JP2013501501A - CDC45L as a tumor marker and therapeutic target for cancer - Google Patents

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祐輔 中村
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Abstract

本発明は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子が癌において過剰発現し、かつ癌細胞の生存に関与するという知見に基づいている。本発明は、診断マーカーとしてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を用いる、がんを診断するための、またはがんを有する対象の予後を評価／判定するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、そのような二本鎖分子を用いてがんを治療および／または予防するための方法または組成物を特徴とする。また、分子標的としてＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を用いる、肺癌を治療および予防するための候補化合物を同定する方法も開示する。The present invention is based on the finding that CDC45L gene and PIF1 gene are overexpressed in cancer and are involved in the survival of cancer cells. The present invention features a method for diagnosing cancer or for evaluating / determining the prognosis of a subject having cancer using the CDC45L gene and / or PIF1 gene as a diagnostic marker. The invention also features a double-stranded molecule against the CDC45L gene or PIF1 gene, a method or composition for treating and / or preventing cancer using such a double-stranded molecule. Also disclosed are methods of identifying candidate compounds for treating and preventing lung cancer using CDC45L and / or PIF1 as molecular targets.

Description

優先権
本出願は２００９年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２７４，２４８号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。 Priority This application claims the benefit of U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61 / 274,248 on August 13, 2009, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

技術分野
本発明は、肺癌、より詳細にはその診断および治療に関する。 TECHNICAL FIELD This invention relates to lung cancer, and more particularly to its diagnosis and treatment.

原発性肺癌は、全世界におけるがん死の主要な原因である（非特許文献１）。肺の発癌に関与する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子機序は未だ不明である（非特許文献２）。過去２０〜３０年の間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む細胞傷害性剤が出現し、進行性ＮＳＣＬＣ患者に複数の治療選択肢を提供したが、これらのレジメンがもたらす生存上の恩恵は、シスプラチンに基づく治療法と比較して、限られている（非特許文献３）。これらの細胞傷害性薬に加えて、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（すなわち、ベマシズマブ／抗ＶＥＧＦ）またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（すなわち、セツキシマブ／抗ＥＧＦＲ）、およびＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する阻害薬（すなわち、ゲフィチニブおよびエルロチニブ）などのいくつかの分子標的剤が開発され、現在、臨床診療で広く用いられている（非特許文献４〜６）。それぞれの新しいレジメンは、限られた割合の患者に対してしか、生存上の恩恵をもたらすことができない。したがって、患者の大多数に適用可能であり、毒性が少ない、より効果的な分子標的剤の開発などの、新たな治療戦略が待ち望まれている。   Primary lung cancer is a major cause of cancer death worldwide (Non-Patent Document 1). Many genetic changes involved in lung carcinogenesis have been reported, but the exact molecular mechanism is still unclear (Non-Patent Document 2). Over the past 20-30 years, cytotoxic agents including paclitaxel, docetaxel, gemcitabine, and vinorelbine have emerged, providing multiple treatment options for patients with advanced NSCLC, but the survival benefits that these regimens provide Are limited compared to cisplatin-based therapies (Non-Patent Document 3). In addition to these cytotoxic agents, monoclonal antibodies against VEGF (ie, bemacizumab / anti-VEGF) or monoclonal antibodies against EGFR (ie, cetuximab / anti-EGFR), and inhibitors against EGFR tyrosine kinase (ie, gefitinib and erlotinib) Some molecular targeting agents have been developed and are now widely used in clinical practice (Non-Patent Documents 4 to 6). Each new regimen can only provide survival benefits for a limited percentage of patients. Thus, new therapeutic strategies are awaited, such as the development of more effective molecular targeting agents that can be applied to the majority of patients and are less toxic.

肺癌の診断、治療、および／または予防のための潜在的分子標的を単離するため、２７，６４８個の遺伝子または発現配列タグ（ＥＳＴ）からなるｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１０１例の肺癌組織に由来し、レーザーマイクロダイセクションにより精製された癌細胞に対して、遺伝子発現プロファイルのゲノム全域にわたる解析が行われた（非特許文献７〜１２）。各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析と、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術および細胞増殖／浸潤アッセイの組み合わせを用いるスクリーニング系が確立された（非特許文献１３〜３７）。   To isolate potential molecular targets for diagnosis, treatment, and / or prevention of lung cancer, a cDNA microarray consisting of 27,648 genes or expressed sequence tags (ESTs) was used in 101 lung cancer tissues. Genome-wide analysis of gene expression profiles was performed on cancer cells derived and purified by laser microdissection (Non-Patent Documents 7 to 12). To verify the biological and clinicopathological significance of each gene product, a screening system using a combination of tumor tissue microarray analysis of clinical lung cancer material, RNA interference (RNAi) technology and cell proliferation / invasion assay was established. (Non-Patent Documents 13 to 37).

出芽酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において、ＣＤＣ４５ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ４５−ｃｅｌｌ（ＣＤＣ４５）遺伝子は、ＤＮＡ複製の開始に必要な必須遺伝子であり、これはＭＣＭおよびＣＤＣ６タンパク質と共に、真核細胞におけるＤＮＡ複製の開始に必要な複合体を形成する（非特許文献３８）。ＣＤＣ４５Ｌと称される酵母ＣＤＣ４５遺伝子のヒト相同体は、５６６アミノ酸のタンパク質をコードし、酵母ＣＤＣ４５に対して２７．６％の同一性を示す（非特許文献３９）。ＣＤＣ４５ＬはＨｅＬａＳ３細胞において、伸長ＤＮＡポリメラーゼδおよびεと、ならびにＧＩＮＳ複合体の成分であるＰｓｆ２と、ならびに推定上の複製ＤＮＡヘリカーゼ複合体のサブユニットであるＭＣＭ５およびＭＣＭ７と、相互作用する（非特許文献４０）。がん細胞株の増殖中の細胞群において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現がより高レベルであることが報告された（非特許文献４１）。しかしながら、がんの発生および進行におけるＣＤＣ４５Ｌ活性化の役割は明らかにされていない。   In budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), the CDC45 cell division cycle 45-cell (CDC45) gene is an essential gene required for initiation of DNA replication, which, together with MCM and CDC6 proteins, is in eukaryotic cells. A complex necessary for initiation of DNA replication is formed (Non-patent Document 38). The human homologue of the yeast CDC45 gene called CDC45L encodes a protein of 666 amino acids and shows 27.6% identity to yeast CDC45 (Non-patent Document 39). CDC45L interacts in HeLaS3 cells with extended DNA polymerases δ and ε, as well as Psf2, a component of the GINS complex, and MCM5 and MCM7, subunits of the putative replicating DNA helicase complex (non-patented). Reference 40). It has been reported that CDC45L protein expression is higher in a growing cell group of cancer cell lines (Non-patent Document 41). However, the role of CDC45L activation in cancer development and progression has not been clarified.

一方、ｐｅｔｉｔｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ １（ＰＩＦ１）遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエで最初に同定され、酵母からヒトまで保存されているＳＦＩ ５'−３'ＤＮＡヘリカーゼのメンバーとして分類された（非特許文献４２）。酵母におけるＰＩＦ１の機能は、ｍｔＤＮＡ修復、ｒＤＮＡ複製、およびテロメア長の調節に関わる（非特許文献４２、４３）。加えて、酵母ＰＩＦ１は、インビトロにおいて効率的なＤＮＡ巻き戻しのために特定のＤＮＡ構造を必要とし、かつＤＮＡを５'→３'方向に巻き戻すので、領域特異的ＤＮＡヘリカーゼであると考えられている（非特許文献４３）。ＰＩＦ１様ヘリカーゼは多くの生物に存在するが、大部分の研究は酵母種で行われており、哺乳動物細胞におけるＰＩＦ１の機能について、および発がんへの関与についてはほとんどわかっていない。   On the other hand, the petite integration frequency 1 (PIF1) gene was first identified in Saccharomyces cerevisiae and classified as a member of SFI 5′-3 ′ DNA helicase conserved from yeast to human (Non-patent Document 42). The function of PIF1 in yeast is involved in mtDNA repair, rDNA replication, and regulation of telomere length (Non-Patent Documents 42 and 43). In addition, yeast PIF1 is considered a region-specific DNA helicase because it requires a specific DNA structure for efficient DNA unwinding in vitro and unwinds the DNA in the 5 ′ → 3 ′ direction. (Non-Patent Document 43). Although PIF1-like helicases are present in many organisms, most research has been done in yeast species and little is known about the function of PIF1 in mammalian cells and its involvement in carcinogenesis.

国際公開公報第２００７／０１３６７１号International Publication No. 2007/013671 ６１／２１７，１３３61 / 217,133

Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2008;58:71-96.Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2008; 58: 71-96. Sozzi G. European Journal of Cancer 2001;37 Suppl 7:S63-S73.Sozzi G. European Journal of Cancer 2001; 37 Suppl 7: S63-S73. Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002;346:92-8.Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002; 346: 92-8. Sandler A, et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50.Sandler A, et al. N Engl J Med 2006; 355: 2542-50. Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005;353:123-32.Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005; 353: 123-32. Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23.Thatcher N. Lung Cancer 2007; 57 Suppl 2: S18-23. Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53.Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008; 56: 43-53. Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205.Kikuchi T, et al. Oncogene 2003; 22: 2192-205. Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99.Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003; 1: 485-99. Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004; 13: 3029-43. Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805.Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28: 799-805. Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006; 29: 567-75. Suzuki C, et al. Cancer Res 2003;63:7038-41.Suzuki C, et al. Cancer Res 2003; 63: 7038-41. Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70.Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004; 10: 8363-70. Kato T, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46.Kato T, et al. Cancer Res 2005; 65: 5638-46. Furukawa C, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10.Furukawa C, et al. Cancer Res 2005; 65: 7102-10. Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84.Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005; 65: 9176-84. Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25.Suzuki C, et al. Cancer Res 2005; 65: 11314-25. Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45.Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2006; 97: 737-45. Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19.Takahashi K, et al. Cancer Res 2006; 66: 9408-19. Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48.Hayama S, et al. Cancer Res 2006; 66: 10339-48. Kato T, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42.Kato T, et al. Clin Cancer Res 2007; 13: 434-42. Suzuki C, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51.Suzuki C, et al. Mol Cancer Ther 2007; 6: 542-51. Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25.Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007; 67: 2517-25. Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22.Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67: 4113-22. Taniwaki M, et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31.Taniwaki M, et al. Clin Cancer Res 2007; 13: 6624-31. Ishikawa N, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11.Ishikawa N, et al. Cancer Res 2007; 67: 11601-11. Mano Y, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13.Mano Y, et al. Cancer Sci 2007; 98: 1902-13. Kato T, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53.Kato T, et al. Cancer Res 2007; 67: 8544-53. Kato T, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70.Kato T, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 2363-70. Dunleavy EM, et al. Cell 2009;137:485-97.Dunleavy EM, et al. Cell 2009; 137: 485-97. Hirata D, et al. Clin Cancer Res 2009,15:256-66.Hirata D, et al. Clin Cancer Res 2009, 15: 256-66. Takano A, et al. Cancer Res（2009 in press)Takano A, et al. Cancer Res (2009 in press) Suda T, et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8.Suda T, et al. Cancer Sci 2007; 98: 1803-8. Mizukami Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54.Mizukami Y, et al. Cancer Sci 2008; 99: 1448-54. Harao M, et al. Int J Cancer 2008;123:2616-25.Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25. Kono K, et al. Cancer Sci（2009 in press)Kono K, et al. Cancer Sci (2009 in press) Hopwood B, Dalton S. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:12309-14.Hopwood B, Dalton S. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 12309-14. P, et al. J Biol Chem 1998;273:18205-9.P, et al. J Biol Chem 1998; 273: 18205-9. Bauerschmidt C, et al. Genes Cells 2007;12:745-58.Bauerschmidt C, et al. Genes Cells 2007; 12: 745-58. Pollok S, et al. FEBS J 2007;274:3669-84.Pollok S, et al. FEBS J 2007; 274: 3669-84. Foury F, Dyck EV. EMBO J 1985;4:3525-30.Foury F, Dyck EV. EMBO J 1985; 4: 3525-30. Bessler JB, et al. Trends Cell Biol 2001;11:60-5.Bessler JB, et al. Trends Cell Biol 2001; 11: 60-5.

ヒトがんの診断、治療、および予防のための新規分子標的のスクリーニングの過程で、レーザーマイクロダイセクションと組み合わせた、肺癌２６７例のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を、２７，６４８個の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイ上で行った（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205.；Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805；Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99；Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43. Epub 2004 Oct 20；Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep; 29(3):567-75）。その結果、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子が原発性肺癌の大多数で頻繁に過剰発現していることが実証される。同様に、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子として同定されたＰＩＦ１遺伝子も、肺癌で過剰発現することが見出された。さらに、これらの遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、がん細胞増殖を効果的に抑制した。これらの結果から、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子が、がんの診断または治療のための優れた分子標的になり得ることが示唆される。   Including 27,648 genes, genome-wide expression profile analysis of 267 lung cancers combined with laser microdissection in the process of screening for new molecular targets for the diagnosis, treatment and prevention of human cancer Performed on a cDNA microarray (Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10; 22 (14): 2192-205 .; Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006 Apr; 28 (4): 799-805 Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May; 1 (7): 485-99; Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15; 13 (24): 3029-43. Epub 2004 Oct 20; Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep; 29 (3): 567-75). The results demonstrate that the CDC45L gene is frequently overexpressed in the majority of primary lung cancers. Similarly, the PIF1 gene identified as a gene encoding a protein that interacts with the CDC45L protein was also found to be overexpressed in lung cancer. Furthermore, siRNA against these genes effectively suppressed cancer cell growth. These results suggest that the CDC45L gene and the PIF1 gene can be excellent molecular targets for cancer diagnosis or treatment.

したがって本発明は、腫瘍において一般的に上方制御されるがん関連遺伝子ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１、ならびに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を用いてがん治療のための分子標的薬を開発するための戦略に関する。   Thus, the present invention relates to cancer-related genes CDC45L and PIF1 that are generally upregulated in tumors, and strategies for developing molecular targeted drugs for cancer treatment using CDC45L and / or PIF1.

１つの局面において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを指標として用いて、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現するがん、例えば肺癌を診断するための方法を提供する。本発明の方法では、該遺伝子の発現レベルを測定するために、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを適切なプライマーまたはプローブによって検出することができ、あるいはＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体または抗ＰＩＦ１抗体によって検出することもできる。いくつかの態様において、がんはＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介または促進される。いくつかの態様において、がんは肺癌である。１つの態様において、がんは肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および肺大細胞癌（ＬＣＣ）、または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である。   In one aspect, the present invention uses a CDC45L and / or PIF1 gene expression level as an indicator, and a method for diagnosing cancer, for example, a cancer that overexpresses the CDC45L gene and / or PIF1 gene, such as lung cancer I will provide a. In the method of the present invention, in order to measure the expression level of the gene, mRNA of CDC45L or PIF1 gene can be detected by an appropriate primer or probe, or CDC45L or PIF1 protein can be detected by anti-CDC45L antibody or anti-PIF1 antibody. It can also be detected. In some embodiments, the cancer is mediated or promoted by CDC45L and / or PIF1. In some embodiments, the cancer is lung cancer. In one embodiment, the cancer is lung adenocarcinoma (ADC), lung squamous cell carcinoma (SCC), and lung large cell carcinoma (LCC), or small cell lung cancer (SCLC).

本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを指標として用いて、がん、例えば肺癌を有する対象の進行を予測するための方法も提供する。   The present invention also provides a method for predicting the progression of a subject having cancer, such as lung cancer, using the expression level of CDC45L as an index.

さらに本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を指標として用いて、がん、例えば肺癌の患者の予後を予測するための方法を提供する。   The present invention further provides a method for predicting the prognosis of a patient with cancer, for example, lung cancer, using the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene or the biological activity of CDC45L and / or PIF1 protein as an index. .

別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の発現レベル、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性を指標として用いて、がん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。   In another aspect, the present invention relates to cancer using binding to CDC45L and / or PIF1 polypeptide, expression level of CDC45L and / or PIF1 gene, or biological activity of CDC45L and / or PIF1 polypeptide as an indicator. Provides a method for screening candidate compounds, eg, for treating or preventing lung cancer.

別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドの間の相互作用を指標として用いて、がん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。   In another aspect, the present invention provides a method for screening candidate compounds for treating or preventing cancer, eg, lung cancer, using the interaction between CDC45L polypeptide and PIF1 polypeptide as an indicator. .

さらなる態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害する該遺伝子に対する二本鎖分子、例えばｓｉＲＮＡ、および該二本鎖分子をコードするベクターを提供する。本発明の二本鎖分子は、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因するがん、例えば肺癌の治療または予防に有用である。   In a further aspect, the present invention provides a double-stranded molecule against the gene that inhibits expression of the CDC45L or PIF1 gene, such as siRNA, and a vector encoding the double-stranded molecule. The double-stranded molecules of the invention are useful for the treatment or prevention of cancers such as cancers mediated by CDC45L and / or PIF1 or resulting from overexpression of CDC45L and / or PIF1.

別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子もしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、該対象におけるがんを治療または予防する方法を提供し、ここで、該二本鎖分子は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する。   In another embodiment, the present invention relates to cancer in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of a double-stranded molecule against the CDC45L gene or PIF1 gene, or a vector encoding the double-stranded molecule. A method of treating or preventing is provided wherein the double stranded molecule inhibits cell proliferation and expression of the gene when introduced into a cell expressing the CDC45L gene or the PIF1 gene.

別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療または予防するための組成物を提供し、ここで、該二本鎖分子は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する。   In another aspect, the present invention provides a composition for treating or preventing cancer, comprising a double-stranded molecule against CDC45L or PIF1, or a vector encoding the double-stranded molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier. Wherein the double stranded molecule inhibits cell proliferation and expression of the gene when introduced into a cell expressing the CDC45L gene or the PIF1 gene.

本発明の１つまたは複数の局面は特定の目的を満たすことができる一方、１つまたは複数の他の局面は特定の他の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されよう。各目的は、本発明のすべての局面に、あらゆる点で等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の１つの局面に関して選択的に考慮することができる。本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および以下の実施例と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明および本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが、理解されるべきである。   It will be appreciated by one skilled in the art that one or more aspects of the present invention can meet a particular purpose, while one or more other aspects can meet a particular other purpose. Each objective may not apply equally in all respects to all aspects of the invention. Thus, the foregoing objects can be selectively considered with respect to any one aspect of the present invention. These and other objects and features of the invention will become more fully apparent when the following detailed description is read in conjunction with the accompanying drawings and the following examples. However, it should be understood that both the foregoing summary of the invention and the following detailed description are of preferred embodiments and are not intended to limit the invention and other alternative embodiments of the invention. is there.

本発明の様々な局面および適用が、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明らかになるであろう。
図１は、肺腫瘍組織および細胞株におけるＣＤＣ４５Ｌの発現を示す。Ａ、Ｂ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、正常肺組織試料1例および臨床肺癌組織試料１５例（肺ＡＤＣ ５例、肺ＳＣＣ ５例、およびＳＣＬＣ ５例）（Ａ）ならびに正常気道上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）および肺癌細胞株１５例（Ｂ）における、ＣＤＣ４５Ｌの発現。Ｃ、ウエスタンブロット解析により調べた、肺癌細胞株６例およびＳＡＥＣ細胞におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質の発現。Ｄ、ＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の細胞内局在性。ＣＤＣ４５Ｌは、核内で強く、細胞質内で弱く染色された。 図２は、正常組織におけるＣＤＣ４５Ｌの発現、およびＮＳＣＬＣ患者に関するＣＤＣ４５Ｌ過剰発現と予後不良との関連性を示す。Ａ、正常組織５例（心臓、肺、肝臓、腎臓、および精巣）および肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現の免疫組織化学的解析。ＣＤＣ４５Ｌは、精巣および肺癌細胞において（主に核および／または細胞質において）大量に発現したが、残り４例の正常組織ではその発現はほとんど検出できなかった。Ｂ、癌組織におけるＣＤＣ４５Ｌ発現の陽性および陰性染色の例（元の倍率×１００）。Ｃ、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現と予後不良との関連性。ＮＳＣＬＣ患者の生存のカプラン−マイヤー解析（ログランク検定によりＰ＝０．００４５）。 図３は、ＣＤＣ４５Ｌに対するｓｉＲＮＡが肺癌細胞に与える増殖抑制効果を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した、ＣＤＣ４５Ｌに対する２つの異なるｓｉＲＮＡであるｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃２、ならびに２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＥＧＦＰ）が、Ａ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）におけるＣＤＣ４５Ｌ発現に与える、遺伝子ノックダウン効果。Ｂ、Ｃ、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）のコロニー形成アッセイ（Ｂ）およびＭＴＴアッセイ（Ｃ）。カラム、３連のアッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。Ｄ、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃２またはｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（トランスフェクションから４８時間後）のフローサイトメトリー解析。 図４は、ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の相互作用を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析による、正常肺組織試料1例および臨床肺癌組織試料１５例におけるＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１の発現解析。Ｂ、肺癌ＳＢＣ−３細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌと外因性ＰＩＦ１の相互作用。ＦＬＡＧタグ付ＰＩＦ１発現プラスミドをトランスフェクトしたＳＢＣ−３細胞からの細胞溶解物を用いた免疫沈降を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行った。免疫沈降物を、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いるウエスタンブロット解析に供した。ＩＢ、免疫ブロッティング；ＩＰ、免疫沈降。Ｃ、ＳＢＣ−３細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌおよび外因性ＰＩＦ１の免疫蛍光染色。ＣＤＣ４５Ｌ−Ａｌｅｘａ４８８、ＰＩＦ１−Ａｌｅｘａ５９４、または細胞核（４'，６'−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩［ＤＡＰＩ］）を可視化した。核および細胞質におけるＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の共局在が観察された。 図５は、ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡが肺癌細胞に与える増殖抑制効果を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、２種類のｓｉ−ＰＩＦ１（ｓｉ−ＰＩＦ１−＃１およびｓｉ−ＰＩＦ１−＃２）および２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＥＧＦＰ）による、Ａ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）におけるＰＩＦ１発現に対する遺伝子ノックダウン効果。Ｂ、Ｃ、ｓｉ−ＰＩＦ１または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）のコロニー形成アッセイ（Ｂ）およびＭＴＴアッセイ（Ｃ）。カラム、３連のアッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。 Various aspects and applications of the present invention will become apparent to those skilled in the art from consideration of the following brief description of the drawings and detailed description of the invention and preferred embodiments thereof.
FIG. 1 shows the expression of CDC45L in lung tumor tissues and cell lines. A, B, 1 normal lung tissue sample and 15 clinical lung cancer tissue samples (5 lung ADC, 5 lung SCC, and 5 SCLC) detected by semi-quantitative RT-PCR analysis (A) and normal airway CDC45L expression in epithelial derived cells (SAEC) and 15 lung cancer cell lines (B). C, CDC45L protein expression in 6 lung cancer cell lines and SAEC cells examined by Western blot analysis. D, subcellular localization of endogenous CDC45L protein in LC319 cells. CDC45L stained strongly in the nucleus and weakly in the cytoplasm. FIG. 2 shows the expression of CDC45L in normal tissues and the association between CDC45L overexpression and poor prognosis for NSCLC patients. A, immunohistochemical analysis of CDC45L protein expression in 5 normal tissues (heart, lung, liver, kidney, and testis) and lung cancer. CDC45L was expressed in large amounts in testis and lung cancer cells (mainly in the nucleus and / or cytoplasm), but its expression was hardly detectable in the remaining 4 normal tissues. B, Examples of positive and negative staining of CDC45L expression in cancer tissue (original magnification x 100). C, Association between CDC45L protein expression and poor prognosis. Kaplan-Meier analysis of NSCLC patient survival (P = 0.0045 by log rank test). FIG. 3 shows the growth inhibitory effect of siRNA against CDC45L on lung cancer cells. A, two different siRNAs for CDC45L, si-CDC45L- # 1 and si-CDC45L- # 2, and two control siRNAs (si-LUC and si-EGFP), analyzed by semi-quantitative RT-PCR, Gene knockdown effect on CDC45L expression in A549 cells (left) and SBC-3 cells (right). Colony formation assay (B) and MTT assay (C) of A549 cells (left) and SBC-3 cells (right) transfected with B, C, si-CDC45L or control siRNA. Column, relative absorbance of triplicate assay; bar, SD. D, Flow cytometric analysis of A549 cells transfected with si-CDC45L- # 2 or si-LUC (48 hours after transfection). FIG. 4 shows the interaction between CDC45L and PIF1. A, Expression analysis of CDC45L and PIF1 in 1 normal lung tissue sample and 15 clinical lung cancer tissue samples by semi-quantitative RT-PCR analysis. B, Interaction of endogenous CDC45L and exogenous PIF1 in lung cancer SBC-3 cells. Immunoprecipitation using cell lysates from SBC-3 cells transfected with a FLAG-tagged PIF1 expression plasmid was performed using anti-FLAG antibody. The immunoprecipitate was subjected to Western blot analysis using anti-CDC45L antibody. IB, immunoblotting; IP, immunoprecipitation. C, Immunofluorescent staining of endogenous CDC45L and exogenous PIF1 in SBC-3 cells. CDC45L-Alexa488, PIF1-Alexa594, or cell nucleus (4 ′, 6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride [DAPI]) was visualized. Colocalization of CDC45L and PIF1 in the nucleus and cytoplasm was observed. FIG. 5 shows the growth inhibitory effect of siRNA against PIF1 on lung cancer cells. A, with two si-PIF1 (si-PIF1- # 1 and si-PIF1- # 2) and two control siRNAs (si-LUC and si-EGFP) detected by semi-quantitative RT-PCR analysis. Gene knockdown effect on PIF1 expression in A549 cells (left) and SBC-3 cells (right). Colony formation assay (B) and MTT assay (C) of A549 cells (left) and SBC-3 cells (right) transfected with B, C, si-PIF1 or control siRNA. Column, relative absorbance of triplicate assay; bar, SD.

態様の説明
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。 DESCRIPTION OF EMBODIMENTS Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of embodiments of the present invention, the preferred methods, devices, and materials are described below. Describe. However, before describing the materials and methods of the present invention, the specific sizes, shapes, dimensions, materials, methodologies, protocols, etc. described herein can be altered according to routine experimentation and optimization. It should be understood that the present invention is not limited thereto. The terminology used herein is for the purpose of describing particular types or embodiments only and is not intended to limit the scope of the invention which is limited only by the appended claims. It should also be understood.

本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。   The disclosure of each publication, patent, or patent application mentioned in this specification is expressly incorporated by reference in its entirety. However, nothing in this specification should be construed as an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior invention.

矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。   In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

定義
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。 Definitions As used herein, the words “a”, “an”, and “the” mean “at least one” unless stated otherwise.

物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関連して用いられる「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中に含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないということを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞材料、例えば糖質、脂質、および他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドが単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から、該ポリペプチドが分離された、該ポリペプチドの調製物を含む。   The terms “isolated” and “purified” as used in connection with a substance (eg, polypeptide, antibody, polynucleotide, etc.) refer to at least one substance in which the substance can be contained in a natural source. Is substantially not included. Thus, an isolated or purified antibody is substantially free of cellular material from the cell or tissue source from which the protein (antibody) is derived, eg, carbohydrates, lipids, and other contaminating proteins. Or refers to an antibody that is substantially free of chemical precursors and other chemicals when chemically synthesized. The term “substantially free of cellular material” includes preparations of the polypeptide in which the polypeptide is separated from cellular components of cells from which the polypeptide is isolated or recombinantly produced. .

したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）を有する、ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、いくつかの態様においてこれはまた培養培地を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満の培養培地を有する、該ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、いくつかの態様においてこれは化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に伴う化学的前駆体または他の化学物質が該タンパク質調製物の体積の（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満である該ポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、該タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。１つの態様において、本発明の抗体を含むタンパク質は単離されているかまたは精製されている。   Thus, a polypeptide that is substantially free of cellular material is less than about 30%, less than 20%, less than 10%, or less than 5% heterologous protein (per dry weight) (also referred to herein as “contaminating protein”). Polypeptide preparations having: Where the polypeptide is produced recombinantly, in some embodiments it is also substantially free of culture medium and less than about 20%, less than 10%, or less than 5% of the culture medium volume of the protein preparation. Including a preparation of said polypeptide. Where the polypeptide is made by chemical synthesis, in some embodiments it is substantially free of chemical precursors and other chemicals, and chemical precursors or other chemicals associated with protein synthesis are Preparations of the polypeptide that are less than about 30%, less than 20%, less than 10%, less than 5% (by dry weight) of the volume of the protein preparation. The inclusion of an isolated or purified polypeptide in a particular protein preparation can include, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis of the protein preparation and Coomassie brilliant blue staining of the gel. It can be shown later by the appearance of a single band. In one embodiment, the protein comprising the antibody of the present invention is isolated or purified.

「単離された」または「精製された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞材料および培養培地を実質的に含まなくてよく、または化学合成された場合には、化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まなくてよい。１つの態様において、本発明のタンパク質をコードする核酸分子は単離されているかまたは精製されている。   An “isolated” or “purified” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material and culture medium or can be chemically synthesized when made by recombinant techniques. If present, it may be substantially free of chemical precursors and other chemicals. In one embodiment, the nucleic acid molecule encoding the protein of the invention is isolated or purified.

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。   The terms “polypeptide”, “peptide”, and “protein” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acid residues. The term refers to, in addition to natural amino acid polymers, amino acids in which one or more amino acid residues are modified residues or are non-natural residues, eg, artificial chemical mimetics of the corresponding natural amino acids. Applied to polymer.

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾された天然アミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、類似した機能を有する、化学物質を指す。   The term “amino acid” refers to naturally occurring and synthetic amino acids, as well as amino acid analogs and amino acid mimetics that function similarly to the naturally occurring amino acids. Natural amino acids are natural amino acids encoded by the genetic code and natural amino acids that are post-translationally modified in cells (eg, hydroxyproline, γ-carboxyglutamic acid, and O-phosphoserine). The phrase “amino acid analog” is a compound having the same basic chemical structure as a natural amino acid (hydrogen, carboxy group, amino group, and α-carbon attached to the R group), but having a modified R group or a modified backbone (eg, Homoserine, norleucine, methionine, sulfoxide, methionine methylsulfonium). The phrase “amino acid mimetic” refers to a chemical substance that has a different structure from a common amino acid but has a similar function.

アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、公知の３文字表記または１文字表記により言及されてもよい。   Amino acids may be referred to herein by their known three-letter or single-letter code as recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、広く認められた１文字コードにより言及される。アミノ酸と同様に、これには天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方が含まれる。遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。   The terms “gene”, “polynucleotide”, “oligonucleotide”, “nucleic acid”, and “nucleic acid molecule” are used interchangeably unless otherwise specified and are referred to by the widely accepted one-letter code as well as the amino acid. Is done. Like amino acids, this includes both natural and non-natural nucleic acid polymers. A gene, polynucleotide, oligonucleotide, nucleic acid, or nucleic acid molecule can be composed of DNA, RNA, or a combination thereof.

本明細書で用いられる「生物学的試料」という用語は、生物全体、または、その組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および***を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体からまたはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、細胞成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドを含む、生物が増殖した培地、例えば栄養ブロスまたはゲルを指す。   As used herein, the term “biological sample” refers to an entire organism or a tissue, cell, or component thereof (eg, blood, mucus, lymph, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, amniotic membrane) Refers to a subset of bodily fluids including but not limited to cord blood, urine, vaginal fluid, and semen. A “biological sample” is further a homogenate, lysate, extract, cell culture, or tissue culture, or a fraction or preparation thereof prepared from the whole organism or from a subset of its cells, tissues, or components. Point to a part. Finally, “biological sample” refers to a medium in which an organism has grown, such as a nutrient broth or gel, containing cellular components, such as proteins or polynucleotides.

特記しない限り、「がん」という用語は、腺癌（ＡＤＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、大細胞癌（ＬＣＣ）、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌などの、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現するがんを指す。   Unless otherwise stated, the term “cancer” refers to CDC45L and / or PIF1 such as adenocarcinoma (ADC), squamous cell carcinoma (SCC), large cell carcinoma (LCC), and lung cancer including small cell lung cancer (SCLC). Refers to cancer that overexpresses the gene.

（１）遺伝子およびポリペプチド
ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３５０４．３としても入手可能である。本明細書において、「ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子」という語句は、ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子を包含し、対立遺伝子変異体および、他の動物においてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に相当するとして見出される遺伝子を含む。 (1) Gene and polypeptide The nucleotide sequence of the human CDC45L gene is shown in SEQ ID NO: 13 and is also available as GenBank accession number NM_003504.3. As used herein, the phrase “CDC45L gene” encompasses the human CDC45L gene, as well as the CDC45L gene of other animals including, but not limited to, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows. And allelic variants and genes found in other animals as corresponding to the CDC45L gene.

ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３５０４．３（ＮＰ＿００３４９５．１）としても入手可能である。本発明において、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＣＤＣ４５Ｌ」と称され、場合によっては「ＣＤＣ４５Ｌポリペプチド」または「ＣＤＣ４５Ｌタンパク質」と称される。   The amino acid sequence encoded by the human CDC45L gene is shown in SEQ ID NO: 14, and is also available as GenBank accession number NM_003504.3 (NP_003495.1). In the present invention, the polypeptide encoded by the CDC45L gene is referred to as “CDC45L”, and is sometimes referred to as “CDC45L polypeptide” or “CDC45L protein”.

ヒトＰＩＦ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示され、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５０４９．２としても入手可能である。本明細書において、「ＰＩＦ１遺伝子」という語句は、ヒトＰＩＦ１遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のＰＩＦ１遺伝子を包含し、かつ、対立遺伝子変異体および、他の動物においてＰＩＦ１遺伝子に相当するとして見出される遺伝子を含む。   The nucleotide sequence of the human PIF1 gene is shown in SEQ ID NO: 15 and is also available as GenBank accession number NM — 05049.2. As used herein, the phrase “PIF1 gene” includes the human PIF1 gene and other animal PIF1 genes including, but not limited to, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows. And allelic variants and genes found to correspond to the PIF1 gene in other animals.

ヒトＰＩＦ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５０４９．２（ＮＰ＿０７９３２５．２）としても入手可能である。本発明において、ＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＰＩＦ１」と称され、場合によっては「ＰＩＦ１ポリペプチド」または「ＰＩＦ１タンパク質」と称される。   The amino acid sequence encoded by the human PIF1 gene is shown in SEQ ID NO: 16 and is also available as GenBank accession number NM — 05049.2 (NP — 079325.2). In the present invention, the polypeptide encoded by the PIF1 gene is referred to as “PIF1” and is sometimes referred to as “PIF1 polypeptide” or “PIF1 protein”.

本発明の１つの局面によれば、機能的同等物もまたＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１に含まれる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは、そのタンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の少なくとも１つの生物学的活性を保持している任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物およびＰＩＦ１の機能的同等物は、細胞増殖促進活性を保持している。加えて、ＣＤＣ４５Ｌの生物学的活性には、ＰＩＦ１に対する結合活性が含まれる。したがって好ましい態様において、ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物はＰＩＦ１結合領域を含み得る。同様に、ＰＩＦ１の生物学的活性には、ＣＤＣ４５Ｌに対する結合活性が含まれる。したがって好ましい態様において、ＰＩＦ１の機能的同等物はＣＤＣ４５Ｌ結合領域を含み得る。   According to one aspect of the invention, functional equivalents are also included in CDC45L and PIF1. As used herein, a “functional equivalent” of a protein is a polypeptide having a biological activity equivalent to that protein. That is, any polypeptide that retains at least one biological activity of CDC45L or PIF1 can be used as such a functional equivalent in the present invention. For example, the functional equivalent of CDC45L and the functional equivalent of PIF1 retain cell growth promoting activity. In addition, the biological activity of CDC45L includes binding activity to PIF1. Thus, in a preferred embodiment, the functional equivalent of CDC45L may comprise a PIF1 binding region. Similarly, the biological activity of PIF1 includes binding activity to CDC45L. Thus, in a preferred embodiment, the functional equivalent of PIF1 may comprise a CDC45L binding region.

ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物には、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸、例えば１〜５個のアミノ酸、例えば最大５％のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。同様に、ＰＩＦ１の機能的同等物には、ＰＩＦ１タンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸、例えば１〜５個のアミノ酸、例えば最大５％のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。   A functional equivalent of CDC45L is substituted, deleted, added, or inserted with one or more amino acids, eg, 1-5 amino acids, eg, up to 5% amino acids, relative to the natural amino acid sequence of the CDC45L protein. Is included. Similarly, functional equivalents of PIF1 include substitutions, deletions, additions of one or more amino acids, eg 1-5 amino acids, eg up to 5% amino acids, relative to the natural amino acid sequence of the PIF1 protein. Or the inserted one is included.

一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている（Mark DF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep;81(18):5662-6；Zoller MJ & Smith M. Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-500；Wang A, et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-3；Dalbadie-McFarland G, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov;79(21):6409-13）。当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、または置換が、タンパク質の変化によって類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であることを認識するであろう。   In general, modification of one or more amino acids in a protein is known not to affect the function of the protein (Mark DF, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1984 Sep; 81 ( 18): 5662-6; Zoller MJ & Smith M. Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10 (20): 6487-500; Wang A, et al., Science. 1984 Jun 29; 224 (4656): 1431- 3; Dalbadie-McFarland G, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1982 Nov; 79 (21): 6409-13). Those skilled in the art will recognize that individual additions, deletions, insertions, or substitutions to an amino acid sequence that alter a single amino acid or a small percentage of amino acids result in a protein having similar functions due to changes in the protein. You will recognize that it is “modified”.

アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン）、親水性アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖である：脂肪族側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）；ヒドロキシル基含有側鎖（セリン、スレオニン、チロシン）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン）；塩基含有側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；ならびに芳香族含有側鎖（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）。さらに、機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の８群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: W.H. Freeman, c1984を参照されたい）。 Examples of amino acid side chain properties are hydrophobic amino acids (alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, tyrosine, valine), hydrophilic amino acids (arginine, aspartic acid, asparagine, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine , Histidine, lysine, serine, threonine), and side chains having the following functional groups or characteristics in common: aliphatic side chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline); hydroxyl group-containing side chains (Serine, threonine, tyrosine); sulfur atom-containing side chains (C, M); carboxylic acid and amide-containing side chains (aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine); base-containing side chains (arginine, lysine, histidine); Good Group-containing side chain (histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan). In addition, conservative substitution tables providing functionally similar amino acids are well known in the art. For example, the following eight groups each contain amino acids that are conservative substitutions for each other:
(1) Alanine (A), Glycine (G);
(2) Aspartic acid (D), glutamic acid (E);
(3) Asparagine (N), glutamine (Q);
(4) Arginine (R), Lysine (K);
(5) Isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), valine (V);
(6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W);
(7) serine (S), threonine (T); and (8) cysteine (C), methionine (M).
(See, eg, Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: WH Freeman, c1984).

そのような保存的改変ポリペプチドは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性のいずれか１つを保持している限り非保存的改変物も含まれる。このような改変タンパク質において変異を受けるアミノ酸の数は、一般的には１０アミノ酸またはそれ未満、例えば６アミノ酸またはそれ未満、例えば３アミノ酸またはそれ未満である。   Such conservatively modified polypeptides are included in the CDC45L or PIF1 protein. However, the present invention is not limited thereto, and CDC45L or PIF1 protein includes non-conservative modifications as long as it retains any one of the biological activities of CDC45L or PIF1 protein. The number of amino acids that are mutated in such modified proteins is generally 10 amino acids or less, such as 6 amino acids or less, such as 3 amino acids or less.

１つまたは複数のアミノ酸残基の付加によって改変されたタンパク質の例は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の融合タンパク質である。融合タンパク質には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と、同じく本発明において用いることができる他のペプチドまたはタンパク質との融合物が含まれる。融合タンパク質は、当業者に周知の技術によって、例えばＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子をコードするＤＮＡを、他のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡと、フレームが一致するように連結し、該融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを宿主内で発現させることによって、作製することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と融合させるペプチドまたはタンパク質については、得られる融合タンパク質がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の目的の生物学的活性のいずれか１つを保持する限り、制限はない。   An example of a protein modified by the addition of one or more amino acid residues is a fusion protein of the CDC45L or PIF1 protein. Fusion proteins include fusions of CDC45L or PIF1 protein with other peptides or proteins that can also be used in the present invention. The fusion protein is ligated to the expression vector by, for example, ligating DNA encoding a CDC45L or PIF1 gene with a DNA encoding another peptide or protein so as to coincide with the frame by techniques well known to those skilled in the art. It can be made by inserting and expressing it in a host. There is no limitation on the peptide or protein to be fused to the CDC45L or PIF1 protein as long as the resulting fusion protein retains any one of the desired biological activities of the CDC45L or PIF1 protein.

前記タンパク質と融合させるペプチドとして用いることのできる公知のペプチドには、例えばＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含む６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７タグ、ＨＳＶタグ、Ｅタグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、α−チューブリン断片、Ｂタグ、およびプロテインＣ断片等が含まれる。本発明のタンパク質と融合させることができるタンパク質の例には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が含まれる。   Known peptides that can be used as peptides to be fused with the protein include, for example, FLAG (Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)), which contains 6 His (histidine) residues. × His, 10 × His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSP-GP fragment, p18HIV fragment, T7 tag, HSV tag, E tag, SV40T antigen fragment, lck tag, α-tubulin fragment, B tag, protein C fragment and the like are included. Examples of proteins that can be fused with the protein of the present invention include GST (glutathione-S-transferase), influenza agglutinin (HA), immunoglobulin constant region, β-galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like. It is.

さらに、改変タンパク質は、多型変種、種間相同体、および、これらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされる改変タンパク質を排除しない。   Furthermore, modified proteins do not exclude polymorphic variants, interspecies homologues, and modified proteins encoded by alleles of these proteins.

機能的に同等なタンパク質を単離するための当技術分野で公知の方法には、例えばハイブリダイゼーション技術が含まれる（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）。当業者は、ヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質をコードするヒトＣＤＣ４５Ｌ ＤＮＡ配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の全体または一部と高い相同性（すなわち、配列同一性）を有するＤＮＡを容易に単離して、該単離されたＤＮＡからヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質と機能的に同等のタンパク質を単離することができる。同様に、当業者は、ヒトＰＩＦ１タンパク質をコードするヒトＰＩＦ１ ＤＮＡ配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の全体または一部と高い相同性（すなわち、配列同一性）を有するＤＮＡを容易に単離して、該単離されたＤＮＡからヒトＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等のタンパク質を単離することができる。したがって、本発明のために用いられるタンパク質には、ヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはヒトＰＩＦ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の全体または一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはヒトＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等である、タンパク質が含まれる。これらのタンパク質には、ヒトまたはマウスに由来するタンパク質に相当する哺乳動物相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ、またはウシ遺伝子によってコードされるタンパク質）が含まれる。ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはヒトＰＩＦ１遺伝子をコードするＤＮＡに対して高い相同性を有するｃＤＮＡを単離する際には、肺癌組織もしくは細胞株、または精巣由来の組織を用いることができる。   Methods known in the art for isolating functionally equivalent proteins include, for example, hybridization techniques (Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). One skilled in the art can readily isolate DNA having high homology (ie, sequence identity) with all or part of a human CDC45L DNA sequence encoding human CDC45L protein (eg, SEQ ID NO: 13) A protein functionally equivalent to the human CDC45L protein can be isolated from the isolated DNA. Similarly, those skilled in the art can readily isolate DNA having high homology (ie, sequence identity) with all or part of the human PIF1 DNA sequence encoding human PIF1 protein (eg, SEQ ID NO: 15). Thus, a protein functionally equivalent to the human PIF1 protein can be isolated from the isolated DNA. Thus, the protein used for the present invention includes DNA encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with all or part of a DNA sequence encoding human CDC45L protein or human PIF1 protein, and human CDC45L protein or Proteins that are functionally equivalent to the human PIF1 protein are included. These proteins include mammalian homologues corresponding to proteins derived from humans or mice (eg, proteins encoded by monkey, rat, rabbit, or bovine genes). When isolating cDNA having high homology to DNA encoding human CDC45L gene or human PIF1 gene, lung cancer tissue or cell line, or testis-derived tissue can be used.

ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはヒトＰＩＦ１遺伝子と機能的に同等のタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況下では異なる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、例えばバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。   Hybridization conditions for isolating DNA encoding a protein functionally equivalent to the human CDC45L gene or human PIF1 gene can be routinely selected by those skilled in the art. The phrase “stringent conditions” typically refers to a nucleic acid molecule that hybridizes to its target sequence in a complex mixture of nucleic acids but to a detectable extent to other sequences. This refers to the condition where soybeans are not used. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Extensive guidance on nucleic acid hybridization can be found in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Generally, stringent conditions are selected to be about 5-10 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength pH. Tm is the temperature (at a given ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target hybridizes in equilibrium with the target sequence (because the target sequence is present in excess) 50% of the probe is occupied in equilibrium). Stringent conditions can also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide. For selective or specific hybridization, a positive signal is at least twice background, eg, 10 times background hybridization.

例えば「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてプレハイブリダイゼーションを６８℃で３０分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加して、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行うことができる。低ストリンジェント条件とは、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。いくつかの態様では、高ストリンジェント条件が用いられる。高ストリンジェント条件とは、例えば、室温で２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行った後に、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行い、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を２回行うことである。しかしながら、いくつかの要素、例えば温度および塩濃度がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。   For example, by using “Rapid-hyb buffer” (Amersham LIFE SCIENCE), prehybridization is performed at 68 ° C. for 30 minutes or longer, a labeled probe is added, and the mixture is heated at 68 ° C. for 1 hour or longer. Hybridization can be performed. Subsequent washing steps can be performed, for example, under low stringent conditions. Low stringent conditions are, for example, 42 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS, for example, 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS. In some embodiments, high stringency conditions are used. High stringency conditions include, for example, washing 20 minutes in 2 × SSC and 0.01% SDS at room temperature three times, and then washing 20 minutes in 1 × SSC and 0.1% SDS at 37 ° C. This is performed 3 times, and 20 minutes of washing in 1 × SSC and 0.1% SDS at 50 ° C. is performed twice. However, since several factors, such as temperature and salt concentration, can affect the stringency of hybridization, one of ordinary skill in the art can appropriately select these factors to achieve the required stringency.

ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するために、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４または１６）をコードするＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３または１５）の配列情報に基づいて合成したプライマーを用いて、ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができ、プライマー配列の例は「実施例」の半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて示されている。   DNA (SEQ ID NO: 13 or 15) encoding human CDC45L or PIF1 protein (SEQ ID NO: 14 or 16) to isolate DNA encoding a protein functionally equivalent to the human CDC45L or PIF1 gene Instead of hybridization, a gene amplification method, for example, polymerase chain reaction (PCR) method can be used instead of hybridization using a primer synthesized based on the sequence information. In RT-PCR.

上記のハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されたＤＮＡによってコードされる、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性（配列同一性とも称される）を有する。「高い相同性」（「高い配列同一性」とも称される）は典型的に、最適にアラインメントした２つの配列（ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のいずれか）間の同一性の程度を指す。典型的に、高い相同性または配列同一性は、４０％またはそれ以上、例えば６０％またはそれ以上、例えば８０％またはそれ以上、例えば８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を指す。２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の相同性または同一性の程度は、以下のアルゴリズムにより決定することができる（Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb; 80 (3):726-30）。   A protein functionally equivalent to a human CDC45L or PIF1 protein encoded by DNA isolated by the hybridization technique or gene amplification technique described above is usually highly homologous to the amino acid sequence of the human CDC45L or PIF1 protein. (Also referred to as sequence identity). “High homology” (also referred to as “high sequence identity”) typically refers to the degree of identity between two sequences (either polypeptide or polynucleotide sequences) that are optimally aligned. Typically, high homology or sequence identity is 40% or more, such as 60% or more, such as 80% or more, such as 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or Refers to homology above that. The degree of homology or identity between two polypeptide or polynucleotide sequences can be determined by the following algorithm (Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci US A. 1983 Feb; 80 (3): 726-30).

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムのさらなる例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは記載されている（Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3):403-10；Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、（www.ncbi.nlm.nih.gov/における）全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合に一部の正値の閾値スコアＴと一致するかまたはこれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する段階を要する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al、前記)。これら最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための元となる。   Further examples of algorithms suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which have been described (Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5 215 (3): 403-10; Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 (17): 3389-402). Software for performing BLAST analyzes is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (at www.ncbi.nlm.nih.gov/). The algorithm first identifies short words of length W in the query sequence that match or meet some positive threshold score T when aligned with words of the same length in the database sequence. To identify a high-scoring sequence pair (HSP). T is referred to as the neighborhood word score threshold (Altschul et al, supra). These initial neighborhood word hits are the basis for initiating searches to find longer HSPs containing them.

次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一致した一対の残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアが算出される。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アラインメントスコアが、最大達成値から数Ｘだけ低下した場合；スコアが負となる１つまたは複数の残基アラインメントの累積に起因して、累積スコアがゼロ以下になった場合；あるいは、いずれか一方の配列の末端に到達した場合。   The word hits are then extended in both directions along each sequence as long as the cumulative alignment score can be increased. The cumulative score is calculated for the nucleotide sequence using parameters M (reward score for matched pair of residues; always> 0) and N (penalty score for mismatched residues; always <0). For amino acid sequences, a cumulative score is calculated using a score matrix. Word hit extension in each direction is interrupted when: The cumulative alignment score drops by a number X from the maximum achieved value; the accumulation of one or more residue alignments with negative scores Due to the cumulative score being less than or equal to zero; or reaching the end of either sequence.

ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関する）ＢＬＡＳＴＮプログラムでは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）が２８、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9）を使用する。   The BLAST algorithm parameters W, T, and X determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) uses a word length (W) of 28, an expected value (E) of 10, M = 1, N = -2, and comparison of both strands as defaults. The BLASTP program for amino acid sequences defaults to a word length (W) of 3, an expected value (E) of 10, and a BLOSUM62 score matrix (Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci US A. 1992 Nov 15; 89 (22 ): 10915-9).

本発明の文脈において有用なタンパク質には、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、これは、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）またはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の生物学的活性のいずれか１つを有する限り、本発明において有用である。   Proteins useful in the context of the present invention have differences in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, or form depending on the cell or host used to produce it or the purification method utilized. There may be. Nevertheless, this is useful in the present invention as long as it has any one of the biological activities of CDC45L protein (SEQ ID NO: 14) or PIF1 protein (SEQ ID NO: 16).

本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質およびＰＩＦ１タンパク質の部分ペプチドの使用も包含する。部分ペプチドは、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはＰＩＦ１タンパク質に特異的なアミノ酸配列を有し、約４００個未満のアミノ酸、通常は約２００個未満のアミノ酸、多くの場合には約１００個未満のアミノ酸からなり、かつ少なくとも約７アミノ酸、例えば約８アミノ酸またはそれ以上、例えば約９アミノ酸またはそれ以上からなる。   The present invention also encompasses the use of partial peptides of CDC45L protein and PIF1 protein. The partial peptide has an amino acid sequence specific for CDC45L protein or PIF1 protein, consists of less than about 400 amino acids, usually less than about 200 amino acids, often less than about 100 amino acids, and It consists of at least about 7 amino acids, such as about 8 amino acids or more, such as about 9 amino acids or more.

本発明のスクリーニングに用いられる部分ＣＤＣ４５Ｌペプチドは、少なくともＣＤＣ４５Ｌの結合ドメインを適切に含む。さらに、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＣＤＣ４５Ｌペプチドは、ＰＩＦ１結合領域を適切に含む。そのような部分ペプチドもまた、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の「機能的同等物」という語句に包含される。同様に、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＰＩＦ１ペプチドは、少なくともＰＩＦ１の結合ドメインを適切に含む。さらに、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＰＩＦ１ペプチドは、ＣＤＣ４５Ｌ結合領域を適切に含む。そのような部分ペプチドもまた、ＰＩＦ１タンパク質の「機能的同等物」という語句に包含される。   The partial CDC45L peptide used in the screening of the present invention suitably contains at least the binding domain of CDC45L. Furthermore, the partial CDC45L peptide used in the screening of the present invention suitably contains a PIF1 binding region. Such partial peptides are also encompassed by the phrase “functional equivalent” of the CDC45L protein. Similarly, the partial PIF1 peptide used in the screening of the present invention suitably includes at least a PIF1 binding domain. Furthermore, the partial PIF1 peptide used for the screening of the present invention suitably contains a CDC45L binding region. Such partial peptides are also encompassed by the phrase “functional equivalent” of the PIF1 protein.

本発明の方法に用いられるポリペプチドまたは断片は、従来の精製法により天然タンパク質として天然から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学合成によって、得ることができる。例えば、合成に採用できる従来のペプチド合成法には以下が含まれる：
（１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（３）ペプチド合成, 丸善, 1975；
（４）ペプチド合成の基礎と実験, 丸善, 1985；
（５）医薬品の開発（続 第１４巻）ペプチド合成, 広川書店, 1991；
（６）国際公開公報第９９／６７２８８号；および
（７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。 The polypeptide or fragment used in the method of the present invention can be obtained from nature as a natural protein by conventional purification methods, or by chemical synthesis based on a selected amino acid sequence. For example, conventional peptide synthesis methods that can be employed for synthesis include:
(1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(2) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(3) Peptide synthesis, Maruzen, 1975;
(4) Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen, 1985;
(5) Drug development (continued volume 14) peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991;
(6) International Publication No. 99/67288; and (7) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

あるいは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を採用して、前記タンパク質を得ることもできる(例えば、Morrison DA., et al., J Bacteriol. 1977 Oct;132(1):349-51；Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983;101:347-62）。例えば、まず、目的のタンパク質を発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換し、次に該宿主細胞を培養して、該タンパク質を産生させる。より具体的には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１をコードする遺伝子を、外来遺伝子を発現させるためのベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８に、挿入することにより、宿主（例えば、動物）細胞等で発現させる。   Alternatively, any known genetic engineering method for producing a polypeptide can be employed to obtain the protein (eg, Morrison DA., Et al., J Bacteriol. 1977 Oct; 132 (1) : 349-51; Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983; 101: 347-62). For example, first, an appropriate vector containing a polynucleotide encoding the protein of interest in a form that can be expressed (eg, downstream of a regulatory sequence including a promoter) is prepared, transformed into an appropriate host cell, and then Host cells are cultured to produce the protein. More specifically, by inserting a gene encoding CDC45L or PIF1 into a vector for expressing a foreign gene, such as pSV2neo, pcDNAI, pcDNA3.1, pCAGGS, or pCD8, ) Express in cells.

前記発現のために、プロモーターを用いることができる。例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim DW, et al. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-9）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen BR. Methods Enzymol. 1987;152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe Y, et al., Mol Cell Biol. 1988 Jan;8(1):466-72）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May;84(10):3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982;1(5):385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman RJ, et al., Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):946-58）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等を含む、一般的に用いられている任意のプロモーターを使用することができる。   A promoter can be used for the expression. For example, SV40 early promoter (Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141), EF-α promoter (Kim DW, et al. Gene. 1990 Jul 16; 91 (2): 217-23), CAG promoter (Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15; 108 (2): 193-9), RSV LTR promoter (Cullen BR. Methods Enzymol. 1987; 152: 684-704), SRα promoter (Takebe Y, et al., Mol Cell Biol. 1988 Jan; 8 (1): 466-72), CMV immediate early promoter (Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci US A. 1987 May; 84 (10): 3365-9), SV40 late promoter (Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982; 1 (5): 385-94), adenovirus late promoter (Kaufman RJ, et al , Mol Cell Biol. 1989 Mar; 9 (3): 946-58), any commonly used promoter including HSV TK promoter and the like can be used.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu G, et al., Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11;15(3):1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug;7(8):2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata MA, et al., Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25;12(14):5707-17; Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug;4(8):1641-3）、リポフェクチン法（Derijard B, et al., Cell. 1994 Mar 25;76(6):1025-37; Lamb BT, et al., Nat Genet. 1993 Sep;5(1):22-30; Rabindran SK, et al., Science. 1993 Jan 8;259(5092):230-4）等に従って、行うことができる。   Introduction of a vector into a host cell for expressing CDC45L or PIF1 gene can be performed by any method, for example, electroporation (Chu G, et al., Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11; 15 (3): 1311- 26), calcium phosphate method (Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug; 7 (8): 2745-52), DEAE dextran method (Lopata MA, et al., Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25; 12 ( 14): 5707-17; Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug; 4 (8): 1641-3), Lipofectin method (Derijard B, et al., Cell. 1994 Mar 25; 76 (6) : 1025-37; Lamb BT, et al., Nat Genet. 1993 Sep; 5 (1): 22-30; Rabindran SK, et al., Science. 1993 Jan 8; 259 (5092): 230-4) etc. Can be done according to.

インビトロ翻訳系を用いて、前記タンパク質をインビトロで作製することもできる。   The protein can also be produced in vitro using an in vitro translation system.

本発明の文脈において、「ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子」という語句は、ヒトＣＤＣ４５Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の機能的同等物のいずれかを包含する。同様に、「ＰＩＦ１遺伝子」という語句は、ヒトＰＩＦ１をコードするポリヌクレオチド、またはヒトＰＩＦ１遺伝子の機能的同等物のいずれかを包含する。   In the context of the present invention, the phrase “CDC45L gene” encompasses either a polynucleotide encoding human CDC45L or a functional equivalent of the human CDC45L gene. Similarly, the phrase “PIF1 gene” encompasses either a polynucleotide encoding human PIF1 or a functional equivalent of the human PIF1 gene.

ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子は、従来のクローニング法により天然タンパク質として天然から、または選択されたヌクレオチド配列に基づいて化学合成によって、得ることができる。ｃＤＮＡライブラリ等を用いて遺伝子をクローニングするための方法は、当技術分野において周知である。   The CDC45L gene and the PIF1 gene can be obtained from nature as natural proteins by conventional cloning methods or by chemical synthesis based on selected nucleotide sequences. Methods for cloning genes using cDNA libraries and the like are well known in the art.

（２）抗体
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、かつ所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。 (2) Antibody The term “antibody” as used herein is intended to include immunoglobulins and fragments thereof that specifically react with the designated protein or peptide thereof. Antibodies can include human antibodies, primatized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, humanized antibodies, antibodies fused with other proteins or radiolabels, and antibody fragments. Furthermore, antibodies are used herein in a broad sense, specifically, intact monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) formed from at least two intact antibodies. Antibody fragments are included so long as they include and exhibit the desired biological activity. “Antibody” refers to all classes (eg, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM).

本発明は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を使用してもよい。これらの抗体は、肺癌の診断に有用であり得る。さらに本発明は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドまたはＰＩＦポリペプチドの部分ペプチドに対する抗体を使用してもよい。   The present invention may use an antibody against CDC45L protein or PIF1 protein. These antibodies can be useful for the diagnosis of lung cancer. Furthermore, the present invention may use an antibody against a partial peptide of CDC45L polypeptide or PIF polypeptide.

以下に記載するスクリーニング法では、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドのＰＩＦ結合領域、またはＰＩＦ１ポリペプチドのＣＤＣ４５Ｌ結合領域に対する抗体が好ましく用いられ得る。これらの抗体は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドの間の相互作用、例えば結合を阻害および／または阻止するために有用であり得、かつ、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を（過剰）発現するがん、例えば肺癌を治療および／または予防するのに有用であり得る。これらの抗体は、公知の方法によって提供される。本発明において用いられる抗体を作製するための技術については、従来の方法を用いることができる。   In the screening methods described below, an antibody against the PIF binding region of the CDC45L polypeptide or the CDC45L binding region of the PIF1 polypeptide can be preferably used. These antibodies may be useful for inhibiting and / or blocking interactions between CDC45L and PIF1 polypeptides, such as binding, and cancers that (over) express CDC45L and / or PIF1, For example, it may be useful for treating and / or preventing lung cancer. These antibodies are provided by known methods. As a technique for producing the antibody used in the present invention, a conventional method can be used.

（３）二本鎖分子
本明細書で用いる場合、「二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、これには例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））が含まれる。 (3) Double-stranded molecule As used herein, the term “double-stranded molecule” refers to a nucleic acid molecule that inhibits the expression of a target gene, including, for example, small interfering RNA (siRNA; Double stranded ribonucleic acid (dsRNA) or small hairpin RNA (shRNA)) and small interfering DNA / RNA (siD / R-NA; eg, DNA and RNA double stranded chimera (dsD / R-NA) or DNA And RNA small hairpin chimeras (shD / R-NA)).

本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列に対応するリボヌクレオチド（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列に対応するリボヌクレオチド（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築することができる。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。   As used herein, the term “siRNA” refers to a double-stranded RNA molecule that prevents translation of a target mRNA. Standard techniques for introducing siRNA into cells are used, including techniques where the template for RNA transcription is DNA. siRNA includes a ribonucleotide corresponding to the sense nucleic acid sequence of the target gene (also referred to as “sense strand”), a ribonucleotide corresponding to the antisense nucleic acid sequence of the target gene (also referred to as “antisense strand”), Or both. SiRNA can be constructed such that a single transcript has both a sense nucleic acid sequence of the target gene and a complementary antisense nucleic acid sequence, eg, a hairpin. The siRNA can be either dsRNA or shRNA.

本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列を含み、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。本発明において、二本鎖ＲＮＡ分子はまた、ｓｉＲＮＡ、すなわち低分子干渉ＲＮＡも指してもよい。２本の鎖の配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含むことができる。   As used herein, the term “dsRNA” refers to a construct of two RNA molecules that contain complementary sequences to each other and are annealed together through complementary sequences to form a double-stranded RNA molecule. Point to. In the present invention, double-stranded RNA molecules may also refer to siRNA, ie small interfering RNA. The double-stranded sequence includes not only “sense” or “antisense” RNA selected from the protein coding sequence of the target gene sequence, but also RNA molecules having nucleotide sequences selected from non-coding regions of the target gene. be able to.

本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。   As used herein, the term “shRNA” refers to a siRNA having a stem-loop structure comprising a first region and a second region that are complementary to each other, ie, a sense strand and an antisense strand. The degree of region complementarity and orientation is sufficient for base pairing to occur between the regions, the first and second regions being joined by a loop region, the loop comprising nucleotides within the loop region. Caused by a lack of base pairing between (or nucleotide analogues). The loop region of shRNA is a single-stranded region interposed between the sense strand and the antisense strand, and may also be referred to as “intervening single strand”.

本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドとＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有できるものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。   As used herein, the term “siD / R-NA” refers to a double-stranded molecule consisting of both RNA and DNA, including RNA and DNA hybrids and chimeras, which interfere with the translation of the target mRNA. In this specification, hybrid means a molecule in which an oligonucleotide consisting of DNA and an oligonucleotide consisting of RNA hybridize with each other to form a double-stranded molecule, while chimera constitutes a double-stranded molecule. One or both of the strands to be able to contain RNA and DNA. Standard techniques for introducing siD / R-NA into cells are used. The siD / R-NA includes a sense nucleic acid sequence of a target gene (also referred to as “sense strand”), an antisense nucleic acid sequence of a target gene (also referred to as “antisense strand”), or both. SiD / R-NA can be constructed such that a single transcript has both a sense and complementary antisense nucleic acid sequence from the target gene, such as a hairpin. The siD / R-NA can be either dsD / R-NA or shD / R-NA.

本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列を含み、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。   The term “dsD / R-NA” as used herein includes two sequences that include complementary sequences to each other and are annealed together through complementary sequences to form a double-stranded polynucleotide molecule. Refers to a molecular construct. A polynucleotide having a nucleotide sequence selected from a non-coding region of the target gene as well as a “sense” or “antisense” polynucleotide sequence selected from the protein coding sequence of the target gene sequence. May also be included. One or both of the two molecules that make up the dsD / R-NA are composed of both RNA and DNA (chimeric molecule), or alternatively one molecule is composed of RNA and the other is composed of DNA Constructed (hybrid duplex).

本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。   As used herein, the term “shD / R-NA” has a stem-loop structure that includes a first region and a second region that are complementary to each other, ie, a sense strand and an antisense strand. Refers to siD / R-NA. The degree of region complementarity and orientation is sufficient for base pairing to occur between the regions, the first region and the second region being joined by a loop region, the loop comprising nucleotides within the loop region. Caused by a lack of base pairing between (or nucleotide analogues). The loop region of shD / R-NA is a single-stranded region interposed between the sense strand and the antisense strand, and may also be referred to as “intervening single strand”.

（ｉ）標的配列
本明細書で用いられる「標的配列」という用語は、標的遺伝子を発現する細胞に該配列を標的とする二本鎖分子が導入された場合に、該標的遺伝子のｍＲＮＡ全体の翻訳の抑制をもたらす、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列である。標的配列に相当する配列を含む二本鎖分子が、標的遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合に、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列および３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）からなってよい。 (I) Target sequence As used herein, the term "target sequence" refers to the entire mRNA of a target gene when a double-stranded molecule targeting the sequence is introduced into a cell that expresses the target gene. A nucleotide sequence within the mRNA or cDNA sequence of a target gene that results in translational repression. When a double-stranded molecule containing a sequence corresponding to the target sequence inhibits the expression of the gene in a cell expressing the target gene, the nucleotide sequence in the mRNA or cDNA sequence of the target gene is the target sequence Can be determined. A double-stranded polynucleotide that suppresses gene expression may consist of a target sequence and a 3 ′ overhang (eg, uu).

標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、標的配列を規定するために、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖、すなわちｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列に変換された配列が用いられる。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖、および該標的配列に対する相補配列を有するアンチセンス鎖から構成され、アンチセンス鎖はセンス鎖と相補配列においてハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。   When the target sequence is indicated by a cDNA sequence, the sense strand of double stranded cDNA, ie a sequence in which the mRNA sequence is converted to a DNA sequence, is used to define the target sequence. The double-stranded molecule is composed of a sense strand having a sequence corresponding to the target sequence and an antisense strand having a complementary sequence to the target sequence, and the antisense strand hybridizes in the complementary sequence with the sense strand, Form molecules.

本明細書において、「〜に相当する」という語句は、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて標的配列を変換することを意味する。例えば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合には、該ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は塩基「ｕ」に置き換えられる。一方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合には、該ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は塩基「ｔ」に置き換えられる。例えば、標的配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖が、ＤＮＡで構成される３'側半分の領域を有する場合、「標的配列に相当する配列」は「５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＴＣＡＡＧＴＣ−３'」である。   In the present specification, the phrase “corresponding to” means that the target sequence is converted according to the type of nucleic acid constituting the sense strand of the double-stranded molecule. For example, when the target sequence is represented by a DNA sequence and the sense strand of a double-stranded molecule has an RNA region, the base “t” in the RNA region is replaced with the base “u”. On the other hand, when the target sequence is represented by an RNA sequence and the sense strand of the double-stranded molecule has a DNA region, the base “u” in the DNA region is replaced with the base “t”. For example, when the target sequence is represented by the RNA sequence of SEQ ID NO: 9 and the sense strand of the double-stranded molecule has a 3 ′ half region composed of DNA, the “sequence corresponding to the target sequence” is “5′-GCAAACACCUGCTCAAGTC-3 ′”.

同様に、二本鎖分子のアンチセンス鎖に関して、標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて規定され得る。例えば、標的配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のアンチセンス鎖が、ＤＮＡで構成される５'側半分の領域を有する場合には、「標的配列に対する相補配列」は「３'−ＣＧＵＵＵＧＵＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＧ−５'」である。   Similarly, with respect to the antisense strand of a double-stranded molecule, a complementary sequence to the target sequence can be defined depending on the type of nucleic acid constituting the antisense strand. For example, when the target sequence is represented by the RNA sequence of SEQ ID NO: 9 and the antisense strand of the double-stranded molecule has a 5 ′ half region composed of DNA, “complementary sequence to the target sequence” Is “3′-CGUUUGUGGACGGAGTTCAG-5 ′”.

一方、二本鎖分子がＲＮＡで構成される場合には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の標的配列に相当する配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のＲＮＡ配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の標的配列に相当する相補配列は、「３'−ＣＧＵＵＵＧＵＧＧＡＣＧＡＧＵＵＣＡＧ−５'」のＲＮＡ配列である。   On the other hand, when the double-stranded molecule is composed of RNA, the sequence corresponding to the target sequence of SEQ ID NO: 9 is the RNA sequence of SEQ ID NO: 9, and corresponds to the target sequence of SEQ ID NO: 9. The complementary sequence is the RNA sequence of “3′-CGUUUGUGGACGGAGUUCAG-5 ′”.

二本鎖分子は、標的配列に相当する配列およびそれに対する相補配列に加えて、２〜５ヌクレオチド長を有する１つもしくは２つの３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）、および／または、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結してヘアピン構造を形成するループ配列を有してよい。   A double-stranded molecule has one or two 3 ′ overhangs (eg, uu) having a length of 2-5 nucleotides and / or a sense strand in addition to the sequence corresponding to the target sequence and its complementary sequence. It may have a loop sequence that links the antisense strand to form a hairpin structure.

ＣＤＣ４５Ｌ ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写物と会合し、それによって翻訳を妨害し、したがってＣＤＣ４５Ｌタンパク質の発現を阻害することにより、該遺伝子によってコードされるＣＤＣ４５Ｌタンパク質の産生を阻害または低減する。同様に、ＰＩＦ１ ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写物と会合し、それによって翻訳を妨害し、したがってＰＩＦ１タンパク質の発現を阻害することにより、該遺伝子によってコードされるＰＩＦ１タンパク質の産生を阻害または低減する。   A double-stranded molecule to the CDC45L gene that hybridizes to the CDC45L mRNA associates with the normally single-stranded mRNA transcript of the gene, thereby preventing translation and thus inhibiting expression of the CDC45L protein, Inhibits or reduces the production of the CDC45L protein encoded by the gene. Similarly, a double-stranded molecule to the PIF1 gene that hybridizes with PIF1 mRNA associates with the normally single-stranded mRNA transcript of the gene, thereby preventing translation and thus inhibiting expression of the PIF1 protein. Thereby inhibiting or reducing the production of the PIF1 protein encoded by the gene.

癌細胞株におけるＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子の発現は、それぞれ２種類の二本鎖分子によって阻害された（図３および図５）。   Expression of CDC45L gene and PIF1 gene in cancer cell lines was inhibited by two types of double-stranded molecules, respectively (FIGS. 3 and 5).

したがって本発明は、細胞に導入された場合にがん細胞においてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害するかまたは低下させる特性を有する、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下に記載するｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムにより設計することができる。   Accordingly, the present invention provides an isolated double-stranded molecule that has the property of inhibiting or reducing the expression of the CDC45L gene or PIF1 gene in cancer cells when introduced into the cell. The target sequence of the double-stranded molecule can be designed by the siRNA design algorithm described below.

好ましい態様において、ＣＤＣ４５Ｌの標的配列には、例えば、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）または
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
が含まれる。 In a preferred embodiment, the CDC45L target sequence includes, for example:
5'-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3 '(SEQ ID NO: 9) or 5'-GGACUGGAUGCUCUGUGU-3' (SEQ ID NO: 10)
Is included.

同様に、好ましい態様において、ＰＩＦ１の標的配列には、例えば、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）または
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
が含まれる。 Similarly, in a preferred embodiment, the target sequence of PIF1 includes, for example:
5'-GAAAGGCCAGAGCAUCUCUC-3 '(SEQ ID NO: 11) or 5'-GGCAUGACCCCUGGAUUGUG-3' (SEQ ID NO: 12)
Is included.

言い換えれば、本発明はまた、標的配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２を含むかまたはそれらからなる、二本鎖分子も提供する。   In other words, the present invention also provides a double stranded molecule wherein the target sequence comprises or consists of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12.

具体的には、本発明は以下の二本鎖分子［１］〜［１８］を提供する：
［１］細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現ならびに細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、二本鎖分子；
［２］細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現ならびに細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子；。
［３］標的配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３または１５より選択されるヌクレオチド配列に由来する約１９〜約２５個の連続したヌクレオチドを含む、［１］または［２］の二本鎖分子。
［４］約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［２］のいずれか１つの二本鎖分子。
［５］約７５ヌクレオチド長未満である、［４］の二本鎖分子。
［６］約５０ヌクレオチド長未満である、［５］の二本鎖分子。
［７］約２５ヌクレオチド長未満である、［６］の二本鎖分子。
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［７］の二本鎖分子。
［９］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一オリゴヌクレオチドからなる、［１］〜［８］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１０］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、
［９］の二本鎖分子。
［１１］ＲＮＡを含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［１１］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１２］の二本鎖分子。
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１３］の二本鎖分子。
［１５］ＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１２］の二本鎖分子。
［１６］センス鎖における標的配列の５'末端領域、および／または、アンチセンス鎖における標的配列の相補配列の３'末端領域がＲＮＡからなる、［１５］の二本鎖分子。
［１７］ＲＮＡ領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［１６］の二本鎖分子；ならびに
［１８］１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２］のいずれか１つの二本鎖分子。 Specifically, the present invention provides the following double-stranded molecules [1] to [18]:
[1] An isolated double-stranded molecule that inhibits in vivo expression of CDC45L gene or PIF1 gene as well as cell proliferation when introduced into cells, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, A double-stranded molecule acting on an mRNA that matches a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12;
[2] An isolated double-stranded molecule that, when introduced into a cell, inhibits in vivo expression of the CDC45L gene or PIF1 gene as well as cell proliferation, wherein the double-stranded molecules hybridize to each other. A sense strand comprising a double-stranded molecule and an antisense strand complementary thereto, the sense strand comprising SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12 An isolated double-stranded molecule comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group;
[3] The double-stranded molecule of [1] or [2], wherein the target sequence comprises about 19 to about 25 consecutive nucleotides derived from a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 13 or 15.
[4] The double-stranded molecule of any one of [1] to [2], which is less than about 100 nucleotides in length.
[5] The double-stranded molecule of [4], which is less than about 75 nucleotides in length.
[6] The double-stranded molecule according to [5], which is less than about 50 nucleotides in length.
[7] The double-stranded molecule according to [6], which is less than about 25 nucleotides in length.
[8] The double-stranded molecule of [7], which is about 19 to about 25 nucleotides in length.
[9] The double-stranded molecule according to any one of [1] to [8], comprising a single oligonucleotide comprising both a sense strand and an antisense strand linked by an intervening single strand.
[10] General formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′
Have
[A] is a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12;
[B] is an intervening single strand; and [A ′] is an antisense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a sequence complementary to the target sequence selected in [A].
[9] The double-stranded molecule.
[11] The double-stranded molecule of any one of [1] to [10], comprising RNA.
[12] The double-stranded molecule of any one of [1] to [11], comprising both DNA and RNA.
[13] The double-stranded molecule according to [12], which is a hybrid of a DNA polynucleotide and an RNA polynucleotide.
[14] The double-stranded molecule according to [13], wherein the sense strand and the antisense strand are prepared from DNA and RNA, respectively.
[15] The double-stranded molecule according to [12], which is a chimera of DNA and RNA.
[16] The double-stranded molecule according to [15], wherein the 5 ′ terminal region of the target sequence in the sense strand and / or the 3 ′ terminal region of the complementary sequence of the target sequence in the antisense strand is composed of RNA.
[17] The double-stranded molecule of [16], wherein the RNA region consists of 9 to 13 nucleotides; and [18] any one of [1] to [2], comprising one or two 3 ′ overhangs Double-stranded molecule.

本発明の二本鎖分子について、以下でより詳細に説明する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。）例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、（www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlにおける）Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから利用可能である。 The double-stranded molecule of the present invention is described in more detail below.
Methods for designing double-stranded molecules having the ability to inhibit target gene expression in cells are known. (See, eg, US Pat. No. 6,506,559, which is incorporated herein by reference in its entirety.) For example, a computer program for designing siRNAs can be found at (www.ambion.com/techlib Available from the Ambion website (in /misc/siRNA_finder.html).

コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。   The computer program selects the target nucleotide sequence for the double-stranded molecule based on the following protocol.

標的部位の設計
１． 転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡおよび３'側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。Ｔｕｓｃｈｌらは、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するｓｉＲＮＡの設計を避けることを推奨した。
２．潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上で得られるＢＬＡＳＴを使用する（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402）。
３．合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。 Target site design Search downstream for AA dinucleotide sequences, starting with the AUG start codon of the transcript. Record the occurrence of individual AA and the 3 ′ adjacent 19 nucleotides as potential siRNA target sites. Tuschl et al. That the 5 'and 3' untranslated regions (UTR) and regions near the start codon (within 75 bases) may have more regulatory protein binding sites, and UTR binding proteins and / or translation initiation. It was recommended to avoid design of siRNA against these as the complex may prevent binding of the siRNA endonuclease complex.
2. Potential target sites are compared to the appropriate genomic database (human, mouse, rat, etc.) and all target sequences that have significant homology with other coding sequences are excluded from consideration. Basically, BLAST obtained on the NCBI server at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ is used (Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 (17): 3389 -402).
3. A target sequence that is eligible for synthesis is selected. It is common to select and evaluate several target sequences along the length of the gene.

「実施例」において設計されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の好ましい標的配列には、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）または
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
が含まれる。 Preferred target sequences of the CDC45L gene designed in the “Examples” include
5'-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3 '(SEQ ID NO: 9) or 5'-GGACUGGAUGCUCUGUGU-3' (SEQ ID NO: 10)
Is included.

同様に、「実施例」において設計されたＰＩＦ１遺伝子の好ましい標的配列には、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）または
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
が含まれる。 Similarly, preferred target sequences of the PIF1 gene designed in “Examples” include:
5'-GAAAGGCCAGAGCAUCUCUC-3 '(SEQ ID NO: 11) or 5'-GGCAUGACCCCUGGAUUGUG-3' (SEQ ID NO: 12)
Is included.

具体的には、本発明は、標的遺伝子を発現するがん細胞の増殖を阻害および低減する能力についてそれぞれ検討された上記の標的配列のいずれか1つを標的とする二本鎖分子を提供する。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する癌細胞の増殖は、本発明の二本鎖分子によって阻害および低減された(図３および図５)。   Specifically, the present invention provides a double-stranded molecule that targets any one of the above target sequences, each examined for the ability to inhibit and reduce the growth of cancer cells that express the target gene. . The growth of cancer cells expressing the CDC45L gene or the PIF1 gene was inhibited and reduced by the double-stranded molecule of the present invention (FIGS. 3 and 5).

したがって本発明は、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）および
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
からなる群より選択されるCDC45L遺伝子の標的配列を標的とする二本鎖分子を提供する。 Therefore, the present invention
5'-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5'-GGACUGGAUGCUCUGUGU-3' (SEQ ID NO: 10)
A double-stranded molecule targeting a target sequence of a CDC45L gene selected from the group consisting of:

同様に、本発明は、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）および
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
からなる群より選択されるＰＩＦ１遺伝子の標的配列を標的とする二本鎖分子を提供する。 Similarly, the present invention
5′-GAAAGGCCAGAGCAUCUCUC-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and 5′-GGAAUGACCCCUGGAUUGUG-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
A double-stranded molecule targeting a target sequence of a PIF1 gene selected from the group consisting of:

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の上記の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列のいずれか１つおよび／または該標的配列に対する相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を標的とする二本鎖分子の例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列、およびそれに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上記の核酸配列における軽微な改変は許容される。本明細書において、核酸配列における「軽微な改変」とは、該配列に対する１個、２個、または数個の核酸の置換、欠失、付加、または挿入を示す。   An isolated polynucleotide, wherein the double-stranded molecule of the present invention targeting the above target sequence of the CDC45L or PIF1 gene comprises any one of the nucleic acid sequences of the target sequence and / or a complementary sequence to the target sequence including. Examples of double stranded molecules targeting the CDC45L or PIF1 gene include oligonucleotides comprising sequences corresponding to SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12, and complementary sequences thereto. However, the present invention is not limited to these examples, and as long as the modified molecule retains the ability to suppress the expression of the CDC45L or PIF1 gene, minor modifications in the above nucleic acid sequences are allowed. As used herein, “minor modification” in a nucleic acid sequence refers to one, two, or several nucleic acid substitutions, deletions, additions, or insertions relative to the sequence.

１つの態様において、二本鎖分子は２つのポリヌクレオチドから構成され、一方のポリヌクレオチドは標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖を有し、もう一方のポリペプチドは該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。   In one embodiment, the double-stranded molecule is composed of two polynucleotides, one polynucleotide having a sequence corresponding to the target sequence, i.e., the sense strand, and the other polypeptide being a complementary sequence to the target sequence, That is, it has an antisense strand. The sense strand polynucleotide and the antisense strand polynucleotide hybridize with each other to form a double-stranded molecule. Examples of such double stranded molecules include dsRNA and dsD / R-NA.

別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖と、該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖の両方を有するポリヌクレオチドから構成される。一般的に、センス鎖とアンチセンス鎖は介在鎖によって連結され、互いにハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。   In another embodiment, the double-stranded molecule is composed of a polynucleotide having both a sequence corresponding to the target sequence, i.e., the sense strand, and a complementary sequence, i.e., the antisense strand, to the target sequence. Generally, a sense strand and an antisense strand are connected by an intervening strand and hybridize with each other to form a hairpin loop structure. Examples of such double stranded molecules include shRNA and shD / R-NA.

言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチド、および該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。該ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がＲＮＡであってもよく、標的配列がＤＮＡ配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「ｔ」は「ｕ」に置き換えられる。   In other words, the double-stranded molecule of the present invention includes a sense strand polynucleotide having a nucleotide sequence of a target sequence, and an antisense strand polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the target sequence, and both polynucleotides hybridize to each other. Soybeans form double-stranded molecules. In a double-stranded molecule comprising the polynucleotide, part of one or both polynucleotides of the strand may be RNA, and if the target sequence is defined by a DNA sequence, the target sequence and its complement Nucleotide “t” in the sequence is replaced by “u”.

本発明の１つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成されるステムループ構造を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、ループによって結合され得る。したがって本発明はまた、介在一本鎖によって連結されたかまたは介在一本鎖が隣接しているセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子も提供する。   In one embodiment of the invention, such a double-stranded molecule of the invention comprises a stem loop structure composed of a sense strand and an antisense strand. The sense strand and the antisense strand can be joined by a loop. Thus, the present invention also provides a double-stranded molecule comprising a single polynucleotide comprising both a sense strand and an antisense strand joined by or intervening by an intervening single strand.

本発明において、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を標的とする二本鎖分子は、標的配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２より選択される配列を有し得る。したがって、本発明の二本鎖分子の好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列およびそれに対する相補配列において互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列およびそれに対する相補配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。   In the present invention, a double-stranded molecule targeting the CDC45L gene or PIF1 gene may have a sequence selected from SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12 as a target sequence. Accordingly, preferred examples of the double-stranded molecule of the present invention include polynucleotides that hybridize to each other in a sequence corresponding to SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12 and a complementary sequence thereto, and SEQ ID NO: Polynucleotides having sequences corresponding to 9, 10, 11, or 12 and complementary sequences thereto are included.

本発明に従って、本発明の二本鎖分子を、実施例において利用される方法を用いてその能力について試験することができる（「実施例」におけるＲＮＡ干渉アッセイを参照されたい）。実施例では、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を、標準的な方法に従って、（例えば、ＳＢＣ−３およびＡ５４９を用いて）癌細胞株におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生を低減させる能力についてインビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞と比較した、該候補分子と接触させた細胞におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の減少を、例えば、記載されるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子ｍＲＮＡに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって、検出することができる（「実施例」の（ｂ）半定量的ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。次に、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生を低減させる配列を、細胞増殖に対する阻害効果について試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いてインビボでの能力について試験し、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。   In accordance with the present invention, the double-stranded molecules of the present invention can be tested for their ability using the methods utilized in the Examples (see RNA Interference Assay in “Examples”). In the examples, double-stranded molecules comprising the sense strand of various parts of the mRNA of the CDC45L or PIF1 gene and the antisense strand complementary thereto are prepared according to standard methods (eg, using SBC-3 and A549). ) Tested in vitro for the ability to reduce the production of CDC45L or PIF1 gene products in cancer cell lines. Further, for example, using a primer for a CDC45L or PIF1 gene mRNA as described, for example, a decrease in the CDC45L or PIF1 gene product in cells contacted with the candidate molecule compared to cells cultured in the absence of the candidate molecule. It can be detected by RT-PCR (see (b) Semi-quantitative RT-PCR in "Examples"). Next, sequences that reduce the production of CDC45L or PIF1 gene products in in vitro cell-based assays can be tested for inhibitory effects on cell proliferation. Subsequently, sequences that inhibit cell proliferation in in vitro cell-based assays were tested for in vivo capacity using animals with cancer, such as nude mouse xenograft models, to reduce production of CDC45L or PIF1 gene products and The reduction of cancer cell proliferation can be confirmed.

単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合できる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。一部の態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。   When the isolated polynucleotide is RNA or a derivative thereof, the base “t” shall be replaced with “u” in the nucleotide sequence. As used herein, the term “complementarity” refers to Watson-Crick or Hoogsteen-type base pairing between nucleotide units of a polynucleotide, and the term “binding” is between two polynucleotides. Means a physical or chemical interaction. If the polynucleotide contains modified nucleotides and / or non-phosphorylated diester linkages, these polynucleotides can also bind to each other in the same way. In general, complementary polynucleotide sequences will hybridize under appropriate conditions to form a stable duplex with little or no mismatch. Furthermore, the sense strand and the antisense strand of the isolated polynucleotide of the present invention can form a double-stranded molecule or a hairpin loop structure by hybridization. In one embodiment, such duplexes contain no more than 1 mismatch per 10 matches. In some embodiments, such duplexes do not contain mismatches if the duplex strands are fully complementary.

本発明のポリヌクレオチドは典型的に、５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子を形成するため、または、二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するために有用である。二本鎖分子を形成するためにポリヌクレオチドを使用する場合、該ポリヌクレオチドのセンス鎖は１９ヌクレオチドより長くてよく、例えば２１ヌクレオチドより長くてよく、例えば約１９〜２５ヌクレオチド長であってよい。   The polynucleotides of the present invention are typically less than 500, 200, 100, 75, 50, or 25 nucleotides long. The isolated polynucleotide of the present invention is useful for forming a double-stranded molecule against the CDC45L or PIF1 gene or for preparing a template DNA encoding the double-stranded molecule. When using a polynucleotide to form a double-stranded molecule, the sense strand of the polynucleotide may be longer than 19 nucleotides, such as longer than 21 nucleotides, such as about 19-25 nucleotides long.

したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。   The invention thus provides a double-stranded molecule comprising a sense strand and an antisense strand, the sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to the target sequence. In a preferred embodiment, the sense strand hybridizes with the antisense strand at the target sequence to form a double stranded molecule having a length of 19-25 nucleotide pairs.

二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にＲＩＳＣ複合体のｍＲＮＡにおける相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的ＲＮＡはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列を用いてだけでなく、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を用いても示すことができる。   The double-stranded molecule serves as a guide for identifying homologous sequences in the mRNA of the RISC complex when the double-stranded molecule is introduced into the cell. The identified target RNA is cleaved and degraded by Dicer's nuclease activity, which ultimately reduces or inhibits production (expression) of the polypeptide encoded by the RNA. Accordingly, the double-stranded molecule of the present invention can be defined by the ability to generate a single strand that specifically hybridizes under stringent conditions with CDC45L or PIF1 gene mRNA. As used herein, the portion of mRNA that hybridizes to a single strand generated from a double stranded molecule is referred to as a “target sequence” or “target nucleic acid” or “target nucleotide”. In the present invention, the nucleotide sequence of the “target sequence” can be shown not only using the RNA sequence of mRNA but also using the DNA sequence of cDNA synthesized from the mRNA.

本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有することができる。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）が含まれる。   The double-stranded molecules of the present invention can contain one or more modified nucleotides and / or non-phosphorylated diester bonds. Chemical modifications well known in the art can increase the stability, availability and / or cellular uptake of double-stranded molecules. Those skilled in the art will also recognize other types of chemical modifications that can be incorporated into the molecules of the invention (WO 03/070744, WO 2005/045037). In one aspect, modifications can be used to provide improved degradation resistance or improved uptake. Examples of such modifications include phosphorothioate linkages, 2′-O-methyl ribonucleotides (especially on the sense strand of double stranded molecules), 2′-deoxy-fluoro ribonucleotides, 2′-deoxy ribonucleotides, “universal Incorporation of “universal base” nucleotides, 5′-C-methyl nucleotides, and inverted deoxybasic residues (US Patent Application No. 20060122137).

別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾には、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）。   In another embodiment, modifications can be used to improve the stability of double-stranded molecules or to increase targeting efficiency. Modifications include chemical cross-linking between two complementary strands of a double-stranded molecule, chemical modification of the 3 ′ or 5 ′ end of a strand of a double-stranded molecule, sugar modification, nucleobase modification and / or backbone modification, 2 -Fluoro-modified ribonucleotides and 2'-deoxyribonucleotides are included (WO 2004/029212).

別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様において、該二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換することができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらなる詳細については、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が入手可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。   In another embodiment, modifications can be used to increase or decrease the affinity for complementary nucleotides in the target mRNA and / or in the complementary double stranded molecular strand (WO 2005/044976). For example, unmodified pyrimidine nucleotides can be replaced with 2-thiopyrimidine, 5-alkynylpyrimidine, 5-methylpyrimidine, or 5-propynylpyrimidine. Furthermore, unmodified purines can be replaced with 7-deazapurines, 7-alkylpurines, or 7-alkenylpurines. In another embodiment, if the double-stranded molecule is a double-stranded molecule with a 3 ′ overhang, the 3 ′ terminal nucleotide overhanging nucleotide can be replaced with deoxyribonucleotides (Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15 (2): 188-200). For further details, published literature is available, eg, US Patent Application No. 20060234970. The present invention is not limited to these examples, and any known chemical modification can be utilized for the double-stranded molecule of the present invention as long as the resulting molecule retains the ability to inhibit target gene expression. can do.

さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）で作製されたハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。   Furthermore, the double-stranded molecules of the invention can include both DNA and RNA (eg, dsD / R-NA or shD / R-NA). In particular, hybrid polynucleotides of DNA and RNA strands or DNA-RNA chimeric polynucleotides exhibit increased stability. A mixture of DNA and RNA, ie, a hybrid double-stranded molecule made of DNA strand (polynucleotide) and RNA strand (polynucleotide), or both DNA and RNA in one or both strands (polynucleotide) Including chimeric double-stranded molecules and the like can be formed to improve the stability of the double-stranded molecules. As long as the hybrid of the DNA strand and the RNA strand has an activity of inhibiting the expression of the gene when introduced into a cell expressing the target gene, the sense strand is DNA and the antisense strand is RNA, Or the opposite may be sufficient.

一部の態様において、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造を有し得る。一部の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有するが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。キメラ型二本鎖分子の一例として、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。   In some embodiments, the sense strand polynucleotide is DNA and the antisense strand polynucleotide is RNA. In addition, a chimeric double-stranded molecule has a structure in which both the sense strand and the antisense strand are composed of DNA and RNA as long as it has an activity of inhibiting the expression of a target gene when introduced into a cell that expresses the gene, or sense Either one of the strand and the antisense strand may have a structure consisting of DNA and RNA. In some embodiments, to improve the stability of a double-stranded molecule, the molecule contains as much DNA as possible, but sufficient inhibition of expression is required to induce inhibition of target gene expression. It is necessary that the molecule is RNA within the range that induces. As an example of a chimeric double-stranded molecule, the upstream partial region of the double-stranded molecule (ie, the region adjacent to the target sequence or its complementary sequence in the sense strand or antisense strand) is RNA.

上流部分領域とは、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を意味する。即ち、一部の態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５'−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−５'：アンチセンス鎖。 The upstream partial region means the 5 ′ side (5 ′ end) of the sense strand and the 3 ′ side (3 ′ end) of the antisense strand. That is, in some embodiments, both the region adjacent to the 3 ′ end of the antisense strand, or the region adjacent to the 5 ′ end of the sense strand and the region adjacent to the 3 ′ end of the antisense strand are both from RNA. Become. For example, the chimeric or hybrid double-stranded molecule of the present invention includes the following combinations.
Sense strand: 5 ′-[DNA] -3 ′
3 ′-(RNA)-[DNA] -5 ′: antisense strand,
Sense strand: 5 ′-(RNA)-[DNA] -3 ′
3 ′-(RNA)-[DNA] -5 ′: antisense strand and sense strand: 5 ′-(RNA)-[DNA] -3 ′
3 ′-(RNA) -5 ′: antisense strand.

上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて約９〜１３ヌクレオチドのドメインであり得る。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。   The upstream subregion can be a domain of about 9-13 nucleotides, counting from the end of the target sequence or its complementary sequence, within the sense or antisense strand of the double-stranded molecule. Furthermore, examples of such chimeric double-stranded molecules include at least the upstream half region of the polynucleotide (the 5 ′ region in the sense strand and the 3 ′ region in the antisense strand) is RNA and the other half is DNA having a length of 19 to 21 nucleotides is included. In such a chimeric double-stranded molecule, when the entire antisense strand is RNA, the effect of inhibiting the expression of the target gene is considerably increased (US Patent Application No. 20050004064).

本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡで作製されたショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機序によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。   In the present invention, the double-stranded molecule may form a hairpin such as a short hairpin RNA (shRNA) and a short hairpin (shD / R-NA) made of DNA and RNA. shRNA or shD / R-NA is a sequence of RNA or a mixture of RNA and DNA that creates tight hairpin turns that can be used to silence gene expression via RNA interference. The shRNA or shD / R-NA includes a sense target sequence and an antisense target sequence on a single strand, and these sequences are separated by a loop sequence. In general, the hairpin structure is cleaved by cellular mechanisms to become dsRNA or dsD / R-NA, which subsequently binds to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNA that matches the target sequence of dsRNA or dsD / R-NA.

ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２からなる群より選択され得る。 In order to form a hairpin loop structure, a loop sequence consisting of any nucleotide sequence can be placed between the sense and antisense sequences. Therefore, the present invention relates to the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′.
[A] is a sense strand containing a sequence corresponding to the target sequence, [B] is an intervening single strand, and [A ′] is an antisense strand containing a complementary sequence to [A]. Double-stranded molecules are also provided. The target sequence can be selected, for example, from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12.

本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１標的遺伝子の発現を抑制する能力およびこれらの遺伝子を発現する細胞の阻害または低減をもたらす能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であり得る。領域［Ａ］は領域［Ａ'］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］を含むループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列からなる群より選択することができる（ウェブ上のambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。 The present invention is not limited to these examples, and the target sequence in [A] has the ability to suppress the expression of CDC45L or PIF1 target genes and the ability to cause inhibition or reduction of cells expressing these genes. As long as the chain molecule retains, it can be a modified sequence derived from these examples. Region [A] hybridizes with region [A ′] to form a loop including region [B]. The intervening single-stranded portion [B], ie the loop sequence, can preferably be 3 to 23 nucleotides in length. For example, the loop sequence can be selected from the group consisting of the following sequences (ambion.com/techlib/tb/tb_506.html on the web). In addition, a loop sequence of 23 nucleotides also provides an active siRNA (Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418 (6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC, CCACC, or CCACACC: Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418 (6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG: Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5): 500-5, Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100 (4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10 And UUCAAGAGA: Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4 (6): 457-67.

本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡからなる群より選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＣＵＵＧＡＧＣＡＧＧＵＧＵＵＵＧＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−［Ｂ］−ＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＵＣＣＡＣＧＵＣＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＡＧＡＵＧＣＵＣＵＧＧＣＣＵＵＵＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；および
ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−［Ｂ］−ＣＡＣＡＡＵＣＣＡＧＧＧＵＣＡＵＧＣＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。 An exemplary double-stranded molecule having the hairpin loop structure of the present invention is shown below. In the following structure, the loop sequence can be selected from the group consisting of AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC and UUCAAGGA, but the invention is not limited to these:
GCAAACACCUGCUCAAGUC- [B] -GACUUGAGCAGGUGUUGC (target sequence SEQ ID NO: 9);
GGACGUGGAUGCUCUGUGU- [B] -ACACAGAGCAUCCCACGUCC (target sequence SEQ ID NO: 10);
GAAAGGCCAGAGCAUCUCUC- [B] -GAAGAUGCUCUGGCCUUC (target sequence SEQ ID NO: 11);

さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを３'オーバーハングとしてセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、例えば２〜５個である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。３'オーバーハングのヌクレオチドは限定されないが、好ましくは「ｕ」または「ｔ」である。二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の３'末端に３'オーバーハングが付加される。   Furthermore, in order to increase the inhibitory activity of the double-stranded molecule, several nucleotides can be added as 3 ′ overhangs to the 3 ′ end of the sense and / or antisense strand. The number of added nucleotides is at least 2, generally 2-10, for example 2-5. The added nucleotides form a single strand at the 3 ′ end of the sense and / or antisense strand of the double-stranded molecule. The nucleotide of the 3 ′ overhang is not limited, but is preferably “u” or “t”. When the double-stranded molecule has a hairpin loop structure, a 3 ′ overhang is added to the 3 ′ end of the antisense strand.

二本鎖分子を調製する方法には、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することができる。化学合成法に従って、一本鎖のセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。あるいは、本発明の二本鎖分子またはｓｉＲＮＡ分子を、インビトロ翻訳を用いて合成してもよい。この態様においては、標的配列を含むヌクレオチド配列およびそのアンチセンスをコードするＤＮＡを、インビトロにおいて二本鎖分子へと転写する。アニーリングに関する一つの態様において、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも約３：７のモル比で、例えば約４：６のモル比で、例えば実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。   Any chemical synthesis method known in the art can be used for the preparation of the double-stranded molecule. According to the chemical synthesis method, single-stranded sense and antisense polynucleotides are synthesized separately, and then annealed together by an appropriate method to obtain a double-stranded molecule. Alternatively, the double-stranded molecule or siRNA molecule of the present invention may be synthesized using in vitro translation. In this embodiment, the nucleotide sequence including the target sequence and the DNA encoding the antisense are transcribed into a double-stranded molecule in vitro. In one embodiment related to annealing, the synthesized single stranded polynucleotide is at least about 3: 7 molar ratio, such as about 4: 6 molar ratio, eg, substantially equimolar amount (ie about 5: 5 molar). Mixing). Next, the mixture is heated to a temperature at which the double-stranded molecules dissociate, and then gradually cooled. The annealed double-stranded polynucleotide can be purified by commonly used methods known in the art. Examples of purification methods include methods that utilize agarose gel electrophoresis, or methods in which the remaining single-stranded polynucleotide is optionally removed, for example, by degradation with an appropriate enzyme.

その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、標的配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子鋳型を、例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。   The regulatory sequences adjacent to the target sequence may be the same or different so that their expression can be regulated independently or in a temporal or spatial manner. Transcription of a double-stranded molecule in a cell, for example by cloning a CDC45L or PIF1 gene template into a vector containing, for example, an RNA polyIII transcription unit derived from a nuclear small RNA (snRNA) U6 or a human H1 RNA promoter Can do.

あるいは、二本鎖分子のコード配列を、適切な細胞内での該二本鎖分子の発現を支持する調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーター）を該コード配列に隣接して含むベクター内にクローニングすることによって、その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、該二本鎖分子を細胞内で転写してもよい。二本鎖分子のコード配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターについての詳細を以下に述べる。   Alternatively, the coding sequence of the double-stranded molecule may be replaced with a regulatory sequence that supports expression of the double-stranded molecule in appropriate cells (eg, RNA polyIII transcription unit from human nuclear RNA (snRNA) U6 or human The double-stranded molecule so that its expression can be regulated independently or in a temporal or spatial manner by cloning into a vector containing the H1 RNA promoter) adjacent to the coding sequence. May be transcribed inside the cell. The regulatory sequences adjacent to the coding sequence of the double-stranded molecule may be the same or different. Details regarding vectors capable of producing double-stranded molecules are described below.

（ｉｉ）ベクター
本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖分子を含むベクター、および該ベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。一つの態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。したがって、一つの態様において、発現ベクターは本発明の二本鎖分子をコードし、かつ該二本鎖分子の発現に適合している。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。 (Ii) Vectors Vectors comprising one or more double-stranded molecules described herein and cells containing the vectors are also encompassed by the present invention. The vector of the present invention encodes the double-stranded molecule of the present invention in an expressible form. As used herein, the phrase “in an expressible form” indicates that a vector expresses the molecule when introduced into a cell. In one embodiment, the vector contains the regulatory elements necessary for expression of the double-stranded molecule. Thus, in one embodiment, the expression vector encodes a double stranded molecule of the invention and is adapted for expression of the double stranded molecule. Such vectors of the present invention can be used to produce the double-stranded molecules of the present invention, or can be used directly as active ingredients for treating cancer.

あるいは本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターを提供し、ここで該センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に対応するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、約１９〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３または１５のヌクレオチド配列に由来する連続したヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。 Alternatively, the present invention provides a vector comprising each of a combination of polynucleotides comprising a sense strand nucleic acid and an antisense strand nucleic acid, wherein the sense strand nucleic acid corresponds to SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12. A nucleotide sequence, wherein the antisense strand nucleic acid is a sequence complementary to the sense strand, the sense strand and the transcript of the antisense strand hybridize to each other to form a double-stranded molecule, and the vector When introduced into a cell expressing the CDC45L gene or PIF1 gene, inhibits the expression of the gene. Preferably, the polynucleotide is an oligonucleotide of about 19-25 nucleotides in length (eg, a contiguous nucleotide derived from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 or 15). More preferably, the polynucleotide combination comprises a single nucleotide transcript having a sense strand and an antisense strand linked via a single stranded nucleotide sequence. More preferably, the polynucleotide combination has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′.
[A] is a nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12; [B] is a nucleotide sequence consisting of about 3 to about 23 nucleotides; and [A ′] is It is a nucleotide sequence complementary to [A].

本発明のベクターは、例えば、標的配列を含む配列を、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的に該配列に連結されるように発現ベクターにクローニングすることによって、作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。   The vectors of the present invention can be used, for example, to convert an expression vector comprising a target sequence such that a regulatory sequence is operably linked to the sequence in a manner that allows expression of both strands (by transcription of the DNA molecule). It can be made by cloning (Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5): 500-5). For example, an RNA molecule that is antisense to mRNA is transcribed by a first promoter (eg, a promoter sequence adjacent to the 3 ′ end of the cloned DNA), and an RNA molecule that is the sense strand for the mRNA is second Transcribed by a promoter (eg, a promoter sequence adjacent to the 5 ′ end of the cloned DNA). The sense and antisense strands hybridize in vivo to produce a double stranded molecular construct for silencing the gene. Alternatively, the sense and antisense strands are each expressed using two vector constructs that encode the sense and antisense strands of the double-stranded molecule, respectively, and then a double-stranded molecular construct is formed. In addition, the cloned sequence can encode a single transcript of a construct having secondary structure (eg, a hairpin), ie, a vector containing both the sense and complementary antisense sequences of the target gene.

本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR &amp; Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに仲介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子仲介性（「遺伝子銃」）または圧力仲介性の送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。   The vectors of the present invention may also be included to achieve stable insertion into the genome of the target cell (see, eg, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51 for a description of homologous recombination cassette vectors). : See 503-12). For example, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8, US Pat. Nos. 5,580,859, 5,589,466, 5,804,566, 5,739, No. 118, No. 5,736,524, No. 5,679,647, and WO 98/04720. Examples of DNA-based delivery technologies include “naked DNA”, facilitated (bupivacaine, polymer, peptide mediated) delivery, cationic lipid complexes, and particle mediated (“gene gun”) or pressure mediated Sex delivery is included (see, eg, US Pat. No. 5,922,687).

本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターであることができる。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスが含まれる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）が含まれる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。   The vector of the present invention can be, for example, a viral or bacterial vector. Examples of expression vectors include attenuated virus hosts such as cowpox virus or fowlpox virus (see, eg, US Pat. No. 4,722,848). This approach involves the use of cowpox virus, for example as a vector to express nucleotide sequences encoding double-stranded molecules. When introduced into a cell that expresses the target gene, the recombinant cowpox virus expresses the molecule, thereby inhibiting the growth of the cell. Another example of a vector that can be used includes Bacillus Calmette Guerin (BCG). BCG vectors are described in Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. A wide range of other vectors are useful for therapeutic administration and production of double-stranded molecules. Examples include adenovirus vectors and adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, Salmonella typhi vectors, detoxified anthrax toxin vectors, and the like. For example, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71, Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806, and Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85. Please refer.

（ｉｉｉ）二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害または低減し、がんを治療または予防する方法
本発明において、上記の標的配列を標的とする二本鎖分子それぞれを、該標的遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖を阻害または低減する能力について調べた。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する癌細胞の増殖は、本発明の二本鎖分子によって阻害または低減された（図３および図５）。 (Iii) A method of inhibiting or reducing cancer cell growth and treating or preventing cancer using a double-stranded molecule In the present invention, each double-stranded molecule targeting the target sequence is The ability to inhibit or reduce the growth of cells that (over) express the target gene was examined. The growth of cancer cells that (over) express CDC45L and / or PIF1 gene was inhibited or reduced by the double-stranded molecules of the present invention (FIGS. 3 and 5).

したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害することにより、細胞増殖を、すなわち、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんに由来する細胞のがん性細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子発現は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現を特異的に標的とする本発明の前述の二本鎖分子のいずれかによって、または本発明の二本鎖分子のいずれかを発現し得る本発明のベクターによって、阻害され得る。   Thus, the present invention inhibits CDC45L and / or PIF1 gene expression, thereby causing cell proliferation, ie, due to overexpression of CDC45L and / or PIF1 gene or mediated by CDC45L and / or PIF1 gene. A method for inhibiting cancerous cell growth of cells derived from cancer is provided. CDC45L or PIF1 gene expression can be expressed by any of the aforementioned double-stranded molecules of the invention that specifically target expression of CDC45L or PIF1 gene, or any of the double-stranded molecules of the invention. It can be inhibited by the vectors of the invention.

本発明の二本鎖分子およびベクターががん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力によって、それらを、がん、すなわちＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんを治療するための方法に使用できることが示される。したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するか、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんを有する患者を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子すなわち阻害核酸、または該分子を発現するベクターを投与することにより、正常な器官ではそれらの遺伝子がほとんど検出されなかったことから、有害作用を引き起こすことなく治療するための方法を提供する。   Due to such ability of the double-stranded molecules and vectors of the present invention to inhibit cell proliferation of cancerous cells, they are caused by cancer, ie, overexpression of the CDC45L and / or PIF1 gene, or CDC45L and / or Alternatively, it is shown that it can be used in a method for treating cancer mediated by the PIF1 gene. Thus, the present invention relates to the treatment of a patient with cancer resulting from overexpression of CDC45L and / or PIF1 gene or mediated by CDC45L and / or PIF1 gene, Alternatively, the administration of a vector expressing the molecule provides a method for treatment without causing any adverse effects since few genes were detected in normal organs.

具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［２３］を提供する：
［１］少なくとも１つの二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖を阻害または低減する方法、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療もしくは予防する方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現を阻害するかまたは低下させる方法。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列と配列同一性を共有するか、または該標的配列に相補的であるｍＲＮＡにおいて作用する、［１］の方法。
［３］二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］の方法。
［４］複数の二本鎖分子が投与される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法；
［５］複数の二本鎖分子が同一遺伝子を標的とする、［４］の方法；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［５］のいずれか１つの方法；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］の方法；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］の方法；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］の方法；
［１０］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［９］のいずれか１つの方法；
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一オリゴヌクレオチドからなる、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１２］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［１１］の方法。
［１３］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］〜［１２］のいずれか１つの方法。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［１２］のいずれか１つの方法。
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］の方法。
［１６］センス鎖およびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１５］の方法。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１４］の方法。
［１８］センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの一方または両方の５'末端に隣接する領域がＲＮＡから作製されている、［１７］の方法。
［１９］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［１８］の方法。
［２０］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［１９］のいずれか１つの方法。
［２１］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］〜［２０］のいずれか１つの方法。
［２２］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［２１］の方法。
［２３］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および／または細胞透過剤を含む組成物中に含まれる、［１］〜［２２］のいずれか１つの方法。 Specifically, the present invention provides the following methods [1] to [23]:
[1] A method for inhibiting or reducing proliferation of a cell expressing (over) a CDC45L and / or PIF1 gene, comprising administering to a subject at least one double-stranded molecule or a vector encoding the double-stranded molecule. Or a method of treating or preventing a cancer that (over) expresses the CDC45L and / or PIF1 gene, wherein the double-stranded molecule is introduced into a cell and the CDC45L or PIF1 gene is expressed in vivo. How to inhibit or reduce.
[2] In mRNA in which the double-stranded molecule shares sequence identity with or is complementary to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12 The method of [1] which acts.
[3] The double-stranded molecule includes a sense strand that hybridizes to each other to form a double-stranded molecule and an antisense strand complementary thereto, the sense strand comprising SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and The method according to [1], comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of 12.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein a plurality of double-stranded molecules are administered;
[5] The method of [4], wherein a plurality of double-stranded molecules target the same gene;
[6] The method of any one of [1] to [5], wherein the double-stranded molecule is less than about 100 nucleotides in length;
[7] The method of [6], wherein the double-stranded molecule is less than about 75 nucleotides in length;
[8] The method of [7], wherein the double-stranded molecule is less than about 50 nucleotides in length;
[9] The method of [8], wherein the double-stranded molecule is less than about 25 nucleotides in length;
[10] The method of any one of [1] to [9], wherein the sense strand hybridizes with the antisense strand in the target sequence to form a double-stranded molecule having a length of 19-25 nucleotide pairs;
[11] The method of any one of [1] to [10], wherein the double-stranded molecule consists of a single oligonucleotide comprising both a sense strand and an antisense strand linked by an intervening single strand.
[12] The double-stranded molecule has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′
Have
[A] is a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12;
[B] is an intervening single strand; and [A ′] is an antisense strand comprising an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the target sequence selected in [A].
[11] The method.
[13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the double-stranded molecule comprises RNA.
[14] The method of any one of [1] to [12], wherein the double-stranded molecule includes both DNA and RNA.
[15] The method of [14], wherein the double-stranded molecule is a hybrid of a DNA polynucleotide and an RNA polynucleotide.
[16] The method according to [15], wherein the sense strand and the antisense strand polynucleotide are prepared from DNA and RNA, respectively.
[17] The method of [14], wherein the double-stranded molecule is a chimera of DNA and RNA.
[18] The method of [17], wherein the region adjacent to the 5 ′ end of one or both of the sense polynucleotide and the antisense polynucleotide is made from RNA.
[19] The method of [18], wherein the adjacent region consists of 9 to 13 nucleotides.
[20] The method of any one of [1] to [19], wherein the double-stranded molecule comprises one or two 3 ′ overhangs.
[21] The method of any one of [1] to [20], wherein the double-stranded molecule is encoded by a vector.
[22] The double-stranded molecule has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′
Have
[A] is a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12;
[B] is an intervening single strand; and [A ′] is an antisense strand comprising an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the target sequence selected in [A].
[21] The method.
[23] The method according to any one of [1] to [22], wherein the double-stranded molecule is contained in a composition containing, in addition to the molecule, a transfection enhancing agent and / or a cell penetrating agent.

本発明の方法について、以下でより詳細に説明する。
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖は、該細胞をＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物と接触させることにより阻害される。該細胞をさらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、該分子に曝露されていない細胞と比較して、細胞がより低速で増殖するかまたは該細胞の生存率が低下することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイ法を用いて、測定することができる。 The method of the present invention is described in more detail below.
Proliferation of cells expressing (over) the CDC45L and / or PIF1 gene is inhibited by contacting the cell with a double-stranded molecule against the CDC45L or PIF1 gene, a vector expressing the molecule, or a composition comprising the same. The The cell may be further contacted with a transfection agent. Suitable transfection agents are known in the art. The phrase “inhibition of cell proliferation” indicates that the cells grow slower or have a reduced viability compared to cells not exposed to the molecule. Cell proliferation can be measured by methods known in the art, for example using the MTT cell proliferation assay.

細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現する限り、いかなる種類の細胞の増殖も、本発明の方法に従って抑制することができる。例示的な細胞にはがん細胞が含まれる。   As long as the cell expresses or overexpresses the target gene of the double-stranded molecule of the present invention, the proliferation of any kind of cell can be suppressed according to the method of the present invention. Exemplary cells include cancer cells.

したがって、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子に関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現する少なくとも１つのベクター、または該分子の少なくとも１つを含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療することができる。例えば、がん患者を本発明の方法に従って治療することができる。がんの型は、診断する特定の腫瘍の型に従う標準的な方法によって同定することができる。いくつかの態様において、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、または免疫測定法により患者由来の生検材料におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の（過剰）発現を検出することによって、選択される。いくつかの態様では、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本は、当技術分野で公知の方法、例えば免疫組織化学的解析、ハイブリダイゼーション、またはＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現について確認される（「実施例」における半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、または免疫組織化学を参照されたい）。   Accordingly, a patient suffering from or at risk of developing a disease associated with the CDC45L and / or PIF1 gene is treated with at least one of the double-stranded molecules of the invention, at least one of the molecules Treatment can be by administering a vector, or at least one composition comprising at least one of the molecules. For example, cancer patients can be treated according to the methods of the present invention. Cancer types can be identified by standard methods according to the particular tumor type being diagnosed. In some embodiments, patients treated by the methods of the invention detect (over) expression of CDC45L and / or PIF1 gene in patient-derived biopsy material by RT-PCR, hybridization, or immunoassay. Is selected. In some embodiments, prior to treatment of the present invention, a biopsy specimen from a subject is obtained by CDC45L and / or by methods known in the art, such as immunohistochemical analysis, hybridization, or RT-PCR. Confirmed for overexpression of the PIF1 gene (see semi-quantitative RT-PCR, Western blotting, or immunohistochemistry in the "Examples").

細胞増殖を阻害または低減し、それによってがんを治療する本発明の方法によれば、複数種類の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターまたはこれを含む組成物）を投与する場合、該分子のそれぞれは、同一遺伝子の異なる標的配列、または異なる遺伝子の異なる標的配列に指向し得る。例えば、本方法は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子転写物に指向する異なる二本鎖分子を利用することができる。あるいは、例えば本方法は、同一遺伝子から選択される１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。   According to the method of the present invention for inhibiting or reducing cell proliferation and thereby treating cancer, when administering a plurality of types of double-stranded molecules (or a vector expressing the same or a composition containing the same), Each of the molecules can be directed to different target sequences of the same gene, or different target sequences of different genes. For example, the method can utilize different double stranded molecules directed to CDC45L or PIF1 gene transcripts. Alternatively, for example, the method can utilize a double-stranded molecule directed to one, two, or more target sequences selected from the same gene.

細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子と対応するｍＲＮＡ転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡをベクターとして細胞に導入することもできる。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用することができる。   To inhibit cell proliferation, the double-stranded molecule of the invention can be introduced directly into the cell in a form to achieve binding of the molecule to the corresponding mRNA transcript. Alternatively, as described above, DNA encoding a double-stranded molecule can be introduced into a cell as a vector. To introduce double-stranded molecules and vectors into cells, transfection enhancing agents such as FuGENE (Roche diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), and Nucleofector (Wakopure) can be used. .

治療により臨床的恩恵、例えばＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下がもたらされる場合に、該治療は有効であると判定される。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成が遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状が予防もしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定される。   A treatment is determined to be effective if the treatment results in a clinical benefit, such as decreased expression of the CDC45L or PIF1 gene, or a decrease in the size, prevalence, or metastatic potential of the subject. . When the treatment is applied prophylactically, “effective” means that the formation of the cancer is delayed or inhibited, or the clinical symptoms of the cancer are prevented or alleviated. Efficacy is determined in conjunction with any known method for diagnosing or treating a particular tumor type.

本発明の方法および組成物が「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の作用を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能の回復および疾患関連の合併症の低減によって、既に確立された疾患の悪影響を低下させることを目的とした活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。   As long as the methods and compositions of the invention are useful in the context of “prevention and prophylaxis”, such terms are used interchangeably herein to reduce mortality or morbidity burden due to disease. Refers to any action to be made. Prevention and prevention may be performed at “primary, secondary, and tertiary prevention levels”. Primary prevention and prophylaxis avoid the development of disease, whereas secondary and tertiary levels prevention (prevention and prophylaxis) prevent disease progression and appearance of symptoms (prevention and In addition to prophylaxis), it encompasses activities aimed at reducing the adverse effects of previously established diseases by restoring function and reducing disease-related complications. Alternatively, prevention and prophylaxis can include a wide range of prophylactic therapies aimed at reducing the severity of certain disorders, eg, reducing tumor growth and metastasis.

がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などのいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を低下させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療の構成要素であり、かつ／または、予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定な疾患を含む。   Treatment and / or prevention of cancer and / or prevention of its postoperative recurrence may be in the following stages, for example, surgical removal of cancer cells, inhibition of cancerous cell growth, tumor regression or regression, remission Including induction and suppression of cancer development, tumor regression, and reduction or inhibition of metastasis. Effective treatment and / or prevention of cancer reduces mortality, improves the prognosis of individuals with cancer, reduces the level of blood tumor markers, and provides detectable symptoms associated with cancer. ease. For example, symptom reduction or amelioration is a component of effective treatment and / or prevention includes 10%, 20%, 30%, or more of a reduced or stable disease.

本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡ（遺伝子転写物）を分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。   It is understood that the double-stranded molecule of the present invention degrades the target mRNA (gene transcript) in substoichiometric amounts. Without being bound by any theory, it is believed that the double-stranded molecule of the present invention causes degradation of the target mRNA in a catalytic manner. Thus, compared to standard cancer treatments, there are significantly fewer double-stranded molecules that must be delivered to or near the cancer site to exert a therapeutic effect.

当業者は、要素、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかを考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、例えば約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、例えば約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの、がん部位またはその近傍での細胞間濃度を含む。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。   One skilled in the art will recognize a given subject by considering factors such as the subject's weight, age, sex, type of illness, symptoms and other conditions; route of administration; and whether administration is local or systemic. The effective amount of the double-stranded molecule of the present invention to be administered can be readily determined. In general, an effective amount of a double-stranded molecule of the invention is from about 1 nanomolar (nM) to about 100 nM, such as from about 2 nM to about 50 nM, such as from about 2.5 nM to about 10 nM of cells at or near the cancer site. Includes interstitial concentration. It is contemplated that higher or lower amounts of double-stranded molecules can be administered.

本発明の方法を用いて、がん；例えば、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するがん、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがん、例えば肺癌の増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０からなる群より、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に向けられた二本鎖分子が、がんの治療のために有用である。   Using the methods of the present invention to inhibit the growth or metastasis of cancer; eg, cancer resulting from overexpression of CDC45L and / or PIF1 gene, or cancer mediated by CDC45L and / or PIF1 gene, eg, lung cancer can do. Specifically, it is directed to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for CDC45L, and from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for PIF1. Double-stranded molecules are useful for the treatment of cancer.

がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子によって促進されるがんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。   In order to treat cancer, for example, cancer promoted by CDC45L and / or PIF1 gene, the double-stranded molecule of the present invention can be administered to a subject in combination with an agent other than the double-stranded molecule. . Alternatively, the double-stranded molecule of the present invention can be administered to a subject in combination with another treatment designed to treat cancer. For example, the double-stranded molecules of the present invention can be used to treat currently used therapeutics for cancer or prevention of cancer metastasis (eg, radiation therapy, surgery, and cisplatin, carboplatin, cyclophosphamide, 5 -In combination with chemotherapeutic agents such as fluorouracil, adriamycin, daunorubicin, or tamoxifen).

本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。   In this method, the double-stranded molecule can be administered to the subject as a naked double-stranded molecule in combination with a delivery reagent or as a recombinant plasmid or viral vector that expresses the double-stranded molecule.

本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが含まれる。一つの態様において、送達試薬はリポソームである。   Suitable delivery reagents for administration in combination with the double-stranded molecules of the present invention include the Mirrus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, or polycation (eg polylysine) or liposome. In one embodiment, the delivery reagent is a liposome.

リポソームは、特定の組織、例えば網膜組織または腫瘍組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む。一般に脂質の選択は、要素、例えば所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。   Liposomes can assist in the delivery of double-stranded molecules to specific tissues, such as retinal tissue or tumor tissue, and can also increase the blood half-life of the double-stranded molecules. Liposomes suitable for use in the present invention are formed from standard vesicle-forming lipids, which generally include neutral or negatively charged phospholipids and sterols such as cholesterol. In general, the choice of lipid is guided by factors such as the desired liposome size and the liposome's half-life in the bloodstream. Regarding the preparation of liposomes, see, for example, Szoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467, and U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028. And various methods as described in US Pat. No. 5,019,369, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.

一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、有用である。   In some embodiments, the liposomes encapsulating the present double-stranded molecule comprises a ligand molecule that can deliver the liposome to a cancer site. Ligands that bind to receptors abundant in tumor or vesicular endothelial cells, such as monoclonal antibodies that bind to tumor antigens or endothelial cell surface antigens, are useful.

一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾する。一つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。   In some embodiments, the liposomes encapsulating the present double-stranded molecule avoids clearance by mononuclear macrophages and reticuloendothelial systems, for example by having an opsonization-inhibiting moiety attached to the surface of the structure. Qualify. In one embodiment, the liposomes of the invention can include both an opsonization inhibiting moiety and a ligand.

本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。   The opsonization-inhibiting moiety used to prepare the liposomes of the present invention is typically a large hydrophilic polymer that binds to the liposome membrane. As used herein, an opsonization-inhibiting moiety is chemically or physically attached to a liposome membrane, for example, by intercalation of a lipid soluble anchor to the membrane itself, or to an active group of membrane lipids. It is “bound” to the liposome membrane by direct binding of. These opsonization-inhibiting hydrophilic polymers can be found in macrophage-monocyte systems (“MMS”) and, for example, as described in US Pat. No. 4,920,016, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. A protective surface layer is formed that significantly reduces liposome uptake by the reticulated system (“RES”). Thus, liposomes modified with opsonization-inhibiting moieties remain in the circulation much longer than unmodified liposomes. For this reason, such liposomes are sometimes referred to as “stealth” liposomes.

ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（ｌｅａｋｙ）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。   Stealth liposomes are known to accumulate in tissues into which porous or “leaky” microvasculature flows. Therefore, these liposomes accumulate efficiently in target tissues characterized by such microvasculature defects, such as solid tumors. See Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53. Furthermore, the reduced uptake by RES reduces the toxicity of stealth liposomes by preventing significant accumulation in the liver and spleen. Thus, the liposomes of the present invention modified with opsonization-inhibiting moieties can deliver the double-stranded molecules of the present invention to tumor cells.

リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、分子量約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。   Opsonization-inhibiting moieties suitable for modifying liposomes can be water-soluble polymers having a molecular weight of about 500 daltons to about 40,000 daltons, such as about 2000 daltons to about 20000 daltons. Such polymers include polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) derivatives; such as methoxy PEG or PPG, and stearic acid PEG or stearic acid PPG; synthetic polymers such as polyacrylamide or poly N-vinylpyrrolidone; Branched or dendrimeric polyamidoamines; polyacrylic acid; polyhydric alcohols such as polyvinyl alcohol and polyxylitol chemically bonded to carboxylic acid groups or amino groups, and gangliosides such as ganglioside GM1. Also suitable are copolymers of PEG, methoxy PEG or methoxy PPG, or derivatives thereof. In addition, the opsonization-inhibiting polymer can also be a block copolymer of PEG and any of polyamino acids, polysaccharides, polyamidoamines, polyethyleneamines, or polynucleotides. Opsonization-inhibiting polymers are natural polysaccharides containing amino acids or carboxylic acids, such as galacturonic acid, glucuronic acid, mannuronic acid, hyaluronic acid, pectic acid, neuraminic acid, alginic acid, carrageenan; aminated polysaccharide or oligosaccharide (linear or branched) Or a carboxylated polysaccharide or a carboxylated oligosaccharide reacted with a derivative of a carboxylic acid from which a carboxylic acid group has been linked, for example.

一部の態様において、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。   In some embodiments, the opsonization inhibiting moiety is PEG, PPG, or a derivative thereof. Liposomes modified with PEG or PEG derivatives are sometimes referred to as “PEGylated liposomes”.

オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。   The opsonization inhibiting moiety can be bound to the liposome membrane by any one of a number of known techniques. For example, an N-hydroxysuccinimide ester of PEG can be coupled to a phosphatidyl-ethanolamine lipid soluble anchor followed by a membrane. Similarly, dextran polymers can be derivatized with stearylamine lipid soluble anchors by reductive amination at 60 ° C. with Na (CN) BH 3 and a solvent mixture, eg, a 30:12 ratio of tetrahydrofuran and water.

本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。   Vectors expressing the double-stranded molecules of the present invention have been described above. Such vectors that express at least one double-stranded molecule of the invention are also suitable, including directly or as a Mirus Transit LT1 lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, or polycation (eg polylysine) or liposome. It can be administered in combination with a delivery reagent. Methods for delivering a recombinant viral vector expressing a double-stranded molecule of the invention to a cancerous area of a patient are within the skill of the art.

本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。   The double-stranded molecule of the present invention can be administered to a subject by any means suitable for delivering the double-stranded molecule to a cancer site. For example, the double-stranded molecule can be administered by gene gun, electroporation, or other suitable parenteral or enteral route of administration.

好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。   Suitable routes of enteral administration include oral delivery, rectal delivery, or intranasal delivery.

好適な非経口投与経路には、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が含まれる。一部の態様において、二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行うことができる。   Suitable parenteral routes of administration include intravenous administration (eg intravenous bolus injection, intravenous infusion, intraarterial bolus injection, intraarterial infusion and catheter instillation into the vasculature); peri-tissue and intra-tissue injection (eg around tumor tissue) Injection and intratumoral injection); subcutaneous injection or subcutaneous deposition including subcutaneous infusion (eg by osmotic pump); eg catheter or other placement device (eg porous, non-porous or gelatin-like material) Including direct application to or near the area of the cancer site with suppositories or implants; and inhalation. In some embodiments, the injection or infusion of the double-stranded molecule or vector can be at or near the cancer site.

本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。剤の注射は、組織内へ、またはがん部位の近傍に直接行うことができる。がん部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射を施すことができる。   The double-stranded molecule of the present invention can be administered in a single dose or multiple doses. When administration of the double-stranded molecule of the present invention is by infusion, the infusion can be a single sustained dose or can be delivered by multiple infusions. The injection of the agent can be done directly into the tissue or near the cancer site. Multiple injections of the agent into the cancer site or nearby tissue can be given.

当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、例えば約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。一つの例示的な投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。   One skilled in the art can also readily determine an appropriate dosing regimen for administering the double-stranded molecule of the invention to a given subject. For example, the double-stranded molecule can be administered to the subject once, for example, as a single injection or deposition at or near the cancer site. Alternatively, the double-stranded molecule can be administered to the subject once or twice daily for a period of about 3 days to about 28 days, such as about 7 days to about 10 days. In one exemplary dosing regimen, double-stranded molecules are injected once a day for 7 days at or near the cancer site. It is understood that where the administration regimen includes multiple administrations, an effective amount of a double-stranded molecule administered to a subject can include the total amount of double-stranded molecules administered throughout the administration regimen.

本発明において、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分によって治療することができる。 In the present invention, a cancer that overexpresses CDC45L and / or PIF1,
(A) the double-stranded molecule of the present invention,
It can be treated with at least one active ingredient selected from the group consisting of (b) the DNA encoding it, and (c) the vector encoding it.

がんには、肺癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、治療されるがん性細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を（過剰）発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の該発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
ｉｉｉ）正常対照と比較してＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを有する対象に対して、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を投与する段階
を含んでもよい。 Cancer includes, but is not limited to lung cancer. Thus, prior to administration of the double-stranded molecule of the invention as an active ingredient, the expression level of CDC45L and / or PIF1 in the cancerous cell or tissue being treated is increased compared to normal cells in the same organ. It is preferable to check whether or not Accordingly, in one aspect, the invention provides a method for treating a cancer that (over) expresses CDC45L and / or PIF1, wherein the method comprises:
i) measuring the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a cancer cell or tissue obtained from a subject having a cancer to be treated;
ii) comparing the expression level of CDC45L and / or PIF1 to a normal control; and iii) for a subject having a cancer that overexpresses CDC45L and / or PIF1 compared to a normal control,
(A) the double-stranded molecule of the present invention,
It may comprise the step of administering at least one component selected from the group consisting of (b) DNA encoding it, and (c) a vector encoding it.

あるいは本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。 Alternatively, the present invention is for use in administration to a subject having a cancer that overexpresses CDC45L and / or PIF1.
(A) the double-stranded molecule of the present invention,
Also provided is a pharmaceutical composition comprising at least one component selected from the group consisting of (b) DNA encoding it, and (c) a vector encoding it. In other words, the present invention relates to a subject to be treated (a) a double-stranded molecule of the present invention,
Further provided is a method for identification using (b) the DNA encoding it, or (c) a vector encoding it, which comprises CDC45L and / or PIF1 in a cancer cell or tissue from the subject Measuring the level of expression, the increased level compared to the normal control level of the gene allows the subject to
(A) the double-stranded molecule of the present invention,
It is shown to have a cancer that can be treated with (b) the DNA encoding it, or (c) the vector encoding it.

本発明のがん治療法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。 The cancer treatment method of the present invention will be described in more detail below.
The subject to be treated by this method is preferably a mammal. Exemplary mammals include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cows.

本発明に従って、対象から採取したがん細胞におけるがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。   According to the present invention, the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a cancer cell or tissue in a cancer cell collected from a subject is measured. Expression levels can be measured as transcription (nucleic acid) product levels using methods known in the art. For example, CDC45L or PIF1 mRNA may be quantified by a hybridization method (eg, Northern hybridization) using a probe. Detection may be performed on a chip or array. For detection of CDC45L and / or PIF1 expression levels, the use of arrays is preferred. One skilled in the art can prepare such probes utilizing the sequence information of CDC45L or PIF1. For example, CDC45L or PIF1 cDNA may be used as a probe. If necessary, the probe may be labeled with an appropriate label such as a dye, a fluorescent substance, and an isotope, and the expression level of the gene may be detected as the intensity of the hybridized label.

さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３または１５）の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。   In addition, transcripts of CDC45L or PIF1 (eg, SEQ ID NO: 13 or 15) may be quantified by amplification-based detection methods (eg, RT-PCR) using primers. Such primers may be prepared based on available sequence information about the gene.

具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）その標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。   Specifically, the probe or primer used in the method of the present invention hybridizes with CDC45L or PIF1 mRNA under stringent conditions, moderately stringent conditions, or low stringent conditions. . As used herein, the phrase “stringent (hybridization) conditions” refers to conditions under which a probe or primer hybridizes to its target sequence but not to other sequences. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Specific hybridization of longer sequences is observed at higher temperatures than shorter sequences. Generally, the temperature of stringent conditions is selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. Tm is the temperature at which 50% of a probe complementary to a target sequence (under a given ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) hybridizes with the target sequence in equilibrium. Since the target sequence is generally present in excess at Tm, 50% of the probes are occupied in equilibrium. Typically, stringent conditions include a salt concentration of less than about 1.0 M sodium ions at pH 7.0-8.3, typically about 0.01-1. The conditions are 0 M and the temperature is at least about 30 ° C. for short probes or primers (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for longer probes or primers. Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.

あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４または１６）の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質との結合能を保持している限り、該断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。   Alternatively, the translation product may be detected for the diagnosis of the present invention. For example, the amount of CDC45L or PIF1 protein (SEQ ID NO: 14 or 16) may be measured. A method for measuring the amount of a protein as a translation product includes an immunoassay method using an antibody that specifically recognizes the protein. The antibody may be monoclonal or polyclonal. Further, as long as any fragment or modified antibody of the antibody retains the ability to bind to CDC45L or PIF1 protein, the fragment or modification (eg, chimeric antibody, scFv, Fab, F (ab ′) 2, Fv, etc.) Can be used for detection. Methods for preparing these types of antibodies for detection of the proteins are well known in the art, and any method can be utilized in the present invention to prepare such antibodies and their equivalents. .

ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量／レベルの増大を示すと同時に、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の高い発現レベルを示す。   As another method for detecting the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene based on its translation product, staining intensity may be measured by immunohistochemical analysis using an antibody against CDC45L or PIF1 protein. That is, in this measurement, intense staining indicates an increase in protein abundance / level, as well as a high expression level of the CDC45L or PIF1 gene.

がん細胞における標的遺伝子、すなわちＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）よりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを決定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。 If the expression level of the target gene, ie CDC45L or PIF1 gene, in the cancer cell is increased by, for example, 10%, 25%, or 50% over the control level of the target gene (eg, the level in normal cells); Alternatively, it can be determined that it has increased if it has increased more than 1.1 times, more than 1.5 times, more than 2.0 times, more than 5.0 times, more than 10.0 times, or more.
By using the sample (s) previously collected and stored from the subject (s) with known disease state (cancerous or non-cancerous), the control level can be adjusted simultaneously with the cancer cells. You may decide. In addition, normal cells collected from non-cancerous areas of organs with cancer to be treated may be used as normal controls. Alternatively, based on results obtained by analyzing the expression level (s) of CDC45L and / or PIF1 gene previously measured in a sample of a subject with a known disease state, control by statistical methods The level may be determined. Furthermore, the control level can be derived from a database of expression patterns from previously tested cells. Moreover, according to one aspect of the invention, the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene in a biological sample can be compared to a plurality of control levels determined from a plurality of reference samples. Preferably, a control level determined from a reference sample derived from a tissue type similar to that of the subject-derived biological sample is used. Furthermore, it is preferable to use a standard value of the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene in a group whose disease state is known. The standard value can be obtained by any method known in the art. For example, the mean ± 2S. D. Or mean ± 3S. D. Can be used as standard values.

本発明の文脈において、非がん性であることが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。   In the context of the present invention, a control level determined from a biological sample that is known to be non-cancerous is referred to as a “normal control level”. On the other hand, when determined from a cancerous biological sample, the control level is referred to as the “cancerous control level”.

ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。   A subject has a cancer to be treated if the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene is increased relative to a normal control level or similar / equivalent to a cancerous control level Diagnosed.

（ｉｖ）組成物
さらに本発明は、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つまたは該分子をコードするベクターを含む、薬学的組成物を提供する。具体的には、本発明は以下の組成物［１］〜［２４］を提供する：
［１］少なくとも１つの二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞の増殖を阻害または低減するため、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を発現するがんを治療もしくは予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合に、該遺伝子のインビボ発現を阻害するかまたは低下させる組成物。
［２］二本鎖分子が、ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の群、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の群より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］の組成物。
［３］二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］の組成物。
［４］治療を受けるがんが肺癌である、［１］〜［３］のいずれか１つの組成物；
［５］肺癌が小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、［４］の方法；
［６］複数種類の二本鎖分子を含む、［１］〜［５］のいずれか１つの組成物；
［７］複数種類の二本鎖分子が同一遺伝子を標的とする、［６］の組成物；
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［７］のいずれか１つの組成物；
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］の組成物；
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］の組成物；
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］の組成物；
［１２］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［１１］のいずれか１つの組成物；
［１３］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］〜［１２］のいずれか１つの組成物。
［１４］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［１３］の組成物。
［１５］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］〜［１４］のいずれか１つの組成物；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡを含む、［１］〜［１４］のいずれか１つの組成物；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１６］の組成物；
［１８］センス鎖およびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１７］の組成物；
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１８］の組成物；
［２０］センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの一方または両方の５'末端に隣接する少なくとも１つの領域がＲＮＡからなる、［１９］の組成物；
［２１］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［２０］の組成物；
［２２］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２１］のいずれか１つの組成物；
［２３］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］〜［２２］のいずれか１つの組成物；
［２４］トランスフェクション増強剤、細胞透過剤、または薬学的に許容される担体をさらに含む、［１］〜［２３］のいずれか１つの組成物。 (Iv) Composition The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising at least one of the double-stranded molecules of the present invention or a vector encoding the molecule. Specifically, the present invention provides the following compositions [1] to [24]:
[1] In order to inhibit or reduce the proliferation of cells expressing CDC45L and / or PIF1 gene containing at least one double-stranded molecule or a vector encoding the double-stranded molecule, or CDC45L and / or PIF1 gene A composition for treating or preventing cancer that expresses, wherein the composition inhibits or reduces in vivo expression of the gene when the double-stranded molecule is introduced into a cell.
[2] A double-stranded molecule acts on an mRNA that matches a target sequence selected from the group of SEQ ID NO: 9 and 10 for CDC45L, and the group of SEQ ID NO: 11 and 12 for PIF1, [1 ] Composition.
[3] The double-stranded molecule includes a sense strand that hybridizes to each other to form a double-stranded molecule and an antisense strand complementary thereto, the sense strand comprising SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and The composition according to [1], comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of 12.
[4] The composition according to any one of [1] to [3], wherein the cancer to be treated is lung cancer;
[5] The method of [4], wherein the lung cancer is small cell lung cancer or non-small cell lung cancer;
[6] The composition according to any one of [1] to [5], comprising a plurality of types of double-stranded molecules;
[7] The composition of [6], wherein a plurality of types of double-stranded molecules target the same gene;
[8] The composition of any one of [1] to [7], wherein the double-stranded molecule is less than about 100 nucleotides in length;
[9] The composition of [8], wherein the double-stranded molecule is less than about 75 nucleotides in length;
[10] The composition of [9], wherein the double-stranded molecule is less than about 50 nucleotides in length;
[11] The composition of [10], wherein the double-stranded molecule is less than about 25 nucleotides in length;
[12] The composition of any one of [1] to [11], wherein the sense strand hybridizes with the antisense strand in the target sequence to form a double-stranded molecule having a length of 19 to 25 nucleotide pairs. ;
[13] The composition of any one of [1] to [12], wherein the double-stranded molecule consists of a single polynucleotide comprising both a sense strand and an antisense strand linked by an intervening single strand.
[14] The double-stranded molecule has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′
Have
[A] is a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12;
[B] is an intervening single strand; and [A ′] is an antisense strand comprising an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the target sequence selected in [A].
The composition of [13].
[15] The composition according to any one of [1] to [14], wherein the double-stranded molecule comprises RNA;
[16] The composition according to any one of [1] to [14], wherein the double-stranded molecule comprises DNA and RNA;
[17] The composition of [16], wherein the double-stranded molecule is a hybrid of a DNA polynucleotide and an RNA polynucleotide;
[18] The composition of [17], wherein the sense strand and antisense strand polynucleotides are made from DNA and RNA, respectively;
[19] The composition of [18], wherein the double-stranded molecule is a chimera of DNA and RNA;
[20] The composition of [19], wherein at least one region adjacent to the 5 ′ end of one or both of the sense polynucleotide and the antisense polynucleotide consists of RNA;
[21] The composition of [20], wherein the adjacent region consists of 9 to 13 nucleotides;
[22] The composition of any one of [1] to [21], wherein the double-stranded molecule comprises one or two 3 ′ overhangs;
[23] The composition of any one of [1] to [22], wherein the double-stranded molecule is encoded by a vector;
[24] The composition of any one of [1] to [23], further comprising a transfection enhancing agent, a cell permeation agent, or a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で用いられる「薬学的製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されるような、当技術分野における技術の範囲内である。 The method of the present invention is described in more detail below.
The double-stranded molecules of the invention can be formulated as a pharmaceutical composition prior to administration to a subject according to techniques known in the art. The pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it is at least sterile and pyrogen-free. As used herein, “pharmaceutical formulation” includes formulations for human and veterinary use. Methods for preparing the pharmaceutical compositions of the invention are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. It is within the skill of the art as described.

本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容される担体媒体と混合された、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つもしくはそれらをコードするベクター（例えば、０．１〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容される塩を含む。例示的な生理学的に許容される担体媒体には、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が含まれる。   The pharmaceutical formulation of the present invention comprises at least one of the double-stranded molecules of the present invention or a vector encoding them (for example, 0.1 to 90% by weight) mixed with a physiologically acceptable carrier medium, Or a physiologically acceptable salt of the molecule. Exemplary physiologically acceptable carrier media include, for example, water, buffered water, saline, 0.4% saline, 0.3% glycine, hyaluronic acid, and the like.

本発明によれば、組成物は複数種類の二本鎖分子を含んでよく、該分子のそれぞれは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の同一標的配列または異なる標的配列に指向し得る。例えば、組成物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子に指向する二本鎖分子を含み得る。あるいは、例えば組成物は、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子より選択される標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。   According to the present invention, the composition may comprise multiple types of double stranded molecules, each of which may be directed to the same target sequence or different target sequences of the CDC45L or PIF1 gene. For example, the composition can include a double-stranded molecule directed to the CDC45L or PIF1 gene. Alternatively, for example, the composition can include a double-stranded molecule directed to a target sequence selected from the CDC45L and PIF1 genes.

さらに、本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含み得る。例えば、ベクターは、１種類、２種類、または数種類の本発明の二本鎖分子をコードし得る。あるいは、本発明の組成物は、それぞれが異なる二本鎖分子をコードする、複数種類のベクターを含み得る。   Furthermore, the composition of the invention may comprise a vector encoding one or more double-stranded molecules. For example, a vector can encode one, two, or several types of double-stranded molecules of the invention. Alternatively, the composition of the present invention may comprise multiple types of vectors, each encoding a different double-stranded molecule.

さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含まれ得る。リポソームの詳細に関しては、「（ｉｉｉ）二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害または低減し、がんを治療または予防する方法」の項を参照されたい。   Furthermore, the double-stranded molecule of the present invention may be included as a liposome in the composition of the present invention. For details of liposomes, see the section “(iii) Method of Inhibiting or Reducing Cancer Cell Growth and Treating or Preventing Cancer Using a Double-Stranded Molecule”.

本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。   The pharmaceutical compositions of the present invention may also contain conventional pharmaceutical excipients and / or additives. Suitable pharmaceutical excipients include stabilizers, antioxidants, osmotic pressure adjusting agents, buffers, and pH adjusting agents. Suitable additives include physiologically biocompatible buffers (eg tromethamine hydrochloride), chelating agents (eg DTPA or DTPA-bisamide) or calcium chelate complexes (eg calcium DTPA, CaNaDTPA- Addition of calcium salts or sodium salts (eg, calcium chloride, calcium ascorbate, calcium gluconate, or calcium lactate). The pharmaceutical compositions of the invention can be packaged for use in liquid form, or can be lyophilized.

固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いることができる。   The solid composition may be a conventional non-toxic solid carrier such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, talcum, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate and the like.

例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、例えば２５〜７５％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための薬学的組成物は、上記のようにリポソーム中に封入される０．０１〜２０重量％、例えば１〜１０重量％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数、および噴霧剤を含み得る。必要に応じて、担体、例えば鼻腔内送達の場合はレシチンを含めることもできる。   For example, a solid pharmaceutical composition for oral administration comprises any one of the above carriers and excipients and one or more of 10-95%, eg 25-75% of the double-stranded molecules of the invention. May be included. A pharmaceutical composition for aerosol (inhalation) administration comprises 0.01-20% by weight of one of the double-stranded molecules of the invention encapsulated in a liposome as described above, eg 1-10% by weight or Multiple and propellants may be included. If desired, a carrier can also be included, such as lecithin for intranasal delivery.

上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的有効成分を含み得る。例えば、本組成物は、がんを治療するために従来用いられている化学療法薬を含み得る。   In addition to the above, the composition of the present invention may contain other pharmaceutically active ingredients as long as they do not inhibit the in vivo function of the double-stranded molecule of the present invention. For example, the composition can include chemotherapeutic agents conventionally used to treat cancer.

本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療するための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療するための薬学的組成物の製造のための、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における、該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用であって、該分子が、互いにハイブリダイズして該二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする、使用に関する。   The present invention also provides the use of the double stranded nucleic acid molecule of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating a cancer that (over) expresses the CDC45L and / or PIF1 gene. For example, the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition for treating a cancer that (over) expresses a CDC45L and / or PIF1 gene in a cell overexpressing the CDC45L or PIF1 gene. ) The use of a double-stranded nucleic acid molecule that inhibits expression, the molecule comprising a sense strand that hybridizes to each other to form the double-stranded nucleic acid molecule and an antisense strand complementary thereto, and SEQ ID For use targeting NO: 9, 10, 11 or 12 sequences.

あるいは、本発明はさらに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現するがんの治療に使用するための、本発明の二本鎖核酸分子を提供する。   Alternatively, the present invention further provides a double-stranded nucleic acid molecule of the present invention for use in the treatment of a cancer that expresses CDC45L and / or PIF1 gene.

本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される担体を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に製剤化する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつ有効成分として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする。   The invention further comprises formulating a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier with a double stranded nucleic acid molecule that inhibits (over) expression of the gene in cells that overexpress the CDC45L or PIF1 gene. Provided is a method or process for producing a pharmaceutical composition for the treatment of cancer that (over) expresses the CDC45L and / or PIF1 gene, wherein the molecules hybridize to each other to form a double stranded nucleic acid It contains a sense strand that forms a molecule and an antisense strand complementary thereto, and targets the sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12 as an active ingredient.

本発明はまた、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、ここで、該有効成分が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする。   The present invention also produces a pharmaceutical composition for the treatment of cancer that (over) expresses the CDC45L and / or PIF1 gene comprising the step of mixing the active ingredient with a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier. There is also provided a method or process for the treatment wherein the active ingredient is a double stranded nucleic acid molecule that inhibits expression of the gene in cells that overexpress the CDC45L or PIF1 gene, the molecules hybridizing to each other. A sense strand that forms a double-stranded nucleic acid molecule and an antisense strand complementary thereto, and targets the sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12.

（４）ＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがんを診断するための方法
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現は、対応する正常組織と比較して、肺癌組織において特異的に上昇することが見出された（図１、図２）。さらに、ＰＩＦ１遺伝子の発現もまた、対応する正常肺組織と比較して、肺癌組織において特異的に上昇することが見出された（図４）。したがって、本発明において同定された遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんのマーカーとしての診断的有用性を有し、かつ、がんに罹患している疑いのある患者に由来する試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現を測定することにより、これらのがんを診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定することにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるがんを診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断可能なＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１促進性のがんには、肺癌が含まれる。肺癌には、非小肺癌、小肺癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および肺大細胞癌（ＬＣＣ）が含まれる。本発明に従って、対象の状態を調べるための中間結果が提供され得る。そのような中間結果を付加的な情報と組み合わせて、医師、看護師、または他の実施者が、対象が疾患に罹患していると診断するのを補助することができる。あるいは、本発明を用いて対象由来の組織中のがん性細胞を検出し、該対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。 (4) Method for diagnosing CDC45L-mediated cancer It was found that the expression of the CDC45L gene is specifically increased in lung cancer tissues compared to the corresponding normal tissues (FIGS. 1 and 2). ). Furthermore, the expression of the PIF1 gene was also found to be specifically elevated in lung cancer tissues compared to the corresponding normal lung tissues (FIG. 4). Therefore, the genes identified in the present invention and their transcripts and translation products have diagnostic utility as cancer markers mediated by CDC45L and / or PIF1 genes, and suffer from cancer. These cancers can be diagnosed by measuring the expression of the CDC45L and / or PIF1 gene in a sample derived from a suspected patient. Specifically, the present invention provides a method for diagnosing cancer mediated by CDC45L and / or PIF1 by measuring the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a subject. CDC45L and / or PIF1-promoting cancers that can be diagnosed by the methods of the present invention include lung cancer. Lung cancer includes non-small lung cancer, small lung cancer, lung adenocarcinoma (ADC), lung squamous cell carcinoma (SCC), and large cell lung cancer (LCC). In accordance with the present invention, an intermediate result for examining a subject's condition may be provided. Such intermediate results can be combined with additional information to assist a doctor, nurse, or other practitioner in diagnosing a subject as suffering from a disease. Alternatively, the present invention can be used to detect cancerous cells in tissue derived from a subject and provide doctors with information useful for diagnosing that the subject is suffering from a disease.

具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［１５］を提供する：
［１］ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１によって仲介または促進されるがんを診断する方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した発現レベルの上昇を疾患と関連づける段階
を含む、方法。
［２］対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象ががんに罹患しているかもしくはその発症リスクを有することが示されるかまたは該対象におけるがんの存在が示される方法、
［３］発現レベルが正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、［１］または［２］の方法。
［４］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか１つによって検出される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法。
［５］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質の１つまたは複数の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法。
［６］がんが、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因するか、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１によって仲介もしくは促進される、［１］〜［５］のいずれか１つの方法。
［７］がんが肺癌である、［１］〜［６］のいずれか１つの方法。
［８］肺癌が非小細胞肺癌または小細胞肺癌である、［７］の方法。
［９］発現レベルが、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードする遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、［４］または［５］の方法。
［１０］発現レベルが、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することにより測定される、［４］または［５］の方法。
［１１］生物学的試料が生検試料、痰、または血液を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１２］対象由来の生物学的試料が上皮細胞、血清、または胸水を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１３］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１］〜［１３］のいずれかの方法。
［１５］対象由来の生物学的試料が肺組織を含む、［１］〜［１０］のいずれかの方法。 Specifically, the present invention provides the following methods [1] to [15]:
[1] A method for diagnosing cancer mediated or promoted by CDC45L or PIF1,
(A) detecting the expression level of the CDC45L gene and / or PIF1 gene in a biological sample from the subject; and (b) correlating an increase in the expression level of the gene relative to the normal control level with the disease. Including.
[2] A method for detecting or diagnosing cancer in a subject, comprising measuring the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a biological sample derived from the subject, wherein the level is a normal control level of the gene A method that indicates that the subject is suffering from or at risk of developing cancer, or that the presence of cancer in the subject is indicated by
[3] The method of [1] or [2], wherein the expression level is at least 10% above the normal control level.
[4] The expression level is
(A) detecting mRNA encoding CDC45L or PIF1 polypeptide;
Detected by any one of the methods selected from the group consisting of (b) detecting CDC45L or PIF1 polypeptide; and (c) detecting the biological activity of CDC45L or PIF1 polypeptide, [ 1]-any one method of [3].
[5] The expression level is
(A) detecting mRNA of CDC45L gene and / or mRNA of PIF1 gene;
(B) detecting a protein encoded by the CDC45L gene and / or a protein encoded by the PIF1 gene, and (c) one of the protein encoded by the CDC45L gene and / or the protein encoded by the PIF1 gene or The method according to any one of [1] to [3], which is measured by a method selected from the group consisting of detecting a plurality of biological activities.
[6] The method of any one of [1] to [5], wherein the cancer is caused by overexpression of CDC45L or PIF1, or is mediated or promoted by CDC45L or PIF1.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the cancer is lung cancer.
[8] The method of [7], wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer or small cell lung cancer.
[9] The method of [4] or [5], wherein the expression level is measured by detecting hybridization of a probe to a gene transcript encoding CDC45L or PIF1 polypeptide.
[10] The method of [4] or [5], wherein the expression level is measured by detecting binding of an antibody to CDC45L or PIF1 polypeptide.
[11] The method of any one of [1] to [10], wherein the biological sample comprises a biopsy sample, sputum, or blood.
[12] The method of any one of [1] to [10], wherein the biological sample from the subject comprises epithelial cells, serum, or pleural effusion.
[13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the subject-derived biological sample contains cancer cells.
[14] The method according to any one of [1] to [13], wherein the subject-derived biological sample contains cancerous epithelial cells.
[15] The method according to any one of [1] to [10], wherein the subject-derived biological sample contains lung tissue.

がんを診断する方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の方法によって診断される対象は、哺乳動物であってよい。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。 The method for diagnosing cancer is described in more detail below.
The subject diagnosed by the method of the present invention may be a mammal. Exemplary mammals include, but are not limited to, humans, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows.

本発明の方法を実施する際には、診断される対象から生物学的試料を採取して、診断を行う。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を測定のための生物学的試料として用いることができる。生物学的試料には、身体組織ならびに体液、例えば血液、例えば血清、痰、尿、および胸水が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、生物学的試料は、上皮細胞、例えば癌性上皮細胞、または癌性と疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞群を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後生物学的試料として用いることができる。   In carrying out the method of the present invention, a biological sample is collected from the subject to be diagnosed and diagnosed. Any biological material can be used as a biological sample for measurement as long as it contains the desired transcript or translation product of CDC45L and / or PIF1 gene. Biological samples include, but are not limited to, body tissues and fluids such as blood, such as serum, sputum, urine, and pleural effusion. In some embodiments, the biological sample comprises a group of cells comprising epithelial cells, eg, cancerous epithelial cells, or epithelial cells derived from tissue suspected of being cancerous. Furthermore, if necessary, the cells can be purified from the collected body tissue and fluid and then used as a biological sample.

本発明に従って、対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンブロット解析）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するためであってよい。当業者は、ＣＤＣ４５Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００３５０４．３）またはＰＩＦ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２５０４９．２）の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、適切な標識、例えば色素、蛍光物質、および同位体でプローブを標識することができ、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出することができる。   According to the present invention, the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene in a biological sample from a subject is measured. Expression levels can be measured at the transcription (nucleic acid) product level using methods known in the art. For example, CDC45L or PIF1 gene mRNA can be quantified using a probe by a hybridization method (eg, Northern blot analysis). Detection can be performed on a chip or array. The use of the array may be for detecting the expression level of multiple genes (eg, various cancer specific genes) including the CDC45L and PIF1 genes. A person skilled in the art uses such sequence information of CDC45L (SEQ ID NO: 13; GenBank accession number: NM_003504.3) or PIF1 (SEQ ID NO: 15; GenBank accession number: NM_02549.2), Probes can be prepared. For example, CDC45L or PIF1 gene cDNA can be used as a probe. If necessary, the probe can be labeled with an appropriate label, such as a dye, a fluorescent substance, and an isotope, and the expression level of the gene can be detected as the intensity of the hybridized label.

さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写産物を定量することができる。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で用いられるプライマー（ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されない。   Furthermore, transcription products of CDC45L or PIF1 gene can be quantified using primers by amplification-based detection methods (eg, RT-PCR). Such primers can also be prepared based on available sequence information of the gene. For example, the primers used in the “Examples” (SEQ ID NO: 1 and 2 for CDC45L, SEQ ID NO: 3 and 4 for PIF1) can be used for detection by RT-PCR or Northern blot. However, the present invention is not limited to them.

具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。   Specifically, the probe or primer used in the method of the present invention hybridizes with CDC45L or PIF1 gene mRNA under stringent, moderately stringent or low stringent conditions.

あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。タンパク質検出のためのこのような種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。   Alternatively, the translation product can be detected for the diagnosis of the present invention. For example, the amount of CDC45L or PIF1 protein can be measured. The method for measuring the amount of the protein as a translation product includes an immunoassay using an antibody that specifically recognizes the protein. The antibody may be monoclonal or polyclonal. Furthermore, as long as the fragment retains the ability to bind to CDC45L or PIF1 protein, any fragment or modification of the antibody (eg, chimeric antibody, scFv, Fab, F (ab ′) 2, Fv, etc.) can be detected. Can be used. Methods for preparing such types of antibodies for protein detection are well known in the art, and any method can be used in the present invention to prepare such antibodies and their equivalents. it can.

ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色が観察されることにより、該タンパク質の存在量の増加、および同時にＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の高い発現レベルが示される（「実施例」における免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析を参照されたい）。   As another method for detecting the expression level of CDC45L and / or PIF1 based on its translation product, the staining intensity can be observed by immunohistochemical analysis using an antibody against CDC45L or PIF1 protein. That is, the observation of strong staining indicates an increase in the abundance of the protein and at the same time a high expression level of CDC45L or PIF1 (see immunohistochemistry and tissue microarray analysis in “Examples”). .

さらに、診断の精度を向上させるために、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。   Furthermore, in order to improve the accuracy of diagnosis, in addition to the expression level of CDC45L and / or PIF1, the expression level of other cancer-related genes such as genes that are known to be differentially expressed in cancer Can also be measured.

生物学的試料中のＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応する（例えば正常細胞または非がん性細胞内の）がんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇したと見なすことができる。   The expression level of the cancer marker gene comprising CDC45L and PIF1 in the biological sample is, for example, 10%, 25% from the control level of the corresponding cancer marker gene (eg, in normal cells or non-cancerous cells). , Or 50% rise, or if it rises above 1.1 times, 1.5 times, 2.0 times, 5.0 times, 10.0 times or more Can be considered elevated.

対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している一名／複数名の対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを、複数の参照試料から測定された複数の対照レベルと比較することもできる。いくつかの態様では、患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルが用いられる。いくつかの態様では、疾患状態が判明している群におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルの基準値が用いられる。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。   The control level is determined simultaneously with the test biological sample by using a sample previously collected and stored from one or more subjects with known disease state (cancerous or non-cancerous). Can be measured. Alternatively, control levels are determined by statistical methods based on results obtained by analyzing pre-measured expression levels of CDC45L and / or PIF1 in samples from subjects with known disease states You can also In addition, the control level may be a database of expression patterns from previously tested cells. Further, according to one aspect of the invention, the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a biological sample can be compared to multiple control levels measured from multiple reference samples. In some embodiments, control levels measured from a reference sample derived from a tissue type similar to that of a patient-derived biological sample are used. In some embodiments, a reference value for the expression level of CDC45L or PIF1 in a group with known disease state is used. The reference value can be obtained by any method known in the art. For example, the mean value ± 2 S.V. D. Or the mean value ± 3S. D. Can be used as a reference value.

本発明の文脈において、がん性でないと判明している生物学的試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。例えば、癌性器官と同じ器官から採取された正常組織を診断することができる。したがって、正常肺組織を、肺癌を診断するための正常対照として診断することができる。一方、対照レベルががん性生物学的試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。   In the context of the present invention, a control level measured from a biological sample that has been found not to be cancerous is referred to as a “normal control level”. For example, normal tissues collected from the same organ as the cancerous organ can be diagnosed. Thus, normal lung tissue can be diagnosed as a normal control for diagnosing lung cancer. On the other hand, if the control level is measured from a cancerous biological sample, this is referred to as the “cancerous control level”.

ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象を、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有すると診断することができる。さらに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象が、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。そのようながんは肺癌を包含する。   A subject is mediated by a cancer, eg, CDC45L and / or PIF1, if the expression level of CDC45L and / or PIF1 is elevated compared to a normal control level or similar to a cancerous control level Or can be diagnosed as having or at risk of developing cancer resulting from its overexpression. Further, when comparing the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene, the similarity in gene expression pattern between the sample and the cancerous reference indicates that the subject has cancer, eg, CDC45L and / or It is shown to be suffering from or at risk of developing cancer mediated by PIF1 or due to its overexpression. Such cancers include lung cancer.

試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの差を、細胞のがん性状態および非がん性状態によって発現レベルが相違しないことが既知である対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。   The difference between the expression level of the test biological sample and the control level is compared to the expression level of a control nucleic acid, such as a housekeeping gene, whose expression level is known not to vary depending on the cancerous and non-cancerous state of the cell. Can be normalized. Exemplary control genes include, but are not limited to, β-actin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and ribosomal protein P1.

あるいは、本発明は、対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象由来の肺組織試料中の癌細胞を検出または同定するための方法を提供し、ここで、該発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該組織中の癌細胞の存在または疑いが示される。   Alternatively, the present invention provides a method for detecting or identifying cancer cells in a lung tissue sample from a subject comprising measuring the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene in a biological sample from the subject. Provided, wherein the expression level is increased relative to the normal control level of the gene, which indicates the presence or suspicion of cancer cells in the tissue.

対象が疾患に罹患していると診断する際、医師、看護師、または他の医療実施者を補助するために、そのような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。言い換えれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明に従って、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関して疑いがある場合には、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および該対象の臨床経過等を含む該疾患の別の局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血中の診断用肺腫瘍マーカーは、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間結果として役立つ。   Such results can be combined with additional information to assist a doctor, nurse, or other medical practitioner in diagnosing the subject as suffering from a disease. In other words, the present invention may provide doctors with information useful for diagnosing a subject as suffering from a disease. For example, in accordance with the present invention, in the case of doubt about the presence of cancer cells in tissue taken from a subject, in addition to the expression level of CDC45L and / or PIF1 gene, histopathology, known tumor markers in blood Considering other aspects of the disease, including the level of and the clinical course of the subject, etc., a clinical decision can be reached. For example, some well-known diagnostic lung tumor markers in blood are IAP, ACT, BFP, CA19-9, CA50, CA72-4, CA130, CEA, KMO-1, NSE, SCC, SP1, Span-1 , TPA, CSLEX, SLX, STN, and CYFRA. That is, in this particular embodiment of the invention, the results of gene expression analysis serve as intermediate results for further diagnosis of the disease state of interest.

あるいは、本発明は、がんの診断用の診断試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。 Alternatively, the present invention provides the use of a reagent for preparing a diagnostic reagent for cancer diagnosis. In some embodiments, the reagent is
(A) a reagent for detecting mRNA of CDC45L or PIF1 gene;
It can be selected from the group consisting of (b) a reagent for detecting CDC45L or PIF1 protein; and (c) a reagent for detecting biological activity of CDC45L or PIF1 protein.

具体的には、そのような試薬は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する抗体である。   Specifically, such a reagent is an oligonucleotide that hybridizes to a CDC45L or PIF1 polynucleotide, or an antibody that binds to a CDC45L or PIF1 polypeptide.

言い換えれば、本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する試薬を含む、がんの診断または検出において使用するためのキットも提供する。   In other words, the present invention also provides a kit for use in the diagnosis or detection of cancer comprising a reagent that binds to a transcription product or translation product of the CDC45L gene or PIF1 gene.

本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１は有用な診断マーカーであるだけでなく、がん療法のための適切な標的であることが、明らかになっている。したがって、本発明によって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療を達成することができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療とは、がん細胞におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の活性および／または発現の抑制または阻害を指す。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療のために、任意の抗ＣＤＣ４５Ｌ剤または抗ＰＩＦ１剤を用いることができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療のために、剤を用いることができる。本発明において、抗ＣＤＣ４５Ｌ剤または抗ＰＩＦ１剤は、有効成分として以下の物質を含む：
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター。 In the present invention it has been shown that CDC45L or PIF1 is not only a useful diagnostic marker, but also a suitable target for cancer therapy. Therefore, according to the present invention, cancer treatment targeting CDC45L or PIF1 can be achieved. In the present invention, cancer treatment targeting CDC45L or PIF1 refers to suppression or inhibition of CDC45L or PIF1 activity and / or expression in cancer cells. Any anti-CDC45L or anti-PIF1 agent can be used for cancer treatment targeting CDC45L or PIF1. In the present invention, an agent can be used for cancer treatment targeting CDC45L or PIF1. In the present invention, the anti-CDC45L agent or anti-PIF1 agent contains the following substances as active ingredients:
(A) the double-stranded molecule of the present invention,
(B) DNA encoding it, or (c) a vector encoding it.

したがって好ましい態様において、本発明は、（ｉ）対象が治療すべきがんを有するかどうかを診断しかつ／または（ｉｉ）がん治療のために対象を選択する方法を提供し、該方法は、
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルががん性対照レベルと類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。 Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention provides a method of (i) diagnosing whether a subject has a cancer to be treated and / or (ii) selecting a subject for cancer treatment, the method comprising: ,
a) measuring the expression level of CDC45L or PIF1 in cancer cells or tissues taken from a subject suspected of having a cancer to be treated;
b) comparing the expression level of CDC45L or PIF1 with a normal control level;
c) when the expression level of CDC45L or PIF1 is elevated compared to the normal control level, the subject is diagnosed as having a cancer to be treated; and d) the subject is treated in step c) Selecting a subject for cancer treatment when diagnosed with cancer.
Alternatively, such a method comprises a) measuring the expression level of CDC45L or PIF1 in cancer cells or tissues taken from a subject suspected of having a cancer to be treated;
b) comparing the expression level of CDC45L or PIF1 to the cancerous control level;
c) diagnosing the subject as having a cancer to be treated if the expression level of CDC45L or PIF1 is similar or equivalent to a cancerous control level; and d) in step c) Selecting a subject for cancer treatment when diagnosed with having a cancer to be treated.

（５）ＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがんの予後を評価する方法
本発明は、ＣＤＣ４５Ｌの（過剰）発現がＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがん、例えば肺癌を有する患者の予後不良と有意に関連しているという発見に一部基づいている。したがって本発明は、患者の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを検出し；検出された発現レベルを対照レベルと比較し；かつ、対照レベルに対する発現レベルの上昇が予後不良（生存率低下）を示すと判定することによって、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌによって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがん、例えば肺癌を有する患者の予後を判定または評価する方法を提供する。 (5) Methods for Assessing the Prognosis of CDC45L-Mediated Cancer The present invention finds that (over) expression of CDC45L is significantly associated with poor prognosis in patients with CDC45L-mediated cancer, such as lung cancer Based in part. Thus, the present invention detects the expression level of the CDC45L gene in a patient biological sample; compares the detected expression level to a control level; and an increase in expression level relative to the control level results in a poor prognosis (decreased survival rate). To provide a method for determining or assessing the prognosis of a patient having cancer, eg, cancer mediated by or resulting from overexpression of CDC45L, eg, lung cancer.

本明細書において、「予後」という用語は、症例の性質および症状によって示される、疾患の推定される転帰および該疾患からの回復見込みに関する予想を指す。したがって、あまり好ましくない、ネガティブな、または不良な予後は、短い治療後生存期間または低い生存率によって定義される。逆に、ポジティブな、好ましい、または良好な予後は、長い治療後生存期間または高い生存率によって定義される。   As used herein, the term “prognosis” refers to a prediction regarding the estimated outcome of a disease and the likelihood of recovery from the disease as indicated by the nature and symptoms of the case. Thus, a less favorable, negative or poor prognosis is defined by a short post-treatment survival or a low survival rate. Conversely, a positive, favorable or good prognosis is defined by long post-treatment survival or high survival.

「予後を評価する」という用語は、患者のがんの将来の転帰（例えば、悪性度、がんが治癒する見込み、推定生存期間等）を予測する、予想する、または所与の検出もしくは測定と関連づける能力を指す。例えば、経時的なＣＤＣ４５Ｌの発現レベルの測定によって、患者の転帰（例えば、悪性度の上下、がんのグレードの上下、がんが治癒する見込み、生存期間等）を予測することが可能になる。   The term “assessing prognosis” is used to predict, predict, or give a given detection or measurement of the patient's future cancer outcome (eg, grade, likelihood of cancer being cured, estimated survival time, etc.) Refers to the ability to associate with For example, measurement of CDC45L expression levels over time can predict patient outcome (eg, up and down malignancy, up and down cancer grade, likelihood of cancer healing, survival time, etc.) .

本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、がん、進行、特にがんの再発、転移拡散、および疾患再発の予測および尤度解析を包含することが意図される。予後を評価するための本発明の方法は、治療的介入、診断基準、例えば病期分類、ならびに、新生物性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む、治療様式に関する判断において臨床的に用いられることが意図される。   In the context of the present invention, the phrase “assessing (or determining) prognosis” is intended to encompass prediction and likelihood analysis of cancer, progression, particularly cancer recurrence, metastatic spread, and disease recurrence. Is done. The method of the present invention for assessing prognosis is clinically used in judgments regarding therapeutic modalities, including therapeutic intervention, diagnostic criteria such as staging, and disease monitoring and monitoring for metastasis or recurrence of neoplastic disease. It is intended to be used.

具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［６］を提供する：
［１］肺癌を有する対象の予後を評価するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを検出する段階；
（ｂ）検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、患者の予後を判定する段階
を含む、方法；
［２］対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較して発現レベルが上昇していることにより予後不良が示される、［１］の方法；
［３］対照レベルが予後不良対照レベルであり、発現レベルが該対照レベルと類似していることにより予後不良が示される、［１］の方法；
［４］上昇が、前記対照レベルを少なくとも１０％上回る、［２］の方法；ならびに
［５］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、［１］〜［４］のいずれか１つの方法；
［６］対象由来の生物学的試料が肺癌組織または肺癌細胞を含む、［１］〜［５］のいずれか１つの方法。 Specifically, the present invention provides the following methods [1] to [6]:
[1] A method for evaluating the prognosis of a subject having lung cancer,
(A) detecting the expression level of CDC45L in a biological sample from the subject;
(B) comparing the detected expression level with a control level; and (c) determining the prognosis of the patient based on the comparison of (b);
[2] The method of [1], wherein the control level is a good prognosis control level, and a poor prognosis is indicated by an increased expression level compared to the control level;
[3] The method of [1], wherein the control level is a poor prognosis control level and the expression level is similar to the control level, indicating a poor prognosis;
[4] The method of [2], wherein the increase is at least 10% above the control level; and [5] the expression level is
(A) detecting mRNA of the CDC45L gene;
Measured by a method selected from the group consisting of (b) detecting the protein encoded by the CDC45L gene; and (c) detecting the biological activity of the protein encoded by the CDC45L gene [1 ] Any one method of [4];
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the biological sample derived from the subject contains lung cancer tissue or lung cancer cells.

本方法に用いられる患者由来の生物学的試料は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子が試料中で検出され得る限り、評価される対象に由来する任意の試料であってよい。いくつかの態様において、生物学的試料は肺細胞（肺から採取された細胞）を含む。さらに、生物学的試料には、体液、例えば痰、血液、血清、血漿、胸水等が含まれる。さらに、試料は組織から精製または採取された細胞であってよい。生物学的試料は、治療前、治療中、および／または治療後を含む様々な時点で、患者から採取することができる。例えば、評価される対象から採取された肺癌細胞は、好ましい生物学的試料である。   The patient-derived biological sample used in the method may be any sample derived from the subject to be evaluated, so long as the CDC45L gene can be detected in the sample. In some embodiments, the biological sample comprises lung cells (cells taken from the lung). In addition, biological samples include body fluids such as sputum, blood, serum, plasma, pleural effusion and the like. Further, the sample may be cells purified or collected from tissue. The biological sample can be taken from the patient at various times including before, during, and / or after treatment. For example, lung cancer cells collected from the subject to be evaluated are preferred biological samples.

本発明に従って、患者由来の生物学的試料中で測定されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復、および／または生存率に関する予後がより不良であり、かつ臨床転帰不良の可能性がより高いことが示された。したがって、本発明の方法によれば、比較に用いられる「対照レベル」は、例えば、治療後にがんの良好なまたはポジティブな予後を示した個体または個体群において、任意の種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後良好対照レベル」と称される。あるいは、「対照レベル」は、治療後にがんの不良なまたはネガティブな予後を示した個体または個体群において、あらゆる種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後不良対照レベル」と称される。「対照レベル」は、単一の参照群に由来する単一の発現パターンであるか、または複数の発現パターンに由来する。したがって対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん患者またはがん患者群におけるあらゆる種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。いくつかの態様において、がんは肺癌である。いくつかの態様では、疾患状態が判明している患者群におけるＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルの基準値が用いられる。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。   In accordance with the present invention, the higher the expression level of the CDC45L gene measured in a patient-derived biological sample, the worse the prognosis for post-treatment remission, recovery, and / or survival, and the poorer clinical outcome. The possibility was shown to be higher. Thus, according to the method of the present invention, the “control level” used for the comparison is, for example, in an individual or population showing a good or positive prognosis of cancer after treatment before any type of treatment. It may be the detected level of expression of the CDC45L gene, referred to herein as the “good prognosis control level”. Alternatively, the “control level” may be the expression level of the CDC45L gene detected before any type of treatment in an individual or population that has shown a poor or negative prognosis of cancer after treatment, This is referred to herein as the “poor prognosis control level”. A “control level” is a single expression pattern from a single reference group or from multiple expression patterns. Thus, the control level may be determined based on the expression level of the CDC45L gene detected prior to any kind of treatment in a cancer patient or group of cancer patients with known disease status (good prognosis or poor prognosis). it can. In some embodiments, the cancer is lung cancer. In some embodiments, a reference value for the expression level of the CDC45L gene in a group of patients with known disease states is used. The reference value can be obtained by any method known in the art. For example, the mean value ± 2 S.V. D. Or the mean value ± 3S. D. Can be used as a reference value.

対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん患者（対照または対照群）から、あらゆる種類の治療前に予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。   Control levels are tested by using pre-collected and stored samples from cancer patients (control or control group) with known disease status (good or poor prognosis) prior to any type of treatment. It can be measured simultaneously with a biological sample.

あるいは、対照レベルは、対照群から予め採取し保存しておいた試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞または患者に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することができる。いくつかの態様では、患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルが用いられる。   Alternatively, the control level can be determined by a statistical method based on the result obtained by analyzing the expression level of the CDC45L gene in a sample collected and stored in advance from the control group. In addition, the control level may be a database of expression patterns from previously tested cells or patients. Further, according to one aspect of the present invention, the expression level of the CDC45L gene in a biological sample can be compared to a plurality of control levels measured from a plurality of reference samples. In some embodiments, control levels measured from a reference sample derived from a tissue type similar to that of a patient-derived biological sample are used.

本発明に従って、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが予後良好対照レベルに類似していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、予後良好対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。一方、予後不良対照レベルと比較してＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが低下していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、該発現レベルが予後不良対照レベルと類似していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。例えば、治療後に癌の良好なまたは不良な予後を示した対象から採取された肺癌細胞は、それぞれ予後良好対照レベルまたは予後不良対照レベルの好ましい生物学的試料である。   According to the present invention, the expression level of the CDC45L gene is similar to the good prognosis control level, indicating that the patient prognosis is more favorable, and that the expression level is increased compared to the good prognosis control level Indicates that the prognosis for remission, recovery, survival, and / or clinical outcome after treatment is less favorable and poor. On the other hand, the decreased expression level of the CDC45L gene compared to the poor prognosis control level indicates that the patient's prognosis is more favorable, and the expression level is similar to the poor prognosis control level, Prognosis for remission, recovery, survival, and / or clinical outcome after treatment is shown to be less favorable and poor. For example, lung cancer cells collected from subjects who have shown a good or poor prognosis of cancer after treatment are preferred biological samples with good prognosis control levels or poor prognosis control levels, respectively.

生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルは、該発現レベルが対照レベルと１．０倍、１．５倍、２．０倍、５．０倍、１０．０倍、またはそれ以上異なる場合に、変化した（すなわち、上昇または低下した）と見なすことができる。   The expression level of the CDC45L gene in the biological sample is 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, 10.0, or more different from the control level Can be considered changed (ie, increased or decreased).

試験生物学的試料と対照レベルとの間の発現レベルの差は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、がん性細胞と非がん性細胞との間で発現レベルが相違しないことが既知であるポリヌクレオチド、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを正規化することができる。   The difference in expression level between the test biological sample and the control level can be normalized to a control, eg, a housekeeping gene. For example, a polynucleotide whose expression level is known not to differ between cancerous cells and non-cancerous cells, such as β-actin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and ribosomal protein P1 The encoding polynucleotide can be used to normalize the expression level of the CDC45L gene.

当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物学的試料中の遺伝子転写物を検出することによって、発現レベルを測定することができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。   Expression levels can be measured by detecting gene transcripts in patient-derived biological samples using techniques well known in the art. Gene transcripts detected by the methods of the present invention include both transcripts and translation products, such as mRNA and proteins.

例えば、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の転写産物は、該遺伝子転写物に対するＣＤＣ４５Ｌ遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析により、検出することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイを使用することができる。別の例として、例えばＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に特異的なプライマーを用いる、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）といった増幅に基づく検出法を、該検出に使用することができる（「実施例」における（ｂ）半定量的ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーは、ＣＤＣ４５Ｌの全配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製することができる。例えば、実施例で用いられるプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）を、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されない。   For example, the transcription product of the CDC45L gene can be detected by hybridization using a CDC45L gene probe to the gene transcript, for example, Northern blot hybridization analysis. Detection can be performed on a chip or array. Arrays can be used to detect the expression levels of multiple genes including the CDC45L gene. As another example, amplification-based detection methods such as reverse transcription-based polymerase chain reaction (RT-PCR), for example using primers specific for the CDC45L gene, can be used for the detection (in “Examples”). (B) See semi-quantitative RT-PCR). Probes or primers specific for the CDC45L gene can be designed and prepared using conventional techniques by referring to the entire CDC45L sequence (SEQ ID NO: 13). For example, the primers used in the examples (SEQ ID NO: 1 and 2) can be used for detection by RT-PCR, but the present invention is not limited thereto.

具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いられる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。通常、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３においてナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することもできる。   Specifically, the probe or primer used in the method of the present invention hybridizes with the mRNA of the CDC45L gene under stringent, moderately stringent or low stringent conditions. As used herein, the phrase “stringent (hybridization) conditions” refers to conditions under which a probe or primer hybridizes to its target sequence but not to other sequences. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Specific hybridization of longer sequences is observed at higher temperatures than shorter sequences. Generally, the temperature of stringent conditions is selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. Tm is the temperature (at a given ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target sequence hybridizes with the target sequence in equilibrium. Since target sequences are generally present in excess, at Tm, 50% of the probes are occupied in equilibrium. Usually, stringent conditions are that the salt concentration is less than about 1.0M sodium ion at pH 7.0-8.3, typically about 0.01-1.0M sodium ion (or other salt). Conditions where the temperature is at least about 30 ° C. for short probes or primers (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for longer probes or primers. Stringent conditions can also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.

あるいは、本発明の評価のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５Ｌタンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製することができる。   Alternatively, translation products can be detected for evaluation of the present invention. For example, the amount of CDC45L protein can be measured. Methods for measuring the amount of the protein as a translation product include immunoassays using an antibody that specifically recognizes the CDC45L protein. The antibody may be monoclonal or polyclonal. Furthermore, any fragment or modification of an antibody (eg, chimeric antibody, scFv, Fab, F (ab ′) 2, Fv, etc.) should be used for detection as long as the fragment retains the ability to bind to the CDC45L protein. You can also. Methods for preparing such types of antibodies for detecting proteins are well known in the art and any method in the present invention may be used to prepare such antibodies and their equivalents. Can do.

ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色の観察により、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の存在の増加、およびそれと同時にＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の高発現レベルが示される。   As another method for detecting the expression level of the CDC45L gene based on its translation product, the staining intensity can be observed by immunohistochemical analysis using an antibody against the CDC45L protein. That is, the observation of strong staining indicates an increase in the presence of CDC45L protein and at the same time a high expression level of the CDC45L gene.

さらに、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、そのような細胞増殖活性を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌを発現する細胞を調製し、生物学的試料の存在下で培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。   Furthermore, the CDC45L protein is known to have cell proliferation activity. Therefore, the expression level of the CDC45L gene can be measured using such cell proliferation activity as an index. For example, by preparing cells that express CDC45L and culturing in the presence of a biological sample, detecting the growth rate or measuring the cell cycle or colony-forming ability of the biological sample Cell proliferation activity can be measured.

さらに、評価の精度を向上させるために、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルに加えて、その他の肺細胞関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。そのような他の肺癌関連遺伝子には、国際公開公報第２００４／０３１４１３号および国際公開公報第２００５／０９０６０３号に記載されているものが含まれる。   Furthermore, in order to improve the accuracy of evaluation, in addition to the expression level of the CDC45L gene, the expression level of other lung cell-related genes such as genes that are known to be differentially expressed in lung cancer is measured. You can also. Such other lung cancer-related genes include those described in International Publication No. 2004/031413 and International Publication No. 2005/090603.

本発明の方法に従ってがんの予後について評価を受ける患者は哺乳動物であってよく、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。   Patients who are evaluated for cancer prognosis according to the methods of the present invention may be mammals, including humans, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows.

あるいは、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果もまた提供され得る。そのような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実施者が対象の予後を評価、判定、または推定するのを補助することができる。予後を評価するために、本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮され得るさらなる情報には、対象の臨床症状および身体状態が含まれる。   Alternatively, in accordance with the present invention, intermediate results may also be provided in addition to other test results for assessing a subject's prognosis. Such intermediate results can assist a physician, nurse, or other practitioner in assessing, determining, or estimating a subject's prognosis. Additional information that can be considered in combination with intermediate results obtained by the present invention to assess prognosis includes the subject's clinical symptoms and physical condition.

あるいは、本発明は、がんの予後を評価するための試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌを検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される。 Alternatively, the present invention provides the use of a reagent for preparing a reagent for assessing the prognosis of cancer. In some embodiments, the reagent is
(A) a reagent for detecting mRNA of the CDC45L gene;
Selected from the group consisting of (b) a reagent for detecting CDC45L; and (c) a reagent for detecting the biological activity of the CDC45L protein.

具体的には、そのような試薬は、ＣＤＣ４５Ｌポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに結合する抗体である。   Specifically, such a reagent is an oligonucleotide that hybridizes to a CDC45L polynucleotide, or an antibody that binds to a CDC45L polypeptide.

（６）がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキット
本発明は、がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキットを提供する。本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターで治療可能ながんに罹患している対象を判定するためのキットを提供し、これはまた、がん治療の有効性を評価および／またはモニタリングするのにも有用であり得る。いくつかの態様において、がんは、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１によって仲介されるか、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因し、例えば肺癌である。具体的には、本キットは、患者由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、該試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。 (6) Kit for diagnosing cancer or for evaluating prognosis of cancer The present invention provides a kit for diagnosing cancer or for evaluating prognosis of cancer. The present invention also provides a kit for determining a subject suffering from a cancer that can be treated with the double-stranded molecule of the present invention or a vector encoding the same, which is also effective in treating cancer. May also be useful for assessing and / or monitoring. In some embodiments, the cancer is mediated by CDC45L and / or PIF1 or is due to overexpression of CDC45L and / or PIF1, eg, lung cancer. Specifically, the kit includes at least one reagent for detecting the expression of CDC45L or PIF1 gene in a biological sample from a patient, and the reagent can be selected from the following group:
(A) a reagent for detecting mRNA of CDC45L or PIF1 gene;
(B) a reagent for detecting CDC45L or PIF1 protein; and (c) a reagent for detecting biological activity of CDC45L or PIF1 protein.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、または該ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡに特異的であるプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。   Suitable reagents for detecting CDC45L or PIF1 gene mRNAs specifically bind to CDC45L or PIF1 mRNA or are complementary to a nucleic acid that identifies the mRNA, eg, a portion of CDC45L or PIF1 mRNA. Oligonucleotides having the correct sequence are included. This type of oligonucleotide is exemplified by primers and probes that are specific for CDC45L or PIF1 mRNA. Such types of oligonucleotides can be prepared based on methods well known in the art. If necessary, a reagent for detecting CDC45L or PIF1 mRNA can be immobilized on a solid substrate. In addition, more than one reagent for detecting CDC45L or PIF1 mRNA can be included in the kit.

プローブまたはプライマーは、特定のサイズのものであってよい。サイズは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドからなる群より選択され、プローブおよびプライマーは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドのサイズ範囲であってよい。   The probe or primer may be of a specific size. The size is selected from the group consisting of at least 10 nucleotides, at least 12 nucleotides, at least 15 nucleotides, at least 20 nucleotides, at least 25 nucleotides, at least 30 nucleotides, and the probes and primers are 5-10 nucleotides, 10-15 nucleotides, 15-20 It may range in size from nucleotides, 20-25 nucleotides, and 25-30 nucleotides.

一方、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するのに適した試薬には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。さらに、直接連結または間接標識技術により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識および、抗体を標識してその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。   On the other hand, suitable reagents for detecting CDC45L or PIF1 protein include antibodies to CDC45L or PIF1 protein. The antibody may be monoclonal or polyclonal. Furthermore, any fragment or modified antibody (for example, chimeric antibody, scFv, Fab, F (ab ′) 2, Fv, etc.) is used as a reagent as long as the fragment retains the ability to bind to CDC45L or PIF1 protein. It can also be used. Methods for preparing such types of antibodies for detecting proteins are well known in the art, and any method is used in the present invention to prepare such antibodies and their equivalents. be able to. Furthermore, the antibody can be labeled with a signal generating molecule by direct linkage or indirect labeling techniques. Labels and methods for labeling antibodies and detecting antibody binding to their targets are well known in the art, and any label and method can be used in the present invention. In addition, more than one reagent for detecting CDC45L or PIF1 protein can be included in the kit.

さらに、例えば、生物学的試料中の発現したＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質による細胞増殖活性を測定することにより、生物学的活性を測定することができる。例えば、患者由来の生物学的試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。必要に応じて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。   Furthermore, biological activity can be measured, for example, by measuring cell proliferation activity by expressed CDC45L or PIF1 protein in a biological sample. For example, after culturing cells in the presence of a biological sample derived from a patient, the cell proliferation activity of the biological sample is measured by detecting the growth rate or measuring the cell cycle or colony forming ability. be able to. If necessary, a reagent for detecting CDC45L or PIF1 mRNA can be immobilized on a solid substrate. In addition, more than one reagent for detecting the biological activity of the CDC45L or PIF1 protein can be included in the kit.

キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。さらに、キットは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対するプローブまたはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、予後良好または予後不良である患者から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器内に含まれ得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。   The kit can include two or more of the aforementioned reagents. In addition, the kit includes solid substrates and reagents for binding probes to CDC45L or PIF1 gene or antibodies to CDC45L or PIF1 protein, media and containers for culturing cells, positive and negative control reagents, and CDC45L or PIF1 protein A secondary antibody for detecting the antibody may be included. For example, a tissue sample taken from a patient with a good or poor prognosis can serve as a useful control reagent. The kit of the present invention is desirable from a commercial and user standpoint, including buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts (eg, documents, tapes, CD-ROM, etc.) containing instructions for use. Other materials may further be included. These reagents and the like can be contained in a labeled container. Suitable containers include bottles, vials, and test tubes. The container may be formed from a variety of materials such as glass or plastic.

本発明の１つの態様として、試薬がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を固体基質上、例えば多孔性ストリップ上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定領域または検出領域には、核酸（プローブ）をそれぞれ含む複数の部位が含まれ得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより大量、以降の部位ではより少量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。   As one aspect of the present invention, when the reagent is a probe for CDC45L or PIF1 mRNA, the reagent can be immobilized on a solid substrate, eg, a porous strip, to form at least one detection site. . The measurement region or detection region of the porous strip can include a plurality of sites each containing a nucleic acid (probe). The test strip can also include sites for negative and / or positive controls. Alternatively, the control site can be located on a separate strip from the test strip. Optionally, the different detection sites can contain different amounts of immobilized nucleic acid, ie, more in the first detection site and less in subsequent sites. When a test sample is added, the number of sites that exhibit a detectable signal provides a quantitative indicator of the amount of CDC45L or PIF1 mRNA present in the sample. The detection site can be configured in any shape that can be suitably detected and is typically in the shape of a bar or dot across the width of the test strip.

本発明のキットは、陽性対照試料またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１陽性血液試料を回収することによって調製することができ、次にそれらのＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１レベルを分析する。あるいは、精製されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を含まない血清に添加して、陽性試料すなわちＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１標準物質を形成することもできる。本発明において、精製されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１レベルは、例えばカットオフ値を上回る。   The kit of the present invention may further comprise a positive control sample or a CDC45L or PIF1 standard sample. Positive control samples of the present invention can be prepared by collecting CDC45L or PIF1 positive blood samples and then analyzing their CDC45L or PIF1 levels. Alternatively, purified CDC45L or PIF1 protein or polynucleotide can be added to serum free of CDC45L or PIF1 to form a positive sample, ie CDC45L or PIF1 standard. In the present invention, purified CDC45L or PIF1 may be a recombinant protein. The CDC45L or PIF1 level of the positive control sample is above the cutoff value, for example.

（７）スクリーニング法
ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはその断片、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、該遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変更する剤または化合物をスクリーニングすることが可能である。そのような剤または化合物は、がん、特に肺癌を治療または予防するための医薬として用いることができる。したがって本発明は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはその断片、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、がんを治療または予防するための候補剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。 (7) Screening method Using the CDC45L or PIF1 gene, a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof, or a transcriptional regulatory region of the gene, expression of the gene, or biology of the polypeptide encoded by the gene It is possible to screen for agents or compounds that alter the physical activity. Such an agent or compound can be used as a medicament for treating or preventing cancer, particularly lung cancer. Accordingly, the present invention provides a method for screening a candidate agent or compound for treating or preventing cancer using the CDC45L or PIF1 gene, a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof, or a transcriptional regulatory region of the gene. I will provide a.

本発明のスクリーニング法によって単離される剤または化合物は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現または該遺伝子の翻訳産物の活性を阻害することが予想される物質であり、したがって、例えば、がん（特に、肺癌および食道癌）などの細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するための候補である。すなわち、本発明の方法によってスクリーニングされた剤または化合物は、臨床的利点を有すると考えられ、動物モデルまたは試験対象においてがん細胞増殖を予防する能力についてさらに試験することができる。   The agent or compound isolated by the screening method of the present invention is a substance expected to inhibit the expression of the CDC45L or PIF1 gene or the activity of the translation product of the gene, and thus, for example, cancer (particularly lung cancer). And candidates for the treatment or prevention of diseases caused by cell proliferative diseases such as esophageal cancer). That is, agents or compounds screened by the methods of the present invention are believed to have clinical advantages and can be further tested for the ability to prevent cancer cell growth in animal models or test subjects.

（Ｉ）スクリーニング用の試験化合物
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤は、複数の化合物を含む任意の化合物または組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。 (I) Test Compound for Screening In the context of the present invention, the agent identified by this screening method can be any compound or composition comprising a plurality of compounds. Furthermore, the test agent or test compound exposed to the cell or protein by the screening method of the present invention may be a single compound or a combination of compounds. When a combination of compounds is used in the method, the compounds can be contacted sequentially or simultaneously.

本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。   In the screening method of the present invention, any test agent or test compound, for example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified protein or crude protein, Peptides, non-peptide compounds, synthetic micromolecular compounds (including nucleic acid constructs such as antisense DNA, siRNA, ribozymes, etc.) and natural compounds can be used. The test agents or test compounds of the present invention are (1) biological library methods, (2) spatially addressable parallel solid phase library methods or solution phase library methods, and (3) synthesis requiring deconvolution. Using any of a number of approaches in combinatorial library methods known in the art, including library methods, (4) “one bead one compound” library methods, and (5) synthetic library methods using affinity chromatography selection. It can also be obtained.

アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２−１０３３６０号）の表面に提供され得る。   Biological library methods using affinity chromatography selection are limited to peptide libraries, but the other four approaches are also applicable to compound peptide libraries, non-peptide oligomer libraries, or small molecule libraries (Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67). Examples of methods for synthesizing molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13, Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91 : 11422-6, Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994, Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5, Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059 Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061, Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51). Compound libraries can be in solution (see Houghten, Bio / Techniques 1992, 13: 412-21) or beads (Lam, Nature 1991, 354: 82-4), chips (Fodor, Nature 1993, 364 : 555-6), bacteria (US Pat. No. 5,223,409), spores (US Pat. Nos. 5,571,698, 5,403,484, and 5,223,409) , Plasmid (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9) or phage (Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90, Devlin, Science 1990, 249: 404-6, Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82, Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10, US Patent Application No. 2002-103360).

本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる化合物に含まれる。   A compound obtained by converting a part of the structure of the compound screened by any of the screening methods by addition, deletion, and / or substitution is included in the compound obtained by the screening method of the present invention.

さらに、スクリーニングした試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験剤または試験化合物の調製において有用である。   Further, when the screened test agent or test compound is a protein, in order to obtain DNA encoding the protein, the entire amino acid sequence of the protein may be determined to estimate the nucleic acid sequence encoding the protein, Alternatively, the partial amino acid sequence of the obtained protein can be analyzed, an oligo DNA can be prepared as a probe based on the sequence, and a cDNA library can be screened using the probe to obtain DNA encoding the protein. . The resulting DNA is useful in the preparation of test agents or test compounds that are candidates for treating or preventing cancer.

本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物とは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質またはパートナーに対する結合活性が欠如したＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の部分ペプチドに特異的に結合する、抗体または非抗体結合タンパク質でもあり得る。そのような部分タンパク質または抗体は、本明細書に記載の方法（定義または抗体の（１）がん関連遺伝子およびがん関連タンパク質、ならびにこれらの機能的同等物を参照されたい）によって調製することができ、かつ、それらがタンパク質とその結合パートナーとの結合を遮断する能力について試験することができる。試験剤または試験化合物のライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤または化合物のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。   A test agent or test compound useful in the screening described herein is an antibody or non-antibody binding that specifically binds to a CDC45L or PIF1 protein or a partial peptide of CDC45L or PIF1 that lacks binding activity to a partner. It can also be a protein. Such partial proteins or antibodies are prepared by the methods described herein (see definition or antibody (1) Cancer-related genes and cancer-related proteins, and functional equivalents thereof). And can be tested for their ability to block the binding of the protein to its binding partner. Although the construction of a library of test agents or test compounds is well known in the art, hereinafter, further guidance on the identification of test agents and the construction of libraries of such agents or compounds for the screening methods of the present invention is provided herein. I will provide a.

（ｉ）分子モデリング
試験剤／試験化合物のライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、阻害される標的分子の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤／試験化合物とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングである。 (I) Molecular modeling Building a library of test agents / test compounds is easier by knowing the molecular structure of the compound known to have the required properties and / or the molecular structure of the target molecule to be inhibited Become. One approach to prescreen test agents or test compounds suitable for further evaluation is computer modeling of the interaction between the test agent / test compound and its target.

コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）コンピュータが必要である。   Computer modeling technology allows visualization of the three-dimensional atomic structure of a selected molecule and the rational design of new compounds that are believed to interact with the molecule. Three-dimensional construction typically depends on X-ray crystallographic or NMR imaging data of selected molecules. Molecular dynamics requires force field data. Computer graphics systems allow prediction of how new compounds bind to the target molecule, allowing experimental manipulation of the structure of the compound and the target molecule to improve binding specificity. To predict what happens to a molecule-compound interaction when a minor change is made to one or both, it usually has a user-friendly menu-style interface between the molecular design program and the user. There is also a need for molecular mechanics software and a computationally intensive computer.

上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。   Examples of molecular modeling systems outlined above include the CHARMm program and the QUANTA program (Polygen Corporation, Waltham, Mass). CHARMm performs the functions of energy minimization and molecular dynamics. QUANTA performs molecular structure building, graphic modeling, and analysis. QUANTA allows interactive construction, modification, visualization, and behavioral analysis of molecules relative to each other.

多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay &amp; Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry &amp; Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis &amp; Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。   Numerous papers such as Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66, Ripka, New Scientist 1988, 54-8, McKinlay &amp; Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22, Perry &amp; Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93, Lewis &amp; Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62, and Askew et al., J Am for model receptors for nucleic acid components Chem Soc 1989, 111: 1082-90 reviews computer modeling of drugs that interact with specific proteins.

化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。   Other computer programs for screening and schemating chemicals are available from BioDesign, Inc. (Pasadena, Calif.), Allelix, Inc (Mississauga, Ontario, Canada), and Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). For example, DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9, Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24, Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78, Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50.

後述のように、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１活性のインヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定されたインヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた候補インヒビターすなわち「試験剤／試験化合物」のライブラリを、がんの治療および／もしくは予防ならびに／またはがんの術後再発の防止に関するＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の活性を妨害する該ライブラリの試験剤または試験化合物を同定するための本発明の方法を用いて、スクリーニングすることができる。   As described below, once an inhibitor of CDC45L or PIF1 activity is identified, combinatorial chemistry techniques can be used to construct any number of variants based on the chemical structure of the identified inhibitor. The resulting library of candidate inhibitors or “test agents / test compounds” is used as a test agent of the library that interferes with the activity of CDC45L or PIF1 for the treatment and / or prevention of cancer and / or prevention of postoperative recurrence of cancer. Alternatively, screening can be done using the methods of the invention for identifying test compounds.

（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１活性の既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築することができる。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。 (Ii) Combinatorial chemical synthesis Combinatorial libraries of test agents or test compounds can be created as part of a rational drug design program that requires knowledge of the core structure present in known inhibitors of CDC45L or PIF1 activity . This approach makes it possible to maintain the library at an appropriate size, which facilitates high throughput screening. Alternatively, simple, particularly short polymer molecular libraries can be constructed by simply synthesizing all permutations of the molecular families that make up the library. An example of this latter approach is a library where all peptides are 6 amino acids long. Such a peptide library may contain a sequence permutation every 6 amino acids. This type of library is referred to as a linear combinatorial chemical library.

コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（ｒａｎｄｏｍ ｂｉｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。   The preparation of combinatorial chemical libraries is well known to those skilled in the art and can be made either by chemical synthesis or biological synthesis. For combinatorial chemical libraries, see peptide libraries (see, eg, US Pat. No. 5,010,175, Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93, Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6. Be included) is included without limitation. Other chemistries for creating chemical diversity libraries can also be used. Such chemistry includes peptides (eg, WO 91/19735), encoded peptides (eg, WO 93/20242), random bio-oligomers (eg, WO 92/00091), benzodiazepines (eg US Pat. No. 5,288,514), diversomers such as hydantoins, benzodiazepines, and dipeptides (DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909- 13), vinylogous polypeptide (Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568), nonpeptidal peptidomimetics with glucose backbone (Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992) , 114: 9217-8), similar to small molecule library Organic synthesis (Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661), oligocarbamate (Cho et al., Science 1993, 261: 1303), and / or peptidylphosphonate (Campbell et al. al., J Org Chem 1994, 59: 658), nucleic acid library (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA), peptide nucleic acid libraries (see, eg, US Pat. No. 5,539,083), antibody libraries (eg, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14 ( 3): 309-14, and International Application PCT / US96 / 10287), carbohydrate libraries (eg, Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22, USA No. 5,593,853), as well as small organic libraries (eg, benzodiazepines (Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6 (6): 624-31.), Isoprenoids (US patents) 5,569,588), thiazolidinone and metathiazoneone (US Pat. Nos. 5,549,974), pyrrolidine (US Pat. Nos. 5,525,735 and 5,519,134), morpholino Compounds (see US Pat. No. 5,506,337), benzodiazepines (see US Pat. No. 5,288,514) and the like, but are not limited thereto.

（ｉｉｉ）その他の候補
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott &amp; Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。 (Iii) Other Candidates Another approach uses recombinant bacteriophage to create a library. This "phage method" (Scott &amp; Smith, Science 1990, 249: 386-90, Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82, Devlin et al., Science 1990, 249: 404- 6) can be used to build very large libraries (eg 106-108 chemicals). The second approach uses primarily chemical methods, but is not limited to Geysen's method (Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15, Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74). ) And the method of Fodor et al. (Science 1991, 251: 767-73) are examples. Furka et al. (14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume # 5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93), Houghten (US Pat. No. 4,631,211), And Rutter et al. (US Pat. No. 5,010,175) describe a method for producing a mixture of peptides that can be tested as agonists or antagonists.

アプタマーは、特定の分子標的に強く結合する核酸から構成される巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249: 505-510 (1990））は、アプタマー選択のためのＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリ｛例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。 Aptamers are macromolecules composed of nucleic acids that bind strongly to specific molecular targets. Tuerk and Gold (Science. 249: 505-510 (1990)) disclose a SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method for aptamer selection. In the SELEX method, a large library of nucleic acid molecules (eg, 10 15 different molecules) can be used for screening.

（ＩＩ）スクリーニング法
（ｉ）一般的スクリーニング法
ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるタンパク質、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、該遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変更する化合物を同定することができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子は、がんにおいて過剰発現することが見出され、がん細胞の増殖および／または生存に関与することが実証された。したがって、該遺伝子の発現または該遺伝子によるポリペプチドの生物学的活性を変更する化合物は、がんの候補治療薬となり得る。 (II) Screening method (i) General screening method Using the CDC45L or PIF1 gene, the protein encoded by the gene, or the transcriptional regulatory region of the gene, the expression of the gene or the polypeptide encoded by the gene Compounds that alter biological activity can be identified. In the present invention, the CDC45L and PIF1 genes were found to be overexpressed in cancer and demonstrated to be involved in cancer cell proliferation and / or survival. Therefore, a compound that alters the expression of the gene or the biological activity of the polypeptide by the gene can be a candidate therapeutic agent for cancer.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合するアンタゴニストは、がんの細胞増殖を仲介する生物学的活性を阻害することができ、よってそれらはがんを治療するための候補である。したがって本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する剤または化合物を同定することにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現するがんを治療または予防するための潜在的候補を同定するための方法を提供する。   Antagonists that bind to CDC45L or PIF1 polypeptide can inhibit biological activities that mediate cancer cell growth, and thus are candidates for treating cancer. Accordingly, the present invention provides a method for identifying potential candidates for treating or preventing cancers that express CDC45L and / or PIF1 by identifying agents or compounds that bind to CDC45L or PIF1 polypeptide. To do.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質とその結合パートナーとの（例えば、ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の相互の）間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。例えばインビトロアッセイ系、例えば細胞系として、スクリーニングを行うことができる。より具体的には、まず、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質、あるいはその結合パートナーのいずれか一方を、支持体に結合させ、それに対してもう一方のタンパク質を試験化合物と共に添加する。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を支持体に結合させ、それに対して結合パートナーポリペプチドを試験化合物と共に添加する。次に、この混合物をインキュベーションし、洗浄し、支持体に結合しているもう一方のタンパク質を検出および／または測定する。   Many methods well known to those skilled in the art can be used to screen for compounds that inhibit binding between CDC45L or PIF1 protein and its binding partner (eg, between CDC45L and PIF1). For example, screening can be performed as an in vitro assay system, such as a cell system. More specifically, first, either CDC45L or PIF1 protein or its binding partner is bound to a support, and the other protein is added together with a test compound thereto. For example, CDC45L or PIF1 is bound to the support, to which a binding partner polypeptide is added along with the test compound. The mixture is then incubated, washed, and the other protein bound to the support is detected and / or measured.

本発明の文脈において、２つのタンパク質間の「結合の阻害」とは、タンパク質間の結合を少なくとも低減させることを指す。したがって、場合によっては、試験剤または化合物の存在下における試料中の結合対のパーセンテージは、適切な（例えば、試験化合物で処理していないか、または、非がん試料に由来するかもしくはがん試料に由来する）対照と比較して低下する。結合しているタンパク質の量の減少とは、対照試料中で結合している対の例えば９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、またはそれ以下であってもよい（例えば、０％）。   In the context of the present invention, “inhibition of binding” between two proteins refers to at least reducing binding between proteins. Thus, in some cases, the percentage of binding pairs in a sample in the presence of a test agent or compound is appropriate (eg, not treated with a test compound, or derived from a non-cancer sample or cancer Reduced compared to control (derived from sample). A decrease in the amount of bound protein is, for example, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 25% of the pair bound in a control sample. It may be less than 10%, less than 5%, less than 1%, or less (eg, 0%).

タンパク質を結合させるために使用できる支持体の例には、例えば、不溶性多糖類、例えばアガロース、セルロース、およびデキストラン；ならびに合成樹脂、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンが含まれ；例えば、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ等）を用いることができる。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填することができる。あるいは、磁気ビーズの使用もまた当技術分野において公知であり、これにより、ビーズに結合しているタンパク質を、磁力によって容易に単離することが可能になる。   Examples of supports that can be used to bind proteins include, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, cellulose, and dextran; and synthetic resins such as polyacrylamide, polystyrene, and silicon; Commercially available beads and plates prepared from (for example, multi-well plates, biosensor chips, etc.) can be used. If beads are used, they can be packed into a column. Alternatively, the use of magnetic beads is also known in the art, which allows proteins bound to the beads to be easily isolated by magnetic force.

支持体に対するタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの慣行的方法に従って行うことができる。あるいは、タンパク質を、該タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させることができる。さらに、支持体に対するタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンによって行うこともできる。   Binding of the protein to the support can be performed according to conventional methods such as chemical binding and physical adsorption. Alternatively, the protein can be bound to the support via an antibody that specifically recognizes the protein. Furthermore, protein binding to the support can also be performed by avidin and biotin.

固定化されたポリペプチドが合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露された場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および該タンパク質に結合するタンパク質のみならず化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するためのコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いたスクリーニングの方法（Wrighton et al., Science 273: 458-63 (1996)；Verdine, Nature 384: 11-3 (1996)）は、当業者に周知である。   Methods for screening molecules that bind when immobilized polypeptides are exposed to synthetic chemicals, or natural substance banks, or random phage peptide display libraries, and chemicals (agonists) as well as proteins that bind to the proteins And high-throughput screening methods based on combinatorial chemistry techniques for isolating (including antagonists) (Wrighton et al., Science 273: 458-63 (1996); Verdine, Nature 384: 11-3 (1996) )) Is well known to those skilled in the art.

さらに、本発明のスクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦの発現レベルを抑制する剤または化合物もまた、がんの候補治療薬として同定することができる。ポリペプチドまたはその機能的同等物の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、レポーターアッセイを用いることができる。適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製することができる。該遺伝子の転写調節領域が当業者に公知である場合には、以前の配列情報を用いることによって、レポーター構築物を調製することができる。転写調節領域が同定されていない場合には、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントを、該遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリから単離することができる。具体的には、スクリーニングに必要なレポーター構築物は、関心対象のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列を連結することによって調製することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、例えば１０００ｂｐ、例えば５０００または１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することもでき、ＰＣＲにより増殖させることもできる。転写調節領域を同定するための方法、およびまたアッセイプロトコールも周知である（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。   Furthermore, an agent or compound that suppresses the expression level of CDC45L or PIF in the screening method of the present invention can also be identified as a candidate therapeutic agent for cancer. The expression level of a polypeptide or functional equivalent thereof can be detected according to any method known in the art. For example, a reporter assay can be used. Suitable reporter genes and host cells are well known in the art. The reporter construct required for screening can be prepared by using the transcriptional regulatory region of CDC45L or PIF1 gene. If the transcriptional regulatory region of the gene is known to those skilled in the art, reporter constructs can be prepared by using previous sequence information. If a transcriptional regulatory region has not been identified, a nucleotide segment comprising the transcriptional regulatory region can be isolated from a genomic library based on the nucleotide sequence information of the gene. Specifically, a reporter construct necessary for screening can be prepared by linking a reporter gene sequence to a transcriptional regulatory region of a CDC45L or PIF1 gene of interest. The transcriptional regulatory region of CDC45L or PIF1 gene is a region from the start codon to at least 500 bp upstream, such as 1000 bp, such as 5000 or 10000 bp upstream. Nucleotide segments containing transcriptional regulatory regions can be isolated from genomic libraries or grown by PCR. Methods for identifying transcription regulatory regions and also assay protocols are well known (Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press).

さらに、本発明のスクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦタンパク質の生物学的活性を阻害する剤または化合物を、がんの候補治療薬として同定することもできる。   Furthermore, in the screening method of the present invention, an agent or compound that inhibits the biological activity of CDC45L or PIF protein can be identified as a candidate therapeutic agent for cancer.

様々なロースループットおよびハイスループットの酵素アッセイ形式が当技術分野で公知であり、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性の検出または測定のために容易に適合させることができる。ハイスループットアッセイのために、基質を好都合に固体支持体上に固定化することができる。反応後、上記の方法によって、該ポリペプチドによって変換された基質を固体支持体上で検出することができる。あるいは、接触段階を溶液中で行うことができ、その後、基質を固体支持体上に固定化することができ、該ポリペプチドによって変換された基質を検出することができる。このようなアッセイを容易にするために、固体支持体をストレプトアビジンでコーティングしかつ基質をビオチンで標識することができ、または、固体支持体を基質に対する抗体でコーティングすることができる。当業者は、スクリーニングの所望のスループット容量に応じて、適切なアッセイ形式を決定することができる。   A variety of low-throughput and high-throughput enzyme assay formats are known in the art and can be readily adapted for detection or measurement of biological activity of a CDC45L or PIF1 polypeptide. For high-throughput assays, the substrate can be conveniently immobilized on a solid support. After the reaction, the substrate converted by the polypeptide can be detected on the solid support by the method described above. Alternatively, the contacting step can be performed in solution, after which the substrate can be immobilized on a solid support and the substrate converted by the polypeptide can be detected. To facilitate such an assay, the solid support can be coated with streptavidin and the substrate labeled with biotin, or the solid support can be coated with an antibody against the substrate. One skilled in the art can determine the appropriate assay format depending on the desired throughput capacity of the screen.

本発明のアッセイはまた、ハイスループットスクリーニングを容易にする自動化手順にも適している。いくつかの周知のロボットシステムが、液相化学のために開発されている。これらのシステムには、Ｔａｋｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（大阪、日本）によって開発された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および化学者によって行われる手作業での合成操作を模倣するロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。上記装置のいずれも、本発明と共に使用するのに適している。本明細書で考察したように該装置が動作するような性質、および（必要であれば）該装置に対する改良の実施は、関連技術分野の当業者には明白であろう。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリがそれ自体で市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等を参照されたい）。   The assay of the present invention is also suitable for automated procedures that facilitate high-throughput screening. Several well-known robotic systems have been developed for liquid phase chemistry. These systems include Takeda Chemical Industries, Ltd. Many robotic systems (Zymate II, Zymark Corporation, etc.) that utilize automated workstations such as automated synthesizers developed by (Osaka, Japan) and robot arms that mimic manual synthesis operations performed by chemists Hopkinton, Mass .; Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.). Any of the above devices are suitable for use with the present invention. The nature of operation of the device as discussed herein and the implementation of improvements to the device (if necessary) will be apparent to those skilled in the relevant arts. In addition, numerous combinatorial libraries are commercially available on their own (eg, ComGenex, Princeton, NJ, Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルおよび／または生物学的活性の抑制ががん細胞の増殖の抑制をもたらすことが明らかとなる。したがって、化合物または剤がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現および／または活性を抑制する場合、該抑制は対象における潜在的治療効果を示す。本発明において、潜在的治療効果とは、合理的に予想される臨床的利点を指す。本発明において、そのような臨床的利点には、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現の低下、
（ｂ）対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下、
（ｃ）がんの形成の妨害、または
（ｄ）がんの臨床症状の妨害もしくは緩和
が含まれる。 In the present invention, it becomes clear that suppression of the expression level and / or biological activity of CDC45L or PIF1 results in suppression of cancer cell growth. Thus, if a compound or agent suppresses CDC45L or PIF1 expression and / or activity, the suppression indicates a potential therapeutic effect in the subject. In the present invention, a potential therapeutic effect refers to a clinically expected clinical advantage. In the present invention, such clinical advantages include:
(A) decreased expression of CDC45L or PIF1 gene,
(B) a decrease in the size, prevalence, or metastatic potential of the cancer in the subject,
(C) interference with cancer formation, or (d) interference or alleviation of clinical symptoms of cancer.

（ｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の過剰発現は癌において検出されたが、正常組織では検出されなかった。さらに、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドは、がん細胞増殖に関与することが実証された。したがって、これらの遺伝子は、がんの治療および診断のための優れた分子標的であり得る。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する剤または化合物は、これらのポリペプチドの生物学的活性を阻害する可能性がある。そのような化合物は、肺癌を治療もしくは予防するための医薬、または、肺癌を診断するためおよび肺癌患者の予後を評価するための検出剤として用いられる。 (Ii) Screening for compounds that bind to CDC45L or PIF1 protein In the present invention, overexpression of CDC45L or PIF1 was detected in cancer but not in normal tissues. Furthermore, the polypeptides encoded by these genes have been demonstrated to be involved in cancer cell growth. Thus, these genes may be excellent molecular targets for cancer treatment and diagnosis. Agents or compounds that bind to CDC45L or PIF1 polypeptides may inhibit the biological activity of these polypeptides. Such compounds are used as medicaments for treating or preventing lung cancer, or as detection agents for diagnosing lung cancer and for evaluating the prognosis of lung cancer patients.

具体的には、本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いて、がんを診断する、治療する、または予防するのに有用な剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング法の１つの態様は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたは断片と該試験剤または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片に結合する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む。 Specifically, the present invention provides methods of screening for agents or compounds useful for diagnosing, treating or preventing cancer using CDC45L or PIF1 polypeptide. One aspect of this screening method is:
(A) contacting a test agent or test compound with a polypeptide selected from the group consisting of CDC45L and PIF1 protein or a fragment thereof;
(B) detecting the level of binding between the polypeptide or fragment and the test agent or test compound;
(C) selecting a test agent or test compound that binds to the polypeptide or fragment of step (a).

本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。   According to the present invention, the therapeutic effect of a test agent or test compound on the inhibition of cell proliferation, or the therapeutic effect of a candidate agent or candidate compound for treating or preventing a CDC45L or PIF1-related disease can be evaluated. Therefore, the present invention also provides a method for screening a candidate agent or candidate compound that suppresses the growth of cancer cells, and a method for screening a candidate agent or candidate compound for treating or preventing cancer.

より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）ｂ）の結合レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。 More specifically, the method comprises
(A) contacting a test agent or test compound with a polypeptide selected from the group consisting of CDC45L and PIF1 protein or a fragment thereof;
(B) detecting the level of binding between the polypeptide and the test agent or test compound;
(C) correlating the binding level of b) with the therapeutic effect of the test agent or test compound.

あるいは、本発明に従って、がんの治療または予防に対する試験剤または試験化合物の潜在的治療効果を評価または推定することもできる。いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防、または該がんの阻害に対する、試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）剤または化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該試験剤または試験化合物が該ポリペプチドに結合する場合に示される潜在的治療効果を、該剤または化合物と関連付ける段階
を含む。 Alternatively, in accordance with the present invention, the potential therapeutic effect of a test agent or test compound on the treatment or prevention of cancer can be evaluated or estimated. In some embodiments, the present invention provides a method for evaluating or estimating the therapeutic effect of a test substance on the treatment or prevention of cancer associated with overexpression of CDC45L and / or PIF1, or the inhibition of the cancer. Providing the method comprising:
(A) contacting the agent or compound with a polypeptide encoded by a CDC45L or PIF1 polynucleotide;
(B) detecting a binding activity between the polypeptide and the test agent or test compound; and (c) a potential therapeutic effect exhibited when the test agent or test compound binds to the polypeptide. Associating with the agent or compound.

本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。   In the present invention, the therapeutic effect can be correlated with the binding level of CDC45L or PIF1 protein. For example, when a test agent or test compound binds to CDC45L or PIF1 protein, the test agent or test compound can be identified or selected as a candidate agent or candidate compound having a therapeutic effect. Alternatively, if a test agent or test compound does not bind to CDC45L or PIF1 protein, the test agent or test compound can be identified as an agent or compound that has no significant therapeutic effect.

本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
スクリーニングのために使用されるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。 The method of the present invention is described in more detail below.
The CDC45L or PIF1 polypeptide used for screening can be a recombinant polypeptide or a naturally derived protein or a partial peptide thereof. The polypeptide that is contacted with the test compound can be, for example, a purified polypeptide, a soluble protein, a form bound to a carrier, or a fusion protein fused to another polypeptide.

例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いてＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって実施することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。   For example, as a method for screening a protein that binds to CDC45L or PIF1 polypeptide using CDC45L or PIF1 polypeptide, many methods well known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. By inserting a gene encoding CDC45L or PIF1 polypeptide into an expression vector for a foreign gene, such as pSV2neo, pcDNAI, pcDNA3.1, pCAGGS and pCD8, the gene is expressed in a host (eg, animal) cell or the like.

発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等が含まれる。   The promoter used for expression may be any promoter that can be generally used. For example, the SV40 early promoter (Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 ( 1982)), EF-α promoter (Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)), CAG promoter (Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), SRα promoter (Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 ( 1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), adenovirus late promoter (Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), HSV TK promoter Etc. are included.

外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。   In order to express a foreign gene, any method such as electroporation (Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), calcium phosphate method (Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52) (1987)), DEAE dextran method (Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984), Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)), lipofectin method (Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994), Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993), Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)), etc. Introduction can be carried out.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。   The polypeptide encoded by the CDC45L or PIF1 gene can be obtained by introducing a monoclonal antibody recognition site (epitope) whose specificity has been clarified into the N-terminus or C-terminus of the polypeptide. It can be expressed as a fusion protein containing. A commercially available epitope-antibody system can be used (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Vectors that can express a fusion protein with, for example, β-galactosidase, maltose-binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP) and the like by using the plurality of cloning sites are commercially available. In addition, a fusion protein prepared by introducing only a small epitope consisting of several amino acids to 12 amino acids so that the properties of CDC45L or PIF1 polypeptide do not change by fusion has also been reported. Epitopes such as polyhistidine (His tag), influenza agglutinin HA, human c-myc, FLAG, vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-GP), T7 gene 10 protein (T7 tag), human herpes simplex virus glycoprotein ( HSV tags), E tags (epitopes on monoclonal phage), etc., and monoclonal antibodies that recognize them can be used as an epitope-antibody system for screening proteins that bind to CDC45L or PIF1 polypeptides (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもでき、該抗体は上述のように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを、エピトープ、例えばＧＳＴとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。   In immunoprecipitation, immune complexes are formed by adding these antibodies to cell lysates prepared using an appropriate detergent. The immune complex consists of a CDC45L or PIF1 polypeptide, a polypeptide containing the ability to bind to the polypeptide, and an antibody. In addition to the use of antibodies against the above epitopes, immunoprecipitation can also be performed using antibodies against CDC45L or PIF1 polypeptides, which can be prepared as described above. When the antibody is a mouse IgG antibody, the immune complex can be precipitated, for example, with protein A sepharose or protein G sepharose. When preparing polypeptides encoded by CDC45L or PIF1 genes as fusion proteins with epitopes such as GST, immune complexes are specific for these epitopes, similar to the use of antibodies to CDC45L or PIF1 polypeptides. For example, glutathione-sepharose 4B.

免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。   Immunoprecipitation can be performed, for example, according to or according to the method of the literature (Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).

ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合したタンパク質は、一般的な染色法、例えばクマシー染色または銀染色では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。   SDS-PAGE is commonly used for analysis of immunoprecipitated proteins, and the bound protein can be analyzed by the molecular weight of the protein using an appropriate concentration of gel. Proteins bound to CDC45L or PIF1 polypeptide are difficult to detect by common staining methods such as Coomassie staining or silver staining, so cells in culture media containing radioisotopes, 35S-methionine or 35S-cysteine The detection sensitivity for the protein can be improved by culturing the protein, labeling the protein in the cell, and detecting the protein. If the molecular weight of the protein is known, the target protein can be purified directly from an SDS-polyacrylamide gel and its sequence can be determined.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウエスト−ウエスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞（例えば肺癌細胞株）からｃＤＮＡライブラリを調製する段階、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識することができる。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用することができる。   As a method for screening a protein that binds to the polypeptide using CDC45L or PIF1 polypeptide, for example, West-Western blot analysis (Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)) can be used. Specifically, using a phage vector (eg, ZAP) to prepare a cDNA library from a cultured cell (eg, a lung cancer cell line) expected to express a protein that binds to CDC45L or PIF1 polypeptide, LB Expressing the protein on agarose, immobilizing the expressed protein on a filter, reacting the purified and labeled CDC45L or PIF1 polypeptide with the filter, and according to the label, the CDC45L or PIF1 poly By detecting plaques that express a protein that binds to the peptide, a protein that binds to the CDC45L or PIF1 polypeptide can be obtained. Polypeptides of the invention can be obtained by utilizing the binding of biotin and avidin, or antibodies that specifically bind to CDC45L or PIF1 polypeptide, or peptides or polypeptides fused to CDC45L or PIF1 polypeptide (eg, GST) It is possible to label by using. A method using a radioisotope or a fluorescent dye can be used.

「標識」および「検出可能な標識」という用語は、本明細書において、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を指すために用いられる。このような標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびその他、ＥＬＩＳＡで一般的に用いられるもの）、および例えばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のビーズなどの比色標識が含まれる。このような標識の使用を開示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が含まれる。このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、感光フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、蛍光マーカーは、放出された光を検出するための光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を与えて該酵素の該基質に対する作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、着色標識を可視化するだけで検出される。   The terms “label” and “detectable label” are used herein to refer to any detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical, or chemical means. Used to refer to a composition. Such labels include biotin for staining with labeled streptavidin conjugate, magnetic beads (eg, DYNABEADS ™), fluorescent dyes (eg, fluorescein, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein, etc.), Radiolabel (eg, 3H, 125I, 35S, 14C, or 32P), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and others commonly used in ELISA), and eg colloidal gold or colored glass or plastic Colorimetric labels such as beads (eg, polystyrene, polypropylene, latex, etc.) are included. Patents disclosing the use of such labels include US Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,275,149; and 4,366,241. Means of detecting such labels are well known to those skilled in the art. Thus, for example, radiolabels can be detected using a light-sensitive film or scintillation counter, and fluorescent markers can be detected using a photodetector to detect the emitted light. Enzymatic labels are typically detected by providing a substrate to the enzyme and detecting the reaction product produced by the action of the enzyme on the substrate, and the colorimetric label is detected simply by visualizing the colored label.

あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。   Alternatively, in another embodiment of the screening method of the present invention, a cell-based two-hybrid system can be used (“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”, “MATCHMAKER one-H "system" (Clontech), "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene), "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)" See).

ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。   In the two-hybrid system, the polypeptide of the present invention is fused to the SRF-binding region or GAL4-binding region and expressed in yeast cells. A cDNA library is prepared so that it will be fused with the transcriptional activation region of VP16 or GAL4 when expressed from cells expected to express a protein that binds to the polypeptide of the present invention. Next, the cDNA library is introduced into the above yeast cell, and the detected positive clone (when the protein that binds to the polypeptide of the present invention is expressed in the yeast cell, the binding between both activates the reporter gene, thereby positively The clones are detectable) and the cDNA from the library is isolated. The protein encoded by the cDNA can be prepared by introducing the cDNA isolated above into E. coli and expressing the protein. In addition to the HIS3 gene, as a reporter gene, for example, Ade2 gene, lacZ gene, CAT gene, luciferase gene and the like can be used.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化することができ、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験化合物を該カラムにアプライする。本明細書における試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。   Compounds that bind to the polypeptide encoded by the CDC45L or PIF1 gene can also be screened using affinity chromatography. For example, the polypeptide of the present invention can be immobilized on a carrier of an affinity column, and a test compound containing a protein that can bind to the polypeptide of the present invention is applied to the column. Test compounds herein can be, for example, cell extracts, cell lysates, and the like. After loading the test compound, the column can be washed to prepare a compound bound to the polypeptide of the present invention. When the test compound is a protein, the amino acid sequence of the obtained protein is analyzed, an oligo DNA is synthesized based on the sequence, a cDNA library is screened using the oligo DNA as a probe, and a DNA encoding the protein Get.

本発明において結合した化合物を検出または定量するための手段として、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサを使用することができる。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。   As a means for detecting or quantifying the bound compound in the present invention, a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can be used. When such a biosensor is used, the interaction between the polypeptide of the present invention and the test compound can be observed in real time as a surface plasmon resonance signal using only a trace amount of the polypeptide without using a label. (Eg BIAcore, Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the polypeptide of the present invention and a test compound using a biosensor such as BIAcore.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。   Synthetic chemicals, or natural substance banks, or random phage peptides for isolating immobilized CDC45L or PIF1 polypeptides to isolate chemicals (including agonists and antagonists) as well as proteins that bind to CDC45L or PIF1 protein Screening for molecules that bind when exposed to a display library and screening using high throughput based on combinatorial chemistry techniques (Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996), Verdine, Nature 384 : 11-13 (1996), Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) are known to those skilled in the art.

本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを抑制することにより、細胞増殖が低下することが明示される。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１と結合する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物ががんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけられ得る。   In the present invention, it is clearly shown that cell proliferation is reduced by suppressing the expression level of CDC45L or PIF1. Thus, screening for candidate compounds that bind to CDC45L or PIF1 can identify candidate compounds that may treat or prevent cancer. The likelihood of these candidate compounds treating or preventing cancer can be assessed by secondary and / or further screening to identify therapeutic agents for cancer. For example, if a compound that binds to CDC45L or PIF1 protein inhibits the activity of cancer, it can be concluded that such compound has a CDC45L or PIF1-specific therapeutic effect.

（ｉｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を指標として用いて、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。 (Iii) Screening for compounds that suppress the biological activity of CDC45L or PIF1 protein The present invention also provides for treating or preventing cancer using the biological activity of CDC45L or PIF1 polypeptide or a fragment thereof as an indicator. Also provided are methods of screening for candidate agents or compounds.

具体的には、本発明は以下の［１］〜［４］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現するがんの治療または予防に有用な剤または化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリヌクレオチドまたはその機能的同等物もしくは断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出されたレベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階；
（ｄ）該ポリペプチドの生物学的活性を低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［２］生物学的活性が細胞増殖促進活性である、［１］の方法；
［３］ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの生物学的活性がＤＮＡ複製活性またはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合活性である、［１］の方法；ならびに
［４］ＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性がヘリカーゼ活性、テロメラーゼ阻害活性、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに対する結合活性である、［１］の方法。 Specifically, the present invention provides the following methods [1] to [4]:
[1] A method for screening for an agent or compound useful for treating or preventing cancer expressing CDC45L and / or PIF1,
(A) contacting a test agent or test compound with a CDC45L or PIF1 polynucleotide or a functional equivalent or fragment thereof;
(B) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a);
(C) comparing the level detected in step (b) with the level detected in the absence of the test agent or test compound;
(D) selecting a test agent or test compound that reduces or inhibits the biological activity of the polypeptide.
[2] The method of [1], wherein the biological activity is a cell growth promoting activity;
[3] The method of [1], wherein the biological activity of the CDC45L polypeptide is DNA replication activity or binding activity to the PIF1 polypeptide; and [4] the biological activity of the PIF1 polypeptide is helicase activity, telomerase inhibitory activity Or the method of [1], which is a binding activity to a CDC45L polypeptide.

本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補剤もしくは候補化合物、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階、および
ｃ）ｂ）の生物学的活性を該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。 According to the present invention, the therapeutic effect of a test agent or test compound on the inhibition of cell proliferation or the therapeutic effect of a candidate agent or candidate compound for treating or preventing CDC45L and / or PIF1-related diseases such as lung cancer can be evaluated. it can. Accordingly, the present invention also uses a CDC45L or PIF1 polypeptide or fragment thereof to candidate agents or candidate compounds for inhibiting cell proliferation, or candidates for treating or preventing CDC45L and / or PIF1-related diseases such as lung cancer. Also provided are methods for screening agents or candidate compounds, the methods comprising:
a) contacting a test agent or test compound with a CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof; and b) detecting the biological activity of the polypeptide or fragment of step (a), and c) b. ) In association with the therapeutic effect of the test agent or test compound.

あるいは、いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対する、または該がんの阻害に対する、試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。 Alternatively, in some embodiments, the invention evaluates the therapeutic effect of a test agent or test compound on the treatment or prevention of cancer associated with overexpression of CDC45L and / or PIF1, or on inhibition of the cancer, or A method for estimating is provided, the method comprising:
(A) contacting a test agent or test compound with a polypeptide encoded by a polynucleotide of the CDC45L or PIF1 gene;
(B) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a); and (c) an organism of the polypeptide in which the test agent or test compound is detected in the absence of the test agent or test compound. Associating a potential therapeutic effect shown in inhibiting the biological activity of a polypeptide encoded by a polynucleotide of the CDC45L or PIF1 gene with the test agent or test compound as compared to the biological activity .

本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。   In the present invention, the therapeutic effect can be correlated with the biological activity of the CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof. For example, where the test agent or test compound suppresses or inhibits the biological activity of the CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof as compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound Alternatively, the test agent or test compound can be identified or selected as a candidate agent or candidate compound having a therapeutic effect. Alternatively, the test agent or test compound does not inhibit or inhibit the biological activity of the CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof as compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound. In some cases, the test agent or test compound can be identified as an agent or compound that does not have a significant therapeutic effect.

本発明の方法を以下でより詳細に説明する。   The method of the present invention is described in more detail below.

ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、細胞増殖活性（細胞増殖促進活性）、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する互いの結合活性が含まれる。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の場合、生物学的活性にはＤＮＡ複製活性が含まれる。ＰＩＦ１タンパク質の場合、生物学的活性には、ヘリカーゼ活性およびテロメラーゼ阻害活性が含まれる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。   Any polypeptide can be used for screening as long as it contains the biological activity of CDC45L or PIF1 protein. Such biological activities include cell proliferation activity (cell proliferation promoting activity) or mutual binding activity to CDC45L or PIF1. In the case of CDC45L protein, biological activity includes DNA replication activity. In the case of PIF1 protein, biological activities include helicase activity and telomerase inhibitory activity. For example, CDC45L or PIF1 proteins can be used, and polypeptides functionally equivalent to these proteins can also be used. Such polypeptides can be expressed endogenously or exogenously by the cell.

このスクリーニングにより単離された化合物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）のインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。   The compound isolated by this screening is a candidate for antagonists of the polypeptide encoded by the CDC45L or PIF1 gene. The term “antagonist” refers to a molecule that inhibits its function by binding to a polypeptide. The term also refers to a molecule that reduces or inhibits the expression of a gene encoding CDC45L or PIF1. In addition, compounds isolated by this screening are candidates for compounds that inhibit the in vivo interaction of molecules (including DNA and proteins) with CDC45L or PIF1 polypeptides.

本発明において、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質は、癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有する（図３および図５）。したがって、本発明のスクリーニング法において、この生物学的活性を用いて、これらのタンパク質の生物学的活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。そのような化合物は、がん、例えば肺癌を治療するための潜在的候補であると考えられる。   In the present invention, CDC45L and PIF1 protein have an activity of promoting cell proliferation of cancer cells (FIGS. 3 and 5). Therefore, in the screening method of the present invention, this biological activity can be used to screen for compounds that inhibit the biological activity of these proteins. Such compounds are considered potential candidates for treating cancer, such as lung cancer.

本発明の方法において検出される生物学的活性が細胞増殖促進活性である場合、これは、例えば、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞を調製し、その細胞を試験化合物の存在下で培養し、細胞増殖の速度を決定すること、および細胞周期を測定すること等によって、ならびにコロニー形成活性を測定すること、例えば「実施例」に示されるＭＴＴアッセイ、コロニー形成アッセイ、またはＦＡＣＳによって、検出することができる。   When the biological activity detected in the method of the present invention is a cell growth promoting activity, this is, for example, preparing a cell expressing a polypeptide selected from the group consisting of CDC45L and PIF1, and testing the cell. Culturing in the presence of a compound, determining the rate of cell proliferation, measuring the cell cycle, etc., and measuring colony-forming activity, eg, MTT assay, colony-forming assay shown in “Examples” Or by FACS.

本明細書において定義される「生物学的活性を抑制する」という用語は、化合物非存在下と比較した、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性の少なくとも１０％の抑制、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、例えば少なくとも９０％の抑制を指す。   As defined herein, the term “inhibits biological activity” means at least 10% inhibition, eg, at least 25%, 50%, of the biological activity of CDC45L or PIF1 compared to the absence of the compound. Or 75% inhibition, such as at least 90% inhibition.

好ましい態様では、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを発現しない対照細胞が用いられる。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞、およびＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片を発現しない対照細胞を培養する段階；
ｂ）該タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階；ならびに
ｃ）対照細胞において検出された、および試験剤または試験化合物の非存在下で検出された増殖と比較して、該タンパク質を発現する細胞において生物学的活性を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む。 In a preferred embodiment, control cells that do not express CDC45L or PIF1 polypeptide are used. Accordingly, the present invention also provides a method for screening a candidate substance for inhibiting cell proliferation, or a candidate substance for treating or preventing a CDC45L or PIF1-related disease such as lung cancer, using CDC45L or PIF1 polypeptide or a fragment thereof. And the method comprises:
a) culturing cells expressing a CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof in the presence of a test agent or test compound, and control cells not expressing the CDC45L or PIF1 polypeptide or functional fragment thereof;
b) detecting the biological activity of cells expressing the protein and control cells; and c) compared to proliferation detected in the control cells and detected in the absence of the test agent or test compound. Selecting a test compound that inhibits biological activity in cells expressing the protein.

細胞増殖促進活性に加えて、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその断片がスクリーニングに用いられる場合には、ＤＮＡ複製活性またはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合活性を指標として用いることもできる。同様に、ＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片がスクリーニングに用いられる場合には、ヘリカーゼ活性、テロメラーゼ阻害活性、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに対する結合活性を指標として用いることもできる。これらの生物学的活性は、当技術分野で周知の方法によって検出することができる。   In addition to cell growth promoting activity, when CDC45L polypeptide or a fragment thereof is used for screening, DNA replication activity or binding activity to PIF1 polypeptide can also be used as an indicator. Similarly, when PIF1 polypeptide or a fragment thereof is used for screening, helicase activity, telomerase inhibitory activity, or binding activity to CDC45L polypeptide can also be used as an indicator. These biological activities can be detected by methods well known in the art.

本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性の抑制によって、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療剤を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を抑制する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。   In the present invention, it becomes clear that suppression of CDC45L or PIF1 biological activity reduces cell proliferation. Accordingly, by screening candidate compounds that inhibit the biological activity of CDC45L or PIF1, candidate compounds that have the potential to treat or prevent cancer can be identified. The likelihood that these candidate compounds will treat or prevent cancer can be assessed by secondary and / or further screening to identify therapeutic agents for cancer. For example, if a compound inhibits the activity of a cancer that inhibits the biological activity of the CDC45L or PIF1 protein, it can be concluded that such a compound has a CDC45L or PIF1 specific therapeutic effect.

（ｉｖ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現を変更する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１に特異的な二本鎖分子によるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現の低下は、癌細胞増殖の阻害を引き起こした（図３および図５）。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを指標として用いるスクリーニングを介して、がんの治療または予防において用いられ得る化合物を同定することができる。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは例えば、
（ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含み得る。 (Iv) Screening for compounds that alter the expression of CDC45L or PIF1 In the present invention, the decrease in the expression of CDC45L or PIF1 by a double-stranded molecule specific for CDC45L or PIF1 caused inhibition of cancer cell growth (FIG. 3). And FIG. 5). Therefore, a compound that can be used in the treatment or prevention of cancer can be identified through screening using the expression level of CDC45L or PIF1 as an index. In the context of the present invention, such screening is for example
(A) contacting the test compound with a cell that expresses the CDC45L and / or PIF1 gene; and (b) detecting the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene; and (c) in the absence of the test compound. Selecting a test compound that reduces the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene relative to the expression level detected in step 1.

本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、ならびにＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。   According to the present invention, the therapeutic effect of a test agent or test compound on the inhibition of cell proliferation or the therapeutic effect of a candidate agent or candidate compound for treating or preventing CDC45L and / or PIF1-related diseases such as lung cancer can be evaluated. it can. Accordingly, the present invention also provides a method for screening candidate agents or candidate compounds that inhibit the growth of cancer cells, and candidate agents or candidate compounds for treating or preventing CDC45L and / or PIF1-related diseases such as lung cancer. A method for screening is also provided.

本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは例えば、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含み得る。 In the context of the present invention, such screening is for example
a) contacting a test agent or test compound with a cell expressing a CDC45L and / or PIF1 gene;
b) detecting the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene; and c) correlating the expression level of b) with the therapeutic effect of the test agent or test compound.

あるいは、本発明に従って、がんの治療または予防に対する試験剤または試験化合物の潜在的治療効果を評価または推定することができる。いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防、または該がんの阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果を評価もしくは推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。 Alternatively, according to the present invention, the potential therapeutic effect of a test agent or test compound on the treatment or prevention of cancer can be evaluated or estimated. In some embodiments, the present invention is for treating or preventing cancer associated with overexpression of CDC45L and / or PIF1, or for evaluating or estimating the therapeutic effect of a test agent or test compound on inhibition of the cancer Providing a method comprising:
(A) contacting a test agent or test compound with a cell expressing a CDC45L and / or PIF1 gene;
(B) detecting the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene in step (a); and (c) the potential shown when the test agent or test compound decreases the expression level of the CDC45L and / or PIF1 gene Associating a therapeutic effect with the test agent or test compound.

本発明において、治療効果をＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。   In the present invention, the therapeutic effect can be correlated with the expression level of the CDC45L or PIF1 gene. For example, if the test agent or test compound decreases the expression level of the CDC45L or PIF1 gene compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound is Can be identified or selected as a candidate agent or candidate compound having a therapeutic effect. Alternatively, if the test agent or test compound does not reduce the expression level of the CDC45L or PIF1 gene compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound is Can be identified as agents or compounds that do not have a significant therapeutic effect.

本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現する細胞には、例えば、肺癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞（例えばＡ５４９およびＳＢＣ−３）を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」という用語は、化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルの少なくとも１０％の低下、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、例えば少なくとも９５％のレベル低下を指す。本明細書における化合物には化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを低下させる化合物は、がん、例えば肺癌の治療または予防のために使用される候補剤または候補化合物として選択することができる。 The method of the present invention is described in more detail below.
Cells expressing CDC45L and / or PIF1 include, for example, cell lines established from lung cancer, and such cells (eg, A549 and SBC-3) can be used for the above screening of the present invention. . Expression levels can be estimated by methods well known to those skilled in the art, such as RT-PCR, Northern blot assay, Western blot assay, immunostaining, ELISA, or flow cytometric analysis. The term “reducing expression level” as defined herein is a reduction of at least 10%, eg, at least 25%, 50%, of the expression level of CDC45L or PIF1 compared to the expression level in the absence of the compound. Or 75% level reduction, for example at least 95% level reduction. The compounds herein include chemical substances, double-stranded nucleotides and the like. The preparation of double stranded nucleotides has been described above. In the screening method, the compound that decreases the expression level of CDC45L or PIF1 can be selected as a candidate agent or candidate compound used for the treatment or prevention of cancer, for example, lung cancer.

あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）候補化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる該候補化合物を選択する段階
を含むことができる。 Alternatively, the screening method of the present invention comprises:
(A) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of CDC45L or PIF1 and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region has been introduced;
(B) measuring the expression level or activity of the reporter gene; and (c) selecting the candidate compound that decreases the expression level or activity of the reporter gene.

本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１に関連する疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、ならびにＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１に関連する疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。   According to the present invention, the therapeutic effect of a test agent or test compound on the inhibition of cell proliferation, or the therapeutic effect of a candidate agent or candidate compound for treating or preventing a disease associated with CDC45L and / or PIF1 can be evaluated. Therefore, the present invention also provides a method for screening a candidate agent or candidate compound that suppresses cancer cell proliferation, and a method for screening a candidate agent or candidate compound for treating or preventing a disease associated with CDC45L and / or PIF1. Also provide.

別の局面によると、本発明は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。 According to another aspect, the present invention provides:
a) contacting a test agent or a test compound with a cell into which a vector comprising a transcription regulatory region of a CDC45L or PIF1 gene and a reporter gene expressed under the control of the transcription regulatory region is introduced;
b) detecting the expression level or activity of the reporter gene; and c) associating the expression level of b) with the therapeutic effect of the test agent or test compound.

あるいは一部の態様において、本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防または該がんの阻害における試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）潜在的治療効果と該試験剤または試験化合物とを関連付ける段階であって、試験剤または試験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合に該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。 Alternatively, in some embodiments, the present invention also provides a method for evaluating or estimating the therapeutic effect of a test agent or test compound in treating or preventing cancer associated with overexpression of CDC45L or PIF1 or inhibiting the cancer Providing the method comprising:
(A) contacting a test agent or a test compound with a cell into which a vector containing a transcription regulatory region of CDC45L or PIF1 and a reporter gene expressed under the control of the transcription regulatory region is introduced;
(B) measuring the expression level or activity of the reporter gene; and (c) associating a potential therapeutic effect with the test agent or test compound, wherein the test agent or test compound expresses the reporter gene. Including a step wherein the potential therapeutic effect is shown when reducing the level or activity.

本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。   In the present invention, the therapeutic effect can be correlated with the expression level or activity of the reporter gene. For example, if the test agent or test compound reduces the expression level or activity of the reporter gene compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound Can be identified or selected as a candidate agent or compound having a therapeutic effect. Alternatively, if the test agent or test compound does not reduce the expression level or activity of the reporter gene compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound Can be identified as agents or compounds that do not have a significant therapeutic effect.

適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣＸの転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＣＸの転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流まで、例えば１０００ｂｐまで、例えば５０００または１００００ｂｐ上流までの領域であるが、これに制限されるものではない。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。   Suitable reporter genes and host cells are well known in the art. For example, the reporter gene is luciferase, green fluorescent protein (GFP), sea anemone red fluorescent protein (DsRed), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), lacZ, and β-glucuronidase (GUS), and the host cell is COS7, HEK293, HeLa, etc. The reporter construct required for screening can be prepared by linking the reporter gene sequence to the transcriptional regulatory region of CX. The transcriptional regulatory region of CX in the present specification is a region from the start codon to at least 500 bp upstream, for example, 1000 bp, for example, 5000 or 10,000 bp upstream, but is not limited thereto. Nucleotide segments containing transcriptional regulatory regions can be isolated from genomic libraries or can be amplified by PCR. Methods for identifying transcriptional regulatory regions as well as assay protocols are well known (Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press).

前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の少なくとも１０％の低下、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、例えば少なくとも９５％の低下を指す。   A host cell is infected with a vector containing the reporter construct, and the expression or activity of the reporter gene is detected by a method well known in the art (for example, using a luminometer, an absorption spectrometer, a flow cytometer, etc.). . As used herein, “reducing expression or activity” means at least a 10% decrease in expression or activity of a reporter gene compared to the absence of a compound, eg, at least 25%, 50%, or 75%. Reduction, for example a reduction of at least 95%.

本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。   The invention will be further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the appended claims.

本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを抑制することにより、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療薬を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の発現レベルを阻害する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。   In the present invention, it is clear that cell proliferation is reduced by suppressing the expression level of CDC45L or PIF1. Therefore, by screening candidate compounds that inhibit the expression level of CDC45L or PIF1, candidate compounds having the potential to treat or prevent cancer can be identified. The likelihood of these candidate compounds treating or preventing cancer can be assessed by secondary and / or further screening to identify cancer therapeutics. For example, if a compound inhibits the activity of a cancer that inhibits the expression level of CDC45L or PIF1 protein, it can be concluded that such a compound has a CDC45L or PIF1 specific therapeutic effect.

（ｖ）ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の結合を指標として用いるスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質がＰＩＦ１１タンパク質と相互作用することが確認された（図４Ｂ）。したがって、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質のそのような結合を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。これらのタンパク質はがん細胞の増殖に関与しているため、そのような化合物はがん治療に対する潜在的治療効果を有する可能性がある。したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質のそのような結合を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合の阻害について化合物をスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子を発現するがん細胞、例えば肺癌細胞の増殖を阻害または低減するための候補化合物、およびがん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。 (V) Screening using binding of CDC45L and PIF1 as an index In the present invention, it was confirmed that CDC45L protein interacts with PIF11 protein (FIG. 4B). Therefore, a compound that inhibits the binding between CDC45L protein and PIF1 protein can be screened using such binding between CDC45L protein and PIF1 protein as an index. Because these proteins are involved in the growth of cancer cells, such compounds may have potential therapeutic effects on cancer treatment. Thus, the present invention provides a method for screening compounds for inhibition of binding between CDC45L protein and PIF1 protein using such binding of CDC45L protein and PIF1 protein as an indicator. Furthermore, the present invention also screens candidate compounds for inhibiting or reducing the growth of cancer cells expressing CDC45L and PIF1 genes, such as lung cancer cells, and candidate compounds for treating or preventing cancer, such as lung cancer. A method is also provided.

具体的には、本発明は以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドとの間の結合を妨げる剤または化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［２］がんの治療または予防に有用な候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［３］ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物がＰＩＦ１結合ドメインを含む、［１］または［２］の方法。
［４］ＰＩＦ１の機能的同等物がＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、［１］または［２］の方法。
［５］がんが肺癌である、［１］の方法。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
より具体的には、本方法は
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）ｃ）の結合レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、がんの治療もしくは予防、またはがんの阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定する方法も提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）試験剤または試験化合物が結合レベルを低下させた場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。 Specifically, the present invention provides the following methods [1] to [5]:
[1] A method of screening for an agent or compound that interferes with the binding between a CDC45L polypeptide and a PIF1 polypeptide,
(A) contacting a CDC45L polypeptide or a functional equivalent thereof with a PIF1 polypeptide or a functional equivalent thereof in the presence of a test agent or a test compound;
(B) detecting binding between the polypeptides;
(C) comparing the binding level detected in step (b) with the binding level detected in the absence of the test agent or test compound; and (d) a test that reduces or inhibits the binding level. Selecting the agent or test compound.
[2] A method for screening candidate agents or candidate compounds useful for the treatment or prevention of cancer,
(A) contacting a CDC45L polypeptide or a functional equivalent thereof with a PIF1 polypeptide or a functional equivalent thereof in the presence of a test agent or a test compound;
(B) detecting binding between the polypeptides;
(C) comparing the binding level detected in step (b) with the binding level detected in the absence of the test agent or test compound; and (d) a test that reduces or inhibits the binding level. Selecting the agent or test compound.
[3] The method of [1] or [2], wherein the functional equivalent of CDC45L comprises a PIF1 binding domain.
[4] The method of [1] or [2], wherein the functional equivalent of PIF1 comprises a CDC45L binding domain.
[5] The method of [1], wherein the cancer is lung cancer.
According to the present invention, the therapeutic effect of a test agent or test compound on the inhibition of cell proliferation, or the therapeutic effect of a candidate agent or compound for treating or preventing a CDC45L or PIF1-related disease can be evaluated. Therefore, the present invention also provides a method for screening a candidate agent or candidate compound that suppresses the growth of cancer cells, and a method for screening a candidate agent or candidate compound for treating or preventing cancer. .
More specifically, the method comprises (a) contacting a CDC45L polypeptide or functional equivalent thereof with a PIF1 polypeptide or functional equivalent thereof in the presence of a test agent or test compound;
(B) detecting the level of binding between the polypeptides;
(C) comparing the binding level detected in step (b) with the binding level detected in the absence of the test agent or test compound; and (d) the binding level of c) Correlating with the therapeutic effect of the test compound.
Alternatively, in some embodiments, the present invention also provides a method for evaluating or estimating the therapeutic effect of a test agent or test compound on the treatment or prevention of cancer, or inhibition of cancer, the method comprising:
(A) contacting a CDC45L polypeptide or a functional equivalent thereof with a PIF1 polypeptide or a functional equivalent thereof in the presence of a test agent or a test compound;
(B) detecting the level of binding between the polypeptides;
(C) comparing the binding level detected in step (b) with the binding level detected in the absence of the test agent or test compound; and (d) the test agent or test compound decreases the binding level. Associating a potential therapeutic effect with the test agent or test compound.

本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルを低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルを低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。   In the present invention, the therapeutic effect can be correlated with the binding level of CDC45L protein and PIF1 protein. For example, if the test agent or test compound reduces the binding level of CDC45L protein and PIF1 protein compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound Can be identified or selected as a candidate agent or compound having a therapeutic effect. Alternatively, if the test agent or test compound does not reduce the binding level of CDC45L protein and PIF1 protein compared to the level detected in the absence of the test agent or test compound, the test agent or test compound Can be identified as agents or compounds that do not have a significant therapeutic effect.

本発明の文脈において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの機能的同等物とは、それぞれＣＤＣ４５Ｌポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）またはＰＩＦ１ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）と同等の生物学的活性を有する、ポリペプチドである（（１）遺伝子およびポリペプチドを参照されたい）。より具体的には、ＰＩＦ１ポリペプチドの機能的同等物は、ＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片である。同様に、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの機能的同等物は、ＰＩＦ１結合ドメインを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片である。   In the context of the present invention, a functional equivalent of a CDC45L or PIF1 polypeptide has a biological activity equivalent to that of a CDC45L polypeptide (SEQ ID NO: 14) or PIF1 polypeptide (SEQ ID NO: 16), respectively. A polypeptide (see (1) Genes and polypeptides). More specifically, a functional equivalent of a PIF1 polypeptide is a fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 that includes a CDC45L binding domain. Similarly, a functional equivalent of a CDC45L polypeptide is a fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 that contains a PIF1 binding domain.

ＰＩＦ１に対するＣＤＣ４５Ｌの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法、ウエスト−ウエスタンブロッティング解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）、アフィニティークロマトグラフィー、および表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを用いて行うことができる（（ｉ）一般的スクリーニング法、および（ｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニングを参照されたい）。   As a method for screening a compound that inhibits the binding of CDC45L to PIF1, many methods well known to those skilled in the art can be used. Such screening includes, for example, immunoprecipitation, West-Western blotting analysis (Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)), two-hybrid system using cells (“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “ “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”, “MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid Vector System” (Reference: 1997) “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”), affinity chromatography, and biosensors using surface plasmon resonance. Kill ((i) General screening methods, and (ii) see screening of CDC45L or compounds that bind to PIF1 protein).

スクリーニングに用いるポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然源由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであってよい。任意の前述の試験化合物をスクリーニングに用いることができる。
任意の前述の試験化合物を使用することができる（（１）スクリーニング用の試験化合物を参照されたい）。 The polypeptide used for screening may be a recombinant polypeptide or a protein derived from a natural source, or a partial peptide thereof. Any of the aforementioned test compounds can be used for screening.
Any of the aforementioned test compounds can be used (see (1) Test compounds for screening).

いくつかの態様において、本方法は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質もしくはＰＩＦ１タンパク質に対する候補化合物の結合を検出する段階、またはＰＩＦ１タンパク質に対するＣＤＣ４５Ｌタンパク質の結合のレベルを検出する段階をさらに含む。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質および／またはＰＩＦ１タンパク質を発現する細胞には、これらの２つの遺伝子を発現する限り、例えば、がん、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞を本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。あるいは、これら２つの遺伝子を発現するように、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質の発現ベクターの両方または一方を細胞にトランスフェクトすることもできる。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質のＰＩＦ１タンパク質に対する結合は、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体および抗ＰＩＦ１抗体を用いる免疫沈降アッセイによって検出することができる（図４）。   In some embodiments, the method further comprises detecting binding of the candidate compound to the CDC45L protein or PIF1 protein, or detecting the level of binding of the CDC45L protein to the PIF1 protein. Cells expressing CDC45L protein and / or PIF1 protein include, for example, cell lines established from cancer, such as lung cancer, as long as these two genes are expressed. Can be used for screening. Alternatively, cells can be transfected with both or one of the expression vectors for CDC45L and PIF1 protein to express these two genes. Binding of CDC45L protein to PIF1 protein can be detected by immunoprecipitation assay using anti-CDC45L antibody and anti-PIF1 antibody (FIG. 4).

本発明において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を抑制することにより、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療薬を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を阻害する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。   In the present invention, it becomes clear that cell proliferation is reduced by suppressing the binding between the CDC45L protein and the PIF1 protein. Therefore, by screening candidate compounds that inhibit the binding between CDC45L protein and PIF1 protein, it is possible to identify candidate compounds that have the potential to treat or prevent cancer. The likelihood of these candidate compounds treating or preventing cancer can be assessed by secondary and / or further screening to identify cancer therapeutics. For example, if a compound inhibits the activity of a cancer that inhibits the binding between CDC45L protein and PIF1 protein, it can be concluded that such a compound has a CDC45L or PIF1 specific therapeutic effect.

本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。   The invention will be further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

特記しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below.

材料および方法
癌細胞株および組織試料。本研究で使用したヒト肺癌細胞株は、以下の通りであった：肺腺癌（ＡＤＣ）であるＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、Ａ５４９、およびＰＣ１４；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）であるＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、およびＬＵ６１；肺大細胞癌（ＬＣＣ）であるＬＸ１；ならびに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であるＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＤＭＳ２７３、およびＤＭＳ１１４。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適切な培地中で単層で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。正常対照として使用したヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃによる最適化培地（ＳＡＧＭ）中で培養した。原発性肺癌試料は、他で記載されている通りにインフォームドコンセントを得て、以前に入手していた（非特許文献８、１２）。臨床病期は、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類（Sobin L WC. TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition. Anonymous. New York: Wiley-Liss. 2002）に従って判断した。組織マイクロアレイにおける免疫染色に使用した、ホルマリン固定した原発性肺腫瘍および隣接する正常肺組織試料は、北海道大学およびその提携病院（札幌、日本）で根治的手術を受けた２６７名の患者（ＡＤＣ １５９例、ＳＣＣ ８９例、ＬＣＣ １６例、ＡＳＣ ３例；女性患者９０名および男性患者１７７名；２６〜８４歳の範囲で年齢中央値は６５．０歳、腫瘍サイズｐＴ１ １１４例、ｐＴ２ １２５例、ｐＴ３ ２８例；リンパ節状態ｐＮ０ ２０８例、ｐＮ１ ２３例、ｐＮ２ ３６例）から入手していた。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。 Materials and Methods Cancer cell lines and tissue samples. The human lung cancer cell lines used in this study were as follows: lung adenocarcinoma (ADC) NCI-H1781, NCI-H1373, LC319, A549, and PC14; lung squamous cell carcinoma (SCC) SK-MES-1, NCI-H2170, NCI-H520, NCI-H1703 and LU61; LX1 which is large cell lung cancer (LCC); and SBC-3, SBC-5 and DMS273 which are small cell lung cancer (SCLC) , And DMS114. All cells were cultured in monolayers in an appropriate medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and maintained at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 . Human peripheral airway epithelial cells (SAEC) used as normal controls were cultured in optimized medium (SAGM) by Cambrex Bio Science Inc. Primary lung cancer samples were obtained previously with informed consent as described elsewhere (8, 12). The clinical stage was determined according to the UICC TNM classification (Sobin LWC. TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition. Anonymous. New York: Wiley-Liss. 2002). Formalin-fixed primary lung tumors and adjacent normal lung tissue samples used for immunostaining in tissue microarrays were obtained from 267 patients (ADC 159) who underwent radical surgery at Hokkaido University and its affiliated hospitals (Sapporo, Japan). Example, 89 SCCs, 16 LCCs, 3 ASCs; 90 female patients and 177 male patients; median age in the range of 26-84 years old is 65.0 years old, tumor size pT1 114 cases, pT2 125 cases, pT3 28 cases; lymph node status pN0 208 cases, pN1 23 cases, pN2 36 cases). The use of this study and all mentioned clinical materials was approved by individual institutional ethics committees.

半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。各試料由来のｍＲＮＡの合計３μｇアリコートを、ランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＣＤＣ４５Ｌ、ＰＩＦ１に特異的な合成プライマーの以下のセットを用いて、または内部対照としてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った：
ＣＤＣ４５ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ４５−ｌｉｋｅ（ＣＤＣ４５Ｌ）、５'−ＣＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および５'−ＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＰＩＦ１ ５'−ｔｏ−３' ＤＮＡ ヘリカーゼ類似体（サッカロミセス・セレビシエ）（ＰＩＦ１）、５'−ＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および５'−ＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＴＴＣＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＡＣＴＢ、５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。ＰＣＲ反応は、産物強度が増幅の直線相の範囲内に確実に入るように、サイクル数を最適化した。 Semi-quantitative RT-PCR. A total 3 μg aliquot of mRNA from each sample was reverse transcribed into single stranded cDNA using random primers (Roche Diagnostics) and SuperScript II (Invitrogen). Semi-quantitative RT-PCR experiments were performed using the following set of synthetic primers specific for CDC45L, PIF1, or using β-actin (ACTB) specific primer as an internal control:
CDC45 cell division cycle 45-like (CDC45L), 5′-CACAACCATTTTGACCTCTCCAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-GCTCTCTACCATCTCAAATCATGTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 2),
PIF1 5′-to-3 ′ DNA helicase analog (Saccharomyces cerevisiae) (PIF1), 5′-AGGCAGTGTCCCCTTCTGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-CCTGAAAGGAGGGAGTGTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 4) ,
ACTB, 5′-GAGGTGATATAGCATTGCTTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-CAAGTCAGGTTACAGGTAAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6). The PCR reaction was optimized for cycle number to ensure that product intensity was within the linear phase of amplification.

ウエスタンブロッティング。細胞を、溶解緩衝液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中で溶解した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として用いたＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、各溶解物のタンパク質含有量を測定した。各溶解物１０μｇを１０〜１２％変性ポリアクリルアミドゲル（３％ポリアクリルアミドスタッキングゲルを含む）上で分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に電気泳動により転写した。ＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を一次抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。免疫反応性タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで洗浄した後、高感度化学発光キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて反応物を発色させた。市販のウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体はＡＴＬＡＳ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＢ（カタログ番号ＨＰＡ０００６１４）から購入し、肺癌細胞株の溶解物を用いたウエスタンブロット解析により、ヒトＣＤＣ４５Ｌに特異的であることが判明した。   Western blotting. Cells were lysed in lysis buffer; 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 150 mmol / L NaCl, 0.5% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, and protease inhibitor cocktail set III (Calbiochem). Dissolved. The protein content of each lysate was measured by Bio-Rad protein assay (Bio-Rad) using bovine serum albumin (BSA) as a standard. 10 μg of each lysate was separated on a 10-12% denaturing polyacrylamide gel (including 3% polyacrylamide stacking gel) and transferred to a nitrocellulose membrane (GE Healthcare Bio-sciences) by electrophoresis. After blocking with 5% non-fat dry milk in TBST, the membrane was incubated with the primary antibody for 1 hour at room temperature. Immunoreactive protein was incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (GE Healthcare Bio-sciences) for 1 hour at room temperature. After washing with TBST, the reaction was developed using a sensitive chemiluminescence kit (GE Healthcare Bio-sciences). A commercially available rabbit anti-CDC45L polyclonal antibody was purchased from ATLAS Antibodies AB (Cat. No. HPA000614) and was found to be specific for human CDC45L by Western blot analysis using a lysate of a lung cancer cell line.

免疫組織化学および組織マイクロアレイ。パラフィンブロック中に包埋した臨床試料中のＣＤＣ４５Ｌタンパク質を調べるため、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ｐＨ９）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて、切片を以下の様式で染色した。簡潔に説明すると、スライドをＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に浸漬し、抗原回復のために、オートクレーブ中で１０８℃で１５分間煮沸した。内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、３μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体（ＡＴＬＡＳ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＢ；カタログ番号ＨＰＡ０００６１４）を各スライドに添加し、切片を二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ ＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と共にインキュベーションした。基質−色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。   Immunohistochemistry and tissue microarray. To examine CDC45L protein in clinical samples embedded in paraffin blocks, sections were stained using ENVISION + kit / HRP (pH 9) (DakoCytomation) in the following manner. Briefly, slides were immersed in Target Retrieval Solution and boiled at 108 ° C. for 15 minutes in an autoclave for antigen recovery. After blocking of endogenous peroxidase and protein, 3 μg / ml rabbit anti-human CDC45L polyclonal antibody (ATLAS Antibodies AB; catalog number HPA000614) was added to each slide, and sections were conjugated with horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG ( Incubated with Histofine Simple Stain MAX PO (G), Nichirei). Substrate-chromogen was added and the specimens were counterstained with hematoxylin.

他で記載されている通りに、２６７例のホルマリン固定した原発性ＮＳＣＬＣを用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した（Chin SF, et al. Molecular Pathology 2003;56:275-9.、Callagy G, et al. Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34.、Callagy G, et al. J Pathol 2005;205:388-96.）。スライド上の対応するＨ＆Ｅ染色切片による視覚的配置に基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ、または５つの組織コア（直径０．６ｍｍ；深さ３〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、レシピエントパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアを各症例から穿孔し、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学的解析に使用した。３名の独立した研究者が、臨床病理学的データの事前知識を持たずに、ＣＤＣ４５Ｌ陽性度を半定量的に評価した。各腫瘍組織コア内の染色の強度はほとんど均一であったため、核および細胞質内のＣＤＣ４５Ｌ染色の強度は、陰性（腫瘍細胞内の染色は認識不可能）または陽性（腫瘍細胞の核および細胞質内で認識可能な褐色染色）として記録することによって評価した。３名の検閲者全員が症例を独立に陽性と規定した場合にのみ、該症例を陽性と認定した。   Tumor tissue microarrays were constructed using 267 formalin-fixed primary NSCLC as described elsewhere (Chin SF, et al. Molecular Pathology 2003; 56: 275-9., Callagy G, et al Diagn Mol Pathol 2003; 12: 27-34., Callagy G, et al. J Pathol 2005; 205: 388-96.). Tissue regions for sampling were selected based on visual placement with corresponding H & E stained sections on the slide. Three, four, or five tissue cores (diameter 0.6 mm; depth 3-4 mm) taken from the donor tumor block are placed in the recipient paraffin block using a tissue microarrayer (Beecher Instruments) did. A core of normal tissue was punched from each case and a 5 μm section of the resulting microarray block was used for immunohistochemical analysis. Three independent investigators assessed CDC45L positivity semiquantitatively without prior knowledge of clinicopathological data. Since the intensity of staining in each tumor tissue core was almost uniform, the intensity of CDC45L staining in the nucleus and cytoplasm was negative (no staining in tumor cells was recognizable) or positive (in the nucleus and cytoplasm of tumor cells) Evaluated by recording as recognizable brown stain). A case was identified as positive only if all three censors defined the case independently as positive.

統計解析。ＳｔａｔＶｉｅｗ統計プログラム（ＳａＳ）を用いて、統計解析を行った。手術日からＮＳＣＬＣに関連する死亡時点まで、または最終経過観察時点までの腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびＣＤＣ４５Ｌ発現に関して、カプラン−マイヤー曲線を算出した；ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、考えられる予後因子、例えば年齢、性別、ｐＴ分類、およびｐＮ分類との関連性を、一度に１つの因子を考慮して解析した。次に、多変量Ｃｏｘ解析を、Ｐ値０．０５未満の開始レベルを満たしたありとあらゆる変数と共に、常にＣＤＣ４５Ｌ強発現を強制的にモデルに当てはめる後退（段階）法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はＰ＜０．０５の終了レベルを超えなかった。   Statistical analysis. Statistical analysis was performed using the StatView statistical program (SaS). Tumor-specific survival curves were calculated from the date of surgery to the time of death associated with NSCLC or to the last follow-up time. Kaplan-Meier curves were calculated for each relevant variable and for CDC45L expression; the difference in survival between patient subgroups was analyzed using the log rank test. Univariate and multivariate analyzes were performed using a Cox proportional hazard regression model to determine the association between clinicopathological variables and cancer-related mortality. Initially, the association between death and possible prognostic factors such as age, gender, pT classification, and pN classification was analyzed considering one factor at a time. Next, the multivariate Cox analysis was applied to a regression (step) method that always forced strong CDC45L expression into the model, along with any and all variables that met a starting level of less than 0.05. As long as the model continued to add factors, independent factors did not exceed a termination level of P <0.05.

ＣＤＣ４５Ｌ相互作用タンパク質の同定。細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下で、最終容量２ｍｌの免疫沈降緩衝液（０．５％ＮＰ４０，５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）中、１００μｌのプロテインＧ−アガロースビーズと共に４℃で１時間インキュベーションすることにより、前もって清澄化した。１，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離した後、上清をウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体または対照標準ウサギＩｇＧと共に４℃で４時間インキュベーションした。さらに、３０μｌのプロテインＧ−アガロースビーズを各上清に添加し、さらに２時間インキュベーションした。５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、各試料からビーズを回収し、１ｍｌの免疫沈降緩衝液で６回洗浄した後、それらを５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に再懸濁して５分間煮沸し、次にタンパク質を５％〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体で免疫沈降させた抽出物中に特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出して、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ、ＳＨＩＭＡＺＵ ＢＩＯＴＥＣＨ）による解析に供した。ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１との間の相互作用を確認するため、他で記載される通りに免疫沈降実験を行った（非特許文献１８、２３）。   Identification of CDC45L interacting protein. Cell extracts were washed with 100 μl protein G-agarose beads in a final volume of 2 ml immunoprecipitation buffer (0.5% NP40, 50 mmol / L Tris-Hcl, 150 mmol / L NaCl) in the presence of proteinase inhibitor. Clarified in advance by incubation for 1 hour at 0 ° C. After centrifugation at 1,000 rpm at 4 ° C. for 1 minute, the supernatant was incubated with rabbit anti-CDC45L polyclonal antibody or control rabbit IgG for 4 hours at 4 ° C. In addition, 30 μl of protein G-agarose beads were added to each supernatant and incubated for an additional 2 hours. The beads are recovered from each sample by centrifuging at 5,000 rpm for 2 minutes, washed 6 times with 1 ml of immunoprecipitation buffer, then resuspended in 50 μl of Laemmli sample buffer and boiled for 5 minutes. The proteins were then separated on a 5% -10% SDS-PAGE gel (BioRad). After electrophoresis, the gel was stained with silver. Protein bands specifically found in extracts immunoprecipitated with anti-CDC45L antibody were excised and subjected to matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS; AXIMA-CFR plus, SHIMAZU BIOTECH). To confirm the interaction between CDC45L and PIF1, immunoprecipitation experiments were performed as described elsewhere (Non-Patent Documents 18, 23).

免疫細胞化学的解析。細胞をカバーガラス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）上にプレーティングし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて室温で３分間の透過処理を行った。非特異的な結合を、ＣＡＳＢＬＯＣＫ（ＺＹＭＥＤ）により室温で１０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した一次抗体と共に室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）により室温で６０分間染色した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、各標本を、４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で封入し、スペクトル共焦点スキャンシステム（ＴＳＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で可視化した。   Immunocytochemical analysis. Cells were plated on coverslips (Becton Dickinson Labware), fixed with 4% paraformaldehyde, and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS for 3 minutes at room temperature. Nonspecific binding was blocked with CASBLOCK (ZYMED) for 10 minutes at room temperature. Cells were then incubated for 60 minutes at room temperature with primary antibody diluted in PBS containing 3% BSA. After washing with PBS, cells were stained with FITC-conjugated secondary antibody (Santa Cruz) for 60 minutes at room temperature. After further washing with PBS, each specimen was encapsulated with Vectashield (Vector Laboratories, Inc.) containing 4 ′, 6′-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) and a spectral confocal scanning system ( Visualized with TSC SP2 AOBS; Leica Microsystems).

ＲＮＡｉアッセイ。製造業者のプロトコールに従って２４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（１００ｎＭ）を肺癌細胞株、Ａ５４９およびＳＢＣ−３にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養し、トランスフェクションの７日後に、コロニー数をギムザ染色によって計数し、細胞の生存率を臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって評価した。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１発現の抑制を確認するために、上記のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１に特異的な合成プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡｉのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
ｃｏｎｔｒｏｌ−１（ＬＵＣ：ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子）、５'−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ｃｏｎｔｒｏｌ−２（ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰの変異体）、５'−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１、５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２、５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
ｓｉ−ＰＩＦ１＃１、５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；
ｓｉ−ＰＩＦ１＃２、５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。 RNAi assay. Small interfering RNA (siRNA) duplex (100 nM) was transfected into lung cancer cell lines, A549 and SBC-3 using 24 μL of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. The transfected cells were cultured for 7 days, 7 days after transfection, the number of colonies was counted by Giemsa staining, and the viability of the cells was determined as 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, Evaluated by 5-diphenyltetrazolium (MTT) assay (cell counting kit-8 solution; Dojindo Laboratories). In order to confirm the suppression of CDC45L or PIF1 expression, semi-quantitative RT-PCR was performed using the above-mentioned synthetic primers specific for CDC45L or PIF1. The target sequence of the synthetic oligonucleotide for RNAi was as follows:
control-1 (LUC: Lucinase gene from Firetins pyralis), 5′-CGUACGCGGAAUACUCUCGA-3 ′ (SEQ ID NO: 7);
control-2 (EGFP: high sensitivity green fluorescent protein (GFP) gene, mutant of Aequorea victoria GFP), 5′-GAAGCAGCACGACUUCUCUC-3 ′ (SEQ ID NO: 8);
si-CDC45L # 1, 5′-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3 ′ (SEQ ID NO: 9);
si-CDC45L # 2, 5′-GGACGUGGUGUGCUGUGU-3 ′ (SEQ ID NO: 10);
si-PIF1 # 1, 5'-GAAAGGCCAGAGCAUCUCUC-3 '(SEQ ID NO: 11);
si-PIF1 # 2, 5′-GGCAUGACCCCUGGAUUGUG-3 ′ (SEQ ID NO: 12).

フローサイトメトリー。Ａ５４９細胞を細胞３．５×１０５個／１００ｍｍディッシュの密度でプレーティングし、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中で回収し、７０％冷エタノール中で３０分間固定した。１００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した後、細胞をＰＢＳ中の５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ上でフローサイトメトリーを行い、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．）により解析した。ゲートをかけていない少なくとも１０，０００個の細胞から選択された細胞を、ＤＮＡ含量について解析した。 Flow cytometry. A549 cells were plated at a density of 3.5 × 10 5 cells / 100 mm dish and transfected with siRNA oligonucleotides. Cells were trypsinized 48 hours after transfection, harvested in PBS, and fixed in 70% cold ethanol for 30 minutes. After treatment with 100 μg / mL RNase (Sigma-Aldrich), cells were stained with 50 μg / mL propidium iodide (Sigma-Aldrich) in PBS. Flow cytometry was performed on a Becton Dickinson FACScan and analyzed with ModFit software (Verity Software House, Inc.). Cells selected from at least 10,000 ungated cells were analyzed for DNA content.

結果
肺癌および正常組織におけるＣＤＣ４５Ｌ発現。癌の存在の早期検出、および癌細胞の生物学的特徴に基づいた新規治療の開発に適用可能となり得る新規分子を同定するため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、臨床肺癌のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を行った（非特許文献７〜１２）。スクリーニングした２７，６４８個の遺伝子またはＥＳＴのうち、調べた臨床肺癌試料の大多数において、ＣＤＣ４５Ｌ転写物の発現の上昇（３倍またはそれ以上）が明らかになった。その過剰発現は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により、肺癌組織１５例のうち１２例において、および肺癌細胞株１５例のうちすべてにおいて確認された（図１Ａおよび１Ｂ）。 Results CDC45L expression in lung cancer and normal tissues. Use cDNA microarrays to analyze expression profiles across the genome of clinical lung cancer to identify new molecules that may be applicable for early detection of cancer presence and development of new therapies based on the biological characteristics of cancer cells (Non-Patent Documents 7 to 12). Of the 27,648 genes screened or ESTs, the majority of the clinical lung cancer samples examined showed increased expression (3-fold or more) of the CDC45L transcript. Its overexpression was confirmed by semi-quantitative RT-PCR experiments in 12 of 15 lung cancer tissues and in all 15 lung cancer cell lines (FIGS. 1A and 1B).

続いて、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いるウエスタンブロット解析により、癌細胞株６例のうちすべてにおいてＣＤＣ４５Ｌタンパク質の過剰発現が確認されたが、正常気管支上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）ではバンドは検出されなかった（図１Ｃ）。次に、肺癌細胞株Ａ５４９における内因性ＣＤＣ４５Ｌの細胞内局在性を調べるために免疫蛍光解析を行い、核におけるその強い染色および細胞質における弱い染色が認められた（図１Ｄ）。プローブとしてＣＤＣ４５Ｌ ｃＤＮＡを用いるノーザンブロッティングにより、調べた正常組織１６例のうち精巣のみにおいて、２．２ｋｂのバンドが同定された（データは示さず）。さらに、抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、正常組織５例（心臓、肺、肝臓、腎臓、および精巣）におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現レベルを、肺癌における発現レベルと比較した。ＣＤＣ４５Ｌは、精巣および肺癌細胞の核および細胞質において大量に発現していたが、残り４例の正常組織ではその発現はほとんど検出できなかった（図２Ａ）。   Subsequently, Western blot analysis using an anti-CDC45L antibody confirmed overexpression of CDC45L protein in all 6 cancer cell lines, but no band was detected in normal bronchial epithelial cells (SAEC) (Fig. 1C). Next, immunofluorescence analysis was performed to examine the intracellular localization of endogenous CDC45L in lung cancer cell line A549, and its strong staining in the nucleus and weak staining in the cytoplasm were observed (FIG. 1D). Northern blotting using CDC45L cDNA as a probe identified a 2.2 kb band in only the testis of 16 normal tissues examined (data not shown). Furthermore, the CDC45L protein expression level in 5 normal tissues (heart, lung, liver, kidney, and testis) was compared with the expression level in lung cancer by immunohistochemistry using an anti-CDC45L polyclonal antibody. CDC45L was abundantly expressed in the nuclei and cytoplasm of testis and lung cancer cells, but its expression was hardly detectable in the remaining 4 normal tissues (FIG. 2A).

ＣＤＣ４５Ｌ発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性。肺発癌におけるＣＤＣ４５Ｌの生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、本発明者らは、外科切除を受けたＮＳＣＬＣ患者２６７名からの組織切片を含む組織マイクロアレイにおいて免疫組織化学染色を行った。ＣＤＣ４５Ｌに特異的なポリクローナル抗体によるＣＤＣ４５Ｌ染色は、主に腫瘍細胞の核および細胞質で観察されたが、正常肺細胞では検出されなかった（図２Ｂ）。ＮＳＣＬＣ ２６７例のうち、ＣＤＣ４５Ｌ染色は１７１例（６４．０％）で陽性、９６例（３６．０％）で陰性であった（詳細を表１Ａに示す）。次いで本発明者らは、ＣＤＣ４５Ｌ陽性度の状態を臨床病理学的因子と比較し、ＮＳＣＬＣにおけるＣＤＣ４５Ｌ発現が、高齢（＞＝６５歳；Ｐ＝０．０４１７、フィッシャーの直接確率検定；表１Ａ）、男性（Ｐ＝０．０００８）、非ＡＤＣ組織像（Ｐ＜０．０００１）、およびより大きな腫瘍サイズ（ｐＴ２〜３；Ｐ＝０．００６６）と有意に関連していることを見出した。ＣＤＣ４５Ｌ陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値は、ＣＤＣ４５Ｌ陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値よりも有意に短かった（ログランク検定によりＰ＝０．００４５；図２Ｃ）。また本発明者らは単変量解析も適用して、患者の予後と、年齢（＜６５歳対＞＝６５歳）、性別（女性対男性）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ）、ｐＴステージ（腫瘍サイズ；Ｔ１対Ｔ２＋Ｔ３）、ｐＮステージ（リンパ節状態；Ｎ０対Ｎ１＋Ｎ２）、およびＣＤＣ４５Ｌ状態（陰性対陽性）を含むいくつかの因子との間の関連性を評価した（表１Ｂ）。パラメータのすべてが予後不良と有意に関連していた。多変量解析において、ＣＤＣ４５Ｌ状態は、本研究に参加した外科的治療を受けた肺癌患者の独立予後因子として統計学的に有意なレベルに達しなかったが（Ｐ＝０．４３３２）、ｐＴステージおよびｐＮステージならびに年齢は該レベルに到達し、これによって、肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌ発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性が示唆された。   Association between CDC45L expression and poor prognosis in NSCLC patients. To verify the biological and clinicopathological significance of CDC45L in lung carcinogenesis, we performed immunohistochemical staining on tissue microarrays containing tissue sections from 267 surgically resected NSCLC patients It was. CDC45L staining with a polyclonal antibody specific for CDC45L was observed primarily in the nuclei and cytoplasm of tumor cells, but not in normal lung cells (FIG. 2B). Among 267 NSCLC cases, CDC45L staining was positive in 171 cases (64.0%) and negative in 96 cases (36.0%) (details are shown in Table 1A). We then compared the CDC45L positivity status with clinicopathological factors and showed that CDC45L expression in NSCLC was older (> = 65 years old; P = 0.0417, Fisher's exact test; Table 1A) , Male (P = 0.0008), non-ADC histology (P <0.0001), and larger tumor size (pT2-3; P = 0.0006) were found to be significantly associated. The median survival of NSCLC patients with CDC45L-positive tumors was significantly shorter than the median survival of NSCLC patients with CDC45L-negative tumors (P = 0.0045 by log rank test; FIG. 2C). The inventors also applied univariate analysis to determine patient prognosis, age (<65 years old> = 65 years old), gender (female vs. male), tissue type (ADC vs. non-ADC), pT stage ( Associations were evaluated between several factors including tumor size; T1 vs. T2 + T3), pN stage (lymph node status; N0 vs. N1 + N2), and CDC45L status (negative vs. positive) (Table 1B). All of the parameters were significantly associated with poor prognosis. In multivariate analysis, CDC45L status did not reach a statistically significant level as an independent prognostic factor in lung cancer patients undergoing surgical treatment participating in this study (P = 0.4332), but pT stage and The pN stage as well as age reached this level, suggesting an association between CDC45L expression in lung cancer and these clinicopathological factors.

（表１Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤＣ４５Ｌ陽性度と患者の特徴との関連性（ｎ＝２６７）

Figure 2013501501
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌および大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定） Table 1A: Association between CDC45L positivity in NSCLC tissue and patient characteristics (n = 267)
Figure 2013501501
ADC, adenocarcinoma non-ADC, squamous cell carcinoma and large cell carcinoma and adenosquamous cell carcinoma
* P <0.05 (Fischer's exact test)

（表１Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析

Figure 2013501501
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌および大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定） Table 1B: Cox proportional hazards model analysis of prognostic factors in NSCLC patients
Figure 2013501501
ADC, adenocarcinoma non-ADC, squamous cell carcinoma and large cell carcinoma and adenosquamous cell carcinoma
* P <0.05 (Fischer's exact test)

癌細胞の増殖に対するＣＤＣ４５Ｌの効果。ＣＤＣ４５Ｌが肺癌細胞の増殖および／または生存に必須であるかどうかを評価するため、ＣＤＣ４５Ｌ配列に特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを構築し、ＣＤＣ４５Ｌを高レベルで内因的に発現する肺癌細胞株、Ａ５４９（腺癌）およびＳＢＣ−３（小細胞肺癌）にトランスフェクトした。ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２構築物を使用した場合に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりノックダウン効果が確認された（図３Ａ）。その後のＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイにより（図３Ｂおよび３Ｃ）、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトした細胞における生細胞数およびコロニー数の急激な減少が明らかになった。この効果の機序をさらに明らかにするため、本発明者らは、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトしたＡ５４９細胞を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトした細胞のサブＧ１比率が、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ）で処理したものよりも有意に高いことを見出した（図３Ｄ）。このデータから、ＣＤＣ４５Ｌノックダウンにより肺癌細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆された。   Effect of CDC45L on cancer cell proliferation. To assess whether CDC45L is essential for lung cancer cell growth and / or survival, a siRNA oligonucleotide specific for the CDC45L sequence was constructed and a lung cancer cell line, A549, that endogenously expresses CDC45L at high levels (A549). Adenocarcinoma) and SBC-3 (small cell lung cancer). When the si-CDC45L # 1 and si-CDC45L # 2 constructs were used, a knockdown effect was confirmed by semi-quantitative RT-PCR (FIG. 3A). Subsequent MTT and colony formation assays (FIGS. 3B and 3C) revealed a sharp decrease in viable and colony numbers in cells transfected with si-CDC45L # 1 and si-CDC45L # 2. To further elucidate the mechanism of this effect, the present inventors performed flow cytometry analysis using A549 cells transfected with si-CDC45L # 2, and analyzed the cells transfected with si-CDC45L # 2. We found that the sub-G1 ratio was significantly higher than that treated with the control siRNA (si-LUC) (FIG. 3D). This data suggested that apoptosis of lung cancer cells was induced by CDC45L knockdown.

ＣＤＣ４５Ｌと相互作用するタンパク質としてのＰＩＦ１の同定。肺発癌におけるＣＤＣ４５Ｌ過剰発現の生物学的機序を解明するため、本発明者らは、肺癌細胞においてＣＤＣ４５Ｌと相互作用すると考えられるタンパク質の同定を試みた。ＳＢＣ−３細胞由来の細胞抽出物を、ウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体またはウサギＩｇＧ（対照）で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、タンパク質複合体を銀染色した。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体による免疫沈降物中には見られるが、ウサギＩｇＧによる免疫沈降物中には見られないタンパク質バンドを切り出し、トリプシン消化し、質量分析による解析に供した。抽出されたタンパク質バンド由来のペプチドは、ＰＩＦ１のものと一致した。本発明者らは次に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により原発性ＮＳＣＬＣ組織および肺癌細胞株を再度調べ、ＮＳＣＬＣ臨床試料１５例のうち９例および調べた肺癌細胞株１５例のすべてにおいてＰＩＦ１発現の上昇を見出したが、その発現は、正常肺組織および正常気管支上皮由来細胞、ＳＡＥＣではほとんど検出されなかった（図４Ａ）。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現パターンは、ＰＩＦ１遺伝子の発現パターンとの良好な一致を示し、このことにより、これら２つの遺伝子が肺癌細胞において同時活性化される可能性があることが示唆された。肺癌細胞におけるＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の考えられる相互作用を確認するため、ＦＬＡＧタグ付ＰＩＦ１タンパク質を発現するように設計されたプラスミド（ｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＰＩＦ１−ＦＬＡＧ）を構築し、ＳＢＣ−３細胞にトランスフェクトし、次に抗ＦＬＡＧ抗体で該タンパク質を免疫沈降させた。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いた沈降物のウエスタンブロット解析から、内因性のＣＤＣ４５Ｌが外因性のＰＩＦ１と共沈することが示された（図４Ｂ）。免疫細胞化学的解析から、核および細胞質における内因性ＣＤＣ４５Ｌと外因性ＰＩＦ１の共局在が確認された（図４Ｃ）。   Identification of PIF1 as a protein that interacts with CDC45L. In order to elucidate the biological mechanism of CDC45L overexpression in lung carcinogenesis, the present inventors attempted to identify a protein that is thought to interact with CDC45L in lung cancer cells. Cell extracts from SBC-3 cells were immunoprecipitated with rabbit anti-CDC45L polyclonal antibody or rabbit IgG (control). After separation by SDS-PAGE, the protein complex was silver stained. A protein band that was found in the immunoprecipitate by the anti-CDC45L antibody but not in the rabbit IgG immunoprecipitate was excised, digested with trypsin, and subjected to analysis by mass spectrometry. The extracted protein band-derived peptide was consistent with that of PIF1. We next examined the primary NSCLC tissue and lung cancer cell lines again by semi-quantitative RT-PCR experiments, and PIF1 expression in 9 of 15 NSCLC clinical samples and all 15 lung cancer cell lines examined However, its expression was hardly detected in normal lung tissue and normal bronchial epithelium-derived cells, SAEC (FIG. 4A). The expression pattern of the CDC45L gene showed good agreement with the expression pattern of the PIF1 gene, suggesting that these two genes may be simultaneously activated in lung cancer cells. To confirm the possible interaction between CDC45L and PIF1 in lung cancer cells, a plasmid designed to express the FLAG-tagged PIF1 protein (pCAGGSn3FC-PIF1-FLAG) was constructed and transfected into SBC-3 cells; The protein was then immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody. Western blot analysis of the precipitate using anti-CDC45L antibody showed that endogenous CDC45L co-precipitated with exogenous PIF1 (FIG. 4B). Immunocytochemical analysis confirmed the co-localization of endogenous CDC45L and exogenous PIF1 in the nucleus and cytoplasm (FIG. 4C).

癌細胞の増殖に対するＰＩＦ１の効果。ＰＩＦ１の発現が肺癌細胞の増殖および／または生存において役割を果たしているかどうかをさらに評価するため、本発明者らは、ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡを用いて、肺発癌におけるＰＩＦ１機能の生物学的意義を調べた。ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉ−ＰＩＦ１＃１およびｓｉ−ＰＩＦ１＃２）をＡ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞にトランスフェクトすると、内因性ＰＩＦ１タンパク質の発現は効果的に抑制されたが、対照ｓｉＲＮＡでは効果は認められなかった（図５Ａ）。ＰＩＦ１の発現低下と一致して、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞は、細胞生存率およびコロニー数の有意な減少を示した（図５Ｂおよび５Ｃ）。これらの結果から、ＰＩＦ１もまた、肺癌細胞の増殖および／または生存において重要な役割を果たし得るという可能性が強く支持された。   Effect of PIF1 on cancer cell proliferation. To further evaluate whether PIF1 expression plays a role in lung cancer cell proliferation and / or survival, we used siRNA against PIF1 to investigate the biological significance of PIF1 function in lung carcinogenesis. . When siRNA oligonucleotides against PIF1 (si-PIF1 # 1 and si-PIF1 # 2) were transfected into A549 and SBC-3 cells, expression of endogenous PIF1 protein was effectively suppressed, whereas control siRNA was effective. Was not observed (FIG. 5A). Consistent with the reduced expression of PIF1, A549 and SBC-3 cells showed a significant decrease in cell viability and colony number (FIGS. 5B and 5C). These results strongly supported the possibility that PIF1 may also play an important role in lung cancer cell proliferation and / or survival.

考察
良好な生存率をもたらしかつ重篤な有害作用をほとんどもたらさない新規分子標的抗がん薬の開発は、極めて重要である。したがって本発明は、現在の治療法（Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205.、Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99.、Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.、Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006;28:799-805.、Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.、Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84.）よりも有害反応が少なく、より有効な抗がん効果を有する小分子化合物を開発するための治療標的を同定するのに有効な系を確立した。 Discussion The development of new molecularly targeted anticancer drugs that provide good survival and few serious adverse effects is extremely important. Thus, the present invention is based on current therapies (Kikuchi T. et al. Oncogene 2003; 22: 2192-205., Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003; 1: 485-99., Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004; 13: 3029-43., Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006; 28: 799-805., Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006; 29: 567-75., Yamabuki T et al. Int J Oncol 2006; 28: 1375-84.) an effective system for identifying therapeutic targets for developing small molecule compounds with fewer adverse reactions and more effective anticancer effects Established.

ＣＤＣ４５Ｌは複製開始タンパク質であることが知られているが、臨床がんにおけるその関与は示されていなかった。最近になって、複製因子の調節について理解が進んだことにより、可能な増殖マーカーおよび治療標的の新規供給源が提供された。例えば、セリンスレオニンキナーゼＣＤＣ７は活性化されてＭＣＭタンパク質をリン酸化し、それによって付加的な因子を動員して、ＤＮＡ複製の開始に必須であるＤＮＡの巻き戻しおよびＤＮＡポリメラーゼの結合を促進する。強力なＣＤＣ７キナーゼインヒビターであるＰＨＡ−７６７４９１で処理すると、複数のがん細胞型においてアポトーシス細胞死の誘導が起こり、かつ前臨床がんモデルにおいて腫瘍増殖の阻害が起こった（Montagnoli A, et al. Nat Chem Biol 2008;4:357-65.）。ＤＮＡ複製の開始を制限しかつ抗腫瘍活性を示す別の選択的ＣＤＣ７キナーゼインヒビターであるＢＭＳ−８６３２３３は、難治性血液がん患者における臨床試験の準備中である（//clinicaltrials.gov/show/NCT00838890）。さらに、バイオマーカーの観点では、ＭＣＭタンパク質、ＣＤＣ６、およびジェミニン（ＧＭＮＮ）が、乳癌、前立腺癌、肺癌、脳癌、子宮癌、および腎癌を含む様々な型の癌を有する患者についての予後バイオマーカーとして免疫組織化学的に調べられた（Gonzalez MA et al., Nat Rev Cancer 2005;5:135-41.）。上記の実施例で示した特異的ｓｉＲＮＡで肺癌細胞を処理すると、ＣＤＣ４５Ｌの発現が低下し、ひいてはアポトーシスが生じた。さらに、実施例における組織マクロアレイ実験による臨床病理学的な証拠から、ＣＤＣ４５Ｌを発現する腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者は、ＣＤＣ４５Ｌ発現が陰性であるＮＳＣＬＣ患者よりも短い癌特異的生存期間を示すことが実証された。インビトロおよびインビボアッセイによって得られた結果から、過剰発現したＣＤＣ４５Ｌは、肺癌細胞の悪性度の高い表現型を誘導する重要な分子であることが実証される。本発明者らの知る限り、これは、がんバイオマーカーとしてのＣＤＣ４５Ｌ発現の予後値を示す初めての研究である。 CDC45L is known to be a replication initiator protein, but its involvement in clinical cancer has not been shown. More recently, advances in the regulation of replication factors have provided new sources of possible proliferation markers and therapeutic targets. For example, serine threonine kinase CDC7 is activated to phosphorylate MCM protein, thereby recruiting additional factors to promote DNA unwinding and DNA polymerase binding, which are essential for the initiation of DNA replication. Treatment with PHA-776791, a potent CDC7 kinase inhibitor, resulted in the induction of apoptotic cell death in multiple cancer cell types and inhibition of tumor growth in preclinical cancer models (Montagnoli A, et al. Nat Chem Biol 2008; 4: 357-65.). BMS-863233, another selective CDC7 kinase inhibitor that limits the initiation of DNA replication and exhibits antitumor activity, is in preparation for clinical trials in patients with refractory blood cancer ( //clinicaltrials.gov/show/ NCT00838890 ). Further, in terms of biomarkers, MCM protein, CDC6, and geminin (GMNN) are prognostic biomarkers for patients with various types of cancer, including breast cancer, prostate cancer, lung cancer, brain cancer, uterine cancer, and renal cancer. It was examined immunohistochemically as a marker (Gonzalez MA et al., Nat Rev Cancer 2005; 5: 135-41.). When lung cancer cells were treated with the specific siRNA shown in the above examples, the expression of CDC45L was reduced, and as a result, apoptosis occurred. Furthermore, clinicopathological evidence from tissue macroarray experiments in the examples demonstrates that NSCLC patients with tumors that express CDC45L show shorter cancer-specific survival times than NSCLC patients that are negative for CDC45L expression. It was done. Results obtained by in vitro and in vivo assays demonstrate that overexpressed CDC45L is an important molecule that induces a high-grade phenotype of lung cancer cells. To the best of our knowledge, this is the first study to show the prognostic value of CDC45L expression as a cancer biomarker.

本発明はまた、肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の相互作用を同定した。ＰＩＦ１は、酵母からヒトまで保存されているＳＦＩ ５'−３' ＤＮＡヘリカーゼのメンバーとして分類されており、主に酵母におけるＤＮＡ複製の因子として報告されている（非特許文献４２、４３）。実施例において、ＰＩＦ１もまた、肺癌の大多数において高度にトランス活性化されており、特異的ｓｉＲＮＡで肺癌細胞を処理すると、増殖活性の抑制が生じた。これらのデータから、ＰＩＦ１もまた肺発癌において重要な役割を果たすことが示された。   The present invention has also identified an interaction between CDC45L protein and PIF1 protein in lung cancer. PIF1 is classified as a member of SFI 5′-3 ′ DNA helicase that is conserved from yeast to humans, and has been reported mainly as a factor for DNA replication in yeast (Non-patent Documents 42 and 43). In the examples, PIF1 was also highly transactivated in the majority of lung cancers, and treatment of lung cancer cells with specific siRNA resulted in suppression of proliferative activity. These data indicate that PIF1 also plays an important role in lung carcinogenesis.

サッカロミセス・セレビシエＰＩＦ１ヘリカーゼは、ＤＮＡ複製においてＤＮａ２ヘリカーゼ／ヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼδと共に機能する（Budd ME et al., Mol Cell Biol 2006;26:2490-500.）。一方、ＣＤＣ４５ＬはＭＣＭ２−７複合体、ＧＩＮＳ複合体、およびＤＮＡポリメラーゼδと相互作用し、伸長機序において前進するＤＮＡポリメラーゼδおよびεを複製ヘリカーゼによって架橋することにより、ＤＮＡ複製の伸長において重要な役割を果たす（非特許文献３９）。本明細書において提供されるデータに基づいて、ＣＤＣ４５Ｌ−ＰＩＦ１複合体およびＣＤＣ４５Ｌ発現を標的とすることは、がん細胞の増殖および／または生存を抑制するための新規なアプローチである。   Saccharomyces cerevisiae PIF1 helicase functions in conjunction with DNa2 helicase / nuclease and DNA polymerase δ in DNA replication (Budd ME et al., Mol Cell Biol 2006; 26: 2490-500.). CDC45L, on the other hand, interacts with MCM2-7 complex, GINS complex, and DNA polymerase δ, and is important in the elongation of DNA replication by bridging DNA polymerase δ and ε that advance in the elongation mechanism by replication helicases. It plays a role (Non-Patent Document 39). Based on the data provided herein, targeting CDC45L-PIF1 complex and CDC45L expression is a novel approach for inhibiting cancer cell growth and / or survival.

産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイとの組み合わせを用いる、本明細書に記載されるがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療の標的として特定の遺伝子が同定された。この差次的に発現する遺伝子、すなわちＣＤＣ４５Ｌの発現に基づいて、本発明は、がんを同定および検出するため、ならびに予後を評価するための新規分子診断マーカーを提供する。さらに、その翻訳産物がＣＤＣ４５Ｌと相互作用する遺伝子として同定されたＰＩＦ１は、癌における過剰発現が確認された。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を用いる新規診断戦略も提供する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The cancer gene expression analysis described herein using a combination of laser capture dissection and genome-wide cDNA microarrays allows specific genes to be targeted as cancer prevention and treatment targets. Identified. Based on the expression of this differentially expressed gene, CDC45L, the present invention provides novel molecular diagnostic markers for identifying and detecting cancer and for assessing prognosis. Furthermore, PIF1, whose translation product was identified as a gene that interacts with CDC45L, was confirmed to be overexpressed in cancer. Thus, the present invention also provides a novel diagnostic strategy using CDC45L or PIF1.

さらに、本明細書に記載されるように、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１はがん細胞の生存に関与する。したがって本発明はまた、がんを治療および予防するための新規分子標的を提供する。それらは、有害作用のない新規治療薬および予防剤を開発するのに有用であり得る。   In addition, as described herein, CDC45L and PIF1 are involved in cancer cell survival. Thus, the present invention also provides novel molecular targets for treating and preventing cancer. They can be useful in developing new therapeutics and prophylactics that have no adverse effects.

本明細書に記載される方法は、がんを予防、診断、および治療するためのさらなる分子標的の同定にも有用である。本明細書において提供されるデータは、がんの包括的理解を高め、新規診断戦略の開発を促進し、かつ治療薬および予防剤のための分子標的の同定に手掛かりを与える。そのような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、がんの診断、治療、および最終的には予防の新規戦略を開発するための指標を提供する。   The methods described herein are also useful for identifying additional molecular targets for preventing, diagnosing, and treating cancer. The data provided herein enhances a comprehensive understanding of cancer, facilitates the development of new diagnostic strategies, and provides clues to the identification of molecular targets for therapeutic and prophylactic agents. Such information contributes to a deeper understanding of tumorigenesis and provides an indicator for developing new strategies for cancer diagnosis, treatment, and ultimately prevention.

本明細書で引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。   All patents, patent applications, and publications cited herein are incorporated by reference in their entirety.

さらに、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、本質的に前述の説明は、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。   Furthermore, while the present invention has been described in detail with respect to particular embodiments thereof, the foregoing description is exemplary and explanatory in nature and is intended to describe the invention and preferred embodiments thereof. It should be understood that Those skilled in the art will readily appreciate through routine experimentation that various changes and modifications can be made therein without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is intended to be defined not by the above description, but by the following claims and their equivalents.

Claims (33)

対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象ががんに罹患しているかもしくはその発症リスクを有することが示されるかまたは該対象におけるがんの存在が示され、該発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、方法。 A method of detecting or diagnosing cancer in a subject comprising measuring the expression level of CDC45L and / or PIF1 in a biological sample from the subject, wherein the level is compared to a normal control level of the gene. Is indicated that the subject is suffering from or at risk of developing cancer, or the presence of cancer in the subject is indicated, and the expression level is
(A) detecting mRNA of CDC45L gene and / or mRNA of PIF1 gene;
(B) detecting the protein encoded by the CDC45L gene and / or the protein encoded by the PIF1 gene, and (c) biological of the protein encoded by the CDC45L gene and / or the protein encoded by the PIF1 gene A method measured by a method selected from the group consisting of detecting activity. 前記上昇が、前記正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the increase is at least 10% above the normal control level. 前記対象由来の生物学的試料が生検試料である、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the biological sample from the subject is a biopsy sample. 前記がんが肺癌である、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the cancer is lung cancer. ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する試薬を含む、がんの診断または検出において使用するためのキット。   A kit for use in diagnosis or detection of cancer, comprising a reagent that binds to a transcription product or translation product of CDC45L gene and / or PIF1 gene. 肺癌を有する対象の予後を評価するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを検出する段階；
（ｂ）検出された該発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、患者の予後を判定する段階
を含む、方法。 A method for assessing the prognosis of a subject having lung cancer, comprising:
(A) detecting the expression level of CDC45L in a biological sample from the subject;
(B) comparing the detected expression level with a control level; and (c) determining the prognosis of the patient based on the comparison of (b). 前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較して前記発現レベルが上昇していることにより予後不良が示される、請求項６記載の方法。   The method of claim 6, wherein the control level is a good prognosis control level, and an increased expression level compared to the control level indicates a poor prognosis. 前記上昇が、前記対照レベルを少なくとも１０％上回る、請求項７記載の方法。   8. The method of claim 7, wherein the increase is at least 10% above the control level. 前記発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされる該タンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、請求項６記載の方法。 The expression level is
(A) detecting mRNA of the CDC45L gene;
Measured by a method selected from the group consisting of (b) detecting a protein encoded by the CDC45L gene; and (c) detecting a biological activity of the protein encoded by the CDC45L gene. Item 7. The method according to Item 6. がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｂ）該ポリペプチドまたはその断片と該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
ｃ）該ポリペプチドまたはその断片に結合する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。 A method for screening candidate compounds for treating or preventing cancer or inhibiting the growth of cancer cells,
a) contacting a test compound with a CDC45L or PIF1 polypeptide or fragment thereof;
b) detecting a binding activity between the polypeptide or fragment thereof and the test compound; and c) selecting a test compound that binds to the polypeptide or fragment thereof. がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
ｃ）試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含む、方法。 A method for screening candidate compounds for treating or preventing cancer or inhibiting the growth of cancer cells,
a) contacting a test compound with a cell expressing a CDC45L gene and / or a PIF1 gene;
b) detecting the expression level of the CDC45L gene and / or the PIF gene; and c) reducing the expression level of the CDC45L gene and / or the PIF1 gene compared to the expression level detected in the absence of the test compound. Selecting a test compound. がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を検出する段階；および
ｃ）試験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、該ポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。 A method for screening candidate compounds for treating or preventing cancer or inhibiting the growth of cancer cells,
a) contacting a test compound with a CDC45L or PIF1 polypeptide or fragment thereof;
b) detecting the biological activity of the polypeptide or fragment thereof of step (a); and c) the polypeptide or fragment thereof compared to the biological activity detected in the absence of the test compound. Selecting a test compound that inhibits the biological activity of. 前記生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項１２記載の方法。   13. The method of claim 12, wherein the biological activity is cell proliferation activity. がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
ｃ）試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含む、方法。 A method for screening candidate compounds for treating or preventing cancer or inhibiting the growth of cancer cells,
a) contacting a test compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a CDC45L or PIF1 gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region has been introduced;
b) measuring the expression or activity of the reporter gene; and c) selecting a test compound that reduces the level of expression or activity of the reporter gene compared to the level detected in the absence of the test compound. Including a method. ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物とＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物を接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階；および
（ｄ）試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。 A method of screening for candidate compounds that inhibit binding between a CDC45L polypeptide and a PIF1 polypeptide, comprising:
(A) contacting a CDC45L polypeptide or a functional equivalent thereof with a PIF1 polypeptide or a functional equivalent thereof in the presence of a test compound;
(B) detecting binding between the polypeptides;
(C) comparing the level of binding detected in step (b) with the level detected in the absence of the test compound; and (d) comparing the level detected in the absence of the test compound. Selecting a test compound that reduces or inhibits the level of binding. ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの前記機能的同等物がＰＩＦ１結合ドメインを含む、請求項１５記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the functional equivalent of a CDC45L polypeptide comprises a PIF1 binding domain. ＰＩＦ１ポリペプチドの前記機能的同等物がＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、請求項１５記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the functional equivalent of a PIF1 polypeptide comprises a CDC45L binding domain. 前記がんが肺癌である、請求項１０〜１７のいずれか一項記載の方法。   The method according to any one of claims 10 to 17, wherein the cancer is lung cancer. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。   A double-stranded molecule comprising a sense strand and an antisense strand, the sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12; The antisense strand comprises a nucleotide sequence complementary to the target sequence, the sense strand and the antisense strand hybridize to each other to form the double-stranded molecule, wherein the double-stranded molecule is a CDC45L gene or A double-stranded molecule that inhibits expression of a gene when introduced into a cell that expresses the PIF1 gene. 前記センス鎖が前記標的配列において前記アンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、請求項１９記載の二本鎖分子。   20. The double-stranded molecule of claim 19, wherein the sense strand hybridizes with the antisense strand in the target sequence to form a double-stranded molecule having a length of 19-25 nucleotide pairs. 一本鎖ヌクレオチド配列によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドである、請求項１９または２０記載の二本鎖分子。   21. A double-stranded molecule according to claim 19 or 20, which is a single polynucleotide comprising the sense strand and the antisense strand linked by a single-stranded nucleotide sequence. ポリヌクレオチドが一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である、請求項２１記載の二本鎖分子。 The polynucleotide has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′
Have
[A] is a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12; [B] is a nucleotide sequence consisting of about 3 to about 23 nucleotides And [A ′] is a nucleotide sequence complementary to [A]. センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれまたは両方を含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。   A vector comprising each or both of a combination of polynucleotides comprising a sense strand nucleic acid and an antisense strand nucleic acid, wherein the sense strand nucleic acid comprises a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12; The antisense strand comprises a nucleotide sequence that is complementary to the sense strand, the sense strand and the transcript of the antisense strand hybridize to each other to form a double-stranded molecule, and the vector comprises a CDC45L gene or A vector that inhibits the expression of a gene when introduced into a cell that expresses the PIF1 gene. センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。   A vector comprising each of a combination of polynucleotides comprising a sense strand nucleic acid and an antisense strand nucleic acid, wherein the sense strand nucleic acid comprises a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12, The sense strand nucleic acid has a sequence complementary to the sense strand, the sense strand and the antisense strand transcript hybridize with each other to form a double-stranded molecule, and the vector contains the CDC45L gene or the PIF1 gene. A vector that inhibits cell growth when introduced into an expressing cell. 前記ポリヌクレオチドが約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項２３記載のベクター。   24. The vector of claim 23, wherein the polynucleotide is an oligonucleotide of about 19 to about 25 nucleotides in length. 前記二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ヌクレオチド転写物である、請求項２３または２５記載のベクター。   26. The vector of claim 23 or 25, wherein the double stranded molecule is a single nucleotide transcript comprising a sense strand and an antisense strand linked by a single stranded nucleotide sequence. 前記ポリヌクレオチドが一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である、請求項２６記載のベクター。 The polynucleotide has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′.
Have
[A] is a nucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12; [B] is a nucleotide sequence consisting of about 3 to about 23 nucleotides 27. The vector of claim 26, wherein [A '] is a nucleotide sequence complementary to [A]. ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子もしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する、方法。   A method of treating or preventing cancer in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of a double-stranded molecule against CDC45L gene or PIF1 gene, or a vector encoding the double-stranded molecule, A method of inhibiting cell proliferation and expression of a gene when a double-stranded molecule is introduced into a cell that expresses a CDC45L gene or a PIF1 gene. 前記二本鎖分子が請求項１９〜２２のいずれか一項記載のものである、請求項２８記載の方法。   30. The method of claim 28, wherein the double-stranded molecule is that of any one of claims 19-22. 前記ベクターが請求項２３〜２７のいずれか一項記載のものである、請求項２８記載の方法。   29. The method of claim 28, wherein the vector is that of any one of claims 23-27. ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する、組成物。   A composition for treating or preventing cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of a double-stranded molecule against CDC45L or PIF1, or a vector encoding the double-stranded molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition that inhibits cell proliferation and expression of the gene when the double-stranded molecule is introduced into a cell that expresses the CDC45L gene or the PIF1 gene. 前記二本鎖分子が請求項１９〜２２のいずれか一項記載のものである、請求項３１記載の組成物。   32. The composition of claim 31, wherein the double-stranded molecule is that of any one of claims 19-22. 前記ベクターが請求項２３〜２７のいずれか一項記載のものである、請求項３１記載の組成物。   32. The composition of claim 31, wherein the vector is of any one of claims 23-27.
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