限酵素アイソシゾマーBccIが、粗抽出物およびSAMとともにインキュベーションしたプラスミドを切断できなかったという事実により実証されたように（ゲルのデータは示さず）、大腸菌から単離した2種類のプラスミドを完全にメチル化することができた。 f.Result
The crude M. capricolum extract was isolated from E. coli as demonstrated by the fact that the corresponding restriction enzyme isoschizomer BccI was unable to cleave the plasmid incubated with the crude extract and SAM (gel data not shown). The two isolated plasmids could be completely methylated.

M.ミコイデスLC抽出物によるCCATC、GANTC、CCTTC、GCATC、およびGATC部位のメチル化（およびそれによる保護）についてアッセイした研究の結果は以下のとおりである。M.ミコイデスLC抽出物は、4つの制限修飾システムの場合には、マイコプラズマプラスミドDNAを完全にメチル化することができ、一つのシステム（GATC制限修飾システム）の場合には、マイコプラズマプラスミドDNAの一部だけをメチル化することができた（ゲルの結果は示さず）。内因性のM.ミコイデスLC GATCメチルトランスフェラーゼが、M.ミコイデスLC抽出物中で低い活性を示したため、市販されている大腸菌damメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を、その活性をうまく補うために使用した。   The results of a study assayed for methylation (and thus protection) of CCATC, GANTC, CCTTC, GCATC, and GATC sites by M. mycoides LC extract are as follows. M. mycoides LC extract can fully methylate mycoplasma plasmid DNA in the case of four restriction modification systems, and one mycoplasma plasmid DNA in the case of one system (GATC restriction modification system). Only the part could be methylated (gel results not shown). Endogenous M. mycoides LC GATC methyltransferase showed low activity in M. mycoides LC extract, so that the commercially available Escherichia coli dam methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA) successfully compensates for its activity Used for.

いずれの粗抽出物によるマイコプラズマプラスミドDNAのメチル化も、M.カプリコルム（データは示さず）における形質転換効率を劇的に増大させ、このことは、本提供の方法における粗抽出物とのインキュベーションが、M.カプリコルムレシピエントに移植する、酵母細胞の中で増殖させたドナーゲノムの不和合成の可能性の克服に役立ち得ることを示していた。III型メチルトランスフェラーゼの効果は、その部位特異性が明らかではないとの理由から、M.ミコイデスLC粗抽出物中では評価しなかった。   Methylation of mycoplasma plasmid DNA by any crude extract dramatically increased the transformation efficiency in M. capricolum (data not shown), indicating that incubation with the crude extract in the provided method It has been shown to be able to help overcome the potential for discordant synthesis of donor genomes grown in yeast cells, transplanted into M. capricolum recipients. The effect of type III methyltransferase was not evaluated in the M. mycoides LC crude extract because its site specificity was not clear.

iii.メチル化による形質転換効率の増大
メチル化されていないプラスミド、および上記のようにM.ミコイデスLC抽出物でメチル化したプラスミドで、M.カプリコルム細胞を形質転換し、比較した。結果は、メチル化されたプラスミドの形質転換効率の増大を示し、形質転換の前のDNA修飾のポジティブな効果を示していた。 iii. Increased transformation efficiency by methylation M. capricolum cells were transformed and compared with unmethylated plasmids and plasmids methylated with M. mycoides LC extract as described above. The results showed an increase in the transformation efficiency of the methylated plasmid, indicating the positive effect of DNA modification prior to transformation.

iv.メチル化後のDNAのさらなる分析、立体構造効果、および処理
粗抽出物は、宿主の制限修飾システムからドナープラスミドDNAを保護し、形質転換効率を増大させたが、粗抽出物はまた、アガロースプラグ中で単離した天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNAおよびM.カプリコルム細胞を含むゲノムの移植実験を完全に阻害した（以下の実施例3を参照のこと）。 iv. Further analysis, conformational effects, and processing of DNA after methylation The crude extract protected donor plasmid DNA from the host restriction modification system and increased transformation efficiency, but the crude extract also Genomic transplantation of native M. mycoides LC genomic DNA and M. capricolum cells isolated in agarose plugs was completely inhibited (see Example 3 below).

さらに詳細に阻害を研究するために、M.カプリコルムまたはM.ミコイデスLC マイコプラズマ粗抽出物（上記実施例2E（ii）（a）のように調製した）の存在下または非存在下で、アガロースプラグ（上記実施例2B（ii）に記載したように調製した）中で単離した内因性のM.ミコイデスLCのゲノムDNAを、蛍光顕微鏡によって分析した。M.ミコイデスLCのゲノムDNAのアガロースプラグを、上記（実施例2C（ii））のようにβ-アガラーゼIで融解させた。その後、2μlの希釈した（1/2000）SYBR（登録商標）Gold核酸ゲル染色（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、5μlの融解させたアガロースに対して穏やかに混合し、室温で5分間置いた。この混合物をガラススライドに1滴落とし、カバースリップで覆った。   To study inhibition in more detail, agarose plugs in the presence or absence of M. capricolum or M. mycoides LC mycoplasma crude extract (prepared as in Example 2E (ii) (a) above) The endogenous M. mycoides LC genomic DNA isolated in (prepared as described in Example 2B (ii) above) was analyzed by fluorescence microscopy. The agarose plug of the genomic DNA of M. mycoides LC was thawed with β-agarase I as described above (Example 2C (ii)). Subsequently, 2 μl of diluted (1/2000) SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Was gently mixed against 5 μl of melted agarose and placed at room temperature for 5 minutes. One drop of this mixture was dropped on a glass slide and covered with a coverslip.

その後、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを、AxioCam（登録商標）MRc5カラーカメラ（Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY）を備えた直立型Axioskop（登録商標）2顕微鏡（Carl Zeiss, Inc）（対物レンズ（100×）;ローダミンフィルターを持つ）を使用して視覚化した。蛍光顕微鏡画像を撮影し、Carl Zeiss, Inc.によるAxioVision release 4.7.1ソフトウェアで分析した。図7Aは、アガロースプラグの最初の処理、および未処理のアガロースプラグの結果を説明する。メチル化工程および除タンパク質工程の結果を、それぞれ、図7B〜7Cに示す。ここでは、試料および処理を写真の上に示す。   The genomic DNA of M. mycoides LC was then transferred to an upright Axioskop® 2 microscope (Carl Zeiss, Inc) equipped with an AxioCam® MRc5 color camera (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY) (objective lens) (100 ×); with rhodamine filter). Fluorescence microscope images were taken and analyzed with AxioVision release 4.7.1 software by Carl Zeiss, Inc. FIG. 7A illustrates the initial treatment of the agarose plug and the result of the untreated agarose plug. The results of the methylation step and the deproteinization step are shown in FIGS. Here, the sample and processing are shown on the photograph.

図7Bに示すように、粗抽出物の非存在下で処理した天然のゲノムDNA（レシピエント細胞への移植が可能であることが示された）は、点状のパターンを示した（右側のパネル）が、粗抽出物の存在下で処理した内因性ゲノムDNA（移植を阻害することが示された）は、大きな凝集を形成した（左側の2つのパネル）。この結果は、DNAの立体構造が移植実験に重要であることを示唆した。   As shown in FIG. 7B, native genomic DNA treated in the absence of the crude extract (shown to be capable of transplantation into recipient cells) showed a punctate pattern (on the right side). Panel), but endogenous genomic DNA treated in the presence of the crude extract (shown to inhibit grafting) formed large aggregates (two panels on the left). This result suggested that the three-dimensional structure of DNA is important for transplantation experiments.

立体構造が重要であることを確認するために、試料を、処理後の細胞抽出物を除去するために、以下のようにプロテイナーゼKで処理した。酵母プラグそれぞれを、40μlのプロテイナーゼKを補充した1mLのプロテイナーゼK反応緩衝液［100mMのEDTA;0.2％のデオキシコール酸ナトリウム;1％のラウリルサルコシンナトリウム;pH8.0]中で、50℃で4時間インキュベーションした。その後、プラグを4回、それぞれ45分間、1mlの1×TE緩衝液（2OmMのTris-HCl（pH 8）;50mMのEDTA）で、そして2回、それぞれ30分間、0.1×TE緩衝液中で、室温で優しく撹拌しながら洗浄した。最後の洗浄緩衝液を除去した後、プラグをβ-アガラーゼIで融解させ、上記のように蛍光顕微鏡によって分析した。結果を図7Cに示す。これは、アガロースプラグ中でのゲノムDNAとのインキュベーション後のプロテイナーゼKでの処理による粗抽出物の除去によって、未処理のゲノムDNAを用いた場合に最初に観察された点状のパターンが回復したことを示す。さらに、以下に記載する（実施例3）ように、プロテイナーゼK処理により、粗抽出物で処理した天然のゲノムDNAの移植効率がある程度回復した。したがって、粗細胞抽出物中のタンパク質の除去（例えば、プロテイナーゼKでの処理による）は、酵母宿主細胞から単離したM.ミコイデスLCドナーゲノムDNAを、粗抽出物を使用してメチル化することができ、なおもうまくレシピエント細胞に移植することができる手段を提供する。   In order to confirm that the conformation is important, the sample was treated with proteinase K as follows to remove the cell extract after treatment. Each yeast plug was placed in 1 mL proteinase K reaction buffer supplemented with 40 μl proteinase K [100 mM EDTA; 0.2% sodium deoxycholate; 1% sodium lauryl sarcosine; pH 8.0] at 50 ° C. Incubated for hours. Then plugs 4 times for 45 minutes each with 1 ml 1 × TE buffer (2OmM Tris-HCl pH 8; 50 mM EDTA) and twice for 30 minutes each in 0.1 × TE buffer. Wash with gentle stirring at room temperature. After removing the final wash buffer, the plugs were thawed with β-Agarase I and analyzed by fluorescence microscopy as described above. The results are shown in FIG. 7C. This is due to the removal of the crude extract by treatment with proteinase K after incubation with genomic DNA in an agarose plug, restoring the initially observed punctate pattern when using untreated genomic DNA. It shows that. Furthermore, as described below (Example 3), the proteinase K treatment restored to some extent the transplantation efficiency of natural genomic DNA treated with the crude extract. Therefore, removal of proteins in the crude cell extract (eg, by treatment with proteinase K) can be achieved by methylating M. mycoides LC donor genomic DNA isolated from yeast host cells using the crude extract. Provides a means that can be successfully transplanted into recipient cells.

実施例2F
R-Mシステムの突然変異（M.カプリコルムΔREの作製）
宿主細胞とレシピエント細胞との間での制限の障壁を克服するための手段として、別の方法を利用した。この方法では、M.カプリコルムにおいて同定した一つの制限酵素（上記実施例2D（i）および表3を参照のこと）を、この遺伝子のコード領域への割り込みにより不活化した。制限酵素遺伝子を、この遺伝子のコード領域へのピューロマイシン耐性マーカーの組込みにより割り込ませた。 Example 2F
Mutation of RM system (production of M. capricolum ΔRE)
Another method was utilized as a means to overcome the restriction barrier between host cells and recipient cells. In this method, one restriction enzyme identified in M. capricolum (see Example 2D (i) above and Table 3) was inactivated by interrupting the coding region of this gene. The restriction enzyme gene was interrupted by the incorporation of a puromycin resistance marker into the coding region of this gene.

異種pSD4スピロプラズマ・シトリoriCプラスミド（SEQ ID NO:150）により、M.カプリコルムが形質転換されることが示されている（Lartigue, C.et al.Nucleic Acids Res.31:6610-8（2003））。このプラスミドは、外来配列の組込み、およびM.カプリコルムゲノム中での標的化した突然変異誘発に有効である。M.カプリコルム中の可能性のある制限酵素遺伝子（MCAP0050）を不活化させるために、この遺伝子の内部断片を、オリゴヌクレオチドRE-Mcap-F

およびRE-Mcap-R

（XbaI部位を含む）を使用して、M.カプリコルムのゲノムDNAから増幅させた。その後、この断片をXbaIによって切断し、XbaIで切断したpSD4プラスミド（SEQ ID NO:150）にクローニングして、pSD4-ΔMcap0050.1（SEQ ID NO:159）を得た。10マイクログラムのこのプラスミドを、上記実施例2Cに記載した、5％のPEG媒介性のプロトコールを使用して野生型M.カプリコルム細胞を形質転換するために使用した。形質転換体を、4μg/mLテトラサイクリンを含有している固体のSP4プレート上で選択した。37℃での7日間のインキュベーション後、いくつかのコロニーを、10μg/mlのテトラサイクリンを含有している液体培地中に突いて採取し、細胞を15継代（15P）増殖させた。その後、クローンを、プラスミドの存在と、1回の交叉による相同組換えによる標的遺伝子でのその組込みの可能性を確認するためにサザンブロットにより分析した。 Heterogeneous pSD4 Spiroplasma citri oriC plasmid (SEQ ID NO: 150) has been shown to transform M. capricolum (Lartigue, C. et al. Nucleic Acids Res. 31: 6610-8 (2003) )). This plasmid is effective for integration of foreign sequences and targeted mutagenesis in the M. capricolum genome. In order to inactivate a possible restriction enzyme gene (MCAP0050) in M. capricolum, an internal fragment of this gene was added to the oligonucleotide RE-Mcap-F

And RE-Mcap-R

(Including the XbaI site) was used to amplify from M. capricolum genomic DNA. This fragment was then cut with XbaI and cloned into the pSD4 plasmid (SEQ ID NO: 150) cut with XbaI to give pSD4-ΔMcap0050.1 (SEQ ID NO: 159). Ten micrograms of this plasmid was used to transform wild-type M. capricolum cells using the 5% PEG-mediated protocol described in Example 2C above. Transformants were selected on solid SP4 plates containing 4 μg / mL tetracycline. After 7 days incubation at 37 ° C., several colonies were picked into liquid medium containing 10 μg / ml tetracycline and cells were grown for 15 passages (15P). The clones were then analyzed by Southern blot to confirm the presence of the plasmid and its possible integration with the target gene by homologous recombination with a single crossover.

一つのクローンM.カプリコルムΔREクローン10 15Pを、（サザンブロットによって明らかであるように）そのハイブリダイゼーションパターンがこのプラスミドによるMCAP0050遺伝子の割り込みを示したとの理由から、選択した。遊離のプラスミドは検出されなかった。遠心分離により明澄化した溶解物の抽出物もまた、2D（ii）（b）に記載したように調製し、実施例2D（ii）に記載した制限酵素アッセイにおいて使用した。結果は、野生型M.カプリコルムと比較して、クローン10 15Pクローンにおいては制限酵素活性が全く存在しないことを明らかに示していた（データは示さず）。   One clone, M. capricolum ΔRE clone 10 15P, was selected because its hybridization pattern indicated interruption of the MCAP0050 gene by this plasmid (as evidenced by Southern blot). No free plasmid was detected. Clarified lysate extracts were also prepared as described in 2D (ii) (b) and used in the restriction enzyme assay described in Example 2D (ii). The results clearly showed that there was no restriction enzyme activity in clone 10 15P clone compared to wild type M. capricolum (data not shown).

上記実施例2E（ii）に記載した方法を使用して、M.カプリコルムΔREクローン10を、インビトロでのメチル化実験のための粗M.カプリコルム細胞抽出物を作製するための供給源として使用した。しかし、M.カプリコルムΔREクローン10は、M.ミコイデスLCの移植についてのレシピエント細胞の優れた候補ではなかった。なぜならこれは、酵母中に存在するM.ミコイデスLCドナーゲノムDNAと同じ耐性マーカー遺伝子（tetM）を含むからである。したがって、上記クローニングストラテジーを使用して、YCpと、tetM遺伝子の代わりのピューロマイシン耐性遺伝子を持つ別のM.カプリコルムΔRE突然変異体を構築した。遠心分離により明澄化した溶解物の抽出物を、2D（ii）（b）に記載したように、M.カプリコルムΔREクローン17.5 15Pから調製し、実施例2D（ii）に記載した制限酵素アッセイにおいて使用した。結果は、野生型M.カプリコルムと比較して、クローン17.5 15Pクローンにおける制限酵素活性が全く存在しないことを明らかに示していた。したがって、このクローンを移植のために選択した。   Using the method described above in Example 2E (ii), M. capricolum ΔRE clone 10 was used as a source for making crude M. capricolum cell extracts for in vitro methylation experiments. . However, M. capricolum ΔRE clone 10 was not an excellent candidate for recipient cells for M. mycoides LC transplantation. This is because it contains the same resistance marker gene (tetM) as the M. mycoides LC donor genomic DNA present in yeast. Therefore, the above cloning strategy was used to construct YCp and another M. capricolum ΔRE mutant with a puromycin resistance gene instead of the tetM gene. The lysate extract clarified by centrifugation was prepared from M. capricolum ΔRE clone 17.5 15P as described in 2D (ii) (b) and the restriction enzyme assay described in Example 2D (ii) Used in. The results clearly showed that there was no restriction enzyme activity in clone 17.5 15P clone compared to wild type M. capricolum. This clone was therefore selected for transplantation.

これらの結果は、レシピエント細胞からのM.カプリコルム制限酵素活性の除去により、酵母から単離したドナーであるM.ミコイデスLCのゲノムDNAが、M.カプリコルムの細胞質の中で生き延びることが可能となることを示す。あるいは、上記のように、提供するメチル化方法を、ドナーDNAを保護するために、移植の前のドナーDNAの処理に使用することができる。   These results indicate that removal of M. capricolum restriction enzyme activity from recipient cells allows the genomic DNA of M. mycoides LC, a donor isolated from yeast, to survive in the cytoplasm of M. capricolum. It shows that it becomes. Alternatively, as provided above, the provided methylation method can be used to treat donor DNA prior to transplantation to protect the donor DNA.

実施例3
酵母宿主細胞由来のM.ミコイデスLC-YCpゲノムDNAのM.カプリコルムへの移植
上記実施例1は、酵母宿主細胞の中での完全な細菌ゲノムのクローニングの成功（これらのマイコプラズマを含む）を記載している。本実施例は、全マイコプラズマドナーゲノム（M.ミコイデスLC（Genbankアクセッション番号:NZ_AAZK00000000;GI:149364883））DNA（酵母宿主細胞の中で増殖させた）の、様々な種のマイコプラズマレシピエント細胞（M.カプリコルム）への移植の成功を記載する。ドナーおよびレシピエントは、それらの迅速な増殖に基づいて選択した。しかし、この方法はまた、他のマイコプラズマドナーおよびレシピエント（例えば、上記のM.ゲニタリウムゲノム/細胞）を使用して行うこともできた。さらに、本実施例に記載する方法は、インビボでドナーゲノムを改変するための工程と組み合わせて、移入の前に、依然宿主細胞の中で使用することができる（例えば、細菌のドナーゲノムの増殖の間に酵母ツールのレパートリーを使用する）。したがって、上記方法は、ドナーゲノム（例えば、比較的あまり開発されていない遺伝子システムを持つ細菌由来のゲノム）を遺伝学的に変更するために使用することができる。 Example 3
Transplantation of M. mycoides LC-YCp genomic DNA from yeast host cells into M. capricolum Example 1 above describes the successful cloning of the complete bacterial genome in yeast host cells, including these mycoplasmas doing. This example shows the mycoplasma recipient cells of various species of the entire mycoplasma donor genome (M. mycoides LC (Genbank accession number: NZ_AAZK00000000; GI: 149364883)) DNA (grown in yeast host cells). Describe the success of transplantation to M. capricolum. Donors and recipients were selected based on their rapid growth. However, this method could also be performed using other mycoplasma donors and recipients (eg, the M. genitalium genome / cell described above). Furthermore, the methods described in this example can be used in host cells prior to transfer in combination with a step for modifying the donor genome in vivo (eg, propagation of bacterial donor genomes). Use a repertoire of yeast tools between). Thus, the above method can be used to genetically alter a donor genome (eg, a genome from a bacterium with a relatively poorly developed genetic system).

例えば、上記方法は、合成により変更したゲノムを含む合成の細胞を作製するために使用することができる。マイコプラズマ・ゲニタリウムの非病原性株の完全な合成のゲノムが合成されている（Gibson et al., Science 319:1215-20（2008）;Gibson et al., PNAS USA 105:20404-9（2008））。その研究においては、上記ゲノムが、最後の工程において、酵母の中でセントロメアプラスミドとしてアセンブリされた。   For example, the above methods can be used to create synthetic cells containing genomes that have been altered by synthesis. The complete synthetic genome of a non-pathogenic strain of Mycoplasma genitalium has been synthesized (Gibson et al., Science 319: 1215-20 (2008); Gibson et al., PNAS USA 105: 20404-9 (2008) ). In that study, the genome was assembled as a centromere plasmid in yeast in the last step.

このような合成により産生されたゲノムと、宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）の中で増殖させた天然のゲノム（例えば、マイコプラズマまたは他の細菌のゲノム）を、本提供の方法（例えば、本実施例に記載する方法）を使用して、合成の細胞を作製するためにレシピエントの細胞質に移植することができる。例えば、細菌の合成のドナーゲノム（酵母の中で増殖させた）を細菌のレシピエントの中で発現させるために、上記方法を、細菌（例えば、マイコプラズマ）レシピエントに酵母由来の細菌の合成のドナーゲノムを移植するために使用することができる。   A genome produced by such synthesis and a native genome (eg, a mycoplasma or other bacterial genome) grown in a host cell (eg, a yeast host cell) are used to produce a method (eg, Can be transplanted into the recipient's cytoplasm to produce synthetic cells. For example, in order to express a bacterial synthetic donor genome (grown in yeast) in a bacterial recipient, the above method can be applied to a bacterial (eg, mycoplasma) recipient in the synthesis of a yeast-derived bacteria. Can be used to transplant donor genomes.

上記実施例2に記載したように、様々な制限修飾システムが、宿主細胞（その中でドナーゲノムを増殖させる）から様々な種のレシピエント細胞にドナーゲノムを移植する際に不和合性の問題を示す可能性がある。特に、M.ミコイデスLCゲノムの酵母宿主細胞への導入およびその中での増殖（上記実施例1を参照のこと）の際には、これらのマイコプラズマにより内生的に発現されるメチルトランスフェラーゼ（上記実施例2Bを参照のこと）が酵母宿主細胞中で発現される可能性はあまりないことを決定した。この決定は、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が、真核生物酵母宿主細胞によっては停止コドンとして処理されるUGAトリプトファンコドンを含むという事実に基づいた。この決定は、酵母から単離したM.ミコイデスLCドナーゲノムDNAがメチル化されず、その細胞に移入されると、M.カプリコルムレシピエント細胞の制限修飾システムの影響を受けることを示した。一つまたは複数のM.ミコイデスLC制限酵素が、移植後に発現されると、ドナーゲノムを切断できる可能性もあった。R-M不和合性の問題を克服するための本提供の方法の様々な局面を、上記実施例2に記載した。このような局面を、酵母の中で増殖させたドナーであるマイコプラズマゲノムの、様々な種のマイコプラズマレシピエント細胞への移植の成功を得るために、以下の研究において選択し、使用した。   As described in Example 2 above, various restriction modification systems have incompatibility issues when transplanting a donor genome from a host cell (in which the donor genome is propagated) to various types of recipient cells. May indicate. In particular, during the introduction of the M. mycoides LC genome into yeast host cells and propagation therein (see Example 1 above), methyltransferases (above described) that are endogenously expressed by these mycoplasmas. It was determined that (see Example 2B) is less likely to be expressed in yeast host cells. This determination was based on the fact that the methyltransferase gene contains a UGA tryptophan codon that is processed as a stop codon by eukaryotic yeast host cells. This determination showed that the M. mycoides LC donor genomic DNA isolated from yeast was not methylated and transferred to the cell, affected by the restriction modification system of M. capricolum recipient cells. One or more M. mycoides LC restriction enzymes could also cleave the donor genome if expressed after transplantation. Various aspects of the provided method to overcome the R-M incompatibility problem are described in Example 2 above. Such an aspect was selected and used in the following studies in order to obtain successful transplantation of donor mycoplasma genome grown in yeast into various species of mycoplasma recipient cells.

実施例3A
移植方法
本実施例は、ドナーであるマイコプラズマゲノムを酵母宿主細胞からマイコプラズマレシピエント細胞にうまく移植するためのこれらの技術の使用を記載する。図8は、全ゲノムDNAを移植するために使用することができる3種類の代替えの移植アプローチを示す。これらの3種類のアプローチのバリエーションを、以下に記載する実施例において使用した。第1のアプローチ（図8において番号「1」で示す矢印で示す）は、ゲノムDNAを含有しているアガロースプラグの消化（例えば、β-アガラーゼでの消化（融解工程））、これに続くレシピエント細胞への直接の移植を含む。この方法は、典型的には、一つの細胞（例えば、ドナーであるマイコプラズマ細胞）から類似する細胞への（例えば、マイコプラズマドナー細胞からマイコプラズマレシピエント細胞への）ドナーゲノムまたは核酸の移植のために、図8に示すように使用する。 Example 3A
This Example Describes the use of these techniques to successfully transfer a donor mycoplasma genome from a yeast host cell to a mycoplasma recipient cell. FIG. 8 shows three alternative transplant approaches that can be used to transplant whole genomic DNA. Variations of these three approaches were used in the examples described below. The first approach (indicated by the arrow labeled “1” in FIG. 8) involves digestion of agarose plugs containing genomic DNA (eg, digestion with β-agarase (melting step)), followed by recipe Includes direct transplantation into ent cells. This method is typically for the transfer of donor genome or nucleic acid from one cell (eg, a donor mycoplasma cell) to a similar cell (eg, from a mycoplasma donor cell to a mycoplasma recipient cell). Used as shown in FIG.

第2のアプローチ（番号「2」で示す）は、レシピエント細胞を、制限酵素遺伝子を突然変異させるように改変した（ΔRE;上記実施例2Fに記載したように作製した）ことを除き、第1の方法と同じである。このアプローチを用いて、図8に示すように、酵母宿主細胞中で増殖させ、酵母プラグの中で単離したマイコプラズマゲノムDNAを、マイコプラズマレシピエント細胞にうまく移植することができる。第3のアプローチ（図8に番号「3」で示す）を用いる場合は、試料を、融解工程（β-アガラーゼでの消化）およびレシピエント細胞への移植の前に、メチル化し、除タンパク質工程（プロテイナーゼKでの処理）を行った。図に示すように、メチル化工程と除タンパク質工程もまた、酵母の中での増殖後に単離したドナーであるマイコプラズマゲノムの、マイコプラズマレシピエント細胞への効率的な移植を容易にする。以下に記載するように、対照研究には、第3のアプローチと同様の条件を含めた。ここでは、試料を、メチラーゼの存在を伴わずに同じ条件下で、並行して処理した（「疑似メチル化」）。これらのアプローチと、それぞれにより得られた結果を以下に詳細に記載する。   The second approach (indicated by the number “2”) is the same except that the recipient cells were modified to mutate the restriction enzyme gene (ΔRE; generated as described in Example 2F above). Same as method 1. Using this approach, as shown in FIG. 8, mycoplasma genomic DNA grown in yeast host cells and isolated in yeast plugs can be successfully transplanted into mycoplasma recipient cells. When using the third approach (indicated by the number “3” in FIG. 8), the sample is methylated and deproteinized prior to the thawing step (digestion with β-agarase) and transplantation into recipient cells. (Treatment with proteinase K) was performed. As shown in the figure, the methylation and deproteinization steps also facilitate the efficient transplantation of donor mycoplasma genome, isolated after growth in yeast, into mycoplasma recipient cells. As described below, the control study included conditions similar to the third approach. Here, the samples were processed in parallel under the same conditions without the presence of methylase (“pseudomethylation”). These approaches and the results obtained by each are described in detail below.

i.アガロースプラグの調製
個々のアプローチにおいて、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを、以下のように、酵母株VL6-48N（Larionov et al, PNAS USA 94:7384-7（1997）に記載されている）から、アガロースプラグの中で単離した。 i. Preparation of agarose plugs In individual approaches, genomic DNA of M. mycoides LC is described in yeast strain VL6-48N (Larionov et al, PNAS USA 94: 7384-7 (1997) as follows: ) From agarose plugs.

M.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有している酵母細胞（実施例1Aに記載するように作製した）を、ODがおよそ1.5に達するまで、選択培地の中で30℃で増殖させた。ドナーゲノムを含まない対照細胞を同じ条件下で増殖させた。アガロースプラグをそれぞれのタイプの細胞から、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit（Bio-Rad Laboratories, Valencia, CA）を使用し、以下の改変を加えて酵母（真核生物）のDNA抽出について製造業者が推奨する説明書に従って調製した。一つのプラグあたりで利用できるM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量を増やすために、一つのプラグあたり6×1O⁹個の酵母細胞を使用して（キットにより推奨される6×1O⁸個の細胞の代わりに）、一つのプラグあたり6×lO⁸個の細胞を得た。プラグへの細胞の包埋の後、細胞壁を消化するために、Zymolyase（商標）1OOT酵素（USB Corporation, Cleveland, OH）を、リチカーゼ（Bio-Rad Laboratories, Valencia, CA）の代わりに使用した。この酵素を、5mg/mlの濃度でプラグの内部および外側に添加し、37℃で2時間そのまま置いた。 Yeast cells containing M. mycoides LC genomic DNA (made as described in Example 1A) were grown at 30 ° C. in selective medium until the OD reached approximately 1.5. Control cells without donor genome were grown under the same conditions. Manufacturers recommended agarose plug extraction from each type of cell using the CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad Laboratories, Valencia, CA) with the following modifications: Prepared according to the instructions. Use 6 x 1O ⁹ yeast cells per plug to increase the amount of M. mycoides LC genomic DNA available per plug (6 x 1O ⁸ cells recommended by the kit Instead of ⁸ ) ⁸ x 6 cells per plug were obtained. After cell embedding in plugs, Zymolyase ™ 1OOT enzyme (USB Corporation, Cleveland, OH) was used in place of lyticase (Bio-Rad Laboratories, Valencia, Calif.) To digest the cell wall. The enzyme was added to the inside and outside of the plug at a concentration of 5 mg / ml and left at 37 ° C. for 2 hours.

1×TE緩衝液（2OmMのTris-HCl（pH 8）;5OmMのEDTA）中での洗浄後、包埋した酵母細胞を溶解させ、プラグ1mLあたり200μlのプロテイナーゼKを補充した5mlのプロテイナーゼK反緩衝液［100mMのEDTA;0.2％のデオキシコール酸ナトリウム;1％のラウリルサルコシンナトリウム;pH8.0]とともに、50℃で24時間の2回のインキュベーションによりタンパク質を消化した。その後、アガロースプラグを室温で4回、それぞれ1時間、40mLの1×TE緩衝液で撹拌しながら洗浄し、同じ緩衝液中で4℃で保存した。続いて制限酵素（下記を参照のこと）で消化しようとする酵母のプラグについて、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオライド（PMSF）を、2回目の洗浄の際に添加した。   After washing in 1x TE buffer (2OmM Tris-HCl (pH 8); 5OmM EDTA), the embedded yeast cells were lysed and 5ml proteinase K reaction supplemented with 200µl proteinase K per mL plug. The protein was digested by two incubations at 50 ° C. for 24 hours with buffer [100 mM EDTA; 0.2% sodium deoxycholate; 1% sodium lauryl sarcosine; pH 8.0]. The agarose plugs were then washed 4 times at room temperature for 1 hour each with agitation with 40 mL of 1 × TE buffer and stored at 4 ° C. in the same buffer. Subsequently, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) was added during the second wash for yeast plugs to be digested with restriction enzymes (see below).

浄化
これらの研究の以前には、酵母から抽出したM.ミコイデスLCドナーゲノムDNAとともに単離した酵母のゲノムDNAが、移植反応に影響を及ぼすか、または移植反応を無効にするかどうかは明らかではなかった。したがって、それぞれのアプローチを用いて、2セットのドナーゲノムDNAを調製した。これらのうちの一方は、細胞壁の消化およびプロテイナーゼKでの処理後の随意の「浄化」工程に従った。この「浄化」工程は、試料から酵母のゲノムDNAを除去するように設計した。 Purification Prior to these studies, it is unclear whether yeast genomic DNA isolated with M. mycoides LC donor genomic DNA extracted from yeast affects or negates the transplantation reaction. There wasn't. Therefore, two sets of donor genomic DNA were prepared using each approach. One of these followed an optional “clean-up” step after cell wall digestion and treatment with proteinase K. This “cleanup” process was designed to remove yeast genomic DNA from the sample.

「浄化」試料は、酵母のゲノムDNAを特異的に消化する制限酵素のカクテルで処理し、その後、電気泳動により小さい酵母DNA断片を浄化したか、または、環状のゲノムがウェルに受け止められ、直鎖状の酵母染色体をウェルから電気泳動により外に出して、環状のゲノムを分離するために直接パルスフィールドアガロースゲル上に充填したかのいずれかにより処理した（Lartigue et al, Science 317, 632（2007））。   The “purified” sample was treated with a cocktail of restriction enzymes that specifically digest yeast genomic DNA and then purified by electrophoresis for smaller yeast DNA fragments, or circular genomes were received in the wells and directly Stranded yeast chromosomes were either electrophoresed out of the well and treated either by loading directly onto a pulsed field agarose gel to separate circular genomes (Lartigue et al, Science 317, 632 ( 2007)).

酵素のカクテルでの浄化のために、酵母のプラグを、2回、1mlの0.1×TE緩衝液（2mMのTris-HCl（pH 8.0）-5mMのEDTA）中でそれぞれ1時間洗浄し、BSAを補充した1mlの1×NEB緩衝液2（New England Biolabs, Ipswich, MA）の中で1時間平衡化させた。プラグ中に存在するゲノムDNAを、500μlの反応容量の中で、50ユニットの制限酵素カクテル（AsiSI、RsrII、およびFseI）で一晩消化した。酵母のプラグを、1mLの1×TE緩衝液（2OmMのTris-HCl（pH 8.0）-5OmMのEDTA）で1時間、室温で洗浄し、1％のTAEアガロースゲル上に充填した（120分、120ボルト）。アガロースプラグをウェルから取り出し、4℃で保存した。   For purification with an enzyme cocktail, the yeast plugs were washed twice in 1 ml of 0.1 × TE buffer (2 mM Tris-HCl (pH 8.0) -5 mM EDTA) for 1 hour each and BSA Equilibrated for 1 hour in supplemented 1 ml of 1 × NEB buffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Genomic DNA present in the plug was digested overnight with 50 units of restriction enzyme cocktail (AsiSI, RsrII, and FseI) in a reaction volume of 500 μl. The yeast plug was washed with 1 mL of 1 × TE buffer (2OmM Tris-HCl (pH 8.0) -5 OmM EDTA) for 1 hour at room temperature and loaded onto a 1% TAE agarose gel (120 minutes, 120 volts). The agarose plug was removed from the well and stored at 4 ° C.

電気泳動だけによる浄化のために、他の酵母のプラグについて、外形クランプ均一電界電気泳動（6）（CHEF DR III;Bio-Rad）を用いて、TAE 1×中の1％のLMP中で電気泳動を行った。パルス時間を、3.5V/cmで、24時間かけて60秒から120秒までの傾斜をつけた。電気泳動後、プラグをウェルから取り出し、1×TE緩衝液中で4℃で保存した。   For purification by electrophoresis alone, other yeast plugs were electrophoresed in 1% LMP in TAE 1 × using externally clamped uniform field electrophoresis (6) (CHEF DR III; Bio-Rad). Electrophoresis was performed. The pulse time was 3.5 V / cm, with a slope from 60 to 120 seconds over 24 hours. After electrophoresis, the plugs were removed from the wells and stored at 4 ° C. in 1 × TE buffer.

ii.一般的な移植方法
それぞれのアプローチを用いて、第3のアプローチを用いた場合には、以下の実施例3A（iii）に記載したように、β-アガラーゼでの融解の前に試料をメチル化し、プロテイナーゼKでの処理を行ったことを除き、移植を以下のように進めた。 ii. General Transplantation Methods Using each approach, if the third approach was used, the sample was thawed prior to thawing with β-agarase as described in Example 3A (iii) below. Except for methylation and treatment with proteinase K, transplantation proceeded as follows.

a.レシピエント細胞
12mLのM.カプリコルムレシピエント細胞（野生型またはΔRE（実施例2Fに記載したように産生した））を、ウシ胎児血清（17％）、グルコース（10g/1）、2mLのフェノールレッド（1％）、および100μlのペニシリンG（5mg/ml））を補充したSOB（+）培地（Bacto SOB培地（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）中で、培養物のpHがpH 5.7〜5.85（およそ5×10⁷個の細胞/ml）に達するまで増殖させた。レシピエント細胞を、10℃で15分間、4575×gで遠心分離し、6mLのS/T緩衝液（Tris-HCl 1OmM（pH 6.5）;NaCl 25OmM）中で1回洗浄し、400μlのCaCl₂（0.1M）中に再度懸濁し、氷上で30分間インキュベーションした。 a. Recipient cells
12 mL of M. capricolum recipient cells (wild type or ΔRE (produced as described in Example 2F)), fetal bovine serum (17%), glucose (10 g / 1), 2 mL phenol red (1 %), And in SOB (+) medium (Bacto SOB medium (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)) supplemented with 100 μl penicillin G (5 mg / ml), the pH of the culture was between pH 5.7 and 5.85 (approximately 5 X 10 ⁷ cells / ml) Recipient cells were centrifuged at 4575 × g for 15 minutes at 10 ° C. and 6 mL S / T buffer (Tris-HCl 1OmM, pH 6.5). ); NaCl 25 OmM), resuspended in 400 μl CaCl ₂ (0.1 M) and incubated on ice for 30 min.

b.アガロースプラグ中での単離したドナーゲノムDNAの調製
移植の前に、酵母由来のM.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有している上記実施例3A（i）（a）に記載したように調製したアガロースプラグを、2回、0.1×TE緩衝液［Tris-HCl 2mM（pH 8.0）、EDTA 5mM]中でそれぞれ30分間、室温で穏やかに撹拌しながら洗浄した。この緩衝液を完全に除去し、アガロースプラグを、1/10容量の1O×β-アガラーゼ緩衝液［10mMのBis Tris-HCl（pH 6.5）;1mMのNa₂EDTA]で、65℃で10分間融解させた。融解させたアガロースを、10分かけて42℃に冷却し、この温度で一晩、プラグ100μlあたり3ユニットのβ-アガラーゼI（New England Biolabs, Ipswich, MA）とともにインキュベーションした。以下の実施例3A（i）（c）に記載するように、メチル化とプロテイナーゼKでの処理を、第3のアプローチでのβ-アガラーゼでの処理の前に行った（図8（「3」））。 b. Preparation of isolated donor genomic DNA in an agarose plug Prior to transplantation, as described in Example 3A (i) (a) above, which contains genomic DNA of M. mycoides LC from yeast The prepared agarose plug was washed twice in 0.1 × TE buffer [Tris-HCl 2 mM (pH 8.0), EDTA 5 mM] for 30 minutes each at room temperature with gentle stirring. The buffer was completely removed and the agarose plug was removed with 1/10 volume of 10 × β-agarase buffer [10 mM Bis Tris-HCl (pH 6.5); 1 mM Na ₂ EDTA] at 65 ° C. for 10 minutes. Thawed. Thawed agarose was cooled to 42 ° C. over 10 minutes and incubated at this temperature overnight with 3 units of β-Agarase I (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) Per 100 μl of plug. As described in Example 3A (i) (c) below, methylation and treatment with proteinase K was performed prior to treatment with β-agarase in the third approach (FIG. 8 (“3 ")).

c.5％のPEGの存在下での移植
氷上で30分の後、400μlのレシピエント細胞を、上記実施例2B（ii）において作製した100μlの融解させたドナーゲノムDNAのアガロースプラグを含有している800μlのSP4（-）培地［0％のウシ胎児血清、0.45％のNaCl]とともに穏やかに混合した。このプラグを、以下のように、次の工程の直前に添加した。 c. Transplantation in the presence of 5% PEG After 30 minutes on ice, 400 μl of recipient cells contain 100 μl of agarose plugs of thawed donor genomic DNA prepared in Example 2B (ii) above. Gently mixed with 800 μl of SP4 (−) medium [0% fetal calf serum, 0.45% NaCl]. This plug was added immediately before the next step as follows.

1300μlの2×融合緩衝液（20mMのTris-HCl（pH6.5）、250mMのNaCl、20mMのMgCl₂、Flukaによる10％のPEG-6000]を、SP4（-）、ゲノムDNA、および細胞の混合物に対して直ちに添加し、この混合物を、チューブを30分間穏やかに揺らすことによりホモジナイズした。37℃で50分の後、10mLの予め温めておいたSP4を添加し、細胞を穏やかに混合した。37℃でさらに3時間の後、細胞を、10℃で15分間、4575×gで遠心分離し、1.2mLのSP4中に再度懸濁し、4μg/mlのテトラサイクリンと150μg/mlのX-galを含有しているSP4プレート上に播種した（一つの試料につき2枚のプレート）。3〜4日後、個々のコロニーを突いて採取し、10μg/mlのテトラサイクリンを含有している培養液培地中で増殖させた。 1300 μl of 2 × fusion buffer (20 mM Tris-HCl (pH 6.5), 250 mM NaCl, 20 mM MgCl ₂ , 10% PEG-6000 by Fluka), SP4 (−), genomic DNA, and cellular Immediately added to the mixture and this mixture was homogenized by gently shaking the tube for 30 minutes After 50 minutes at 37 ° C., 10 mL of pre-warmed SP4 was added to gently mix the cells. After an additional 3 hours at 37 ° C., the cells are centrifuged at 4575 × g for 15 minutes at 10 ° C., resuspended in 1.2 mL SP4, 4 μg / ml tetracycline and 150 μg / ml X-gal. (2 plates per sample) 3-4 days later, individual colonies were picked and collected in culture medium containing 10 μg / ml tetracycline Was grown on.

iii.メチル化およびプロテイナーゼKでの消化（第3のアプローチの特徴）
第3のアプローチを用いた場合は（図8、「3」）、β-アガラーゼでの融解の前に、酵母のアガロースプラグ由来のM.ミコイデスLCのゲノムDNAをメチル化し、続いて、除タンパク質工程を行った。このプロセスのために、プラグを、2回、200mMのTris-HCl（pH 7.5）;50mMのEDTA中で30分間洗浄し、メチル化緩衝液（100mMのTris-HCl（pH 7.5）;10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン）中で2回、30分間、優しく撹拌しながら平衡化させた。平衡化後、酵母プラグをそれぞれ、4つの断片に切断し、100μlのメチル化反応（1×メチル化緩衝液とメチルトランスフェラーゼ）に添加し、37℃で16時間インキュベートした。100μlの反応について、5μlの野生型M.ミコイデスLC細胞抽出物または7.5μlのM.カプリコルムΔRE（クローン10 15P）細胞抽出物（およそ125μgのタンパク質）または2.5μlのそれぞれの精製したM.ミコイデスLC特異的メチルトランスフェラーゼ（M.GANTC、M.CCATC、M.GCATC、M.CCTTC、M.TypeIII）のいずれかを。細胞抽出物をそれぞれ、上記実施例2E（ii）に記載したように調製し、精製したメチルトランスフェラーゼを、上記実施例2E（i）に記載したように調製した。M.ミコイデスLC細胞抽出物または精製したメチルトランスフェラーゼを含有しているメチル化反応にもまた、5μlのdamメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を補充した。 iii. Methylation and digestion with proteinase K (characteristic of the third approach)
When the third approach was used (Figure 8, “3”), M. mycoides LC genomic DNA from yeast agarose plugs was methylated prior to thawing with β-agarase followed by deproteinization The process was performed. For this process, the plugs were washed twice in 200 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM EDTA for 30 minutes and methylated buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7.5); 10 mM EDTA). , 3 μM DTT, 200 μM S-adenosylmethionine) and equilibrated twice for 30 minutes with gentle agitation. After equilibration, each yeast plug was cut into 4 fragments, added to 100 μl methylation reaction (1 × methylation buffer and methyltransferase), and incubated at 37 ° C. for 16 hours. For 100 μl reactions, 5 μl of wild-type M. mycoides LC cell extract or 7.5 μl M. capricolum ΔRE (clone 10 15P) cell extract (approximately 125 μg protein) or 2.5 μl of each purified M. mycoides LC One of the specific methyltransferases (M.GANTC, M.CCATC, M.GCATC, M.CCTTC, M.TypeIII). Each cell extract was prepared as described in Example 2E (ii) above, and purified methyltransferase was prepared as described in Example 2E (i) above. Methylation reactions containing M. mycoides LC cell extract or purified methyltransferase were also supplemented with 5 μl of dam methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, Mass.).

メチル化後、それぞれの酵母プラグを、40μlのプロテイナーゼKを補充した1mLのプロテイナーゼK反応緩衝液［100mMのEDTA;0.2％のデオキシコール酸ナトリウム;1％のラウリルサルコシンナトリウム;pH8.0]中で、50℃で4時間インキュベーションした。その後、これらのプラグを、1mLの1×TE緩衝液（20mMのTris-HCl（pH 8）;50mMのEDTA）で4回、45分、そして0.1×TE緩衝液中で2回、30分、室温で優しく撹拌しながら洗浄した。最後の洗浄緩衝液を除去した後、上記セクション（b）に記載したようにプラグをβ-アガラーゼIで融解させ、続いて移植した。   After methylation, each yeast plug is placed in 1 mL proteinase K reaction buffer supplemented with 40 μl proteinase K [100 mM EDTA; 0.2% sodium deoxycholate; 1% sodium lauryl sarcosine; pH 8.0] And incubated at 50 ° C. for 4 hours. The plugs were then washed 4 times with 1 mL of 1 × TE buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8); 50 mM EDTA) for 45 minutes and twice in 0.1 × TE buffer for 30 minutes. Wash with gentle agitation at room temperature. After removing the last wash buffer, the plugs were thawed with β-Agarase I and subsequently implanted as described in section (b) above.

実施例3B
本提供の方法を使用した、移植の成功を明らかにしている研究
上記実施例3Aに記載した一般的方法を使用して、酵母宿主細胞由来のM.ミコイデスLCゲノムドナーDNAの、野生型および制限酵素欠損M.カプリコルムレシピエント細胞への移植を、表11に列挙する以下の条件下で行った。「未処理」の試料は、融解の前に、メチル化を行わず、プロテイナーゼKでの処理も行わなかった。「疑似メチル化」した試料を、メチル化した試料と同じ条件下で、酵素または細胞抽出物を含めずにインキュベーションした。メチル化処理には、ドナーまたはレシピエント細胞抽出物でのメチル化、および精製したメチラーゼでのメチル化を含めた。 Example 3B
Studies demonstrating successful transplantation using the methods provided. Wild type and restriction of M. mycoides LC genomic donor DNA from yeast host cells using the general method described in Example 3A above. Transplantation into enzyme-deficient M. capricolum recipient cells was performed under the following conditions listed in Table 11. The “untreated” samples were not methylated and not treated with proteinase K prior to thawing. Samples that were “pseudo-methylated” were incubated under the same conditions as the methylated sample without the enzyme or cell extract. Methylation treatment included methylation with donor or recipient cell extracts and methylation with purified methylase.

（表１１）移植の条件

(Table 11) Transplant conditions

結果を、テトラサイクリンを含有しているSP4培地上で37℃での青色のコロニーの増殖を選択することによりスコアし、以下の表12Aに示す。その表に示すように、M.ミコイデス抽出物でのメチル化と、野生型細胞への移植のために（試料2）、いくつかの試料を、上記のように、酵母特異的酵素での消化によるか（b）または電気泳動によるか（c）のいずれかで、酵母DNAを除去するために清浄した。   Results were scored by selecting blue colony growth at 37 ° C. on SP4 medium containing tetracycline and are shown in Table 12A below. As shown in the table, several samples were digested with yeast-specific enzymes, as described above, for methylation with M. mycoides extract and transfer to wild type cells (Sample 2). Was cleaned to remove yeast DNA either by (b) or by electrophoresis (c).

（表１２Ａ）ドナーの表現型を持つ移植コロニーの定量化

^a少なくとも3回の実験の平均。報告する誤差は、平均偏差である。
^b酵母のプラグを、AsiSI、RsrII、FseIカクテル制限酵素プロトコールを使用して酵母のゲノムDNAの清浄を行った。
^c酵母のプラグについて、パルスフィールドゲル電気泳動プロトコールを使用して酵母ゲノムDNAの清浄を行った。 Table 12A: Quantification of transplanted colonies with donor phenotype

^{aAverage of} at least 3 experiments. The error reported is the average deviation.
^b Yeast plugs were cleaned of yeast genomic DNA using the AsiSI, RsrII, FseI cocktail restriction enzyme protocols.
^c Yeast plugs were cleaned of yeast genomic DNA using a pulsed field gel electrophoresis protocol.

上記表12Aに示すように、M.ミコイデスLC抽出物、または精製したメチラーゼを使用してメチル化し、野生型もしくはΔREレシピエント細胞のいずれかに移植した試料（試料2、3、7、および8）においては、M.ミコイデスLCと表現型が類似する（類似する外観および増殖速度に基づく）コロニーが得られた（Lartigue et al, （2007）Science 317: 632-8（6）により記載されているとおり）。この結果により、酵母の中で増殖させたM.ミコイデスLCドナーゲノムが、M.ミコイデスLCによって産生された制限酵素、およびレシピエント細胞のシステムによって産生された酵素のいずれに対しても耐性であることを確認した。   Samples (samples 2, 3, 7, and 8) methylated using M. mycoides LC extract or purified methylase and transplanted into either wild-type or ΔRE recipient cells as shown in Table 12A above. ) Resulted in colonies that were similar in phenotype to M. mycoides LC (based on similar appearance and growth rate) (as described by Lartigue et al, (2007) Science 317: 632-8 (6)). As is). This result indicates that the M. mycoides LC donor genome grown in yeast is resistant to both the restriction enzyme produced by M. mycoides LC and the enzyme produced by the recipient cell system. It was confirmed.

対照的に、疑似メチル化したM.ミコイデスLCゲノムおよび未処理のM.ミコイデスLCゲノムの移植によっては、M.カプリコルムΔREレシピエント細胞（試料6および試料10）の場合にのみドナーの表現型のコロニーが生じ、野生型レシピエント細胞（試料1および試料5）の場合には生じなかった。例えば、疑似処理したドナーゲノムDNAおよび未処理のドナーゲノムDNAをM.カプリコルムΔREレシピエント細胞に移植した場合（試料6および試料10）には、それぞれ、34個および37個のコロニーが得られた。しかし、疑似処理したM.ミコイデスLCのゲノムDNAまたは未処理のM.ミコイデスLCのゲノムDNAのいずれかを野生型野生型M.カプリコルムレシピエント細胞に移植した場合には、コロニーは得られなかった（表12A）。   In contrast, the transplantation of pseudo-methylated M. mycoides LC genome and untreated M. mycoides LC genome resulted in a donor phenotype only in the case of M. capricolum ΔRE recipient cells (sample 6 and sample 10). Colonies formed and did not occur in the case of wild type recipient cells (Sample 1 and Sample 5). For example, when mock-treated donor genomic DNA and untreated donor genomic DNA were transplanted into M. capricolum ΔRE recipient cells (sample 6 and sample 10), 34 and 37 colonies were obtained, respectively. . However, no colonies are obtained when either pseudo-treated M. mycoides LC genomic DNA or untreated M. mycoides LC genomic DNA is transplanted into wild-type wild-type M. capricolum recipient cells. (Table 12A).

同様に、M.カプリコルム抽出物で処理したドナーゲノムを持つレシピエント細胞（試料4および試料9）のタイプのいずれにおいても、コロニーが得られた（32個および9個のコロニー、表12A）。M.カプリコルム抽出物がM.カプリコルムの制限酵素に対する保護を提供するので、この結果は、M.カプリコルムレシピエントの制限システムの回避が、酵母細胞の中で増殖させたM.ミコイデスLCドナーゲノムの形質転換の成功に重要であることを示している。M.カプリコルムの制限システムの不活化（M.カプリコルムΔREレシピエント細胞）が、M.ミコイデスのドナーゲノムの移植の成功および活性化を可能にするためには十分であるという事実は、このレシピエント細胞の制限システムの不活化もまた、これらの事象に十分であることを示唆していた。したがって、ドナーであるM.ミコイデスLC制限システム（これは、レシピエント細胞に移植すると、活性化することができた）は、酵母由来のドナーゲノムのM.カプリコルムレシピエント細胞への移植についての障壁を構成するとは考えられなかった。   Similarly, colonies were obtained (32 and 9 colonies, Table 12A) in both types of recipient cells (Sample 4 and Sample 9) with donor genomes treated with M. capricolum extract. Since the M. capricolum extract provides protection against the restriction enzymes of M. capricolum, this result suggests that the circumvention of the restriction system of the M. capricolum recipient was propagated in yeast cells. It is important for the success of transformation. The fact that inactivation of the restriction system of M. capricolum (M. capricolum ΔRE recipient cells) is sufficient to allow for successful transplantation and activation of the donor genome of M. mycoides is this recipient. Inactivation of the cellular restriction system also suggested that these events were sufficient. Thus, the donor M. mycoides LC restriction system (which could be activated when transplanted into recipient cells) was used to transfer yeast-derived donor genomes into M. capricolum recipient cells. It was not considered to constitute a barrier.

移植実験におけるコロニーの回収は、M.カプリコルムレシピエント細胞の存在に依存していた。なぜなら、レシピエント細胞を反応から除いた場合にはコロニーは観察されなかったからである。さらに、移植実験はまた、酵母由来のM.ミコイデスLCゲノムにも依存していた。なぜなら、酵母のゲノムDNAまたは酵母由来のYCpプラスミドだけをドナーDNAとして使用した場合には、コロニーが得られなかったからである。サザンブロットにより、酵母由来のドナーゲノムを受け取ったレシピエント細胞のコロニーが、M.カプリコルム遺伝子型およびM.ミコイデスLC遺伝子型であることを確認した。   Colony recovery in transplantation experiments was dependent on the presence of M. capricolum recipient cells. This is because no colonies were observed when the recipient cells were removed from the reaction. In addition, transplantation experiments also depended on the yeast-derived M. mycoides LC genome. This is because colonies were not obtained when only yeast genomic DNA or yeast-derived YCp plasmid was used as donor DNA. Southern blots confirmed that the recipient cell colonies that received the yeast-derived donor genome were of the M. capricolum genotype and the M. mycoides LC genotype.

「浄化」を行わなかった場合は、酵母DNAが、ゲノムDNAを含有している試料中に存在していた。酵母のゲノムDNAからのドナーゲノムDNAの精製（上記表12Aに「b」および「c」で示す）は、移植の結果を実質的に変更することはなく、レシピエントであるM.カプリコルム細胞が、非特異的DNAまたはキャリアDNAの存在を寛容できることを示していた（表12）。加えて、ポジティブな移植の結果が、2種類の異なる酵母株（VL6-48NおよびW303a）から単離したドナーゲノムDNAを用いた場合に得られ、宿主酵母株の遺伝子型および/または表現型が移植実験には重要ではない可能性があることを示していた。   When "cleaning" was not performed, yeast DNA was present in the sample containing genomic DNA. Purification of donor genomic DNA from yeast genomic DNA (indicated by “b” and “c” in Table 12A above) does not substantially alter the outcome of the transplant, and the recipient M. capricolum cells It was shown that it can tolerate the presence of non-specific DNA or carrier DNA (Table 12). In addition, positive transplant results were obtained using donor genomic DNA isolated from two different yeast strains (VL6-48N and W303a), and the genotype and / or phenotype of the host yeast strain was It indicated that it might not be important for transplant experiments.

まとめると、これらの結果は、酵母由来の表現型が現れていないM.ミコイデスLCゲノムを活性化させ、生存しているM.ミコイデスLCの作製を導くM.カプリコルム細胞の能力を明らかにし、これにより、本提供の方法を、ドナーまたは宿主のいずれとも異なる種のレシピエントである原核細胞に、真核生物宿主細胞中で増殖させた原核生物の全ゲノムを移植するために使用できることを明らかにする。   Taken together, these results reveal the ability of M. capricolum cells to activate the M. mycoides LC genome, which does not show a yeast-derived phenotype, and to lead to the creation of surviving M. mycoides LC. Reveals that the method provided can be used to transfer a whole prokaryotic genome grown in a eukaryotic host cell into a prokaryotic cell that is a recipient of a different species than either the donor or the host. To do.

酵母由来のメチル化されていないM.ミコイデスLCゲノムの、M.カプリコルムΔREレシピエント細胞への移植により、形質転換し、選択したレシピエント細胞がドナーゲノムを含み、これらが、ゲノムDNA以外のいくつかのM.ミコイデスLC構成成分の存在が原因で選択されなかったことを確認した。この確認は、M.ミコイデスLC細胞またはゲノムDNA以外の成分が形質転換の際に存在しないという事実によるものであった。   Transplantation of an unmethylated M. mycoides LC genome from yeast into an M. capricolum ΔRE recipient cell and the selected recipient cell contains the donor genome, which includes some other than genomic DNA. It was confirmed that it was not selected due to the presence of the M. mycoides LC component. This confirmation was due to the fact that no components other than M. mycoides LC cells or genomic DNA were present during transformation.

別の例においては、YCpMmyc1.1、ならびに、変更したYCpゲノム（YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres::URA3およびYCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres）もまた、酵母株W303aから単離した。3種類のYCpゲノム全てのM.カプリコルムレシピエント細胞への移植により、類似する数のテトラサイクリン耐性である青色のコロニーが生じた（表12B）。上記で考察した大きな欠失を持つクローン（YCpMmyc1.1-Δ500kb）を、これが、多くの必須の遺伝子を欠いているが、なおもYCpエレメントとtetMを留めていると推定されるとの理由から、適切な対照とした。予想したとおり、このゲノムをM.カプリコルムレシピエント細胞に移植した場合には、コロニーは回収されなかった。   In another example, YCpMmyc1.1 and the modified YCp genome (YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres :: URA3 and YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres) were also isolated from yeast strain W303a. Transplantation of all three YCp genomes into M. capricolum recipient cells resulted in a similar number of tetracycline resistant blue colonies (Table 12B). The clone with the large deletion discussed above (YCpMmyc1.1-Δ500kb), because it lacks many essential genes but is still presumed to retain the YCp element and tetM As an appropriate control. As expected, no colonies were recovered when this genome was transplanted into M. capricolum recipient cells.

これらの移植実験の全てにおけるコロニーの回収は、M.カプリコルムレシピエント細胞とM.ミコイデスゲノムの両方の存在に依存していた。本明細書中に記載する実験では、酵母のゲノムDNAを含む、ドナーであるYCpゲノムDNAを使用した。しかし、酵母のゲノムDNAからのドナーであるYCpゲノムDNAの精製によっては、移植の結果は実質的には変化せず、これは、レシピエントであるM.カプリコルム細胞が、非特異的DNAまたはキャリアDNAの存在を寛容できることを示している（表12B）。ポジティブな移植の結果が、株VL6-48Nの4つの別々の形質転換体の培養物、および株W303aの4つの別々の形質転換体の培養物から単離した、ドナーであるYCpゲノムDNAを用いて得られた。したがって、細菌のゲノムは、いずれの酵母株においても安定であり得る。回収したコロニーがM.ミコイデスであることの確認は、プローブとしてM.ミコイデス特異的IS1296エレメントを使用するサザンブロット分析により行った（データは示さず）。III型制限遺伝子がPCRにより、変更した細菌の中では欠失していたことが、III型制限遺伝子配列をプローブとして使用したサザンブロット分析によって（データは示さず）、そしてその遺伝子座の配列決定によって（図17）示された。   Colony recovery in all of these transplantation experiments was dependent on the presence of both the M. capricolum recipient cells and the M. mycoides genome. In the experiments described herein, donor YCp genomic DNA, including yeast genomic DNA, was used. However, the purification of YCp genomic DNA, a donor from yeast genomic DNA, did not substantially change the outcome of the transplant, indicating that recipient M. capricolum cells were not It shows that the presence of DNA can be tolerated (Table 12B). Positive transplantation results using donor YCp genomic DNA isolated from cultures of 4 separate transformants of strain VL6-48N and from 4 separate transformants of strain W303a Obtained. Thus, the bacterial genome can be stable in any yeast strain. Confirmation that the recovered colonies were M. mycoides was performed by Southern blot analysis using M. mycoides-specific IS1296 element as a probe (data not shown). The type III restriction gene was deleted by PCR in the modified bacterium by Southern blot analysis using the type III restriction gene sequence as a probe (data not shown) and sequencing the locus (FIG. 17).

（表１２Ｂ）

^＊酵母プラグから、AsiSI、RsrII、およびFseIのカクテルでの消化、続いて、パルスフィールドゲル電気泳動を行うことにより、酵母のゲノムDNAを除去した。
†酵母のプラグから、パルスフィールドゲル電気泳動を使用することにより、酵母のゲノムDNAを除去した。 (Table 12B)

^* Yeast genomic DNA was removed from yeast plugs by digestion with a cocktail of AsiSI, RsrII, and FseI followed by pulsed field gel electrophoresis.
† Yeast genomic DNA was removed from yeast plugs by using pulsed field gel electrophoresis.

表12Bは、酵母由来のM.ミコイデスYCpゲノムの、野生型およびRE（-）M.カプリコルムレシピエント細胞への移植の結果を提供する。酵母由来のM.ミコイデスYCpゲノムのM.カプリコルムレシピエントへの移植後に得られたテトラサイクリン耐性である青色のコロニーの数をカウントした。野生型M.カプリコルムおよびM.カプリコルムRE（-）の移植を、図8に記載する方法を使用して行った。未処理の試料について、酵母プラグをβ-アガラーゼで消化し（融解工程）、両方のレシピエント細胞に移植した。処理した試料を、融解工程の前に、メチル化し、プロテイナーゼKで処理した。疑似メチル化した試料を、抽出物または精製したメチルトランスフェラーゼを添加しなかったことを除き、メチル化した試料と同じように処理した。本実験で使用したVL6-48N酵母のアガロースプラグは、YCpMmyc1.1を有していた。W303a酵母のアガロースプラグは、YCpMmyc1.1、YCpMmyc1.1（これは、酵母の中で変更した（YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres::URA3、またはYCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres））、あるいは、YCpMmyc1.1-Δ500kbを有していた。移植体の数は、少なくとも3回の実験の平均である。報告する誤差は絶対平均偏差である。   Table 12B provides the results of transplantation of the yeast-derived M. mycoides YCp genome into wild-type and RE (-) M. capricolum recipient cells. The number of tetracycline resistant blue colonies obtained after transplantation of the M. mycoides YCp genome from yeast into M. capricolum recipients was counted. Transplantation of wild type M. capricolum and M. capricolum RE (−) was performed using the method described in FIG. For untreated samples, yeast plugs were digested with β-agarase (the thawing step) and transplanted into both recipient cells. The treated sample was methylated and treated with proteinase K prior to the melting step. The pseudo-methylated sample was treated the same as the methylated sample except that no extract or purified methyltransferase was added. The agarose plug of VL6-48N yeast used in this experiment had YCpMmyc1.1. The agarose plug of W303a yeast was YCpMmyc1.1, YCpMmyc1.1 (this was modified in yeast (YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres :: URA3 or YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres)), or YCpMmyc1.1-Δ500kb Had. The number of transplants is an average of at least 3 experiments. The error reported is the absolute mean deviation.

実施例4
酵母宿主細胞内でのドナーゲノムの改変
本実施例は、酵母宿主細胞にクローニングしたマイコプラズマドナーゲノムにシームレスな改変を導入するための方法の使用を記載する。 Example 4
Modification of Donor Genome in Yeast Host Cells This example describes the use of a method for introducing seamless modifications into mycoplasma donor genomes cloned into yeast host cells.

酵母サッカロミセス・セレビジエは、大きなDNA断片（直鎖状および環状の酵母人工染色体（YAC）の両方）をクローニングすることができる宿主として開発された。一旦、酵母にクローニングされると、これらのYACは、標準的な遺伝学的ツールを使用して操作することができる。この改変したDNAの、発現に適している宿主細胞への移入により、遺伝子の機能的研究およびそれらの調節が可能となる。酵母における細菌の全ゲノムのクローニング、およびその後に、そのようなゲノムをそれらのもとの細胞環境に移植して戻すことにより、この適用を、遺伝子レベルからゲノムレベルに拡大した。   Yeast Saccharomyces cerevisiae was developed as a host that can clone large DNA fragments (both linear and circular yeast artificial chromosomes (YACs)). Once cloned into yeast, these YACs can be manipulated using standard genetic tools. Transfer of this modified DNA into a host cell suitable for expression allows for the functional study of genes and their regulation. This application was expanded from the gene level to the genome level by cloning the entire bacterial genome in yeast and then transplanting such genomes back into their original cellular environment.

対抗選択マーカーを利用する2工程の組換えプロトコールを、酵母の中でYACを改変するために使用することができる（Tucker and Burke（1996）Nucleic Acids Res, 24, 3467-3468）。これらの方法においては、対抗選択マーカーを最初にYAC中に組換え、それについて選択する。次に、所望する変更を含む新しいDNA断片を、マーカーの代わりに組換え、これについて選択する。これらの手順において最も頻繁に使用されるマーカーはURA3遺伝子であり、これは、欠損株においてウラシル栄養要求性を回復する。URA3遺伝子の置き換えについての対抗選択は、5-フルオロオロチン酸（5-FOA）での処理により行う（Boeke et al., （1984）Mol Gen Genet, 197, 345-346）。最初に、上記方法によりウラシル栄養要求性を回復させ、これをその後、次の回の改変のために再び使用することができる。次に、上記方法によりシームレスな改変を作製する。シームレスな改変のためのこの基本的な方法は、多数の様式で改良されている。完全欠失（delitto perfetto）法は、エンドヌクレアーゼI-SceIを利用することにより、標的遺伝子座の付近に二本鎖の断裂（DSB）を導入する（Storici et al.（2001）Nat Biotechnol, 19, 773-776）。DSBの形成は、相同組換えの修復の効率を桁違いに刺激する（Storici et al.（2003）PNAS USA, 100, 14994-14999）。タンデム反復ポップアウトと呼ばれる別の方法は、標的部位の側方にタンデム反復配列を作製する（Akada et al.（2006）Yeast, 23, 399-405）。この方法には、わずかに1回の形質転換と、それに続く5-FOA対抗選択が必要であるが、他の方法には2回の形質転換が必要である。これらの方法を、欠失、点突然変異、または遺伝子の置き換えに適応することができる。   A two-step recombination protocol that utilizes a counterselectable marker can be used to modify YAC in yeast (Tucker and Burke (1996) Nucleic Acids Res, 24, 3467-3468). In these methods, the counter selectable marker is first recombined into the YAC and selected for it. A new DNA fragment containing the desired change is then recombined instead of the marker and selected for this. The most frequently used marker in these procedures is the URA3 gene, which restores uracil auxotrophy in deficient strains. Counter selection for replacement of the URA3 gene is performed by treatment with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) (Boeke et al., (1984) Mol Gen Genet, 197, 345-346). Initially, the above method restores uracil auxotrophy, which can then be used again for the next round of modification. Next, a seamless modification is made by the above method. This basic method for seamless modification has been improved in a number of ways. The complete deletion (delitto perfetto) method introduces a double-strand break (DSB) near the target locus by utilizing the endonuclease I-SceI (Storici et al. (2001) Nat Biotechnol, 19 773-776). The formation of DSB stimulates orders of magnitude the efficiency of homologous recombination repair (Storici et al. (2003) PNAS USA, 100, 14994-14999). Another method called tandem repeat popout creates a tandem repeat sequence lateral to the target site (Akada et al. (2006) Yeast, 23, 399-405). This method requires only one transformation followed by 5-FOA counter selection, while the other methods require two transformations. These methods can be adapted to deletions, point mutations, or gene replacements.

合成のM.ゲニタリウムゲノムの、酵母の中での環状のYACとしてのアセンブリおよびクローニングは、Gibson et al.（Science, 319, 1215-1220;およびGibson et al.（PNAS USA, 105, 20404-20409（2008））に記載されている。酵母を、インビボで合成の細菌ゲノムを直接変更するまたは設計するためのプラットフォームとして使用することができる。   Assembly and cloning of the synthetic M. genitalium genome as a circular YAC in yeast has been described by Gibson et al. (Science, 319, 1215-1220; and Gibson et al. (PNAS USA, 105, 20404- 20409 (2008)) Yeast can be used as a platform to directly modify or design a synthetic bacterial genome in vivo.

以下の個々のサブセクションに記載するように、5種類の様々な部位特異的改変方法を、Gibson et al., Science 319, 1215（2008）、およびGibson et alによる米国特許公開第20090275086号に記載されているように、そして上記実施例1Cに記載したように、酵母宿主細胞に導入し、その中で維持した合成のsMgTARBAC37 M.ゲニタリウムゲノムのCDS139遺伝子座の中に1塩基のシチジン欠失（309、388）を含む標的領域（標的遺伝子座）を改変するために行った。   Five different site-specific modification methods are described in Gibson et al., Science 319, 1215 (2008), and US Patent Publication No. 20090275086 by Gibson et al, as described in the individual subsections below. As described above and as described in Example 1C above, a single base cytidine deletion in the CDS139 locus of the synthetic sMgTARBAC37 M. genitalium genome introduced and maintained in yeast host cells. This was done to modify the target region (target locus) containing (309, 388).

サッカロミセス・セレビジエ株VL6-48N（MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 metl4）およびW303a（MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 RAD5）は、Gibson et al, Science Id.に記載されているように、そして上記実施例1に提供したように、合成のゲノムを持つ。酵母細胞を、標準的な富化培地（YEPD）および合成のデキストロース（SD）または合成のガラクトース（SG）最小培地（Amberg et al, （2005）, "Methods in Yeast genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual., "Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.230）の中で増殖させた。   Saccharomyces cerevisiae strain VL6-48N (MATα his3-Δ200 trp1-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 metl4) and W303a (MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 RAD5) has a synthetic genome as described in Gibson et al, Science Id. And as provided in Example 1 above. Yeast cells can be transformed into standard enriched medium (YEPD) and synthetic dextrose (SD) or synthetic galactose (SG) minimal medium (Amberg et al, (2005), "Methods in Yeast genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course. Manual., “Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 230).

本実施例（実施例4）を通じて記載する様々な研究において使用したプライマーの核酸配列を、表13に列挙する。プライマー配列中の点線は、そのプライマーがキメラ構造であることを示す。M.ゲニタリウムの一部分と相同であるプライマー配列の部分を、小文字で示す。M.ゲニタリウムと相同ではないプライマー配列の部分は大文字で示す。I-SceI切断部位（下記を参照のこと）は、下線をひいた字体で示す。本実施例に記載する方法においては、全てのプライマーを特注で合成した（Integrated DNA Technologies（IDT））。60bpより長いプライマーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。   The nucleic acid sequences of the primers used in the various studies described throughout this example (Example 4) are listed in Table 13. The dotted line in the primer sequence indicates that the primer has a chimeric structure. The portion of the primer sequence that is homologous to a portion of M. genitalium is shown in lower case. The portion of the primer sequence that is not homologous to M. genitalium is shown in capital letters. The I-SceI cleavage site (see below) is shown in underlined font. In the method described in this example, all primers were custom-made (Integrated DNA Technologies (IDT)). Primers longer than 60 bp were purified by polyacrylamide gel electrophoresis.

PCR構築物を、公開されている方法（Gietz et al., Nucleic Acids Res, 20, 1425（1992））にしたがって、2〜3μgのPCR産物と25μgのキャリアDNA（サケの***DNA, Sigma）を使用し、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に導入した。   PCR constructs using 2-3 μg PCR product and 25 μg carrier DNA (salmon sperm DNA, Sigma) according to published methods (Gietz et al., Nucleic Acids Res, 20, 1425 (1992)) And introduced into yeast strains containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate.

（表１３）突然変異誘発の研究で使用したプライマー

Table 13: Primers used in the mutagenesis study

実施例4A
従来の2工程の相同組換え法を使用した改変
従来の2工程の相同組換え法（Rothstein, R.Methods Enzymol, 194, 281-301（1991））を、酵母の中で維持した合成のM.ゲニタリウムゲノムの中の1塩基のシチジン欠失を修正するための部位特異的突然変異誘発を導入するために使用した。これを、図12Aに模式的に説明する。 Example 4A
Modification using the conventional two-step homologous recombination method The conventional two-step homologous recombination method (Rothstein, R. Methods Enzymol, 194, 281-301 (1991)) It was used to introduce site-directed mutagenesis to correct a single base cytidine deletion in the genitalium genome. This is schematically illustrated in FIG. 12A.

i.相同組換えによるURA3遺伝子の導入 - 従来の配列の置き換え
表13に列挙したプライマーを使用して、従来の方法（従来の配列の置き換え）を以下のように行った。最初の工程（これは、2回の連続する形質転換を含む）においては、URA3遺伝子（1,066bp）を、プラスミドpRS306（R.S.Sikorski and P.Hieter, Genetics 122, 19（1989）に記載されている）から、プライマーURA-FおよびURA-RによりPCR増幅した。これらの配列は、上記表13に列挙する。この増幅したURA3遺伝子は、突然変異のために標的化したM.ゲニタリウムゲノム領域の部分に同一である2つの50bpの末端配列を含んでいた。PCR反応は、DNAポリメラーゼ（Takara, Madison, WI）を使用して、製造業者が推奨する条件下で行った。PCR産物を、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に導入した。 i. Introduction of URA3 Gene by Homologous Recombination-Replacement of Conventional Sequence Using the primers listed in Table 13, the conventional method (replacement of conventional sequence) was performed as follows. In the first step (which involves two consecutive transformations), the URA3 gene (1,066 bp) is transferred to plasmid pRS306 (described in RSSikorski and P. Hieter, Genetics 122, 19 (1989)) PCR amplification was performed using primers URA-F and URA-R. These sequences are listed in Table 13 above. This amplified URA3 gene contained two 50 bp terminal sequences that were identical to the portion of the M. genitalium genomic region targeted for mutation. PCR reactions were performed using DNA polymerase (Takara, Madison, Wis.) Under conditions recommended by the manufacturer. The PCR product was introduced into a yeast strain containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate.

個々のUra⁺形質転換体を選択し、増幅したURA3遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびSeq-Rを使用して、PCRによって分析した。Seq-FプライマーおよびSeq-Rプライマーは、標的遺伝子座（改変する標的ゲノムの領域）の側方にあり、ゲノムに沿って0.4kbの間隔をあけた。その結果、URA3マーカーの置き換えを含むゲノムからの増幅によって、1.35kbのPCR産物が生じたと考えられる（図12Aに模式的に示す）。PCR反応による産物をアガロースゲル上で分離し、これを視覚化して、URA3遺伝子の正確な挿入を確認した。 To select individual Ura ⁺ transformants and confirm that the amplified URA3 gene was inserted at the correct location in the donor genome, the diagnostic primers Seq-F and Seq-R listed in Table 13 above And analyzed by PCR. The Seq-F and Seq-R primers are to the side of the target locus (the region of the target genome to be modified) and are spaced 0.4 kb along the genome. As a result, it is considered that a 1.35 kb PCR product was generated by amplification from the genome including the replacement of the URA3 marker (schematically shown in FIG. 12A). Products from the PCR reaction were separated on an agarose gel and visualized to confirm the correct insertion of the URA3 gene.

ii.2回目の形質転換:野生型断片の導入と選択
2回目の形質転換のために、328bpの野生型DNA断片（標的領域の部分に対して相同であるが、CDS139遺伝子座の1塩基欠失を含まない）を、上記表13に列挙したプライマーAmp-FおよびSeq-Rを用いたPCR増幅により得た。この断片を、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換方法を使用した1回目の形質転換により得たURA3で置き換えた株に導入した。 ii. Second transformation: introduction and selection of wild-type fragments
For the second transformation, a 328 bp wild-type DNA fragment (homologous to a portion of the target region but not including a single base deletion of the CDS139 locus) was added to the primer Amp listed in Table 13 above. Obtained by PCR amplification using -F and Seq-R. This fragment was introduced into a strain replaced with URA3 obtained by the first transformation using the integration transformation method using lithium acetate.

2回目の形質転換の後、URA3遺伝子を喪失した任意の酵母細胞中に残留しているオロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ（URA3遺伝子によりコードされる）を枯渇させるために、細胞を、SD-HISプレート上で30℃で一晩増殖させた。5-フルオロオロチン酸（FOA）を補充したSD培地（FOAを含有しているSD-HISプレート）を、URA3遺伝子の喪失について選択するために使用した（Boeke et al., Mol Gen Genet, 197, 345-346（1984））。   After the second transformation, the cells are SD to deplete the orotidine-5'-phosphate decarboxylase (encoded by the URA3 gene) remaining in any yeast cell that has lost the URA3 gene. -Grow overnight at 30 ° C on HIS plates. SD medium supplemented with 5-fluoroorotic acid (FOA) (SD-HIS plate containing FOA) was used to select for loss of URA3 gene (Boeke et al., Mol Gen Genet, 197, 345-346 (1984)).

突然変異の修正を、診断用プライマーSeq-FおよびSeq-R（上記、および表13に列挙した）を使用した、選択したクローン由来のゲノムDNAのPCRにより評価した。PCR反応は、Takara DNAポリメラーゼ（Takara, Madison, WI）を使用して、製造業者が推奨する条件下で行った。PCR産物をアガロースゲル上で分離した。これらのプライマーを使用すると、CDS139遺伝子座（1塩基欠失を持つもとの遺伝子座、または置き換えた野生型配列のいずれか）を含むゲノムDNAの増幅により、0.4kbのDNA断片のPCR産物が生じた（データは示さず）。   Mutation correction was assessed by PCR of genomic DNA from selected clones using diagnostic primers Seq-F and Seq-R (listed above and in Table 13). PCR reactions were performed using Takara DNA polymerase (Takara, Madison, Wis.) Under conditions recommended by the manufacturer. PCR products were separated on an agarose gel. Using these primers, amplification of genomic DNA containing the CDS139 locus (either the original locus with a single base deletion or the replaced wild-type sequence) resulted in a PCR product of a 0.4 kb DNA fragment. Produced (data not shown).

97個のFOA耐性コロニーをこの方法によって試験した。全ての結果を表14の1列目にまとめる。表14に示すように、FOA耐性コロニーはいずれも、ゲノムDNAのPCR増幅によっては、正確な0.4kbの断片を生じなかった。この結果は、入ってきた野生型DNA断片と標的部位との間では正確な相同組換え（HR）が起こらなかったことを示唆していた。代わりに、これらのFOA耐性コロニーにおけるURA3マーカーの喪失が、望ましくない欠失により起こった可能性があった。この可能性は、酵母の中で環状YACとして増殖させたM.ゲニタリウムゲノムが、ヒスチジン栄養要求性に加えて、その宿主との機能相補を有さないと仮定すると起こり得る。したがって、ドナーである細菌ゲノム中での欠失および再構成は、おそらく、宿主細胞の生存能力にとっては無害であったと考えられる。   97 FOA resistant colonies were tested by this method. All results are summarized in the first column of Table 14. As shown in Table 14, none of the FOA resistant colonies yielded an accurate 0.4 kb fragment by PCR amplification of genomic DNA. This result suggested that exact homologous recombination (HR) did not occur between the incoming wild-type DNA fragment and the target site. Instead, the loss of the URA3 marker in these FOA resistant colonies may have been caused by unwanted deletions. This possibility can occur assuming that the M. genitalium genome grown as a circular YAC in yeast does not have functional complementation with its host in addition to histidine auxotrophy. Thus, deletions and rearrangements in the donor bacterial genome were probably harmless to the viability of the host cell.

iii.マルチプレックスPCR
選択した酵母の中でのM.ゲニタリウムゲノムの完全性を評価することによりこの可能性を試験するために、マルチプレックスPCR（MPCR）を、Gibson et al, PNAS USA, 105（51）:20404-9（2008）、およびGibson et al., Science 319, 1215（2008）に記載されているように行った。PCR分析のための酵母からの全DNAの単離は、公開されているプロトコール（Kouprina and Larionov, Nat.Protoc.3, 371（2008））に従い、上記実施例3に記載したように行った。MPCRのためのプライマーセット（セット3）を、およそ60kbのDNAごとにM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように分布させた10種類のアンプリコン（0.1kbの増分で、125bpから1025bpまでの範囲）を生じるように設計した（Gibson et al., PNAS USA, 105（51）:20404-9（2008））。マルチプレックスPCRは、Qiagen（Valencia, CA）によるマルチプレックスPCRキットを使用して行った。1/50容量（2μl）のDNA抽出物、およびそれぞれ5μMの20種類のオリゴを含有している1μlの1O×プライマーストックを、10μlの反応物の中に含めた。サイクルのパラメーターは、94℃で15分、その後、35サイクルの、94℃で30秒、52℃で90秒、および72℃で90秒、これに続き、1回の72℃で3分間のインキュベーションであった。その後、2μlの反応物をそれぞれ、2％のE-ゲル（Invitrogen）上に充填し、72Vを30分間かけた。バンドを、Amersham Typhoon 9410 Fluorescence Imagerを使用して視覚化した。 iii. Multiplex PCR
To test this possibility by assessing the integrity of the M. genitalium genome in selected yeasts, multiplex PCR (MPCR) was performed using Gibson et al, PNAS USA, 105 (51): 20404. -9 (2008) and as described in Gibson et al., Science 319, 1215 (2008). Isolation of total DNA from yeast for PCR analysis was performed as described in Example 3 above according to published protocols (Kouprina and Larionov, Nat. Protoc. 3, 371 (2008)). Primer set for MPCR (set 3), 10 amplicons (ranging from 125 bp to 1025 bp in 0.1 kb increments) distributed around the M. genitalium genome every 60 kb of DNA It was designed to occur (Gibson et al., PNAS USA, 105 (51): 20404-9 (2008)). Multiplex PCR was performed using a multiplex PCR kit from Qiagen (Valencia, Calif.). A 1/50 volume (2 μl) of DNA extract and 1 μl of 10 × primer stock containing 20 oligos of 5 μM each were included in the 10 μl reaction. Cycle parameters were 94 ° C for 15 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 90 seconds, and 72 ° C for 90 seconds, followed by a single incubation at 72 ° C for 3 minutes Met. Thereafter, 2 μl of each reaction was loaded onto 2% E-gel (Invitrogen) and 72V was applied for 30 minutes. Bands were visualized using Amersham Typhoon 9410 Fluorescence Imager.

結果は、22個のFOA耐性コロニーのそれぞれについて、全DNAの増幅により、全10種類のアンプリコンが生じなかったことを示した。2種類のアンプリコン（0.55kbおよび0.65kbの長さ（これは、M.ゲニタリウムゲノムと一緒にクラスターを形成する））は、いずれのFOA耐性クローンのMPCRによっても生じなかった。CDS139標的遺伝子座は、0.65kbのアンプリコンの3kb上流に位置している（ゲルの結果は示さず）。   The results showed that for each of the 22 FOA resistant colonies, the amplification of total DNA did not produce all 10 amplicons. Two amplicons (0.55 kb and 0.65 kb in length, which cluster together with the M. genitalium genome) were not generated by MPCR of any FOA resistant clones. The CDS139 target locus is located 3 kb upstream of the 0.65 kb amplicon (gel results not shown).

この結果は、いくつかの非特異的欠失または再構成が、酵母の中で増殖させたM.ゲニタリウムゲノムの中で起こったことを示していた。これらのクローンにおけるURA3マーカーの喪失（FOAでのそれらの選択により明らかである）はおそらく、M.ゲニタリウムゲノム中の反復配列間での相同組換えにより生じた。URA3マーカーがこの組換えの結果として欠失した細胞は、FOA培地上で生存することができた。したがって、この従来の方法ではない方法を用いた場合には、導入した野生型DNA断片との意図した組換え事象によるURA3の置き換え以外の、非特異的なURA3遺伝子の喪失の高い可能性があった。   This result indicated that some non-specific deletions or rearrangements occurred in the M. genitalium genome grown in yeast. The loss of the URA3 marker in these clones (which is evident by their selection with FOA) was probably caused by homologous recombination between repetitive sequences in the M. genitalium genome. Cells in which the URA3 marker was deleted as a result of this recombination were able to survive on FOA medium. Therefore, when this non-conventional method is used, there is a high possibility of non-specific URA3 gene loss other than URA3 replacement by the intended recombination event with the introduced wild-type DNA fragment. It was.

従来の改変方法に伴うこの問題を図9に模式的に説明する。ここでは、URA3が挿入されたM.ゲニタリウム（図9A）を持つ酵母（上記実施例4A（i）に記載したように作製した）への野生型断片の導入、これに続く、FOAを含有しているSD-HISプレート上での選択により、2種類の異なるタイプの組換え事象（P1（野生型断片とゲノムとの間での組換え）およびP2（ゲノム内の反復間での組換え））の選択が生じる（図9B）。これらの事象により、図9Cに説明する別の産物を持つ細胞が生じる可能性があった。M.ゲニタリウムゲノムが多数の反復を含むので、URA3遺伝子の非特異的喪失の可能性（P2）は、意図した組換え（P1）が原因である喪失の可能性よりも高かった。一般的な非特異的喪失は、この従来の方法を使用して、意図した配列を含有している任意のクローンが失われたことの観察の理由である可能性がある。これらの結果は、酵母宿主細胞中でドナーゲノムを改変するための改良された方法の必要性を示している。   This problem associated with the conventional modification method is schematically illustrated in FIG. Here, introduction of a wild-type fragment into yeast (produced as described in Example 4A (i) above) containing M. genitalium with inserted URA3 (Figure 9A), followed by FOA. Two different types of recombination events (P1 (recombination between the wild-type fragment and the genome) and P2 (recombination between repeats within the genome), depending on the selection on the existing SD-HIS plate ) Selection occurs (FIG. 9B). These events could result in cells with different products illustrated in FIG. 9C. Since the M. genitalium genome contains a large number of repeats, the probability of non-specific loss of the URA3 gene (P2) was higher than the probability of loss due to the intended recombination (P1). The general non-specific loss may be the reason for the observation that any clone containing the intended sequence has been lost using this conventional method. These results indicate the need for improved methods for modifying the donor genome in yeast host cells.

（表１４）FoA⁺クローンの間での正確な配列の置き換えおよび完全なマイコプラズマ・ゲニタリウムアンプリコンの数

Table 14: Exact sequence replacement between FoA ⁺ clones and number of complete Mycoplasma genitalium amplicons

実施例4B
別のシームレスな改変の方法
2種類の他のシームレスな改変方法（これらは、より有効であることが報告されている）を、上記の酵母の中で合成のM.ゲニタリウムドナーゲノムの同じ標的領域を改変する試みにおいて使用した。 Example 4B
Another seamless modification method
Two other seamless modification methods, which have been reported to be more effective, are used in an attempt to modify the same target region of a synthetic M. genitalium donor genome in the yeast described above did.

i.完全欠失（Delitto perfetto）
2種類の報告されている効率的な方法のうちの第1のものである完全欠失（delitto perfetto）（Storici, F.et al, Nat Biotechnol, 19, 773-776（2001））を、図1OAに模式的に説明する。この方法では、標的DNA部位への二本鎖の断裂の導入が、組換えを桁違いに刺激する。 i. Complete deletion (Delitto perfetto)
Deletto perfetto, the first of two reported efficient methods (Storici, F. et al, Nat Biotechnol, 19, 773-776 (2001)) Explain schematically to 1OA. In this method, the introduction of a double-strand break at the target DNA site stimulates recombination by orders of magnitude.

本明細書中で使用した完全欠失（delitto perfetto）法では、コアカセットの側方にある標的遺伝子座の上流の領域に相同である50bpの配列と、コアカセットの側方にある標的遺伝子座の下流の領域に対して相同である50bpの配列を有している構築物を使用した。これは、以下を含む:特定のエンドヌクレアーゼによって認識される核酸配列、誘導性プロモーター、誘導性プロモーターの制御下に特定のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、および選択/対抗選択マーカー（図10A）。したがって、エンドヌクレアーゼの発現を誘導すると、エンドヌクレアーゼがこのカセットの中のその認識部位を切断して、二本鎖の断裂を作製し、所望する部位での組換え効率を増大させるように、カセットを設計する。   The complete deletion (delitto perfetto) method used herein uses a 50 bp sequence homologous to the region upstream of the target locus on the side of the core cassette and the target locus on the side of the core cassette. A construct having a 50 bp sequence homologous to the downstream region of was used. This includes: a nucleic acid sequence recognized by a specific endonuclease, an inducible promoter, a gene encoding a specific endonuclease under the control of an inducible promoter, and a select / counterselectable marker (FIG. 10A). Thus, inducing the expression of endonuclease, the cassette will cause the endonuclease to cleave its recognition site in this cassette, creating a double-strand break and increasing the recombination efficiency at the desired site. To design.

a.完全欠失（dellitto perfetto）カセットの作製
完全欠失（delitto perfetto）突然変異誘発カセットを、GAL1プロモーター（誘導性プロモーター）とI-SceI遺伝子（エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子）を含んでいる第1の断片をURA3（選択/対抗選択マーカー）遺伝子断片に対して融合させるための融合PCRにより作製した。URA3遺伝子断片（1,066bp）を、上記実施例4Aに記載したように、プラスミドpRS306から、上記表13に列挙したプライマーURA-FおよびURA-Rを使用して増幅させた。GAL1プロモーターとI-SceI遺伝子（GAL1/I-SceI遺伝子断片）を含むこの1,184bpの断片を、プラスミドpGSKU（Storici et al, PNAS USA, 100, 14994-14999（2003）に記載されている）から、上記表13に列挙したプライマーGal-FおよびGal-Rを使用して増幅させた。融合PCRは、原則としてShevchuk et al., Nucleic Acids Res, 32, e19（2004）に記載されているとおりに、組換えPCR技術を使用して行った。 a. Preparation of a complete deletion (dellitto perfetto) cassette A complete deletion (delitto perfetto) mutagenesis cassette containing a GAL1 promoter (inducible promoter) and an I-SceI gene (a gene encoding an endonuclease) One fragment was prepared by fusion PCR to fuse the URA3 (selection / counterselection marker) gene fragment. The URA3 gene fragment (1,066 bp) was amplified from plasmid pRS306 using the primers URA-F and URA-R listed in Table 13 above as described in Example 4A above. This 1,184 bp fragment containing the GAL1 promoter and the I-SceI gene (GAL1 / I-SceI gene fragment) is derived from the plasmid pGSKU (described in Storici et al, PNAS USA, 100, 14994-14999 (2003)). Amplification was performed using the primers Gal-F and Gal-R listed in Table 13 above. Fusion PCR was performed using recombinant PCR technology as described in principle in Shevchuk et al., Nucleic Acids Res, 32, e19 (2004).

b.1回目の形質転換
上記カセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra⁺形質転換体を選択し、遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびSeq-R（図10Aの中で、挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示す）を使用してPCRによって分析した。これらのプライマーを使用した、カセットが挿入されたゲノムのPCRによって、2.5kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応による産物をアガロースゲル上で分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。 b. First transformation The cassette was introduced into a yeast strain containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate. To select individual Ura ⁺ transformants and confirm that the gene was inserted at the correct location in the donor genome, the diagnostic primers Seq-F and Seq-R listed in Table 13 above (Figure 10A) (Shown as a small unidirectional arrow beside the insertion site) and analyzed by PCR. It is considered that PCR of the genome into which the cassette was inserted using these primers produced a 2.5 kb product. Products from the PCR reaction were separated on an agarose gel, which was visualized to confirm correct insertion of the URA3 gene.

c.エンドヌクレアーゼの発現の誘導、おとび2回目の形質転換
診断用プライマーを用いたPCR反応においてポジティブと試験したクローンを、I-SecIエンドヌクレアーゼ（これは、GAL1プロモーターによって制御されており、これにより、唯一の炭素源としてガラクトースを含有している培地中で酵母を増殖させると発現される）の発現を誘導するために、SD/ガラクトース/-HIS培地中で4時間増殖させた。エンドヌクレアーゼの発現の誘導は、ゲノムに相同である領域のすぐ下流に位置するカセット内の18bpの認識配列を切断することにより二本鎖の断裂を生じるように意図した。誘導後、野生型DNA断片で、上記実施例4Aに記載したように細胞を形質転換した。 c. Induction of endonuclease expression, and second transformation. Clones tested positive in a PCR reaction with diagnostic primers were treated with I-SecI endonuclease (which is controlled by the GAL1 promoter. For 4 hours in SD / galactose / -HIS medium to induce the expression of yeast) in a medium containing galactose as the sole carbon source. Induction of endonuclease expression was intended to cause double-strand breaks by cleaving the 18 bp recognition sequence in the cassette located immediately downstream of the region homologous to the genome. After induction, cells were transformed with the wild type DNA fragment as described in Example 4A above.

細胞を、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、FOAを含有しているSD-HISプレート上で増殖させた。Seq-FプライマーとSeq-Rプライマーを使用した診断用PCRを、選択したFOA耐性細胞が、上記カセットが野生型断片（これは400塩基対のPCR産物を生じると考えられる）で置き換えられたゲノムを含むかどうかを決定するために行った。上記表14に示したように、60個の試験したFOA耐性単離物はいずれも、正確なサイズのアンプリコンを生じなかった。結果は、60個のFOA耐性単離物由来のM.ゲニタリウムゲノムが、CDS139遺伝子座の不正確な欠失を含むことを明らかにした。   Cells were grown on SD-HIS plates containing FOA to select cells that lost the URA3 marker as described in Example 4A. Diagnostic PCR using Seq-F and Seq-R primers, selected FOA-resistant cells with the above cassette replaced with a wild-type fragment (which is thought to produce a 400 base pair PCR product) Went to determine whether to include. As shown in Table 14 above, none of the 60 tested FOA resistant isolates yielded the correct size amplicon. The results revealed that the M. genitalium genome from 60 FOA resistant isolates contained an incorrect deletion of the CDS139 locus.

ii.タンデム反復ポップアウト
2種類の報告されているシームレスな欠失の方法の第2のものであるタンデム反復ポップアウトは、2つのタンデム反復配列間での相同組換え（HR）による核酸セグメントの正確な除去に基づき、これは、Akada et al, Yeast, 23, 399-405（2006）に記載されている。この技術は、遺伝子の置き換えでの使用に適応させることができる。この方法を用いて、1塩基欠失の修正の代わりに、CDS139遺伝子座のシームレスな欠失を、M.ゲニタリウムゲノムを持つ同じ酵母株において行った。 ii. Tandem repeat popout
The second of the two reported seamless deletion methods, tandem repeat popout, is based on the precise removal of nucleic acid segments by homologous recombination (HR) between two tandem repeat sequences, This is described in Akada et al, Yeast, 23, 399-405 (2006). This technique can be adapted for use in gene replacement. Using this method, instead of correcting the single base deletion, a seamless deletion of the CDS139 locus was performed in the same yeast strain with the M. genitalium genome.

a.融合PCRによるタンデム反復カセットの作製
URA3マーカーと、標的遺伝子座（図10Bの中で「反復」として示す大きな矢印）のすぐ上流の部分に相同である358bpの断片（「反復」断片）を含む融合産物を作製した。1,066bpのURA3マーカー断片は、実施例4Aに記載した方法と同じ方法を使用して、Ura-FおよびUra-Rプライマー（表13）を使用してPCRにより産生した。358bpの反復断片は、表13に列挙したAmp-FおよびSeq-Rプライマーを用いて、PCR増幅により産生した。 a. Preparation of tandem repeat cassette by fusion PCR
A fusion product was made containing the URA3 marker and a 358 bp fragment (“repeat” fragment) that is homologous to the portion immediately upstream of the target locus (large arrow shown as “repeat” in FIG. 10B). A 1,066 bp URA3 marker fragment was generated by PCR using Ura-F and Ura-R primers (Table 13) using the same method described in Example 4A. A 358 bp repeat fragment was generated by PCR amplification using the Amp-F and Seq-R primers listed in Table 13.

上記2つの部分を、上記実施例4B（i）に記載したように、以下のように組換えPCR技術を使用して融合PCRにより連結させた。最初に、上記表13に列挙したキメラ融合プライマーFus1およびFus2（それぞれが、URA3遺伝子に対する相同部分と「反復」断片を含む）を、URA3遺伝子を増幅するためのPCRにおいて、および反復断片を増幅するための別のPCRにおいて使用した。それぞれの反応による産物は、2つの増幅産物の間で共通している重複している相同配列の40塩基対の全てについて、他の反応の産物に対する相同領域を含んでいた。その後、これらの産物について、これらの産物を連結させるための低いアニーリング温度を用いて、プライマーレスPCRサイクルを行い、これにより、連結された複数の断片を含む融合産物を得た。   The two parts were ligated by fusion PCR using recombinant PCR technology as described below in Example 4B (i) above. First, the chimeric fusion primers Fus1 and Fus2 listed in Table 13 above, each containing a homologous portion and a “repeat” fragment for the URA3 gene, in PCR to amplify the URA3 gene, and the repeat fragment Used in another PCR. The product from each reaction contained a region of homology to the product of the other reaction for all 40 base pairs of overlapping homologous sequences common between the two amplification products. These products were then subjected to a primerless PCR cycle using a low annealing temperature for ligating these products, resulting in a fusion product containing multiple ligated fragments.

最終的な突然変異誘発カセット（図10Bを参照のこと）を作製するために、上記融合産物を、上記表13に列挙したキメラプライマーUM2-70およびMUT-70を使用して再度PCR増幅した。その表に示したように、これらのプライマーのそれぞれが、融合産物に対する相同性と、標的領域に対する50塩基対（bp）の相同性（5'末端;小文字）を含んでいた。得られたカセット（図10Bに説明する）は、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の上流）、URA3マーカー、反復カセット、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性を含んでいた。上記カセットは、これで酵母宿主細胞を形質転換すると、M.ゲニタリウムゲノムのCDS139遺伝子座内の450塩基対の標的領域の、このカセットでの（HRによる）置き換えが、URA3選択マーカーの側方にある2つのタンデム反復配列（「反復」として示した図14B中の大きな矢印）を含むゲノム中の領域の中で生じるように、この方向で設計した。上記タンデム反復配列は、2つの反復配列間での相同組換えによるカセットの欠失（ポップアウト）を容易にするために含めた。このような事象によりURA3マーカーを除去し、そしてこのような事象を、FOAを含有している培地上での増殖により選択することができた。   To create the final mutagenesis cassette (see FIG. 10B), the fusion product was PCR amplified again using the chimeric primers UM2-70 and MUT-70 listed in Table 13 above. As shown in the table, each of these primers contained homology to the fusion product and 50 base pair (bp) homology to the target region (5 ′ end; lower case). The resulting cassette (described in FIG. 10B) is 50 bp homology to the 5 ′ portion of the target region (upstream of a single base deletion), URA3 marker, repeat cassette, and 3 ′ of the target region in the following order: It contained 50 bp homology to the part. When the above cassette is now transformed into yeast host cells, the replacement of the 450 base pair target region within the CDS139 locus of the M. genitalium genome with this cassette (by HR) is lateral to the URA3 selectable marker. Were designed in this direction to occur in a region in the genome containing the two tandem repeats (large arrows in FIG. 14B shown as “repeats”). The tandem repeat sequence was included to facilitate cassette deletion (pop-out) by homologous recombination between two repeat sequences. Such an event removed the URA3 marker and such an event could be selected by growth on medium containing FOA.

b.形質転換および分析
上記カセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra+形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびM2-detl-R（図10Bの中で、挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示す）を使用して、PCRによって分析した。これらのプライマーを用いた野生型ゲノムのPCRによって、1kbの産物が生じたと考えられる。一方、カセットが挿入されたゲノムのPCRによっては、1.973kbの産物が生じた。PCR反応による産物をアガロースゲル上で分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。 b. Transformation and analysis The cassette was introduced into yeast strains containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate. To select individual Ura + transformants and confirm that the gene was inserted at the correct location in the donor genome, the diagnostic primers Seq-F and M2-detl-R listed in Table 13 above ( In FIG. 10B, it was analyzed by PCR using a small unidirectional arrow to the side of the insertion site. It is considered that a 1-kb product was generated by PCR of the wild-type genome using these primers. On the other hand, depending on the PCR of the genome into which the cassette was inserted, a 1.773 kb product was generated. Products from the PCR reaction were separated on an agarose gel, which was visualized to confirm correct insertion of the URA3 gene.

正確な挿入についてPCRによりポジティブと試験した細胞を、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、FOAを含有しているSD-HISプレート上で増殖させた。プライマーSeq-FおよびM2-det1を使用した診断用PCRを、選択したFOA耐性細胞が、カセットが欠失した、標的領域の450塩基対部分のシームレスな欠失が残っているゲノムを含むかどうかを決定するために行った。そのような正確な欠失が起こったゲノムについてのこれらのプライマーを用いたPCRによって、0.55kbの産物が生じたと考えられる。上記表14に示すように、38個のFOA耐性単離物はいずれも、このPCR増幅において産物を生じなかった。   Cells tested positive by PCR for correct insertion were grown on SD-HIS plates containing FOA to select cells that lost the URA3 marker as described in Example 4A. Diagnostic PCR using primers Seq-F and M2-det1, whether selected FOA-resistant cells contain a genome that lacks the cassette and remains a seamless deletion of the 450 base pair portion of the target region Went to determine. It is believed that PCR with these primers on the genome in which such an exact deletion occurred resulted in a 0.55 kb product. As shown in Table 14 above, none of the 38 FOA resistant isolates produced any product in this PCR amplification.

MPCRを、9個のFOA耐性単離物由来のDNAについて、実施例4Aに記載したように行った。上記表14に示したように、これらの9個の単離物のうちの一つだけが、完全なレプリコン（10種類の産物全て）を生じた。完全なレプリコンが存在しないことは、ドナーゲノム自体の中で反復配列間で組換えが起こったことを示していた。この結果は、URA3マーカーの側方にあるタンデム反復配列間での組換えの頻度が、M.ゲニタリウムゲノム中の反復配列間での組換えよりもはるかに低かったことを示唆していた。   MPCR was performed as described in Example 4A on DNA from 9 FOA resistant isolates. As shown in Table 14 above, only one of these nine isolates yielded a complete replicon (all 10 products). The absence of a complete replicon indicated that recombination occurred between repetitive sequences within the donor genome itself. This result suggested that the frequency of recombination between tandem repeats beside the URA3 marker was much lower than recombination between repeat sequences in the M. genitalium genome.

実施例4Aおよび本実施例（4B）に記載した研究による結果は、まとめると、URA3/FOAシステムをベースとする公知の方法が、これらの酵母宿主細胞中でM.ゲニタリウムドナーゲノムを操作および変更するためのこの特定のシステムにおいては十分ではないこと、そしてこれらの研究において回収したFOA耐性コロニーの大部分が、一連の操作の間の意図しない組換え事象によりURA3マーカーを非特異的に喪失したことを示していた。これらのことは、酵母宿主細胞中でドナーゲノムを改変するための改良された方法の必要性を示している。   The results from the studies described in Example 4A and this Example (4B) summarized that known methods based on the URA3 / FOA system manipulate and manipulate the M. genitalium donor genome in these yeast host cells. This particular system to modify is not sufficient, and the majority of FOA resistant colonies recovered in these studies lost the URA3 marker nonspecifically due to unintended recombination events during a series of manipulations It showed that. These indicate the need for improved methods for modifying the donor genome in yeast host cells.

実施例4C
タンデム反復とエンドヌクレアーゼによる切断を使用した改変方法（TREC）
実施例4Aおよび4Bに記載した研究の結果に基づいて、ポップアウト法（実施例4B（ii））における意図したタンデム反復間での組換え頻度が、標的遺伝子座付近での二本鎖の断裂の導入により増強され得ると理由づけした。タンデム反復とエンドヌクレアーゼによる切断（TREC）を使用し、そして酵母宿主細胞の中でドナー核酸を改変するために使用することができるそのような方法（TREC）を提供する。本実施例は、酵母の中でのM.ゲニタリウムドナーゲノム中の同じ遺伝子座を改変するための本提供の方法の使用を記載する。この研究の結果により、標的部位付近への二本鎖の断裂の導入により、このシステムにおけるタンデム反復を介する組換え効率が増大することを確認する。 Example 4C
Modification method using tandem repeats and endonuclease cleavage (TREC)
Based on the results of the studies described in Examples 4A and 4B, the frequency of recombination between the intended tandem repeats in the pop-out method (Example 4B (ii)) was determined as a double-strand break near the target locus. It was reasoned that it could be enhanced by the introduction of Such methods (TREC) are provided that use tandem repeats and endonuclease cleavage (TREC) and that can be used to modify donor nucleic acids in yeast host cells. This example describes the use of the provided method to modify the same locus in the M. genitalium donor genome in yeast. The results of this study confirm that the introduction of double-strand breaks near the target site increases the recombination efficiency through tandem repeats in this system.

URA3マーカーに対する対抗選択の際の非特異的喪失のバックラウンドを減少させ、標的部位の付近にタンデム反復配列と二本鎖の断裂（これは、標的特異的組換えの効率と特異性を大幅に増強する）の両方を作製するための一つの方法を設計した。このTREC法は、酵母の中でM.ゲニタリウムゲノムをシームレスに変更するには十分に有効である。   Reduces non-specific loss background during counter-selection against the URA3 marker, tandem repeats and double-strand breaks near the target site (this greatly increases the efficiency and specificity of target-specific recombination) One method was designed to create both. This TREC method is effective enough to seamlessly change the M. genitalium genome in yeast.

i.TRECカセットの作製
別の例においては、TREC突然変異誘発構築物を、（GAL1/I-SceI）-URA3融合産物（実施例4B（i）に記載したように産生した）を標的遺伝子座の上流に位置する358bpの「反復」断片（実施例4B（ii）に記載した）と融合させることにより作製した。（GAL1/I-SceI）-URA3産物と反復断片の融合は、以下のように、融合PCRにより行った。キメラプライマーFus1およびFus2（上記表13に列挙した）（それぞれが、（GAL1/I-SceI）-URA3融合産物および反復断片に対する相同部分を有している）を、（GAL1/I-SceI）-URA3融合産物を鋳型として用いたPCR増幅において、そして「反復」断片を鋳型として用いた別のPCR増幅において使用した。その後、これらの産物について、上記実施例4Aおよび4Bに記載したように、プライマーを用いないPCRを行って、（（GAL1/I-SceI）-URA3）-反復融合産物を作製した。 i. Generation of TREC cassettes In another example, a TREC mutagenesis construct was used to generate a (GAL1 / I-SceI) -URA3 fusion product (produced as described in Example 4B (i)) at the target locus. It was made by fusing with an upstream 358 bp “repeat” fragment (described in Example 4B (ii)). Fusion of the (GAL1 / I-SceI) -URA3 product and the repetitive fragment was performed by fusion PCR as follows. Chimeric primers Fus1 and Fus2 (listed in Table 13 above) (each having a homologous part to the (GAL1 / I-SceI) -URA3 fusion product and repetitive fragment) (GAL1 / I-SceI)- Used in PCR amplification using the URA3 fusion product as a template and in another PCR amplification using the “repeat” fragment as a template. These products were then subjected to PCR without primers as described in Examples 4A and 4B above to produce ((GAL1 / I-SceI) -URA3) -repetitive fusion products.

その後、（（GAL1/I-Scel）-URA3）-反復融合産物を、上記表13に列挙したSce-Int1およびMUT-70プライマーを使用して増幅した。その表に示したように、これらのプライマーはそれぞれ、（（GAL1/I-SceI）-URA3）-反復融合産物に対する相同性と、標的領域の末端部分に対する5'の50塩基対（bp）相同部分（5'の小文字の部分）を含んでいた。Sce-Int1プライマーはさらに、I-SceI認識部位（下線をひいた）を含んでいた。   The ((GAL1 / I-Scel) -URA3) -repeat fusion product was then amplified using the Sce-Int1 and MUT-70 primers listed in Table 13 above. As shown in the table, each of these primers is homologous to the ((GAL1 / I-SceI) -URA3) -repeat fusion product and 5 '50 base pair (bp) homology to the terminal portion of the target region. Part (5 'lowercase part). The Sce-Int1 primer further contained an I-SceI recognition site (underlined).

得られたTRECカセット（図10Cに説明する）は、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の上流）、コアカセット（18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーター、I-SceIエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、およびURA3マーカーからなる）、「反復」（標的遺伝子座のすぐ上流にあるゲノムの配列に対して相同である358bpの部分）、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の下流が修正されている）を含んでいた。   The resulting TREC cassette (described in FIG. 10C) has the following order: 50 bp homology to the 5 ′ portion of the target region (upstream of a single base deletion), core cassette (18 bp I-SceI recognition site, Consisting of the GAL1 promoter, the gene encoding the I-SceI endonuclease, and the URA3 marker), the “repeat” (the 358 bp portion that is homologous to the genomic sequence immediately upstream of the target locus), and the target region It contained 50 bp homology to the 3 ′ portion (corrected downstream of the 1 base deletion).

したがって、このカセットは、酵母宿主細胞を形質転換すると、M.ゲニタリウムゲノムのCDS139遺伝子座内の450塩基対の標的領域の、このカセットでの（HRによる）置き換えが、URA3選択マーカーと、ガラクトース上での増殖によってエンドヌクレアーゼの発現を促進することにより切断を誘導することができるエンドヌクレアーゼ切断部位との側方にある2つのタンデム反復配列（「反復」として示した図10Bの中の大きな矢印）を含むゲノム中の領域の中で生じるように、設計した。タンデム反復ポップアウト法においてそうであったように、2つの反復配列間での相同組換えによるシームレスな欠失を可能にするために、タンデム反復配列を含めた。完全欠失（delitto perfetto）法においてそうであったように、誘導可能なエンドヌクレアーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ認識部位を、所望する組換え部位で二本鎖の断裂の生成を誘導できるように含めた。組換えによるシームレスな欠失の選択は、FOAを含有している培地上での増殖により行うことができた。   Thus, when this cassette is transformed into a yeast host cell, replacement of the 450 base pair target region within the CDS139 locus of the M. genitalium genome with this cassette (by HR) will result in the URA3 selectable marker and galactose Two tandem repeats to the side of the endonuclease cleavage site that can induce cleavage by promoting endonuclease expression by growth above (large arrow in Figure 10B shown as "repeat") ) In the region of the genome containing. Tandem repeats were included to allow seamless deletion by homologous recombination between two repeats, as was the case in the tandem repeat popout method. As was the case with the full deletion (delitto perfetto) method, an inducible endonuclease gene and endonuclease recognition site were included so that double-strand break generation could be induced at the desired recombination site. Selection for seamless deletion by recombination could be achieved by growth on media containing FOA.

ii.形質転換および選択
TRECカセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra⁺形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびM2-det1（図10Cにおいて挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示した）を使用して、PCRによって分析した。これらのプライマーを使用した、TRECカセットが挿入されたゲノムのPCRによって、2.884kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応の産物をアガロースゲルで分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。 ii. Transformation and selection
The TREC cassette was introduced into a yeast strain containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate. To select individual Ura ⁺ transformants and confirm that the gene was inserted at the correct location in the donor genome, the diagnostic primers Seq-F and M2-det1 listed in Table 13 above (Figure Analysis by PCR was performed using a small unidirectional arrow on the side of the insertion site at 10C). It is considered that a 2.84 kb product was generated by PCR of the genome into which the TREC cassette was inserted using these primers. The products of the PCR reaction were separated on an agarose gel, which was visualized to confirm the correct insertion of the URA3 gene.

iii.エンドヌクレアーゼの発現の誘導、FOA選択、および評価
その後、クローンを、SG（合成のガラクトース）-Hisを含有しているプレート、およびSD-HISを含有しているプレート（グルコースを含有している）上でレプリカ培養し、24時間増殖させた。唯一の炭素源としてガラクトースを含有しているSG培地上での増殖は、GAL1プロモーターにより制御されるI-SecIエンドヌクレアーゼの発現を誘導するために行った。同じ条件下でのSD-HISプレート上での増殖は、対照として行った。エンドヌクレアーゼの発現は、ゲノムに対する相同領域のすぐ下流に位置しているカセットの内部の18bpの認識配列を切断することにより二本鎖の断裂が生じるように意図した。24時間のインキュベーション後、誘導した細胞と対照（誘導しなかった）細胞を、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、FOAを含有しているSD-HISプレート（SD-HIS＋FOA）上でレプリカ培養した。 iii. Induction of endonuclease expression, FOA selection, and evaluation. Subsequently, clones were added to plates containing SG (synthetic galactose) -His, and plates containing SD-HIS (containing glucose). ) And cultured for 24 hours. Growth on SG medium containing galactose as the sole carbon source was performed to induce expression of the I-SecI endonuclease controlled by the GAL1 promoter. Growth on SD-HIS plates under the same conditions was performed as a control. Endonuclease expression was intended to cause double-strand breaks by cleaving the 18 bp recognition sequence inside the cassette located immediately downstream of the region of homology to the genome. After 24 hours of incubation, induced cells and control (not induced) cells were selected for SD-HIS containing FOA to select cells that lost the URA3 marker as described in Example 4A. Replica culture was performed on a plate (SD-HIS + FOA).

ガラクトース誘導に提供された細胞は、SD-HIS＋FOA上で増殖させると多数のコロニーを生じた。一方、対照細胞は、数個しかコロニーを生じなかった。誘導した細胞と誘導しなかった細胞の両方からFOA耐性の単一コロニーを得るために、細胞を再度画線した。Seq-FおよびM2-det1診断用プライマー（上記表13に列挙した）を使用した診断用PCRを、選択したFOA耐性細胞が、TRECカセットが除去され、継標的遺伝子座の部分のシームレスな欠失を生じたゲノムを含むかどうかを決定するために行った。シームレスな欠失を含むゲノムのPCRによっては、0.55kbの産物が生じた。ガラクトースで誘導した細胞に由来する試験した24個のコロニー全てが、意図した改変を持つM.ゲニタリウムゲノムを含んでいた。誘導しなかった細胞からは、わずかに2つのポジティブクローンしか単離されなかった。   Cells provided for galactose induction yielded numerous colonies when grown on SD-HIS + FOA. On the other hand, only a few control cells produced colonies. Cells were re-streaked to obtain FOA resistant single colonies from both induced and non-induced cells. Diagnostic PCR using Seq-F and M2-det1 diagnostic primers (listed in Table 13 above), selected FOA resistant cells, TREC cassette removed, seamless deletion of part of the translocation target locus Was performed to determine whether the resulting genome was included. PCR of the genome containing seamless deletions resulted in a 0.55 kb product. All 24 colonies tested from cells derived with galactose contained the M. genitalium genome with the intended modification. Only two positive clones were isolated from the uninduced cells.

M.ゲニタリウムゲノムの完全性を、上記実施例4Aおよび4Bに記載したように、診断用PCR分析により試験した最初の10個の誘導したクローンおよび誘導しなかったクローンについてのMPCRによりさらに分析した。10個の試験したガラクトースで誘導したコロニーの全てに由来するDNAのPCRにより、完全なレプリコン（10種類全てのアンプリコン）が生じた。誘導しなかった細胞由来のDNAのPCRによっては、完全なレプリコンは生じなかった（現時点で示されるデータ）。これらの結果を、上記表14にまとめる。この結果は、高い効率での、酵母宿主細胞内での細菌のドナーゲノムの部分のシームレスな欠失の成功を明らかにしている。   The integrity of the M. genitalium genome was further analyzed by MPCR for the first 10 induced and uninduced clones tested by diagnostic PCR analysis as described in Examples 4A and 4B above. . PCR of DNA from all 10 tested galactose-derived colonies resulted in complete replicons (all 10 amplicons). PCR of DNA from cells that were not induced did not produce a complete replicon (data shown at present). These results are summarized in Table 14 above. This result demonstrates the success of seamless deletion of portions of the bacterial donor genome in yeast host cells with high efficiency.

iv.例示的なTREC
完全な合成のマイコプラズマ・ゲニタリウムゲノム（〜583kb）を、酵母サッカロミセス・セレビジエの中でアセンブリし、環状プラスミドとしてクローニングした。URA3/5-フルオロオロチン酸（5-FOA）対抗選択を含む標準的な遺伝学的方法によりクローニングしたゲノムを変更する試みは、酵母の中で維持した細菌ゲノムの自発的な欠失に由来する5-FOA耐性クローンの高いバックグラントを示した。ここでは、本発明者らは、高い効率で酵母の中で細菌ゲノムを正確に改変することができる方法を報告する。この方法は、2回の連続する相同組換え事象を含む。最初に、標的領域を、ノックアウトコア（18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーターの制御下にあるI-SceI遺伝子、およびURA3遺伝子）と標的部位の上流にある配列に同一であるDNA断片からなる突然変異誘発カセットで置き換える。この置き換えは、コアの側方にタンデム反復配列を生じる。2番目に、ガラクトースによりI-SceIの発現を誘導する。I-SceIは、I-SceI部位に二本鎖の断裂（DSB）を作製する。このDSBは、反復配列間での分子内相同組換えを促進し、コアの除去を導く。結果として、これはシームレスな改変を作製する。この方法は、様々なゲノムの改変に適応させることができ、したがって、酵母の中で合成のゲノムを改変および設計するための代替え方法を提供する。 iv. Exemplary TREC
The fully synthetic Mycoplasma genitalium genome (˜583 kb) was assembled in the yeast Saccharomyces cerevisiae and cloned as a circular plasmid. Attempts to alter the cloned genome by standard genetic methods, including URA3 / 5-fluoroorotic acid (5-FOA) counter-selection, stem from the spontaneous deletion of the bacterial genome maintained in yeast High background of 5-FOA resistant clones. Here we report a method that can accurately modify the bacterial genome in yeast with high efficiency. This method involves two consecutive homologous recombination events. First, the target region consists of a DNA fragment that is identical to the knockout core (18 bp I-SceI recognition site, I-SceI gene under the control of the GAL1 promoter, and the URA3 gene) and the sequence upstream of the target site Replace with mutagenesis cassette. This replacement results in a tandem repeat on the side of the core. Secondly, I-SceI expression is induced by galactose. I-SceI creates a double-strand break (DSB) at the I-SceI site. This DSB promotes intramolecular homologous recombination between repetitive sequences, leading to core removal. As a result, this creates a seamless modification. This method can be adapted to a variety of genome modifications and thus provides an alternative method for modifying and designing synthetic genomes in yeast.

材料および方法
酵母株と培地
0.6Mbのマイコプラズマ・ゲニタリウム全ゲノムYACを収容しているサッカロミセス・セレビジエ酵母株VL6-48N（MATα his3-Δ200 trpl-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14）およびW303a（MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 RAD5）を、以前に記載されたとおりに構築した（Lartigue et al.（2009）Science, 325, 1693-1696;およびGibson et al.（2008）PNAS USA, 105, 20404-20409）。酵母細胞を、標準的な富化培地（YEPD）および合成のデキストロース（SD）または合成のガラクトース（SG）最小培地（Amberg et al.（2005）Methods in yeast genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.230）中で増殖させた。5-フルオロオロチン酸（5-FOA）を補充したSD培地を使用して、URA3遺伝子の喪失を選択した（Boeke et al.（1984）Mol Gen Genet, 197, 345-346）。 Materials and Methods Yeast strains and media
Saccharomyces cerevisiae yeast strain VL6-48N (MATα his3-Δ200 trpl-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14) and W303a (MATa ade2-1 ura3-1 his3) containing 0.6 Mb Mycoplasma genitalium whole genome YAC -11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 RAD5) were constructed as previously described (Lartigue et al. (2009) Science, 325, 1693-1696; and Gibson et al. ( 2008) PNAS USA, 105, 20404-20409). Yeast cells can be prepared using standard enriched medium (YEPD) and synthetic dextrose (SD) or synthetic galactose (SG) minimal medium (Amberg et al. (2005) Methods in yeast genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 230). SD media supplemented with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) was used to select for loss of the URA3 gene (Boeke et al. (1984) Mol Gen Genet, 197, 345-346).

突然変異誘発カセットの産生
全てのプライマーは特注で合成した（Integrated DNA Technologies）。60bpより長いプライマーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。全ての突然変異誘発カセットの構築に使用したプライマーを表13にまとめる。URA3遺伝子（1,066bp）をプラスミドpRS306（Sikorski and Hieter（1989）Genetics, 122, 19-27）から増幅した。GAL1プロモーター（450bp）は、プラスミドpYES2（Invitrogen）から増幅した。GAL1プロモーターとI-SceI遺伝子を含む1,184bpの断片は、プラスミドpGSKU（Storici et al.（2003）PNAS USA., 100, 14994-14999）から増幅した。そして、Creリコンビナーゼ遺伝子（1,032bp）は、プラスミドpBS185（Sauer and Henderson（1990）New Biologist 2, 441-449）から増幅した。 Production of mutagenesis cassettes All primers were custom synthesized (Integrated DNA Technologies). Primers longer than 60 bp were purified by polyacrylamide gel electrophoresis. The primers used for construction of all mutagenesis cassettes are summarized in Table 13. The URA3 gene (1,066 bp) was amplified from plasmid pRS306 (Sikorski and Hieter (1989) Genetics, 122, 19-27). The GAL1 promoter (450 bp) was amplified from the plasmid pYES2 (Invitrogen). A 1,184 bp fragment containing the GAL1 promoter and the I-SceI gene was amplified from the plasmid pGSKU (Storici et al. (2003) PNAS USA., 100, 14994-14999). The Cre recombinase gene (1,032 bp) was amplified from plasmid pBS185 (Sauer and Henderson (1990) New Biologist 2, 441-449).

全てのPCRは、Takara Ex Taq DNAポリメラーゼ（Takara Bio Inc.）を用いて、製造業者が推奨する条件を使用して行った。遺伝子の融合は、重要ではない改変を加えて組換えPCR技術（Shevchuk et al.（2004）Nucleic Acids Res, 32, e19）によって行った。PCRによる融合のそれぞれの場合において、相補性末端を40bp重複させた（表13）。それぞれの最終的な突然変異誘発カセットを作製するために、融合産物を、キメラプライマー（それぞれが、標的部位に対する50bpの相同性を含む）により再度PCR増幅した（表13）。   All PCRs were performed using Takara Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio Inc.) using conditions recommended by the manufacturer. Gene fusion was performed by recombinant PCR technology (Shevchuk et al. (2004) Nucleic Acids Res, 32, e19) with minor modifications. In each case of PCR fusion, the complementary ends were overlapped by 40 bp (Table 13). To create each final mutagenesis cassette, the fusion products were PCR amplified again with chimeric primers, each containing 50 bp homology to the target site (Table 13).

中央に点線を含むプライマーはキメラ構造である。小文字は、M.ゲニタリウム相同配列を示す。大文字は、非相同配列を示す。そして、I-SceI切断部位に下線をつける。   The primer containing a dotted line in the center has a chimeric structure. Lower case letters indicate M. genitalium homologous sequences. Uppercase letters indicate non-homologous sequences. And the I-SceI cleavage site is underlined.

形質転換およびPCR分析
酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を、公開されている方法に従って行った（Gietz et al.（1992）Nucleic Acids Res, 20, 1425）。2〜3μgの組込み型構築物DNAと、25μgのキャリアDNA（サケの***DNA、Sigma）を、日常的に行う実験において使用した。PCR分析のための酵母からの全DNAの単離は、公開されているプロトコールに従って行った（Kouprina and Larionov.（2008）Nat Protoc, 3, 371-377）。それぞれの突然変異誘発カセットの正確な組込みを、標的部位の上流および下流に位置するプライマー（表13）を使用したPCRにより確認した。マルチプレックスPCRを、以前に記載されたとおりに（Gibson et al.（2008）PNAS USA, 105, 20404-20409）M.ゲニタリウムクローンの完全性を確認するために使用した。マルチプレックスPCRに使用したプライマーのセット（セット3）は、およそ60kbごとにM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように分布させた10種類のアンプリコン（0.1kbの増分で、125bp〜1025bpまでの範囲）を生じるように設計した（Gibson et al.（2008）PNAS USA, 105, 20404-20409）。 Transformation and PCR analysis Integration transformation with lithium acetate was performed according to published methods (Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res, 20, 1425). 2-3 μg of integrative construct DNA and 25 μg of carrier DNA (salmon sperm DNA, Sigma) were used in routine experiments. Isolation of total DNA from yeast for PCR analysis was performed according to published protocols (Kouprina and Larionov. (2008) Nat Protoc, 3, 371-377). The correct integration of each mutagenesis cassette was confirmed by PCR using primers (Table 13) located upstream and downstream of the target site. Multiplex PCR was used to confirm the integrity of the M. genitalium clone as previously described (Gibson et al. (2008) PNAS USA, 105, 20404-20409). The set of primers used for multiplex PCR (set 3) consisted of 10 amplicons distributed around the M. genitalium genome approximately every 60 kb (ranging from 125 bp to 1025 bp in 0.1 kb increments) (Gibson et al. (2008) PNAS USA, 105, 20404-20409).

結果
伝統的な方法により酵母の中で維持した合成のM.ゲニタリウムゲノムのMG259遺伝子座中の点変異の変更には、2つの相同組換え事象が関係していた（図12A）。最初の相同組換えの後、合成のゲノム中の標的領域のURA3遺伝子での正確な置き換えを、PCRにより確認した。しかし、2回目の相同組換え後は、本発明者らは、5-FOA耐性コロニーからのPCRスクリーニングによっては、DNAセグメントでのURA3遺伝子の正確な置き換えを同定することはできなかった（図12Bおよび表15）。 Results Altering point mutations in the MG259 locus of the synthetic M. genitalium genome maintained in yeast by traditional methods involved two homologous recombination events (Figure 12A). After the initial homologous recombination, the correct replacement of the target region in the synthetic genome with the URA3 gene was confirmed by PCR. However, after the second homologous recombination, we were unable to identify the exact replacement of the URA3 gene in the DNA segment by PCR screening from 5-FOA resistant colonies (FIG. 12B). And Table 15).

（表１５）酵母中でのM.ゲニタリウムゲノムの変更におけるいくつかの酵母DNA改変方法の効率

Table 15 Efficiency of several yeast DNA modification methods in modifying the M. genitalium genome in yeast

特有のPCRプライマーのセットを、正確な置き換えについてFOA＋クローンを分析するために使用した。10種類のプライマー対を、マルチプレックスPCR分析に使用した。10種類全てのアンプリコンの産生を完全なゲノムと考えた。   A unique set of PCR primers was used to analyze FOA + clones for correct replacement. Ten primer pairs were used for multiplex PCR analysis. The production of all 10 amplicons was considered a complete genome.

これらの結果は、正確な相同組換えが、入ってきたDNA断片と標的部位との間では起こらなかったことを示唆している。URA3マーカーの喪失は、予想しなかった欠失が原因である可能性がある。酵母の中で環状YACとして増殖させたM.ゲニタリウムゲノムは、ヒスチジン栄養要求性を除き、その宿主と機能相補を有さない。細菌ゲノム中の任意の欠失および再構成は、おそらく、酵母の生存能力にとっては無害である。マルチプレックスPCRを、酵母の中でのM.ゲニタリウムゲノムの完全性を評価するために使用した。プライマーのセットは、およそ60kbごとにM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように分布させた10種類のアンプリコン（0.1kbの増分で、125bpから1025bpまでの範囲）を生じるように設計した。22個の5-FOA耐性コロニーから調製した全DNAは10種類全てのアンプリコンを生じなかった（図12C）。2種類のアンプリコン（0.525kbおよび0.625kb（M.ゲニタリウムゲノムに隣接する）は、全てのクローンにおいて欠けていた。MG259遺伝子座は、0.65kbのアンプリコンの上流3kbに位置する。この結果は、いくつかの自発的欠失または再構成が、酵母の中で増殖させたM.ゲニタリウムゲノムの中で起こったことを示す。URA3マーカーの喪失は、M.ゲニタリウムゲノム中の反復配列間での相同組換えにより生じた可能性がある。結果として、URA3マーカーの欠失を持つ細胞は、5-FOA培地上で生存することができた。URA3遺伝子の非特異的喪失の可能性は、入ってきたDNA断片によるURA3の置き換えの可能性よりも高い（図12D）。本発明者らはまた、同じ遺伝子座を変更するために2つの他の方法を利用し、完全欠失（delitto perfetto）法またはタンデム反復ポップアウト法（図1OAおよび10Bに概説するストラテジー）によりそれぞれ、点突然変異または450bpの欠失を得た。しかし、本発明者らは、5-FOA耐性コロニーをスクリーニングするPCRによっては、正確な改変を全く同定できなかった（表15）。したがって、本発明者らは、5-FOA耐性コロニーのほとんどが、一連の操作の間にURA3マーカーを非特異的に喪失した細胞に由来すると結論付けた。   These results suggest that exact homologous recombination did not occur between the incoming DNA fragment and the target site. The loss of the URA3 marker may be due to an unexpected deletion. The M. genitalium genome grown as a circular YAC in yeast does not have functional complementation with its host, except for histidine auxotrophy. Any deletions and rearrangements in the bacterial genome are probably harmless for yeast viability. Multiplex PCR was used to assess the integrity of the M. genitalium genome in yeast. The primer set was designed to generate 10 amplicons (ranging from 125 bp to 1025 bp in 0.1 kb increments) distributed around the M. genitalium genome approximately every 60 kb. Total DNA prepared from 22 5-FOA resistant colonies did not produce all 10 amplicons (FIG. 12C). Two amplicons (0.525 kb and 0.625 kb (adjacent to the M. genitalium genome) were missing in all clones. The MG259 locus is located 3 kb upstream of the 0.65 kb amplicon. Indicates that some spontaneous deletions or rearrangements occurred in the M. genitalium genome grown in yeast, and the loss of the URA3 marker is a repetitive sequence in the M. genitalium genome. As a result, cells with deletion of the URA3 marker were able to survive on 5-FOA medium, possibly nonspecific loss of the URA3 gene Is higher than the possibility of replacement of URA3 by the incoming DNA fragment (Fig. 12D) We also used two other methods to alter the same locus, using complete deletion ( delitto perfetto) method or tandem iterative pop-out method (Strategies outlined in FIGS. 1OA and 10B) resulted in point mutations or deletions of 450 bp, respectively, but we did not make any exact modifications by PCR screening 5-FOA resistant colonies. (Table 15) Therefore, we concluded that most of the 5-FOA resistant colonies were derived from cells that lost the URA3 marker nonspecifically during a series of manipulations.

2つのタンデム反復間での組換えの頻度は、標的部位付近でのDSBの導入により大幅に増強され得た。したがって、本発明者らは、2つのストラテジー（タンデム反復ポップアウト法と完全欠失（delitto perfetto）法）を組み合わせた。突然変異誘発構築物を、コアカセットを標的部位の上流の358bpのDNAと融合させることにより作製した。この構築物による450bpの標的領域の置き換えにより、I-SceI認識部位を含む、コアを含む2つの反復配列が生じたと考えられる（図13）。その後、上記反復間での相同組換えにより、シームレスな欠失が生じたと考えられる。酵母の中での突然変異誘発構築物の形質転換後、I-SceIエンドヌクレアーゼの発現を、SG-マイナスHIS寒天上で誘導した。24時間のインキュベーション後、細胞を、SD-マイナスHIS＋5-FOA寒天上でレプリカ培養した。ガラクトースで誘導した細胞は、誘導しなかった細胞よりもSD-HIS＋5-FOA寒天上で有意に多いコロニーを生じた（データは示さず）。誘導した細胞に由来する5-FOA耐性細胞と、誘導しなかった細胞に由来する5-FOA耐性細胞の両方を、再び画線し、単一コロニーを選択し、分析した。正確な欠失を持つ形質転換体をPCRにより同定した。コアカセットが正確に除去されたDNAは、0.55kbのアンプリコンの生成を生じたと考えられる。ガラクトースで誘導した細胞由来の24個のコロニー全てが、M.ゲニタリウムゲノムの正確な改変を含んでいた。誘導しなかった細胞由来のコロニーからは、わずかに2個のポジティブクローンしか単離されなかった（データは示さず）。M.ゲニタリウムのゲノムの完全性を、マルチプレックスPCRによりさらに評価した。試験した10個の誘導したクローン由来のDNAは、10種類のアンプリコンの完全なセットを生じた。誘導しなかった細胞由来のDNAは、10種類のアンプリコンの完全なセットを生じなかった（データは示さず）。したがって、いずれのPCR分析による結果も、TREC法により、酵母にクローニングした細菌ゲノムにシームレスな欠失を高い効率で行うことができることを示している（表15）。   The frequency of recombination between two tandem repeats could be greatly enhanced by the introduction of DSB near the target site. Therefore, we combined two strategies: tandem iterative popout method and deletto perfetto method. A mutagenesis construct was made by fusing the core cassette with 358 bp DNA upstream of the target site. Replacement of the 450 bp target region with this construct would have resulted in two repetitive sequences containing the core, including the I-SceI recognition site (FIG. 13). Thereafter, it is considered that seamless deletion occurred due to homologous recombination between the above repeats. After transformation of the mutagenic construct in yeast, expression of I-SceI endonuclease was induced on SG-minus HIS agar. After 24 hours of incubation, cells were replica cultured on SD-minus HIS + 5-FOA agar. Cells induced with galactose yielded significantly more colonies on SD-HIS + 5-FOA agar than cells not induced (data not shown). Both 5-FOA resistant cells derived from induced cells and 5-FOA resistant cells derived from non-induced cells were streaked again and single colonies were selected and analyzed. Transformants with the correct deletion were identified by PCR. DNA from which the core cassette was correctly removed is thought to have produced a 0.55 kb amplicon. All 24 colonies from cells induced with galactose contained the correct modification of the M. genitalium genome. Only two positive clones were isolated from colonies from cells that were not induced (data not shown). The genomic integrity of M. genitalium was further assessed by multiplex PCR. DNA from the 10 derived clones tested yielded a complete set of 10 amplicons. DNA from cells that were not induced did not yield a complete set of 10 amplicons (data not shown). Therefore, the results of any PCR analysis show that seamless deletion can be carried out with high efficiency in the bacterial genome cloned in yeast by the TREC method (Table 15).

最後に、TREC法の効率を、酵母にクローニングした細菌ゲノム中の欠失について、Cre-loxPシステムの効率と比較した。Cre-loxPシステムは、効率の高い部位特異的組換え法である。これは、広範囲の生物において、選択マーカーおよび大きなゲノムDNAセグメントを除去するためにうまく使用されている（Gueldener et al.（2002）Nucleic Acids Res, 30, e23）。突然変異誘発構築物を、2回のPCRにより作製した（Materials and Methods）。これは、URA3マーカー、GAL1プロモーターの制御下にあるCre遺伝子、および標的部位に対して相同である2つの末端配列が側方にある2つの突然変異loxP部位から構成されていた（図15）。上記loxP部位は、逆組換え事象を妨害する（Araki, et al.（1997）Nucleic Acids Res, 25, 868-872）   Finally, the efficiency of the TREC method was compared to the efficiency of the Cre-loxP system for deletions in the bacterial genome cloned in yeast. The Cre-loxP system is an efficient site-specific recombination method. This has been successfully used in a wide range of organisms to remove selectable markers and large genomic DNA segments (Gueldener et al. (2002) Nucleic Acids Res, 30, e23). Mutagenesis constructs were made by two rounds of PCR (Materials and Methods). It consisted of a URA3 marker, a Cre gene under the control of the GAL1 promoter, and two mutant loxP sites flanked by two terminal sequences that are homologous to the target site (FIG. 15). The loxP site prevents reverse recombination events (Araki, et al. (1997) Nucleic Acids Res, 25, 868-872)

先に改変した同じ領域を、この構築物により標的化した。同様の手順と分析を、部位特異的欠失を生じさせ、検出するために行った。PCR分析は、5-FOA耐性単離物の93％（28/30）が所望する欠失を含むことを示し、マルチプレックスPCRの結果は、正確な欠失を持つ単離物の100％（4/4）が完全なM.ゲニタリウムゲノムを含むことを示唆していた（表15）。結論として、TREC法の効率は、酵母にクローニングしたM.ゲニタリウムゲノムの変更においては、Cre-loxPシステムの効率に匹敵する。   The same region previously modified was targeted by this construct. Similar procedures and analyzes were performed to generate and detect site-specific deletions. PCR analysis shows that 93% (28/30) of 5-FOA resistant isolates contain the desired deletion and multiplex PCR results show that 100% of isolates with the correct deletion ( 4/4) suggested that it contained the complete M. genitalium genome (Table 15). In conclusion, the efficiency of the TREC method is comparable to that of the Cre-loxP system in modifying the M. genitalium genome cloned in yeast.

シームレスなゲノムの変更には、多くの場合、それについて選択することができ、その後に除去することができる対抗選択マーカーが必要である。対抗選択URA3/5-FOAシステムを採用するいくつかの既存の方法について、酵母の染色体中での改変の成功が報告されている（Rothstein（1991）Methods Enzymol, 194, 281-301）。しかし、本発明者らは、これらの方法が、酵母の中でエピソームとして維持されたM.ゲニタリウムゲノムを変更するためには適していないことを示した。合成のM.ゲニタリウムゲノムは、そのゲノムが4％までの反復配列を含む場合でもなお、酵母の中で安定に維持されることが示されている（Peterson et al.（1995）PNAS USA, 92, 11829-11833）。したがって、自発的な欠失または再構成が、酵母を維持する間に低い頻度で起こる可能性が依然存在する。これは、一連の操作の間に望ましくないURA3ネガティブクローンを生じる可能性があり、したがって、部位特異的突然変異誘発についての5-FOA選択を複雑にする。   Seamless genomic alterations often require a counter-selectable marker that can be selected for and then removed. Several existing methods employing the counter-selective URA3 / 5-FOA system have been reported to have been successfully modified in the yeast chromosome (Rothstein (1991) Methods Enzymol, 194, 281-301). However, the inventors have shown that these methods are not suitable for altering the M. genitalium genome maintained as an episome in yeast. The synthetic M. genitalium genome has been shown to remain stable in yeast even when the genome contains up to 4% repeat sequences (Peterson et al. (1995) PNAS USA, 92, 11829-11833). Thus, there still remains a possibility that spontaneous deletions or rearrangements will occur less frequently while maintaining the yeast. This can result in undesirable URA3 negative clones during a series of operations, thus complicating 5-FOA selection for site-directed mutagenesis.

本発明者らは、TREC法により、酵母の中でM.ゲニタリウムゲノムのシームレスな改変を効率よく作製することができることを明らかにした。これは、わずかに1回しか形質転換を必要とせず、他の種の改変（挿入、遺伝子の置き換え、または点突然変異）にも適応できる単純な方法である。突然変異誘発構築物の調製には、1日未満しか要さない。実際、本発明者らは、融合反応を行うよりもむしろ、互いに50bpの重複を持つコアカセットと反復断片の同時形質転換が、正確な遺伝子の置き換えを得るには十分であることを見出した（データは示さず）。TREC法を使用する場合の相同組換えのこの高い頻度は主に、原則として全ての細胞が、DSBの誘導の間に修復に従事していること、および修復物質（反復配列およびDSB）が非常に近位にあることの事実に大きく起因する。TRECの性能は、Cre/loxPシステムに匹敵する。しかし、TRECは痕跡を残さないので、ゲノムの変更においてはCre/loxPシステムよりも有益である。最近、MIRAGEと呼ばれる新しい方法が、酵母ゲノムのシームレスな改変を高い効率で生じることが示された。この方法は、2つの短いタンデム反復が側方にある、標的部位付近の逆位反復配列の導入に基づく。不安定な逆位反復配列は、2つのタンデム反復の間の除去を大幅に促進する。しかし、逆位反復配列はまた、複製のずれが原因で、不正確な欠失の問題が起こる可能性を導入する（Gordenin et al.（1992）PNAS USA, 89, 3785-3789）。MIRAGE法を使用する別の欠点は、2日間の準備が必要であるとの理由から、ノックアウト構築物の作製に時間がかかることである。   The present inventors have revealed that seamless modification of the M. genitalium genome can be efficiently produced in yeast by the TREC method. This is a simple method that requires only one transformation and can be adapted to other species modifications (insertion, gene replacement, or point mutation). Preparation of the mutagenesis construct takes less than a day. In fact, rather than performing a fusion reaction, the inventors have found that co-transformation of a core cassette and repeat fragments with 50 bp overlap with each other is sufficient to obtain accurate gene replacement ( Data not shown). This high frequency of homologous recombination when using the TREC method is mainly due to the fact that, in principle, all cells are engaged in repair during the induction of DSB, and the repair material (repeat sequence and DSB) is very Largely due to the fact of being proximal to. TREC performance is comparable to Cre / loxP systems. However, TREC does not leave a trace, so it is more beneficial than Cre / loxP system for genome modification. Recently, a new method called MIRAGE has been shown to produce seamless modification of the yeast genome with high efficiency. This method is based on the introduction of an inverted repeat near the target site with two short tandem repeats to the side. An unstable inverted repeat greatly facilitates removal between two tandem repeats. However, inverted repeats also introduce the possibility of inaccurate deletion problems due to replication slippage (Gordenin et al. (1992) PNAS USA, 89, 3785-3789). Another disadvantage of using the MIRAGE method is that it takes time to make the knockout construct because it requires two days of preparation.

YACとして持つ変更した細菌ゲノムをそのもともとの細胞に導入して戻すことにより、遺伝子および遺伝子クラスターの機能ならびに調節を決定することができる（Vrancic et al.（2008）Food Tech Biotechnol 46, 237-251）。シームレスな改変が、YACを変更する好ましい手段である。なぜなら、変更した部位に残っているさらなる配列が、予期しない結果を引き起こす可能性があるからである。さらに、多くの高等真核細胞の染色体は、高い割合で反復配列を含む。本明細書中に記載する方法は、酵母にクローニングしたそれらの遺伝子を改変するために有利であるはずである。本発明者らはまた、この方法を、酵母にクローニングしたマイコプラズマ・ミコイデスラージコロニー（M.ミコイデスLC）ゲノム中のIII型制限酵素のシームレスな欠失を作製するために適用した。正確な欠失を配列決定により確認した。その後のゲノムの移植により、この生物中の限られた遺伝学的ツールが原因で、宿主細胞中で作製することが困難である、ゲノムの欠失を持つM.ミコイデスLC株を作製した（Lartigue et al.（2009）Science, 325:1693）。酵母は、M.ゲニタリウムの全ゲノムのアセンブリのための宿主として成功が実証されている。TRECは、合成の細胞を作製するために使用することができる合成のゲノムを設計するための相補的な手段を提供する。   The function and regulation of genes and gene clusters can be determined by introducing the modified bacterial genome as YAC back into its original cell (Vrancic et al. (2008) Food Tech Biotechnol 46, 237-251 ). Seamless modification is the preferred means of changing the YAC. This is because additional sequences remaining at the altered site can cause unexpected results. In addition, many higher eukaryotic cell chromosomes contain a high percentage of repetitive sequences. The methods described herein should be advantageous for modifying those genes that have been cloned into yeast. We have also applied this method to create a seamless deletion of type III restriction enzymes in the Mycoplasma mycoides large colony (M. mycoides LC) genome cloned in yeast. The exact deletion was confirmed by sequencing. Subsequent genome transplantation produced a M. mycoides LC strain with a genomic deletion that was difficult to produce in host cells due to limited genetic tools in this organism (Lartigue et al. (2009) Science, 325: 1693). Yeast has proven successful as a host for assembly of the entire genome of M. genitalium. TREC provides a complementary means for designing synthetic genomes that can be used to create synthetic cells.

酵母の使用により、大腸菌を上回る利点がもたらされる。なぜなら、大腸菌においては、300kbより大きい外来DNAのクローニングはあまり一般的ではなく、これがその適用を制限するからである。一方、酵母細胞は、メガ塩基対のクローニングの能力を提供する。   The use of yeast provides advantages over E. coli. This is because, in E. coli, cloning of foreign DNA larger than 300 kb is not very common and this limits its application. Yeast cells, on the other hand, provide the ability to clone megabase pairs.

実施例4D
Cre-LoxP改変システム
比較のために、細菌ゲノムの改変のための公知の改変システムであるCre-loxPシステムを、酵母宿主細胞中で同じ細菌ゲノムを改変するために使用した。Cre-loxPシステムは、多数の様々な生物の中で選択マーカーおよび大きなゲノムDNAセグメントを除去するためにうまく使用されている、公知の効率的な部位特異的組換え方法である。Gueldener et al., Nucleic Acids Res, 30, e23（2002）を参照のこと。 Example 4D
Cre-LoxP modification system For comparison, the Cre-loxP system, a known modification system for modification of bacterial genomes, was used to modify the same bacterial genome in yeast host cells. The Cre-loxP system is a known efficient site-specific recombination method that has been successfully used to remove selectable markers and large genomic DNA segments in many different organisms. See Gueldener et al., Nucleic Acids Res, 30, e23 (2002).

突然変異体loxP遺伝子を持つCre-loxP突然変異誘発構築物を、先の実施例に記載したように、2回のPCR反応により産生した。loxPの突然変異は、Araki, K.et al., Nucleic Acids Res, 25, 868-872（1997）に記載されているように、逆の組換え事象を妨げる。   A Cre-loxP mutagenesis construct with a mutant loxP gene was produced by two PCR reactions as described in the previous examples. The loxP mutation prevents reverse recombination events as described in Araki, K. et al., Nucleic Acids Res, 25, 868-872 (1997).

i.Cre-loxPカセットの作製
loxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE突然変異誘発カセットを、Cre-FおよびCre-Rプライマー（表13）を使用してプラスミドpBS185（Sauer and Henderson.New Biologist 2, 441-449（1990））から増幅したCreリコンビナーゼ遺伝子のORF断片（1,032bp）、プライマーGal-FおよびGal-R（表13）を使用してプラスミドpYES2（Invitrogen, Carlsbad, CA））から増幅したGAL1プロモーター（450bp）、およびUra-FプライマーおよびUra-Rプライマー（表13）を使用して先の実施例に記載したようにPCRにより産生した1066bpのURA3遺伝子断片を使用して得た。 i.Cre-loxP cassette production
The loxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE mutagenesis cassette was prepared using plasmid pBS185 (Sauer and Henderson. New Biologist 2, 441-449) using Cre-F and Cre-R primers (Table 13). 1990)), the GAL1 promoter (450 bp) amplified from the plasmid pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Using the ORF fragment (1,032 bp) of the Cre recombinase gene amplified from the primer Gal-F and Gal-R (Table 13). ), And the 1066 bp URA3 gene fragment produced by PCR as described in the previous example using Ura-F and Ura-R primers (Table 13).

Gal1-Cre-URA3融合産物を、Cre-Fus2プライマーおよびCre-Fus4プライマー（表13）を使用したPCR融合を使用して作製し、突然変異loxP部位を、GAL1-Cre-URA3融合産物と突然変異LoxP部位に対する相同部分を含むキメラプライマーLox-FおよびLox-R（表13）を使用した融合産物の増幅により導入した。この増幅により、LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE融合産物を作製した。その後、この融合産物を、上記表13に列挙したInt-F2プライマーとInt-R2プライマーを使用して増幅した。その表に示したように、これらのプライマーにはそれぞれ、LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE融合産物に対する相同性と、5'の50塩基対（bp）の標的領域に相同であるセグメント（小文字）を含めた。   Gal1-Cre-URA3 fusion products were generated using PCR fusion using Cre-Fus2 and Cre-Fus4 primers (Table 13), and mutant loxP sites were mutated with GAL1-Cre-URA3 fusion products It was introduced by amplification of the fusion product using chimeric primers Lox-F and Lox-R (Table 13) containing homologous portions to the LoxP site. This amplification produced a LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE fusion product. The fusion product was then amplified using the Int-F2 and Int-R2 primers listed in Table 13 above. As shown in the table, each of these primers is homologous to the LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE fusion product and to the 5 '50 base pair (bp) target region. A segment (lowercase) was included.

得られたLoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE突然変異誘発カセット（図10Dに説明する）には、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の上流）、第1のloxP部位（loxP-RE）、GAL1プロモーター、Creリコンビナーゼ遺伝子のORF、URA3マーカー、第2のloxP部位（loxP-LE）、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性（1塩基欠失の下流）を含めた。したがって、このカセットは、これで酵母宿主細胞を形質転換すると、このカセット内のM.ゲニタリウムゲノムのCDS139遺伝子座内の450塩基対の標的領域の置き換え（HRによる）により、ガラクトース上での増殖による同じカセットからCreの発現の誘導によって組換えおよび欠失を標的するように誘導することができるloxP部位を含む一つの領域が、ゲノム中に生じるように、設計した。URA3マーカーを含むカセットの欠失は、FOA培地上での増殖により選択することができた。   The resulting LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE mutagenesis cassette (described in FIG. 10D) has a 50 bp homology (1 base deletion) to the 5 ′ portion of the target region in the following order: 50 bp homology to the first loxP site (loxP-RE), GAL1 promoter, Cre recombinase gene ORF, URA3 marker, second loxP site (loxP-LE), and 3 'part of the target region Sex (downstream of single base deletion) was included. Thus, the cassette now grows on galactose upon transformation of a yeast host cell by replacement (by HR) of a 450 base pair target region within the CDS139 locus of the M. genitalium genome within this cassette. Was designed so that one region containing a loxP site that could be induced to target recombination and deletion by inducing expression of Cre from the same cassette. Deletion of the cassette containing the URA3 marker could be selected by growth on FOA medium.

ii.形質転換および選択
loxP-Creカセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra⁺形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、診断用プライマーSeq-FおよびM2-det1（図10Dにおいて挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示し、表13に列挙した）を使用して、PCRによって分析した。loxP-Creカセットが挿入されたゲノムのこのPCRによって、3.068kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応の産物をアガロースゲルで分離し、これを、上記カセットの正確な挿入を確認するために視覚化した。 ii. Transformation and selection
The loxP-Cre cassette was introduced into yeast strains containing the M. genitalium genome using integrative transformation with lithium acetate. To select individual Ura ⁺ transformants and confirm that the gene was inserted at the correct location in the donor genome, the diagnostic primers Seq-F and M2-det1 (on the side of the insertion site in FIG. 10D) Were analyzed by PCR using a small unidirectional arrow on the side and listed in Table 13). This PCR of the genome with the loxP-Cre cassette inserted seems to have produced a 3.068 kb product. The products of the PCR reaction were separated on an agarose gel, which was visualized to confirm the correct insertion of the cassette.

iii.エンドヌクレアーゼの発現の誘導、FOA選択、および評価
その後、クローンを、SG（合成のガラクトース）-Hisを含有しているプレート、およびSD-HISを含有しているプレート（グルコースを含有している）上でレプリカ培養し、24時間増殖させた。唯一の炭素源としてガラクトースを含有しているSG培地上での増殖は、GAL1プロモーターにより制御されるCreリコンビナーゼの発現を誘導するために行った。リコンビナーゼの発現は、カセットの内部のLoxP部位で組換えを誘導するように意図した。誘導後、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、細胞を、FOAを含有しているSD-HISプレート（SD-HIS＋FOA）上でレプリカ培養した。 iii. Induction of endonuclease expression, FOA selection, and evaluation. Subsequently, clones were added to plates containing SG (synthetic galactose) -His, and plates containing SD-HIS (containing glucose). ) And cultured for 24 hours. Growth on SG medium containing galactose as the sole carbon source was performed to induce the expression of Cre recombinase controlled by the GAL1 promoter. Recombinase expression was intended to induce recombination at the LoxP site inside the cassette. After induction, cells were replica cultured on SD-HIS plates containing FOA (SD-HIS + FOA) to select cells that lost the URA3 marker as described in Example 4A.

5-FOA耐性コロニーについて、選択したFOA耐性細胞が、カセットが除去されて標的遺伝子座の部分のシームレスな欠失を生じたゲノムを含むかどうかを決定するために、Seq-FプライマーおよびM2-det1プライマー（表13）を使用して診断用PCR（実施例4A〜Cに記載したとおり）を行った。表14に示したように、結果は、試験した5-FOA耐性単離物のうちの93％（28/30）が所望する欠失を含むことを示した。   For 5-FOA resistant colonies, to determine whether the selected FOA resistant cells contain a genome from which the cassette has been removed resulting in a seamless deletion of a portion of the target locus, the Seq-F primer and M2- Diagnostic PCR (as described in Examples 4A-C) was performed using the det1 primer (Table 13). As shown in Table 14, the results indicated that 93% (28/30) of the 5-FOA resistant isolates tested contained the desired deletion.

M.genitaliumゲノムの完全性を、上記実施例4Aおよび4Bに記載したように、診断用PCR分析によりポジティブと試験した4個のクローンついて、MPCRによりさらに分析した。上記表14に示したように、これらのコロニーのうちの100％（4/4）が10種類のアンプリコンを全て含み、このことは、ゲノムの完全性が明らかにしている。   The integrity of the M. genitalium genome was further analyzed by MPCR on 4 clones tested positive by diagnostic PCR analysis as described in Examples 4A and 4B above. As shown in Table 14 above, 100% (4/4) of these colonies contain all 10 amplicons, revealing genomic integrity.

実施例4Cおよび4Dに示した研究による結果は、酵母宿主細胞中でのマイコプラズマゲノムの改変について、提供するTREC法（これは、1回の形質転換により行うことができ、欠失、挿入、遺伝子の置き換え、および点変異に適応することができる簡単な方法である）の効率が、周知のcre-loxP改変方法の効率に等しく、それよりも高くないことを示した。しかし、Cre-loxP法とは異なり、TREC法によっては、シームレスな改変も生じ、これによりこの方法は特に有効となる。   The results from the studies shown in Examples 4C and 4D show that the TREC method provided for modification of the mycoplasma genome in yeast host cells (this can be done by a single transformation, deletion, insertion, gene The efficiency of the replacement and the simple method that can be adapted to point mutations is equal to and not higher than that of the well-known cre-loxP modification method. However, unlike the Cre-loxP method, the TREC method also produces a seamless modification, which makes this method particularly effective.

実施例5
宿主細胞へのドナーゲノムの移入、宿主細胞内でのTRECによる改変、およびレシピエント細胞への移植
本実施例は、宿主細胞へのドナーゲノムの移入、宿主細胞内でのドナーゲノムの改変（TREC改変）、およびドナーゲノムのレシピエント細胞への移植のための、本提供の方法の組み合わせを使用するドナーゲノムの操作を記載する。上記方法を、研究室また自然界のいずれにもこれまで存在していなかった酵母の中でM.ミコイデスLCゲノムをうまく変更するために使用した。以下に記載するように、III型制限酵素遺伝子を、酵母宿主にクローニングしたドナーであるM.ミコイデスLCゲノムから欠失させた。III型制限酵素遺伝子を、これが生存能力および移植に必須ではないと予想したので選択した。その後、改変したゲノムをM.カプリコルムレシピエント細胞に移植し、これにより、改変された全ゲノムを含有している新しい細胞を作製した。 Example 5
Transfer of donor genome to host cell, modification by TREC in host cell, and transplantation to recipient cell This example shows transfer of donor genome to host cell, modification of donor genome in host cell (TREC Modifications) and manipulation of the donor genome using a combination of the provided methods for transplantation of the donor genome into recipient cells is described. The above method was used to successfully modify the M. mycoides LC genome in yeast that had never existed in the laboratory or in nature. As described below, the type III restriction enzyme gene was deleted from the donor M. mycoides LC genome cloned into the yeast host. The type III restriction enzyme gene was selected because it was not expected to be essential for viability and transplantation. The modified genome was then transplanted into M. capricolum recipient cells, thereby creating new cells containing the entire modified genome.

実施例5A
ドナーゲノムの宿主への移入およびゲノムの改変
M.ミコイデスLC-YCpゲノムを、上記実施例1Aに記載したように、酵母株W303aに導入し、その中で増殖させた。 Example 5A
Transfer of donor genome into host and modification of genome
The M. mycoides LC-YCp genome was introduced into and grown in yeast strain W303a as described in Example 1A above.

一つの例においては、III型制限酵素遺伝子を、URA3マーカーを含むカセットで置き換えた。続いてこれを、上記実施例4Cに記載したTREC法を使用して、5-フルオロオロチン酸（5-FOA）選択により除去した。図11に模式的に説明するこのプロセスのために、TRECノックアウトカセットを、以下の詳細を用いて上記実施例4Cに記載したように、PCR融合により作製した。最初に、コアカセット（GAL1遺伝子、SceI遺伝子、およびURA3マーカーをこの順序で含む）を作製した。   In one example, the type III restriction enzyme gene was replaced with a cassette containing the URA3 marker. This was subsequently removed by 5-fluoroorotic acid (5-FOA) selection using the TREC method described in Example 4C above. For this process schematically illustrated in FIG. 11, a TREC knockout cassette was made by PCR fusion as described in Example 4C above with the following details. First, a core cassette (containing GAL1 gene, SceI gene, and URA3 marker in this order) was made.

タンデム反復配列（TRS）断片もまた、PCRによって作製した。この断片には、III型制限酵素標的遺伝子座の上流に、M.ミコイデスLCゲノムの一部分に対する相同性を含めた。TRS断片と、標的領域の上流にあるゲノム中の対応する相同部分を、図11の中で大きな水平方向の矢印で示す。組換えによる上記カセットのポップアウトを容易にするために、相同組換えによりゲノムに上記カセットが組込まれた後にゲノム中にタンデム反復が存在するように、TRS断片を含めた。   Tandem repeat (TRS) fragments were also generated by PCR. This fragment included homology to a portion of the M. mycoides LC genome upstream of the type III restriction enzyme target locus. The TRS fragment and the corresponding homologous portion in the genome upstream of the target region are indicated by large horizontal arrows in FIG. In order to facilitate the pop-out of the cassette by recombination, a TRS fragment was included so that tandem repeats were present in the genome after the cassette was integrated into the genome by homologous recombination.

コアカセットを、上記実施例4に記載したように、融合PCRによってTRS断片に融合させた。融合プライマーを、コアカセットを使用したPCRにおいて鋳型として使用し、別のPCRにおいてはTRS断片を鋳型として使用した。その後、産物を合わせて一つにし、これらの産物を連結させるためのプライマーレスPCRを行った。その後、得られた融合産物を、コア-TRS融合産物に対する相同性と、標的領域に相同である50bp領域もまた含むさらなるプライマーを使用して増幅した。プライマーにはさらに、18bpのI-SceI認識部位を含めた。したがって、TRECノックアウトカセットには、以下の順序で、標的領域の5'部分に対する50bpの相同性、18bpのI-SceI認識部位、コアカセット（GAL1プロモーター、I-SceIエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、およびURA3マーカーから、この順序で構成されている）、TRS反復断片、（標的遺伝子座のすぐ上流にあるゲノムの配列に対して相同である部分;図10Aにおいて大きな水平方向の矢印で示した）、および標的領域の3'部分に対する50bpの相同性を含めた。   The core cassette was fused to the TRS fragment by fusion PCR as described in Example 4 above. The fusion primer was used as a template in PCR using the core cassette, and the TRS fragment was used as a template in another PCR. Thereafter, the products were combined into one, and primerless PCR was performed to link these products. The resulting fusion product was then amplified using additional primers that also included homology to the core-TRS fusion product and a 50 bp region homologous to the target region. The primer further contained an 18 bp I-SceI recognition site. Thus, the TREC knockout cassette includes 50 bp homology to the 5 ′ portion of the target region, 18 bp I-SceI recognition site, core cassette (GAL1 promoter, gene encoding I-SceI endonuclease, and From the URA3 marker, organized in this order), a TRS repeat fragment, (part homologous to the genomic sequence immediately upstream of the target locus; indicated by a large horizontal arrow in FIG. 10A), And a 50 bp homology to the 3 'portion of the target region was included.

酵母W303a宿主中でのM.ミコイデスLC-YCpドナーゲノムの改変のために、TRECノックアウトカセットにより、上記実施例4C（ii）に記載したように、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して宿主細胞を形質転換した。TRECノックアウトカセットによるタイプR IIIのORF（標的遺伝子座）の置き換え（標的部位に対するカセットの末端にある50bpの相同領域による）を選択するために、細胞を増殖させ、個々のURA⁺形質転換体を選択し、分析した。このプロセスにより、III型制限酵素遺伝子がカセットで置き換えられたゲノム（ΔtypeIIIres::URA3として図11の中に示す）を得た。 For modification of the M. mycoides LC-YCp donor genome in the yeast W303a host, the host was used with TREC knockout cassette using integrative transformation with lithium acetate as described in Example 4C (ii) above. Cells were transformed. To select for replacement of the Type R III ORF (target locus) by the TREC knockout cassette (by the 50 bp homology region at the end of the cassette relative to the target site), the cells are grown and individual URA ⁺ transformants are Selected and analyzed. This process yielded a genome in which the type III restriction enzyme gene was replaced with a cassette (shown in FIG. 11 as ΔtypeIIIres :: URA3).

その後、細胞を、SG-His培地を含有しているプレート上で増殖させた。したがって、ガラクトースが唯一の炭素源であった。この工程により、18bpのI-SceI部位（図11中のアスタリスク）の切断を促進するために、GAL1プロモーターの制御下にあるI-SceIエンドヌクレアーゼの発現を誘導して、二本鎖の断裂を作製した。その後、この二本鎖の断裂は、二本鎖の断裂により促進されるタンデム反復配列間での相同組換え（水平方向の大きな矢印）を促進すると考えられる。   The cells were then grown on plates containing SG-His medium. Thus, galactose was the only carbon source. This step induces the expression of the I-SceI endonuclease under the control of the GAL1 promoter to promote the cleavage of the 18 bp I-SceI site (asterisk in Fig. 11), thereby breaking the double-strand break. Produced. Thereafter, this double-strand break is thought to promote homologous recombination (large horizontal arrows) between tandem repeats promoted by double-strand breaks.

この組換え事象を選択するために、細胞を、URA3マーカーを喪失した（これによりおそらくTRECカセットを喪失した）細胞を選択するためのSD-HIS 5-FOA培地上で増殖させた。このプロセスは、typeIIIres遺伝子のシームレスな欠失を持つゲノム（ΔtypeIIIRとして図11中に示す）を選択するために行った。   To select for this recombination event, cells were grown on SD-HIS 5-FOA medium to select for cells that lost the URA3 marker (and possibly lost the TREC cassette). This process was performed to select genomes with a seamless deletion of the typeIIIres gene (shown in FIG. 11 as ΔtypeIIIR).

別の例においては、ノックアウトカセットは3工程で構築することができる。最初に、2.3kbのDNA断片（ノックアウトコア（Knock-Out Core（KOC）と呼ぶ）を、プライマーRCO293

およびプライマーRCO294

を使用してPCRにより得た。得られたPCR産物は、5'末端から初めて、5'標的部位の上流に対して相同である50bpのセグメント（プライマーRCO293の中で太字体で強調した）、18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーター、I-SceIホーミングエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、およびURA3マーカーを含む。2番目に、標的部位の上流の400bpを、プライマーRCO295

およびプライマーRCO296

によって、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを鋳型として使用して増幅した。PCR産物（タンデム反復配列（TRS）と呼ぶ）は、3'標的部位の下流に対して相同である50bpのセグメント（プライマーRCO296の中で太字体で協調した）を含む。3番目に、互いに50bpが重複している（プライマーRCO294およびRCO295の中に下線をつけた）2つのPCR産物（KOCとTRS）を、PCRによる融合方法により互いに連結させた。融合産物であるノックアウトカセットを、Qiagenによるゲル抽出キットによりゲル精製し、プライマーRCO293およびプライマーRCO296により再度増幅した。その後、最終的な2.7kbの断片で、M.ミコイデスLCゲノム（Benders et al., Science, submitted（2009））を持つ酵母303a株を、記載されているような酢酸リチウム（LioAc）法（Gietz et al., Nucleic Acids Res 20, 1425（1992年3月25日））を使用して形質転換し、ウラシル栄養要求性およびヒスチジン栄養要求性の両方について選択した。全DNAを、記載されているとおりに（Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371（2008））形質転換体から調製した。III型RE遺伝子座によるノックアウトカセットの置き換えを、標的部位の上流に位置するプライマー5

およびノックアウトカセットの内部に位置するプライマー6

を使用したPCRスクリーニングにより確認した。III型REのマークレス（mark-less）欠失を作製するために、PCRポジティブ株を、唯一の炭素源としてガラクトースを含有する培地中で増殖させ、続いて、実施例4に記載したように5-FOA対抗選択を行った。上記に記載した全てのPCR増幅実験は、Phusion DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して行った。移植体から精製したM.ミコイデスLCゲノムを、プライマー5と、標的部位の下流に位置するプライマー7

を使用したPCRにより増幅した。PCR産物をキット（Qiagen）により精製し、プライマー5とプライマー7を使用した配列決定に使用した。 In another example, a knockout cassette can be constructed in three steps. First, a 2.3 kb DNA fragment (called Knock-Out Core (KOC)) is used as primer RCO293.

And primer RCO294

Obtained by PCR. The resulting PCR product is a 50 bp segment homologous to the upstream of the 5 'target site (highlighted in bold in primer RCO293), 18 bp I-SceI recognition site, GAL1 Includes promoter, gene encoding I-SceI homing endonuclease, and URA3 marker. Second, 400 bp upstream of the target site

And primer RCO296

Was amplified using the genomic DNA of M. mycoides LC as a template. The PCR product (referred to as the tandem repeat (TRS)) contains a 50 bp segment (coordinated in boldface in primer RCO296) that is homologous downstream of the 3 ′ target site. Third, two PCR products (KOC and TRS) that are 50 bp overlapping each other (underlined in primers RCO294 and RCO295) were ligated together by the PCR fusion method. The fusion product knockout cassette was gel purified with a gel extraction kit by Qiagen and amplified again with primers RCO293 and RCO296. The final 303 kb fragment with the M. mycoides LC genome (Benders et al., Science, submitted (2009)) was then obtained using the lithium acetate (LioAc) method (Gietz) as described. et al., Nucleic Acids Res 20, 1425 (March 25, 1992)) and selected for both uracil and histidine auxotrophy. Total DNA was prepared from transformants as described (Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371 (2008)). Primer 5 located upstream of the target site to replace the knockout cassette with the type III RE locus

And primer 6 located inside the knockout cassette

This was confirmed by PCR screening using To create a mark-less deletion of type III RE, PCR positive strains were grown in media containing galactose as the sole carbon source, followed by as described in Example 4. 5-FOA opposition selection was performed. All PCR amplification experiments described above were performed using Phusion DNA polymerase (New England Biolabs). Purified M. mycoides LC genome from the transplant, primer 5 and primer 7 located downstream of the target site

Amplified by PCR using The PCR product was purified by a kit (Qiagen) and used for sequencing using primer 5 and primer 7.

したがって、酵母宿主細胞中で2種類の改変M.ミコイデスLCゲノムが得られるように、改変方法を設計した。第1の改変ゲノムは、TRECカセットの挿入後、I-SecIエンドヌクレアーゼでの消化および5-FOA上での選択により促進される組換えの前に得られたものであった。この第1のゲノムは、III型制限酵素遺伝子座で野生型遺伝子が置き換えられている（ΔtypeIIIres::URA）URA3を含む（TREC）カセットを含んでいた。第2のゲノムは、上記カセットの除去後に得られる最終的な産物であり、これは、III型制限酵素遺伝子のシームレスな欠失（ΔtypeIIIres）を含んでいた。   Therefore, the modification method was designed to obtain two types of modified M. mycoides LC genome in yeast host cells. The first modified genome was obtained after insertion of the TREC cassette and prior to recombination facilitated by digestion with I-SecI endonuclease and selection on 5-FOA. This first genome contained a (TREC) cassette containing URA3 in which the wild-type gene was replaced at the type III restriction enzyme locus (ΔtypeIIIres :: URA). The second genome was the final product obtained after removal of the cassette, which contained a seamless deletion of the type III restriction enzyme gene (ΔtypeIIIres).

この研究で生じた改変ゲノム（ΔtypeIIIres::URA、ΔtypeIIIres）が正確なサイズであることを明らかにするために、単離したゲノムDNAを以下のようにCHEFゲル上で泳動して、それらのサイズを、未改変のM.ミコイデスLCゲノムのサイズに対して比較した。このプロセスのために、酵母のプラグを洗浄し、50ユニットのAsiSI、RsrII、およびFseI制限酵素（これらは、上記のように、酵母ゲノムDNAを特異的に切断する）で一晩消化した。その後、このDNAプラグを、消化した酵母ゲノムDNA断片を泳動することによりドナーDNAを精製するために、1％のTAEアガロースゲル上に充填した。プラグをウェルから取り出し、残っているゲノムDNAをPspXI制限酵素（これは、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを直線化する）で消化した。この消化の後、全てのプラグを洗浄し、パルスフィールドゲル上に充填した。ゲルをSYBR Gold（1:10,000に希釈した）で染色した。PFGEパターンを、GE Typhoon 9410イメージャーでゲルをスキャンした後で観察した（データは示さず）。   In order to clarify that the modified genomes (ΔtypeIIIres :: URA, ΔtypeIIIres) generated in this study were the correct size, the isolated genomic DNA was run on a CHEF gel as follows, Were compared against the size of the unmodified M. mycoides LC genome. For this process, yeast plugs were washed and digested overnight with 50 units of AsiSI, RsrII, and FseI restriction enzymes, which specifically cleave yeast genomic DNA as described above. This DNA plug was then loaded onto a 1% TAE agarose gel to purify donor DNA by running the digested yeast genomic DNA fragment. Plugs were removed from the wells and the remaining genomic DNA was digested with PspXI restriction enzyme (which linearizes the genomic DNA of M. mycoides LC). After this digestion, all plugs were washed and loaded onto a pulse field gel. The gel was stained with SYBR Gold (diluted 1: 10,000). The PFGE pattern was observed after scanning the gel with a GE Typhoon 9410 imager (data not shown).

ΔtypeIIIres::URAで改変したゲノムを持つように設計した試料、およびΔtypeIIIresで改変したゲノムを持つように設計した試料は、未改変のゲノムと匹敵するサイズのゲノムを正確に示した。このプロセスはさらに、別のクローン（Δ500kb）がこの研究の過程の間に生じたことを明らかにした。このクローンから回収したバンドのサイズに基づくと、そのゲノムは500kbの欠失を含んでいた。このクローンを、後の研究において対照として使用した。なぜなら、これはおそらく、多くの必須の遺伝子を欠いていたが、YCp（酵母セントロメアプラスミド）エレメントとtetM選択マーカーを留めていたからである。   Samples designed to have a genome modified with Δtype IIIres :: URA, and samples designed to have a genome modified with Δtype IIIres accurately displayed a genome of a size comparable to the unmodified genome. This process further revealed that another clone (Δ500 kb) occurred during the course of this study. Based on the size of the band recovered from this clone, its genome contained a 500 kb deletion. This clone was used as a control in later studies. This is probably because it lacked many essential genes but retained the YCp (yeast centromere plasmid) element and the tetM selectable marker.

III型制限酵素欠失の作製の別の例を図19に説明する。YCpMmyc1.1を、必須ではないIII型制限エンドヌクレアーゼ遺伝子中にシームレスな欠失を作製することにより、酵母の中で変更した。簡単に説明すると、YCpMmyc1.1酵母クローンを、最初に、URA3マーカーと、GAL1プロモーターの制御下にSCEIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むカセットで形質転換した。上記カセットのIII型遺伝子への挿入を、選択基準として使用した。5つのクローンのうちの4つはインタクトなゲノムを含んでおり、一つは大きな欠失を持つゲノムを含んでいた（YCpMmyc1.1-Δ500kb）（図11）。URA3カセットを、上記カセットの一方の末端付近にあるI-SceI認識部位での切断により除去した（図19）。5-フルオロオロチン酸（5-FOA）での対抗選択により、URA3カセットを喪失したクローンを得た。これにより、2つのM.ミコイデスYCpゲノムを得た。一方は、URA3カセットを含んでおり、他方は、III型制限酵素遺伝子のシームレスな欠失を含んでいた（図19）。ゲノムへの変化をPCRによって確認した（データは示さず）。   Another example of the generation of a type III restriction enzyme deletion is illustrated in FIG. YCpMmyc1.1 was altered in yeast by creating a seamless deletion in the nonessential type III restriction endonuclease gene. Briefly, the YCpMmyc1.1 yeast clone was first transformed with a cassette containing the URA3 marker and the SCEI endonuclease gene under the control of the GAL1 promoter. Insertion of the cassette into the type III gene was used as a selection criterion. Four of the five clones contained an intact genome and one contained a genome with a large deletion (YCpMmyc1.1-Δ500 kb) (FIG. 11). The URA3 cassette was removed by cleavage at the I-SceI recognition site near one end of the cassette (FIG. 19). A clone that lost the URA3 cassette was obtained by counter-selection with 5-fluoroorotic acid (5-FOA). This resulted in two M. mycoides YCp genomes. One contained the URA3 cassette and the other contained a seamless deletion of the type III restriction enzyme gene (FIG. 19). Changes to the genome were confirmed by PCR (data not shown).

実施例5B
改変したゲノムのドナー細胞への移植
これらのM.ミコイデスLCの改変したゲノム（Δ500kbの対照を含む）と未改変のM.ミコイデスLCゲノムのそれぞれを、上記実施例3に記載した方法を使用してM.カプリコルムレシピエント細胞に移植した。移植は、数字「3」で示した上記実施例3に記載した、図8に説明する第3のプロトコールを使用して行った。実施例3に記載したように、この方法には、メチル化工程、除タンパク質工程（プロテイナーゼKでの処理）、および移植反応の前の融解工程を含めた。移植は、野生型レシピエント細胞への移植である。このプロセスのために、アガロースプラグを、実施例3A（i）に記載したように調製し、制限酵素カクテルとゲル電気泳動の両方を用いて、上記実施例5Aに記載したように清浄した（実施例3A（i）もまた参照のこと）。移植は、実施例3A（ii）および3A（iii）に記載したように、5％のPEGの存在下で、細胞を含まないM.ミコイデスLC抽出物を使用したメチル化とプロテイナーゼKでの消化を用いて行った。ゲノムを、野生型（RE欠失ではない）M.カプリコルム細胞に、上記実施例3に記載したように移植した。移植の成功は、テトラサイクリンを含有しているSP4培地上での、37℃での青色コロニーの増殖を選択することにより評価した。結果を以下の表17に示す。 Example 5B
Transplantation of modified genomes into donor cells Each of these modified M. mycoides LC genomes (including the Δ500 kb control) and unmodified M. mycoides LC genomes was used using the method described in Example 3 above. And transplanted into M. capricolum recipient cells. Transplantation was performed using the third protocol described in FIG. 8 described in Example 3 above, indicated by the numeral “3”. As described in Example 3, this method included a methylation step, a deproteinization step (treatment with proteinase K), and a melting step prior to the transplantation reaction. Transplantation is transplantation into wild type recipient cells. For this process, agarose plugs were prepared as described in Example 3A (i) and cleaned as described in Example 5A above using both restriction enzyme cocktails and gel electrophoresis. See also Example 3A (i)). Transplantation was performed by methylation and digestion with proteinase K using cell-free M. mycoides LC extract in the presence of 5% PEG as described in Examples 3A (ii) and 3A (iii). It was performed using. The genome was transplanted into wild type (not RE deleted) M. capricolum cells as described in Example 3 above. Transplantation success was assessed by selecting blue colony growth at 37 ° C. on SP4 medium containing tetracycline. The results are shown in Table 17 below.

（表１７）改変M.ミコイデスLCゲノムの、野生型M.カプリコルムレシピエント細胞への移植

Table 17. Transplantation of modified M. mycoides LC genome into wild-type M. capricolum recipient cells

移植体の数は、少なくとも3回の研究の平均を示す。報告する誤差は平均偏差である。   The number of transplants represents the average of at least 3 studies. The error reported is the average deviation.

表17に示すように、2つの意図するように改変したゲノム（ΔtypeIIIres::URA3およびΔtypeIIIres）の移植により、未改変のM.ミコイデスLCゲノム（プラグ一つあたり平均28個のコロニー）を移植した場合に観察された数に匹敵する、類似する数のテトラサイクリン耐性である青色コロニー（それぞれ、プラグ一つあたり平均28個および33個のコロニー）が生じた。予想したとおり、500kbの欠失（およびおそらく、必須のマイコプラズマ遺伝子を欠失しているが、YCpエレメントとtetMを留めている）を含有している対照クローンのM.カプリコルムレシピエント細胞への移植によっては、コロニーは得られなかった。   As shown in Table 17, transplantation of two intentionally modified genomes (ΔtypeIIIres :: URA3 and ΔtypeIIIres) transplanted unmodified M. mycoides LC genome (average 28 colonies per plug) A similar number of tetracycline resistant blue colonies (average 28 and 33 colonies per plug, respectively) were generated, comparable to the number observed in some cases. As expected, a control clone containing a 500 kb deletion (and possibly lacking the essential mycoplasma gene but retaining the YCp element and tetM) into M. capricolum recipient cells No colonies were obtained by transplantation.

移植された未改変のゲノムを含む選択したコロニーの配列を確認するために、これらのゲノム中のIII型遺伝子座を配列決定した。配列決定の結果は、予想した改変が、いずれの改変した株（ΔtypeIIIres::URA3およびΔtypeIIIres）の中にも存在することを明らかにした。例えば、ΔtypeIIIresゲノム中のtypeIIIres遺伝子の欠失を、野生型ゲノムにおいてtypeIIIres遺伝子に隣接しており、天然のtypeIIIres遺伝子の下流のDNAである、typeIIImod遺伝子の連結を含む核酸の配列を用いて確認し（図11を参照のこと）、これらの細胞中でのその遺伝子のシームレスな欠失を明らかにした。   In order to confirm the sequence of selected colonies containing the transplanted unmodified genome, the type III locus in these genomes was sequenced. Sequencing results revealed that the expected modification was present in any modified strain (ΔtypeIIIres :: URA3 and ΔtypeIIIres). For example, the deletion of the typeIIIres gene in the ΔtypeIIIres genome is confirmed using the sequence of a nucleic acid containing a linkage of the typeIIImod gene, which is adjacent to the typeIIIres gene in the wild-type genome and downstream of the natural typeIIIres gene. (See FIG. 11) revealed a seamless deletion of that gene in these cells.

回収したコロニーの遺伝子型がM.ミコイデスLCであることを確認するために、選択した青色コロニー由来のゲノムDNAを、サザンブロットにより、IS1296エレメントをプローブとして使用して分析した。IS1296挿入配列のコピーを、M.ミコイデスLC（ドナー）ゲノム全体に分散させるが、M.カプリコルム（レシピエント）ゲノム由来のものは存在しない。改変したゲノム中のIII型制限酵素配列の完全な喪失を確認するために、ブロットを、M.ミコイデスLC typeIIIres遺伝子配列を含むプローブでさらにプローブした。サザンブロットを以下のように行った。   In order to confirm that the recovered colony genotype was M. mycoides LC, genomic DNA from the selected blue colonies was analyzed by Southern blot using the IS1296 element as a probe. A copy of the IS1296 insert is distributed throughout the M. mycoides LC (donor) genome, but none from the M. capricolum (recipient) genome. To confirm the complete loss of type III restriction enzyme sequences in the modified genome, the blot was further probed with a probe containing the M. mycoides LC type IIIres gene sequence. Southern blots were performed as follows.

マイコプラズマの全DNAを、改変したM.ミコイデスゲノムまたは未改変のM.ミコイデスゲノムを移植したM.カプリコルムレシピエント細胞の10mlの培養物から抽出した。天然のM.ミコイデスLCクローン1.1ドナー細胞由来のゲノムDNAと、M.カプリコルムレシピエント細胞由来のゲノムDNAを、対照として使用した。抽出は、WizardゲノムDNA精製キット（Promega）を使用して行った。サザンブロットハイブリダイゼーションのために、1.5μgのDNAを、HindIIIまたはEcoRVのいずれかで消化し、得られた試料を、1％のアガロースゲル上での電気泳動により分離した。ゲル由来のDNA断片を、正電荷を持つナイロンメンブレン（Nytran Super Charge, Schleicher and Schuell）上にアルカリ移動（alkali transfer）により移動させた。20ng/mlのジゴキシゲニン標識DNAプローブ（IS1296挿入配列）およびtypeIIIres遺伝子配列を、メンブレンにハイブリダイズさせて、M.ミコイデスの遺伝子型とドナーゲノムの改変をそれぞれ確認した。   Total mycoplasma DNA was extracted from 10 ml cultures of M. capricolum recipient cells transplanted with modified or unmodified M. mycoides genomes. Genomic DNA from native M. mycoides LC clone 1.1 donor cells and genomic DNA from M. capricolum recipient cells were used as controls. Extraction was performed using the Wizard genomic DNA purification kit (Promega). For Southern blot hybridization, 1.5 μg of DNA was digested with either HindIII or EcoRV and the resulting samples were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. Gel-derived DNA fragments were transferred onto a positively charged nylon membrane (Nytran Super Charge, Schleicher and Schuell) by alkali transfer. A 20 ng / ml digoxigenin-labeled DNA probe (IS1296 insertion sequence) and a type IIIres gene sequence were hybridized to the membrane to confirm the alteration of the M. mycoides genotype and donor genome, respectively.

メンブレンを、アルカリホスファターゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体のFab断片とともにインキュベーションした。その後、ハイブリダイゼーションを、蛍光基質HNPP（2-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2'-フェニルアニリドホスフェート）（Roche Molecular Bio Chemicals）を用いて検出した。化学発光を、画像を撮影するように設計された、カメラとQuantity Oneソフトウェアを用いてUV下で検出した（Bio-Rad Laboratories, Inc.）。   Membranes were incubated with Fab fragments of anti-digoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase. Hybridization was then detected using the fluorescent substrate HNPP (2-hydroxy-3-naphthoic acid-2′-phenylanilide phosphate) (Roche Molecular Bio Chemicals). Chemiluminescence was detected under UV using a camera and Quantity One software designed to take images (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

選択した移植したコロニーはそれぞれ、IS1296プローブでプローブしたブロットにおいて同じパターン（8本のバンド）を生じた（データは示さず）。予想したとおり、IS1296パターンは、レシピエント細胞（r）由来の試料を含有しているレーンにおいては検出されなかった。この結果は、回収したコロニーが、実際に、M.ミコイデスLC遺伝子型であることを強く示唆している。さらに、M.ミコイデスのドナーゲノム由来の対照試料を含有しているレーンは、typeIIIresプローブにより認識されるバンドを含んでいた。しかし、このバンドは、移植改変ゲノム由来の試料を含有しているレーンにおいては検出されなかった。   Each of the selected transplanted colonies produced the same pattern (8 bands) in the blot probed with IS1296 probe (data not shown). As expected, the IS1296 pattern was not detected in lanes containing samples from recipient cells (r). This result strongly suggests that the recovered colonies are indeed M. mycoides LC genotype. In addition, the lane containing the control sample from the M. mycoides donor genome contained a band recognized by the type IIIres probe. However, this band was not detected in the lane containing the sample derived from the transplanted modified genome.

これらの結果は、酵母宿主細胞中で改変したドナーゲノムを、ドナーとは異なる種のレシピエント細胞にうまく移植できたことを示していた。これらの結果はさらに、改変したゲノムがいずれも、意図した改変（TypeIIIres遺伝子の喪失）を含むことを示している。したがって、本提供の方法を、研究室または自然界のいずれにもこれまでは存在していなかった合成のドナーであるM.ミコイデスLCゲノムが移植された2つの合成のレシピエント細胞を作製するためにうまく使用できた。これらの結果は、酵母中での細菌の全ゲノムの遺伝子操作の第1の例と、新規の細菌を得るためのレシピエント細胞へのそのインストールを示す。   These results indicated that the donor genome modified in yeast host cells was successfully transplanted into recipient cells of a different species than the donor. These results further indicate that any modified genome contains the intended modification (loss of the Type IIIres gene). Thus, the provided method can be used to generate two synthetic recipient cells that have been transplanted with the M. mycoides LC genome, a synthetic donor that has never existed in the laboratory or in nature. We were able to use well. These results show a first example of genetic manipulation of the entire bacterial genome in yeast and its installation into recipient cells to obtain new bacteria.

実施例6
レシピエント細胞への、酵母宿主細胞中でアセンブリされ増殖された化学合成ドナーゲノムまたは半合成ドナーゲノムの移植
1.08Mbpのマイコプラズマ・ミコイデスのゲノムを化学的に合成し、セントロメアプラスミドとして酵母中でアセンブリした; ゲノムを裸のDNAとして単離し、マイコプラズマ・カプリコルムへ移植し、合成ゲノムによってのみ制御される新しい細菌細胞を作製した。 Example 6
Transplanting chemically synthesized or semi-synthetic donor genomes assembled and propagated in yeast host cells into recipient cells
A 1.08 Mbp Mycoplasma mycoides genome was chemically synthesized and assembled in yeast as a centromere plasmid; the genome was isolated as naked DNA, transferred to Mycoplasma capricolum, and a new bacterial cell controlled only by the synthetic genome Was made.

本明細書において記述されるのは、1,078個の1kb合成DNAカセットからの1,077,947bpのマイコプラズマ・ミコイデスJCVI-syn1ゲノムの設計、合成およびアセンブリである。アセンブリはインビトロおよびインビボでのアセンブリ法によって容易とされた。10セットのカセットを酵母組換えによってアセンブリし、酵母/大腸菌シャトルベクターにて増殖させた。10kbのアセンブリを10セットで再結合させて、100kbのアセンブリを生成した。得られた11個の100kbアセンブリを完全なゲノムへ単一の最終段階で再結合させた。合成ゲノムを持つ酵母クローンをマルチプレックスPCRおよび制限分析によって確認した。   Described herein is the design, synthesis and assembly of the 1,077,947 bp Mycoplasma mycoides JCVI-syn1 genome from 1,078 1 kb synthetic DNA cassettes. Assembly was facilitated by in vitro and in vivo assembly methods. Ten sets of cassettes were assembled by yeast recombination and grown on a yeast / E. Coli shuttle vector. The 10 kb assembly was recombined in 10 sets to produce a 100 kb assembly. The resulting 11 100 kb assemblies were recombined into a complete genome in a single final step. Yeast clones with a synthetic genome were confirmed by multiplex PCR and restriction analysis.

アセンブリした合成ゲノムをセントロメアプラスミドとして酵母中で増殖させ、制限マイナスのマイコプラズマ・カプリコルム細胞へ移植することに成功した。この新しい細胞は、M.ミコイデスに対して予想される表現型特性と、透かし配列を含め、設計した合成DNA配列ならびに設計した他の遺伝子欠失および多型とを有する。本発明者らはこの株をM.ミコイデスJCVI-syn1と呼ぶ。これは、合成された第2の細菌染色体および100万bp超の第1の細菌染色体である。それは、レシピエント細胞への移植が成功し、合成染色体によってのみ制御される新しい細胞をもたらす、合成細菌ゲノムである。この新しい合成染色体細胞は持続的な自己複製の能力がある。本研究では、デジタル化された遺伝情報から始め、新しいDNAを合成し、その合成DNAを細胞へ移植して既存の遺伝情報の全てに取って代え、結果として、その合成により設計されたDNAによってのみ制御される新しい細胞を作製できることを確認する。既存(内因性)の遺伝情報は失われ、結果として、設計した合成染色体によってのみ制御される新しい細胞が作製される。   The assembled synthetic genome was propagated in yeast as a centromere plasmid and successfully transferred to restriction-negative Mycoplasma capricolum cells. This new cell has the expected phenotypic characteristics for M. mycoides and the designed synthetic DNA sequence, including watermark sequences, and other designed gene deletions and polymorphisms. We call this strain M. mycoides JCVI-syn1. This is the second bacterial chromosome synthesized and the first bacterial chromosome of over 1 million bp. It is a synthetic bacterial genome that has been successfully transplanted into recipient cells resulting in new cells that are controlled only by synthetic chromosomes. This new synthetic chromosomal cell is capable of sustained self-renewal. In this study, we begin with digitized genetic information, synthesize new DNA, transfer the synthetic DNA to cells and replace all existing genetic information, and as a result, the DNA designed by the synthesis Make sure you can make new cells that are only controlled. Existing (endogenous) genetic information is lost, resulting in the creation of new cells controlled only by the designed synthetic chromosomes.

実施例6A
合成ドナーゲノムの設計
M.ミコイデスJCVI-syn1ゲノムの設計は、M.ミコイデス亜種カプリ(capri)GM12の既述されている2つの研究室株の非常に正確な完成ゲノム配列に基づいた(Benders et al., Nucleic Acids Res, (2010); Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009))。一方はLartigueらによって用いられたゲノムドナー[GenBankアクセッションCP001621]であった(Lartigue et al., Science 317, 632 (2007))。もう一方は、酵母においてクローニングされ変更されたゲノムYCpMmyc1.1-ΔtypeIIIresの移植により作製された株[GenBankアクセッションCP001668]であった(Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009))。95箇所の部位での差異がM.ミコイデスゲノム配列の間で同定された。本発明者らは、本発明者らの設計基準として酵母(CP001668)からの移植に成功したゲノムの配列を用いることを選んだ; 生物学的意義があるものと思われ、過去に合成されたカセット間の全ての差異をCP001668に適合するように修正した。19箇所の部位で起きていた本発明者らの合成カセットとCP001668との配列の差異は、害のないように思われたので、修正されなかった。これらは、本発明者らの合成ゲノム(JCVI-syn1)と、本発明者らが酵母においてクローニングし、酵母からのゲノム移植の標準として用いる天然ゲノムYCpMmyc1.1との間で19個の多型差異をもたらす(Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009))。 Example 6A
Designing a synthetic donor genome
The design of the M. mycoides JCVI-syn1 genome was based on the highly accurate completed genome sequences of the two previously described laboratory strains of M. mycoides subspecies capri GM12 (Benders et al., Nucleic Acids Res, (2010); Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009)). One was the genomic donor [GenBank Accession CP001621] used by Lartigue et al. (Lartigue et al., Science 317, 632 (2007)). The other was a strain [GenBank Accession CP001668] produced by transplantation of the genome YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres cloned and modified in yeast (Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009)). Differences at 95 sites were identified between the M. mycoides genome sequences. We chose to use the genomic sequence that was successfully transferred from yeast (CP001668) as our design criteria; it was considered biologically significant and was synthesized in the past All differences between cassettes were corrected to fit CP001668. The sequence difference between our synthetic cassette and CP001668 that occurred at 19 sites was not corrected because it appeared harmless. These are 19 polymorphisms between our synthetic genome (JCVI-syn1) and the natural genome YCpMmyc1.1 that we cloned in yeast and used as a standard for genome transfer from yeast. Makes a difference (Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009)).

i.ゲノム配列
GenBankアクセッション番号CP001621は、Lartigueら(Science 317, 632 (2007))によって記述されているようにゲノムドナーとして用いられたM.ミコイデス株の配列であり、1,089,202bpの長さを有する。 i. Genome sequence
GenBank accession number CP001621 is the sequence of the M. mycoides strain used as a genomic donor as described by Lartigue et al. (Science 317, 632 (2007)) and has a length of 1,089,202 bp.

mmycDRAFT - 本発明者らの合成M.ミコイデスゲノムの設計は、上記の配列(CP001621)をもたらした計画からのドラフトゲノム配列を用いて始められ、1,114,292bpの長さを有する。このドラフトは大きな重複を含むことが分かった。   mmycDRAFT-Our synthetic M. mycoides genome design was started with a draft genome sequence from the scheme that resulted in the above sequence (CP001621) and has a length of 1,114,292 bp. This draft was found to contain large overlaps.

GenBankアクセッション番号CP001668は、III型制限エンドヌクレアーゼに対する遺伝子を欠失させることにより酵母において変更され、その後、マイコプラズマを産生するように移植されたM.ミコイデス株の配列である(Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009))。この配列は1,084,586bpの長さを有する。   GenBank accession number CP001668 is a sequence of an M. mycoides strain that was altered in yeast by deleting the gene for the type III restriction endonuclease and then transplanted to produce mycoplasma (Lartigue et al., Science 325, 1693 (2009)). This sequence has a length of 1,084,586 bp.

最初にmmycDRAFT配列を、80bpの重複部分を有する、長さが1080bpのカセットに分け、以下のように、NotI制限部位を各末端に付加した。
mmyc0 = 塩基番号1〜1080の前後にGCGGCCGC
mmyc1 = 塩基番号1001〜2080の前後にGCGGCCGC
mmyc2 = 塩基番号2001〜3080の前後にGCGGCCGC
mmyc1113 = 塩基番号1113001〜1114080の前後にGCGGCCGC
mmyc1114 = 塩基番号1114001〜1114292の前後にGCGGCCGC First, the mmycDRAFT sequence was divided into a 1080 bp long cassette with an 80 bp overlap and a NotI restriction site was added to each end as follows.
mmyc0 = GCGGCCGC before or after base number 1 to 1080
mmyc1 = GCGGCCGC before or after base number 1001-2080
mmyc2 = GCGGCCGC before and after base numbers 2001-3080
mmyc1113 = GCGGCCGC before or after base number 1113001-1111080
mmyc1114 = GCGGCCGC before or after base number 1114001 ~ 1114292

mmycDRAFT配列の部分のなかに位置する設計したカセットは、Blue Heronに合成を注文した。この初注文の1,072個のカセットにはmmyc0〜mmyc14 (15カセット)、mmyc835〜mmyc852 (18カセット)、およびmmyc1105〜mmyc1114 (10カセット)を除く、設計した全1,115個のカセットが含まれた。   The designed cassette located within the mmycDRAFT sequence part was ordered from Blue Heron for synthesis. This first-order 1,072 cassettes included all 1,115 designed cassettes, except mmyc0-mmyc14 (15 cassettes), mmyc835-mmyc852 (18 cassettes), and mmyc1105-mmyc1114 (10 cassettes).

これらの1,072個のカセットのアセンブリにより、配列が不確かな領域に2つのギャップが対応している、2つの連続したDNAストレッチが得られる。   The assembly of these 1,072 cassettes yields two consecutive DNA stretches with two gaps corresponding to regions of uncertain sequence.

残りのカセットの設計は完成後の配列CP001668に基づいていた。というのは、そのゲノムは酵母において安定的に維持され、生存可能なマイコプラズマを生ずるように酵母から移植可能であることが公知であったからである。最初に、2つの最も大きなギャップを埋めるためにカセットを設計した。   The remaining cassette design was based on the completed sequence CP001668. This is because the genome was known to be stably maintained in yeast and transplantable from yeast to produce viable mycoplasma. First, a cassette was designed to fill the two largest gaps.

ギャップ1を埋めるためのカセット
「a」は、Blue Heronに初注文しなかった部分のカセットを指定する。カセット835a〜850aは、CP001668にマッチしかつカセットmmyc835〜mmyc852によって残されたギャップを埋める配列をもたらし、これはBlue Heronへの初注文から省かれた。 Cassette “a” to fill gap 1 specifies the cassette that was not ordered from Blue Heron for the first time. Cassettes 835a-850a resulted in an arrangement that matched CP001668 and filled the gap left by cassettes mmyc835-mmyc852, which was omitted from the initial order to Blue Heron.

ギャップ2を埋めるためのカセット
カセット2a〜12axは、ドラフト配列においてカセットmmyc1105〜mmyc1114およびmmyc0〜mmyc14が位置していた場所の左側のギャップを埋める(これらはBlue Heronへの注文から省かれた)。この配列は正確にCP001668にマッチし、その配列のアセンブリに関する問題によって主に、ドラフト配列の対応領域よりもかなり短い。mmyc12axの配列は大抵のものよりも長く; ゆえに「x」は伸長を表す。 Cassettes to fill gap 2 Cassettes 2a-12ax fill the left gap where the cassettes mmyc1105-mmyc1114 and mmyc0-mmyc14 were located in the draft sequence (these were omitted from the order to Blue Heron). This sequence matches CP001668 exactly and is considerably shorter than the corresponding region of the draft sequence, mainly due to problems with assembly of the sequence. The sequence of mmyc12ax is longer than most; hence “x” represents extension.

合成ゲノムを複製起点の近傍でCP001668にマッチさせるためのカセット
この領域におけるCP001668とmmycDRAFT配列との間には多くの差異が存在していた。
mmyc799a (80bpだけmmyc798に重複〜CP001668の末端1084586まで)
mmyc811a (CP001668の-80〜1074)
mmyc812a (CP001668の995〜2074) Cassette for matching the synthetic genome to CP001668 in the vicinity of the origin of replication There were many differences between the CP001668 and mmycDRAFT sequences in this region.
mmyc799a (overlapping by 80bp to mmyc798 ~ up to the end 1084586 of CP001668)
mmyc811a (CP001668 -8-1074)
mmyc812a (CP001668 995-2074)

CP001668にマッチするように合成されたカセット
mmyc56a (CP001668の344335〜345333)、mmyc58a (CP001668の345252〜345926)、およびmmyc938とmmyc939の間に入る、mmyc938.1a。 Cassettes synthesized to match CP001668
mmyc56a (3440016-345333 of CP001668), mmyc58a (345252-345926 of CP001668), and mmyc938.1a, which falls between mmyc938 and mmyc939.

CP001668にマッチするようにオリゴヌクレオチド突然変異誘発によって「修正された」カセット
「f」カセットは、CP001668に正確に適合するようにオリゴヌクレオチド突然変異誘発によって修正されうる少数の配列差異を有していた。これらのカセットをいかにして修正するかに関する詳細は、以下を参照されたい。以下のカセットを修正した: mmyc1011f、mmyc1028f、mmyc247f、mmyc248f、mmyc342f、mmyc399f、mmyc400f、mmyc528f、mmyc529f、mmyc578f、mmyc579f、mmyc632f、mmyc642f、mmyc759f、およびmmyc874f。さらに、mmyc936〜mmyc939を欠いている、「94D」の欠失を有するゲノムを構築するために、カセットmmyc935との5'重複部分を含むようにカセットmmyc940fを生成した。この領域は、これを酵母において天然ゲノムから欠失させ、次に移植して生存可能なマイコプラズマを産生することにより、不要であることが実証された。 Cassette “corrected” by oligonucleotide mutagenesis to match CP001668 The “f” cassette had a small number of sequence differences that could be corrected by oligonucleotide mutagenesis to match CP001668 exactly . See below for details on how to modify these cassettes. The following cassettes were modified: mmyc1011f, mmyc1028f, mmyc247f, mmyc248f, mmyc342f, mmyc399f, mmyc400f, mmyc528f, mmyc529f, mmyc578f, mmyc579f, mmyc632f, mmyc642f, mmyc759f, and mmyc759f. In addition, cassette mmyc940f was generated to include a 5 ′ overlap with cassette mmyc935 to construct a genome with a “94D” deletion that lacked mmyc936-mmyc939. This region has been demonstrated to be unnecessary by deleting it from the natural genome in yeast and then transplanting to produce viable mycoplasma.

透かし配列を含むカセット
(1) mmycWM1はmmyc282〜287に取って代わる(5'側にmmyc282由来の80bpの重複部分; 3'側にmmyc287由来の80bpの重複部分)、(2) mmycWM2bはmmyc447に取って代わる(80bpの重複部分の両方がmmyc447由来である)、(3) mmycWM3はmmyc106に取って代わる(80bpの重複部分の両方がmmyc106由来である)、および(4) mmycWM4はmmyc680に取って代わる(80bpの重複部分の両方がmmyc680由来である)。 Cassette containing watermark array
(1) mmycWM1 replaces mmyc282 to 287 (80 bp overlap from mmyc282 on the 5 ′ side; 80 bp overlap from mmyc287 on the 3 ′ side), (2) mmycWM2b replaces mmyc447 (80 bp (3) mmycWM3 replaces mmyc106 (both 80 bp overlaps are derived from mmyc106), and (4) mmycWM4 replaces mmyc680 (80 bp Both overlaps are from mmyc680).

ヌクレオチド番号1はdnaA遺伝子の開始コドンの位置にある
M.ミコイデス配列CP001621およびCP001668の両方で、ヌクレオチド番号1がDNA複製起点の近くの、dnaA遺伝子の開始コドンの位置となる、付番方式を用いる。初期カセット設計に用いたmmycDRAFT配列は異なる起点から、しかし同じ方向に付番された。その結果、ゲノム配列のヌクレオチド番号1はカセットmmyc811aに位置する。 Nucleotide number 1 is at the start codon position of the dnaA gene
In both M. mycoides sequences CP001621 and CP001668, a numbering scheme is used in which nucleotide number 1 is the position of the start codon of the dnaA gene, near the origin of DNA replication. The mmycDRAFT sequences used in the initial cassette design were numbered from different origins but in the same direction. As a result, nucleotide number 1 of the genomic sequence is located in cassette mmyc811a.

カセット設計とCP001668との間の修正されなかった差異
カセット設計とCP001668配列との間には、無害と思われ、修正しないことを選択した、19個の差異がある。これらは全て、ホモポリマーまたはジヌクレオチドの連続の長さの差異であり、注釈付きの遺伝子の間に位置していた。プロモーターの-35配列と-10配列との間の間隔に影響を与え、そのため、遺伝子発現に影響を与えうるものもある。表18はこれらの19個の差異の詳細を示す。それらは透かし配列に加え、酵母においてクローニングされた天然M.ミコイデスゲノムと合成ゲノムとを区別するためのさらに多くの配列差異を提供する。 Uncorrected differences between the cassette design and CP001668 There are 19 differences between the cassette design and the CP001668 sequence that seemed harmless and chose not to be corrected. These were all differences in the length of the homopolymer or dinucleotide sequence and were located between the annotated genes. Some affect the spacing between the -35 and -10 sequences of the promoter, and thus can affect gene expression. Table 18 details these 19 differences. In addition to the watermark sequence, they provide more sequence differences to distinguish between the natural M. mycoides genome cloned in yeast and the synthetic genome.

DNAカセット配列の修正
合成ゲノムを含む合成カセットは、不完全なドラフト配列に基づいて注文した。このため、注文した合成カセット配列と基礎となった完全M.ミコイデス亜種カプリゲノム配列との間にはわずかな差異が存在していた。43個のカセットに差異が含まれていた。差異の多くは、遺伝子に位置することが予想されていなかったホモポリマーまたはジヌクレオチドの連続における小さな挿入または欠失であった。これらの変化は無害であるものと考えられ、修正されなかった。16個のカセットを修正するために選抜した。差異は、1つのカセットでの12bpの反復単位の欠失を除き全て単一塩基の変化であった。 Correction of DNA cassette sequence A synthetic cassette containing a synthetic genome was ordered based on an incomplete draft sequence. For this reason, there was a slight difference between the ordered synthetic cassette sequence and the underlying complete M. mycoides subspecies caprigenome sequence. 43 cassettes contained differences. Many of the differences were small insertions or deletions in homopolymer or dinucleotide sequences that were not expected to be located in the gene. These changes were considered harmless and were not corrected. Selected to correct 16 cassettes. The differences were all single base changes except for a 12 bp repeat unit deletion in one cassette.

2つの戦略を利用し合成カセット配列を変化させて、完全M.ミコイデス亜種カプリゲノム配列にマッチさせた。単一塩基変化の一部にはQuikChange(登録商標) II部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いた。残りの変化はPCRおよびインビトロ組換えの組み合わせによって行った(Gibson et al., Nat Methods 6, 343 (2009))。プライマー(BH pUC骨格順方向1および逆方向1)を用いて、組換え反応で用いるためのプラスミド骨格を増幅した。骨格プライマーの相補鎖(BH挿入断片順方向1および逆方向1)を誤り修正用のプライマー(カセット修正順方向1および逆方向1)とともに用いて、相互に相同性の領域およびBH骨格アンプリコンと相同性の領域を有するアンプリコンを生成した。3つのPCR産物をインビトロ組換えで用いて、修正されたカセットを作製した(データ示さず)。1,080bpのカセットクローンにおいて全ての修正を行った。   Two strategies were used to alter the synthetic cassette sequence to match the complete M. mycoides subspecies capri genome sequence. The QuikChange® II site-directed mutagenesis kit (Stratagene) was used for some single base changes. The remaining changes were made by a combination of PCR and in vitro recombination (Gibson et al., Nat Methods 6, 343 (2009)). Primers (BH pUC backbone forward 1 and reverse 1) were used to amplify the plasmid backbone for use in the recombination reaction. Using the complementary strands of the backbone primer (BH insert forward 1 and reverse 1) together with the error correction primers (cassette correction forward 1 and reverse 1), the region of homology with each other and the BH backbone amplicon Amplicons with regions of homology were generated. Three PCR products were used in in vitro recombination to generate a modified cassette (data not shown). All corrections were made in the 1,080 bp cassette clone.

プライマーBH pUC骨格順方向1

およびBH pUC骨格逆方向1

を用いてカセットクローンのプラスミド骨格を増幅した。このアンプリコン(BH骨格)はおよそ2,600bpであり、アンピシリン耐性マーカーおよび複製起点を含む。プライマーBH挿入断片順方向1

および
BH挿入断片逆方向1

は、BH pUC骨格順方向1およびBH pUC骨格逆方向1の逆相補鎖であり、これらを順方向および逆方向プライマーとして、修正プライマーとともに用いて、カセット挿入断片を増幅し、インビトロ組換え用のBH骨格を有する相同性領域を作製する。 Primer BH pUC backbone forward 1

And BH pUC skeleton reverse direction 1

Was used to amplify the plasmid backbone of the cassette clone. This amplicon (BH backbone) is approximately 2,600 bp and contains an ampicillin resistance marker and an origin of replication. Primer BH insert forward direction 1

and
BH insert reverse direction 1

Are the reverse complementary strands of BH pUC backbone forward 1 and BH pUC backbone reverse 1, which are used as forward and reverse primers in combination with the modified primer to amplify the cassette insert and for in vitro recombination A homology region with a BH backbone is created.

カセット中の単一のヌクレオチドを変化させるためには、2つのオリゴヌクレオチドが必要とされる。第1のプライマーはおよそ20〜25塩基が隣接している修正ヌクレオチド配列を含み、第2のものは第1のものの相補鎖である。ヌクレオチドをGに変化させるために用いたプライマーの例を示す。カセット修正順方向1

および
カセット修正逆方向1

。変化させるヌクレオチドを太字とした。PCRを用いて、選択した塩基を変化させる。プライマーBH挿入断片順方向1およびカセット修正逆方向1を用いて、修正した挿入断片の部分を増幅させ、プライマーBH挿入断片逆方向1およびカセット修正順方向1は残りの挿入断片を同様に修正して増幅させるためのものである。カセット修正順方向1およびカセット修正逆方向1プライマーは互いの逆相補鎖であるため、これによりアンプリコン間でのインビトロ組換え用の相同性領域が作製される。前述のように、BH挿入断片プライマーはBH骨格片との相同性を作製し、これにより、3つの小片のインビトロ組換え反応で修正挿入断片プラスミドを作製することが可能になる。 Two oligonucleotides are required to change a single nucleotide in the cassette. The first primer contains a modified nucleotide sequence that is approximately 20-25 bases contiguous and the second is the complementary strand of the first. The example of the primer used in order to change a nucleotide into G is shown. Cassette correction forward direction 1

And cassette correction reverse direction 1

. The nucleotide to be changed is bold. PCR is used to change the selected base. Primer BH insert forward direction 1 and cassette correction reverse direction 1 are used to amplify the portion of the corrected insert, and primer BH insert reverse direction 1 and cassette correction forward direction 1 similarly correct the remaining insert. For amplification. Since the cassette correction forward 1 and cassette correction reverse 1 primers are reverse complementary strands of each other, this creates a region of homology for in vitro recombination between amplicons. As mentioned above, the BH insert primer creates homology with the BH backbone fragment, which allows the modified insert plasmid to be generated in an in vitro recombination reaction of three pieces.

1つの合成カセットには12bpの配列の5つの反復を含めたが、完成したゲノム配列はこの配列の6つの反復を示した。PCRおよびインビトロ組換えを上記のように用いて、若干の変更を伴いながら12bpの欠失を修正した。12bpの反復単位を加えるのに用いた順方向プライマーには、5'末端の4つの反復単位と、それに続き3'末端の非反復配列27塩基を含めた。このプライマーをプライマーBH挿入断片逆方向1とともに用いて、5'末端に4つの反復単位を有するアンプリコンを作製した。12bpの反復単位を加えるのに用いた逆方向プライマーには、5'末端の4つの反復単位と、それに続き3'末端の非反復配列27塩基の相補鎖を含めた。このプライマーをプライマーBH挿入断片順方向1とともに用いて、3'末端に4つの反復単位を有するアンプリコンを作製した。インビトロ組換えの後に、クローンを配列決定して、アンプリコンの3'末端の2つの反復単位と5'末端の2つの単位との間で再結合したクローンを同定し、6つの12bpの反復単位を有するカセット挿入断片配列を得た。   One synthesis cassette contained 5 repeats of the 12 bp sequence, but the completed genomic sequence showed 6 repeats of this sequence. PCR and in vitro recombination were used as described above to correct the 12 bp deletion with minor changes. The forward primer used to add the 12 bp repeat unit included 4 repeat units at the 5 ′ end followed by 27 bases of non-repetitive sequence at the 3 ′ end. This primer was used with primer BH insert reverse direction 1 to make an amplicon with 4 repeat units at the 5 ′ end. The reverse primer used to add the 12 bp repeat unit included 4 repeat units at the 5 ′ end followed by a 27 base complementary strand at the 3 ′ end of the non-repetitive sequence. This primer was used with primer BH insert forward direction 1 to create an amplicon with 4 repeat units at the 3 ′ end. After in vitro recombination, clones were sequenced to identify clones that recombined between the two repeat units at the 3 'end and the two units at the 5' end of the amplicon, and six 12 bp repeat units A cassette insert sequence with

合成配列と天然配列との間の差異に関連していなかったカセット940においてさらなる変更を加えた。カセット936〜939はアセンブリすることが困難であった。さらなる研究によって、カセット936〜939はM.ミコイデス亜種カプリの生存性に不可欠でなく、欠失できることが実証された。合成ゲノムの構築中にこの領域を欠失させるために、カセット940の5'側の80bpの重複を、カセット935の80bpの3'側の重複にマッチするように変更した。構築により、カセット935がカセット940と連結し、カセット936〜939を欠失させることになる。重複領域を変更するために、カセット940をBH挿入断片逆方向1および5'側の80bpの重複領域に隣接して結合する順方向プライマーで増幅した。カセット936由来の5'側の重複部分(これはカセット935の3'側の80bpの重複部分と同一である)は、BH挿入断片順方向1およびカセット940を増幅するために用いた順方向プライマーの相補鎖である5'側の伸長部との重複部分の3'側40bpに結合する逆方向プライマーでカセット936を増幅させることによって得た。次いでインビトロ組換えをBH骨格片とともに用いて、カセット935との5'側の80bpの重複部分を有するカセット940を作製した。   Further changes were made in cassette 940 that was not related to differences between synthetic and native sequences. Cassettes 936-939 were difficult to assemble. Further studies have demonstrated that cassettes 936-939 are not essential for the viability of M. mycoides subsp. To delete this region during the construction of the synthetic genome, the 80 bp overlap of cassette 940 was changed to match the 80 bp 3 'overlap of cassette 935. By construction, cassette 935 is linked to cassette 940 and cassettes 936-939 are deleted. To alter the overlap region, cassette 940 was amplified with a forward primer that binds adjacent to the 80 bp overlap region on the BH insert reverse direction 1 and 5 '. The 5 ′ overlap from cassette 936 (which is identical to the 80 bp overlap at 3 ′ of cassette 935) is the forward primer used to amplify BH insert forward 1 and cassette 940. It was obtained by amplifying the cassette 936 with a reverse primer that binds to the 3 ′ side 40 bp of the overlapping part with the 5 ′ side extension part that is the complementary strand of. In vitro recombination was then used with the BH backbone fragment to produce cassette 940 with an 80 bp overlap on 5 'side with cassette 935.

ii.透かし
合成ゲノムと天然ゲノムとをさらに区別するために、4つの透かし配列を、1つまたは複数のカセットに取って代わるように設計し、付加配列の挿入が生存性を妨げないような場所に付加した。 ii. Watermark In order to further distinguish between synthetic and natural genomes, a place where four watermark sequences are designed to replace one or more cassettes, and insertion of additional sequences does not interfere with viability. Added to.

透かし-1、321個の非コード文字、1246塩基対

Watermark-1, 321 non-coded characters, 1246 base pairs

透かし-2、326個の非コード文字、1081塩基対

Watermark-2, 326 non-coded characters, 1081 base pairs

透かし-3、335個の非コード文字、1109塩基対

Watermark-3, 335 non-coded characters, 1109 base pairs

透かし-4、338個の非コード文字、1222塩基対

Watermark-4, 338 non-coded characters, 1222 base pairs

透かし1〜4を、それぞれ、カセット282〜287、447、106、および680に代えて用いた。透かしは、細胞生存を妨げないことが実験的に証明された領域(透かし1 (1246bp)および2 (1081bp))または予測された領域(透かし3 (1109bp)および4 (1222bp)に挿入した。全6個のリーディングフレーム停止コドンは各透かしの始めと終わりの位置に下線で示されており; Afc I制限部位は太字斜体で示されている。本発明者らのデータから、カセット936〜939によって表されるゲノム配列は不必要なことが示唆されたので、本発明者らは、カセット935との80bpの重複を含めたカセット940のバージョンを生成した。これにより4kbの欠失が生み出され、合成ゲノムと天然ゲノムとがさらに区別される。   Watermarks 1-4 were used in place of cassettes 282-287, 447, 106, and 680, respectively. Watermarks were inserted into regions that were experimentally proven not to interfere with cell survival (watermark 1 (1246 bp) and 2 (1081 bp)) or predicted regions (watermark 3 (1109 bp) and 4 (1222 bp)). Six reading frame stop codons are underlined at the beginning and end of each watermark; Afc I restriction sites are shown in bold italic.From our data, cassettes 936-939 Since the genomic sequence represented was suggested to be unnecessary, we generated a version of cassette 940 that included an 80 bp overlap with cassette 935. This produced a 4 kb deletion, A further distinction is made between synthetic and natural genomes.

合成ゲノムの設計は、この欠失と4つの透かし配列を有し、長さが1,077,947bpである。この配列を80bpの重複部分を有する1,080bp長のカセットに分割し、NotI制限部位(GCGGCCGC)を各末端に付加した。JCVI-syn1のゲノムマップを提供する、遺伝子、アセンブリされた1,078個のカセット、予期される多型、予期せぬ多型、挿入された大腸菌トランスポゾン、およびM.ミコイデスJCVI-syn1の他の特徴についてのマップを作製した: 遺伝子、構造RNA、透かし、天然M.ミコイデス・カプリGM12に対する多型、および合成DNAカセットの座標を同定した。表18には合成ゲノムと酵母中でクローニングされた本発明者らの対照の天然ゲノムYCpMmyc1.1との間の差異が載せてある。   The synthetic genome design has this deletion and four watermark sequences, and is 1,077,947 bp in length. This sequence was split into a 1,080 bp long cassette with an 80 bp overlap and a NotI restriction site (GCGGCCGC) was added to each end. About genes, assembled 1,078 cassettes, expected polymorphisms, unexpected polymorphisms, inserted E. coli transposon, and other features of M. mycoides JCVI-syn1 that provide a genomic map of JCVI-syn1 A map of: gene, structural RNA, watermark, polymorphisms against native M. mycoides Capri GM12, and the coordinates of the synthetic DNA cassette were identified. Table 18 lists the differences between the synthetic genome and our control native genome YCpMmyc1.1 cloned in yeast.

（表１８）M.ミコイデスJCVI-syn1と天然ゲノムYCpMmyc1.1との間の差異

Table 18: Differences between M. mycoides JCVI-syn1 and the native genome YCpMmyc1.1

差異は2つの群に分けられる: 1) 「設計した差異」- 合成ゲノム設計と天然YCpMmyc1.1ゲノムとの間の25個の差異、および2) 「設計していない」- sMmYCp235の1つの移植クローンから生じた配列決定済のゲノムとYCpMmyc1.1との間で認められた9個の差異。これらの差異をタイプによって分類する(列1)。設計したM.ミコイデスJCVI-syn1配列上の各差異の座標を示す(列2)。合成ゲノムと天然ゲノム上の実際の配列差異をsnpについて、ならびにホモポリマーおよびジヌクレオチドの連続について載せてある; 透かしの場合には透かしの名称を示してあり、置換されたM.ミコイデス配列の長さを示してある; サイズは与えられた欠失および挿入のものである(列3および4)。差異によって影響を受けるカセットおよび各差異に位置する検索文字列も示してある(列5および6)。   Differences are divided into two groups: 1) “designed differences”-25 differences between synthetic and native YCpMmyc1.1 genomes, and 2) “not designed”-one transplant of sMmYCp235 Nine differences observed between the sequenced genome generated from the clone and YCpMmyc1.1. Classify these differences by type (column 1). The coordinates of each difference on the designed M. mycoides JCVI-syn1 sequence are shown (column 2). The actual sequence differences on the synthetic and natural genomes are listed for snp and for homopolymer and dinucleotide sequences; in the case of watermarks, the name of the watermark is shown and the length of the substituted M. mycoides sequence The size is that of a given deletion and insertion (rows 3 and 4). The cassette affected by the difference and the search string located in each difference are also shown (columns 5 and 6).

設計した全ての1kbカセットを、Blue Heron; Bothell, Washingtonに合成を注文した。全てのカセットは製造元により個別に合成され、配列が検証された。   All designed 1 kb cassettes were ordered from Blue Heron; Bothell, Washington for synthesis. All cassettes were synthesized individually by the manufacturer and sequence verified.

実施例6B
合成ドナーゲノムのアセンブリおよび移植
酵母での形質転換および相同組換えにより3段階でゲノムをアセンブリするように階層的戦略を設計した(図20に例証されている)。第1の段階では、一度に10カセットを取り込んで10kbのアセンブリ中間体を生成する。第2の段階では、これら10kbの中間体を一度に10個ずつ取り込んで11個のおよそ100kbのアセンブリ中間体を生成する。最終の段階では、全11個のDNA断片を完全な合成ゲノムへアセンブリする。 Example 6B
Assembly and transplantation of synthetic donor genome A hierarchical strategy was designed to assemble the genome in three steps by transformation in yeast and homologous recombination (illustrated in FIG. 20). In the first stage, 10 cassettes are taken at a time to produce a 10 kb assembly intermediate. In the second step, these 10 kb intermediates are incorporated 10 at a time to produce 11 approximately 100 kb assembly intermediates. In the final stage, all 11 DNA fragments are assembled into a complete synthetic genome.

i.宿主ベクター調製
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を用いて、各アセンブリのクローニング用に特有のベクターを生成した。増幅されたベクターには、アセンブリの末端との末端重複部分が含まれる。アセンブリベクターの調製のための戦略は、これまでに記述されている(Gibson et al., Science 319, 1215 (2008))。各PCRプライマーはベクターの一端との20bpの重複部分、NotI制限部位、およびカセットアセンブリの一端との40bpの重複部分を含む。アセンブリの第1段階のため、PCRにおける鋳型DNA用にpCC1BAC-LCYEASTと名付けた酵母/大腸菌シャトルベクターを生成した。このベクターは、AfeI制限断片との40bpの重複部分、ヒスチジン選択マーカー、セントロメア、および複製起点(pRS313 (Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (1989)に由来する)からなるPCR産物とAfeI消化pCC1BACとのインビトロアセンブリによって構築した(Gibson et al., Nat. Methods., 6: 343 (2009))。 i. Host Vector Preparation Polymerase chain reaction (PCR) amplification was used to generate unique vectors for cloning each assembly. The amplified vector contains a terminal overlap with the end of the assembly. Strategies for the preparation of assembly vectors have been described previously (Gibson et al., Science 319, 1215 (2008)). Each PCR primer contains a 20 bp overlap with one end of the vector, a NotI restriction site, and a 40 bp overlap with one end of the cassette assembly. For the first stage of assembly, a yeast / E. Coli shuttle vector named pCC1BAC-LCYEAST was generated for template DNA in PCR. This vector consists of a PCR product consisting of a 40 bp overlap with the AfeI restriction fragment, a histidine selection marker, a centromere, and an origin of replication (derived from pRS313 (derived from Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (1989)) and AfeI digested pCC1BAC. (Gibson et al., Nat. Methods., 6: 343 (2009)).

アセンブリの第2段階のため、pRS314 (Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (1989))を(鋳型DNAとしてpCC1BACを用いた、831-840のアセンブリを除き) PCRにおける鋳型DNAとして用いた。特有のアセンブリベクターは、反応液に1mMのさらなるMgCl₂を補充し、産物を60℃でアニールし、1キロベースあたり1分間伸長したことを除き、製造元の使用説明書にしたがってHF緩衝液(NEB)とともにPhusion(登録商標) Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼを用いてPCRにより作製した。PCR産物を電気泳動後にアガロースゲルから抽出し、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い精製した。本発明者らは天然断片および合成断片をクローニングするために同じ第2段階のベクターを用いることもできたが、天然の100kbの断片をクローニングするためにさらなるベクター配列を構築した。このベクター配列をpCC1BAC-URAと名付け、pRS313の代わりにpRS316を用いたことを除き、pCC1BACLCYEASTを構築したのと同じように構築した。PCR増幅アセンブリベクターを生成するために用いたプライマーは、表19〜21に載せてある。 For the second stage of assembly, pRS314 (Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (1989)) was used as the template DNA in PCR (except for the 831-840 assembly, using pCC1BAC as the template DNA). The unique assembly vector is supplemented with 1 mM additional MgCl ₂ to the reaction and the product is annealed at 60 ° C. and extended for 1 minute per kilobase, followed by HF buffer (NEB) according to the manufacturer's instructions. ) And Phusion (registered trademark) Hot Start High-Fidelity DNA polymerase. The PCR product was extracted from the agarose gel after electrophoresis and purified using the QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. We could use the same second stage vector to clone the natural and synthetic fragments, but constructed additional vector sequences to clone the natural 100 kb fragment. This vector sequence was named pCC1BAC-URA and was constructed in the same way as pCC1BACLCYEAST was constructed except that pRS316 was used instead of pRS313. The primers used to generate the PCR amplification assembly vector are listed in Tables 19-21.

（表１９）特有の第1段階アセンブリベクターを生成するために用いたプライマー
カセット配列の末端との重複を大文字で示す。

Table 19: Capitalization of the ends of primer cassette sequences used to generate unique first stage assembly vectors.

（表２０）特有の第二段階合成アセンブリベクターを生成するために用いたプライマー
10kbのアセンブリ配列の末端との重複を大文字で示す。

Table 20: Primers used to generate unique second stage synthetic assembly vectors
Overlap with the end of the 10 kb assembly sequence is shown in capital letters.

（表２１）100kbの天然M.ミコイデス断片をクローニングするための特有のベクターを生成するために用いたプライマー
100kbの天然配列の末端との重複を大文字で示す。

Table 21: Primers used to generate unique vectors for cloning the 100 kb native M. mycoides fragment.
The overlap with the end of the 100 kb native sequence is shown in capital letters.

ii.10kbの合成中間体のアセンブリ
ドナーゲノムの断片をほぼ等しい濃度でDNAカセットとして供給し、大腸菌クローニングベクターに含めた。これらのカセットの等量を10セットにプールし、NotIで消化して挿入断片を放出し、ゲル精製し、その後、宿主ベクター、特有の酵母/大腸菌シャトルベクターと混合した。 ii. Assembly of a 10 kb synthetic intermediate A fragment of the donor genome was supplied as a DNA cassette at approximately equal concentrations and included in an E. coli cloning vector. Equal amounts of these cassettes were pooled into 10 sets, digested with NotI to release the insert, gel purified, and then mixed with the host vector, a unique yeast / E. Coli shuttle vector.

a.カセットDNAの調製
未切断カセットDNAおよそ500 ngを10セットにプールし、NotIで消化し、96 Vにて90分間1%低融点アガロースゲル上で電気泳動した。1kbのDNA断片をゲルから切り出し、ゲルスライスの質量を測定した。3M酢酸ナトリウムを含有する10×TAE緩衝液の10分の1溶液を各ゲルスライスに加え、アガロースゲルを10分間65℃で融解した。ゲルスライスを融解した後に、それらを42℃で15分間インキュベートし、β-アガラーゼ(NEB)を50分の1で加え、1時間以上インキュベーションを継続した。フェノール抽出およびエタノール沈殿(グリコブルー1μlの存在下)の後、DNAをTE (pH 8.0) 40μlに再懸濁した。10マイクロリットルを形質転換実験に用いた。 a. Preparation of cassette DNA Approximately 500 ng of uncleaved cassette DNA was pooled into 10 sets, digested with NotI, and electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel at 96 V for 90 minutes. A 1 kb DNA fragment was excised from the gel and the mass of the gel slice was measured. A 1 / 10th solution of 10 × TAE buffer containing 3M sodium acetate was added to each gel slice and the agarose gel was melted at 65 ° C. for 10 minutes. After thawing the gel slices, they were incubated for 15 minutes at 42 ° C., β-agarase (NEB) was added 1/50 and the incubation continued for over 1 hour. After phenol extraction and ethanol precipitation (in the presence of 1 μl glycoblue), the DNA was resuspended in 40 μl TE (pH 8.0). Ten microliters were used for transformation experiments.

b.宿主ベクター
この宿主ベクターは、酵母での選択および増殖のために挿入されたヒスチジン栄養要求性マーカー、セントロメア、および複製起点を有する細菌人工染色体(BAC; pCC1BAC [Epicentre])である。酵母増殖エレメントはアセンブリ831-840中に既に設計した。このため、このアセンブリのためのクローニングベクターにはBACエレメント(pCC1BAC)が含まれただけであった。特有の第1段階アセンブリベクターは、アセンブリされるカセットの末端との40bpの重複配列を含んだプライマーでのPCR増幅によって生成した(Gibson et al., Science 319, 1215 (Feb 29, 2008))。 b. Host Vector This host vector is a bacterial artificial chromosome (BAC; pCC1BAC [Epicentre]) with a histidine auxotrophic marker, centromere, and origin of replication inserted for selection and propagation in yeast. The yeast growth element was already designed in assembly 831-840. For this reason, the cloning vector for this assembly only contained the BAC element (pCC1BAC). A unique first stage assembly vector was generated by PCR amplification with a primer containing a 40 bp overlap sequence with the end of the assembled cassette (Gibson et al., Science 319, 1215 (Feb 29, 2008)).

c.酵母形質転換
これらのプライマーにはNotI制限部位も含まれ、これによりアセンブリしたカセットをベクターからインタクトのまま放出させることが可能になった。次いで宿主ベクター/カセット混合物で酵母を形質転換し、選択プレート上で数日間インキュベートした。 c. Yeast Transformation These primers also contained a NotI restriction site, which allowed the assembled cassette to be released intact from the vector. The yeast was then transformed with the host vector / cassette mixture and incubated on selection plates for several days.

酵母スフェロプラスト形質転換手順において、細胞をザイモリアーゼで処理して細胞壁を除去し、次いで、PEGおよびCaCl₂での処理によって外来DNAを取り込むようにコンピテントにした。この手順は、VL6-48N酵母株で既刊のプロトコル(6)を用い1つの変更を加えて行った: 酵母スフェロプラストの調製の前に細胞をOD600 0.5 (細胞およそ10⁷個/ml)まで増殖させた。本発明者らは、この光学密度が酵母での複数の重複断片のアセンブリに最適であることを見出した。NotI消化断片をプールし、特有のPCR増幅アセンブリベクター40 ngと混合し(アセンブリの最終段階を除き)、次いで、およそ2×10⁸個の酵母スフェロプラストに加えた。形質転換の後、酵母スフェロプラストを再生し、ヒスチジンなしの完全補充培地(CSM-His; 10kbのアセンブリ、811-900、および完全ゲノム)またはトリプトファンなしの完全補充培地(CSM-Trp; 811-900を除く100kbのアセンブリ)および1Mのソルビトール寒天プレート上にて30℃で3日間選択した。次いで一次形質転換体を小パッチとして選択プレート上へ移し、30℃で一晩インキュベートした。 In yeast spheroplast transformation procedure, cells were treated with Zymolyase to remove cell wall, and then competent to incorporate foreign DNA by treatment with PEG and CaCl _2. This procedure was performed with the VL6-48N yeast strain using a published protocol (6) with one modification: cells were prepared to OD600 0.5 (approximately 10 ⁷ cells / ml) prior to preparation of yeast spheroplasts. Allowed to grow. The inventors have found that this optical density is optimal for the assembly of multiple overlapping fragments in yeast. NotI digested fragments were pooled, mixed with 40 ng of the unique PCR amplification assembly vector (except for the final stage of assembly) and then added to approximately 2 × 10 ⁸ yeast spheroplasts. Following transformation, yeast spheroplasts are regenerated and completely supplemented medium without histidine (CSM-His; 10 kb assembly, 811-900, and complete genome) or tryptophan-free complete supplemented medium (CSM-Trp; 811- 100 kb assembly excluding 900) and 1M sorbitol agar plates were selected for 3 days at 30 ° C. The primary transformants were then transferred as small patches onto selection plates and incubated overnight at 30 ° C.

d.第2段階アセンブリのスクリーニングおよび調製
プラスミドDNAを個々の酵母クローンから抽出し、これを用いて、アセンブリしたカセットの増殖にさらに適した宿主である大腸菌を形質転換した。次いでプラスミドDNAを個々の大腸菌クローンから単離し、NotIで消化して、アセンブリした10kbの挿入断片(10kbのアセンブリの成功を示すゲルデータ: データ示さず)を有するベクターを含んだ細胞をスクリーニングした。 d. Screening and preparation of second stage assembly Plasmid DNA was extracted from individual yeast clones and used to transform E. coli, a host more suitable for propagation of the assembled cassette. Plasmid DNA was then isolated from individual E. coli clones, digested with NotI, and screened for cells containing vectors with the assembled 10 kb insert (gel data indicating successful 10 kb assembly: data not shown).

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い1つの変更を加えて酵母細胞(パッチ由来)およそ10⁷個からDNAを抽出した: 緩衝液P1に1000分の1のβ-メルカプトエタノールおよび100分の1の20mg/mlザイモリアーゼ(Zymolyase-100T) (USB)を補充し、細胞を緩衝液P2の添加の前に30〜60分間37℃でインキュベートした。酵母抽出DNAの試料(3μlまで)により、Gene Pulser Xcell Electroporationシステム(BioRad)を用いて1,200 V、25μFおよび200 Ωで1 mmキュベット(BioRad)中のEPI300(商標) (Epicentre)エレクトロコンピテント大腸菌細胞30μlを形質転換した。細胞をSOC培地1ml中にて1.5時間37℃で回復させ、その後、12.5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地上に播種した。37℃で16〜24時間のインキュベーションの後、個々のコロニーを選び、12.5μg/mlのクロラムフェニコールを有するLB培地3ml中にて37℃で一晩増殖させた。 DNA was extracted from approximately 10 ⁷ yeast cells (from patches) with one change using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions: 1/1000 β-mercapto in buffer P1 Ethanol and 1 / 100th of 20 mg / ml Zymolyase-100T (USB) were supplemented and cells were incubated at 37 ° C. for 30-60 minutes prior to addition of buffer P2. EPI300TM (Epicentre) electrocompetent E. coli cells in 1 mm cuvettes (BioRad) at 1,200 V, 25 μF and 200 Ω using Gene Pulser Xcell Electroporation system (BioRad) with samples of yeast extracted DNA (up to 3 μl) 30 μl was transformed. Cells were allowed to recover in 1 ml SOC medium for 1.5 hours at 37 ° C. and then seeded on LB medium containing 12.5 μg / ml chloramphenicol. After incubation for 16-24 hours at 37 ° C., individual colonies were picked and grown overnight at 37 ° C. in 3 ml of LB medium with 12.5 μg / ml chloramphenicol.

DNAをこれらの細胞からP1、P2およびP3緩衝液(Qiagen)を用いたアルカリ溶解、引き続きイソプロパノール沈殿により調製した。DNAペレットを、RNase AおよびRNase T1 (Ambion)を含有するTE緩衝液(pH 8.0)に溶解した。あるいは、DNAをQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)から、提供されている使用説明書にしたがって調製した。   DNA was prepared from these cells by alkaline lysis using P1, P2 and P3 buffers (Qiagen) followed by isopropanol precipitation. The DNA pellet was dissolved in TE buffer (pH 8.0) containing RNase A and RNase T1 (Ambion). Alternatively, DNA was prepared from QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) according to the instructions provided.

精製の後、DNAをNotI (時にはSbfI)で消化して、ベクターから挿入断片を放出させ、30〜60分間0.8% E-ゲル(Invitrogen)上でのゲル電気泳動によりサイズ分類した。Amersham Typhoon 9410蛍光イメージャーを用いてバンドを可視化した。   After purification, the DNA was digested with NotI (sometimes SbfI) to release the insert from the vector and sized by gel electrophoresis on a 0.8% E-gel (Invitrogen) for 30-60 minutes. Bands were visualized using an Amersham Typhoon 9410 fluorescence imager.

陽性クローンを、12.5μg/mlのクロラムフェニコールおよび1000分の1の誘導溶液(Epicentre)を含有するLB培地10ml中で増殖させ、37℃で一晩インキュベートした。培養物を集め、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがい用いてDNA分子を精製した。アセンブリ211-220はEpi300 (商標)株において不安定であったので、アセンブリ211-220をStb14株(Invitrogen)に移入し、そこではアセンブリ211-220を安定的に維持することができた。このアセンブリはこの株においていっそう高いコピーレベルにまでは誘導することができず、上記のようにカラム精製されなかった。代わりに、このクローンは、12.5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地50ml中で増殖させた。溶解細胞の中和後、これらのDNA分子を遠心分離し、次にイソプロパノールで沈殿させた。DNAペレットをTE緩衝液(pH 8.0)に溶解し、次いでRNase処理し、フェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。DNAペレットをTE緩衝液に溶解した。10kbのアセンブリごとに、NotI消化DNAを既知のDNA標準物質と並べてゲル電気泳動により定量化した。   Positive clones were grown in 10 ml LB medium containing 12.5 μg / ml chloramphenicol and 1/1000 induction solution (Epicentre) and incubated overnight at 37 ° C. Cultures were collected and DNA molecules were purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Since assembly 211-220 was unstable in the Epi300 ™ strain, assembly 211-220 was transferred to Stb14 strain (Invitrogen) where assembly 211-220 could be stably maintained. This assembly could not be induced to higher copy levels in this strain and was not column purified as described above. Instead, this clone was grown in 50 ml LB medium containing 12.5 μg / ml chloramphenicol. After neutralization of the lysed cells, these DNA molecules were centrifuged and then precipitated with isopropanol. The DNA pellet was dissolved in TE buffer (pH 8.0), then treated with RNase, extracted with phenol chloroform, and ethanol precipitated. The DNA pellet was dissolved in TE buffer. For each 10 kb assembly, NotI digested DNA was quantified by gel electrophoresis alongside a known DNA standard.

概して、10個の酵母クローンをスクリーニングすることによって少なくとも1つの10kbのアセンブリ断片を得ることができた。しかしながら、成功率は10〜100%まで変化した。アセンブリの1つ、791-799は酵母での相同組換えによって生成することができなかった。この断片は2つの部分791-795および796-799に分割し、これをインビトロ組換えによって個々にアセンブリした(Gibson et al., Nat Methods 6, 343 (May, 2009))。211-220を除いて、全ての第1段階アセンブリをEpi300大腸菌細胞(Epicentre)において増殖させた。この細胞株は単一コピーから高コピー数までのクローニングベクターの誘導を可能にする。アセンブリ211-220はEpi300細胞において不安定であったので、Stb14細胞に移入し、そこではアセンブリ211-220を安定的に維持することができた。   In general, at least one 10 kb assembly fragment could be obtained by screening 10 yeast clones. However, the success rate varied from 10 to 100%. One of the assemblies, 791-799, could not be generated by homologous recombination in yeast. This fragment was divided into two parts 791-795 and 796-799, which were individually assembled by in vitro recombination (Gibson et al., Nat Methods 6, 343 (May, 2009)). With the exception of 211-220, all first stage assemblies were grown in Epi300 E. coli cells (Epicentre). This cell line allows the induction of cloning vectors from single copy to high copy numbers. Since assembly 211-220 was unstable in Epi300 cells, it was transferred to Stb14 cells, where it was able to maintain assembly 211-220 stably.

第1段階の中間体の全てを配列決定した。111個のアセンブリのうちの19個が誤りを含んでいた。本発明者らの配列決定分析から、アセンブリ81-90および811-820が、それぞれ、カセット82および812に起因する単一の誤りを各々含むことが明らかにされた。カセット82は1kbのレベルで修正し、再アセンブリして、誤りのない81-90のクローンを生成した。カセット812における変異は811の重複部分において生じていたが、これは誤りを含んでない。それゆえ、811-820のさらなるクローンを配列決定した場合に、これらのいくつかは誤りを含んでいなかった。配列を検証した811-820のクローンの1つを後続のアセンブリ反応に用いた。本発明者らは、121-130に存在していた誤りを修正しないことを選択した。というのは、それが非必須遺伝子における同義変異であったからである。この変異は、合成ゲノムを天然ゲノムとさらに区別するためのさらなる差異として役立った(表18)。変異の1つは、アセンブリした断片を大腸菌中での増殖中に単一コピー数で維持することによって回避することができた。誤りの1つは、カセット接続部の1つでのNotI制限部位の不完全な除去によって生成された。誤りの4つは、クローニングベクターをPCR増幅するために用いたプライマーに由来する可能性が高かった。残りの誤りは酵母での増殖中に生成された。15アセンブリの代わりのクローンを選び、配列を検証した。   All of the first stage intermediates were sequenced. Nineteen of the 111 assemblies contained errors. Our sequencing analysis revealed that assemblies 81-90 and 811-820 contained single errors due to cassettes 82 and 812, respectively. Cassette 82 was corrected at the 1 kb level and reassembled to generate 81-90 clones without errors. The mutation in cassette 812 occurred in the 811 overlap, which is error-free. Therefore, some of these were error-free when further clones of 811-820 were sequenced. One of the 811-820 clones whose sequence was verified was used in subsequent assembly reactions. The inventors have chosen not to correct the errors that existed in 121-130. This is because it was a synonymous mutation in a non-essential gene. This mutation served as an additional difference to further distinguish the synthetic genome from the natural genome (Table 18). One of the mutations could be avoided by maintaining the assembled fragment at a single copy number during growth in E. coli. One of the errors was generated by incomplete removal of the NotI restriction site at one of the cassette junctions. Four of the errors were likely derived from the primers used to PCR amplify the cloning vector. The remaining errors were generated during growth in yeast. An alternative clone of 15 assemblies was selected and sequence verified.

iii.100kbの合成中間体のアセンブリ
a.DNAの調製
10kbのアセンブリ中間体の等量を10セットにプールし、NotIで消化して挿入断片を放出し、次いでゲル精製した。未切断DNAおよそ125 ngを10セットにプールし、NotIで(および通常はベクターバンドと挿入断片とのさらに良好な分離を与えるために同様にSbfIで)消化し、96 Vにて90分間1%低融点アガロースゲル上で電気泳動した。10kbのDNA断片をゲルから切り出し、上記のようにβ-アガラーゼ処理の後に抽出した。DNAをTE (pH 8.0) 20μlに再懸濁した。10マイクロリットルをベクター40 ngでの形質転換実験に用いた。 iii. Assembly of 100kb synthetic intermediate
a. Preparation of DNA
Equal amounts of 10 kb assembly intermediates were pooled into 10 sets, digested with NotI to release the insert, and then gel purified. Pool approximately 125 ng of uncleaved DNA into 10 sets, digest with NotI (and usually with SbfI as well to give better separation of vector band and insert), 1% at 96 V for 90 minutes Electrophoresis on a low melting point agarose gel. A 10 kb DNA fragment was excised from the gel and extracted after β-agarase treatment as described above. DNA was resuspended in 20 μl TE (pH 8.0). Ten microliters were used for transformation experiments with 40 ng of vector.

b.宿主ベクター
これらのゲル精製したアセンブリを、PCRの鋳型としてpRS414 (Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (May, 1989))を用いたこと以外は上記のように調製された、特有の第2段階の宿主ベクターと混合した。酵母において選択マーカーはヒスチジンからトリプトファンへ変えられるので、本発明者らは、望ましくないクローンのバックグラウンドを減らせるものと推論した。酵母増殖エレメントはアセンブリ811-900に既に存在していた。それゆえ、アセンブリ831-840と同様に、アセンブリ811-900のクローニングベクターはBACエレメントからなるのみであった。 b. Host vectors These gel-purified assemblies were prepared as described above, except that pRS414 (Sikorski and Hieter, Genetics 122, 19 (May, 1989)) was used as a PCR template. Mixed with the stage host vector. Since the selectable marker is changed from histidine to tryptophan in yeast, we reasoned that the background of undesirable clones could be reduced. The yeast growth element was already present in assembly 811-900. Therefore, like assembly 831-840, the cloning vector of assembly 811-900 only consisted of BAC elements.

c.酵母形質転換
プールした10kbのアセンブリおよびその各クローニングベクターを用いて、上記のように酵母を形質転換して、100kbのアセンブリ中間体を生成した。これによって数百の酵母クローンを得た。 c. Yeast transformation The pooled 10 kb assembly and its respective cloning vectors were used to transform yeast as described above to produce a 100 kb assembly intermediate. This gave hundreds of yeast clones.

d.最終のドナーゲノムアセンブリのスクリーニングおよび調製
100kbのアセンブリの各々に対して予想されるPCRパターンを実証するために、表22に載せたマルチプレックスPCRプライマーを用いてYCpMmyc1.1をスクリーニングし、これを酵母から抽出した。PCRアンプリコンは100bp間隔で隔てた。 d. Screening and preparation of final donor genome assembly
To demonstrate the expected PCR pattern for each of the 100 kb assemblies, YCpMmyc1.1 was screened using multiplex PCR primers listed in Table 22 and extracted from yeast. PCR amplicons were separated by 100 bp intervals.

（表２２）

(Table 22)

アンプリコン10d (下線; 931-940に対応する領域)、およびアセンブリ796-799を除いて、全ての第1段階アセンブリをこのPCR分析によって説明することができる。下流分析を用いて、701-799および901-100中間体をさらに確認した。この結果から、大腸菌においてM.ミコイデスの100kbのアセンブリ中間体を安定的に維持できないことが示唆されたので、10kbのアセンブリをスクリーニングするために用いた方法は利用することができなかった。代わりに、サイズが100bpから1150bpに及ぶアンプリコンを生ずる、110組のプライマー対を、個々のマルチプレックスPCR反応の11反応（100kbのアセンブリ中間体につき）の各々において9〜11個のアンプリコンを生成しうるように設計した(表23および表24)。   Except for amplicon 10d (underlined; region corresponding to 931-940) and assembly 796-799, all first stage assemblies can be described by this PCR analysis. Downstream analysis was used to further confirm the 701-799 and 901-100 intermediates. This result suggested that the 100 kb assembly intermediate of M. mycoides could not be stably maintained in E. coli, so the method used to screen the 10 kb assembly could not be used. Instead, 110 primer pairs yielding amplicons ranging in size from 100 bp to 1150 bp, and 9-11 amplicons in each of 11 reactions (per 100 kb assembly intermediate) of each multiplex PCR reaction. It was designed to be generated (Table 23 and Table 24).

（表２３）アンプリコン

(Table 23) Amplicon

（表２４）第1段階アセンブリの全てを含んだ100kbの中間体を同定するために用いたマルチプレックスPCRプライマー

Table 24: Multiplex PCR primers used to identify a 100 kb intermediate containing all of the first stage assembly

すべての10kbアセンブリ中間体がプライマー対によって表されたので、全てのアンプリコンの存在から、アセンブリされた100kbの中間体が示唆される。DNAを10個またはそれ以上の酵母クローンから抽出し、プライマー対の各セットでのマルチプレックスPCRによって分析した。DNAを上記のようにパッチから抽出した。   Since all 10 kb assembly intermediates were represented by primer pairs, the presence of all amplicons suggests an assembled 100 kb intermediate. DNA was extracted from 10 or more yeast clones and analyzed by multiplex PCR with each set of primer pairs. DNA was extracted from the patch as described above.

表24に同定されているプライマーを用いQiagen Multiplex PCR Kitを用いてマルチプレックスPCRを行った。DNA抽出物1/50容量(1μl)および20種のオリゴを各2.5〜5.0μMで含有する10×プライマーストック1μlを反応液各10μl中に含めた。サイクリングパラメーターは15分間94℃、次いで30秒間94℃、90秒間57〜60℃、および90秒間72℃を35サイクル、引き続き一回の、72℃で3分のインキュベーションであった。その後、各反応液2μlを2% E-ゲル(登録商標) (Invitrogen)上に負荷し、72 Vを30分間加えた。Typhoon 9410蛍光イメージャーを用いてバンドを可視化した。   Multiplex PCR was performed using Qiagen Multiplex PCR Kit using the primers identified in Table 24. 1 μl of DNA extract containing 1/50 volume (1 μl) and 20 oligos at 2.5-5.0 μM each was included in 10 μl of each reaction. The cycling parameters were 94 ° C for 15 minutes, then 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 57-60 ° C for 90 seconds, and 72 ° C for 90 seconds, followed by a single 3 minute incubation at 72 ° C. Subsequently, 2 μl of each reaction was loaded onto 2% E-gel® (Invitrogen) and 72 V was added for 30 minutes. Bands were visualized using a Typhoon 9410 fluorescence imager.

酵母からの100kbのスーパーコイル環状アセンブリの小規模単離の場合、飽和した酵母培養物5mlを選択培地中で増殖させた。この手順は既述の方法(Leem et al. (2008) Genome, 51: 155)に基づくが、スケールダウンされ、酵母染色体DNAの除去に重きを置いていない。   For small scale isolation of a 100 kb supercoiled circular assembly from yeast, 5 ml of saturated yeast culture was grown in selective medium. This procedure is based on the previously described method (Leem et al. (2008) Genome, 51: 155) but is scaled down and does not focus on the removal of yeast chromosomal DNA.

手短に言えば、収集した酵母細胞を、水1mlを有する微量遠心管に移し、14M β-メルカプトエタノール8μlを有する前処理用緩衝液(Pretreatment Buffer; 1.2Mソルビトール、200mM Tris-Cl、100mM EDTA, pH9.1にする) 1mlに再懸濁した。室温で10分のインキュベーションの後、細胞を収集し、SCE (1Mソルビトール、60mM EDTA、100mMクエン酸ナトリウム, pH 5.75) 1mlで2回洗浄し、SCE 1mlに加えてザイモリアーゼ(Zymolyase)-100T溶液(20mg/mlザイモリアーゼ-100T [USB]、50%グリセロール、2.5%グルコース、50mM Tris-Cl, pH 8.0) 10μlに再懸濁した。37℃で1時間のインキュベーションの後、スフェロプラストを収集し、次いで、Tris/スクロース緩衝液(50mM Tris-Cl pH 8.0、25%スクロース) 25μlおよびプロテイナーゼK溶液(10mg/mlのプロテイナーゼK [Sigma]、1mM塩化カルシウム、50mM Tris-Cl pH 8.0) 20μlに再懸濁した。次に、溶解用緩衝液(20mM EDTA、50mM Tris-Cl、1% SDS, pH 12.45) 475μlを加え、上下にピペッティングすることによって混合した。37℃で30分のインキュベーションの後、2M Tris-Cl pH 7.0 100μlを加え、混合した。次に、4M NaCl 100μlを加え、混合した。室温で30分のインキュベーションの後、3M酢酸ナトリウム70μlを加え、混合した。標準的なフェノール・クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿、および70%エタノール洗浄を行い、DNAペレットを、RNase Aを含有するTE pH 8.0 100μlに再懸濁した。37℃で1時間のインキュベーションの後、DNA 10μlを1×TAE緩衝液中1%のアガロースゲル上に負荷し、電気泳動を4.5 V/cmで3時間行った。電気泳動の後、ゲルをSYBR(登録商標) Goldで染色し、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。   Briefly, the collected yeast cells are transferred to a microfuge tube with 1 ml of water and pretreatment buffer (Pretreatment Buffer; 1.2 M sorbitol, 200 mM Tris-Cl, 100 mM EDTA, 8 μl of 14 M β-mercaptoethanol). pH 9.1) Resuspended in 1 ml. After 10 minutes incubation at room temperature, cells were harvested, washed twice with 1 ml of SCE (1M sorbitol, 60 mM EDTA, 100 mM sodium citrate, pH 5.75), added to 1 ml of SCE and Zymolyase-100T solution ( Resuspended in 10 μl of 20 mg / ml zymolyase-100T [USB], 50% glycerol, 2.5% glucose, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0). After 1 hour incubation at 37 ° C., spheroplasts were collected and then 25 μl Tris / sucrose buffer (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 25% sucrose) and proteinase K solution (10 mg / ml proteinase K [Sigma ], 1 mM calcium chloride, 50 mM Tris-Cl pH 8.0) and resuspended in 20 μl. Next, 475 μl of lysis buffer (20 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, 1% SDS, pH 12.45) was added and mixed by pipetting up and down. After 30 minutes incubation at 37 ° C., 100 μl of 2M Tris-Cl pH 7.0 was added and mixed. Next, 100 μl of 4M NaCl was added and mixed. After 30 minutes incubation at room temperature, 70 μl of 3M sodium acetate was added and mixed. Standard phenol / chloroform extraction, isopropanol precipitation, and 70% ethanol wash were performed and the DNA pellet was resuspended in 100 μl TE pH 8.0 containing RNase A. After 1 hour incubation at 37 ° C., 10 μl of DNA was loaded onto a 1% agarose gel in 1 × TAE buffer and electrophoresis was performed at 4.5 V / cm for 3 hours. After electrophoresis, the gel was stained with SYBR® Gold and scanned with a GE Typhoon 9410 imager.

一般に、スクリーニングしたクローンの25%またはそれ以上に、完全なアセンブリの予想されるアンプリコンの全てが含まれた。これらのクローンの1つをさらなるスクリーニングのために選んだ。環状プラスミドDNAを抽出し、スーパーコイルマーカーと並べてアガロースゲル上でサイズ分類した。ベクター配列を有する成功した第2段階アセンブリは、長さがおよそ105kbである(データ示さず)。全てのアンプリコンがマルチプレックスPCR後に生成された場合には、的確なサイズの第2段階アセンブリ中間体が通常、生成された。しかしながら、場合によっては、小さな欠失が起きた。他の例では、複数の10kbの断片をアセンブリし、これがさらに大きい第2段階アセンブリ中間体を生じた。幸いなことに、これらの差異は完全なゲノムアセンブリの前にアガロースゲル上で容易に検出することができた。   In general, 25% or more of the screened clones contained all of the expected amplicons of the complete assembly. One of these clones was chosen for further screening. Circular plasmid DNA was extracted and sized on an agarose gel alongside the supercoil marker. A successful second stage assembly with vector sequence is approximately 105 kb in length (data not shown). If all amplicons were generated after multiplex PCR, the correct size second stage assembly intermediate was usually generated. In some cases, however, small deletions occurred. In another example, multiple 10 kb fragments were assembled, resulting in a larger second stage assembly intermediate. Fortunately, these differences could be easily detected on agarose gels prior to complete genome assembly.

iv.合成ドナーゲノムの最終アセンブリ
a.DNAの調製
アセンブリの最終段階の調製では、11個の第2段階アセンブリの各々のマイクログラム量を単離した; これは簡単ではなかった。というのは、これらのアセンブリを酵母から精製しなければならなかったからである。既報(Devenish and Newlon, Gene 18, 277 (Jun, 1982))のように、本発明者らは、本発明者らの第2段階アセンブリのサイズの環状プラスミドをアルカリ溶解手順の後に酵母スフェロプラストから単離できることを見出した。11個のアセンブリ中間体をさらに精製するために、それらをエキソヌクレアーゼ処理し、陰イオン交換カラムに通した。総プラスミドDNAのごく一部(100分の1)をNotIで消化し、電場反転ゲル電気泳動(FIGE)によって分析した(データ示さず)。この方法によって、400mlの酵母培養物(細胞およそ10¹¹個)あたりおよそ1μgの各アセンブリが生成された。 iv. Final assembly of the synthetic donor genome
a. DNA Preparation In the final stage preparation of the assembly, microgram quantities of each of the 11 second stage assemblies were isolated; this was not straightforward. This is because these assemblies had to be purified from yeast. As previously reported (Devenish and Newlon, Gene 18, 277 (Jun, 1982)), we have developed a circular plasmid of the size of our second stage assembly after yeast spheroplast It was found that it can be isolated from To further purify the 11 assembly intermediates, they were exonuclease treated and passed through an anion exchange column. A small portion (1/100) of the total plasmid DNA was digested with NotI and analyzed by field inversion gel electrophoresis (FIGE) (data not shown). This method produced approximately 1 μg of each assembly per 400 ml of yeast culture (approximately 10 ¹¹ cells).

酵母からの100kbのアセンブリの大規模単離の場合、11個の100kbのアセンブリのうちの1つを持つ各VL6-48N株の前培養物(5〜10ml)を選択培地中で飽和状態にまで一晩増殖させ、その後、選択培地400mlの中に播種した。培養物がOD600 1.5に達したら、細胞を収集した(2,205 rcf、3分)。ペレットを水100mlに再懸濁し、2本の50mlコニカル管に移し、上記のように収集した。細胞ペレットを、ザイモリアーゼ-20T (10mg/ml) 0.4mlおよび14M β-メルカプトエタノール40μlを含有するSPE (1Mソルビトール、10mM Na2EDTA、0.01Mリン酸Na, pH 7.5) 40mlに再懸濁した。細胞懸濁液を37℃で60分間インキュベートした。スフェロプラストを収集し(5分間1,125 rcf)、1Mソルビトール1mlに再懸濁し、その後、溶解緩衝液(0.05M Tris-HCl、0.02M EDTA、1% SDS, pH 12.8) 20mlを加え、試験管を10回反転した。細胞溶解物を30分間37℃でインキュベートし、その後、20回の穏やかな反転および3,645 rcfで20分間の遠心分離の後にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(Invitrogen) 20mlで抽出した。   For large-scale isolation of 100 kb assemblies from yeast, preculture (5-10 ml) of each VL6-48N strain with one of 11 100 kb assemblies to saturation in selective medium. Grow overnight and then inoculate in 400 ml of selective medium. When the culture reached OD600 1.5, the cells were harvested (2,205 rcf, 3 min). The pellet was resuspended in 100 ml water, transferred to two 50 ml conical tubes and collected as described above. The cell pellet was resuspended in 40 ml of SPE (1 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0.01 M Na phosphate, pH 7.5) containing 0.4 ml zymolyase-20T (10 mg / ml) and 40 μl 14M β-mercaptoethanol. The cell suspension was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Spheroplasts are collected (1,125 rcf for 5 minutes), resuspended in 1 ml of 1M sorbitol, then 20 ml of lysis buffer (0.05M Tris-HCl, 0.02M EDTA, 1% SDS, pH 12.8) is added and the tube Was inverted 10 times. Cell lysates were incubated for 30 minutes at 37 ° C. and then extracted with 20 ml of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (Invitrogen) after 20 gentle inversions and centrifugation at 3,645 rcf for 20 minutes.

水相を新しい50mlコニカル管に移した。3M NaAc (pH 5.2) 2mlおよびイソプロパノール20mlを加え、引き続き4℃、30分間3,645 rcfでの遠心分離を行うことによってDNA沈殿を行った。ペレットを、RNase A (30μg/ml)を含有するTE (pH 8.0) 1mlに再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。この時点で、2つのDNA試料を混ぜ合わせた。環状DNAをQiagen Large-Construct Kitによってさらに精製した。若干の変更を加えつつ製造元の使用説明書にしたがって精製を行った。EX緩衝液10mlをDNA溶液と混合し、引き続きエキソヌクレアーゼ(Exonuclease) 200μlおよび100mM ATP 300μlの添加を行った。37℃で45分のインキュベーションの後、QS緩衝液12mlを添加することによって反応を停止した。この溶液を次いで、Qiagen-tip 500カラムにアプライした。カラムをQF緩衝液30mlで洗浄し、DNAをQF緩衝液12mlで溶出し、55℃で予め加温した。DNAを次に、3M NaAc (pH 5.2) 1.2ml、GlycoBlue (Ambion) 15μl、および酵母総tRNA (Sigma) 15μlの存在下、2容量のエタノールの添加により-20℃で一晩沈殿させた。   The aqueous phase was transferred to a new 50 ml conical tube. DNA precipitation was performed by adding 2 ml of 3M NaAc (pH 5.2) and 20 ml of isopropanol, followed by centrifugation at 3,645 rcf for 30 minutes at 4 ° C. The pellet was resuspended in 1 ml TE (pH 8.0) containing RNase A (30 μg / ml) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. At this point, the two DNA samples were mixed. Circular DNA was further purified by Qiagen Large-Construct Kit. Purification was performed according to the manufacturer's instructions with minor modifications. 10 ml of EX buffer was mixed with the DNA solution, followed by addition of 200 μl of exonuclease and 300 μl of 100 mM ATP. After 45 minutes incubation at 37 ° C., the reaction was stopped by adding 12 ml of QS buffer. This solution was then applied to a Qiagen-tip 500 column. The column was washed with 30 ml QF buffer and DNA was eluted with 12 ml QF buffer and pre-warmed at 55 ° C. The DNA was then precipitated overnight at −20 ° C. by the addition of 2 volumes of ethanol in the presence of 1.2 ml of 3M NaAc (pH 5.2), 15 μl of GlycoBlue (Ambion), and 15 μl of yeast total tRNA (Sigma).

あるいは、DNAを1容量のイソプロパノールの添加によって沈殿させた。沈殿したDNAを4℃で1時間3,645 rcfでの遠心分離によって回収した。DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、TE (pH 8.0) 150μlに再懸濁した。各々の試料(0.75μl)をNotIで消化し、U-2 FIGEによって分析した。FIGE分析をサーキュレーションなしで1×TAE緩衝液中1%のアガロースゲル(BioRad、カタログ番号161-3016)上にて行った。パラメーターは直線傾斜で、順方向90 V、初期スイッチ5.0秒、最終スイッチ30秒、および直線傾斜で、逆方向60 V、初期スイッチ5.0秒、最終スイッチ30秒である。電気泳動の後、ゲルをSYBR(登録商標) Goldで染色し、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。   Alternatively, DNA was precipitated by the addition of 1 volume of isopropanol. Precipitated DNA was recovered by centrifugation at 3,645 rcf for 1 hour at 4 ° C. The DNA pellet was washed with 70% ethanol and resuspended in 150 μl TE (pH 8.0). Each sample (0.75 μl) was digested with NotI and analyzed by U-2 FIGE. FIGE analysis was performed on a 1% agarose gel (BioRad, catalog number 161-3016) in 1 × TAE buffer without circulation. The parameters are linear slope, forward 90 V, initial switch 5.0 seconds, final switch 30 seconds, and linear slope, reverse 60 V, initial switch 5.0 seconds, final switch 30 seconds. After electrophoresis, the gel was stained with SYBR® Gold and scanned with a GE Typhoon 9410 imager.

b.酵母形質転換
上記の方法では直鎖状酵母染色体DNAの全てが完全に除去されるわけではなく、本発明者らは、それが酵母形質転換およびアセンブリ効率を顕著に低下させうることを見出した。11個の環状アセンブリ中間体をさらに濃縮するために、各アセンブリの試料およそ200 ngをプールし、融解アガロースと混合した。アガロースが固まるにつれて、繊維が環状DNAを通り抜け、形態的に「捕捉」する(Dean et al., Anal Biochem 56, 417 (Dec, 1973))。捕捉されていない直鎖状DNAはその後、アガロースプラグの中から外へ電気泳動されるので、捕捉された環状分子を濃縮することができる。11個の環状アセンブリ中間体を、挿入断片が放出されうるようにNotIで消化した。その後、断片をアガロースプラグから抽出し、FIGEによって分析し(データ示さず)、これを用いて酵母スフェロプラストを形質転換した。この第3および最終段階のアセンブリでは、酵母増殖エレメントがアセンブリ811-900に既に存在していたので、さらなるベクター配列は必要とされなかった。選択プレート上でのインキュベーションの後、およそ100個のコロニーが現れた。 b. Yeast Transformation The above method does not completely remove all linear yeast chromosomal DNA, we have found that it can significantly reduce yeast transformation and assembly efficiency. It was. To further concentrate the eleven annular assembly intermediates, approximately 200 ng samples of each assembly were pooled and mixed with molten agarose. As the agarose hardens, the fibers pass through the circular DNA and morphologically “capture” (Dean et al., Anal Biochem 56, 417 (Dec, 1973)). The uncaptured linear DNA is then electrophoresed out of the agarose plug so that the captured circular molecules can be concentrated. Eleven circular assembly intermediates were digested with NotI so that the insert could be released. Fragments were then extracted from agarose plugs and analyzed by FIGE (data not shown) and used to transform yeast spheroplasts. In this third and final stage assembly, no additional vector sequences were required because the yeast growth element was already present in assembly 811-900. Approximately 100 colonies appeared after incubation on the selection plate.

形態的捕捉および分析
各未切断の100kbアセンブリ20マイクロリットルをプールし、50℃にまで平衡化した。同様に50℃にまで平衡化した、2%低融点アガロース1容量(220μl)を、プールしたDNAと混合した。この混合物およそ85μlをアガロースプラグモールド(Bio-Rad)に加え、これを氷上で冷却し続けた。氷上で30分のインキュベーションの後、アガロースプラグを1%アガロースゲル(1×TAE緩衝液)のウェルに加え、電気泳動を4.5 V/cmで2時間行った。プラグをアガロースゲルから取り出し、室温で1時間0.1×洗浄用緩衝液(Wash Buffer) (Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug Kit) 5ml中で反転させることによって洗浄した。この緩衝液を除去し、1×緩衝液3 (NEB) 5mlを加えた。室温で1時間のインキュベーション/反転の後、緩衝液を除去し、250単位のNotIを有する新たな1×緩衝液3 (2.5ml)を加えた。アガロースプラグを37℃で一晩インキュベートすることによってNotI消化を行った。 Morphological capture and analysis 20 microliters of each uncleaved 100 kb assembly was pooled and equilibrated to 50 ° C. One volume (220 μl) of 2% low melting point agarose, also equilibrated to 50 ° C., was mixed with the pooled DNA. Approximately 85 μl of this mixture was added to an agarose plug mold (Bio-Rad), which continued to cool on ice. After 30 minutes incubation on ice, an agarose plug was added to the wells of a 1% agarose gel (1 × TAE buffer) and electrophoresis was performed at 4.5 V / cm for 2 hours. The plug was removed from the agarose gel and washed by inverting in 5 ml of 0.1 × Wash Buffer (Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug Kit) for 1 hour at room temperature. The buffer was removed and 5 ml of 1 × Buffer 3 (NEB) was added. After 1 hour incubation / inversion at room temperature, the buffer was removed and fresh 1 × buffer 3 (2.5 ml) with 250 units of NotI was added. NotI digestion was performed by incubating agarose plugs at 37 ° C. overnight.

アガロースプラグを1時間1×TAE/0.3M酢酸ナトリウム溶液5ml中で反転させた。アガロースプラグを次いで、微量遠心管に移した。3M酢酸ナトリウムを含有する10×TAE緩衝液の溶液をゲルスライスに10分の1で(およそ40μl)加え、アガロースゲルを15分間50℃での初期インキュベーションの後に7分間68℃で融解させた。ゲルスライスの融解後、それらを42℃で15分間インキュベートし、β-アガラーゼ(New England Biolabs)を50分の1で(およそ8μl)加え、1時間以上インキュベーションを継続した。(遠心管を10分間ゆっくり反転させることによる)穏やかなフェノール抽出、および標準的なエタノール沈殿(グリコブルー1μlの存在下)の後、DNAをTE (pH 8.0) 20μlに再懸濁した。0.5μlを除く全てを用いて酵母を形質転換した。この0.5μlの試料を上記のようにU-2 FIGEで分析した。   The agarose plug was inverted in 5 ml of 1 × TAE / 0.3 M sodium acetate solution for 1 hour. The agarose plug was then transferred to a microcentrifuge tube. A 10 × TAE buffer solution containing 3M sodium acetate was added to the gel slices in 1/10 (approximately 40 μl) and the agarose gel was thawed at 68 ° C. for 7 minutes after an initial incubation at 50 ° C. for 15 minutes. After thawing of the gel slices, they were incubated at 42 ° C. for 15 minutes, β-agarase (New England Biolabs) was added at 50/50 (approximately 8 μl) and the incubation continued for over 1 hour. After gentle phenol extraction (by slowly inverting the centrifuge tube for 10 minutes) and standard ethanol precipitation (in the presence of 1 μl Glycoblue), the DNA was resuspended in 20 μl TE (pH 8.0). All except 0.5 μl were used to transform yeast. This 0.5 μl sample was analyzed with U-2 FIGE as described above.

酵母アガロースプラグ
酵母培養物(50ml)を、CSM-His＋アデニン培地(Teknova)中でOD600 1.0にまで増殖させた。培養物を収集し、次いで水50mlで洗浄した。次に、培養物を収集し、次いでEDTA pH 8.0 10mlで洗浄した。培養物を収集し、次いで細胞再懸濁用緩衝液750μlを有する微量遠心管に移した。細胞ペレットを次に、細胞再懸濁用緩衝液150μlに再懸濁した。この混合物を50℃にまで平衡化し、その後、ザイモリアーゼ-100T溶液(20mg/mlザイモリアーゼ-100T [USB]、50%グリセロール、2.5%グルコース、50mM Tris-Cl, pH 8.0) 85μlおよび2%低融点アガロース225μlと混合した。この混合物およそ85μlをアガロースプラグモールド(Bio-Rad)に加え、これを氷上で冷却し続けた。氷上で30分のインキュベーションの後、プラグを、ザイモリアーゼ-100T溶液500μlを含有するリチカーゼ緩衝液(10mM Tris-Cl pH 7.5、50mM EDTA pH 8.0) 5mlに加えた。37℃で2時間のインキュベーションの後、プラグを水25mlで洗浄した。Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug Kitを用いて、プロテイナーゼKインキュベーションおよび洗浄段階を行ったが、これはキットに提供されている取扱説明書に記述されている。 Yeast agarose plug Yeast cultures (50 ml) were grown to OD600 1.0 in CSM-His + Adenine medium (Teknova). The culture was collected and then washed with 50 ml of water. The culture was then harvested and then washed with 10 ml EDTA pH 8.0. The culture was collected and then transferred to a microfuge tube with 750 μl of cell resuspension buffer. The cell pellet was then resuspended in 150 μl of cell resuspension buffer. This mixture was equilibrated to 50 ° C. and then zymolyase-100T solution (20 mg / ml zymolyase-100T [USB], 50% glycerol, 2.5% glucose, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0) 85 μl and 2% low melting point agarose Mixed with 225 μl. Approximately 85 μl of this mixture was added to an agarose plug mold (Bio-Rad), which continued to cool on ice. After a 30 minute incubation on ice, the plug was added to 5 ml of lyticase buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 50 mM EDTA pH 8.0) containing 500 μl of zymolyase-100T solution. After 2 hours incubation at 37 ° C., the plug was washed with 25 ml water. Proteinase K incubation and washing steps were performed using the Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug Kit, as described in the instructions provided with the kit.

c.合成ドナーゲノムのスクリーニングおよび分析
完全なゲノムをスクリーニングするために、1反応で、サイズが337bpから1149bpに及ぶ11個のアンプリコンを生ずる11組のプライマー対でマルチプレックスPCRを行った(表25)。 c. Screening and analysis of synthetic donor genomes To screen the complete genome, multiplex PCR was performed with 11 primer pairs yielding 11 amplicons ranging in size from 337 bp to 1149 bp in one reaction (Table 1). twenty five).

（表２５）アセンブリした完全なゲノムを同定するために用いたマルチプレックスPCRプライマー
このプライマーセットをTSS2と呼ぶ; 各プライマーセットは11個の100kb接続部のうちの1つを横断する。

Table 25: Multiplex PCR primers used to identify assembled complete genome. This primer set is referred to as TSS2; each primer set traverses one of 11 100 kb junctions.

完全にアセンブリした合成ゲノムを含有する酵母クローンを、11個のアンプリコンを生ずるプライマーセット（11個のアセンブリ接続部の各々の位置に1つ）でのマルチプレックスPCRによってスクリーニングした。プライマー対は11個の100kbアセンブリ接続部の各々にまたがるように設計した。スクリーニングした48コロニーのうち、1クローン(sMmYCp235)から抽出されたDNAでは全11個のアンプリコンが生成された。WT陽性対照(YCpMmyc1.1)のPCRでは、区別がつかない11個のアンプリコンのセットが生成された(データ示さず)。合成M.ミコイデスゲノムの完全なアセンブリをさらに実証するために、インタクトなDNAをアガロースプラグ中の酵母から単離し、2つの制限分析（AscIおよびBssHII）に供した。これらの制限部位は4つの透かし配列のうちの3つに存在するので、この消化の選択により、天然M.ミコイデスゲノムと異なる制限パターンが生ずる(図20および表26)。天然(WT)および合成(235)M.ミコイデスゲノムをアガロースプラグ中の酵母から単離した。さらに、DNAを宿主株単独から精製した。アガロースプラグをAscIまたはBssHIIで消化し、断片をクランプ均一電界(clamped homogeneous electrical field; CHEF)ゲル電気泳動によって分離した。   Yeast clones containing the fully assembled synthetic genome were screened by multiplex PCR with a primer set that produced 11 amplicons (one at each position of the 11 assembly junctions). Primer pairs were designed to span each of the 11 100 kb assembly connections. Of the 48 colonies screened, a total of 11 amplicons were generated from the DNA extracted from one clone (sMmYCp235). PCR of the WT positive control (YCpMmyc1.1) produced an indistinguishable set of 11 amplicons (data not shown). To further demonstrate the complete assembly of the synthetic M. mycoides genome, intact DNA was isolated from yeast in an agarose plug and subjected to two restriction analyzes (AscI and BssHII). Since these restriction sites are present in 3 of the 4 watermark sequences, this digestion choice results in a restriction pattern that differs from the native M. mycoides genome (Figure 20 and Table 26). Natural (WT) and synthetic (235) M. mycoides genomes were isolated from yeast in agarose plugs. In addition, DNA was purified from the host strain alone. Agarose plugs were digested with AscI or BssHII and fragments were separated by clamped homogeneous electrical field (CHEF) gel electrophoresis.

酵母において増殖させたM.ミコイデスゲノムの制限分析
酵母アガロースプラグを0.1×洗浄用緩衝液(Bio-Rad) 1ml中で1時間2回洗浄し、BSAを補充した1×緩衝液2 (NEB) 1ml中で1時間平衡化した。酵母染色体DNAを制限酵素AsiSIおよびRsrII (これらの酵素はM.ミコイデスゲノムを消化しない)の各50単位で一晩消化した。プラグを次に1% TAEアガロースゲル上に負荷して、消化された酵母ゲノムDNA断片をプラグの中から外へ泳動させた(環状M.ミコイデスゲノムはプラグの中にとどまる)。アガロースゲルを3時間6 V/cmで電気泳動させた。電気泳動後、アガロースプラグをウェルから取り出し、0.1×洗浄用緩衝液1ml中で1時間2回洗浄し、1×緩衝液3 (NEB; BssHII消化の場合)または1×緩衝液4 (NEB; AscI消化の場合) 1ml中で1時間平衡化した。M.ミコイデスゲノムDNAを50単位の制限酵素BssHIIまたは50単位のAscIで一晩消化した。インキュベーションの後、全てのプラグを0.1×洗浄用緩衝液1mlで室温にて1時間洗浄し、アガロースゲル上に負荷し、パルスフィールドゲル電気泳動に供した。制限酵素は全て、NEBから購入した。 Restriction analysis of the M. mycoides genome grown in yeast Yeast agarose plugs were washed twice in 1 ml of 0.1 × wash buffer (Bio-Rad) for 1 hour and supplemented with BSA 1 × buffer 2 (NEB) Equilibrated in 1 ml for 1 hour. Yeast chromosomal DNA was digested overnight with 50 units each of restriction enzymes AsiSI and RsrII (these enzymes do not digest the M. mycoides genome). The plug was then loaded onto a 1% TAE agarose gel to allow the digested yeast genomic DNA fragment to migrate out of the plug (the circular M. mycoides genome remains in the plug). The agarose gel was electrophoresed at 6 V / cm for 3 hours. After electrophoresis, the agarose plug is removed from the well, washed twice in 1 ml of 0.1 × wash buffer for 1 hour, 1 × buffer 3 (NEB; for BssHII digestion) or 1 × buffer 4 (NEB; AscI Digestion) Equilibrated in 1 ml for 1 hour. M. mycoides genomic DNA was digested overnight with 50 units of restriction enzyme BssHII or 50 units of AscI. After incubation, all plugs were washed with 1 ml of 0.1 × washing buffer for 1 hour at room temperature, loaded onto an agarose gel and subjected to pulse field gel electrophoresis. All restriction enzymes were purchased from NEB.

パルスフィールドゲル電気泳動
酵母アガロースプラグ(図4c)およびM.ミコイデスアガロースプラグ(図5b)を外形クランプ均一電界(CHEF DR III; Bio-Rad)により、14℃にてサーキュレーションありで0.5μg/mlの臭化エチジウムを有する1×TAE中1%のアガロースゲルにおけるパルスフィールド電気泳動に供した。パルス時間は4.0 V/cmで20〜24時間かけて60秒から120秒までの傾斜をつけた。 Pulse field gel electrophoresis Yeast agarose plug (Fig. 4c) and M. mycoides agarose plug (Fig. Subjected to pulsed field electrophoresis on a 1% agarose gel in 1 × TAE with ml of ethidium bromide. The pulse time was 4.0 V / cm with a slope from 60 to 120 seconds over 20 to 24 hours.

M.ミコイデスJCVI-syn1細胞から単離されたM.ミコイデスJCVI-syn1ゲノムの配列分析
10mg/lのテトラサイクリンを含有するSP4培地中で細胞を増殖させ、Promega Genomic DNA Extraction Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。454およびSanger技術の組み合わせを用いてDNAを配列決定した。ギャップを網羅するPCRアンプリコンの配列決定および直接的なゲノムウォークの組み合わせを用いてギャップを埋めた。セレラ・アセンブラ(Celera Assembler)を用いてゲノムをアセンブリした。sMmYCp235クローンは、完全にアセンブリされた合成ゲノムに対して予想された制限パターンを生じた(データ示さず)。 Sequence analysis of the M. mycoides JCVI-syn1 genome isolated from M. mycoides JCVI-syn1 cells
Cells were grown in SP4 medium containing 10 mg / l tetracycline and genomic DNA was extracted using the Promega Genomic DNA Extraction Kit. DNA was sequenced using a combination of 454 and Sanger technology. The gap was filled using a combination of sequencing of PCR amplicons covering the gap and a direct genome walk. The genome was assembled using a Celera Assembler. The sMmYCp235 clone produced the expected restriction pattern for the fully assembled synthetic genome (data not shown).

（表２６）

(Table 26)

天然(WT)および合成(Syn235)M.ミコイデスに対して予想されたAscIおよびBssH II制限断片のサイズを示す。   The size of AscI and BssH II restriction fragments predicted for native (WT) and synthetic (Syn235) M. mycoides are shown.

v.レシピエント細胞への合成ドナーゲノムの移植
上記のゲル分析において用いた追加のアガロースプラグはまた、ゲノム移植実験において用いた。sMmYCp235酵母クローン由来のインタクトな合成M.ミコイデスゲノムを、既述(Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009))のように、制限マイナスのM.カプリコルムレシピエント細胞へ移植した。テトラサイクリンおよびX-galを含有するSP4培地上37℃での青色コロニーの増殖を選択することにより、結果をスコア化した。この酵母クローンから単離されたゲノムは、1つのアガロースプラグあたり5〜15個のテトラサイクリン耐性の青色コロニーを生じた。これはYCpMmyc1.1対照に匹敵していた。M.カプリコルムレシピエント細胞とM.ミコイデスゲノムの両方が存在していた場合に、全ての移植実験におけるコロニーの回収が認められた。 v. Transplantation of synthetic donor genomes into recipient cells The additional agarose plugs used in the gel analysis above were also used in genome transplantation experiments. Intact synthetic M. mycoides genome derived from sMmYCp235 yeast clone is transferred to restriction-negative M. capricolum recipient cells as previously described (Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009)) did. Results were scored by selecting blue colony growth at 37 ° C. on SP4 medium containing tetracycline and X-gal. The genome isolated from this yeast clone yielded 5-15 tetracycline resistant blue colonies per agarose plug. This was comparable to the YCpMmyc1.1 control. Colony recovery was observed in all transplantation experiments when both M. capricolum recipient cells and M. mycoides genome were present.

合成移植体をM.カプリコルムまたは天然M.ミコイデスと素早く区別するために、2つの分析を行った。第一に、4つの透かしの各々に特異的な4組のプライマー対を、単一のマルチプレックスPCR反応においてそれらが4つのアンプリコンを生ずるように設計した(表27)。   Two analyzes were performed to quickly distinguish synthetic grafts from M. capricolum or natural M. mycoides. First, four primer pairs specific for each of the four watermarks were designed such that they yield four amplicons in a single multiplex PCR reaction (Table 27).

（表２７）

(Table 27)

合成ゲノムを含有する移植体を、4つのアンプリコンを生成するプライマーセット（1つが4つの透かしの各々の内側にある）でのマルチプレックスPCRによりスクリーニングした。酵母クローンsMmYCp235由来の1つの移植体(syn1)を、酵母から移植された天然の非合成ゲノム(WT)と並べて分析した。   Transplants containing synthetic genomes were screened by multiplex PCR with primer sets that produced four amplicons, one inside each of the four watermarks. One transplant (syn1) from the yeast clone sMmYCp235 was analyzed alongside the natural non-synthetic genome (WT) transplanted from yeast.

4つ全てのアンプリコンがsMmYCp235から作製された移植体によって生成されたが、YCpMmyc1.1ではそうでなかった(データ示さず)。   All four amplicons were generated by transplants made from sMmYCp235, but not with YCpMmyc1.1 (data not shown).

第二に、上記の、AscIおよびBssHIIでのゲル分析を行った。手短に言えば、天然(WT)および合成(syn1)M.ミコイデスゲノムをアガロースプラグ中のM.ミコイデス移植体から単離した。アガロースプラグをAscIまたはBssHIIで消化し、断片をCHEFゲル電気泳動によって分離した。的確なサイズに対応する制限断片は、表25に示される断片数によって示される。得られた制限パターンは、合成M.ミコイデスゲノムから生成された移植体と一致していた(データ示さず)。   Second, the gel analysis with AscI and BssHII described above was performed. Briefly, native (WT) and synthetic (syn1) M. mycoides genomes were isolated from M. mycoides transplants in agarose plugs. The agarose plug was digested with AscI or BssHII and the fragments were separated by CHEF gel electrophoresis. Restriction fragments corresponding to the exact size are indicated by the number of fragments shown in Table 25. The resulting restriction pattern was consistent with transplants generated from a synthetic M. mycoides genome (data not shown).

sMmYCp235合成ゲノムに由来する単一の移植体を配列決定した。合成過程中に起きた既知の多型、ならびに8つの新たな多型および予想外の大腸菌トランスポゾンの挿入を除いて、配列は意図した設計とマッチした。この株をM.ミコイデスJCVI-syn1と呼ぶ。コロニーを、Xgalを含有するSP4寒天上で増殖させて、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞を青色にさせた。JCVIsyn1および野生型のコロニーの両方とも直径が0.5 mmであった。JCVI-syn1および野生型の生物の両方の溶血能の試験において、コロニーに、5%ヒツジ赤血球を含有する寒天を重層した。野生型M.ミコイデスは、コロニーの真下にある細胞を溶解した。このパターンおよび寒天の淡緑色の色合いはα溶血に特有である。M.ミコイデスJCVI-syn1コロニーは赤血球を溶解しなかった。   A single transplant derived from the sMmYCp235 synthetic genome was sequenced. Except for known polymorphisms that occurred during the synthesis process, and 8 new polymorphisms and an unexpected E. coli transposon insertion, the sequences matched the intended design. This strain is called M. mycoides JCVI-syn1. Colonies were grown on SP4 agar containing Xgal, causing cells expressing β-galactosidase to turn blue. Both JCVIsyn1 and wild type colonies were 0.5 mm in diameter. In testing for hemolytic potential of both JCVI-syn1 and wild type organisms, colonies were overlaid with agar containing 5% sheep erythrocytes. Wild type M. mycoides lysed the cells directly under the colony. This pattern and the pale green shade of agar are characteristic of alpha hemolysis. M. mycoides JCVI-syn1 colonies did not lyse erythrocytes.

移植体は野生型M.ミコイデス亜種カプリと外見上は違わない。コロニー形態および増殖速度は区別ができなかった(データ示さず); しかしながら本発明者らは、野生型M.ミコイデス・カプリとは表現型的に異なるように合成ゲノムをプログラムした。このマイコプラズマ種はヤギの日和見病原体である(DaMassa et al., Am J Vet Res 44, 322 (Feb, 1983))が、ヒトの日和見病原体ではない。病原性機構は細菌による過酸化水素産生であるものと考えられ、それにより感染動物の組織が損傷される。M.ミコイデスにおいて、過酸化水素はグリセロール代謝の副産物である。本発明者らの合成ゲノムの潜在的病原性を改良するために、本発明者らは、M.ミコイデスABCグリセロール輸送体(gtsA、gtsB、gtsC、およびgtsD) (P. Pilo et al., J Bacteriol 187, 6824 (Oct, 2005); E. M. Vilei, J. Frey, Clin Diagn Lab Immunol 8, 85 (Jan, 2001))をコードする遺伝子を除外した。この除外の結果として、M.ミコイデスJCVI-syn1はヒツジ赤血球を溶解しなかったが、野生型生物は赤血球の過酸化水素による損傷に特有のα溶血を実証した(データ示さず)。溶血はマイコプラズマ病原性の標準的なアッセイ法である。   The transplant is no different in appearance from wild-type M. mycoides subsp. Colony morphology and growth rate were indistinguishable (data not shown); however, we programmed the synthetic genome to be phenotypically different from wild type M. mycoides capri. This mycoplasma species is an opportunistic pathogen in goats (DaMassa et al., Am J Vet Res 44, 322 (Feb, 1983)), but not a human opportunistic pathogen. The pathogenic mechanism is thought to be hydrogen peroxide production by bacteria, thereby damaging the tissues of infected animals. In M. mycoides, hydrogen peroxide is a byproduct of glycerol metabolism. In order to improve the potential virulence of our synthetic genome, we have developed the M. mycoides ABC glycerol transporter (gtsA, gtsB, gtsC, and gtsD) (P. Pilo et al., J The gene encoding Bacteriol 187, 6824 (Oct, 2005); EM Vilei, J. Frey, Clin Diagn Lab Immunol 8, 85 (Jan, 2001)) was excluded. As a result of this exclusion, M. mycoides JCVI-syn1 did not lyse sheep erythrocytes, whereas the wild type organism demonstrated alpha hemolysis characteristic of erythrocyte hydrogen peroxide damage (data not shown). Hemolysis is a standard assay for mycoplasma virulence.

実施例6C
半合成ドナーゲノムアセンブリおよび移植
ゲノム中のいずれの誤りによっても移植体を生成できなかったので、個々の100kb合成アセンブリの実行可能性を独立して検証するように方法を開発した。各100kbの合成セグメントの機能性の試験を補助するため、半合成ゲノムを構築し、移植した。天然片を合成片と混合することにより、各合成100kbアセンブリの構築の成功を、これらの中間体を配列決定する必要なしに検証することができた。本発明者らは、既述の方法(Leem et al., Nucleic Acids Res 31, e29 (Mar 15, 2003))を用いることにより酵母において11個の重複する天然100kbアセンブリをクローニングした。11の並行反応において、酵母細胞を、平均すると長さがおよそ100kbになった断片化M.ミコイデスゲノムDNA (YCpMmyc 1.1)および100kbの挿入断片の末端に重複するように設計したPCR増幅ベクターで同時形質転換した。天然断片および合成断片が再結合されうるように適切な重複部分を維持するため、100kb合成アセンブリをクローニングするために用いた同じ40bpの重複部分を有するプライマーを用いてPCR増幅ベクターを生成した。構築された半合成ゲノムには11個中2〜10個の100kb合成サブアセンブリが含まれた。生存可能なコロニーが移植後に産生されれば、各ゲノムの合成画分が致死突然変異を含まないことが確認された。100kbサブアセンブリの1つ811-900だけは生存可能でないことが明らかになった。 Example 6C
Semi-synthetic donor genome assembly and transplantation Since no grafts could be generated due to any error in the genome, a method was developed to independently verify the feasibility of individual 100 kb synthetic assemblies. A semi-synthetic genome was constructed and transplanted to assist in testing the functionality of each 100 kb synthetic segment. By mixing the natural pieces with the synthetic pieces, the successful construction of each synthetic 100 kb assembly could be verified without the need to sequence these intermediates. We cloned 11 overlapping natural 100 kb assemblies in yeast by using the method described previously (Leem et al., Nucleic Acids Res 31, e29 (Mar 15, 2003)). In eleven parallel reactions, yeast cells are treated with a fragmented M. mycoides genomic DNA (YCpMmyc 1.1), which averages approximately 100 kb in length, and a PCR amplification vector designed to overlap the ends of the 100 kb insert. Co-transformed. In order to maintain the proper overlap so that the natural and synthetic fragments can be recombined, a PCR amplification vector was generated using primers with the same 40 bp overlap used to clone the 100 kb synthetic assembly. The constructed semi-synthetic genome contained 2-10 of 11 100 kb synthetic subassemblies. If viable colonies were produced after transplantation, it was confirmed that the synthetic fraction of each genome did not contain a lethal mutation. Only one of the 100 kb subassemblies, 811-900, was found not viable.

最初に、上記の、誤りを含んだ811-820クローンを用いて、移植しない合成ゲノムを生成した。これは予想されたことである。というのは、単一の塩基対の欠失が染色体複製に不可欠な遺伝子dnaAにおけるフレームシフトを生み出したからである。本発明者らはこれまでは、この突然変異に気付いていなかった。半合成ゲノム構築戦略を用いることにより、本発明者らは、合成移植実験の失敗の発生源として811-900を素早く同定することができた。したがって、本発明者らは、誤りのない811-900アセンブリを再アセンブリし始め、これを用いてsMmYCp235酵母株を産生した。dnaA突然変異ゲノムはsMmYCp235における合成ゲノムとは1ヌクレオチドしか違わない。このゲノムは本発明者らの移植実験における陰性対照として役立った。dnaA突然変異はまた、酵母でのゲノム変更によって811-900のレベルで修復された(Noskov, Segall-Shapiro, and Chuang, Nucleic Acids Res, (Mar 12, 2010))。修復された811-900アセンブリを最終段階のアセンブリで用いて、修復されたゲノムを有する酵母クローンを産生した。この酵母クローンをsMmYCP142と名付け、移植することができた。11個の小片からアセンブリされ、移植に成功したゲノムの完全なリストを表28に示す。   First, the above-described erroneous 811-820 clone was used to generate a non-transplanted synthetic genome. This is expected. This is because the deletion of a single base pair produced a frameshift in the gene dnaA that is essential for chromosome replication. We have not been aware of this mutation so far. By using a semi-synthetic genome construction strategy, we were able to quickly identify 811-900 as a source of synthetic transplant experiment failure. We therefore began to reassemble the error free 811-900 assembly and used it to produce the sMmYCp235 yeast strain. The dnaA mutant genome differs from the synthetic genome in sMmYCp235 by only one nucleotide. This genome served as a negative control in our transplantation experiments. The dnaA mutation was also repaired at the 811-900 level by genome modification in yeast (Noskov, Segall-Shapiro, and Chuang, Nucleic Acids Res, (Mar 12, 2010)). The repaired 811-900 assembly was used in the final stage assembly to produce a yeast clone with the repaired genome. This yeast clone was named sMmYCP142 and could be transplanted. A complete list of genomes assembled from 11 pieces and successfully transferred is shown in Table 28.

（表２８）11個の小片からアセンブリされ、移植に成功したゲノム

(Table 28) Genome assembled from 11 small pieces and successfully transferred

実施例6D
カセット、アセンブリ中間体およびM.ミコイデスJCVI-svn1の検証
合成細胞ゲノムの構築スキームでは階層化された階層(1kbのカセット、10kbのサブアセンブリ、100kbのサブアセンブリ、および完成した合成ゲノム)をたどったように、アセンブリ中のDNAが、有するよう設計された配列を有することを確実にする品質管理への努力がなされた。費用制約のばらつき、時間的制約のばらつき、および配列決定の本質的差異のため、主に非反復DNAの1つの大領域の配列決定からの重複配列を有する多くのDNA小領域、配列決定の異なる戦略を各階層に適用した。最も簡単、最も経済的かつ最も速い配列検証の方法は、構築努力の異なる階層のそれぞれで大いに異なっていた。また、これらの方法の限界のばらつきが、カセットのレベルで導入された少数の突然変異を100kbの階層までずっと存続させる原因になった。また、アセンブリのあらゆる階層が少数の事例ではいくつかの突然変異の作製と関連していた。これは、大きなDNA領域の構築に尽力する合成生物学の努力の全てのレベルで品質管理の努力が必要になることを実証している。 Example 6D
Validation of cassettes, assembly intermediates, and M. mycoides JCVI-svn1 The synthetic cell genome construction scheme followed a stratified hierarchy (1 kb cassette, 10 kb subassembly, 100 kb subassembly, and finished synthetic genome) As such, efforts have been made to quality control to ensure that the DNA in the assembly has a sequence designed to have. Many DNA subregions with overlapping sequences, mainly different from sequencing of one large region of non-repetitive DNA, due to cost constraint variation, time constraint variation, and inherent differences in sequencing The strategy was applied to each hierarchy. The simplest, most economical and fastest method of sequence verification was very different at each of the different levels of construction effort. Also, variations in the limitations of these methods have caused a small number of mutations introduced at the cassette level to persist all the way to the 100 kb hierarchy. Also, every level of assembly was associated with the creation of several mutations in a few cases. This demonstrates that quality control efforts are required at all levels of synthetic biology efforts dedicated to the construction of large DNA regions.

1kbカセットの検証
カセットはBlue Heronから購入した。Blue Heronからはまた、供給されたDNAの配列を確認する配列追跡ファイルが供給された; これらの追跡ファイルは半自動的に処理された。自家の塩基呼び出しソフトウェアを用いて、追跡ファイルの配列をfasta形式へ展開した。得られた配列ファイルを、初期設定でClustalW (Larkin et al., Bioinformatics 23: 2947 (2007))を用いて標的参照配列と整列させた。得られたペアワイズアライメントをその目的用に書かれたPERLスクリプトで解析し、標的参照配列にマッチしない配列位置を同定した。各1kbのカセットは2つまたはそれ以上のBlue Heron提供の追跡ファイルにより網羅されていたので、それによって同数のペアワイズアライメントをもたらし、特定の1kbカセットを網羅する全てのペアワイズアライメントからのミスマッチ位置のリストを相互に一致させた。これは別のカスタムPERLスクリプトによって行い、全ての読み出しを考慮した場合に標的配列と違ったカセット位置を次に、手作業で分析した。 Verification of 1 kb cassette The cassette was purchased from Blue Heron. Blue Heron also provided sequence tracking files that confirmed the sequence of the supplied DNA; these tracking files were processed semi-automatically. The tracking file sequence was expanded to fasta format using in-house base calling software. The resulting sequence file was aligned with the target reference sequence using ClustalW (Larkin et al., Bioinformatics 23: 2947 (2007)) by default. The obtained pairwise alignment was analyzed with a PERL script written for that purpose, and sequence positions that did not match the target reference sequence were identified. Each 1 kb cassette was covered by two or more Blue Heron-provided tracking files, which resulted in the same number of pair-wise alignments and a list of mismatch positions from all pair-wise alignments covering a particular 1 kb cassette Were matched with each other. This was done with a separate custom PERL script, and the cassette position, which was different from the target sequence when all readings were considered, was then manually analyzed.

1031個のカセットのうち、578個が完全に自動化されたスクリーニングを通過した。残る453個のカセットのうち、370個は、追跡ファイルの直接的な手分析を要しないものと判断された部類に適合する矛盾を有した。そのような部類が2つあった; 1) 明らかな配列の異常が、カセットに隣接するNotI部位の中にあった。これは、配列決定用プライマーのすぐ後ろでのSanger配列決定法の性能の不足によることが多かったが、少しの懸念にもならなかった。というのは、NotI部位の完全性は、NotIによるクローニングベクターからのカセットの切断、およびそのゲル精製を伴ったカセット処理の通常の過程においてすぐに試験可能であったからである。2) Blue Heron追跡ファイルの一部には、C-ビッグ-ダイ・ターミネータ試薬の酸化を伴うこともある通り、非常に広範なCピークが含まれた。結果として、追跡ファイルの一部ではCの、間違った塩基呼び出しが生じた。自動検証を通過しなかった453カセットのうちの83のものではその追跡ファイルを目視検査し; 62のものでは自家での再配列決定を要しないものと見なし、21のものでは再配列決定した。1kbカセットのうちの3つは、最終の分析において、突然変異(2つが単一ヌクレオチドの欠失および1つが単一ヌクレオチドの置換)を有するものと判定されたが、それらのうちの1つしかBlue Heron提供の追跡ファイルのスクリーニング中に見られなかった。1kbの階層で他の2つの誤りを検出できなかったのは、少数の読み出し(非常に広範なCピークを有するもの)の質の悪さと、ある事例では、供給された間違いのあるクローンが主因であった。このスクリーニングを通過した全ての1kbカセットを用いて、10kbのサブアセンブリを作製した。   Of the 1031 cassettes, 578 passed a fully automated screening. Of the remaining 453 cassettes, 370 had discrepancies that matched a category that was determined not to require direct manual analysis of the tracking file. There were two such classes; 1) There was a clear sequence abnormality in the NotI site adjacent to the cassette. This was often due to the lack of performance of the Sanger sequencing method directly behind the sequencing primer, but was not of any concern. This is because the integrity of the NotI site could be readily tested in the normal course of cassette processing with NotI cleavage of the cassette from the cloning vector and its gel purification. 2) Part of the Blue Heron tracking file contained a very broad C peak, as may be accompanied by oxidation of the C-Big-Die Terminator reagent. As a result, an incorrect base call for C occurred in some of the tracking files. 83 of the 453 cassettes that did not pass automatic verification were visually inspected for their tracking files; 62 were considered not requiring self-reordering and 21 were re-sequenced. Three of the 1 kb cassettes were determined to have mutations (two single nucleotide deletions and one single nucleotide substitution) in the final analysis, but only one of them was Not seen during screening of tracking files provided by Blue Heron. The other two errors could not be detected in the 1 kb hierarchy, mainly due to the poor quality of the small number of reads (those with a very broad C peak) and, in some cases, the wrongly supplied clone. Met. A 10 kb subassembly was made using all 1 kb cassettes that passed this screen.

10kbアセンブリ中間体の検証
10kbサブアセンブリをプールし、非ペアエンド読み出しを用い454配列決定により検証した。最初に、116個の10kbアセンブリをスクリーニングした。これら116個のアセンブリには、重複またはほぼ重複であったいくつかの10kbサブアセンブリが含まれる。これは、ある種の10kbサブアセンブリの代替のクローンを並行して試験したことが理由の事例であった。また、透かしの存在などの、設計したある種の変化を除き同一であったある種の10kbサブアセンブリの代替バージョンを並行して試験した。独立して読み出される必要があった重複またはほぼ重複の配列の存在、および80塩基対の重複部分による連続した10kbサブアセンブリ中の重複領域の存在のため、116個の10kbサブアセンブリを、サブアセンブリの2つの末端と80塩基対を共有した2つの10kbサブアセンブリのいずれかと同じプール中にいずれの10kbサブアセンブリも存在しないようにした4つの別個のプールにプールした。特定の10kbセグメントの代替クローンおよび代替バージョンの全てを相互に分離した。また、IS 1296挿入配列を含んだものなどの互いに非常に類似した配列を有したある種の10kbサブアセンブリを4つのプール間で互いにできる限り分離した。4つのプールにバーコードを付け、次いでこれを1つのプールにプールし、これを454によって配列決定した。次いでバーコードを付けた4つのプールからの読み出しを分離し、CLC Workbenchソフトウェアパッケージの使用により初期設定に設定した高速大量処理の参照アセンブリツールを用いて分析した。各プールからの読み出しを、500 Nの実行によって分離されたそのプールに対する29個の10kb標的配列からなる人工的に構築された「基準配列」に対してアセンブリした。この基準配列に対するアセンブリの後、手動観測、CLC SNP検出ツール、およびCLC DIP検出ツールの混成で突然変異を検出した。CLCは基準配列とコンセンサス配列との差異を自動的に検出する方法を持たない。この欠陥を回避するために、SNPおよびDIPツールの以下の非初期設定を用いた; 最低カバー度=1、最大カバー度=999999、最低変異頻度=50%またはカウント=999999。その他全ての設定はその初期設定とした。最初に116個の10kbサブアセンブリのうちの18個は、その標的配列との差異を含むことが分かった。最終的に、これらの差異のうちの3つは合成ゲノム中のマーカーと、骨格配列が10kbの配列に混入している10kbサブアセンブリクローンのプラスミド骨格中のマーカーとの間の配列類似性によって引き起こされるものと判定された。残りの差異のいくつかは、標的化PCR後の大腸菌における10kbクローンのプラスミド誘導、ならびに酵母から、誘導前の大腸菌、および誘導後の大腸菌から直接単離された選択クローンの突然変異領域の配列決定と関連しているものと分かった。3回認められた突然変異の1つのクラスは、重複部分を見て「GC」の導入であった。これは、カセット重複配列に隣接しているNotI部位の残部でありうると仮定される。作製の最初の試みにおいて突然変異させた10kbセグメントの代替アセンブリを次に、今回を除き、バーコードを付けた2つのプールだけで、前と同様に配列決定した。1kbカセットにおける3つの突然変異のうちの1つは10kbのレベルで検出された。誘導大腸菌によって引き起こされなかった他の全ての突然変異は、構築に由来していた。 Verification of 10kb assembly intermediate
10 kb subassemblies were pooled and verified by 454 sequencing using non-paired end reads. Initially, 116 10 kb assemblies were screened. These 116 assemblies include several 10 kb subassemblies that were overlapping or nearly overlapping. This was an example of the reason that some 10 kb subassembly alternative clones were tested in parallel. In addition, alternative versions of certain 10 kb subassemblies that were identical except for certain designed changes, such as the presence of watermarks, were tested in parallel. Because of the presence of overlapping or nearly overlapping sequences that had to be read independently, and the presence of overlapping regions in consecutive 10 kb subassemblies due to 80 base pair overlap, substituting 116 10 kb subassemblies Were pooled into four separate pools, such that none of the 10 kb subassemblies were present in the same pool as either of the two 10 kb subassemblies that shared 80 base pairs with the two ends. All alternative clones and alternative versions of a specific 10 kb segment were isolated from each other. Also, certain 10 kb subassemblies with sequences very similar to each other, such as those containing the IS 1296 insertion sequence, were separated as much as possible from each other between the four pools. Four pools were barcoded and then pooled into one pool, which was sequenced by 454. The readouts from the four pools with barcodes were then isolated and analyzed using a high-speed, high-throughput reference assembly tool set to default by using the CLC Workbench software package. The readout from each pool was assembled against an artificially constructed “reference sequence” consisting of 29 10 kb target sequences for that pool separated by 500 N runs. After assembly to this reference sequence, mutations were detected by a hybrid of manual observation, CLC SNP detection tool, and CLC DIP detection tool. CLC does not have a method to automatically detect the difference between the reference sequence and the consensus sequence. To avoid this deficiency, the following non-initial settings of SNP and DIP tools were used; minimum coverage = 1, maximum coverage = 999999, minimum mutation frequency = 50% or count = 999999. All other settings were their initial settings. Initially, 18 of the 116 10 kb subassemblies were found to contain differences from their target sequences. Ultimately, three of these differences are caused by sequence similarity between the markers in the synthetic genome and the markers in the plasmid backbone of the 10 kb subassembly clone where the backbone sequence is mixed into the 10 kb sequence. It was determined that Some of the remaining differences are the plasmid induction of 10 kb clones in E. coli after targeted PCR, and the sequencing of mutant regions of selected clones isolated directly from yeast, E. coli before induction, and E. coli after induction. It was found to be related to. One class of mutations observed three times was the introduction of “GC” by looking at the overlap. It is hypothesized that this may be the remainder of the NotI site adjacent to the cassette overlap sequence. An alternative assembly of the 10 kb segment that was mutated in the first attempt to make was then sequenced as before, except for the two pools that were barcoded, except this time. One of the three mutations in the 1 kb cassette was detected at the 10 kb level. All other mutations that were not caused by induced E. coli were derived from construction.

100kbアセンブリ中間体の検証
100kbサブアセンブリの各々の配列ではなく、半合成ゲノムを構築した。これらの半合成ゲノムは11個中2〜10個の100kbサブアセンブリを含み、ゲノムの残部は天然M.ミコイデスゲノム配列に由来した。これらの半合成ゲノムは移植に成功し、ゲノムの合成画分には致死突然変異のないことが検証された。カセット811a-900に対応する、100kbサブアセンブリの1つだけは生存可能でないことが迅速に明らかになった。この89kbのセグメントが、直接的なゲノムウォーキングまたは454配列決定を容易にするまたはその費用対効果を高くする量で酵母から利用するには都合が悪かったので、重複するPCRアンプリコンを作製し、鎖間で交互に存在する各アンプリコンに沿って200塩基対ごとに配列決定用プライマーを用いて配列決定した。 Verification of 100kb assembly intermediate
A semi-synthetic genome was constructed rather than the sequence of each of the 100 kb subassemblies. These semi-synthetic genomes contained 2-10 of 11 100 kb subassemblies, and the rest of the genome was derived from the native M. mycoides genome sequence. These semi-synthetic genomes were successfully transplanted and verified that the synthetic fraction of the genome was free of lethal mutations. It quickly became apparent that only one of the 100 kb subassemblies corresponding to cassette 811a-900 was not viable. Since this 89 kb segment was inconvenient to use from yeast in an amount that facilitates direct genomic walking or 454 sequencing or its cost-effectiveness, creating overlapping PCR amplicons, Sequencing was performed using sequencing primers every 200 base pairs along each amplicon present alternately between strands.

この過程は、合成811a-900と、半合成実験において生存可能であることが示された天然M.ミコイデスゲノムの対応領域の両方に対して行った。天然断片の再配列決定は、811a-900領域が、移植の際に生存性を妨害する異常をもって設計されていたという可能性を避けるためであった。合成811a-900の配列決定は設計した配列にはない突然変異を避けるためであったが、設計にはないこのような突然変異の1つが811a-900配列において検出された。それは812aの1kbカセットに存在していたと最終的に判定された1塩基対の欠失であった。この突然変異は1kbのレベルでは捕捉されなかった。454の読み出しの多くが、偶然一致して、突然変異を引き起こすそのすぐ近くで終わるかまたは始まり、これにより、読み出しの集団すべてにわたって裏付けが不十分となったと考えられ、したがって自動化SNPおよびDIP検出ツールにより見落とされたために、この突然変異は10KBのレベルで検出されなかった。   This process was performed on both synthetic 811a-900 and the corresponding region of the native M. mycoides genome that was shown to be viable in semi-synthetic experiments. The re-sequencing of the natural fragment was to avoid the possibility that the 811a-900 region was designed with abnormalities that interfered with viability during transplantation. Although the sequencing of synthetic 811a-900 was to avoid mutations not in the designed sequence, one such mutation not in the design was detected in the 811a-900 sequence. It was a 1 base pair deletion that was ultimately determined to be present in the 812a 1 kb cassette. This mutation was not captured at the 1 kb level. Many of the 454 readouts coincided and started or started in the immediate vicinity of causing mutations, which would have resulted in poor support across the entire population of readouts, thus automated SNP and DIP detection tools This mutation was not detected at the 10 KB level.

考察
今回のこの研究では、本発明者らは、108万塩基対のM.ミコイデスゲノムを構築した。しかしながら、合成ゲノムによってのみ制御された新しい細胞を作製するようにレシピエント細胞において活性化されうる誤りのないゲノムを得ることは、複雑であって、多くの品質管理段階を要した。必須遺伝子dnaAにおける単一の塩基対欠失によって何週間も成功が妨げられた。100万超の塩基における必須遺伝子中の間違った1つの塩基によってゲノムが不活性にされたが、ゲノムの非必須部分における主なゲノム挿入および欠失は生存性に影響を与えなかった。 Discussion In this study, we constructed a 1.08 million base pair M. mycoides genome. However, obtaining an error-free genome that can be activated in recipient cells to create new cells controlled only by a synthetic genome was complex and required many quality control steps. A single base pair deletion in the essential gene dnaA prevented success for weeks. Although the genome was inactivated by the wrong single base in the essential gene at over 1 million bases, major genomic insertions and deletions in non-essential parts of the genome did not affect viability.

この研究の間に、本発明者らは、合成ゲノムセグメントの試験および誤り修正を容易にするためのいくつかの方法を開発した。これらの方法には、合成および非合成ゲノムセグメントと、それに続いてゲノム移植ならびに配列の誤りを見つけ出すためのおよび合成設計の実行可能性を試験するためのDNA配列決定の組み合わせが含まれる。   During this study, we developed several methods to facilitate testing and error correction of synthetic genomic segments. These methods include a combination of synthetic and non-synthetic genomic segments, followed by genome transplantation and DNA sequencing to find sequence errors and to test the feasibility of synthetic designs.

本発明者らの最初のゲノム移植の成功では、インタクトな細胞から単離された天然ゲノムを用いた。これらの研究は、ゲノムを関連種へ移植することに成功し、このゲノムは、既存の遺伝物質に取って代わることができ、その過程で、新しいゲノムによって決定される表現型へと細胞を変換できることを証明した。これらの実験は裸のDNAを移植できることを証明した。本発明者らがその時点で分からなかったことは、M.ミコイデス細胞中のDNAがメチル化されており、それゆえ、M.カプリコルム細胞への挿入時に制限から保護されていたことであった。   Our initial genome transfer success used a native genome isolated from intact cells. These studies have succeeded in transplanting the genome to a related species, which can replace the existing genetic material and in the process transform the cell into a phenotype determined by the new genome Prove that you can. These experiments prove that naked DNA can be transplanted. What we did not know at that time was that the DNA in M. mycoides cells was methylated and therefore protected from restriction upon insertion into M. capricolum cells.

最終の合成ゲノムアセンブリは酵母組換えにより達成されたので、本発明者らは酵母において天然の細菌染色体をクローニングするための新しい方法(Benders et al., Nucleic Acids Res, (Mar 7, 2010))ならびに酵母からインタクトな天然および合成細菌ゲノムを単離するための新しい方法(Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009))を開発した。酵母セントロメアプラスミドとしてクローニングされた天然M.ミコイデスゲノムを伴う初期の移植体では失敗した。その後の広範な研究により、制限システム遺伝子がレシピエントM.カプリコルム細胞のゲノムから除去されていないなら、部位特異的なDNAメチル化がゲノム移植には必要であることが実証された(Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009))。   Since the final synthetic genome assembly was achieved by yeast recombination, we have a new method for cloning natural bacterial chromosomes in yeast (Benders et al., Nucleic Acids Res, (Mar 7, 2010)). A new method (Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009)) has been developed to isolate intact natural and synthetic bacterial genomes from yeast. Early transplants with the native M. mycoides genome cloned as a yeast centromere plasmid failed. Subsequent extensive studies have demonstrated that site-specific DNA methylation is required for genome transplantation if the restriction system gene has not been removed from the recipient M. capricolum cell genome (Lartigue et al ., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009)).

これらの研究により、遺伝システムを欠いている種由来の細菌ゲノムが酵母セントロメア配列の付加によって酵母中で増殖することを可能にする強力な新しい方法が得られた。さらに、酵母においてクローニングされた細菌ゲノムは、相同組換えを含む酵母の遺伝学的ツールで容易に改変することができた。改変された細菌染色体を次いで、酵母から単離し、任意でメチル化し、レシピエント細胞へ移植し戻してドナー細胞の改変バージョンを作製することができた(Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009))。   These studies have provided a powerful new method that allows bacterial genomes from species lacking the genetic system to grow in yeast by the addition of yeast centromere sequences. Furthermore, bacterial genomes cloned in yeast could be easily modified with yeast genetic tools including homologous recombination. The modified bacterial chromosome could then be isolated from yeast, optionally methylated and transplanted back into the recipient cell to produce a modified version of the donor cell (Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009)).

細菌ゲノムの平均以下のサイズではあるが、本発明者らが合成した1,077,947bpの二本鎖DNA分子は、報告されている画定された構造の最大の合成分子であり、本発明者らが以前に合成したM.ゲニタリウムゲノムのサイズのほぼ2倍である(Gibson et al., Science 319, 1215 (Feb 29, 2008))。合成分子または半合成分子の合成、ならびにそれが天然化合物と同じ特性を有するという実証は、提唱される分子構造を支持する証拠として長く用いられてきた。本発明者らの合成ゲノムおよび半合成ゲノムがM.ミコイデスの表現型特性を与えるという実証は、それの基となるDNA配列が生細胞を規定するのに十分に的確であることを意味している。   The 1,077,947 bp double-stranded DNA molecule synthesized by the inventors, although below the average size of the bacterial genome, is the largest synthetic molecule with the defined structure reported, It is almost twice the size of the M. genitalium genome synthesized in (Gibson et al., Science 319, 1215 (Feb 29, 2008)). The synthesis of synthetic or semi-synthetic molecules and the demonstration that they have the same properties as natural compounds have long been used as evidence in support of the proposed molecular structure. Our demonstration that synthetic and semi-synthetic genomes give the phenotypic characteristics of M. mycoides means that the underlying DNA sequence is sufficiently accurate to define living cells. Yes.

導入されたゲノム(天然ゲノム、合成ゲノム、または半合成ゲノム)によって制御される細胞は、レシピエント細胞の細胞質が合成ではなくても、「合成細胞」といわれる。レシピエント細胞質の表現型効果は、タンパク質の代謝回転とともに、および移植されたゲノムだけを保有する細胞が複製するにつれて希薄化される。コロニーを形成させるためのプレート上での移植および複製(30回の分割を上回るまたは109倍の希釈を上回る)の後には、子孫は、オリジナルのレシピエント細胞に存在していたいずれのタンパク質分子も含まないと考えられる。アセンブリされたゲノムによって制御される細胞の特性は、全細胞が合成によって産生された場合と同じものと予想される(DNAソフトウェアがそれ自体のハードウェアを構築する)。   A cell that is controlled by an introduced genome (natural genome, synthetic genome, or semi-synthetic genome) is referred to as a “synthetic cell” even if the recipient cell cytoplasm is not synthetic. The phenotypic effect of the recipient cytoplasm is diminished with protein turnover and as cells carrying only the transplanted genome replicate. After transplantation and replication (more than 30 divisions or more than 109-fold dilution) on the plate to form colonies, the progeny are free of any protein molecules that were present in the original recipient cells. It is thought that it does not include. The characteristics of the cells controlled by the assembled genome are expected to be the same as if all cells were produced synthetically (DNA software builds its own hardware).

上記から、当業者は、開示する態様の本質的な特徴を確認することができ、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、それを様々な用途および条件に適応し、そして本発明のシステムおよび方法をそれらの最も広い範囲に利用するために変更および改変することができる。上記の特異的な態様は、単なる説明と解釈され、どのような形であってもその適用範囲を限定するようには解釈されない。上記で引用した全ての出願、特許、刊行物（参照マニュアルを含む）、および図面の開示全体が、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。   From the above, those skilled in the art can ascertain the essential features of the disclosed embodiments and adapt them to various applications and conditions without departing from the spirit and scope thereof, and the system and The methods can be changed and modified to utilize their broadest range. The specific embodiments described above are to be construed as merely illustrative and are not to be construed as limiting the scope of the application in any way. The entire disclosures of all applications, patents, publications (including reference manuals) and drawings cited above are hereby incorporated by reference in their entirety.

Claims (28)

(i) 一つまたは複数の断片として合成または半合成ドナーゲノムをアセンブリする工程;
(ii) ドナーゲノムと宿主ベクターとを異種宿主細胞に導入する工程であって、該宿主細胞への導入の前に該ドナーゲノムと該宿主ベクターとが任意で連結される、工程;
(iii) ドナーゲノムを宿主細胞から回収する工程; および
(iv) 回収したドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程
を含む、合成細胞を作製するための方法であって、
それにより該ドナーゲノムを含む合成細胞が作製され、該ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さである、
前記方法。 (i) assembling a synthetic or semi-synthetic donor genome as one or more fragments;
(ii) introducing a donor genome and a host vector into a heterologous host cell, wherein the donor genome and the host vector are optionally linked prior to introduction into the host cell;
(iii) recovering the donor genome from the host cell; and
(iv) A method for producing a synthetic cell comprising the step of introducing a collected donor genome into a recipient cell,
A synthetic cell is thereby generated that contains the donor genome, which is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least a minimal genome and about 300 kb. Is longer than
Said method. ドナーゲノムが、本質的に、全細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムである、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the donor genome is essentially a whole cell genome, a viral genome, or an organelle genome. ドナーゲノムと宿主ベクターとが、同時に、または連続して宿主細胞に導入される、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the donor genome and the host vector are introduced into the host cell simultaneously or sequentially. 宿主細胞への導入の前に、宿主ベクターが、ドナーゲノムを含むドナー細胞を該宿主ベクターで形質転換することによりドナーゲノムと連結される、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein prior to introduction into the host cell, the host vector is ligated to the donor genome by transforming a donor cell containing the donor genome with the host vector. 宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞である、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the host cell is a bacterial cell, fungal cell, insect cell, plant cell, or algal cell. 宿主細胞が酵母細胞である、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the host cell is a yeast cell. 宿主ベクターがセントロメアプラスミドである、請求項4記載の方法。   5. The method according to claim 4, wherein the host vector is a centromere plasmid. 宿主ベクターが酵母セントロメアプラスミドであり、かつ宿主細胞が酵母細胞である、請求項7記載の方法。   8. The method of claim 7, wherein the host vector is a yeast centromere plasmid and the host cell is a yeast cell. 宿主ベクターが、相同組換えに有用なベクターである、請求項1記載の方法。   2. The method according to claim 1, wherein the host vector is a vector useful for homologous recombination. 宿主細胞への導入の前に、ドナーゲノムが直線化されるか、または断片化される、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the donor genome is linearized or fragmented prior to introduction into the host cell. ドナーゲノムが、細菌ゲノム、真菌ゲノム、酵母ゲノム、古細菌ゲノム、シアノバクテリアゲノム、藻類ゲノム、バクテリオファージゲノム、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムである、請求項1記載の方法。   The donor genome is a bacterial genome, fungal genome, yeast genome, archaeal genome, cyanobacteria genome, algae genome, bacteriophage genome, mitochondrial genome, chloroplast genome, viral genome, or organelle genome. The method described. 宿主細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the host cell is a eukaryotic cell or a prokaryotic cell. ドナーゲノムを宿主細胞内で改変する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, further comprising modifying the donor genome in the host cell. レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, further comprising degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. レシピエント細胞への導入の前に、回収したドナーゲノムがメチル化される、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the recovered donor genome is methylated prior to introduction into the recipient cell. レシピエント細胞の制限エンドヌクレアーゼ機能が、存在しないか、除去されているか、または不活化されている、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the restriction endonuclease function of the recipient cell is absent, has been removed, or is inactivated. レシピエント細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞である、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the recipient cell is a bacterial cell, yeast cell, fungal cell, insect cell, plant cell, or algal cell. 第2のドナーゲノムを宿主細胞に導入する工程をさらに含み、該第2のドナーゲノムは第1のドナーゲノムとは異なり、それにより、2種類の異なるドナーゲノムを含有する宿主細胞が産生される、請求項1記載の方法。   Further comprising introducing a second donor genome into the host cell, wherein the second donor genome is different from the first donor genome, thereby producing a host cell containing two different donor genomes. The method of claim 1. 第2のドナーゲノムを導入する工程が、第1のドナーゲノムを含有している宿主細胞と該第2のドナーゲノムを含有している第2の宿主細胞とを接合させることを含む、請求項18記載の方法。   Introducing the second donor genome comprises joining a host cell containing the first donor genome and a second host cell containing the second donor genome. 18. The method according to 18. 合成細胞が、任意の改変を組み入れているドナーゲノムに対応する表現型を示す、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the synthetic cell exhibits a phenotype corresponding to a donor genome incorporating any modification. ドナーゲノムが合成ゲノムである、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the donor genome is a synthetic genome. ドナーゲノムが半合成ゲノムである、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the donor genome is a semisynthetic genome. 請求項1記載の方法によって産生された合成細胞。   A synthetic cell produced by the method of claim 1. (i) 宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物が得られるように、ドナーゲノムと、宿主細胞中での該ドナーゲノムのクローニングに適している宿主ベクターとを宿主細胞に導入する工程;
(ii) 工程(i)で得たドナーゲノムを含む産物を、宿主細胞から回収する工程;
(iii) (ii)の産物を、レシピエント細胞が該産物によりコードされる表現型を示すようになる条件下で、レシピエント細胞に導入する工程;ならびに
(iv) 工程(iii)により得られた合成細胞を回収する工程
を含む、合成または半合成ドナーゲノムによりコードされる表現型を示す合成細胞を作製するための方法であって、
該ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さであり、かつ該ドナーゲノムは、該ドナーゲノムによりコードされる表現型を該合成細胞が示すのに必要な核酸材料の最小限の構成要素を含む、
前記方法。 (i) introducing into the host cell a donor genome and a host vector suitable for cloning of the donor genome in the host cell so that a product comprising the donor genome comprising the host vector is obtained;
(ii) recovering the product containing the donor genome obtained in step (i) from the host cell;
(iii) introducing the product of (ii) into a recipient cell under conditions such that the recipient cell exhibits a phenotype encoded by the product; and
(iv) a method for producing a synthetic cell exhibiting a phenotype encoded by a synthetic or semi-synthetic donor genome, comprising the step of recovering the synthetic cell obtained by step (iii),
The donor genome is essentially an intact cell genome, viral genome, or organelle genome, which is at least a minimal genome and is longer than about 300 kb, and the donor genome is Comprising the minimum components of nucleic acid material necessary for the synthetic cell to exhibit the phenotype encoded by the donor genome,
Said method. ドナーゲノムを宿主細胞内で改変する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。   25. The method of claim 24, further comprising modifying the donor genome in the host cell. レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。   25. The method of claim 24, further comprising degrading or removing the endogenous genome of the recipient cell. 請求項24記載の方法によって産生された合成細胞であって、
ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型
を示す、前記合成細胞。 A synthetic cell produced by the method of claim 24, comprising:
Said synthetic cell encoded by a donor genome and exhibiting the desired phenotype otherwise the cell does not exhibit. 合成または半合成ドナーゲノム
を含み、かつ
該ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型
を示す、合成細胞であって、
該ドナーゲノムが、300kbより大きい外来ゲノム核酸材料と、合成細胞が該所望の表現型を示すのに必要なゲノムの最小限の構成要素とを含む、
前記合成細胞。 A synthetic cell comprising a synthetic or semi-synthetic donor genome and exhibiting a desired phenotype encoded by the donor genome, otherwise not exhibited by the cell,
The donor genome comprises foreign genomic nucleic acid material greater than 300 kb and the minimal components of the genome necessary for a synthetic cell to exhibit the desired phenotype,
The synthetic cell.

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