JP2013231740A

JP2013231740A - Multi-light-source microscope

Info

Publication number: JP2013231740A
Application number: JP2013161458A
Authority: JP
Inventors: Shinichiro Isobe; 信一郎礒部; Takaaki Kanamaru; 孝昭金丸; Shinichi Takasu; 信一高洲
Original assignee: IST Inc; KURUME RES PARK KK; KURUME RESEARCH PARK KK
Current assignee: IST Inc; KURUME RES PARK KK; KURUME RESEARCH PARK KK
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2013-11-14
Anticipated expiration: 2029-05-29
Also published as: JP2010008406A; JP5893687B2; JP2014211448A; JP5628978B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a multi-light-source microscope, including a plurality of light sources for observation, for not only electronic image observation, but also fluorescent image observation, fluoroscopic image observation, etc., of the same biological tissue sample.SOLUTION: There is provided a multi-light-source microscope that includes an electron gun as a light source of an electron microscope and at least another kind of light source, and enables a sample to be observed at the same position. The multi-light-source microscope comprises an optical microscope and a scanning type electron microscope for observing fluorescent light, and a Cassegrain mirror of the optical microscope is arranged in the lens barrel of the scanning type microscope coaxially with the light source of an electron beam of the scanning type electron microscope, the Cassegrain mirror having a reflecting surface of an aspherical surface type.

Description

本発明は、複数の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡に関する。 The present invention relates to a multi-light source microscope having a plurality of light sources and capable of observing a sample at the same position.

疾病診断方法の開発等の医療バイオ分野では、生体組織を蛍光色素で免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察している。しかし、この方法では１０００倍程度の解像度が限界である。それに対し、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を高倍率で観察する方法として、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという。）の電子線を試料に照射して蛍光を発生させ（カソードルミネッセンス）、その蛍光を観察する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。また、半導体ウェハ等の分析に関するものではあるが、荷電粒子による試料励起と光による試料励起を一つの装置で行うようＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、試料の分析点のＸ線分光スペクトルと蛍光スペクトルとを測定する表面分析装置も提案されている（例えば、特許文献２）。 In the field of medical biotechnology such as development of disease diagnosis methods, biological tissues are immunostained with fluorescent dyes and then observed using a fluorescence microscope. However, this method has a limit of about 1000 times the resolution. On the other hand, as a method of observing the analysis point of a sample made of biological tissue labeled with a fluorescent dye at a high magnification, the sample is irradiated with an electron beam from a scanning electron microscope (hereinafter referred to as SEM) to generate fluorescence. (Cathodeluminescence) and a method of observing the fluorescence has been proposed (for example, Patent Document 1). In addition, although it relates to the analysis of semiconductor wafers and the like, the SEM and optical microscope are combined so that sample excitation by charged particles and sample excitation by light are performed in one apparatus, and the X-ray spectrum and fluorescence at the analysis point of the sample are combined. A surface analyzer for measuring a spectrum has also been proposed (for example, Patent Document 2).

特開平１１−２６０３０３号公報JP 11-260303 A 特開平５−１１３４１８号公報Japanese Patent Laid-Open No. 5-113418

ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせることにより、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を即座にＳＥＭで観察することにより、その分析点の形態的特徴から対象物を短時間で同定できることが期待できる。しかしながら、分解能が不十分であり、生体組織の観察に使用可能な、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの分析装置は報告されていない。 By combining an SEM and an optical microscope, the analysis point of a sample consisting of a biological tissue labeled with a fluorescent dye can be immediately observed with the SEM, and the object can be identified in a short time from the morphological characteristics of the analysis point. Can be expected. However, there has been no report on a practical level analyzer that combines an SEM and an optical microscope, which has insufficient resolution and can be used for observation of living tissue.

また、ＳＥＭと光学顕微鏡との組み合わせだけでなく、ＳＥＭとＸ線顕微鏡、あるいはＳＥＭと光学顕微鏡とＸ線顕微鏡との組み合わせも必要とされている。 Further, not only a combination of an SEM and an optical microscope but also a combination of an SEM and an X-ray microscope or an SEM, an optical microscope and an X-ray microscope is required.

そこで、本発明は、同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、そして透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供することを目的とした。 Therefore, the present invention provides a multi-light source microscope equipped with a plurality of observation light sources capable of performing not only electronic image observation but also fluorescence image observation and fluoroscopic image observation on the same biological tissue sample. Aimed at that.

上記課題を解決するため、本発明の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有することを特徴とする。 In order to solve the above-described problems, a multi-light source microscope of the present invention is a multi-light source microscope capable of observing a sample at the same position. A light source unit provided; an optical system that irradiates the sample with an electron beam or an electromagnetic wave from the light source unit; and a detection unit that includes a fluorescent plate made of cerium-doped YAG and detects an electron beam or an electromagnetic wave transmitted through the sample. It is characterized by.

本発明の多光源顕微鏡は、複数の光源の光軸が同軸となるように構成されており、試料を移動させることなく、１台の装置で、蛍光観察と電子像観察、あるいは蛍光観察と電子像観察と透視Ｘ線像観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。本発明によれば、光源に電子銃を用いた場合、二次電子像観察、反射電子像観察、透過電子像観察、ＥＤＸ観察、そしてＳＴＥＭ観察が可能であり、光源にレーザを用いた場合、ケーラー照明による像観察やケーラー照明による蛍光像観察、光源にＸ線を用いた場合、透視Ｘ線像観察や３Ｄ透視Ｘ線像観察、そして電子線照射によるカソードルミネッセンス観察や、レーザ照射によるラマン／蛍光測定等が可能である。なお、本発明の観察対象は生体組織に限定されず、従来の電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、そして光学顕微鏡が対象とするものであれば、金属、半導体、セラミックス、プラスチック等の種々の材料も含まれる。 The multi-light source microscope of the present invention is configured so that the optical axes of a plurality of light sources are coaxial, and without moving a sample, fluorescence observation and electron image observation, or fluorescence observation and electron observation can be performed with a single device. Image observation and fluoroscopic X-ray image observation are possible. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced. According to the present invention, when an electron gun is used as a light source, secondary electron image observation, reflected electron image observation, transmission electron image observation, EDX observation, and STEM observation are possible. When a laser is used as a light source, Image observation by Koehler illumination, fluorescence image observation by Koehler illumination, when X-ray is used as a light source, fluoroscopic X-ray image observation, 3D fluoroscopic X-ray image observation, cathode luminescence observation by electron beam irradiation, Raman / Fluorescence measurement and the like are possible. Note that the observation object of the present invention is not limited to living tissue, and includes various materials such as metals, semiconductors, ceramics, and plastics as long as they are intended for conventional electron microscopes, X-ray microscopes, and optical microscopes. It is.

参考形態１に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows an example of a structure of the multiple light source microscope which concerns on the reference form 1. FIG. 参考例１におけるラットの神経組織の顕微鏡写真であり、（ａ）は蛍光画像、（ｂ）は蛍光ＳＥＭ画像である。It is a microscope picture of the rat nerve tissue in the reference example 1, (a) is a fluorescence image, (b) is a fluorescence SEM image. 参考例２におけるラットの腎(尿細管)の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。It is a microscope picture of the rat kidney (tubule) in Reference Example 2, (a) is a SEM image, (b) is a fluorescence image, (c) is a fluorescence SEM image. 参考例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。It is a microscope picture of the lymph node tissue containing the macrophage in the reference example 3, (a) is a SEM image, (b) is a fluorescence image, (c) is a fluorescence SEM image. 実施の形態１に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。2 is a schematic diagram illustrating an example of a configuration of a multi-light source microscope according to Embodiment 1. FIG.

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
参考形態１．
図１は、本参考形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータ１からなるシステム制御部１と、ＳＥＭ部２と、光学顕微鏡部２０とから構成されている。ＳＥＭ部２においては、電子線発生部３から発生し加速された電子線が、電子線走査部４により２次元的に走査され、真空チャンバ６内に配置された鏡筒部５を通って試料９に照射される。なお、鏡筒内５には、光学顕微鏡用の反射ミラー１３が配置されているが、電子線は反射ミラー１３内の通過孔（不図示）を通って試料１０に至る。また、１１は試料１０をＸＹ方向に移動させる試料ステージであり、試料ステージ制御部９により駆動される。また、試料１０への電子線照射により発生する二次電子は検出器７により検出され、増幅器８により増幅される。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
Reference Form 1
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of the configuration of a multi-light source microscope according to the present embodiment.
The multi-light source microscope includes a system control unit 1 including a host computer 1, an SEM unit 2, and an optical microscope unit 20. In the SEM unit 2, the electron beam generated and accelerated from the electron beam generation unit 3 is two-dimensionally scanned by the electron beam scanning unit 4 and passes through the lens barrel unit 5 disposed in the vacuum chamber 6. 9 is irradiated. A reflecting mirror 13 for an optical microscope is disposed in the lens barrel 5, but the electron beam reaches the sample 10 through a passage hole (not shown) in the reflecting mirror 13. Reference numeral 11 denotes a sample stage that moves the sample 10 in the XY directions, and is driven by the sample stage control unit 9. Further, secondary electrons generated by electron beam irradiation on the sample 10 are detected by the detector 7 and amplified by the amplifier 8.

一方、光学顕微鏡部２０は、ＳＥＭ部の光軸から離れた位置に配置された、照明用の光源２１と、照明部２２と、観察カメラ２３と、試料９からの蛍光を集光する光ファイバー部２４と、その光ファイバー部２４からの蛍光強度を測定する分光器２５とを有している。 On the other hand, the optical microscope unit 20 includes an illumination light source 21, an illumination unit 22, an observation camera 23, and an optical fiber unit that collects fluorescence from the sample 9, which are arranged at positions away from the optical axis of the SEM unit. 24 and a spectroscope 25 for measuring the fluorescence intensity from the optical fiber portion 24.

例えば、試料１０の光学像を観察する場合、光学顕微鏡部２０の光源２１の光を、照明部２２からレンズやミラー等の光学系（不図示）により反射ミラー１３に向けて照射する。反射ミラー１３で反射された光は、ＳＥＭ部に電子線の光軸に沿って、鏡筒内５に配置されたカセグレン鏡１２に至る。カセグレン鏡１２は、中央に開口を有し上方に配置された１個の大鏡１２ａと、その開口の下方に配置された小鏡１２ｂとからなり、その大鏡１２ａと小鏡１２ｂとが対向するように配置されている。反射ミラー１３からの光は、大鏡１２ａの開口を通過し、小鏡１２ｂによって反射され、その反射光は大鏡１２ａによって反射集束されて試料１０に照射される。 For example, when an optical image of the sample 10 is observed, the light from the light source 21 of the optical microscope unit 20 is irradiated from the illumination unit 22 toward the reflection mirror 13 by an optical system (not shown) such as a lens or a mirror. The light reflected by the reflection mirror 13 reaches the Cassegrain mirror 12 disposed in the lens barrel 5 along the optical axis of the electron beam in the SEM part. The Cassegrain mirror 12 is composed of one large mirror 12a having an opening at the center and disposed above, and a small mirror 12b disposed below the opening. The large mirror 12a and the small mirror 12b are opposed to each other. Are arranged to be. The light from the reflection mirror 13 passes through the opening of the large mirror 12a, is reflected by the small mirror 12b, and the reflected light is reflected and focused by the large mirror 12a and irradiated onto the sample 10.

そして、試料１０からの光は、大鏡１２ａによって反射され、小鏡１２ｂによって反射され、反射ミラー１３へ向かう。反射ミラー１３で反射された光は、光学系（不図示）によって観察カメラ２３と光ファイバー部２４へと向かう。 The light from the sample 10 is reflected by the large mirror 12 a, reflected by the small mirror 12 b, and travels toward the reflecting mirror 13. The light reflected by the reflection mirror 13 travels to the observation camera 23 and the optical fiber unit 24 by an optical system (not shown).

蛍光標識された試料について光学顕微鏡で数百倍程度の観察倍率で観察を行い、さらに所望の試料領域についてＳＥＭを用いてさらに高倍率の観察を行う。 The fluorescently labeled sample is observed with an optical microscope at an observation magnification of about several hundred times, and the desired sample region is further observed with an SEM at a higher magnification.

ここで、ＳＥＭ部は、ホストコンピュータ１で電子線を走査制御して得られた二次電子等を検出部７で検出してＩ−Ｖアンプ（不図示）にて電気信号に変え、ホストコンピュータ１のＡ・Ｄコンバータ（不図示）で変換してＳＥＭ画像を取得する。また、光学顕微鏡部は、蛍光選択フィルタ（不図示）と観察用カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、ホストコンピュータ１へデジタル信号として送る。送られたＳＥＭ画像と蛍光画像は、ホストコンピュータ１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。 Here, the SEM unit detects secondary electrons or the like obtained by scanning control of the electron beam with the host computer 1 with the detection unit 7 and converts it into an electrical signal with an IV amplifier (not shown). A SEM image is acquired by conversion with an A / D converter (not shown). The optical microscope section also has a fluorescence selection filter (not shown) and an observation camera (for example, a CCD camera), and the fluorescence image displayed at the target wavelength by the wavelength selection by the fluorescence selection filter is displayed on the CCD camera. And sent to the host computer 1 as a digital signal. The sent SEM image and fluorescent image are synthesized (superposed) by the host computer 1 using image synthesis system software.

本参考形態では、非球面型のカセグレン鏡を用いている。すなわち、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡は、中央に開口を有する１個の凹面鏡と、その凹面鏡よりは小さい１個の凸面鏡とから構成されており、その反射面の形状が放物面、楕円面、双曲面等の球面型であった。しかしながら、反射面が球面型であると、光学像を観察した際に周辺部が歪むため、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできない。これに対し本参考形態では、大鏡と小鏡の反射面が非球面である非球面型のカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易である。これにより分解能をさらに向上させることができるので、高倍率での蛍光観察が可能となる。ここで、非球面型とは、反射面が上記の放物面、楕円面、双曲面等の球面型でないもの、具体的には平坦面を意味する。効果についてさらに詳しく説明すると、カセグレン鏡を非球面化することで、ザイデル収差の一つ歪曲収差(物体平面上の形状と像面での形状が相似形とはならない現象)が改善され、球面収差(軸上光線で開口数Ｎ．Ａ．の差によって結像位置が異なる現象)、コマ収差(球面収差が十分小さく補正されていても、軸外物点から出た光線は像面上の1点に集まらず、彗星のように尾を引いた非対称なボケを作る現象)等も同時に改善され、尚且つ、光学的な問題(軸上、倍率)である色収差(光学系に使用するガラスは、各波長により屈折率が異なる特性を有している。それにより各波長毎で焦点距離が異なることとなり、結像位置のズレが発生する現象)も改善され、電子顕微鏡像と重ね合わせても光学顕微鏡で観察している蛍光像の視野範囲内でのズレが生じなくなる。 In this reference embodiment, an aspherical Cassegrain mirror is used. That is, conventionally, a Cassegrain mirror constituting an optical microscope is composed of one concave mirror having an opening at the center and one convex mirror smaller than the concave mirror, and the shape of the reflecting surface is a paraboloid, It was a spherical type such as an elliptical surface or a hyperboloid. However, if the reflecting surface is a spherical type, the peripheral portion is distorted when the optical image is observed, so that it cannot be superimposed on the electron microscope image. On the other hand, in this embodiment, since the aspherical Cassegrain mirror with the reflecting surfaces of the large mirror and the small mirror is aspherical, there is no distortion around the optical image, and the superposition with the electron microscope image is possible. Easy. As a result, the resolution can be further improved, and fluorescence observation at a high magnification becomes possible. Here, the aspheric type means that the reflecting surface is not a spherical type such as the above-mentioned paraboloid, ellipsoid or hyperboloid, specifically a flat surface. The effect will be explained in more detail. By making the Cassegrain mirror aspherical, one distortion of Seidel aberration (a phenomenon in which the shape on the object plane and the shape on the image plane do not become similar) is improved, and spherical aberration (Phenomenon in which the imaging position varies depending on the numerical aperture NA due to the axial ray), coma aberration (even if the spherical aberration is corrected sufficiently small, the ray emitted from the off-axis object point is 1 on the image plane. At the same time, the phenomenon of creating asymmetric blur with a tail like a comet that does not gather at a point) is improved, and chromatic aberration (on the axis, magnification) that is an optical problem (glass used in the optical system is The refractive index varies depending on each wavelength, which results in different focal lengths for each wavelength, and the phenomenon that the image formation position shifts is improved. Fluorescence image observed with an optical microscope within the field of view It does not occur.

また、本参考形態においては、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が光源の照射光量に対し６０〜９０％の範囲にあることが好ましい。より好ましくは、７０〜９０％、さらに好ましくは７０％である。戻り光の光量低下を抑制することにより、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が向上し、高価な高感度観察カメラを使用すること無く、観察カメラで観察できる。また、観察カメラを単眼鏡または双眼鏡に置き換えて目視でも観察可能となる。 Moreover, in this reference form, it is preferable that the light quantity of the return light which reflected and returned from the sample exists in the range of 60 to 90% with respect to the irradiation light quantity of the light source. More preferably, it is 70-90%, More preferably, it is 70%. By suppressing the reduction in the amount of return light, the amount of return light reflected back from the sample is improved, and observation can be performed with an observation camera without using an expensive high-sensitivity observation camera. In addition, the observation camera can be replaced with monoculars or binoculars and can be observed visually.

光学顕微鏡部の光源には、レーザ光等の単色光、白色光及びそれらの組み合わせを用いることができる。また、照明部はケーラー照明又はスポット照明が可能であることが好ましい。例えば、光源にレーザ光源を用い、照明部にケーラー照明を用いることにより、蛍光顕微鏡を構成することができる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を検出器でＩ／Ｖ変換させ、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、走査型レーザ顕微鏡を構成することもでき、さらに、検出器の位置調整を行うことで共焦点型走査レーザ顕微鏡とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、戻り光を分光器に導くことにより、蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を分光器に導き、走査位置毎の分光分析を実施しながら、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、３次元での蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。ここで、ＸＹ軸は共に試料面上の位置情報となり、Ｚ軸方向は分光分析による波長軸となる。 Monochromatic light such as laser light, white light, and combinations thereof can be used as the light source of the optical microscope unit. Moreover, it is preferable that Koehler illumination or spot illumination is possible for an illumination part. For example, a fluorescence microscope can be configured by using a laser light source as a light source and using Koehler illumination as an illumination unit. Also, a laser light source is used as the light source, spot illumination is used as the illumination unit, the sample stage is scanned in the XY direction, the return light is I / V converted by the detector, and synchronized with the scanning signal of the sample stage as an XY map. By displaying, a scanning laser microscope can be configured, and further, a confocal scanning laser microscope can be formed by adjusting the position of the detector. Alternatively, a laser light source may be used as a light source, spot illumination may be used as an illumination unit, and return light may be guided to a spectroscope so that fluorescence measurement and Raman measurement can be performed. In addition, a laser light source is used as the light source, spot illumination is used as the illumination unit, the sample stage is scanned in the X and Y directions, the return light is guided to the spectrometer, and the sample stage is scanned while performing spectroscopic analysis for each scanning position. By synchronizing with the signal and displaying it as an XY map, it is also possible to adopt a configuration capable of three-dimensional fluorescence measurement and Raman measurement. Here, both the XY axes are positional information on the sample surface, and the Z-axis direction is a wavelength axis by spectroscopic analysis.

本参考形態に用いる観察用試料の作製方法は、特に限定されず、従来、顕微鏡観察用に用いられているいずれの作製方法も用いることができ、例えば、検体の薄切片を用いる包埋法や凍結法を挙げることができる。また、実体観察のため、検体片自身を支持基材上に固定する方法も含まれる。なお、蛍光色素には、（国際公開第２００８／０１３２６０号パンフレット）に記載された蛍光色素を用いることが好ましい。その国際公開パンフレットに記載された蛍光色素（オキサジアゾロピリジン誘導体）を用いることにより、期間保存しても蛍光色素からの蛍光が消失することがない永久標本を提供することができる。すなわち、従来の蛍光色素を用いた生体標本では、１週間程度で褪色するのに対し、その蛍光色素を用いた生体標本は、冷蔵保存可能である限り半永久的に保存することが可能となる。また、従来の蛍光色素に比べ安価である。また、実質的に乾燥状態である生体標本でも高い蛍光強度を与えるため、さらに信頼性の高い病理診断が可能である。 The preparation method of the observation sample used in this reference form is not particularly limited, and any of the preparation methods conventionally used for microscopic observation can be used. For example, an embedding method using a thin section of a specimen or A freezing method can be mentioned. In addition, a method of fixing the specimen piece itself on the support base material for entity observation is also included. In addition, it is preferable to use the fluorescent dye described in (International Publication No. 2008/013260 pamphlet) as the fluorescent dye. By using the fluorescent dye (oxadiazolopyridine derivative) described in the international publication pamphlet, it is possible to provide a permanent specimen in which the fluorescence from the fluorescent dye does not disappear even when stored for a period of time. That is, a biological specimen using a conventional fluorescent dye fades in about one week, whereas a biological specimen using the fluorescent dye can be stored semipermanently as long as it can be stored refrigerated. Moreover, it is cheaper than conventional fluorescent dyes. In addition, since a biological specimen that is substantially in a dry state gives high fluorescence intensity, a more reliable pathological diagnosis is possible.

以下に、バルク観察とエッチング切片観察を行う場合の試料作製方法の一例を示す。なお、試料作製には、以下の試薬を共通して用いることができる。
ａ）免疫染色およびレクチン染色用の蛍光色素には、電子線耐性が高い、上記国際公開パンフレットに記載された蛍光色素又はAlexa系を用いることができる。
ｂ）脱水剤にはアセトンを用い、上昇系脱水法による（50-75-85-95-100%×2(各７分)）。 Below, an example of the sample preparation method in the case of performing bulk observation and etching slice observation is shown. In addition, the following reagents can be commonly used for sample preparation.
a) As the fluorescent dye for immunostaining and lectin staining, the fluorescent dye described in the above international publication pamphlet or Alexa system having high electron beam resistance can be used.
b) Acetone is used as the dehydrating agent, and ascending dehydration method (50-75-85-95-100% × 2 (each 7 minutes)).

（バルク観察用試料作製法）
＜Ａ：灌流固定＞
１)固定液は、2.8%パラフォルムアルデヒド＋0.2%ピクリン酸＋0.06%グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。後固定として4%パラフォルムアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。
＜Ｂ：凍結割断（DMSO法）＞
２)4%パラフォルムによる後固定後、PBSで十分な洗浄を行い、試料を30%DMSO→50%DMSOへ置換し、凍結割断装置（液体窒素）を用い50%DMSOに封じ込めた試料を割断・洗浄する。
＜Ｃ：蛍光標識＞
３）PBS洗浄後、免疫蛍光法およびレクチン染色により試料を蛍光色素で標識する。
＜Ｄ：試料処理−１＞
４）蛍光標識された試料を、アセトン脱水系に回した後、上昇系Tert-ブチルアルコール（50-100%×2(各５分)）に置換する。凍結乾燥機（エイコー製ＲＤ−１）にて乾燥しバルク試料とする。
＜Ｅ：コーティング＞
５）試料をＳＥＭ用試料台にカーボン製両面テープ等で接着後、オスミウムコータ（真空デバイス社製ＩＤ−２）を用い、約２ｎｍの厚さにオスミウムをコートする。 (Sample preparation method for bulk observation)
<A: Perfusion fixation>
1) Use 2.8% paraformaldehyde + 0.2% picric acid + 0.06% glutaraldehyde phosphate buffer as the fixative. 4% paraformaldehyde phosphate buffer is used for post-fixation.
<B: Freezing cleaving (DMSO method)>
2) After post-fixation with 4% paraform, thoroughly wash with PBS, replace the sample with 30% DMSO → 50% DMSO, and cleave the sample contained in 50% DMSO using a freeze crusher (liquid nitrogen)・ Wash.
<C: Fluorescent label>
3) After washing with PBS, the sample is labeled with a fluorescent dye by immunofluorescence and lectin staining.
<D: Sample treatment-1>
4) After the fluorescently labeled sample is transferred to the acetone dehydration system, it is replaced with ascending system Tert-butyl alcohol (50-100% × 2 (each 5 minutes)). Dry with a freeze dryer (RD-1 manufactured by Eiko) to obtain a bulk sample.
<E: Coating>
5) After adhering the sample to the SEM sample stage with carbon double-sided tape or the like, osmium is coated to a thickness of about 2 nm using an osmium coater (ID-2 manufactured by Vacuum Device Inc.).

（エッチング観察用試料作製法）
試料処理に以下の方法を用いた以外は、バルク観察用試料作製法と同様の方法で行うことができる。
＜Ｄ：試料処理−２＞
５）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製する。蛍光輝度を確保するため、切片の厚さを１０μｍとすることもできる。
６）試料搭載用の板には、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、試料を載せる。
７）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とする。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行う。 (Sample preparation for etching observation)
Except for using the following method for sample processing, it can be performed in the same manner as the sample preparation method for bulk observation.
<D: Sample treatment-2>
5) After embedding the labeled and dehydrated sample with a hydrophilic plastic (Technobit 8100), a slice of about 5 μm thickness is prepared using a diamond knife for light microscopy and an ultramicrotome. In order to ensure the fluorescence luminance, the thickness of the slice can be set to 10 μm.
6) As the sample mounting plate, a wafer Si substrate divided into about 8 mm square is used, and the sample is placed thereon.
7) Perform ion etching on the substrate sample to obtain a slice sample. Ion etching is performed at 13 mA / 8 minutes using PIB-10 manufactured by Vacuum Device Corporation.

本参考形態によれば、ＳＥＭシステムの電子ビームの光軸と同軸となるように光学顕微鏡のカセグレン鏡がＳＥＭの鏡筒内に配置されていることで、試料を移動させることなく、１台の装置で蛍光観察とＳＥＭ観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。また、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡の反射面は球面型であり、光学像を観察した際に周辺部が歪んでおり、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできなかった。これに対し本参考形態では、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易であり、分解能を向上させることができる。それにより、試料中の蛍光標識した部位を即座に拡大して高倍率で観察することが可能となる。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。 According to the present embodiment, the Cassegrain mirror of the optical microscope is arranged in the SEM column so as to be coaxial with the optical axis of the electron beam of the SEM system. Fluorescence observation and SEM observation are possible with the device. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced. Conventionally, the reflection surface of the Cassegrain mirror constituting the optical microscope is a spherical type, and when the optical image is observed, the peripheral portion is distorted and cannot be superimposed on the electron microscope image. On the other hand, this embodiment uses a Cassegrain mirror with an aspherical reflecting surface, so there is no distortion around the optical image, it is easy to superimpose with an electron microscope image, and the resolution is improved. Can do. As a result, the fluorescently labeled site in the sample can be immediately enlarged and observed at a high magnification. Thereby, identification confirmation of a labeled part can be performed rapidly.

実施の形態１．
図５は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部５１と、分光器５２と、顕微鏡部５０とから構成されている。顕微鏡部５０は、複数の光源５４，５５，５６と、それら光源を移動可能に保持する光源保持手段５７とを有する光源部５３と、鏡筒５８内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ６０ａからなる光学系６０と、試料６８を保持し、ＸＹ方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒６９と、試料の透過電子を検出する検出部７０と、鏡筒５８外に配置された観察部６４を有する。検出部７０は、試料６８を透過した電子が到達する蛍光板７１と、蛍光板７１が取着されたファイバーテーパー７２と、レンズユニット７４と、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５と、ファイバーテーパー７２とレンズユニット７４との間に取り付けられたフィルター７３とから構成されている。また、観察部６４は、外部ＣＣＤカメラ６５と蛍光選択フィルター６７が取着された三眼鏡筒６６から構成されている。また、５９は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、６１は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、６２は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、６３は、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）検出器である。また、７６は、可動型小反射蛍光板であり、試料６８からの透過電子を観察部６４に導くものである。 Embodiment 1 FIG.
FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the multi-light source microscope according to the present embodiment.
The multi-light source microscope includes a system control unit 51 including a host computer, a spectroscope 52, and a microscope unit 50. The microscope unit 50 is disposed in a light source unit 53 having a plurality of light sources 54, 55, and 56 and a light source holding unit 57 that holds these light sources so as to be movable, and accelerates an electron beam from the light source. An optical system 60 composed of a plurality of electromagnetic lenses 60a for irradiating the sample, a sample cylinder 69 that holds the sample 68, is movable in the XY directions and is rotatable, and a detection unit 70 that detects the transmitted electrons of the sample, It has an observation part 64 arranged outside the lens barrel 58. The detection unit 70 includes a fluorescent plate 71 to which electrons transmitted through the sample 68 arrive, a fiber taper 72 to which the fluorescent plate 71 is attached, a lens unit 74, a CCD / CMOS detector 75, a fiber taper 72, and a lens unit 74. And a filter 73 mounted between the two. The observation unit 64 includes a trinocular tube 66 to which an external CCD camera 65 and a fluorescence selection filter 67 are attached. Reference numeral 59 denotes a partition plate, which is used to block the lens barrel and the light source unit. That is, when switching the light source in the light source unit, if not only the light source unit but also the entire lens barrel in a vacuum state leaks, it takes time to return to the vacuum state again. Therefore, the light source unit and the lens barrel are shut off by the gate valve, and the leak time and re-evacuation time of the light source unit are shortened. Reference numeral 61 denotes a backscattered electron detector that detects backscattered electrons from the sample. Reference numeral 62 denotes a secondary electron detector that detects secondary electrons from the sample. Reference numeral 63 denotes an energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) detector. Reference numeral 76 denotes a movable small reflection fluorescent plate that guides transmitted electrons from the sample 68 to the observation unit 64.

光源部５３の光源としては、電子銃、レーザ光源、そしてＸ線源の３種の光源を用いることができる。本実施の形態に係る多光源顕微鏡では、この３種の光源を適宜切り換えて使用する。 As the light source of the light source unit 53, three types of light sources, that is, an electron gun, a laser light source, and an X-ray source can be used. In the multi-light source microscope according to the present embodiment, these three types of light sources are switched appropriately for use.

（電子顕微鏡）
光源に電子銃を用いることにより電子顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内の電子銃より照射された電子線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８からの反射電子は反射電子検出器６１で検出される。また、試料６８を透過した電子は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、透過型電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過電子像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料より発生したＸ線をＥＤＸ検出器６３を用いて検出することで元素分析が可能となる。 (electronic microscope)
By using an electron gun as a light source, it can be used as an electron microscope.
That is, the electron beam irradiated from the electron gun in the light source unit 53 passes through the gate valve 59, is accelerated by the optical system 60 in the lens barrel 58, and is irradiated on the sample 68 fixed to the sample cylinder 69. The reflected electrons from the sample 68 are detected by the reflected electron detector 61. The electrons that have passed through the sample 68 pass through the fluorescent plate 71, the fiber taper 72, and the lens unit 74, are detected by the CCD / CMOS detector 75, are imaged and displayed on the monitor of the system control unit 51. That is, it can be used as a transmission electron microscope. Here, the observation magnification can be changed by operating the lens unit 74. Further, by moving the movable small reflection fluorescence 76 on the optical path, the transmitted electron image from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66. Further, elemental analysis can be performed by detecting the X-rays generated from the sample using the EDX detector 63.

また、試料筒６９をＸＹ方向へ走査、そして回転走査(θ方向)し、二次電子検出器６２を用いて試料６８からの二次電子を検出することにより、走査型電子顕微鏡として使用することができる。また、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いることによりＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）の観察が可能となる。また、ＥＤＸ検出器６３を用いることで、ＸＹ方向の２次元元素マップ像の観察が可能となる。 The sample tube 69 is scanned in the X and Y directions and rotated (θ direction), and the secondary electrons from the sample 68 are detected by using the secondary electron detector 62, so that it can be used as a scanning electron microscope. Can do. Further, by using the CCD / CMOS detector 75, an STEM image (scanning transmission electron microscope image) can be observed. In addition, by using the EDX detector 63, it is possible to observe a two-dimensional element map image in the XY directions.

また、試料６８からの発光を三眼鏡筒６６を経由して分光器５２に光ファイバ等で導くことで、カソードルミネッセンス測定が可能となる。そして、試料筒６９をＸＹ方向へ走査することで２次元カソードルミネッセンスマップ像の観察が可能となる。 Further, cathodoluminescence measurement can be performed by guiding light emitted from the sample 68 to the spectroscope 52 via the trinocular tube 66 by an optical fiber or the like. Then, the two-dimensional cathodoluminescence map image can be observed by scanning the sample cylinder 69 in the XY directions.

（レーザ顕微鏡）
光源にレーザ光源を用いることにより、レーザ顕微鏡（光学顕微鏡）として使用することができる。ただし、電顕鏡筒内に光学系が組み込まれていないのでケーラー照明としてある面積に対してのみレーザが照射される。
光源部５３内のレーザ光源より照射されたレーザ光は、仕切り弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０を通り、試料筒６９内に固定された試料６８に照射される。可動型小反射蛍光板７６を光路上に移動させることで、試料６８からの光を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。すなわち、光学顕微鏡として使用することができる。また、試料が蛍光色素で標識されている場合は、三眼鏡筒６６に搭載されている蛍光選択フィルタ６７を光軸上に挿入することで、レーザ光(励起光)をカットして蛍光像を観察することが可能となる。また、試料からの光を三眼鏡筒６６経由で分光器５２に光ファイバ等で導くことで、ラマン測定が可能となる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ光学像又は３Ｄ蛍光像の観察が可能となる。 (Laser microscope)
By using a laser light source as the light source, it can be used as a laser microscope (optical microscope). However, since an optical system is not incorporated in the electron microscope column, the laser is irradiated only to a certain area as Koehler illumination.
The laser light emitted from the laser light source in the light source unit 53 passes through the gate valve 59, passes through the optical system 60 in the lens barrel 58, and is applied to the sample 68 fixed in the sample cylinder 69. By moving the movable small reflection fluorescent plate 76 on the optical path, the light from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66. That is, it can be used as an optical microscope. When the sample is labeled with a fluorescent dye, a fluorescence selection filter 67 mounted on the trinocular tube 66 is inserted on the optical axis, so that the laser light (excitation light) is cut and a fluorescent image is obtained. It becomes possible to observe. Further, the Raman measurement can be performed by guiding the light from the sample to the spectroscope 52 via the trinocular tube 66 with an optical fiber or the like. Further, a 3D optical image or a 3D fluorescent image can be observed by scanning the sample tube 69 in the X and Y directions and rotating and scanning (the θ direction).

また、透過光で撮影する場合、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いるが、試料作製により蛍光剤感度に低下が起こる場合がある。すると検出器７５のみでの撮影では、長時間の露出を強いられる可能性があり、それを補助する手段として蛍光板７１を用いることで輝度を確保できる。また、テーパー７２で広い視野を確保し検出器７５に画像を導く事ができる。 In addition, when photographing with transmitted light, the CCD / CMOS detector 75 is used, but the sensitivity of the fluorescent agent may be lowered due to sample preparation. Then, when photographing with only the detector 75, there is a possibility that exposure for a long time may be forced, and brightness can be secured by using the fluorescent plate 71 as means for assisting the exposure. Further, the taper 72 can secure a wide field of view and guide the image to the detector 75.

なお、レーザ光源としては、白色レーザを用いることができる。あるいは、波長が異なる複数のレーザ光源を必要に応じて切り換えて使用することもできる。 A white laser can be used as the laser light source. Alternatively, a plurality of laser light sources having different wavelengths can be switched and used as necessary.

（Ｘ線顕微鏡）
光源にＸ線源を用いることによりＸ線顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内のＸ線源より照射されたＸ線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８を透過したＸ線は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、Ｘ線電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過Ｘ線像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ透視Ｘ線像の観察が可能となる。 (X-ray microscope)
By using an X-ray source as a light source, it can be used as an X-ray microscope.
That is, the X-rays irradiated from the X-ray source in the light source unit 53 pass through the gate valve 59 and are accelerated by the optical system 60 in the lens barrel 58 and are irradiated on the sample 68 fixed to the sample tube 69. The X-ray that has passed through the sample 68 passes through the fluorescent plate 71, the fiber taper 72, and the lens unit 74, is detected by the CCD / CMOS detector 75, and is displayed as an image on the monitor of the system control unit 51. That is, it can be used as an X-ray electron microscope. Here, the observation magnification can be changed by operating the lens unit 74. In addition, the transmitted X-ray image from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66 by moving the movable small reflection fluorescence 76 on the optical path. Further, a 3D fluoroscopic X-ray image can be observed by scanning the sample tube 69 in the X and Y directions and rotating and scanning (the θ direction).

なお、Ｘ線源としては、公知のＸ線源を用いることができるが、チップ化されたものを用いることが好ましい。 As the X-ray source, a known X-ray source can be used, but it is preferable to use a chip.

本実施の形態で用いる蛍光板は、試料を透過した電子線や電磁波のエネルギーを吸収して蛍光を発生させるものである。蛍光板には試料透過部の拡大像が形成され、その拡大像はＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器により撮影される。従来、電子顕微鏡にはＰ２２粉末蛍光体からなる蛍光板が使用され、Ｘ線顕微鏡には微量の銀の入った硫化亜鉛等の蛍光板が使用されていた。電子顕微鏡用の蛍光板の検出波長域は、０．００３７ｎｍ〜０．００２５ｎｍであるのに対し、Ｘ線顕微鏡の蛍光板の検出波長域は０．０７ｎｍ〜０．１５ｎｍであり、共通に使用できるものではなかった。これに対し、本実施の形態では、蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いている。このセリウムドープＹＡＧは、０．００２〜７００ｎｍの検出波長域を有しているため、１種の蛍光板で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察を行うことが可能である。 The fluorescent plate used in the present embodiment generates fluorescence by absorbing energy of an electron beam or electromagnetic wave that has passed through the sample. An enlarged image of the sample transmission part is formed on the fluorescent plate, and the enlarged image is taken by a CCD / CMOS detector. Conventionally, a fluorescent plate made of a P22 powder phosphor has been used for an electron microscope, and a fluorescent plate such as zinc sulfide containing a small amount of silver has been used for an X-ray microscope. The detection wavelength range of the fluorescent plate for an electron microscope is 0.0037 nm to 0.0025 nm, whereas the detection wavelength range of the fluorescent plate of the X-ray microscope is 0.07 nm to 0.15 nm. There wasn't. In contrast, in the present embodiment, cerium-doped YAG is used for the fluorescent plate. Since this cerium-doped YAG has a detection wavelength range of 0.002 to 700 nm, it is possible to perform electron microscope observation and X-ray microscope observation with one kind of fluorescent plate.

セリウムドープＹＡＧは、例えば、以下の文献に記載された方法で作製された単結晶を用いる。
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi,Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
2. Tadayuki Takahashi: Future Prospects on X-ray and Gamma-ray Mission: 17th Annual October Astrophysics Conference in Maryland, Radiation Backgrounds from the First Stars, Galaxies and Black Holes: (2006)).
その方法によれば、チョクラルスキー法（Cz法）、又は、フローティングゾーン法（FZ法）によって単結晶のインゴットが作製可能である。また、セリウムのドープ量は、０．００５〜０．５ｍｏｌ％である。 As the cerium-doped YAG, for example, a single crystal produced by a method described in the following document is used.
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi, Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
2.Tadayuki Takahashi: Future Prospects on X-ray and Gamma-ray Mission: 17th Annual October Astrophysics Conference in Maryland, Radiation Backgrounds from the First Stars, Galaxies and Black Holes: (2006)).
According to that method, a single crystal ingot can be produced by the Czochralski method (Cz method) or the floating zone method (FZ method). The doping amount of cerium is 0.005 to 0.5 mol%.

ここで、電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像及び／又はＸ線顕微鏡画像との重ね合わせについて説明する。
例えば、透過電子顕微鏡画像とレーザ顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、レーザ顕微鏡は、蛍光選択フィルタ６７と外部ＣＣＤカメラ６５を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、システム制御部１へデジタル信号として送る。送られた透過電子顕微鏡画像と蛍光画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。 Here, the superposition of the electron microscope image and the laser microscope image and / or the X-ray microscope image will be described.
For example, transmission electron microscope images and laser microscope images are as follows.
Transmitted electrons from the sample are detected by the detection unit 70, photoelectrically converted, and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission electron microscope image. Further, the laser microscope has a fluorescence selection filter 67 and an external CCD camera 65. The fluorescence image displayed at the target wavelength is detected by the CCD camera by the wavelength selection by the fluorescence selection filter, and the system control unit 1 is detected. Send as a digital signal. The transmitted transmission electron microscope image and fluorescent image are synthesized (superposed) by the system control unit 1 using image synthesis system software.

また、透過電子顕微鏡画像とＸ線顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、試料からの透過Ｘ線は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過Ｘ線顕微鏡画像が得られる。送られた透過電子顕微鏡画像と透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。 In the case of a transmission electron microscope image and an X-ray microscope image, it is as follows.
Transmitted electrons from the sample are detected by the detection unit 70, photoelectrically converted, and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission electron microscope image. Further, transmitted X-rays from the sample are detected and photoelectrically converted by the detection unit 70 and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission X-ray microscope image. The transmitted transmission electron microscope image and transmission X-ray microscope image are synthesized (superposed) by the system control unit 1 using image synthesis system software.

また、透過電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像と、Ｘ線顕微鏡画像とを重ね合わせる場合、送られた透過電子顕微鏡画像と、蛍光画像と、透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。 Further, when the transmission electron microscope image, the laser microscope image, and the X-ray microscope image are superimposed, the transmitted transmission electron microscope image, the fluorescence image, and the transmission X-ray microscope image are imaged by the system control unit 1. Synthesis (superposition) is executed using the synthesis system software.

なお、本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、参考形態１で用いたと同様の作製方法を用いることができる。 Note that as a manufacturing method of the observation sample used in this embodiment mode, a manufacturing method similar to that used in Reference Embodiment 1 can be used.

本実施の形態によれば、検出部の蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いるようにしたので、試料を移動させることなく、１台の装置で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察、そしてレーザ顕微鏡観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。 According to the present embodiment, since cerium-doped YAG is used for the fluorescent plate of the detection unit, electron microscope observation, X-ray microscope observation, and laser microscope observation can be performed with one apparatus without moving the sample. It is. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced. Thereby, identification confirmation of a labeled part can be performed rapidly.

参考例１．
（試料作製）
ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PB(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した（３時間）。
２）20%シュークロースを含む0.1M PBで洗浄した（４℃、一晩）。
３）ａ．カミソリによる切断、ｂ．ＳＥＭ用凍結割断、ｃ．１０μｍ凍結切片作製などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。図２（ａ）にはｃ、図２（ｂ）にはａの方法を用いた。
４）0.1M PB洗浄（５分×３回）
５）0.8% fish gelatin、１％牛血清アルブミン, 0.2%Triton X-100を含む0.1M PBS(PBSTBF)でブロッキングした（室温、１時間）。
６）抗グリア線維性酸性蛋白Glial fibrillary acidic protein (GFAP)マウスモノクローナル抗体(1: 20,000; Sigma) in PBSTBF（４℃、１４時間）。コントロールはPBSTBFのみでインキュベートした。
７）0.1M PB洗浄（５分×３回）
８）ビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF（室温、９０分）
９）0.1M PB洗浄（５分×３回）
１０）Fluolid-labeled streptavidin in 10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3), 室温, 90分AMCA(7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid)標識ストレプトアビジン(1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, 室温,９０分。
但し、希釈倍率はFluolidの製作過程により変動する。
１１)0.1M PB洗浄（５分×３回）
なお、本参考例及び以下の参考例中、Fluolidとは、前記国際公開に記載された蛍光色素を指す。 Reference Example 1
(Sample preparation)
Immunostaining was performed on astrocytes, which are rat nerve tissue, by the following procedure.
1) The solution was fixed by refluxing with 0.1M PB (Phosphate Buffer) containing 4% paraformaldehyde and then fixed by immersion (3 hours).
2) Washed with 0.1M PB containing 20% sucrose (4 ° C., overnight).
3) a. Cutting with a razor, b. Freezing cleaving for SEM, c. Nerve (spinal cord) tissue was divided into small samples by a technique suitable for each application, such as preparation of 10 μm frozen sections. The method c was used in FIG. 2A and the method a in FIG.
4) 0.1M PB washing (5 minutes x 3 times)
5) Blocking was performed with 0.1 M PBS (PBSTBF) containing 0.8% fish gelatin, 1% bovine serum albumin, and 0.2% Triton X-100 (room temperature, 1 hour).
6) Glial fibrillary acidic protein (GFAP) mouse monoclonal antibody (1: 20,000; Sigma) in PBSTBF (4 ° C., 14 hours). Controls were incubated with PBSTBF only.
7) 0.1M PB washing (5 minutes x 3 times)
8) Biotin-labeled anti-mouse antibody (1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF (room temperature, 90 minutes)
9) 0.1M PB washing (5 minutes x 3 times)
10) Fluolid-labeled streptavidin in 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl (pH 7.3), room temperature, 90 minutes AMCA (7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid) labeled streptavidin (1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, room temperature, 90 minutes.
However, the dilution factor varies depending on the production process of Fluolid.
11) 0.1M PB washing (5 minutes x 3 times)
In addition, in this reference example and the following reference examples, Fluolid refers to the fluorescent dye described in the said international publication.

（顕微鏡観察方法）
ＳＥＭ部と光学顕微鏡部を備えた日本電子（株）製の波長分散型元素分析装置ＪＸＡ−８６００の光学顕微鏡部の光学系を改造したものを用いた。 (Microscope observation method)
A modified optical system of an optical microscope unit of a wavelength dispersive elemental analyzer JXA-8600 manufactured by JEOL Ltd. equipped with an SEM unit and an optical microscope unit was used.

（結果）
図２（ａ）に蛍光顕微鏡画像を、そして（ｂ）に本参考例の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。本参考例の蛍光ＳＥＭシステムを用いることにより、アストロサイトのみが染色された鮮明な画像が得られた。 (result)
FIG. 2A shows a fluorescence microscope image, and FIG. 2B shows a fluorescence SEM image obtained using the fluorescence SEM system of this reference example. By using the fluorescence SEM system of this reference example, a clear image in which only astrocytes were stained was obtained.

参考例２．
（試料作製）
ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドin PBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３) Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水（50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。 Reference Example 2
(Sample preparation)
Immunostaining was performed on rat kidneys (tubules) according to the following procedure.
1) After reflux fixation with 2.8% paraformaldehyde-0.2% picric acid-0.06% glutaraldehyde-0.1 MPB, post-fixation was performed with 4% paraformaldehyde in PB, and the mixture was stored at 4 ° C.
2) A 1 mm sample was prepared with a vibratome and washed with PBS (0.01 M) (4 ° C., 1 day).
3) Biotinylated Peanut Agglutinin (PNA) (Vector) in PBS (4 ° C, 4 days) (1: 100)
4) PBS washing (4 ° C., 20 minutes × 3)
5) Addition of fluorescent dye (4 ° C, 1 day)
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS (1:10)
6) PBS washing (4 ° C, 20 minutes x 3)
7) Acetone dehydration (50-75-85-95-100% ascending dehydration)
8) After embedding the labeled and dehydrated sample with a hydrophilic plastic (Technobit 8100), a slice of about 5 μm thickness was prepared using a light microscope diamond knife and an ultramicrotome.
9) The sample mounting plate was obtained by dividing the Si substrate for wafer into about 8 mm square, and the sample was placed thereon.
10) The substrate sample was ion-etched to obtain a slice sample. Ion etching was performed at 13 mA / 8 minutes using PIB-10 manufactured by Vacuum Device Corporation.

（結果）
図３（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本参考例の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。蛍光ＳＥＭ画像により、尿細管断面のブラッシュボーダーが選択的に染色されていることを確認できた。また、蛍光顕微鏡では観察不可能な尿細管内壁の絨毛を詳細に観察することができた。 (result)
3A shows an SEM image, FIG. 3B shows a fluorescence image, and FIG. 3C shows a fluorescence SEM image obtained using the fluorescence SEM system of this reference example. From the fluorescence SEM image, it was confirmed that the brush border of the tubular section was selectively stained. Moreover, the villi on the inner wall of the tubule, which could not be observed with a fluorescence microscope, could be observed in detail.

参考例３．
（試料作製）
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、４％パラホルムアルデヒドPBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１mmの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３)Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange（IST）in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水（50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。 Reference Example 3.
(Sample preparation)
1) After reflux fixation with 2.8% paraformaldehyde-0.2% picric acid-0.06% glutaraldehyde-0.1 MPB, post-fixation was performed with 4% paraformaldehyde PB, and the mixture was stored at 4 ° C.
2) A 1 mm sample was prepared with a vibratome and washed with PBS (0.01 M) (4 ° C., 1 day).
3) Biotinylated Peanut Agglutinin (PNA) (Vector) in PBS (4 ° C, 4 days) (1: 100)
4) PBS washing (4 ° C., 20 minutes × 3)
5) Addition of fluorescent dye (4 ° C, 1 day)
Streptavidin-Fluolid-W-Orange (IST) in PBS (1:10)
6) PBS washing (4 ° C, 20 minutes x 3)
7) Acetone dehydration (50-75-85-95-100% ascending dehydration)
8) After embedding the labeled and dehydrated sample with a hydrophilic plastic (Technobit 8100), a slice of about 5 μm thickness was prepared using a light microscope diamond knife and an ultramicrotome.
9) The sample mounting plate was obtained by dividing the Si substrate for wafer into about 8 mm square, and the sample was placed thereon.
10) The substrate sample was ion-etched to obtain a slice sample. Ion etching was performed at 13 mA / 8 minutes using PIB-10 manufactured by Vacuum Device Corporation.

（結果）
図４（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本参考例の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。試料は、マクロファージを含むラットのリンパ節である。リンパ節組織中にあるマクロファージ(貪食細胞)は、生体内の様々な老廃物を取り込んでいるため、自家蛍光を有すると考えられている。そこで、無染色のまま、本装置にてリンパ節を蛍光観察した結果が（ｂ）であり、この黄色に光る蛍光部と一致してマクロファージの存在を同定することができた。ＳＥＭ像と重ね合わせることにより（ｃ）マクロファージ細胞を他の細胞と区別してＳＥＭにて観察することができた。 (result)
FIG. 4A shows an SEM image, FIG. 4B shows a fluorescence image, and FIG. 4C shows a fluorescence SEM image obtained using the fluorescence SEM system of this reference example. The sample is a rat lymph node containing macrophages. Macrophages (phagocytic cells) in lymph node tissue are considered to have autofluorescence because they take in various waste products in the living body. Therefore, the result of fluorescence observation of the lymph nodes with this apparatus without staining was (b), and the presence of macrophages could be identified in agreement with the fluorescent part that glowed yellow. By superimposing with the SEM image, (c) macrophage cells were distinguished from other cells and could be observed with SEM.

これら参考例１から３で説明した蛍光ＳＥＭ画像は、従来全く報告がなく、本発明により初めて観察することが可能となったものである。以上の通り、本参考例によれば、迅速に蛍光ＳＥＭ画像を観察することができるので、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの生体組織分析装置を提供することが可能となる。 These fluorescent SEM images described in Reference Examples 1 to 3 have never been reported before, and can be observed for the first time by the present invention. As described above, according to the present reference example, since the fluorescence SEM image can be observed quickly, it is possible to provide a biological tissue analyzer of a practical level that combines the SEM and the optical microscope.

１システム制御部
２ＳＥＭ部
３電子発生部
４電子線走査部
５真空チャンバ
６鏡筒
７検出器
８増幅器
９試料ステージ制御部
１０試料
１１試料ステージ
１２カセグレン鏡
１２ａ大鏡
１２ｂ小鏡
１３反射ミラー
２０光学顕微鏡部
２１光源
２２照明部
２３観察カメラ
２４光ファイバー部
２５分光器
５０顕微鏡部
５１システム制御部
５２分光器
５３光源部
５４，５５，５６光源
５７光源保持手段
５８鏡筒
５９仕切板
６０光学系
６０ａ電磁レンズ
６１反射電子検出器
６２二次電子検出器
６３ＥＤＸ検出器
６４観察部
６５外部ＣＣＤカメラ
６６三眼鏡筒
６７蛍光選択フィルター
６８試料
６９試料筒
７０検出部
７１蛍光板
７２ファイバーテーパー
７３フィルター
７４レンズユニット
７５ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器
７６可動型小反射蛍光板 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 System control part 2 SEM part 3 Electron generation part 4 Electron beam scanning part 5 Vacuum chamber 6 Lens barrel 7 Detector 8 Amplifier 9 Sample stage control part 10 Sample 11 Sample stage 12 Cassegrain mirror 12a Large mirror 12b Small mirror 13 Reflective mirror 20 Optical microscope section 21 Light source 22 Illumination section 23 Observation camera 24 Optical fiber section 25 Spectroscope 50 Microscope section 51 System control section 52 Spectrometer 53 Light source section 54, 55, 56 Light source 57 Light source holding means 58 Lens barrel 59 Partition plate 60 Optical system 60a Electromagnetic lens 61 Backscattered electron detector 62 Secondary electron detector 63 EDX detector 64 Observation unit 65 External CCD camera 66 Trinocular tube 67 Fluorescence selection filter 68 Sample 69 Sample tube 70 Detection unit 71 Fluorescent plate 72 Fiber taper 73 Filter 74 Lens unit 75 CCD / CMOS detector 76 Movable small reflective fluorescent screen

Claims

試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、
該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、
セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有する、多光源顕微鏡。 A multi-light source microscope capable of observing a sample at the same position,
A light source unit including an electron gun, a laser light source, and an X-ray source, which are movably disposed;
An optical system for irradiating the sample with an electron beam or electromagnetic waves from the light source unit;
A multi-light source microscope having a fluorescent plate made of cerium-doped YAG and having at least a detection unit for detecting an electron beam or an electromagnetic wave transmitted through the sample.