JP2013514813A

JP2013514813A - 新規ニューモウィルス組成物及びその使用方法

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Publication number: JP2013514813A
Application number: JP2012546141A
Authority: JP
Inventors: ドゥボヴィ，エドワード; レンショー，ランドール，ダブリュ
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2013-05-02
Anticipated expiration: 2030-12-21
Also published as: EP2818182A1; EP3047855A1; AU2010339715A1; EP2818182B1; EP2516649A4; EP2516649B1; US9028834B2; BR112012017204A2; JP5806233B2; WO2011084783A3; ES2537421T3; KR101675473B1; ES2584861T3; WO2011084783A2; CA2784970A1; EP2516649A2; AU2010339715B2; US9382518B2; CN102884193A; US20150299669A1

Abstract

犬及び猫、潜在的には人間を含む哺乳類に感染しうる、新規に特定されたニューモウィルスが提供される。ウィルスの単離されたポリヌクレオチド及びタンパク質、また、単離されたウィルス自体が提供される。発明は、ウィルスを検出するための組成物及び方法、ウィルスの存在と正の相関関係のある病徴を予防及び／又は治療するための方法及び組成物、及び、ウィルスを含む単離された細胞を含む。完全なウィルス粒子、ウィルス性のタンパク質、及びそれらの断片もまた含まれる。
【選択図】図３

Description

本願は、その開示内容が引用によりここに援用される、２００９年１２月２１日出願の米国出願番号６１／２８８，４０１に対して優先権を主張する。

本発明は一般的に、ウィルス学の分野、より詳細には、イヌ及びネコを含む哺乳類で見いだされた、パラミクソウィルス科、ニューモウィルス亜科の新規に発見されたウィルスに関する。

シェルター、犬舎又は繁殖施設等に一緒に閉じ込められている家畜犬は、しばしば急性の呼吸器感染症（ケンネルコフ）に感染する。新しい動物が連続的に導入されるにつれて疾患は急速に伝染し、除去が困難となる。病原体のスペクトラムは、診断や処置を困難にする複数で連続的に重複する感染症の複雑な症候群を引き起こしうる。感染した犬は、軽い乾いた咳や鼻汁から肺炎や深刻な場合には死に至る範囲の臨床的な徴候を示す。猫もまた、多様な深刻度の呼吸器の苦痛を引き起こす様々な病原体に感染する。同一又は類似のウィルスはヒトにもまた感染しうる。このように多様な哺乳類に感染する病原体を特定することやこのような感染症のための診断、予防、及び／又は治療において使用するための組成物や方法を発展させることには、継続的かつ未充足のニーズが存在している。本発明はこれらのニーズを満たすものである。

本発明は、新規なニューモウィルスの我々の発見に基づいている。このウィルスは、イヌ、ネコ及びおそらくヒトを含むがこれらに制限されない、多くの種類の哺乳類に感染しうる。ウィルスの存在は、イヌの急性の呼吸器疾患（ＡＲＤＣ）又はネコの呼吸器疾患、又は、ヒトその他の哺乳類の呼吸器その他の病気と正の相関関係がある。

本発明は、ウィルスの単離されたポリヌクレオチド及びタンパク質、また単離されたウィルスそのものを提供する。本発明はウィルスを検出するための組成物及び方法、ウィルスの存在と正の相関関係のある病徴を予防及び／又は治療するための方法及び組成物を含む。またウィルスを含む単離された細胞を提供する。

本発明のウィルスはマイナス鎖ＲＮＡウィルスである。本発明は、単離されたマイナス鎖、当該マイナス鎖と逆相相補性を有するプラス鎖、ＲＮＡポリヌクレオチドのＤＮＡ等価物、プラス鎖にコードされているタンパク質、及び、ポリヌクレオチド及びタンパク質の断片を含む。

ある実施態様において、単離されたウィルスは配列番号１の配列、又は、配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一である配列を含むマイナス鎖ポリヌクレオチドを含む。また、配列番号２又は配列番号３の配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は、配列番号２又は３の配列と少なくとも９６％が同一である配列を有するポリヌクレオチドが提供される。

本発明は、哺乳類において免疫応答を刺激する方法を提供する。刺激された免疫応答は細胞仲介性、体液性、又はそれらの組み合わせでありえ、動物に対して予防及び／又は治療的な利益を提供しうる。免疫応答を刺激する方法は、ここに開示されるポリヌクレオチド及び／又はウィルス、ここに開示されるウィルス性ポリヌクレオチドによってコードされるウィルス性タンパク質、このようなタンパク質の断片、又は、それらの組み合わせを含む組成物を、哺乳類に投与することを含む。ポリヌクレオチド、ウィルス及び／又はタンパク質及び／又はそれらの断片は、いかなる適切なソースから単離されてもよく、また、それらは公知の技術を用いて組み換えによって生産されてもよい。

本発明は、哺乳類から取得した生物学的サンプルにおけるウィルスの存在を検出するための方法を提供する。当該方法は、哺乳類から生物学的サンプルを取得すること、及び、当該生物学的サンプルから、ウィルス又はウィルス性のタンパク質又はそれらの断片によって含まれるポリヌクレオチド配列を検出すること、を含む。ポリヌクレオチド、タンパク質、タンパク質の断片、又はそれらの組み合わせの存在は、その哺乳類がウィルスに感染していることを示唆する。

ヒトＲＳウィルス特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いたＡ７２細胞の免疫蛍光アッセイ。Ａ）感染細胞でのＭａｂ２Ｇ１２２。Ｂ）非感染細胞でのＭａｂ２Ｇ１２２。Ｃ）感染細胞でのＭａｂ５Ｈ５Ｎ。Ｄ）非感染細胞でのＭａｂ５Ｈ５Ｎ。一次Ｍａｂのストックは製造者から入手したものを１：１００希釈して用いられた。赤いバックグラウンドは、エバンスブルーでの対比染色によるものである。感染及び非感染のイヌＡ７２細胞に対する、非呼吸器関連のテストのために提出された、ランダムに選択されたイヌ血清の反応性を示す免疫蛍光アッセイである。Ａ）１：３２０希釈での感染細胞の血清。Ｂ）１：３２０希釈での非感染細胞の血清。赤いバックグラウンドは、エバンスブルーでの対比染色によるものである。配列番号１の配列を含むウィルスゲノム組織の図示である。

本発明は、新規な単離されたウィルス、単離されたポリヌクレオチド、及びウィルスのタンパク質、ウィルスを検出するための組成物及び方法、及び、哺乳類においてウィルスの存在と正の相関関係のある病徴の予防及び／又は治療のための組成物及び方法を提供する。

本発明のウィルスは、ネガティブ（マイナス）鎖ＲＮＡウィルスである。つまり、ウィルス粒子に包含されている遺伝子材料は、ポジティブ（プラス）鎖の逆相補物であるＲＮＡの単一鎖である。プラス鎖は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってマイナス鎖から転写される。当該プラス鎖によってコードされているウィルス性タンパク質の、少なくとも一部はｍＲＮＡとしてのプラス鎖の機能は、感染細胞の細胞質で翻訳され、そして、新しいウィルス粒子の組み立て及びマイナス鎖ゲノムのパッケージングに関与する。

特定の実施態様において、本発明は、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一である配列を含むマイナス鎖ポリヌクレオチドを含有する単離されたウィルスを提供する。本発明はまた、当該マイナス鎖に相補的なポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、これらのポリヌクレオチドは、配列番号４に示される配列又は少なくとも９６％が配列番号４と同一である配列を含む。また、配列番号１の配列又は少なくとも９６％が配列番号１の配列と同一である配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は、配列番号４の配列又は少なくとも９６％が配列番号４の配列と同一である配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。また、配列番号２及び／又は配列番号３の配列を含むポリヌクレオチド、又は少なくとも９６％が配列番号２，３の配列と同一である配列を有するポリヌクレオチドが提供される。これらの配列の逆相補物、及び、少なくとも９６％が逆相補配列と同一性を有する配列もまた提供される。ここに開示されるすべてのポリヌクレオチド及びタンパク質及びそれらの断片の組み合わせもまた、本発明に含まれる。本発明によって提供されるウィルス性のポリヌクレオチドは、生ウィルス（弱毒化ウィルスも含む）において、複製をサポートする働きをすることによって特徴づけられる。

また、ウィルスを含有する細胞が提供される。多くの実施態様において、ウィルスを含有する細胞は、単離された細胞、又は、ウィルス弱毒化のために及び／又はワクチンや他の目的のために使用するためのウィルス源として、インビトロで増殖させられる細胞である。このように、ウィルスを含む単離された細胞、ウィルスを含む細胞培養及び／又はセルライン、細胞培養培地に存在するウィルス及び／又はウィルス性生産物、及び、ウィルスを含む単離された組織は全て、本発明の局面である。

特定の実施態様において、本発明で開示される各ＲＮＡ配列のＤＮＡ等価物が提供される。つまり、本発明は、ＲＮＡの各々のＵ（ウラシル）がＴ（チミン）に置換されている、ここに開示される各ＲＮＡ配列を含む。本発明で開示される各々のウィルス性ポリヌクレオチドは、各ポリヌクレオチドについて指定された配列番号で示される配列と同一であるポリヌクレオチドを含み、さらに、ウィルスの配列番号で示された配列と少なくとも９６％が同一であるすべてのポリヌクレオチドをも含む。特定の実施態様では、配列リストで示されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドは、全長に渡る配列のうち少なくとも９６％がそれらの配列と同一である。いかなる特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、ここに示され、また、配列リストで説明されるウィルス性のポリヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列は、例えばネズミ科の哺乳類に感染することが既に知られているウィルスのような、関連のウィルスによって含まれるポリヌクレオチドとは区別されるものと考えられている。また、これもいかなる特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、例えば連続継代によるウィルスの弱毒化は、配列リストに示された配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含み、及び／又は転写するウィルスを生じ得る。配列リストに特定して列挙された配列と同一でない配列は、示された配列と９６．０％から９９．９％同一でありえ、数値には示された数値の間の小数第一位のすべての整数値を含む。９６．０％から１００．０％の間の配列の同一性の全ての範囲が、包括的に、本発明の実施態様である。

ポリヌクレオチドの断片もまた本発明に含まれる。つまり、様々な実施態様において、各々のウィルス性ポリヌクレオチド（その逆相補物及びＤＮＡ等価物を含む）は、１０ヌクレオチドからポリヌクレオチド全長にわたる範囲、そしてその間のすべての整数値を含む範囲の、ポリヌクレオチド断片を含む。例えば、本発明は、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドを含み、また、長さで１０ヌクレオチド以上、８５９８ヌクレオチドポリヌクレオチドまでの間（また、それらの間の全ての整数値を含む）の全ての配列の断片を含むポリヌクレオチドを含む。本発明で提供されるポリヌクレオチドは、ウィルス粒子に存在するか否かに関わらず、ここに開示されるものよりも長くてもよい。なぜなら、提示される配列は、ウィルスゲノム及び／又はそれらの逆相補物及び／又はＤＮＡ等価物の、全体を含むものではないからである。

本発明はまた、哺乳類において免疫応答を刺激する方法をも提供する。刺激された免疫応答は、動物に予防的及び／又は治療的利益をもたらしうる免疫応答である。刺激された免疫応答は、体液性の及び／又は細胞仲介性の免疫応答でありえる。刺激された免疫応答は、ウィルスにコードされる、抗原及び／又は免疫原のいずれかに対するものでありえる。つまり、完全なウィルス粒子、各ウィルス性のタンパク質、及び、ウィルス性のタンパク質の断片は、哺乳類において免疫応答を刺激するために使用されうる本発明の実施態様である。多くの実施態様において、免疫応答が刺激される動物はイヌ（Canis familiaris）又はネコ（Felis catus）、すなわち各々家畜化された犬又は猫である。

特定の実施態様において、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一の配列、又はそこにコードされるタンパク質又はタンパク質断片、又は配列番号１の逆相補物によってコードされるウィルス粒子、を含むポリヌクレオチドは、イヌにおいて免疫応答を刺激するために用いられる。配列番号２及び／又は配列番号３の配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号２又は３の配列と少なくとも９６％が同一の配列を有するポリヌクレオチド、又は、配列番号２又は３の逆相補物によってコードされるタンパク質又はタンパク質断片又はウィルス性タンパク質、又は、配列番号２又は３の逆相補物と少なくとも９６％が同一の配列を有するポリヌクレオチドは、ネコにおいて免疫応答を刺激するために好ましく使用される。イヌ及びネコへの、これらの配列、タンパク質、タンパク質断片、及びウィルス粒子の間の同様の関係が、診断目的のためのこれらの組成物の使用にも適用される。しかしこのことは、ヒトを含む他の哺乳類での本発明の実施についての適用性を、いかなる意味でも減縮するものではない。

免疫応答を刺激する方法には、ここに開示されたウィルス、ここに開示されたウィルス性ポリヌクレオチドによってコードされるウィルス性タンパク質、このようなタンパク質の断片又はこれらの組み合わせを含む組成物を、哺乳類に投与することを含む。ウィルス及び／又はタンパク質及び／又はそれらの断片は、いかなる適切なソースから単離されてもよく、また、公知の技術を用いて組み換え的に生産されてもよい。多くの実施態様において、ワクチンにおいて使用されるための本発明によって提供されるウィルス性タンパク質は、ＮＳ−１、ＮＳ−２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、Ｌタンパク質及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質をコードする全てのヌクレオチド配列は本発明に含まれ、当業者によって通常の技術を用いて決定されうるものである。

本発明の組成物が投与される哺乳類は、ここに開示されるウィルスを含むがそれに制限されない１又は複数のニューモウィルスに対してリスクのある、保菌が疑われる、又はこのウィルスの存在と正の相関関係のある条件で診断された、あらゆる哺乳類でありえる。ある実施態様において、この動物は、ＡＲＤＣにリスクがあり、疑われ、又は診断されている犬である。他の実施態様において、この哺乳類は、ここに開示されるウィルスと正の関連がありうる呼吸器疾患その他の疾患が疑われ、或いは診断された、リスクのある人間である。この点において、マウス肺炎ウィルスのような、ここに開示される新規に発見されたウィルスと関係するウィルスは、人間にも広範囲の感染を引き起こすことが、当分野では公知である（例えば、Pringle CR, Eglin RP. Murine pneumonia virus: seroepidemiological
evidence of widespread human infection. J Gen Virol. 1986 Jun; 67 (Pt 6):
975-82を参照）。つまり、ここに提供される組成物及び方法が、人間において免疫応答を刺激するために、また、人間においてウィルス感染の診断に用いられるために、有用性を有すると考えることは合理的である。

動物への本発明の組成物すなわちワクチンの投与は予防的効果を生じ得る。これはワクチンを受けていない動物よりもワクチンを受けた動物のほうが感染の可能性が低いこと、又は、動物においてウィルスの存在と正の相関関係のある病徴がワクチンを受けていない動物よりもワクチンを受けた動物において深刻度がより低いことを意味している。本発明のワクチンの投与はまた治療的効果を有しうる。これはワクチンを受けていない感染動物に対して、ワクチンを受けた後に感染した動物は感染の度合い（すなわちウィルス負荷又は力価、及び／又は当業者に公知の感染度マーカー）が低いことを意味している。同様に、ワクチンを受けていない動物に対してワクチンを受けた感染動物は、動物においてウィルスの存在と正の相関関係のある病徴の深刻度が低い。

ここに開示されるウィルス及び／又はタンパク質及びポリヌクレオチドは単離されうる。これは例えば動物及び／又は動物から得られる生物学的サンプルからウィルスを分離することによって、ウィルスの自然の環境からウィルスが除かれることを意味している。一つの実施態様において、ここに開示されるウィルスを含む単離された細胞は単離されたウィルスを包含すると考えられる。さらに本発明の単離されたウィルス及び／又はタンパク質及び／又はそれらの断片及び／又は単離され及び／又は組み換えられたポリヌクレオチドは、如何なる所望の精製度で精製されてもよい。本発明で提供される組成物はウィルス、ウィルス性タンパク質、それらの断片、及び／又はポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの断片及び／又はそれらの組み合わせを含み、それらからなり、又は、実質的にそれらからなるものであってよい。

一つの実施態様において方法は、イヌにおいてウィルスに対する免疫応答が刺激されるように、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド又は配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一の配列を有するポリヌクレオチドを含む組成物をイヌに投与することを含む。一つの実施態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡワクチンとして投与される。ＤＮＡワクチンを含む薬剤組成物を成形すること、及び、ＤＮＡワクチンを含む組成物を投与することは当分野で公知である。一つの実施態様において、イヌに投与されるポリヌクレオチドはウィルス粒子中に存在する。ウィルス粒子は単離及び／又は組み換えされうる。多くの実施態様において、イヌに投与されるウィルスはウィルス粒子によって含まれるタンパク質の一部であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含んでいる。ウィルスゲノムによってコードされるウィルス粒子によって含まれるウィルスタンパク質の予測されるアミノ酸配列は、イヌウィルス性タンパク質ＮＳ１、非構造タンパク質１（配列番号７）、ＮＳ２、非構造タンパク質２（配列番号８）、Ｎ、核タンパク質（配列番号９）、Ｐ、リン酸タンパク質（配列番号１０）、Ｍ、マトリクスタンパク質（配列番号１１）、ＳＨ、小疎水性タンパク質（配列番号１２）、Ｇ、アタッチメントタンパク質（配列番号１３）、Ｆ、フュージョンタンパク質（配列番号１４）、Ｍ２、マトリクスタンパク質Ｍ２−１（配列番号１５）、及びＭ２−２（配列番号１６）、Ｌ、一部配列が提供されている（配列番号１７）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。これらのタンパク質のネコウィルス型も本発明によって提供される。

他の実施態様においてこの方法は、ネコにおいてこのウィルスに対する免疫応答が刺激されるように配列番号２及び／又は配列番号３の配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号２又は３の配列と少なくとも９６％が同一の配列を有するポリヌクレオチドを含む組成物でウィルスをネコに投与することを含む。一つの実施態様において、ネコに投与されるポリヌクレオチドはウィルス粒子の中に存在する。粒子は単離され及び／又は組み換えられ得る。

多くの実施態様において、ネコに投与されるウィルスは配列番号５又は配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。

ある実施態様において本発明は、ここに開示されるウィルスによる感染に対する予防的及び／又は治療的効果を提供しうるワクチンを含む。このワクチンは生又は死滅（不活性化）ウィルス又はその断片を含みうる。死滅ウィルスとは複製が不可能であるウィルスである。死滅ウィルスは当業者には周知の多様な技術のいずれを用いて調製されてもよく、熱による不活性化及びウィルス性タンパク質及び／又は核酸の修飾を含みまたこれらに制限されず、その方法はパラホルムアルデヒド、ホルマリン及び紫外光線への暴露を含みまたこれらに制限されない。例えば、ウィルス性タンパク質は例えばウィルス性の細胞侵入及び／又は複製に必要とされる１又は複数のステップを回避するようにウィルス性タンパク質を修飾できうるクロスリンク剤によって共有結合的に修飾されうる。生ウィルスは弱毒化ウィルスを含むと考えられている。弱毒化ウィルスとは弱毒化されていないものに対して毒性が低減されているウィルスである。つまり弱毒化ウィルスは複製可能である、しかしながら、同種の弱毒化されていないものと比して速度は遅く、つまりそれゆえに一般的に疾患を引き起こさない。当業者は、弱毒化されていないもの、弱毒化されたもの、及び、死滅ウィルスの間の他の区別点についても認識しそれらは互いに区別され得るであろう。

ウィルスの弱毒化は何らかの標準的な技術を用いて得られうる。一つの実施態様ではウィルスは哺乳類細胞培養における連続継代によって弱毒化される。連続継代は多様な機構を通じて弱毒化を生じ得る。人間の細胞を含みこれに制限されない、ウィルスの複製を支える何らかの細胞はウィルスの増殖や弱毒化の目的のために継代において使用され得る。様々な非制限の例示において継代のための細胞培養は其々Canis familiaris 又はFelis catus のようなイヌ又はネコから得られ又はそれに由来しうる。一つの実施態様において細胞は初代細胞培養である。ある実施態様において、細胞はＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５４２の番号を有するＡ−７２細胞株由来のイヌ細胞に含まれうる。ウィルスの弱毒化に好適ないかなる継代数も使用することができる。当業者は本開示の有益性を持ったウィルスの弱毒化のための継代パラメータを決定することができるだろう。一般的に５−１５０（その間の全ての整数値を含む）継代、好ましくは２０−５０の間の継代が使用され得る。

ウィルスを含む組成物はワクチンとして使用するための医薬製剤として提供されうる。ウィルスを含む組成物は懸濁液として又は凍結乾燥形態で提供されることができ、またこのような組成物に通常使用される医薬的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤を含有しうる。本発明での使用のために好適なキャリア及び希釈剤のいくつかの例が、The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21^st edition,
Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins に見出される。特定かつ制限的ではないキャリアの例は安定化剤、防腐剤及びバッファを含む。特定かつ制限的ではない安定化剤の例は、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン、グルタミン酸、又はグルコースなど）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミン又はカゼインなど）又はそれらの分解生成物を含む。好適な、特定かつ制限的ではないバッファの例はアルカリ金属リン酸塩を含む。好適な、特定かつ制限的ではない希釈剤の例は水、水系バッファ（例えば緩衝生理食塩水）、アルコール及びポリオール（例えばグリセロール）を含む。

当業者はここに提供されるワクチン製剤はアジュバント活性を有する１又は複数の組成物を含みうることを認識するであろう。好適なアジュバントはフロイント（Freund）の不完全アジュバント、トレオニルムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、リン酸塩又は酸化物、例えば、鉱物油又は、例えばビタミンＥ酢酸塩のようなベジタブルオイル及びサポニンに基づく水中油型又は油中水型乳化液を含みまたこれらに制限されない。

本発明によって提供されるワクチンはあらゆる好適なルートを通じて投与されうる。多様な実施態様においてワクチンは非経口で、筋肉注射又は皮下に、静脈内投与で、或いは、経鼻を含むがこれに制限されない経口で投与されうる。ワクチンの効果的な投与量は例えば、免疫応答の刺激が所望される動物のタイプ、サイズ、年齢、環境、感染ステージのリスクのような通常の検討を用いて決定され得ることを当業者は認識するであろう。一般的に本発明による生ワクチンは、動物当たり、例えば１ｍＬ用量あたり１０^１−１０^６ｐｆｕ（プラーク形成ユニット）の用量で投与されうる。不活性化されたワクチンは動物当たり１０^６−１０^１０ｐｆｕの抗原性等価物を含みうる。

本発明のポリヌクレオチドは例えばここに開示されるウィルスだけでなく、他の関連する又は非関連のウィルス及び／又は他の感染性病原体に対して免疫化を提供しうる異種遺伝子（１又は複数）を包含するように修飾されてもよい。同様にここで提供されるワクチン組成物は、ここに開示されるウィルスから区別される感染性病原体に対して免疫応答を刺激することを目的とされる免疫原性の薬剤を含むことができる。つまり本発明は種々の哺乳類において、また、種々の感染性病原体に対して使用するための混合ワクチンを予測するものである。混合ワクチンはここに開示されるウィルス性タンパク質の全部又は一部を含み、また、異なる感染性病原体に対して効果を有する多価ワクチンを提供するために他のタンパク質からのポリペプチド配列を含みうる融合タンパク質を含みうる。本発明はさらに、動物に有益な効果を与え得る他の組成物であってこのような感染のための従来的な治療に先立って、同時に、又は続いて投与される組成物を投与することを含む。

本発明はまたここに開示されるウィルスを検出するための方法も提供する。この方法は動物から生物学的サンプルを得ること、及び、サンプル中に又はサンプルから、ウィルス性タンパク質及び／又はウィルス性ポリヌクレオチドの存在を検出することを含む。ウィルス性ポリヌクレオチド及びタンパク質のいずれかがウィルスの存在又は不存在を検出する方法において使用されうる。配列番号１、２又は３の逆相補物又はＤＮＡ等価物を検出することは配列番号１、２、又は３の配列、又はこれらの配列と少なくとも９６％が同一の配列を含むポリヌクレオチドを検出することと同等であると考えられている。

検出は、診断が望まれる哺乳類から得られたいずれの好適な生物学的サンプルを使用して実行されてもよい。生物学的サンプルの好適なソースは、血液、粘膜剥離物、組織生検、又は唾液を含みこれらに制限されない。一つの実施態様においては生物学的サンプルは鼻及び／又は咽頭スワブ、又は気管洗浄液を含む。

ウィルスの存在又は不存在は当分野では周知の様々な技術を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を検査することによって検出されうる。ある実施態様ではウィルスの存在はウィルスゲノムの全体又は一部を含む、又は、ウィルスゲノムの全部又は一部から増幅されるポリヌクレオチドを検出することによって決定される。この点で本発明はウィルスのマイナス鎖、ウィルスのプラス鎖、又はそれらの組み合わせからのポリヌクレオチド配列を同定することによって、ウィルスの存在（又は不存在）を決定することを含む。本発明はまたウィルスのマイナス鎖、プラス鎖、及びそれらの組み合わせのＤＮＡ型を検出することも含む。例えば一つの実施態様において逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）がウィルスのマイナス鎖又はその一部のＤＮＡ複製物を生成するために用いられる。またＤＮＡ複製物はハイブリダイズされた二本鎖において、プラス及びマイナス鎖又はそれらの一部分のＤＮＡ型を含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を得るためのウィルスゲノムの増幅のためのテンプレートとして用いられうる。当業者は興味の対象である生物学的サンプル中にウィルスがいるか又はいたかどうかの決定において使用するための遺伝子材料の量の増幅のために使用される多様な増幅技術があること、また、この増幅された（又は増幅されない）遺伝子材料はポリヌクレオチド配列を決定するための多くの周知の方法及び試薬を用いて分析されうることを認識するであろう。すなわち本発明は、ウィルス性ポリヌクレオチドの存在又は不存在が確認されうるように生物学的サンプルから核酸を獲得し、また分析するための何らかの及びあらゆる方法を含む。この方法は何らかの公知の技術を用いて、核酸及び／又は他のタイプのプローブをハイブリダイズすることによって、及び、ウィルス性ポリヌクレオチドの配列を決定することによってポリヌクレオチドを検出するための方法を含みこれらに制限されない。配列の全部又は一部分がウィルス性のポリヌクレオチドを同定するために決定され、使用され得る。

ある実施態様において本発明は単離されたウィルス性ポリヌクレオチドを含む組成物、及び、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は増幅のために使用される要素を提供する。また組成物はＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、遊離核酸三リン酸塩、塩、バッファ、及び、核酸をハイブリダイズ及び／又は増幅するのに典型的に用いられる他の試薬を付加的に含むことができる。一つの実施態様において本発明は、単離されたウィルス性ポリヌクレオチド及び／又はウィルス性ポリヌクレオチドから増幅されたポリヌクレオチドであって、ｒｔ（real time）核酸増幅技術において用いられる１又は複数の増幅プライマー及び検出プローブにハイブリダイズされたものである単離されたウィルス性ポリヌクレオチド及び／又はウィルス性ポリヌクレオチドから増幅されたポリヌクレオチドを提供する。

本発明はまた、単離されたウィルス性ポリヌクレオチド、及び／又は、ポリヌクレオチドがアレイの中に存在する少なくとも一つのプローブに増幅されたものである、ウィルス性ポリヌクレオチドから増幅されたポリヌクレオチドを提供する。このアレイは、例えば複数の特定のポリヌクレオチドの存在又は不存在を決定するために使用されるチップ上に存在しうる。このようなチップは商業的に提供されるものであり、また本質的にあらゆるポリヌクレオチドの存在又は不存在を検出するためにカスタマイズされうる。

多様な実施形態において本発明はさらに、哺乳類がここに開示されるウィルスに感染しているか否かの決定を有形的な媒体に固定することを含む。有形的な媒体はどのような有形的な媒体でもよく、例えば、コンピュータ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ又は電子メールメッセージに保存されるデジタルファイルを含みこれらに制限されないデジタル媒体のあらゆるものでありえる。有形的な媒体は感染哺乳類のための治療プロトコルを発展させるようにヘルスケア提供者に提供されうる。

当業者には本発明の利益を受けて多様な反応試薬が作られ、ここに開示されるウィルスの検出のための診断方法に使用されうることが認識されるであろう。例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体が、ウィルス粒子又はウィルス粒子の一部、又は単離された又は組み換えのウィルス性タンパク質又はその断片を用いて作られ得る。すなわち抗体は、あらゆるウィルス性タンパク質に存在するあらゆる抗原決定要因を特異的に認識するように作られ得る。多様な実施態様において抗体は、ＮＳ−１，ＮＳ−２，Ｎ、Ｐ，Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１、Ｍ２−２及びＬウィルス性タンパク質、又は、その一部又は組み合わせを認識する。抗体は本発明のウィルスを、ＭＰＶのような他の関連するウィルスから識別できるように、作られ得る。

抗体は、生物学的サンプルからウィルス性抗原の存在又は不存在が決定されうるようなあらゆる技術において用いられ得る。このような技術はウェスタンブロッティング、免疫蛍光法、免疫組織化学及びビーズ法又は従来のタンパク質アレイのＥＬＩＳＡアッセイを含みこれらに制限されない。

一つの実施態様において本発明は、抗体との複合体に存在する単離された及び／又は組み換えウィルス又はウィルス性タンパク質を提供する。
続く実施例は本発明の特定の実施形態を描写することを意図しているが、いかなる意味でも本発明を制限するものと解釈されるべきではない。

［実施例１］
我々は、雑種犬の鼻及び咽頭スワブからサンプルを採取し、呼吸器ウィルスを単離するために、イヌＡ７２細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ＣＲＬ−１５４２）にそれらを植菌するために用いた。植菌後約２１日に対応する、培養の経過の後期段階において、いくつかの培養が僅かに細胞変性の変化を示した。連続する経過の後、培養は培養全体の急速な細胞死に続いて、円形細胞の小巣を現した。このパターンは一般的なＡＲＤＣに伴うウィルスには非特徴的であると主観的に判断された。１３の別個のウィルス単離物が得られ、この実施例において説明される。一般的なイヌ呼吸器病原体に特異的な診断反応試薬のパネルを用いたテストは、公知のウィルスを同定することができなかった。他のウィルスのための追加的な反応試薬でのさらなるテストは、最終的に、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（抗ＨＲＳＶ、番号ＶＰ−Ｒ１５１、Vector Laboratories、ＵＳＡ、カリフォルニア州バーリンガム）に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）プールを用いた免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって陽性認識を示した。この抗体の調製は、ウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）の検出のために我々のラボで一般的に使用されているものである。染色パターンは、ＲＳＶ感染細胞において観察される典型的なパターンである線維状の膜結合及び遊離のウィルス粒子及び細胞質内封入体を含んでいた。

最初のＩＦＡ結果に続いて、我々は、ヒト、ウシ、ヒツジのＲＳＶ配列のアライメントに基づいてデザインされたＰＣＲプライマーを用いて、ウィルスからヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ）の断片を増幅することを試みた。これは不成功であった。抗ＲＳＶプールの個々のＭａｂのストック及びそれらの特異性は、製造者から入手され、ＩＦＡ（図１）のために使用された。Ｍａｂ５Ｈ５Ｎ（Ｍ２タンパク質特異的）での染色は、ウィルス粒子及び封入体の両方を染色した。Ｍａｂ２Ｇ１２２（Ｐタンパク質特異的）は、一次的に封入体を染色し、相対的に均一な膜仲介性のシグナルを与えた。Ｍａｂ１Ｃ３（Ｎタンパク質特異的）又は５Ａ６（Ｆタンパク質特異的）では染色は得られなかった。４種の個々のＭａｂの全てが、ＩＦＡによってＢＲＳＶを認識した。４種のＭａｂのうちの２種のみによるイヌウィルスの認識と、ＲＳＶの保存領域の増幅が不可能であったことは、ＲＳＶに関連性があるが典型的な形態でないことを示唆した。

ウィルス配列の解明は、ＣＯＤＥＨＯＰアルゴリズムを用いて、ニューモウィルス亜科の全てのウィルスの複数の配列アライメントのうち高度に保存されたアミノ酸（ａａ）配列に基づいた変性ＰＣＲプライマーをデザインすることによって追跡された。Ｌ（ポリメラーゼ）及びＮ遺伝子の特定領域が目標とされた。反応生成物の配列決定とＢＬＡＳＴ分析は、ウィルスが伝統的にマウスのニューモウィルス（又は肺炎ウィルス）として知られているマウスニューモウィルス（ＭＰＶ）に近いことを明らかにした。２つのＬ遺伝子ＰＣＲ産物は、ＭＰＶと９５％から９７％同一であることが見いだされ、Ｎ遺伝子断片は約９６％が同一であった。

新規に同定されたニューモウィルスが、テストされたシェルターのイヌの群に限られるのかどうかという疑問に対処するために、我々はランダムなイヌ血清サンプルをスクリーニングし、２７のうち６の動物が感染された培養のウィルスが特異的に認識される抗体を有していたことを見出した。染色パターンは、Ｍａｂ（図２）で観察されるものと類似であった。ＢＲＳＶに対する中和抗体を種々の量で含有するウシ血清は、イヌウィルスに感染している細胞を染色しなかった。

この例は、ＡＲＤＣの１３頭のイヌから単離されたウィルスはＭＰＶに非常に近い関係にあるとみられることを示し、ゆえに我々は、それらはイヌニューモウィルス（CnPnV）であると考える。マウスニューモウィルスは、パラミクソウィルス科のニューモウィルス亜科の中でニューモウィルス属として分類されている３種のうちの１種である。ヒトＲＳＶはタイプ種であり、ＢＲＳＶと非常に近縁関係であるがＭＰＶはより遠い関係である。例えば、ヒト及びウシＲＳＶのＮタンパク質ヌクレオチド配列は約９４％が互いに同一であるが、ＭＰＶに対しては６０％の同一性を有するにとどまる。ＭＰＶの完全に配列決定された株は２種のみで、‘Strain 15’及びJ3666であるが、それらはヌクレオチドのレベルでは９９．７％の同一性を有する。

ＡＲＤＣでのCnPnVの連関は、いくらかの場合、特に複合的な病因論に関与する時には病原性でありえる。類推では、ＭＰＶは一般に齧歯類の飼育株に感染することが知られ、また、血清学的な証拠は幾らかの野生型齧歯類での感染を指摘するが、自然的な生態学については多くは知られていない。実際、齧歯類がＭＰＶの唯一の自然的なホストであること、又は、近縁関係のウィルスが他種に拡散するのかどうかは、明確ではない。呼吸器症状を伴うヒトの感染の証拠が報告されている（Pringle CRら、J.Gen.Virol. 1986;67:975-82）。自然界では齧歯類の感染は無症状で潜在的であるかもしれない。飼育マウスでの臨床症状は無症状から高い罹患率及び死亡率を伴う肺浮腫への発展まで幅広い。J3666とStrain15の両方を含む病原株は、深刻な肺炎を引き起こし、少量で植菌された時には６−１０日で死に至りうる。病原性、またはその欠如はウィルス及びマウス株依存性であるのだろう。

複数の微生物とウィルス病原体がイヌの呼吸器疾患に関与しうる。すなわちCnPnVは、より深刻な疾患を導く上部呼吸器胴の防御機構を損傷する一連の事象を開始する能力のある他の病原体であると考えられる。

［実施例２］
この実施例の材料及び方法は、残りの実施例で説明される結果を得るために使用された。

［ウィルスの単離］
鼻及び咽頭検査サンプルは、湿潤スワブを用いて呼吸器疾患の症状のある雑種犬から集められ、コーネル大学動物健康診断センターにおいて受領から２４時間以内に処置された。植菌の前に、スワブはアール塩（Earle’s salt）（Gibco 10370, Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA）、0.5%ウシ血清アルブミン、ペニシリン（200 U/ml）、ストレプトマイシン（200 μg/ml）、及びファンギゾン（2.5 μg/ml）を含む最少基礎培地（ＭＥＭ培地）３ｍＬに３０分間浸漬し、続いて１０秒間機械的に撹拌した。それぞれ０．５ｍＬの鼻及び咽頭抽出物の分割単位は集められ、セミコンフルエントのＡ７２細胞（Binnら、1980）(CRL-1542,
American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)のシングルＴ２５フラスコに、培地を追加することなく植菌するのに用いられた。抽出物は、１−３時間モノレイヤーの上に残置され、その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスオフされた。細胞は６ｍＬの培養培地（ライボビッツのＬ−１５培地、10% 熱非活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、200 U/ml ペニシリン、200 μg/ml ストレプトマイシン、50 μg/mlゲンタマイシン）にて３７℃で維持され、６−８日毎に継代培養された。植菌されていないコントロールのＡ−７２培養が単離プロセスを通じて並行して行われた。

［免疫蛍光アッセイ］
細胞はガラススライドに接着させられ、その後ＰＢＳでリンスされ、冷アセトン１０ｍＬで固定化された。スライドは空気乾燥され、染色の前に−２０℃で貯蔵された。ＰＢＳで希釈された一次抗体及び二次抗体がスライドに滴下され、３７℃で３０分間インキュベートされた。各インキュベーションの後、スライドはＰＢＳ中で１５分間リンスされた。染色は蛍光顕微鏡で可視化された。ＨＲＳＶに対するＭａｂのプールが希釈率１：４００にて当初の同定において使用された（ＶＰ−Ｒ１５１、ベクターラボラトリー、バーリンガム、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。１倍濃度で供給されたマウス抗−ＰＶＭ（CL-603IFA, Charles River Laboratories, ウィルミントン、マサチューセッツ州、USA)が、希釈率１：２０にて使用された。二次抗体ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（０２−１８−０６、ＫＰＬ、ガイザースバーグ、メリーランド州、ＵＳＡ）は、希釈率１：４０（12.5 μｇ／ｍＬ）で使用された。

［ＲＮＡ精製］
全細胞性ＲＮＡがＡ７２細胞から精製された（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。約５０−７５％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す一つの２５ｃｍ^２フラスコからの細胞が、ペレットにされ、各カラムを通して精製された。細胞フリーの上清及びスワブ溶出物を含む培地はサンプル１４０μＬを用いて精製された（５２９０６、Ｑｉａｇｅｎ）。精製されたＲＮＡｓはＲＮａｓｅフリーの水４０μＬで再懸濁された。

［ＰＣＲ］
ゲノム断片を得るために当初使用された縮重プライマー配列は、ニューモウィルス科ウィルスのアライメントに基づき、ＣＯＤＥＨＯＰアルゴリズム(blocks.fhcrc.org/codehop.html)（Roseら、1998）を用いて設計された。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は製造者の指示に従い２５μＬボリュームで１段階反応（２１０２１２、Ｑｉａｇｅｎ）で行われた。１：５〜１：１０で希釈された全ＲＮＡの１μＬ及び各プライマー１０ｐｍｏｌが各反応で使用された。ＲＴステップの反応条件は、５０℃／３０分、続いて９５℃／１５分であった。サイクル条件は、９５℃／６０秒、５４−５６℃／３０秒及び７２℃／６０−９０秒を３５サイクル行った。プライマーは次の通りである：Ｎ遺伝子：N276F,tccgtgcaggccgaratggarcarg/P1R,（配列番号３５）ggaactcgggggcgaayttytccat;配列番号３６）；Ｌ遺伝子 no 1:L428F, ccggatcttcggccayccnatggt/（配列番号３７）L538R, ttcttaggaggggagatggcyttrtcrtt；（配列番号３８）Ｌ遺伝子 no. 2：L698F,
catcaccgacctgtccaagttyaaycargc/（配列番号３９）L894R,
ttgaagtcgtccaggatggtrttdatcca配列番号４０。様々な地理的位置からのスワブサンプルと用いられた２つのＰＣＲプライマーセットは、CnPnV、ＭＰＶ J3666及びstrain15の配列のアライメントに基づいて設計された。Ｇタンパク質：G715F, ggcttctgtttcttcctttctgg/（配列番号４１）G1062R,
ccgtggtggtgcctgtg（配列番号４２);ＳＨ１タンパク質:SH1F,atggatcctaacatgacctcayac（配列番号４３)/SH187R,
gattgggatgaacygtgcattg（配列番号４４）。低継代Brne単離物を増幅するのに使用されたプライマー：G84F,tgtaaaagtgaaccaaatgtgta（配列番号４５)/G404R,aaatcttcaggtaaatcaggtc（配列番号４６);G849F,ttttaacaacaagaatcagtc（配列番号４７)/G1048R,
ctcctaggtgcgggggttgg（配列番号４８)。Ｇ及びＳＨ単位複製配列のための反応条件は、ＲＴが５０℃／３０分、不活性化／変性が９５℃／１５分、及び、ＰＣＲは９５℃／６０秒、５４℃／３０秒及び７２℃／９０秒を３５サイクルであった。

［ゲノム分析］
ＰＣＲ生成物は、Applied Biosystems Automated 3730 DNA Analyzerを用いてコーネル大学Sequencing and Genotyping Core Laboratoryにて配列決定された。完全配列を決定するのに使用されたプライマーはＭＰＶ配列又は先に決定されたCnPnV配列に基づくものであった。重複するＰＣＲ生成物はギャップとプライマー結合領域をカバーするように作り出された。すべての領域は両鎖分析された。CnPnV単離物は、Lasergene（DNASTAR,マディソン, ウィスコンシン州, USA）を用いて、ＭＰＶ Strain15（GenBank AY729016）及びJ3666（GenBank NC006579）配列と比較された。

［実施例３］
［単離と同定］
鼻及び咽頭スワブ溶出液が、Ａ７２細胞に植菌するように用いられた。相対的に長期間の培養の後、通常は３継代又は４継代の後に出現する、限定的なＣＰＥが観察された。初期のＣＰＥは典型的に円形細胞の分散性の小巣を含み、いくらかは小合胞体や空胞化を伴っていた。このＣＰＥは、静置培養において数日間以上ゆっくりと進行した。継代培養はしばしばこの低レベルＣＰＥが維持されるモノレイヤーを導いたが、いくらかの培養では２４−４８時間以内に迅速な進行及びモノレイヤーの崩壊が生じた。このパターンはいくつかのヘルペスウィルス感染と同様であるが、イヌヘルペスウィルスには試験陽性ではなく、同様の方法を用いて一般に単離されている犬呼吸器ウィルスのいずれでも典型的なものではないようであった。新鮮な細胞への上清の移送に続くＣＰＥは僅かであるか又は生じず、初期継代の単離物の幾らかは培養における複製が少なかった。しかしながら継代の連続につれていくつかの培養は、より安定的な移送可能ＣＰＥを発展させ、それらはさらなる分析のために選択された。初期のテストでは、いくつかの無関連のイヌからの血清はＣＰＥの培養においてウィルス性抗原を認識するように見え（データは不図示）たが、しかし、一般的なイヌ呼吸器ウィルスに対するテストはネガティブであった。実施例１で報告されたように、ＨＲＳＶ特異的なＭａｂはウィルス性抗原を強く認識した。抗ＰＭＶポリクローナル血清でのポジティブＩＦＡ染色が確認のために使用された。抗ＰＭＶマウス血清はＩＦＡによってＢＲＳＶを弱く認識するのみであった。

実施例１で説明されたCnPnVの元の１３の単離物は、同じ組織によって管理されている２つの動物シェルターに由来するものであった。ウィルスがこれらの２施設に制限されるのかどうか調査するために、他の地理的位置からの病気のからの鼻又は咽頭スワブ試料がＰＣＲによって試験された。ＵＳＡの８つの州（コロラド、ジョージア、フロリダ、インディアナ、ミズーリ、ネバダ、サウスカロライナ、バージニア）からの１９頭のイヌが、Ｇ及びＳＨ遺伝子のプライマーセットを用いてテストされた。１９サンプルのうち、ネバダからの１例、サウスカロライナからの９頭のグループのうち５例がＧ及びＳＨの両方のＰＣＲに陽性を示し、配列決定により確認された。他の１３頭からはＰＣＲ陽性の結果は得られなかった。Ａ７２細胞でのウィルス単離が、イヌ呼吸器診断のためのニューヨーク及びペンシルヴァニアからの鼻スワブの６サンプルについてさらに行われた。これらのうち、２つのさらなる単離物はニューヨーク市の獣医学病院からのものであり、他は、ペンシルヴァニア州フィラデルフィアのシェルター由来のものであった。これらの単離物は、抗ＲＳＶ及び抗ＰＶＭ抗体でＩＦＡによって、続いてＲＴ−ＰＣＲで、CnPnVと確認された。これらのＲＴ−ＰＣＲとウィルス単離結果は正確な有病率の評価を提供するものではないが、それらは、CnPnV感染が広汎であることを示すものではなかった。

［配列分析］
以前の研究は自然的な準種の存在、培養における継代中の変異やＰＣＲ産物に起因しうるウィルス性単離物の間の差異を指摘していた。CnPnV単離物の最も正確なコンセンサス配列を決定するために、テンプレートとして全細胞性ＲＮＡを用いる複数の重複するＲＴ−ＰＣＲ反応が使われた。２頭の犬からのウィルス性単離物が配列決定されたが、一つは４継代の組織培養（Ane4）、一つは１７継代（Brne17）であり、J3666（Thorpe及びEaston、2005）及びStrain15（Kremplら、2005）の配列と比較された。ＮＳ−１に近接する３´リーダーの中から開始し、Ｌコード領域中へと小距離延在し、ゲノム中の予測された１０の遺伝子のうち９をカバーしている、８５９８ヌクレオチドの配列（配列番号１）がCnPnV-Ane4から得られた。遺伝子の順番、ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌが確認された。ＭＰＶ株と比較した、CnPnV-Ane4のこの領域の全体的なヌクレオチド配列の同一性は、J3666に対して９５．０％でありStrain15に対して９４．７％であった。ＭＰＶ株は互いに９９．７％同一であった。CnPnV-Ane4とＭＰＶ株を比較したときにコード領域中のギャップは見いだされなかった。セクション３．４及び３．５で説明したようにＧとＳＨの長さの違いを除いて、ＭＰＶとCnPnV-Ane4のコード領域の全てが同じ長さのタンパク質をコードしていることが見いだされた。

［非翻訳領域の比較分析］
CnPnVのＧＳ及びＧＥ配列の境界が、J3666及びStrain1５の配列のアライメントによって決定された（Thorpe, L.C.,
Easton, A.J., 2005. J. Gen. Virol. 86, 159-169、 Kremplら 2005. Virus Genes 30, 237-249）。ＭＰＶのＧＳ配列は、Chambersら（1991）によって説明され、より最近では (Dibben及びEaston, 2007) 、Collinら（1986）によって決定されたＲＳＶＧＳ配列に基づく長さ９ヌクレオチドのものとして説明されている。Kuoら（1997）は、１０番目のヌクレオチドもまたＲＳＶのＧＳにおいて重要であり、これは長さ１０ヌクレオチドであるＭＰＶＧＳ（Kremplら、2005）と同等であることの証拠を提供している。表１において、ＧＳは、両方の解釈を含む１０ヌクレオチドとして示されている。表１は、ＭＰＶstrain15、J3666と比較したCnPnV-Ane4のコード領域間のＧＳ、ＧＥ及びＩＧＲｓを提供する。

表１では２つのＭＰＶ株の間でＮＴＲ長の違いはない。ＲＮＡ配列の向きは５’から３’方向である。＊：J3666及びstrain15から少なくとも１ヌクレオチドの変化がある。ヌクレオチドの差異は太字・下線で示されている。ＧＥ：遺伝子末端；ＩＧＲ：遺伝子間領域；ＧＳ：遺伝子開始、無印；長さの差異がない。^aＭ−ＳＨについてはＮＴＲ全長において差異がない；一つのｕがＩＧＲから消失し、他のｕがＮＴＲの上流に追加されている。^b３ヌクレオチドＩＧＲ及びＭ２もＧＳはDibbon及びEastonによる分析に基づいている（Dibbon,O., Easton, A.J.,
2007. Mutational Analysis of the Gene Start Sequences of Pneumonia Virus of
Mice. Virus Res. 130, 303-309）。表１に示された１０又はそれ以上のヌクレオチドを有する配列は次の配列番号を有している：“ＧＥ”カラムの配列：ＮＳ１
uaguuaauuaaaa（配列番号１８）；ＮＳ２ uaguuauagaaaaa（配列番号１９）；Ｎ uauuuaauuaaaaa（配列番号２０）；Ｐ（配列番号１８）；Ｍ
uaguuaaauaaaa （配列番号２１）；ＳＨ uaguuaacaaaaaa （配列番号２２）；
Ｇ uaguuaaugaaaaa （配列番号２３）；Ｆ
uaguuaauuaaaaaa （配列番号３３）；及びＭ２ uaguuauauaaaaa （配列番号３４）。“ＩＧＲ”カラムの配列：Ｎ
cuggaaaauau （配列番号２４）；及びＧ uaagcuaugauauaau
（配列番号２５）。“ＧＳ”カラムの配列；ＮＳ１ aggacaagug （配列番号２６）；ＮＳ２ aggacaaauc （配列番号２７）；
Ｎ aggauaaaua （配列番号２８）；Ｐ（配列番号２８）；Ｍ
aggacaaaua （配列番号２９）；ＳＨ aggauaagua （配列番号３０）；
Ｇ（配列番号３０）；Ｍ２aggauaagug （配列番号３１）；Ｆ（配列番号２９）及びＬ aggaucaaua（配列番号３２）。

わずかな長さのバリエーション及びヌクレオチドの相違が、CnPnV-Ane4 ＮＴＲで同定され、大部分はＩＧＲの中で見いだされた。ＩＧＲにおける２つのＭＰＶ株の間には差異がみられなかった。Chambersら（Chambers, P., Matthews, D.A.,
Pringle, C.R., Easton, A.J., 1991. Virus Res. 18, 263-270）はｃＤＮＡクローンからのＭ２のＧＳを決定したが、５６ヌクレオチドのＩＧＲ中に２つの付加的な潜在的なＧＳ配列（ＧＳ１、ＧＳ２）の存在も指摘している。変異分析は後に、６番位置のＡの代わりであるＧによって推定されるＧＳ配列は非機能的であることを決定した。続いて彼らは、ＧＳ１及びＧＳ２の両方の配列が転写開始を指示する能力を有し、第一の配列（ＧＳ１）が最も重要であることを示した。彼らは、元々同定されたＧＳ配列はｃＤＮＡクローニングの間の自然的な削除によって誤って同定されたものだと結論づけた。CnPnVにおいて、ＦのためのＧＥ配列のすぐ後ろに続くＭ２のためのＧＳ１配列は、１０番目のヌクレオチドを除いてＳＨ及びＧ遺伝子の開始配列と同じである。ＧＳ１は一次的に使用されるものと考えられており、表１に示されている。Ｍ２のためのＧＳ２AGGACAGGGは（Dibben, O., Easton, A.J., 2007.
Virus Res. 130, 303-309）で報告されたコンセンサス配列から２箇所のみが異なるものである、しかしながら、７番目に保存されたＡを有していないので活性は低いかもしれない。これは、Ａが保存されているJ3666及びStrain15からは相違点である。CnPnV-Ane4での第三の潜在的なＭ２ＧＳ（ＧＳ３）は、J3666及びStrain15と同一であり、それゆえ６番目のＧによって貧弱な機能であることが予測されるであろう。

［非構造タンパク質の分析］
非構造の小疎水性タンパク質は９２アミノ酸を共有し、９２．４％のアミノ酸同一性のみを有する２つのＭＰＶ株の間で最も不一致のタンパク質であるように、大幅な変動性を許容するようである。CnPnV-Ane4において、ＳＨタンパク質はＭＰＶstrain15と比較した時にすべての試験したタンパク質のうちでもっとも不一致であった。CnPnV-Ane4 ＳＨは、J3666と比較して４アミノ酸の相違（９５．７％）、strain15と比較して９アミノ酸の相違（９０．２％）を有し、すなわちＭＰＶ株の相互の相同性よりもJ3666により類似している（表２）。他の特徴的な相違は、異なる単離物におけるＳＨＯＲＦの長さの相違である。CnPnV-Ane4及びstrain15の両方が２７９ヌクレオチド（９２アミノ酸）のＳＨＯＲＦを有しているが、公開されたJ3666配列は３４５ヌクレオチド（１１４アミノ酸）である。しかしながら、J3666の独立に増幅された配列は、９２、９６又は１１４アミノ酸というバリエーションをもってコードされており、これらは抗体回避変異体を表していると示唆されている。表２は、CnPnV-Ane4遺伝子及びタンパク質のニューモウィルス亜科におけるウィルスに対する同一性（％）のまとめを提供している。

表２ではＧｅｎＢａｎｋ配列に言及している：ＨＲＳＶ、NC_001781；ＢＲＳＶ、NC_001989；ＨＭＰＶ、NC_004148.2；ＡＭＰＶ、NC_007652。これらは、ヒトＲＳＶ、ウシＲＳＶ、ヒトメタニューモウィルス及び鳥メタニューモウィルスの配列全長に対応している。nt：ヌクレオチド；aa：アミノ酸；NA：適用無し、をそれぞれ表す。^aの付された数字は各遺伝子におけるヌクレオチド、アミノ酸の相違の数を示す。CnPnV-Ane4Ｐタンパク質は、J3666に対して１０アミノ酸の差異、strain15に対して１５アミノ酸の差異を有することが見いだされた。ＭＰＶ及びＲＳＶＰのアライメントは明確な類似性を有さず、アライメント中に６から７ギャップを含むアミノ酸２２−１２４のアミノ末端近傍領域に隣接する、高い相同性を有する２つの領域を示す。CnPnV-Ane4がＭＰＶ株の両方と比較されたときに、中程度の相違である２つの領域が、Ｐにおいて相同性の低いこの領域の中で同定された。７アミノ酸の相違がアミノ酸５８−７４の領域に集まっており、他の４つの変異はアミノ酸９３−１０２に見出された。確率プロットは、アミノ酸５８−７４の相違の第一領域は相対的に表面への露出しやすさ（surface probability）及び抗原指数（antigenic index）が高いことを予測する。第二の相違領域アミノ酸９３−１０２は疎水性で表面への露出しやすさが低い（データは示さず）。１３７アミノ酸のタンパク質をコードしうるものであるＰにおける第二のオーバーラップする内部開始ＯＲＦは、ＭＰＶにおいて同定された。合成ミニゲノム構築物が、第二のＯＲＦから作られるタンパク質を調査するために使用され、それは転写インヒビターとして機能することが見いだされた。CnPnV-Ane4は、同位置から始まるが終止位置は早い、第二のオーバーラップＰＯＲＦを有しており、ヌクレオチド２８５のＴがＡに変異してＴＡＧコドンになることによって、半分以下のサイズである５４アミノ酸のタンパク質を産生する（Dibben, O.ら、(2008) Virus Res. 131, 47-53）。このことは、もし生産されるならばより短いＰ−２タンパク質が同じ機能を有するかどうかという疑問を残している。

残る非構造タンパク質はＮＳ１及びＮＳ２、及びＭ１−１及びＭ１−２を含んでおり、これらはＭ２遺伝子のＡＲＦ（alternate
reading frame）から翻訳されるものである。strain15とＪ3666におけるこれらのタンパク質の間には差異がない。しかしながら、CnPnVは、これらのタンパク質それぞれのＭＰＶ単離物と差異を有している。CnPnV-Ane4 ＮＳ−１は２つのＭＰＶ株と比較して７アミノ酸の差異を有しており、４つはＣ末端近傍に位置している。ＮＳ２では、配列全体にわたって比較的均等に分散している９アミノ酸の差異がある。CnPnV-Ane4は６アミノ酸の差異でＭ２−１と９６．６％同一であり、４アミノ酸の差異でＭ２−２と９５．９％同一である。

［構造タンパク質の分析］
ニューモウィルスのＧ付着タンパク質は典型的に最大の相違があり、抗体応答の無効化のための第一目標となるため特に興味深い。Ｇタンパク質は２つのＭＰＶ単離物の間で３９６アミノ酸のうち相違は３つのみであり（９９．２％）、比較的高い保存性を有している。CnPnVにおけるＧタンパク質は、J3666との比較ではもっとも保存されておらず、strain15ではＳＨに続いて２番目に保存されていないタンパク質である。J3666、strain15とそれぞれ３２アミノ酸、３３アミノ酸の差異がある。アミノ酸の相違は、１１３−１２４領域に数個の差異が集まっていること、及び、３３１と３６７アミノ酸（Ane4ＯＲＦに基づく数字）の間に１１アミノ酸の差異があることを除いて、一般的にランダムに分散している。一つの注目すべき観察は、CnPnV-Ane4のＧＯＲＦは、比較対象のJ3666及びstrain15に比べて、５４ヌクレオチド長いことである。ＧＳから＋２９の位置でのＡＣＧからＡＵＧへの変異は、J3666にはあるがstrain15にはない代替的な開始コドンを作り出している。＋６５位置の、第二のＵＡＧからＡＡＧへの変異はインフレーム終止コドンを抹消するものである。ＧＯＲＦは５３アミノ酸の細胞質末端があり、公知のJ3666とstrain15の配列よりも１８アミノ酸長いタンパク質をコードしている。J3666の配列はこの位置に終止コドンを有しているがstrain15にはない。すなわち、J3666とstrain15の両方において、単一点変異がより長いＧ変異体を産生しうる。これはJ3666に感染したマウス肺から増幅されたクローンでないＲＴ−ＰＣＲ産物の配列も＋６５位置でＵからＡへの変異を有していたように、前例の無いことではない。すなわちより長いＧの変異体はCnPnVに特異的な特徴ではないように見える。本開示の利益を受けて、いずれの変異体が自然感染において優位であるかを決定するためのイヌ及びマウスのＲＴ−ＰＣＲ産物からの、さらなる配列データが当分野の通常の技術で決定されうる。Ｇ細胞質尾の長さにはいくらかの自然的な柔軟性があるようであり、また、尾自体が病原性の決定要因である。Ｇ細胞質尾を欠く組み換えＭＰＶ変異体はＢａｌｂＣマウスで弱毒化されたが、複製レベルは野生型ウィルスと区別できなかった（Krempl, C.D.ら、2007.. J. Virol. 81, 9490-9501）。ＲＳＶにおいて細胞質尾の最初の６アミノ酸はＭタンパク質との相互作用に本質的である。ＧのＮ末端近傍アミノ酸がＭＰＶにおけるＭへの結合のために本質的であるかどうかは知られていない。しかしそうであれば、細胞質尾の２つの変異体は、Ｍとの相互作用能力に差がありえる。

CnPnV-Ane4のＦタンパク質は、Ｇで見いだされたのと類似のハイレベルな多様性を有しておらず、実際それはＭＰＶとの比較において、より保存されたタンパク質の一つである。J3666と１４アミノ酸、strain15と１６アミノ酸の差異があり、９７％もしくはそれ以上が保存されている。アミノ酸の差異の約半分が、ＣＯＯＨ末端の最後５５アミノ酸の中、膜貫通ドメインの中もしくは近傍にあり、ほとんどの置換アミノ酸は類似の機能グループのタイプである。全体として、他のニューモウィルスとの関係においてＮが最も高度に保存されたタンパク質である。CnPnV-Ane4のアミノ酸２４５−３３３のタンパク質の中央領域は、ＨＲＳＶ及びＢＲＳＶと９２から９３％の同一性に達している。CnPnV-Ane4 Ｎは、J3666と９アミノ酸の差異、strain15と８アミノ酸の差異を有しておりそれらは比較的均等に分散している。ニューモウィルスで同定された不変位置、又はＲＮＡゲノムと相互作用する残基に対応するアミノ酸の差異はない。これらの差異のいずれもタンパク質の構造又は機能に大きな影響を有するものとは思われない。Ｍタンパク質はＭＰＶ単離物と９８．１％という、最も高いレベルの保存性を有している。５アミノ酸の差異は配列中に均等に分散されており、どのケースでも機能グループは保存されている。アミノ酸１８におけるＶからＩへのただ１つの変異のみが、ニューモウィルス及びメタニューモウィルスのＭタンパク質において通常は不変とみられる残基に関する。

［低継代及び高継代培養における分析］
我々は、培養によく適合され、また、一貫して複製されナイーブ培養に感染させるために用いられるときにはＣＰＥが産生される一つの単離物を同定した。この単離物は１７継代（Brne17）であったが、配列決定され、続いて、より低い継代数のAne4単離物と比較された。配列決定された８４２３ヌクレオチドのうち、Brne17では７ヌクレオチドの変異が同定された（表３、CnPnV-Ane4及び２種の継代数及びex vivoのBrneの間のヌクレオチド及びアミノ酸の差異を提供している）。表３について、^a：各遺伝子の開始位置からのヌクレオチド位置、^b：各ＯＲＦでの位置に基づくアミノ酸番号、ＮＤ：未決定、ｎｔ：ヌクレオチド、ａａ：アミノ酸。

Ｎでの単一のヌクレオチドの差異、Ｆでの２つの差異は同義の置換体である。Brne17のＳＨＧＥ配列におけるＡ残基の付加もまた非コードである。２つのヌクレオチドの差異は、Ｍにおいてアミノ酸１７８をＱからＲに変異させ、また、Ｇにおいてアミノ酸３４２をＬからＰに変異させる非同義の置換である。Brne17で見いだされた最も顕著な差異は、ＧＯＲＦでの３６４ヌクレオチドのＵからＡへの置換であり、これはアミノ酸位置１２２においてＫ残基を終止コドンに置換するものである。この位置は、ＭＰＶ株において、ヌクレオチド３１０（アミノ酸１０４）に相当する。この位置での終止は、Brne17に５３アミノ酸の細胞質尾、２４アミノ酸の膜貫通ドメイン及び４４アミノ酸のみの細胞外ドメインのある切り取られたＧを与えるであろう。Brne17における短縮されたＧの発見は、３継代のストック及びオリジナルのスワブ溶出物（Brne3及びBrneSW）からの増幅産物のさらなる配列決定を促した。興味深いことにこのことは短縮された変異体が早くも３継代目において既に形成されていることを示した。しかしながら、BrneSWではヌクレオチド３６４にはＡが存在し、これはイヌにおける優位なウィルス種は、短縮されたＧを有していないことを意味した。ＲＮＡ抽出物及び増幅物の第二の独立したセットは、１継代及び２継代からのサンプルを含み、１継代のもののみにヌクレオチド３６４がＡであるマイナーな亜集団を示唆する電気泳動図の潜在的なピークが見られた。つまり培養において短縮された形態は迅速に選択されることを表している。同様の変異が継代されたstrain15（Warwick）の培養において同定されたが、そこではフレームシフトを生じる１つのヌクレオチド挿入がペプチドの中途終止を引き起こした。代替的な下流サイトでの翻訳の開始は３３アミノ酸短く、細胞質尾を欠くＧタンパク質を産生しうるものである。切り取られたＧは少なくとも、strain15の低減された病原性についての部分的な説明を示唆した（Warwick）。

ＲＳＶにおいて、低温継代されたｃｐ−５２変異体はＧ及びＳＨの産生を抹消する大きな欠失を有するが、培養において複製回避はされないことが見いだされた。この状況はＢＨＫ−２１細胞培養では完全な組み換えウィルスと同じくＧ遺伝子全体を欠く組み換え体ＭＰＶが複製されたが、マウスにおいては検出可能なレベルに複製されなかったことと相同である。このことは、Ｇは常にin vivoでは本質的であることを示唆しており、すなわちBrneSwでは短縮されていない変異体のみの検出が予測され得る。なぜ２継代の終わりまでに短縮された変異体が完全に選択されるのかは明らかではない。もしも選択が単に複製効率の向上のみによるならば、Ｇの不存在は複製のレートや力価を向上させると予測される。しかし、これが真実だと支持する証拠は無い（Kremplら、2007、supra）。Ｇ欠損変異体の選択に影響を与える要素は、Ａ７２細胞に特異的でありえる。

図３は配列番号１のゲノム組織の図示を提供する。当業者は図３の図は３´から５´方向に示されていることを認識するであろう。なぜならこれは、配列番号１は従来の方向としてマイナス鎖を左から右に読んで５´から３´に表している一方で、マイナス鎖ウィルスであるからである。つまり図３において、ＬＯＲＦは、プラス鎖の３´末端にある。表４は配列番号１に示された配列の注釈を示している。略号は次の通りである。ＧＳ：遺伝子開始シグナル配列、ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム、ＧＥ：遺伝子終止シグナル配列、ＩＧＲ：非翻訳インテグリン領域。リストされていないヌクレオチドは翻訳されないと考えられている。

［実施例４］
我々はまた、ここで同定されるイヌのウィルスと関係がありえるウィルスの存在のためネコから得たサンプルを分析した。配列は２つの単離物から得られ、それらは２９ケンタッキー（２９ＫＹ）及び７７ケンタッキー（７７ＫＹ）と称呼される。２９ＫＹ及び７７ＫＹからの部分的なＧ遺伝子配列は上記で説明されたイヌニューモウィルス（CnPnV）Ane4単離物の７２６−１０７８ヌクレオチドに対応する、３５３ヌクレオチドを提供する。２９ＫＹは、CnPnV-Ane4の２−２０８ヌクレオチドに対応する２０７ヌクレオチドを有する。

両方の単離物の部分的なＧヌクレオチド配列はマウスニューモウィルス（ＭＰＶ）単離物J3666と９４．７％が同一であり、Ane4と９８．０％が同一であった。１１７アミノ酸（ａａ）配列はJ3666と９０．６％が同一、Ane4と９７．４％が同一であった。つまり、ネコ２９ＫＹ／７７ＫＹＧ配列はJ3666よりもAne4により関連している。

２９ＫＹの部分ＳＨヌクレオチド配列はJ3666と９４．７％が同一であり、Ane4と９７．１％が同一である。６９アミノ酸配列はJ3666と９８．５％が同一であり、Ane4と９７．１％が同一である。つまり、ネコ２９ＫＹ配列はAne4よりもJ3666にわずかにより関連している。しかしながら、これらの配列は新規に発見されたネコニューモウィルスを表すと考えられている。つまり、上記で説明されたイヌニューモウィルスについて開示された発明の組成物及び方法及びすべての実施態様の開示は、ネコウィルスにも同様に適用され、それらの開示はすなわちネコウィルスについても反復される。

当業者には前記から、我々は、CnPnV感染はそれが元々単離されたシェルターの犬に留まらないことを示したことを理解するであろう。それは、急性の呼吸器疾患の犬からのサンプルにおいて容易に同定される。疾患における病原性の役割は明確に証明されていないが、本発明はウィルスの存在を同定し、防御する組成物と方法を提供するものであって、それらは哺乳類においてウィルスの存在と正の相関関係のあるイヌやネコ両方の疾患を含みまたこれらに限定されない呼吸器疾患をコントロールするのに重要であろうと予測されるものである。

Claims

配列番号１、２又は３の配列と少なくとも９６％が同一である単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
配列番号１、２又は３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含む単離されたウィルス。
前記単離されたウィルスが弱毒化されている、請求項５に記載の単離されたウィルス。
前記単離されたウィルスが、配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離されたウィルス。
前記単離されたウィルスが、配列番号２の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項６に記載の単離されたウィルス。
前記単離されたウィルスが、配列番号３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の単離されたウィルス。
配列番号１、２又は３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含むウィルスを含む、単離された細胞又はインビトロの細胞培養。
請求項５の単離されたウィルス、又は、前記単離されたウィルスの一部である単離されたタンパク質を含む組成物を哺乳類に投与することを含む方法であって、投与後に、動物において免疫応答が刺激されることを特徴とする、哺乳類において免疫応答を刺激する方法。
前記請求項５の単離されたウィルスが、配列番号１の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含み、前記組成物がイヌに投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
前記請求項５の単離されたウィルスが、配列番号２又は配列番号３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドを含み、前記組成物がネコに投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
哺乳類から生物学的サンプルを得ること、配列番号１、２又は３の配列と少なくとも９６％が同一であるポリヌクレオチドの存在を決定すること、又は、配列番号１、２又は３の逆相相補配列によってコードされるタンパク質の存在を検出することによる方法であって、前記ポリヌクレオチド又は前記タンパク質の存在は、哺乳類がニューモウィルスに感染していることを示すことを特徴とする、哺乳類がニューモウィルスに感染しているか否かを決定する方法。
前記哺乳類がイヌ又はネコである、請求項１４に記載の方法。