JP2013500034A - 多繊毛上皮細胞における繊毛の機能不全に関連する疾患を治療するためのマイクロrnaの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
1)創傷床を埋めるために上皮細胞が増殖かつ/または遊走する、
2)これらの第一段階の後に、密着結合の形成および頂端極と基底極の間の膜タンパク(チャネル、イオン輸送体など)の特定の差示的対応を特徴とする細胞の極性化の段階の活性化が起こる(Puchelle et al. 2006; Hajj, R. et al. J Pathol (2007) 211, 340-350)、
3)繊毛細胞の表面における繊毛の形成(毛様体形成)と粘液の合成および分泌を担う分泌細胞の存在をもたらす最終分化段階。
(i)該被験体の繊毛上皮組織のmiRNAの発現レベルを定量的に測定する工程;
(ii)該被験体の繊毛上皮組織のmiRNA発現プロフィールを確定する工程;
(iii)該被験体のmiRNAの発現プロフィールを、1以上の他の被験体の健康な繊毛上皮組織のmiRNAの発現プロフィールと比較する工程(このプロフィールは下記表IのmiRNAの一部または全部を含んでなる);
(iv)該被験体によるその発現レベルが該他の被験体による同じmiRNAの発現レベルに対して少なくとも2倍、すなわち発現レベルのいずれか1つが他の発現レベルの少なくとも2倍に相当する、少なくとも1つのmiRNAを同定する工程;および
(v)工程(ii)で確定されたプロフィールの少なくとも1つのmiRNAが、表Iの発現プロフィールにおける同じmiRNAの発現レベルに対して少なくとも2倍異なる発現レベルを有する場合に、該被験体の少なくとも1つのmiRNAの発現異常と関係した、繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力の欠陥が証明される工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。この発現レベルをlog2で表すと(表Iのように)、これは、log2で表される供試被験体の発現レベルが1以上の他の健康な被験体における発現プロフィールに比べて少なくとも1単位異なる場合に、少なくとも1つのmiRNAの発現異常と関係した、繊毛上皮組織の再生および/または分化能、ならびに毛様体形成能の欠陥が見られるということを意味する。
(i)該被験体の気道上皮組織のmiRNAの発現レベルを定量的に測定する工程;
(ii)該被験体の気道上皮組織のmiRNA発現プロフィールを確定する工程;
(iii)該被験体のmiRNAの発現プロフィールを、1以上の他の被験体の該健康な気道上皮組織のmiRNAの発現プロフィールと比較する工程(このプロフィールは下記表IのmiRNAの一部または全部を含んでなる);
(iv)該被験体によるその発現レベルが該他の被験体による同じmiRNAの発現レベルに対して少なくとも2倍、すなわち発現レベルのいずれか1つが他の発現レベルの少なくとも2倍に相当する、少なくとも1つのmiRNAを同定する工程;および
(v)工程(ii)で確定されたプロフィールの少なくとも1つのmiRNAが、表Iの発現プロフィールにおける同じmiRNAの発現レベルに対して少なくとも2倍異なる発現レベルを有する場合に、該被験体の少なくとも1つのmiRNAの発現異常と関係した、気道上皮組織の再生および/または分化能の欠陥が証明される工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
「被験体」とは、脊椎動物個体、特に哺乳類、好ましくはヒトを意味する。好ましくは、本発明者らが繊毛上皮組織の、機能的毛様体形成をもたらす能力に関して診断を確立したいと考える被験体であり、より具体的には、気道上皮組織の再生および/または分化能を診断する対象、ならびに同じ種に属す健康な1個体の被験体または複数の被験体であり得る。
原発性繊毛ジスキネジアまたはカルタゲナー症候群;
内臓逆位;
雄性不妊症(***の運動)および雌性不妊症(例えば、子宮外妊娠);
アルストレム症候群;
バルデー・ビードル症候群;
メッケル・グルーバー症候群;
多発性嚢胞腎;
網膜変性;
シーニア・ローケン症候群
である。
膵臓線維症;
慢性閉塞性肺疾患(COPD);
喘息;
細気管支炎;
ウイルス起源の呼吸器系感染
などの繊毛機能の欠陥に関連する疾患の予防および/または治療に対して注目される。
I−A.ヒト気道上皮細胞
これらの試験は、鼻中隔形成術、鼻甲介切除術またはポリープ切除術下の患者から採取した鼻甲介またはポリープから単離された健康なヒト気道上皮細胞の初代培養物で行った。次に、分化を誘導する目的で、これらの細胞をIV型コラーゲンで覆われた多孔質支持体(Transwell(商標)クリア、ポリエステル、0.4μm、Costar)上の、気液界面(ALI)で培養した(Puchelle, E et al., 2006)。気道上皮の形態的および生理学的特徴は詳細に記載されている(Puchelle, E et al., 2006)。
患者および組織サンプル
鼻腔閉塞のための鼻甲介切除術もしくはポリープ切除術または鼻中隔形成術を受ける予定であった3人の患者から下鼻甲介または鼻ポリープを採取した(Dr. Castillo, ORL Department, Pasteur Hospital, Nice, France)。喘息、膵臓線維症またはアレルギーを有する患者は試験から除外した。これらの手順は総て、ニース・ソフィア・アンティポリス大学の倫理委員会によって認可されたものである。
鼻粘膜に由来する健康なHAECの初代培養は、従前の研究から適合させた方法によって行った(Wu et al., 1985; Marcet et al., 2007; LeSimple et al., 2007)。切除後、すぐに組織を、HEPES(25mM、Invitrogen)、100U/mlペニシリン(Gibco、Invitrogen)、100mg/mlストレプトマイシン(Gibco, Invitrogen)、100mg/mlの硫酸ゲンタマイシン(Gibco, Invitrogen)および2.5mg/mlのアムホテリシンB(Gibco, Invitrogen)を含有する平衡塩溶液(HBSS(Ca2+/Mg2+不含)Invitrogen)に浸漬する。HBSS−HEPES−抗生物質媒体で3回洗浄した後、組織を0.1%のプロナーゼ(Sigma)で4℃にて一晩消化する。次に、組織を消化媒体から注意深く取り出し、鼻粘膜表面の気道上皮細胞を、10%のウシ胎児血清(FCS)を含有するHBSS−HEPES−抗生物質媒体を用いて穏やかに攪拌することによって間質から解離させた。この細胞懸濁液を4℃にて10分、150gで遠心分離し、細胞ペレットを10%FCS−HBSS−HEPES−抗生物質に再懸濁させ、再び遠心分離する。その後、この第二の細胞ペレットを10%FCS−抗生物質−ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)の媒体に、細胞凝集塊を解離させるためにニードル(0.8mm)および10mlシリンジを用いて再懸濁させる。次に、これらの細胞をIV型コラーゲン(Sigma)で被覆された透過性多孔質支持体(Transwell(商標), Costar, Sigma)上に播種し(104/cm2)、加湿雰囲気中、37℃、5%CO2でインキュベートする。翌日、培養培地を、以下のホルモン添加剤および他の増殖因子:インスリン、アポトランスフェリン、上皮細胞増殖因子(EGF)、エピネフリン、ヒドロキシコルチゾン、3,30,5−トリヨードチロニン、内皮細胞成長添加剤、レチノイン酸(低濃度、約10nM)、アムホテリシンB(2.5mg/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)、ペニシリン(100U/ml)、硫酸ゲンタマイシン(50mg/ml)およびL−グルタミン(2mM)を含有するBEBM培地(Lonza)を用いて再構成した増殖培地(BEGM)に置き換える。
気液界面で増殖させた気道細胞培養物からの膜の切片をアセトンまたはメタノール中で固定する(10分、−20℃)。PBSですすいだ後、非特異的部位をPBS−BSA3%でブロックし、その後、一次抗体を、用いる抗体によって室温にて1時間〜4℃で16時間、PBS−BSA−1%でインキュベートする。すすいだ後、結合した二次抗体を、PBS−BSA1%に溶解させ、室温で1時間インキュベートする。すすいだ後、核をDAPIで標識し、ハリスヘマトキシリンで対比染色する。すすいだ後、これらのスライドを取り付け、共焦顕微鏡で観察する。2つのマウス抗体を含む二重連続標識の場合、一次抗体の空き部位をブロックする工程を、抗マウス抗Fab(H+L)抗体を用いて室温で30分間行う。
鼻ポリープの間質を解離した後、上皮細胞(約20.106)をPBS−BSA−EDTA中で30分間インキュベートし、その後、標識抗体CD151−PEおよび抗TF(組織因子)−FITCとともに4℃で20分間インキュベートする(Hajj, R. et al., Stem Cells 25, 139-148 (2007)参照)。2回洗浄した後、細胞をPBS−EDTAにとり、完全性が変化した細胞を標識するためにDAPIとともにインキュベートする。
上皮分化マーカー(繊毛細胞のチューブリン−β4(図1E〜F)、粘液分泌細胞のムチンMUC5AC(図1G〜H)および基底細胞のサイトケラチン13(図1I〜J))の発現を調べるために免疫標識を行った。
(1)気液界面の確立の1日目(ALI−D0)に、細胞は増殖し、層状の扁平上皮を生成する。
(2)気液界面5〜7日後(ALI−D7)、細胞の極性化が始まる。
(3)気液界面約14日後、細胞は多列上皮を形成し、細胞表面に最初の繊毛が見られ(ALI−FC)、同時に細胞の伸長が見られ、毛様体形成の開始を示す(図1C)。
(4)気液界面約21日後(ALI−WD)、気道上皮は、大部分の細胞が円筒状で繊毛を有する完全な分化段階である多列となり、下層をなす基底細胞層ならびに粘液分泌細胞を伴う(図1D)。
ハイスループットシーケンシングの技術は、複雑な混合物中のある特定のmiRNAの存在度を確定することを可能とする。
アフリカツメガエル胚の繊毛表皮細胞
Hayes et al. (Dev Biol 312 (1), 115 (2007))に記載されているようなアフリカツメガエル胚の繊毛表皮を粘液繊毛上皮モデルとして用いる。
気液界面で培養した4つの分化段階:ALI−D0(0日目)、ALI−D7(7日目)、ALI−FC(約14日目の、最初の繊毛出現の際)およびALI−WD(約21日目の、完全に分化したもの)のHAECから全RNAを抽出した。細胞を、トリゾール(商標)(Invitrogen)を含む試薬中で溶解させる。小RNAおよびマイクロRNAを含む全RNAをQiagen RNEasyカラム(Qiagen)にて、供給者の説明書に従って精製する。
小RNAおよびマイクロRNAを含む全RNAを上記のように単離する。この手順は、Applied Biosystems Ligase-Enhanced Genome Detection technology (LEGenD(商標))に基づき、SOLiD(商標)Small RNA Expressionキット(Applied Biosystems, France)に基づく。この方法を用いれば、サンプルの小RNAを二本鎖DNAのライブラリーに変換することができ、それは新世代ハイスループットシーケンシングとしてApplied Biosystems SOLiD(商標)Systemにより開発されたものである。
統計分析は、Bioconductor(商標)(Peter Dalgaard, Statistics and computing, Introductory statistics with R. Springer, 2002; R. Gentleman, V.J. Carey, W. Huber, R.A. Irizarry, S. Dudoit. Statistics for biology and health. Bioinformatics and computational biology solutions using R and bioconductor. Springer, 2005)のソフトウエアRを用いて行う。
マイクロRNAのハイスループットシーケンシングと並行して、マイクロRNAの発現レパートリー(マイクロRNAome)を、Agilent(商標)マイクロRNAチップ技術を用いて調べる。このために、以前と同じ患者からのRNAサンプルを用い、Agilent(商標)miRNAチップ(866のヒトmiRNAおよび89のヒトウイルスmiRNA、すなわち、Sanger miRBase v.12.0, Agilent Technologies, Franceに収められ参照できる全てのヒトmiRNAを含むヒトmiRNAマイクロアレイv2)上で、「miRNA標識およびハイブリダイゼーション」キットを供給者(Agilent Technologies)の説明書に従って標識し、ハイブリダイズさせた。
トランスクリプトームの分析のため、上記のように、全RNAを精製し、それらの品質を確認する。
データ分析は、statistical consortium Rによって開発されたソフトウエアR Bioconductorを用いて行う。次に、これらのデータを、チップ分析の際に得られる情報の大規模分析および保存のために開発された情報システムMedianteインターフェース(Le Brigand and Barbry, 2007)の手段によって可視化する。
4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences)中で固定した後、ALI−D21段階の細胞培養物またはヒト気道組織の凍結切片をアセチル化し、脱イオン化ホルムアミド50%、0.3M NaCl、20mM Tris−HCl pH 8.0、5mM EDTA、10mM NaPO4 pH8.0、10%デキストラン硫酸、1×デンハート溶液および0.5mg/mlの酵母RNA中、ジゴキシゲニン標的マイクロRNA(Exiquon, Woburn, MA)で標識した0.3ng/μlのLNAプローブとともに55℃で一晩インキュベートする。
miR−449の場合:ccagctaacaatacactgcc(配列番号204)
miR−31の場合:agctatgccagcatcttgcct(配列番号205)
陰性対照マイクロRNA(「スクランブル」)の場合:gtgtaacacgtctatacgccca(配列番号206)
である。
II−2.A.HAEC細胞
このように、本発明者らは、現在知られている総てのヒトmiRNA(約750)に関して、まず、miRNAのハイスループットシーケンシング(HTS)技術によって115のmiRNAが分化中に、8を超える強度値(シーケンシングを行ったmiRNA数をノーマライズしたもののLog2に相当する)で発現されることを見出した。
このモデルに関して得られた結果を下表IIIBおよび図6(HAEC細胞に関する結果も表す)に示す。
miR−449は、増殖中のHAEC細胞におけるマイクロRNAの全配列の0.01%未満に相当するが、これらのmiR−449は、分化したHAEC細胞で発現されるマイクロRNAの8%超に相当する(図6のグラフaおよびb参照)。さらに、アフリカツメガエル細胞中のmiR−449aは分化中に有意に増え、表皮外植体の繊毛細胞中の全マイクロRNA配列の最大39%を占める(図6のグラフc〜d参照)。
III−1.各miRNAの特異的細胞種の同定
天然の気道上皮と同様に、これらの試験で用いたin vitro分化モデルは、基底細胞、繊毛細胞および粘液分泌細胞からなる。各細胞種に特異的なmiRNAのレパートリーを同定するために、本発明者らは、特異的マーカーの手段によるフローサイトメトリーによる細胞選別を用いた(Hajj, R. et al. 2007)。この技術を用い、成体気道前駆体細胞(先験的に基底細胞に相当する)(このような細胞はテトラスパニンCD151と組織因子に対して二重陽性を呈する)を、これらの同じマーカーに対して陰性を呈する錐体細胞(すなわち、繊毛細胞および粘液分泌細胞)から単離、選択および選別した。これらは3人の異なるドナーから得られたポリープまたは鼻甲介から精製されたものであった。
miRNA生物学における大きな試みは、それらが調節する標的mRNAを実験的に同定および特性決定可能にすることである。この目標を持って、in silicoアプローチ(標的を予測するためのバイオインフォマティックソフトウエア)を実験アプローチ(トランスクリプトームチップ、miRNAならびにルシフェラーゼと融合させた対象遺伝子の3’−UTR部分を含むリポーターベクターの異所発現)に組み合わせた。補足実験として、免疫細胞化学、ビデオ顕微鏡および生化学的アプローチを用いた。
認識配列レベルで配列相同性を有する5つの選択されたmiRNA mir−449a、mir−449bおよびmir−34a、mir−34b−5p(mir−34b*)およびmir−34c−5pの各5p鎖に関して、Mediante network interface (www.microarray.fr)からアクセス可能な予測バイオインフォマティックツール(すなわち、TargetScan, mirbase target, picTar and Microcible 2to8)を用い、予測された標的遺伝子を取得した。本発明者らは、まず、目的とする5つのmiRNAに共通の予測された標的遺伝子を選択し、上記で詳説した方法論によって確認した。個々に取得した各miRNAに対する3500近くの予測標的のうち、1229の標的が、選択された5つのmiRNAに共通である。次に、この1229の予測標的を、分化中に、より詳しくは、完全に分化した状態と最初の未分化増殖段階の間(ALI−WDとALI−D0(n=3ドナー))に有意に抑制されたもの(約1000、P<0.05)と比較した。このように、結果は、気道上皮の再生に重要な役割を果たす可能性のある、選択された5つのmiRNAに共通の62の遺伝子を示す(表VIII参照)。これらの遺伝子の中でも、特に、カベオリン−1が見出される。これらの結果は、カベオリン−1が分化中、強く阻害されることを示す(図8参照)。
カベオリン−1(Cav−1)は、カベオラと呼ばれる原形質膜の小さな陥入の形成に不可欠な22kDaの膜タンパク質である。Cav−1遺伝子は接着細胞(内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞)で発現される。
MicroCibleアルゴリズムを用いた。このアルゴリズムは、Cav−1転写物おいて、mir−34a/34c−5p、mir−449a/bに対する3つの異なる固定部位に対して、miR−34b−5pに対する7つの異なる固定部位を同定する。本発明者らは、Cav−1の全3’−UTR部分がルシフェラーゼコード配列の下流に挿入されたリポーター遺伝子の発現ベクターを構築した。次に、HEK293T細胞をこのベクターおよび選択された5つの各miRNA(mir34a/b−5p/c−5p/449a/b)でコトランスフェクトし、それぞれ陰性対照miRNAの場合と比較した。
3’−UTR発現ベクターおよびルシフェラーゼ活性の測定
カベオリンの非コード部分(3’−UTR)の完全配列(配列番号178)をPCRによって増幅した後、psiCheck2ベクター(Promega)のXhoIおよびNotI部位にクローニングする。
目的とする遺伝子と他の官能基との間の相互作用のネットワークを同定するために、ソフトウエアIngenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA)を用いた。1を超える比を有する遺伝子を選択した。このように、生物学的機能および疾患と本発明者らの試験結果を関連づけることができる。
本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子をカベオリン−1の非コード3’部分と融合させた場合、mir−34b−5pがルシフェラーゼ遺伝子の発現を有意に阻害したことを示した(P<0.01)。これらの結果は、本発明者らが見出した分化中にはカベオリン−1が強く阻害されることと合わせると、Cav−1は気道上皮の分化プロセスに関与するmir−34b*(mir−34b−5p)の特異的標的であることを示唆する(図11)。
目的とするmiRNAの発現によって特異的に変調される遺伝子を決定するために、mir−449a、mir−449b、mir−34a、mir−34b*およびmir−34c−5pの各miRNAを未分化気道上皮細胞(HAEC)の初代培養物にトランスフェクトし、トランスフェクション48時間後に、トランスクリプトームチップ(Affymetrix(商標))によって、特異的に変調される遺伝子を調べた。
次に、毛様体形成に対するmiR−449発現減衰の効果を検討した。
HAEC細胞
6つの独立したHAEC細胞培養物を、miR−449に対するオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、コレステロール分子に結合させ、再生期間中の毛様体形成を評価した。
miR−449に対するモルホリノ(MO)オリゴヌクレオチド(GeneTools, LLC, Philomath, Oregon, USA)は以下の配列を有する。
MO−449a:5’-ACCAGCTAACATTACACTGCCT-3’(配列番号209)
MO−449b:5’-GCCAGCTAAAACTACACTGCCT-3’(配列番号210)
MO−449c:5’-ACAGCCAGCTAGCAAGTGCACTGCC-3’(配列番号211)および
対照MO:5’-TGCACGTTTCAATACAGACCGT-3’(配列番号212)
そのantagomirによって無効とされるmiR−449は、ALI−D21段階の繊毛HAEC細胞の数に有意な減少をもたらし(毛様体形成阻害の平均値2.3±0.3、n=6、P<0.001)(図14参照)、並行してmiR−449発現にも同程度の減少をもたらす(図14、顕微鏡写真b)。
毛様体形成に対するmiR−449の影響を評価するためには、miR−449の標的が最終分化中、およびmiR−449のトランスフェクション後に阻害されたかどうかを確認することが望ましいと思われた。
フローサイトメトリーによる細胞周期の分析
肺腺癌のA549細胞の細胞周期を血清欠乏の一晩の培養によって同調させた後、マイクロRNAでトランスフェクトし、次に、これらの細胞を、L−グルタミンおよび10%FCSを添加したDMEM中で30%コンフルエントまで培養する。これらの細胞を48時間後に回収し、80%エタノールで固定し、RNアーゼA(50μg/ml)を含有する0.1mlのヨウ化プロピジウム溶液で染色する(37℃、30分)。
Areg、Ccnb1、Ccne2、Cdc25a、DII1およびNotch1の非翻訳3’領域の完全配列または部分配列を増幅し、psiCheck2ベクター(Promega)にクローニングした。
miR−449の標的を、(i)HAEC細胞の4つの再生段階(ALI−D0、ALI−D7、ALI−D14、ALI−D21)における発現プロフィール、(ii)miR−449でトランスフェクトされた増殖中のHAEC細胞を用いた場合の発現プロフィールの分析によって定義した。Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (Edgar et al. Nucleic Acids Res 30 (1), 207 (2002))によって特異的に発現されたmRNAの機能的注釈により、G2/M期と関連し、かつ、毛様体形成と関連する遺伝子の有意な増加が明らかである(図16参照)。
次に、毛様体形成に対する持続的DII1活性の結果を評価した。
Claims (10)
- 脊椎動物被験体の繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力をin vitroで診断する方法であって、
(i)該被験体の繊毛上皮組織の細胞によるmiRNAの発現レベルを定量的に測定する工程;
(ii)該被験体の該繊毛上皮組織のmiRNA発現プロフィールを確定する工程;
(iii)該被験体のmiRNAの発現プロフィールを、下表Iで示される1以上の他の健康被験体の繊毛上皮組織のmiRNAの発現プロフィールと比較する工程(ここで、この発現レベルは発現強度のレベルとしてlog2で表す);
(v)工程(ii)で確定された該プロフィールの少なくとも1つのmiRNAが、該他の健康被験体による同じmiRNAの発現レベルに対して少なくとも2倍、すなわちlog2で少なくとも1単位異なる発現レベルを有する場合、該第一の被験体の少なくとも1つのmiRNAの発現異常と関係した繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力の欠陥が証明される工程
を含んでなる、方法。 - 繊毛上皮組織の繊毛の機能不全に関連する障害の予防および/または治療に用いるための配列番号1〜6、8〜52、157〜162および201の配列のhsa−miR−100、hsa−miR−106b、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−130a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−141、hsa−miR−151−5p、hsa−miR−15a、hsa−miR−16、hsa−miR−17、hsa−miR−181a、hsa−miR−191、hsa−miR−193b、hsa−miR−1975、hsa−miR−200a、hsa−miR−200b、hsa−miR−200c、hsa−miR−203、hsa−miR−205、hsa−miR−21、hsa−miR−210、hsa−miR−22、hsa−miR−224、hsa−miR−23a、hsa−miR−23b、hsa−miR−25、hsa−miR−26a、hsa−miR−26b、hsa−miR−27b、hsa−miR−29a、hsa−miR−29c、hsa−miR−30b、hsa−miR−30c、hsa−miR−30d、hsa−miR−30e、hsa−miR−31、hsa−miR−34a、hsa−miR−34b、hsa−miR−34c−5p、hsa−miR−365、hsa−miR−374a、hsa−miR−378、hsa−miR−425、hsa−miR−429、hsa−miR−449a、hsa−miR−449b、hsa−miR−449c、hsa−miR−574−3p、hsa−miR−92b、hsa−miR−939、hsa−miR−96、hsa−miR−99a、hsa−let−7a、hsa−let−7b、hsa−let−7c、hsa−let−7e、hsa−let−7fおよびhsa−let−7g(下記表B参照)、配列番号53〜58、60〜104、163〜168および202の配列のそれらの「スター」相補鎖、または場合により化学的に修飾されていてもよい相補的配列鎖、ならびに配列番号105〜110、112〜156、169〜174、193〜200および203の配列のそれらの前駆体から選択される、請求項1に記載の方法によって同定されたmiRNA。
- 原発性繊毛ジスキネジアまたはカルタゲナー症候群などの原発性繊毛病;内臓逆位;雄性および雌性不妊症;アルストレム症候群;バルデー・ビードル症候群;メッケル・グルーバー症候群;多発性嚢胞腎;網膜変性;シーニア・ローケン症候群;または、膵臓線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、細気管支炎およびウイルス起源の呼吸器系感染などの続発性繊毛病の予防および/または治療に用いるための請求項2に記載のmiRNA。
- 気道上皮の再生および/または分化の障害を含む病態の予防および/または治療のための、請求項2または3に記載のmiRNA。
- 前記病態が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、膵臓線維症、喘息、原発性繊毛ジスキネジア、気道の慢性炎症および感染ならびに呼吸不全などの慢性および/または遺伝性呼吸器系疾患を含んでなる群から選択される、請求項4に記載のmiRNA。
- hsa−miR−34a(配列番号38)、hsa−miR−34b(配列番号39)、hsa−miR−34c−5p(配列番号40)、hsa−miR−449a(配列番号46)、hsa−miR−449b(配列番号47)、hsa−miR−449b*(配列番号99)、hsa−miR−449c(配列番号201)、hsa−miR−92b(配列番号49)、hsa−miR−1975(配列番号15)、hsa−miR−99a(配列番号52)、hsa−miR−191(配列番号13)、hsa−miR−378(配列番号43)、hsa−miR−23b(配列番号26)、hsa−miR−125a−5p(配列番号3)、hsa−miR−203(配列番号19)、hsa−miR−574−3p(配列番号48)、hsa−miR−29c(配列番号32)、hsa−miR−140−3p(配列番号5)、hsa−miR−205(配列番号20)、hsa−miR−23a(配列番号25)、hsa−miR−31(配列番号37)、hsa−miR−31*(配列番号89)、hsa−miR−21(配列番号21)、hsa−miR−17(配列番号11)、hsa−miR−29a(配列番号31)、hsa−miR−193b(配列番号14)、hsa−miR−210(配列番号22)およびhsa−miR−130a(配列番号4)、配列番号55〜57、63、65〜67、71〜74、77、78、83、84、90〜92、95、98、100、101、104および202の配列のそれらの「スター」相補鎖、場合により化学的に修飾されていてもよいそれらの相補的配列鎖、ならびに配列番号107〜109、115、117〜119、123〜126、129、130、135、136、141〜144、147、151〜153、156および203のそれらの前駆体を含んでなる群から選択される、請求項2〜5のいずれか一項に記載のmiRNA。
- hsa−miR−34a(配列番号38)、hsa−miR−34b(配列番号39)、hsa−miR−34c−5p(配列番号40)、hsa−miR−449a(配列番号46)、hsa−miR−449b(配列番号47)、hsa−miR−449b*(配列番号99)、hsa−miR−449c(配列番号201)、hsa−miR−92b(配列番号49)、hsa−miR−1975(配列番号15)、hsa−miR−99a(配列番号52)、hsa−miR−191(配列番号13)、hsa−miR−378(配列番号43)、hsa−miR−23b(配列番号26)、hsa−miR−125a−5p(配列番号3)、hsa−miR−203(配列番号19)、および配列番号107、117、119、123、130、142〜144、147、150、151、153、156および203の配列のそれらの前駆体、および/またはhsa−miR−205、hsa−miR−31、hsa−miR−21、hsa−miR−17、hsa−miR−29a、hsa−miR−193b、hsa−miR−31*、hsa−miR−210、hsa−miR−130aから選択される場合により化学的に修飾されていてもよいmiRNAの少なくとも1つの「スター」相補鎖であるhsa−miR−205*(配列番号72)、hsa−miR−31およびhsa−miR−31*(配列番号37および89)、hsa−miR−21*(配列番号73)、hsa−miR−17*(配列番号63)、hsa−miR−29a*(配列番号83)、hsa−miR−193b*(配列番号66)、hsa−miR−210*(配列番号74)、hsa−miR−130a*(配列番号56)、ならびに配列番号108、115、118、124〜126、135および141の配列のそれらの前駆体を含んでなる群から選択される、請求項2〜5のいずれか一項に記載のmiRNA。
- 領域2〜7または領域3〜8に、GGCAGUGA(配列番号175)、AAUCACU(配列番号176)およびAUCACUA(配列番号177)を含んでなる群から選択される認識配列を有する、請求項2〜5のいずれか一項に記載のmiRNA。
- hsa−miR−34a(配列番号38)、hsa−miR−34b(配列番号39)、hsa−miR−34c−5p(配列番号40)、hsa−miR−449a(配列番号46)、hsa−miR−449b(配列番号47)、およびhsa−miR−449c(配列番号201)を含んでなる群から選択される、請求項8に記載のmiRNA。
- 医薬品として用いるための、hsa−miR−125a−5p(配列番号3)、hsa−miR−130a(配列番号4)、hsa−miR−140−3p(配列番号5)、hsa−miR−151−5p(配列番号8)、hsa−miR−15a(配列番号9)、hsa−miR−16(配列番号10)、hsa−miR−17(配列番号11)、hsa−miR−181a(配列番号12)、hsa−miR−191(配列番号13)、hsa−miR−193b(配列番号14)、hsa−miR−1975(配列番号15)、hsa−miR−200b(配列番号17)、hsa−miR−203p(配列番号19)、hsa−miR−205(配列番号20)、hsa−miR−21(配列番号21)、hsa−miR−22(配列番号23)、hsa−miR−224(配列番号24)、hsa−miR−23a(配列番号25)、hsa−miR−23b(配列番号26)、hsa−miR−25(配列番号27)、hsa−miR−26a(配列番号28)、hsa−miR−26b(配列番号29)、hsa−miR−27b(配列番号30)、hsa−miR−29a(配列番号31)、hsa−miR−29c(配列番号32)、hsa−miR−30b(配列番号33)、hsa−miR−30c(配列番号34)、hsa−miR−30d(配列番号35)、hsa−miR−30e(配列番号36)、hsa−miR−31(配列番号37)、hsa−miR−34b(配列番号39)、hsa−miR−34c−5p(配列番号40)、hsa−miR−365(配列番号41)、hsa−miR−374a(配列番号42)、hsa−miR−378(配列番号43)、hsa−miR−425(配列番号44)、hsa−miR−449a(配列番号46)、hsa−miR−449b(配列番号47)、hsa−miR−449c(配列番号201)、hsa−miR−574−3p(配列番号48)、hsa−miR−92b(配列番号49)、hsa−miR−939(配列番号50)、hsa−miR−96(配列番号51)、およびhsa−miR−99a(配列番号52)、配列番号55〜57、60、61、63〜67、69、71、72、75〜78、80〜84、87〜89、91〜96、98〜104および202の配列のそれらの「スター」相補鎖、場合により化学的に修飾されていてもよいそれらの相補的配列鎖、ならびに配列番号107〜109、112、113、115〜119、121、123、124、127〜130、132〜136、139〜141、143〜148、150〜156、194、195、197および203のそれらの前駆体を含んでなる群から選択されるmiRNA。
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