JP2013514813A - 新規ニューモウィルス組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
evidence of widespread human infection. J Gen Virol. 1986 Jun; 67 (Pt 6):
975-82を参照)。つまり、ここに提供される組成物及び方法が、人間において免疫応答を刺激するために、また、人間においてウィルス感染の診断に用いられるために、有用性を有すると考えることは合理的である。
Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins に見出される。特定かつ制限的ではないキャリアの例は安定化剤、防腐剤及びバッファを含む。特定かつ制限的ではない安定化剤の例は、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン、グルタミン酸、又はグルコースなど)、タンパク質(例えば、乾燥乳清、アルブミン又はカゼインなど)又はそれらの分解生成物を含む。好適な、特定かつ制限的ではないバッファの例はアルカリ金属リン酸塩を含む。好適な、特定かつ制限的ではない希釈剤の例は水、水系バッファ(例えば緩衝生理食塩水)、アルコール及びポリオール(例えばグリセロール)を含む。
続く実施例は本発明の特定の実施形態を描写することを意図しているが、いかなる意味でも本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
我々は、雑種犬の鼻及び咽頭スワブからサンプルを採取し、呼吸器ウィルスを単離するために、イヌA72細胞(アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)、CRL−1542)にそれらを植菌するために用いた。植菌後約21日に対応する、培養の経過の後期段階において、いくつかの培養が僅かに細胞変性の変化を示した。連続する経過の後、培養は培養全体の急速な細胞死に続いて、円形細胞の小巣を現した。このパターンは一般的なARDCに伴うウィルスには非特徴的であると主観的に判断された。13の別個のウィルス単離物が得られ、この実施例において説明される。一般的なイヌ呼吸器病原体に特異的な診断反応試薬のパネルを用いたテストは、公知のウィルスを同定することができなかった。他のウィルスのための追加的な反応試薬でのさらなるテストは、最終的に、ヒト呼吸器合胞体ウィルス(抗HRSV、番号VP−R151、Vector Laboratories、USA、カリフォルニア州バーリンガム)に対するモノクローナル抗体(Mab)プールを用いた免疫蛍光アッセイ(IFA)によって陽性認識を示した。この抗体の調製は、ウシRSV(BRSV)の検出のために我々のラボで一般的に使用されているものである。染色パターンは、RSV感染細胞において観察される典型的なパターンである線維状の膜結合及び遊離のウィルス粒子及び細胞質内封入体を含んでいた。
この実施例の材料及び方法は、残りの実施例で説明される結果を得るために使用された。
鼻及び咽頭検査サンプルは、湿潤スワブを用いて呼吸器疾患の症状のある雑種犬から集められ、コーネル大学動物健康診断センターにおいて受領から24時間以内に処置された。植菌の前に、スワブはアール塩(Earle’s salt)(Gibco 10370, Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA)、0.5%ウシ血清アルブミン、ペニシリン(200 U/ml)、ストレプトマイシン(200 μg/ml)、及びファンギゾン(2.5 μg/ml)を含む最少基礎培地(MEM培地)3mLに30分間浸漬し、続いて10秒間機械的に撹拌した。それぞれ0.5mLの鼻及び咽頭抽出物の分割単位は集められ、セミコンフルエントのA72細胞(Binnら、1980)(CRL-1542,
American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)のシングルT25フラスコに、培地を追加することなく植菌するのに用いられた。抽出物は、1−3時間モノレイヤーの上に残置され、その後リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でリンスオフされた。細胞は6mLの培養培地(ライボビッツのL−15培地、10% 熱非活性化ウシ胎児血清(FBS)、200 U/ml ペニシリン、200 μg/ml ストレプトマイシン、50 μg/mlゲンタマイシン)にて37℃で維持され、6−8日毎に継代培養された。植菌されていないコントロールのA−72培養が単離プロセスを通じて並行して行われた。
細胞はガラススライドに接着させられ、その後PBSでリンスされ、冷アセトン10mLで固定化された。スライドは空気乾燥され、染色の前に−20℃で貯蔵された。PBSで希釈された一次抗体及び二次抗体がスライドに滴下され、37℃で30分間インキュベートされた。各インキュベーションの後、スライドはPBS中で15分間リンスされた。染色は蛍光顕微鏡で可視化された。HRSVに対するMabのプールが希釈率1:400にて当初の同定において使用された(VP−R151、ベクターラボラトリー、バーリンガム、カリフォルニア州、USA)。1倍濃度で供給されたマウス抗−PVM(CL-603IFA, Charles River Laboratories, ウィルミントン、マサチューセッツ州、USA)が、希釈率1:20にて使用された。二次抗体FITC標識ヤギ抗マウスIgG(02−18−06、KPL、ガイザースバーグ、メリーランド州、USA)は、希釈率1:40(12.5 μg/mL)で使用された。
全細胞性RNAがA72細胞から精製された(74106、Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州、USA)。約50−75%の細胞変性効果(CPE)を示す一つの25cm2フラスコからの細胞が、ペレットにされ、各カラムを通して精製された。細胞フリーの上清及びスワブ溶出物を含む培地はサンプル140μLを用いて精製された(52906、Qiagen)。精製されたRNAsはRNaseフリーの水40μLで再懸濁された。
ゲノム断片を得るために当初使用された縮重プライマー配列は、ニューモウィルス科ウィルスのアライメントに基づき、CODEHOPアルゴリズム(blocks.fhcrc.org/codehop.html)(Roseら、1998)を用いて設計された。逆転写PCR(RT−PCR)は製造者の指示に従い25μLボリュームで1段階反応(210212、Qiagen)で行われた。1:5〜1:10で希釈された全RNAの1μL及び各プライマー10pmolが各反応で使用された。RTステップの反応条件は、50℃/30分、続いて95℃/15分であった。サイクル条件は、95℃/60秒、54−56℃/30秒及び72℃/60−90秒を35サイクル行った。プライマーは次の通りである:N遺伝子:N276F,tccgtgcaggccgaratggarcarg/P1R,(配列番号35)ggaactcgggggcgaayttytccat;配列番号36);L遺伝子 no 1:L428F, ccggatcttcggccayccnatggt/(配列番号37)L538R, ttcttaggaggggagatggcyttrtcrtt;(配列番号38)L遺伝子 no. 2:L698F,
catcaccgacctgtccaagttyaaycargc/(配列番号39)L894R,
ttgaagtcgtccaggatggtrttdatcca配列番号40。様々な地理的位置からのスワブサンプルと用いられた2つのPCRプライマーセットは、CnPnV、MPV J3666及びstrain15の配列のアライメントに基づいて設計された。Gタンパク質:G715F, ggcttctgtttcttcctttctgg/(配列番号41)G1062R,
ccgtggtggtgcctgtg(配列番号42);SH1タンパク質:SH1F,atggatcctaacatgacctcayac(配列番号43)/SH187R,
gattgggatgaacygtgcattg(配列番号44)。低継代Brne単離物を増幅するのに使用されたプライマー:G84F,tgtaaaagtgaaccaaatgtgta(配列番号45)/G404R,aaatcttcaggtaaatcaggtc(配列番号46);G849F,ttttaacaacaagaatcagtc(配列番号47)/G1048R,
ctcctaggtgcgggggttgg(配列番号48)。G及びSH単位複製配列のための反応条件は、RTが50℃/30分、不活性化/変性が95℃/15分、及び、PCRは95℃/60秒、54℃/30秒及び72℃/90秒を35サイクルであった。
PCR生成物は、Applied Biosystems Automated 3730 DNA Analyzerを用いてコーネル大学Sequencing and Genotyping Core Laboratoryにて配列決定された。完全配列を決定するのに使用されたプライマーはMPV配列又は先に決定されたCnPnV配列に基づくものであった。重複するPCR生成物はギャップとプライマー結合領域をカバーするように作り出された。すべての領域は両鎖分析された。CnPnV単離物は、Lasergene(DNASTAR,マディソン, ウィスコンシン州, USA)を用いて、MPV Strain15(GenBank AY729016)及びJ3666(GenBank NC006579)配列と比較された。
[単離と同定]
鼻及び咽頭スワブ溶出液が、A72細胞に植菌するように用いられた。相対的に長期間の培養の後、通常は3継代又は4継代の後に出現する、限定的なCPEが観察された。初期のCPEは典型的に円形細胞の分散性の小巣を含み、いくらかは小合胞体や空胞化を伴っていた。このCPEは、静置培養において数日間以上ゆっくりと進行した。継代培養はしばしばこの低レベルCPEが維持されるモノレイヤーを導いたが、いくらかの培養では24−48時間以内に迅速な進行及びモノレイヤーの崩壊が生じた。このパターンはいくつかのヘルペスウィルス感染と同様であるが、イヌヘルペスウィルスには試験陽性ではなく、同様の方法を用いて一般に単離されている犬呼吸器ウィルスのいずれでも典型的なものではないようであった。新鮮な細胞への上清の移送に続くCPEは僅かであるか又は生じず、初期継代の単離物の幾らかは培養における複製が少なかった。しかしながら継代の連続につれていくつかの培養は、より安定的な移送可能CPEを発展させ、それらはさらなる分析のために選択された。初期のテストでは、いくつかの無関連のイヌからの血清はCPEの培養においてウィルス性抗原を認識するように見え(データは不図示)たが、しかし、一般的なイヌ呼吸器ウィルスに対するテストはネガティブであった。実施例1で報告されたように、HRSV特異的なMabはウィルス性抗原を強く認識した。抗PMVポリクローナル血清でのポジティブIFA染色が確認のために使用された。抗PMVマウス血清はIFAによってBRSVを弱く認識するのみであった。
以前の研究は自然的な準種の存在、培養における継代中の変異やPCR産物に起因しうるウィルス性単離物の間の差異を指摘していた。CnPnV単離物の最も正確なコンセンサス配列を決定するために、テンプレートとして全細胞性RNAを用いる複数の重複するRT−PCR反応が使われた。2頭の犬からのウィルス性単離物が配列決定されたが、一つは4継代の組織培養(Ane4)、一つは17継代(Brne17)であり、J3666(Thorpe及びEaston、2005)及びStrain15(Kremplら、2005)の配列と比較された。NS−1に近接する3´リーダーの中から開始し、Lコード領域中へと小距離延在し、ゲノム中の予測された10の遺伝子のうち9をカバーしている、8598ヌクレオチドの配列(配列番号1)がCnPnV-Ane4から得られた。遺伝子の順番、NS1−NS2−N−P−M−SH−G−F−M2−Lが確認された。MPV株と比較した、CnPnV-Ane4のこの領域の全体的なヌクレオチド配列の同一性は、J3666に対して95.0%でありStrain15に対して94.7%であった。MPV株は互いに99.7%同一であった。CnPnV-Ane4とMPV株を比較したときにコード領域中のギャップは見いだされなかった。セクション3.4及び3.5で説明したようにGとSHの長さの違いを除いて、MPVとCnPnV-Ane4のコード領域の全てが同じ長さのタンパク質をコードしていることが見いだされた。
CnPnVのGS及びGE配列の境界が、J3666及びStrain15の配列のアライメントによって決定された(Thorpe, L.C.,
Easton, A.J., 2005. J. Gen. Virol. 86, 159-169、 Kremplら 2005. Virus Genes 30, 237-249)。MPVのGS配列は、Chambersら(1991)によって説明され、より最近では (Dibben及びEaston, 2007) 、Collinら(1986)によって決定されたRSV GS配列に基づく長さ9ヌクレオチドのものとして説明されている。Kuoら(1997)は、10番目のヌクレオチドもまたRSVのGSにおいて重要であり、これは長さ10ヌクレオチドであるMPV GS(Kremplら、2005)と同等であることの証拠を提供している。表1において、GSは、両方の解釈を含む10ヌクレオチドとして示されている。表1は、MPVstrain15、J3666と比較したCnPnV-Ane4のコード領域間のGS、GE及びIGRsを提供する。
2007. Mutational Analysis of the Gene Start Sequences of Pneumonia Virus of
Mice. Virus Res. 130, 303-309)。表1に示された10又はそれ以上のヌクレオチドを有する配列は次の配列番号を有している:“GE”カラムの配列:NS1
uaguuaauuaaaa(配列番号18);NS2 uaguuauagaaaaa(配列番号19);N uauuuaauuaaaaa(配列番号20);P(配列番号18);M
uaguuaaauaaaa (配列番号21);SH uaguuaacaaaaaa (配列番号22);
G uaguuaaugaaaaa (配列番号23); F
uaguuaauuaaaaaa (配列番号33);及びM2 uaguuauauaaaaa (配列番号34)。“IGR”カラムの配列:N
cuggaaaauau (配列番号24); 及び G uaagcuaugauauaau
(配列番号25)。“GS”カラムの配列;NS1 aggacaagug (配列番号26); NS2 aggacaaauc (配列番号27);
N aggauaaaua (配列番号28);P (配列番号28);M
aggacaaaua (配列番号29);SH aggauaagua (配列番号30);
G (配列番号30); M2aggauaagug (配列番号31);F (配列番号29)及びL aggaucaaua(配列番号32)。
Pringle, C.R., Easton, A.J., 1991. Virus Res. 18, 263-270)はcDNAクローンからのM2のGSを決定したが、56ヌクレオチドのIGR中に2つの付加的な潜在的なGS配列(GS1、GS2)の存在も指摘している。変異分析は後に、6番位置のAの代わりであるGによって推定されるGS配列は非機能的であることを決定した。続いて彼らは、GS1及びGS2の両方の配列が転写開始を指示する能力を有し、第一の配列(GS1)が最も重要であることを示した。彼らは、元々同定されたGS配列はcDNAクローニングの間の自然的な削除によって誤って同定されたものだと結論づけた。CnPnVにおいて、FのためのGE配列のすぐ後ろに続くM2のためのGS1配列は、10番目のヌクレオチドを除いてSH及びG遺伝子の開始配列と同じである。GS1は一次的に使用されるものと考えられており、表1に示されている。M2のためのGS2AGGACAGGGは(Dibben, O., Easton, A.J., 2007.
Virus Res. 130, 303-309)で報告されたコンセンサス配列から2箇所のみが異なるものである、しかしながら、7番目に保存されたAを有していないので活性は低いかもしれない。これは、Aが保存されているJ3666及びStrain15からは相違点である。CnPnV-Ane4での第三の潜在的なM2 GS(GS3)は、J3666及びStrain15と同一であり、それゆえ6番目のGによって貧弱な機能であることが予測されるであろう。
非構造の小疎水性タンパク質は92アミノ酸を共有し、92.4%のアミノ酸同一性のみを有する2つのMPV株の間で最も不一致のタンパク質であるように、大幅な変動性を許容するようである。CnPnV-Ane4において、SHタンパク質はMPVstrain15と比較した時にすべての試験したタンパク質のうちでもっとも不一致であった。CnPnV-Ane4 SHは、J3666と比較して4アミノ酸の相違(95.7%)、strain15と比較して9アミノ酸の相違(90.2%)を有し、すなわちMPV株の相互の相同性よりもJ3666により類似している(表2)。他の特徴的な相違は、異なる単離物におけるSH ORFの長さの相違である。CnPnV-Ane4及びstrain15の両方が279ヌクレオチド(92アミノ酸)のSH ORFを有しているが、公開されたJ3666配列は345ヌクレオチド(114アミノ酸)である。しかしながら、J3666の独立に増幅された配列は、92、96又は114アミノ酸というバリエーションをもってコードされており、これらは抗体回避変異体を表していると示唆されている。表2は、CnPnV-Ane4遺伝子及びタンパク質のニューモウィルス亜科におけるウィルスに対する同一性(%)のまとめを提供している。
reading frame)から翻訳されるものである。strain15とJ3666におけるこれらのタンパク質の間には差異がない。しかしながら、CnPnVは、これらのタンパク質それぞれのMPV単離物と差異を有している。CnPnV-Ane4 NS−1は2つのMPV株と比較して7アミノ酸の差異を有しており、4つはC末端近傍に位置している。NS2では、配列全体にわたって比較的均等に分散している9アミノ酸の差異がある。CnPnV-Ane4は6アミノ酸の差異でM2−1と96.6%同一であり、4アミノ酸の差異でM2−2と95.9%同一である。
ニューモウィルスのG付着タンパク質は典型的に最大の相違があり、抗体応答の無効化のための第一目標となるため特に興味深い。Gタンパク質は2つのMPV単離物の間で396アミノ酸のうち相違は3つのみであり(99.2%)、比較的高い保存性を有している。CnPnVにおけるGタンパク質は、J3666との比較ではもっとも保存されておらず、strain15ではSHに続いて2番目に保存されていないタンパク質である。J3666、strain15とそれぞれ32アミノ酸、33アミノ酸の差異がある。アミノ酸の相違は、113−124領域に数個の差異が集まっていること、及び、331と367アミノ酸(Ane4ORFに基づく数字)の間に11アミノ酸の差異があることを除いて、一般的にランダムに分散している。一つの注目すべき観察は、CnPnV-Ane4のG ORFは、比較対象のJ3666及びstrain15に比べて、54ヌクレオチド長いことである。GSから+29の位置でのACGからAUGへの変異は、J3666にはあるがstrain15にはない代替的な開始コドンを作り出している。+65位置の、第二のUAGからAAGへの変異はインフレーム終止コドンを抹消するものである。G ORFは53アミノ酸の細胞質末端があり、公知のJ3666とstrain15の配列よりも18アミノ酸長いタンパク質をコードしている。J3666の配列はこの位置に終止コドンを有しているがstrain15にはない。すなわち、J3666とstrain15の両方において、単一点変異がより長いG変異体を産生しうる。これはJ3666に感染したマウス肺から増幅されたクローンでないRT−PCR産物の配列も+65位置でUからAへの変異を有していたように、前例の無いことではない。すなわちより長いGの変異体はCnPnVに特異的な特徴ではないように見える。本開示の利益を受けて、いずれの変異体が自然感染において優位であるかを決定するためのイヌ及びマウスのRT−PCR産物からの、さらなる配列データが当分野の通常の技術で決定されうる。G細胞質尾の長さにはいくらかの自然的な柔軟性があるようであり、また、尾自体が病原性の決定要因である。G細胞質尾を欠く組み換えMPV変異体はBalbCマウスで弱毒化されたが、複製レベルは野生型ウィルスと区別できなかった(Krempl, C.D.ら、2007.. J. Virol. 81, 9490-9501)。RSVにおいて細胞質尾の最初の6アミノ酸はMタンパク質との相互作用に本質的である。GのN末端近傍アミノ酸がMPVにおけるMへの結合のために本質的であるかどうかは知られていない。しかしそうであれば、細胞質尾の2つの変異体は、Mとの相互作用能力に差がありえる。
我々は、培養によく適合され、また、一貫して複製されナイーブ培養に感染させるために用いられるときにはCPEが産生される一つの単離物を同定した。この単離物は17継代(Brne17)であったが、配列決定され、続いて、より低い継代数のAne4単離物と比較された。配列決定された8423ヌクレオチドのうち、Brne17では7ヌクレオチドの変異が同定された(表3、CnPnV-Ane4及び2種の継代数及びex vivoのBrneの間のヌクレオチド及びアミノ酸の差異を提供している)。表3について、a:各遺伝子の開始位置からのヌクレオチド位置、b:各ORFでの位置に基づくアミノ酸番号、ND:未決定、nt:ヌクレオチド、aa:アミノ酸。
我々はまた、ここで同定されるイヌのウィルスと関係がありえるウィルスの存在のためネコから得たサンプルを分析した。配列は2つの単離物から得られ、それらは29ケンタッキー(29KY)及び77ケンタッキー(77KY)と称呼される。29KY及び77KYからの部分的なG遺伝子配列は上記で説明されたイヌニューモウィルス(CnPnV)Ane4単離物の726−1078ヌクレオチドに対応する、353ヌクレオチドを提供する。29KYは、CnPnV-Ane4の2−208ヌクレオチドに対応する207ヌクレオチドを有する。
Claims (15)
- 配列番号1、2又は3の配列と少なくとも96%が同一である単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号1、2又は3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含む単離されたウィルス。
- 前記単離されたウィルスが弱毒化されている、請求項5に記載の単離されたウィルス。
- 前記単離されたウィルスが、配列番号1の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項5に記載の単離されたウィルス。
- 前記単離されたウィルスが、配列番号2の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項6に記載の単離されたウィルス。
- 前記単離されたウィルスが、配列番号3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含む、請求項7に記載の単離されたウィルス。
- 配列番号1、2又は3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含むウィルスを含む、単離された細胞又はインビトロの細胞培養。
- 請求項5の単離されたウィルス、又は、前記単離されたウィルスの一部である単離されたタンパク質を含む組成物を哺乳類に投与することを含む方法であって、投与後に、動物において免疫応答が刺激されることを特徴とする、哺乳類において免疫応答を刺激する方法。
- 前記請求項5の単離されたウィルスが、配列番号1の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含み、前記組成物がイヌに投与されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記請求項5の単離されたウィルスが、配列番号2又は配列番号3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドを含み、前記組成物がネコに投与されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 哺乳類から生物学的サンプルを得ること、配列番号1、2又は3の配列と少なくとも96%が同一であるポリヌクレオチドの存在を決定すること、又は、配列番号1、2又は3の逆相相補配列によってコードされるタンパク質の存在を検出することによる方法であって、前記ポリヌクレオチド又は前記タンパク質の存在は、哺乳類がニューモウィルスに感染していることを示すことを特徴とする、哺乳類がニューモウィルスに感染しているか否かを決定する方法。
- 前記哺乳類がイヌ又はネコである、請求項14に記載の方法。
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