JP2013508319A - グリカン結合タンパク質およびグリカンの医学的有用性 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、真菌、細菌および/または植物グリカン結合タンパク質(いわゆるレクチン)、および任意選択の蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞を準備すること;
(b)(a)の少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドおよび任意選択の蠕虫食餌細胞と、対象とする蠕虫細胞または蠕虫、好ましくは、線虫細胞または線虫とを、(i)グリカン結合ポリペプチドが蠕虫細胞に結合することを可能とし、かつ/または(ii)蠕虫細胞または蠕虫に任意選択の食餌細胞を摂食させることを可能とする条件下で接触させること;および
(c)死滅した蠕虫細胞または蠕虫を同定すること
を含む方法を対象とする。
(d)任意選択により、(a)の少なくとも1つの毒性グリカン結合ポリペプチドを同定するため、および/または
(e)任意選択により、少なくとも1つの毒性グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも1つのグリカンを同定するため
に使用することができる。
(a)グリカン特異性を有するグリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する特異的グリカンを産生する、ランダム突然変異および/または標的突然変異を有する蠕虫細胞または蠕虫、および任意選択の野生型蠕虫細胞または蠕虫を準備すること;
(b)(a)の蠕虫細胞または蠕虫と、該グリカン特異性を有する少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドとを、任意選択により、蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞の存在下で接触させること;および
(c)(b)におけるグリカン結合ポリペプチドの接触から生き残る(a)の蠕虫細胞または蠕虫における突然変異遺伝子を同定すること
を含む方法に関する。
(d.i)ステップ(c)の突然変異遺伝子と、特徴的な遺伝子、好ましくは、グリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、より好ましくは、蠕虫のグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とを比較するステップ;
(d.ii)(c)で同定された突然変異体のN−グライコーム、O−グライコームまたはリポグライコームと、野生型蠕虫のグライコームとを、好ましくは、個々の複合糖質の生化学的単離とクロマトグラフィーおよび質量分析によるそれらの分析によって比較するステップ;
(d.iii)ステップ(c)の遺伝子を異種系、例えば、昆虫細胞、好ましくは、SF9細胞において発現させ、その遺伝子産物の生化学的活性をin vitroにおいてアッセイするステップ
の1以上を包含するステップ(d)をさらに含む。
(a)グリカンにより媒介される毒性に関与することが知られているグリカンを準備すること;
(b)(a)のグリカンと対象物質とを接触させること;
(c)(a)のグリカンと結合する対象物質を潜在的抗蠕虫物質、好ましくは、潜在的抗線虫物質として同定すること
を含む方法を対象とする。
(i)C.エレガンスN−グリカンコアのAsn結合GlcNAc上のGal−β−1,6−Fuc−α−1,6と結合するウシグソヒトヨタケ由来のCGL2(図1〜7参照)、
(ii)C.エレガンスN−グリカンコアのAsn結合GlcNAc上のFuc−α−1,3と結合するウシグソヒトヨタケ由来のRedA(CCL2)(図8および11)、
(iii)線虫グリコスフィンゴ脂質上のGal−α−1,3−GalNAc−β−x,yと結合するシバフタケ由来のMOA(図9参照)、
(iv)おそらく線虫O−グリカン上のGal−β−1,3−GalNAcと結合する、それぞれキッコウアワタケおよびソルダリア・マクロスポラ由来のXCLおよびTAP1(グリカンアレイデータ[図11]参照)、
(v)まだ同定されていない線虫複合糖質上の末端Fucと結合するヒイロチャワンタケ由来のAAL(図10参照)
である。
株および培養条件
大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)をそれぞれプラスミドのクローニングおよび増幅と、タンパク質の細菌発現に用いた。大腸菌をSambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ed., Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている標準培地で培養した。カエノラブディティス・エレガンス株は線虫増殖培地(NGM)で維持し、Stiernagle, T. (2006) WormBook, 1−11に記載されているように大腸菌株OP50を与えた。Bristol単離株N2を野生株として用いた。pmk−1(km25)、bre−1(ye4)、bre−2(ye31)、bre−3(ye26)、bre−4(ye27)、bre−5(ye17)、fut−1(ok892)、fut−2(gk360)、fut−2(ok509)、fut−3(gk103)、fut−4(gk111)、fut−5(ok242)、fut−6(ok475)、fut−8(ok2558)、gly−2(qa703)、gly−12(is47)、dpy−6(e14);gly−13(ok712)、gly−14(id48)、gly−20(ok826)株はミネソタ大学(米国)のGenetics Center(CGC)から入手した。2つの染色体外構築物frEx113[hsp::Mosトランスポゼース;Pcol12::DsRed]およびoxEx229[Mos1;Pmyo−2::gfp]を有する株は、Jonathan Ewbankから厚意により提供されたものである。Mos1により媒介される突然変異誘発のために、本発明者らは、pmk−1(km25);frEx113株およびpmk−1(km25);oxEx229株を作出した。Mos1により媒介される突然変異誘発およびその後の他殖から得られた株は、pmk−1(km25);M03F8.4(op497)、pmk−1(km25);fut−8(op498)、pmk−1(km25);ger−1(op499)、pmk−1(km25);gly−13(op507)およびpmk−1(km25);bre−1(op509)であった。
真菌レクチンの細菌発現のためのプラスミドは、cDNAまたは利用可能なプラスミドから個々のオープンリーディングフレームを増幅させ、得られたフラグメントを、導入された制限部位を用いてpET24a(Invitrogen)に連結することによって構築した。液体培養におけるCGL2およびCGL2(W72G)の発現は、CGL3に関してWalti, M. A. et al. (2008) J. Mol. Biol. 379, 146−159に記載されている通りに行った。C.エレガンスのバイオアッセイについては、個々のBL21(DE3)形質転換体の一晩培養物300μlを、1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)および50μg/mlカナマイシンを含有するNGMプレートに拡げ、23℃で一晩インキュベートした後に線虫を加えた。レクチンの発現は、導入されたBL21(DE3)形質転換体の全細胞抽出物を、クーマシーブルー染色SDSポリアクリルアミドゲルで分離すること、および利用できるのであれば特異的抗血清を用いて免疫ブロットを行うことによって確認した(データは示されていない)。
細菌細胞ペレットを、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)[30mMリン酸ナトリウムpH7.3、150mM NaCl]に再懸濁させ、フレンチプレスを用いて破砕した。細胞残渣を12000gで15分および27000gで30分の2回の連続する遠心分離工程で除去した。上清をラクトシル−セファロースとともに4℃で1時間インキュベートし、CGL2を最終的に、室温で、200mMラクトースを含有するPBSで溶出した。PBSで平衡化したセファロース6 10/300GL(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィー後に、該タンパク質を含有する画分をプールし、分子量カットオフが10kDaのAmicon Ultra−4遠心分離フィルターデバイス(Millipore)を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、280nmでの吸光度を測定し、光路長1cmで280nmでの吸光度1単位に対して1.25mg/ml−1の関係を仮定することにより計算した。精製CGL2とテトラメチルローダミン(TAMRA)(Molecular Probes)の結合はWalser, P. J. et al. (2005) Fungal Genet Biol 42, 293−305に記載されている通りに行った。
一般的な線虫の取扱いでは、Leica MZ12.5実体顕微鏡を用いた。ダブルアレイを持つ線虫(pmk−1(km25);oxEx229;frEx113)を選択するためには、適当なフィルターセット(DsRedフィルターとGFPフィルター)を備えたLeica MZ16FA実体顕微鏡を用いた。Nikon Coolpix 990デジタルカメラで写真を撮影した。
電子顕微鏡観察では、線虫を記載されている2段階の化学的固定(Hall, 1995)によって処理した。サンプルの固定および薄層切片化は、the Center for Microscopy and Image Analysis (チューリッヒ大学,スイス連邦)にてGarry Barmettlerにより、厚意によって行われた。これらのサンプルを、サイドマウントデジタルカメラ(Gatan)を備えたPhilips CM100透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
プレートアッセイ
C.エレガンスに対する野生型および変異型CGL2の毒性を調べるためにプレートアッセイを考案した。NGMプレートに、上記のように、野生型CGL2かまたは変異型CGL2(W72G)のいずれかを発現する大腸菌BL21(DE3)を播種した。対照として、プレートにベクターpET24aを含む大腸菌BL21(DE3)を播種した。これらのプレートを23℃で一晩インキュベートし、種々の毒性アッセイのために、同調したC.エレガンス集団を載せた(Barrows, B. D. et al. (2006) Methods Enzymol 417, 340−358参照)。
C.エレガンスに対するCGL2の毒性作用の表現型分析のため、L4期の線虫をプレートに載せ、23℃で24時間後に観察した。
C.エレガンス発達に対するCGL2の作用に関する定量的データは、示された遺伝子型の、新たに孵化したL1期幼虫50〜100個体をプレートに置くことによって得た。72時間後、L4期に達した線虫の割合を求めた。
C.エレガンスの繁殖に対するCGL2の作用は、個々のL4期野生型雌雄同体をプレートに採取することによってアッセイした。その後、その母虫が子孫を産むのを止めるか、または死に至るまで、毎日、母虫を新しいプレートに移した。翌日に前日のプレートの後代を計数した。種々のプレートからの後代数を足して最終的な同腹子数とした。
MICを、50%を超える個体が液体培養中で96時間以内に第4期幼虫(L4)に達することができない毒素濃度と定義した。L1期C.エレガンス野生型線虫20個体を、S培地(Sulston & Hodgkin (1988) Methods. in The nematode Caenorhabditis (Wood, W. B. ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. pp 587−606参照)、KanR遺伝子を有するエンプティーベクターpET24aを含む食餌源としての大腸菌BL21、カナマイシンおよびクロラムフェニコール(各30μg/ml)、ならびに示された濃度の精製CGL2タンパク質を含むウェルに入れた。96時間後、線虫をNGMプレートに移し、L4期に達した線虫の数を求めた。
示された遺伝子型のL4期C.エレガンス10個体をCGL2プレートに移した。24時間おきに、これらのプレートの生存個体を確認した。線虫は、ワームピックで触っても反応しなかった場合に死滅と見なした。
Mos1挿入突然変異誘発は基本的にBoulin and Bessereau(2007) Nat. Protoc. 2, 1276−1287に公開されている通りに行った。染色体外アレイfrEx113(熱ショックプロモーターの制御下にMos1トランスポゼースを有する)およびoxEx229(基質Mos1トランスポゾンの多重コピーを有する)を用いた。この2つの染色体外構築物をCGL2高感受性pmk−1(km25)線虫と交雑させ、スクリーニングのための2つの始原株pmk−1(km25);frEx113およびpmk−1(km25);oEx229を作出した。二重アレイを有する個体を作出するために、pmk−1(km25);oxEx229雄とL4 pmk−1(km25);frEx113雌雄同体とを交雑させた。咽頭におけるGFP(Pmyo−2::gfp、oxEx229に含まれる)と体腔細胞におけるDsRed(Pcol12::DsRed、frEx113に含まれる)を同時に発現することで認識される二重アレイを含む後代をおよそ6世代、繁殖させた後、それらに熱ショックを施した。1回の突然変異誘発につき数百の二重トランスジェニック個体に33℃1時間、20℃1時間、および33℃1時間の熱ショックを施し、その後、20℃で一晩回復させた。P0を90mm NGMプレートに分配し、熱ショック12〜40時間後に卵を回収した。その後、P0を取り出した。3日後、妊娠個体F1をM9バッファーで洗浄してプレート成分を除去し、Stiernagle, T. (2006) WormBook, 1−11に記載されているように、F2卵を分離した。同調したF2 L1個体の集団を、CGL2発現大腸菌BL21(DE3)を含む30枚のプレートに分配した。3〜7日後、これらのプレートを、成虫に達したCGL2耐性個体に関してスクリーニングした。冗長なMos1挿入を避けるため、耐性個体を含む各プレートは個別処理とした。候補線虫をCGL2発現大腸菌上で繁殖させ、耐性表現型を確認した。耐性が確認されれば、染色体外Mos1担持アレイを欠損した突然変異体と2〜6回他殖させた後、Mos1要素の存在をアッセイし、挿入部位の位置決定を試みた。Mos1要素をまだ含んでいた突然変異体について、本発明者らは、Boulin and Bessereau (2007) Nat. Protoc. 2, 1276−1287に公開されているように、線虫ライゼートに対する逆PCRによって挿入部位を決定した。
C.エレガンス株pmk−1(km25)、pmk−1(km25);M03F8.4(op497)およびpmk−1(km25);fut−8(op498)を、室温で5日間、大腸菌OP50とともに液体培養で増殖させ、その後、30%(w/v)スクロース勾配遠心分離(Stiernagle, T. (2006) WormBook, 1−11参照)によって細菌および残渣から分離した。N−グリカンの調製は、Poltl et al. (2007) Febs. J. 274, 714−726に従前に記載されているように、コアα1,3−フコシル化グリカンを他のコアフコシル化グリカンから分離するために、ペプチド−N−グリカナーゼ(PNGアーゼ)F、次いで、PNGアーゼAを用い、部分的に精製されたグリコペプチドからグリカンを酵素的に遊離させることによって行った。要するに、およそ3gの線虫(湿重)をボイルした後に摩砕した。この抽出物を5%(v/v)のギ酸を含むように調整し、3mgのペプシン(Sigma)とともに37℃で一晩インキュベートした。15,000gで15分遠心分離した後、上清を、2%酢酸で平衡化した15ml Dowex AG WX2に適用した。グリコペプチドを酢酸アンモニウム(0.6M、pH6)で溶出させた。オルシノール陽性画分をプールし、一晩凍結乾燥した。次に、セファデックスG25カラムに適用することでこれらのサンプルを脱塩し、1%酢酸で溶出させた。オルシノール陽性画分を再びプールし、凍結乾燥した。これらのサンプルを250μlの水に溶かした。95℃で5分間熱処理をして残留しているペプシンを不活化した後、サンプルをプールし、その後、250μlの炭酸アンモニウムバッファーpH8および3UのPNGアーゼF(Roche)を加え、37℃で一晩インキュベートした。次に、これらのサンプルを400μlの10%酢酸で酸性化し、5ml Dowex AG WX2に適用した。保持されなかった遊離グリカンは凍結乾燥し、次の蛍光標識のために乾燥させ、一方、保持されたオルシノール陽性画分は、酢酸アンモニウム(0.6M、pH6)で溶出させ、上記のように脱塩し、酢酸アンモニウムバッファー(50mM、pH5)に溶かし、37℃で一晩、PNGアーゼA(0.6mU)で処理した。再び、これらのサンプルを400μlの10%酢酸で酸性化し、5ml Dowex AG WX2に適用した。保持されなかった遊離グリカンを凍結乾燥し、また、次の蛍光標識のために乾燥させた。
N−グリカンの蛍光標識は、2−アミノ−ピリジン(PA)を用い、従前に記載されている通りに行った。PNGアーゼAまたはFのいずれかによって遊離され、ピリジルアミノ化されたグリカンの完全なN−グライコームを、室温にて、島津HPLCシステム(Class−VPソフトウエア(V6.13SP2)を用い、パーソナルコンピューターによって制御される、SCL−10Aコントローラー、2基のLC10APポンプおよびRF−10AXL蛍光検出器からなる)および蛍光検出(310または320nmで励起、380または400nmで発光を検出)を用いる2D−HPLCによって分画した。N−グリカンは、順相HPLC(Tosoh TSKゲルアミド−80、4.6×250mm、5μm;流速1ml/分、溶出:71.3%MeCN無勾配で5分、71.3%から61.8%MeCNの勾配で10分、61.8%MeCN無勾配で25分、61.8%から54.2%MeCNで15分、ギ酸アンモニウム(10mM、pH7)をバッファーとして使用)にて最初に分画された。これらの画分を凍結乾燥し、逆相HPLC(Hypersil ODS C−18;4×250mm、5μm;流速1.5ml/分、30分にわたって0〜30%MeOHの勾配、ギ酸アンモニウム(0.1M、pH4)をバッファーとして使用)にてさらに分画した。HPLCクロマトグラムを、オープンソースプログラムPLOT(Wesemann and Thijsseによるバージョン0.997)を用いて可視化した。各画分に対し、Bruker Ultraflex TOF/TOFを、マトリックスとしての2,5−ジヒドロキシ安息香酸とともに用いて、モノアイソトピックMALDI−TOF MSを行った。一般に、フコース含有N−グリカンを含む全ての画分に対してMS/MSを行い、それらの組成を明らかにした。ペプチド標品混合物(Bruker)を外部較正に用いた。MSデータは、BrukerソフトウエアおよびmMass V2.4ソフトウエアパッケージを用いて分析した(Strohalm, M. et al., M. (2008) Rapid Commun Mass Spectrom 22, 905−908参照)。
試験は、精製CGL2(TBS中300μM)を用い、25℃でVP−ITC等温滴定熱量測定計(Microcal,マサチューセッツ州,米国)にて行った。Gal−β−1,4−Fuc−α−1,6−GlcNAc−β−O−C5H10−NH2をTBS中に、1H−NMRによる純度評価値に基づいて補正した1.6mMの濃度で溶かした(およそ50〜60%)。このリガンドを、タンパク質溶液を含有するセル中へ、2μl 1回の注入の後、6μl 48回の注入によって滴定した。注入は全て、270rpmで攪拌しながら、3分間隔で行った。試験データを、Microcalによって供給されているMCS−ORIGINソフトウエアを用い、理論的滴定曲線に当てはめた。1タンパク質モノマーにつき1リガンド結合部位のモデルを用い、結合部位の数(N=0.977±0.004)、会合定数(Ka=1.15±0.044×104M−1)およびエンタルピー変化(ΔH=−8.85±0.1kcal/mol)を得た。
上述の寄生性線虫に対する毒性を、96ウェル細胞培養プレートを用いた液体アッセイで評価した。捻転胃虫の卵を感染したヒツジの糞便から分離し、カナマイシン(50μg/ml)およびアムホテリシンB(2.5μg/ml)を含む水−寒天プレート上で孵化させた。およそ30固体のL1幼虫を回収し、各ウェルの総容量150μlの0.1×Earls溶液中に移した。食餌源として、レクチン発現大腸菌BL21(DE3)細胞かまたは大腸菌OP50のいずれか(OD600=1)を、種々の濃度の精製抗体またはレクチンと組み合わせて加えた。プレートを暗所、28℃でインキュベートし、L3期へ発達した幼虫のパーセンテージを7日後に求めた。
表1:C.エレガンスグリコシル化突然変異体の比較。コードされている酵素の機能はwww.wormbase.org.から引用した。
Claims (49)
- 薬剤としてのグリカン結合ポリペプチドの使用。
- グリカン結合ポリペプチドがN−グリカン結合ポリペプチドから選択される、請求項1に記載の使用。
- N−グリカン結合ポリペプチドが、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−1,4含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル−α−1,6−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF6Gal含有および/またはMMF6Gal含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項2に記載の使用。
- N−グリカン結合ポリペプチドが、フコシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF3含有および/またはMMF3含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項2に記載の使用。
- グリカン結合ポリペプチドがO−グリカン結合ポリペプチドから選択され、O−グリカン結合ポリペプチドがガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−O−Ser/Thr化合物と結合する、請求項1に記載の使用。
- グリカン結合ポリペプチドが、リポグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質と結合するものから選択される、請求項1に記載の使用。
- ポリペプチドが、好ましくは、毛様線虫科(Trichostrongylidae)、好ましくは、捻転胃虫(Haemonchus contortus)、蛇状毛様線虫(Trichostrongylus colubriformis)、テラドルサジア・サークムシンクタ(Teladorsagia circumcincta)、クーペリア・オンコフォラ(Cooperia oncophora)、ネマトディルス・バッタス(Nematodirus battus)、オステルタジア・レプトスピアリアス(Ostertagia leptospiarias)、大口腸線虫(Chabertia ovina)、ブタ腸結節虫(Oesophagostomum dentatum)、ならびに線虫種の旋毛虫(Trichinella spiralis)、鞭虫(Trichuris trichuria)、住血線虫(Angiostrongylus vasorum)、イヌ鉤虫(Ancylostoma caninum)、ズビニ鉤虫(Ancylostoma duodenale)、セイロン鉤虫(Ancylostoma ceylanicum)、アメリカ鉤虫(Necator americanus)、肺虫種(Dictyocaulus spp.)、回虫(Ascaris lumbricoides)、ブタ回虫(Ascaris suum)、バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、ロア糸状虫(Loa loa)、蟯虫(Enterobius vermicularis)、イヌ糸状虫(Dirofilaria immitis)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)および糞線虫(Strongyloides stercoralis)から選択される線虫により産生される少なくとも1つの線虫グリカンと結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用。
- ポリペプチドがレクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
- ポリペプチドが多価であり、従って少なくとも2つ以上のグリカンと結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
- レクチンが真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ(Coprinopsis cinerea)、キッコウアワタケ(Xerocomus chrysenteron)、シバフタケ(Marasmius oreades)、ヒイロチャワンタケ(Aleuria aurantia)またはソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)由来のレクチン、より好ましくは、CGL1、CGL2、RedA(CCL2)、CCL1、XCL、MOA、AALおよびTAP1からなる群から選択されるレクチンの群から選択される、請求項8または9に記載の使用。
- 蠕虫感染、好ましくは線虫感染または免疫疾患を治療および/または予防するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
- 蠕虫感染、好ましくは線虫感染が、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる、請求項11に記載の使用。
- 免疫疾患がアレルギー、好ましくは植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項11のいずれか一項に記載の使用。
- 薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−1,4含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル−α−1,6−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF6Gal含有および/またはMMF6Gal含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から好ましく選択されるN−グリカンの使用。
- フコシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF3含有および/またはMMF3含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から好ましく選択される、請求項14に記載の使用。
- 薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−O−Ser/Thr化合物から好ましく選択される、O−グリカンの使用。
- 薬剤としての、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質から好ましく選択される、リポグリカンの使用。
- (i)グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)またはネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)の表面に展示されるか、または(ii)グリカンが、キーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ(Ulex europaeus)凝集素(UEA)、ミツバチ・ホスホリパーゼA2およびアメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)などの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは機能的誘導体からなる群から好ましく選択される糖タンパク質の一部である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の使用。
- 蠕虫感染、好ましくは線虫感染または免疫疾患を治療および/または予防するための請求項14〜の18いずれか一項に記載の使用。
- 蠕虫感染、好ましくは、線虫感染が、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される蠕虫によって起こる感染である、請求項19に記載の使用。
- 免疫疾患がアレルギー、好ましくは植物およびダニに対するアレルギー、および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項19に記載の使用。
- 少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドを含む、医薬組成物。
- グリカン結合ポリペプチドがN−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−1,4含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル−α−1,6−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF6Gal含有および/またはMMF6Gal含有オリゴ糖および複合糖質と結合する、請求項22に記載の組成物。
- グリカン結合ポリペプチドが、フコシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF3含有および/またはMMF3含有オリゴ糖および複合糖質からなる群から選択されるN−グリカンと結合する、請求項23に記載の組成物。
- グリカン結合ポリペプチドが、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−O−Ser/Thr化合物からなるO−グリカンの群から好ましく選択されるO−グリカンと結合する、請求項22に記載の組成物。
- グリカン結合ポリペプチドが、リポグリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質と結合する、請求項22に記載の組成物。
- グリカン結合ポリペプチドが、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生される少なくとも1つの線虫グリカンと結合する、請求項22〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリペプチドがレクチン、抗体、抗体のフラグメントまたは機能的誘導体および抗体様結合タンパク質からなる群から選択される、請求項22〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリペプチドが多価であり、従って少なくとも2つ以上のグリカンと結合する、請求項22〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリペプチドが、真菌レクチン、好ましくは、ウシグソヒトヨタケ、キッコウアワタケ、シバフタケ、ヒイロチャワンタケまたはソルダリア・マクロスポラ由来のレクチン、より好ましくは、レクチンCGL1、CGL2、RedA(CCL2)、CCL1、XCL、MOA、AALおよびTAP1の群から選択されるレクチンである、請求項22〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- グリカン結合ポリペプチド(glycan−binding polypepides)が細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、ヒト腸内細菌細胞、最も好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に提示される、請求項22〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、ガラクト−ピラノシル−β−1,4含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,4−L−フコピラノシル−α−1,6−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF6Gal含有および/またはMMF6Gal含有オリゴ糖および複合糖質から選択されるN−グリカンを含む、薬組成物。
- グリカンがフコシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、L−フコピラノシル−α−1,3−GlcNAc含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、GnGnF3含有および/またはMMF3含有オリゴ糖および複合糖質から選択される、請求項32に記載の組成物。
- O−グリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−β−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−O−Ser/Thr化合物を含む、医薬組成物。
- リポグリカン、好ましくは、ガラクトシド含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、より好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質、最も好ましくは、D−ガラクト−ピラノシル−α−1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミノ−ピラノシル−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミノ−ピラノシル含有オリゴ/多糖および/または複合糖質を含む、医薬組成物。
- グリカンまたはリポグリカンが、毛様線虫科、好ましくは、捻転胃虫、蛇状毛様線虫、テラドルサジア・サークムシンクタ、クーペリア・オンコフォラ、ネマトディルス・バッタス、オステルタジア・レプトスピアリアス、大口腸線虫、ブタ腸結節虫、ならびに線虫種の旋毛虫、鞭虫、住血線虫、イヌ鉤虫、ズビニ鉤虫、セイロン鉤虫、アメリカ鉤虫、肺虫種、回虫、ブタ回虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ロア糸状虫、蟯虫、イヌ糸状虫、回旋糸状虫および糞線虫から選択される線虫によって産生されるものである、請求項32〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- (i)グリカンが細菌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌またはネズミチフス菌の表面に展示されるか、または(ii)グリカンが、好ましくは、キーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)、ブロメライン、タチナタマメ・マンノシダーゼ、ハリエニシダ凝集素(UEA)、ミツバチ・ホスホリパーゼA2およびアメリカカブトガニなどの軟体動物のヘモシアニン、これらのいずれかの機能的フラグメントまたは機能的誘導体からなる群から選択される糖タンパク質の一部である、請求項32〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 単離されたグリカン、複合糖質および/またはグリカン結合ポリペプチドを含む、食品。
- 単離されたグリカン、複合糖質および/またはグリカン結合ポリペプチドを含む、動物飼料。
- 寄生性蠕虫の組換えまたは天然消化性プロテアーゼ(その機能的フラグメントおよび機能的誘導体を含む)を含む、請求項22〜37のいずれか一項に記載の組成物、請求項38に記載の食品、または請求項39に記載の動物飼料。
- グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも1つのグリカンを含む蠕虫、好ましくは、線虫を同定する方法であって、
(a)少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチド、好ましくは、真菌、細菌および/または植物グリカン結合タンパク質、および任意選択の蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、最も好ましくは、該少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞を準備すること;
(b)(a)の少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドおよび任意選択の蠕虫食餌細胞と、対象とする蠕虫細胞または蠕虫、好ましくは、線虫細胞または線虫とを、(i)グリカン結合ポリペプチドが蠕虫細胞に結合することを可能とし、かつ/または(ii)蠕虫細胞または蠕虫に任意選択の食餌細胞を摂食させることを可能とする条件下で接触させること;および
(c)死滅した蠕虫細胞または蠕虫を同定すること;
(d)任意選択により、(a)の少なくとも1つの毒性グリカン結合ポリペプチドを同定すること;
(e)任意選択により、少なくとも1つの毒性グリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する少なくとも1つのグリカンを同定すること
を含む、方法。 - ステップa)の少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドが蠕虫食餌細胞、好ましくは、大腸菌によって、より好ましくは、細胞質において活性型で発現される、請求項41に記載の方法。
- グリカン結合タンパク質と結合した際のグリカンにより媒介される毒性に関与する蠕虫遺伝子標的、好ましくは、線虫遺伝子標的、好ましくは、蠕虫グリカンおよび複合糖質の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子標的を同定する方法であって、
(a)グリカン特異性を有するグリカン結合ポリペプチドと結合した際に毒性を媒介する特異的グリカンを産生する、ランダム突然変異および/または標的突然変異を有する蠕虫細胞または蠕虫、および任意選択の野生型蠕虫細胞または蠕虫を準備すること;
(b)(a)の蠕虫細胞または蠕虫と、該グリカン特異性を有する少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドとを、任意選択により、蠕虫食餌細胞、好ましくは、腸内細菌、より好ましくは、大腸菌、好ましくは、該少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドを含む蠕虫食餌細胞の存在下で接触させること;および
(c)(b)におけるグリカン結合ポリペプチドの接触から生き残る(a)の蠕虫細胞または蠕虫における突然変異遺伝子を同定すること
を含む、方法。 - ステップb)の少なくとも1つのグリカン結合ポリペプチドが蠕虫食餌細胞、好ましくは、大腸菌によって、より好ましくは、細胞質において活性型で発現される、請求項43に記載の方法。
- 請求項42に記載の毒性を媒介する遺伝子標的を同定する方法であって、毒性関連グリカンを同定する、好ましくは、
(d.i)ステップ(c)の突然変異遺伝子と、特徴的な遺伝子、好ましくは、グリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、より好ましくは、蠕虫のグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子とを比較するステップ;
(d.ii)(c)で同定された突然変異体のN−グライコーム、O−グライコームまたはリポグライコームと、野生型蠕虫のグライコームとを、好ましくは、個々の複合糖質の生化学的単離とクロマトグラフィーおよび質量分析によるそれらの分析によって比較するステップ;
(d.iii)ステップ(c)の遺伝子を異種系、例えば、昆虫細胞、好ましくは、SF9細胞において発現させ、その遺伝子産物の生化学的活性をin vitroにおいてアッセイするステップ
の1以上を包含するステップ(d)をさらに含む、方法。 - 抗蠕虫物質、好ましくは、抗線虫物質を同定する方法であって、
(a)グリカンにより媒介される毒性に関与することが知られているグリカンを準備すること;
(b)(a)のグリカンと対象物質とを接触させること;
(c)(a)のグリカンと結合する対象物質を潜在的抗蠕虫物質、好ましくは、潜在的抗線虫物質として同定すること
を含む、方法。 - (a)のグリカンが細胞、好ましくは、細胞表面の一部を形成する、請求項46に記載の方法。
- (a)のグリカンを含む細胞への対象物質の取り込みが増孔剤および/または該細胞に対する食餌細胞によって補助される、請求項47に記載の方法。
- グリカンが単離される、請求項46に記載の方法。
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