JP2013234156A - リンカー領域がリン酸化されたSmad3を特異的に認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定キット。被験者由来の検体を抗体と接触させるステップ;及び、該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたSmad3の結合を検出又は定量するステップ、を備える、リンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定方法。
【選択図】なし
Description
(1) リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。
(2) Smad3がヒト、マウス又はラット由来である、(1)に記載のモノクローナル抗体。
(3) Smad3のリンカー領域のセリン又はスレオニンがリン酸化されていることを特徴とする(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体。
(4) リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、配列番号1で表わされるアミノ酸配列の133〜223番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、179番目のスレオニン、204番目のセリン、208番目のセリン、及び/又は213番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(5) リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、配列番号1で表わされるアミノ酸配列の133〜223番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、208番目のセリン、及び/又は213番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、(1)〜(4)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(6) リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−pSer−Pro−Asn−Pro−Met−pSer−Pro−Ala(配列番号32)、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−pSer−Pro−Asn−Pro−Met−Ser−Pro−Ala(配列番号33)、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−Ser−Pro−Asn−Pro−Met−pSer−Pro−Ala(配列番号34)、又はGln−Ser−Asn−Ile−Pro−Glu−pThr−Pro−Pro−Pro−Gly−Tyr−Leu(配列番号35)である、(1)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(7) リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識し、かつ、リン酸化されたSmad3のC末端を認識しない(1)〜(6)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(8) リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するが、リン酸化されたSmad2のリンカー領域を認識しない、(1)〜(7)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(9) 以下の、(i)又は(ii)から選択されるいずれか1つのモノクローナル抗体又はその断片:
(i)重鎖が配列番号5に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。
(ii)重鎖が配列番号19に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号21に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。
(10) 配列番号12、13、14、15、16及び17に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号26、27、28、29、30及び31に記載のアミノ酸配列を有する、(9)に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(11) 配列番号12、13、14、15、16及び17に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号26、27、28、29、30及び31に記載のアミノ酸配列をCDRとして有する、(9)に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(12) 重鎖のCDR1が配列番号12に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号13に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のCDR3が配列番号14に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のCDR1が配列番号15に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号16に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のCDR3が配列番号17に記載されたアミノ酸配列を有する抗体、あるいは、重鎖のCDR1が配列番号26に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号27に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のCDR3が配列番号28に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のCDR1が配列番号29に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号30に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のCDR3が配列番号31に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
(13) 以下の(i)〜(iv)から選択されるいずれか1つのモノクローナル抗体:
(i)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号9のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号9のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号9のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号11のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号11のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号11のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(ii)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号23のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号23のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号23のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号25のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号25のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号25のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(iii)重鎖の可変領域が配列番号9のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号11のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体;
(iv)重鎖の可変領域が配列番号23のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号25のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。
(14) (1)〜(13)のいずれか1項に記載の抗体を含有する薬剤。
(15) (1)〜(13)のいずれか1項に記載の抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定キット。
(16) 被験者由来の検体を(1)〜(13)のいずれか1項に記載の抗体と接触させるステップ;及び、
該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたSmad3の結合を検出又は定量するステップ、
を備える、リンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定方法。
(17) 癌の発症を予測するための情報を得る方法、又は癌の発症を予測する方法であって:
(a)被験者由来の検体中と少なくとも1つの(1)〜(13)のいずれか1項に記載の抗体とを接触させるステップ;
(b)リンカー領域がリン酸化されたSmad3の該抗体への結合を検出して試料中のリンカー領域がリン酸化されたSmad3を検出又は定量するステップ;及び、
(b)リンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルから癌の発症を予測するステップ、ここで、リンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルが高いことが、被検者が癌を発症しやすいことを示す。
(18) 被験者が慢性肝炎患者であり、癌が肝臓癌である、(17)に記載の方法。
(19) 被験者由来の検体が、血液、血漿、血清、尿、又は肝臓組織である、(17)又は(18)に記載の方法。
重鎖のCDR1が配列番号26に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号27に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のCDR3が配列番号28に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のCDR1が配列番号29に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号30に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のCDR3が配列番号31に記載されたアミノ酸配列を有する抗体(例えば、ヒト化抗体)である。
(i)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号9のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号9のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号9のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号11のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号11のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号11のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(ii)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号23のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号23のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号23のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号25のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号25のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号25のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(iii)重鎖の可変領域が配列番号9のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号11のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体;
(iv)重鎖の可変領域が配列番号23のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号25のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。
本発明の抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、リンカー部がリン酸化されたSmad3の全部、又はその一部を有するポリペプチド(例えば、配列番号36〜41のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるペプチド)をコードするDNAを含む発現ベクター(例えば、pGEX(大腸菌用)、pcDNA3.1(動物細胞発現用)等)を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等(好ましくは、カイコ細胞)に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を適切な培地(例えば、LB培地等)で培養して発現させることにより得ることができる。また、当該配列を有するペプチドを化学合成したものを用いることも可能である。
本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識する非ヒトモノクローナル抗体のVH及びVLをコードするDNA(例えば、配列番号8及び配列番号10に記載の核酸配列からなるDNA、又は、配列番号22及び配列番号24に記載の核酸配列からなるDNA)を調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(Morrison,S.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,6851−6855,1984)。
本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識する非ヒトモノクローナル抗体のVH及びVLのCDRをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLのFRに移植したV領域をコードするDNAを構築し、構築したDNAをヒト由来免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(L.Rieohmannら,Nature,332,323,1988:Kettleborough,C.A.ら,Protein Eng.,4,773−783,1991;Clark M.,Immunol.Today.,21,397−402,2000参照)。非ヒト動物モノクローナル抗体のCDRは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のVH及びVLをコードするDNA配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のVH及びVLの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のFRとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域(以下、「V領域」という)のCDRが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のV領域と類似の立体構造となるヒト抗体のFR、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のFRのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体FRである。使用するヒト化抗体のV領域をコードするDNA配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のCDRのアミノ酸配列とヒト抗体のFRのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するDNA配列として設計する。ヒト化抗体のV領域をコードするDNAは、設計したDNA配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる(富塚ら,Nature Genet.,15,146−156(1997))。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる(パンニング)。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのVH遺伝子及びVL遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
F(ab’)2断片(分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片)は、本発明のIgG抗体(例えば、5A11あるいは1A1モノクローナル抗体)をペプシンで処理することにより得ることができる。Fab’断片は、上述の方法により得られたF(ab’)2をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のFab’断片は、本発明の抗体のFab’をコードするDNAから得ることができる。Fab断片(H鎖のN末端側の約半分の領域とL鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片)は、本発明の抗体をパパインで処理することにより得ることができる。また、本発明のFab断片は、本発明の抗体のFabをコードするDNAから得ることができる。scFvは、本発明の抗体のVH及びVLをコードするcDNAの間にリンカー配列をコードするDNAを挿入して、scFvをコードするDNAを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、VHとVLが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは10〜20残基であり、より好ましくは15残基である。また、リンカーの配列は、VHとVLの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び/又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、GGGGS(G:グリシン、S:セリン)又はその繰り返し配列である。dsFvは、VH及びVL中のそれぞれ1アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Diabodyは、上述のscFvをコードするDNAにおいて、リンカーのアミノ酸配列が8残基以下(好ましくは5残基)となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなDiabodyは、異なる2種類のscFvのVH及びVLのDNAを組み合わせてscFvを作製することにより得ることができる。本発明のCDRを含むペプチドは、本発明の抗体のVH又はVLのCDRのアミノ酸配列を有するペプチドとして設計することにより得ることができる。
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、DMSO、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で10分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット(Biotin Labeling Kit−NH2、Biotin Labeling Kit−SH:株式会社同仁化学研究所)、アルカリフォスファターゼ標識用キット(Alkaline Phosphatase Labeling Kit−NH2、Alkaline Phosphatase Labeling Kit−SH:株式会社同仁化学研究所)、ペルオキシダーゼ標識キット(Peroxidase Labering Kit−NH2、Peroxidase Labering Kit−NH2:株式会社同仁化学研究所)、フィコビリプロテイン標識キット(Allophycocyanin Labeling Kit−NH2、Allophycocyanin Labeling Kit−SH、B−Phycoerythrin Labeling Kit−NH2、B−Phycoerythrin Labeling Kit−SH、R−Phycoerythrin Labeling Kit−NH2、R−Phycoerythrin Labeling Kit−SH:株式会社同仁化学研究所)、蛍光標識キット(Fluorescein Labeling Kit−NH2、HiLyte Fluor(登録商標) 555 Labeling Kit−NH2、HiLyte Fluor(登録商標) 647 Labeling Kit−NH2:株式会社同仁化学研究所)、DyLight547、DyLight647(テクノケミカル株式会社)、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)抗体標識キット、Qdot(登録商標)抗体標識キット(インビトロゲン社)、EZ−Label Protein Labeling Kit(フナコシ株式会社)等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
また、本発明は、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識する抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定キットに関する。具体的には、本発明は、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする免疫化学測定のキットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体(又は標識化した抗体)を用いて、酵素免疫測定法(EIA法)、簡易EIA法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA法)、ラジオイムノアッセイ法(RIA法)、蛍光免疫測定法(FIA法)等の標識化免疫測定法;ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法;金コロイド凝集法等のイムノクロマト法;イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法、CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
一の態様において、本発明は、リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、リンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定方法に関する。具体的には、本発明の測定方法は、以下のステップを含んでいてもよい:被験者由来の検体をリン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ;及び、該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたSmad3の結合を検出又は定量するステップ。
(a)被験者由来の検体をリン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ;
(b)リンカー領域がリン酸化されたSmad3の該抗体への結合を検出して検体中のリンカー領域がリン酸化されたSmad3を検出又は定量するステップ;及び、
(b)リンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルから癌の発症を予測するステップ(又は、癌の発症を予測するための情報を得るステップ)、ここで、リンカー領域がリン酸化されたSmad3が存在する又はリンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルが高いことが、被検者が癌を発症しやすいことを示す。
(a)被験者由来の検体のリンカー領域がリン酸化されたSmad3を定量すること;及び、
(b)測定されたリンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルと該患者の癌発症との関連付けをすることを含む方法、
ここで、前記関連付けは、以下の方法を含む:
(c)定量されたリンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルから、癌の発症クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は定量されたリンカー領域がリン酸化されたSmad3のレベルに依存している;及び
(d)分類された当該一つの反応クラスに属する癌の発症に特異的な既知の性質から当該患者の癌の発症を予測すること。
(1)抗原の調製
Smad3のリンカー部におけるリン酸化部位のうち、179番目のスレオニン、204番目のセリン、208番目のセリン、及び、213番目のセリンに着目し、これらの部位を含むペプチドを抗原として設計し、リン酸化させて抗原として使用した。具体的には、CQSNIPETPPPGYL(配列番号36)、IPETPPPGYLSEDGETS(配列番号37)、SPNPMSPAHNNLDL(配列番号38)、AGSPNLSPNPMSPA(配列番号39)、NHSMDAGS−PNLSPNP(配列番号40)、又は、AGSPNLSPNPMSPA(配列番号41)のアミノ酸配列からなるペプチドを設計し、抗原として使用した。
抗原ペプチドは、Chinese Peptide Company社(杭州市、中国)に合成を依頼し取得した。
得られた抗原ペプチドをマウスに注射した。免疫マウスから得られた脾細胞、及びリンパ節細胞をミエローマ細胞株X63−Ag8.653と融合させた。
抗リンカー部セリンリン酸化Smad3ペプチドを固相しハイブリドーマ細胞の上清の抗体とリンカー部のセリンがリン酸化されたSmad3との反応性をEIAにより測定した。結果を表1に示す。
さらにリン酸化部位特異的なクローンの樹立を行うため開発を鋭意進め、最終的に1つのクローンを樹立し、5A11と名づけた。この得られたクローンの反応特異性の検討を行った。
得られた5A11抗体の結合特性を評価するため、ELISA及びウエスタンブロットによる分析を行った。各種Smad3ペプチドを固相し、5A11抗体を反応させた。ELISAの結果を図2に示す。本図に示す通り、5A11抗体は213番目のセリンを特異的に認識する抗体であることが確認された。また、Smad3非リン酸化(EPSM)、Smad3 リン酸化(W.T.)をCOS細胞に発現させた細胞を用いてウエスタンブロット解析を行った。ウエスタンブロットの結果を図3に示す。その結果、5A11はCOS細胞発現系での発現をウエスタンブロットで確認できる程度に結合力が強いことが確認された。またリンカー部のリン酸化がおこらないSmad3非リン酸化(EPSM)を発現させた細胞には反応しないことが確認された。
上記(3)および(4)で示した抗リンカー部セリンリン酸化Smad3抗体産生の作製及びクローンの樹立と同様の方法を用いて、リンカー部スレオニンリン酸化部位特異的なクローンの樹立を行うため開発を鋭意進め、最終的に1つのクローンを樹立し、1A1と名づけた。この得られたクローンの反応特異性の検討を行った。
(7)クローン1A1抗体のELISA分析及びウエスタンブロット分析
抗原固相ELISAにより1A1抗体とリン酸化された各ペプチドSmad3との反応性を測定した。結果を図4に示す。1A1は179番目のスレオニンがリン酸化されたSmad3を認識し、かつ、179番目のスレオニンがリン酸化されていないSmad3を認識しなかった。
また、得られたクローンの結合特性を評価するため、ウエスタンブロットによる分析を行った。Smad3非リン酸化(EPSM)、Smad3 リン酸化(W.T.)をCOS細胞に発現させた細胞を用いてウエスタンブロット解析を行った。ウエスタンブロットの結果を図5に示す。その結果、1A1はCOS細胞発現系での発現をウエスタンブロットで確認できる程度に結合力が強いことが確認された。またリンカー部のりん酸化がおこらないSmad3(EPSM)を発現させた細胞には反応しないことが確認された。
抗原として、リン酸化された種々の各Smad3ペプチドを固相した後、上記で得られた5A11抗体および1A1抗体を反応させ、洗浄後、HRP標識した抗マウスIgGを反応させ、洗浄後基質液を加えて得られる発色強度の確認により、リン酸化された各Smad3ペプチドとの反応特異性を判定した。結果を表2に示す。+が反応している事を示す。
5A11抗体及び1A1抗体の遺伝子配列を決定するため、重鎖(以下、「Hc」という)及び軽鎖(以下、「Lc」という)のクローニングを行った。各抗体を産生するハイブリドーマからmRNAを抽出し、cDNAを作製した。常法に従って、5’−Rapid amplification of cDNA ends(5’−RACE)を行い、Hc及びLc遺伝子の5’末端の塩基配列を決定した。Hc、Lcに特異的なプライマーを使用して、それぞれの全長cDNAをクローニングした。決定された5A11のHc及びLcの遺伝子配列は、配列番号4及び配列番号6、アミノ酸配列は、配列番号5及び配列番号7にそれぞれ記載の通りであった。また、決定された1A1のHc及びLcの遺伝子配列は、配列番号18及び配列番号20、アミノ酸配列は、配列番号19及び配列番号21にそれぞれ記載の通りであった。
(1)ヒト肝臓組織の調製
インフォームドコンセントの下、大腸癌が肝臓に転移した患者の手術後の肝臓組織を実験に使用した。
大腸癌が肝臓に転移した患者から得たホルマリン固定パラフィン包埋切片を、常法に従ってミクロトーム上で5μm厚に切断した。
切片からパラフィンを定法により除去、水和させ、トリス塩酸緩衝生理食塩水(TBST)で洗浄後、内因性の過酸化を防ぐため、3%過酸化水素含有メタノール中で10分間静置処理した。水で洗浄後、切片を市販の抗原賦活溶液(DAKO社)に浸したまま、圧力鍋に入れて電子レンジで、予熱10分した後、15分加熱し、30分室温で放置した。TBSTで洗浄後、1%BSAで切片をブロッキング操作を10分間行った。TBSTで軽く洗浄後、第一抗体として、5A11抗体(2〜5μg/mL濃度)および1A1抗体(1〜2μg/mL濃度)と共に4℃で一晩静置反応した。TBSTで洗浄後、二次抗体として、ENVISIONキット/HRP(DAB) Rabbit/Mouse (DAKO #K5027)と共に室温で60分間静置反応した。TBSTで洗浄後、免疫反応性は、3,3’−ジアミノベンジジン(シグマ社)を色原体として使用し可視化した。またヘマトキシリンで対比核染色した。最終的に脱水、透徹、封入を行い顕鏡に供した。
結果を図7に示す。
Claims (17)
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。
- Smad3がヒト、マウス又はラット由来である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- Smad3のリンカー領域のセリン又はスレオニンがリン酸化されていることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、配列番号1で表わされるアミノ酸配列の133〜223番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、179番目のスレオニン、204番目のセリン、208番目のセリン、及び/又は213番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、配列番号1で表わされるアミノ酸配列の133〜223番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、208番目のセリン、及び/又は213番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域が、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−pSer−Pro−Asn−Pro−Met−pSer−Pro−Ala(配列番号32)、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−pSer−Pro−Asn−Pro−Met−Ser−Pro−Ala(配列番号33)、Ala−Gly−Ser−Pro−Asn−Leu−Ser−Pro−Asn−Pro−Met−pSer−Pro−Ala(配列番号34)、又はGln−Ser−Asn−Ile−Pro−Glu−pThr−Pro−Pro−Pro−Gly−Tyr−Leu(配列番号35)である、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識し、かつ、リン酸化されたSmad3のC末端を認識しない請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するが、リン酸化されたSmad2のリンカー領域を認識しない、請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 以下の、(i)又は(ii)から選択されるいずれか1つのモノクローナル抗体又はその断片:
(i)重鎖が配列番号5に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片;
(ii)重鎖が配列番号19に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号21に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。 - 配列番号12、13、14、15、16及び17に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号26、27、28、29、30及び31に記載のアミノ酸配列を有する、請求項9に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 配列番号12、13、14、15、16及び17に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号26、27、28、29、30及び31に記載のアミノ酸配列をCDRとして有する、請求項9に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 重鎖のCDR1が配列番号12に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号13に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のCDR3が配列番号14に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のCDR1が配列番号15に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号16に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のCDR3が配列番号17に記載されたアミノ酸配列を有する抗体、あるいは、重鎖のCDR1が配列番号26に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のCDR2が配列番号27に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のCDR3が配列番号28に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のCDR1が配列番号29に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のCDR2が配列番号30に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のCDR3が配列番号31に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
- 以下の(i)〜(iv)から選択されるいずれか1つのモノクローナル抗体:
(i)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号9のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号9のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号9のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号11のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号11のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号11のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(ii)(I)重鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号23のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列;
配列番号23のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号23のアミノ酸配列、かつ、
(II)軽鎖の可変領域が、以下から選択される1のアミノ酸配列を有し:
配列番号25のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列;
配列番号25のアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列;又は、
配列番号25のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたSmad3のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体;
(iii)重鎖の可変領域が配列番号9のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号11のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体;
(iv)重鎖の可変領域が配列番号23のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号25のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。 - 請求項1〜請求項13のいずれか1項に記載の抗体を含有する薬剤。
- 請求項1〜請求項13のいずれか1項に記載の抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定キット。
- 被験者由来の検体を請求項1〜請求項13のいずれか1項に記載の抗体と接触させるステップ;及び、
該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたSmad3の結合を検出又は定量するステップ、
を備える、リンカー領域がリン酸化されたSmad3の測定方法。 - 被験者由来の検体が、血液、血漿、血清、尿、又は肝臓組織である、請求項16に記載の方法。
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JPN6016005747; HEPATOLOGY (2003) Vol.38, No.4, p.879-889 * |
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