JP2013208087A - Synthesizing method for sugar fatty acid ester using enzyme method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a synthesizing method, capable of controlling the purity of sugar fatty acid ester in which fatty acid bonds to di-or tri-or higher oligosaccharide mixture such as sucrose or cyclic sugar such as cyclodextrin.SOLUTION: A hydroxyl group of a di-or tri-or higher oligosaccharide mixture or cyclic sugar such as cyclodextrin is previously modified by hydroxy terminal type (poly) oxyalkylene radical, the saccharide modified by the hydroxy terminal type (poly) oxyalkylene radical and the fatty acid are mixed, and enzyme (lipase) capable of reacting under a mild condition is made to react.

Description

この発明は、様々な分野で有用な糖脂肪酸エステルの製造方法に関する。より詳しくは、この発明は、反応効率が高く、かつ、脂肪酸の劣化の少ない温和な条件下で糖脂肪酸エステルを製造する方法に関し、さらに、糖脂肪酸のモノエステル、ジエステル、トリエステル等のエステルのうち、特定のエステルの収率を制御する方法に関する。   The present invention relates to a method for producing a sugar fatty acid ester useful in various fields. More specifically, the present invention relates to a method for producing a sugar fatty acid ester under mild conditions with high reaction efficiency and low fatty acid degradation, and further, the ester of a sugar fatty acid monoester, diester, triester, etc. Among them, the present invention relates to a method for controlling the yield of a specific ester.

ショ糖脂肪酸モノエステルは乳化剤としての機能を保持し、食品添加物、界面活性剤、化成品などに幅広く利用されている。二糖の代表であるショ糖の脂肪酸モノエステルは、脂肪酸の低級アルコールエステルとショ糖のエステル交換反応（特許第3002922号明細書など）による化学法が知られている。また、脂肪酸クロライドや脂肪酸無水物によるトレハロースのアシル化（特公昭62-50478号公報）も知られている。これらの化学法によれば、モノエステル体以外にもジエステル体やトリエステル体も多く生成し、エステルの混合物が得られる。また、これらの化学法は、ピリジンなどの悪臭を持つ溶媒を用いる、高温・高圧下あるいは高温・減圧下で反応させることによるエネルギーの必要性、副反応を起こしやすい、生成物が変色しやすい、などの問題点がある。   Sucrose fatty acid monoester retains the function as an emulsifier and is widely used in food additives, surfactants, chemical products and the like. A fatty acid monoester of sucrose, which is a typical disaccharide, is known to have a chemical method based on a transesterification reaction between a lower alcohol ester of a fatty acid and sucrose (for example, Japanese Patent No. 3002922). In addition, acylation of trehalose with fatty acid chloride or fatty acid anhydride (Japanese Patent Publication No. 62-50478) is also known. According to these chemical methods, many diesters and triesters are produced in addition to the monoester, and a mixture of esters is obtained. In addition, these chemical methods use a solvent with a bad odor such as pyridine, require energy by reacting at high temperature / high pressure or high temperature / reduced pressure, are liable to cause side reactions, and products are easily discolored. There are problems such as.

酵素(リパーゼ)を用いて、単糖、二糖、およびシクロデキストリンを脂肪酸でエステル化する方法は多数報告されている。特公平3-35912号公報、J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1761-1765 (1984)、特公平7-94483号公報、および特開平7-115983号公報では、単糖、二糖、およびシクロデキストリンを水に溶解し、カンジダ・シリンドラセア (Candida cylindracea)（現在の名称：カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa)）由来リパーゼなどを添加して常圧または減圧下で反応させると、糖脂肪酸モノエステルが合成できるが、モノエステルと同時にジエステルやトリエステルも多く生成して、エステルの混合物が得られる。 Many methods for esterifying monosaccharides, disaccharides, and cyclodextrins with fatty acids using an enzyme (lipase) have been reported. In Japanese Patent Publication No. 3-35912, J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1761-1765 (1984), Japanese Patent Publication No. 7-94483, and Japanese Patent Laid-Open No. 7-115983, monosaccharides, disaccharides, When lipase derived from Candida cylindracea (current name: Candida rugosa ) is added and reacted under normal pressure or reduced pressure, sugar fatty acid monoester Can be synthesized, however, a large amount of diesters and triesters can be produced simultaneously with the monoester, and a mixture of esters can be obtained.

特開平3-76593号公報では、グルコースをtert-ブタノール、固定化カンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)リパーゼ、モレキュラーシーブ存在下で反応させると、純度良く糖脂肪酸モノエステルが合成できる。しかし、この方法はグルコースやフラクトースなどの単糖には適用できるが、ショ糖などの二糖へ適用しようとした場合、糖の溶媒への溶解度が低いため、その反応効率が低い（本出願の実施例参照）。この反応性低下傾向は、ラウリン酸などの中鎖脂肪酸に比べ、ステアリン酸やオレイン酸などの長鎖脂肪酸でより顕著になると言われている。これらの反応の効率を上げるためには、長鎖脂肪酸の溶解度を上げるピリジン等を溶媒として用いなくてはならないが、ピリジンは悪臭がある等の欠点がある（特開平3-168091号公報）。 In JP-A-3-76593, sugar fatty acid monoester can be synthesized with high purity by reacting glucose in the presence of tert-butanol, immobilized Candida antarctica lipase, and molecular sieve. However, this method can be applied to monosaccharides such as glucose and fructose, but when it is applied to disaccharides such as sucrose, the reaction efficiency is low due to the low solubility of the sugar in the solvent (the present application). See Examples). This tendency to decrease the reactivity is said to be more pronounced with long chain fatty acids such as stearic acid and oleic acid, compared to medium chain fatty acids such as lauric acid. In order to increase the efficiency of these reactions, pyridine or the like that increases the solubility of long-chain fatty acids must be used as a solvent, but pyridine has drawbacks such as a bad odor (Japanese Patent Laid-Open No. 3-168091).

糖脂肪酸モノエステルを合成するために種々の改良法が報告されている。特開平5-176783号公報、および特開平9-271387号公報などでは、還元末端をメチル化したグルコースを基質とし、リパーゼを用いて常圧または減圧下で反応させることにより効率よく脂肪酸モノエステルが合成できるが、この方法は二糖には適用されていない、還元末端のメチル基を外す際に脂肪酸エステルも外れてしまう、などの欠点がある。ショ糖をケタール化する（特開平8-217783号公報）、ショ糖をアセタール化する（特開平8-266296号公報および特開2010-233566号公報）、などの糖の誘導化により糖脂肪酸モノエステルが合成されているが、糖のケタール・アセタール化という誘導化処理、生成物の分子内ケタール・アセタールを外す処理という煩雑な操作が必要となる。   Various improved methods have been reported for synthesizing sugar fatty acid monoesters. In JP-A-5-76783, JP-A-9-271387 and the like, a fatty acid monoester is efficiently obtained by reacting glucose having a reducing end methylated as a substrate and using lipase under normal pressure or reduced pressure. Although it can be synthesized, this method has disadvantages such as not being applied to disaccharides, and the removal of the reducing end methyl group also removes fatty acid esters. Sucrose is ketalized (JP-A-8-217783), sucrose is acetalized (JP-A-8-266296 and JP2010-233566), etc. Esters have been synthesized, but complicated operations such as derivatization of sugar ketals and acetals and removal of intramolecular ketals and acetals of products are required.

J. Ferment. Bioeng. 78, 70-73 (1994)では、マルトースなどの二糖にグリセリンまたはトリメチルプロパンを結合させ、カンジダ・シリンドラセア (Candida cylindracea)由来リパーゼを用いてオレイン酸などの脂肪酸をエステル結合させている。この方法によれば、モノエステル以外にもジエステルやトリエステルが多く生成し、エステルの混合物が得られる。 In J. Ferment. Bioeng. 78, 70-73 (1994), glycerin or trimethylpropane is bound to disaccharides such as maltose, and fatty acids such as oleic acid are ester-linked using lipase derived from Candida cylindracea. I am letting. According to this method, in addition to the monoester, a large amount of diester and triester are produced, and a mixture of esters is obtained.

特開昭61-191610号公報では、モノエステルが９０％以上含まれるショ糖脂肪酸エステルを含有し、胃液中で速やかに溶解する錠剤が報告されている。また、特開2000-256386号公報では、ショ糖と脂肪酸とのモノエステルおよびジエステル、トリエステルのようなショ糖脂肪酸エステル混合物から簡便で収率よく、ショ糖脂肪酸モノエステルを精製する方法が報告されている。このように、特定のエステルを高い収率で得ることの有用性も指摘されている。   Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-191610 reports a tablet containing a sucrose fatty acid ester containing 90% or more of a monoester and rapidly dissolving in gastric juice. JP-A-2000-256386 reports a method for purifying sucrose fatty acid monoesters in a simple and high yield from sucrose fatty acid ester mixtures such as monoesters and diesters and triesters of sucrose and fatty acids. Has been. Thus, the usefulness of obtaining a specific ester in a high yield is also pointed out.

特許第3002922号明細書Japanese Patent No. 3002922 特公昭62-50478号公報Japanese Patent Publication No.62-50478 特公平3-35912号公報Japanese Patent Publication No. 3-35912 特公平7-94483号公報Japanese Patent Publication No. 7-94483 特開平7-115983号公報Japanese Patent Laid-Open No. 7-115983 特開平3-76593号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-76593 特開平3-168091号公報Japanese Patent Laid-Open No. 3-168091 特開平5-176783号公報Japanese Patent Laid-Open No. 5-176783 特開平9-271387号公報JP 9-271387 A 特開平8-217783号公報JP-A-8-217783 特開平8-266296号公報JP-A-8-266296 特開2010-233566号公報JP 2010-233566 特開昭61-191610号公報JP 61-191610 A 特開2000-256386号公報JP 2000-256386 A

J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1761-1765 (1984)J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1761-1765 (1984) J. Ferment. Bioeng. 78, 70-73 (1994)J. Ferment. Bioeng. 78, 70-73 (1994)

糖脂肪酸エステルは、様々な分野で有用であるため、効率よく製造することが望まれる。したがって、反応効率が高く、かつ、脂肪酸の劣化の少ない温和な条件下で糖脂肪酸エステルを製造する方法が必要とされる。   Since sugar fatty acid esters are useful in various fields, it is desired to produce them efficiently. Therefore, there is a need for a method for producing a sugar fatty acid ester under mild conditions with high reaction efficiency and low fatty acid degradation.

また、糖脂肪酸エステルの適用分野に応じて、例えば、純度の高い糖脂肪酸モノエステルが要求されることがある。上記の方法では、モノエステル、ジエスエル、トリエステル等の複数種類のエステルの混合物を得ることができるが、いずれかのエステルを効率よく合成することができなかった。   Further, depending on the application field of the sugar fatty acid ester, for example, a high purity sugar fatty acid monoester may be required. In the above method, a mixture of a plurality of types of esters such as monoester, diesel, triester and the like can be obtained, but any of the esters cannot be synthesized efficiently.

そこで、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類が複数結合した二糖または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリンなどの環状糖に脂肪酸が結合した糖脂肪酸エステルを合成するとき、糖に結合している脂肪酸の数を制御する、つまりモノエステルまたはジエステルまたはトリエステル等のいずれかの純度を制御することが可能な糖脂肪酸エステルの合成方法の確立が求められている。   Therefore, when synthesizing a sugar fatty acid ester in which a fatty acid is bound to a cyclic sugar such as a cyclosaccharide or a mixture of disaccharides or trisaccharide or more oligosaccharides or a mixture of monosaccharides such as glucose or fructose, the fatty acids bound to the sugar It is required to establish a method for synthesizing sugar fatty acid esters that can control the number of amino acids, that is, the purity of any of monoesters, diesters, triesters, and the like.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、二糖または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリンなどの環状糖の水酸基を予めヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾し、ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基修飾糖類と脂肪酸とを混合し、温和な条件下で反応可能な酵素（リパーゼ）を反応させ、例えば、糖脂肪酸モノエステルが選択的に製造可能な方法を提供することを課題とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and a hydroxyl group of a cyclic sugar such as a disaccharide or a mixture of trisaccharide or more oligosaccharides or cyclodextrin is modified in advance with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group, Providing a method for selectively producing, for example, sugar fatty acid monoesters, by mixing a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group-modified saccharide with a fatty acid and reacting with an enzyme (lipase) that can react under mild conditions The task is to do.

上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。   In order to achieve the above object, the present invention adopts the following configuration.

二糖（マルトース、スクロース、およびラクトースなど）または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリンなどの環状糖を、温和な温度下でプロピレンオキシドおよびブチレンオキシドのようなアルキレンオキシドやエチレンクロルヒドリンのようなアルキレンクロルヒドロン等のエーテル化剤を作用させることによりエーテル化して、主として糖類が有する少なくとも一つの水酸基をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾する。   Disaccharides (such as maltose, sucrose, and lactose) or trisaccharide or higher oligosaccharide mixtures or cyclic sugars such as cyclodextrins, such as alkylene oxides such as propylene oxide and butylene oxide, and ethylene chlorohydrin at mild temperatures Etherification is carried out by the action of an etherifying agent such as alkylene chlorohydrone, and at least one hydroxyl group mainly possessed by the saccharide is modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group.

この反応は、ピリジン等の悪臭のある溶媒、およびその他の揮発性・引火性の高い溶媒を用いない温和な反応である。糖の水酸基をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾することにより、糖の有機溶媒への溶解性が高まり、リパーゼが作用しやすくなると考えられる。また、糖のピラノース環に結合している水酸基は、リパーゼの活性中心に入るためには立体的に嵩高く、結果としてリパーゼの反応性が低くなってしまう。しかしながら、この水酸基に（ポリ）オキシアルキレン基などのリンカーを付与することにより、このリンカーに結合している末端の水酸基の立体的嵩高さが減少し、リパーゼの活性中心に水酸基が入りやすくなり、リパーゼの反応性が高まると考えられる。   This reaction is a mild reaction that does not use a bad odor solvent such as pyridine and other volatile and flammable solvents. By modifying the hydroxyl group of the sugar with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group, it is considered that the solubility of the sugar in an organic solvent is increased and the lipase is likely to act. Moreover, the hydroxyl group bonded to the pyranose ring of the sugar is sterically bulky to enter the active center of the lipase, resulting in a low lipase reactivity. However, by adding a linker such as a (poly) oxyalkylene group to the hydroxyl group, the steric bulk of the terminal hydroxyl group bonded to the linker is reduced, and the hydroxyl group can easily enter the active center of the lipase. The lipase reactivity is thought to increase.

次に、ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾した二糖または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリンなどの環状糖に、脂肪酸と有機溶媒（tert-ブタノールやアセトン）、およびリパーゼ（固定化カンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)リパーゼ、固定化リゾムコール・ミーハイ (Rhizomucor miehei)リパーゼ、固定化サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa)リパーゼ、および固定化アルカリゲネス属 (Alcaligenes sp.) リパーゼ、遊離型カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa)リパーゼなど）を作用させることにより、糖脂肪酸モノエステルが効率よく、かつ総エステル体に対するモノエステル体の純度が90%以上で製造可能となる。 Next, a fatty acid, an organic solvent (tert-butanol or acetone), and a lipase (fixed) are added to a cyclic sugar such as a cyclosaccharide or a mixture of disaccharides or trisaccharide or more oligosaccharides modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group. Candida antarctica lipase, immobilized Rhizomucor miehei lipase, immobilized Thermomyces lanuginosa lipase, and immobilized Alcaligenes sp. Lipase, free form ( Candida rugosa ) lipase, etc.) allows the sugar fatty acid monoester to be efficiently produced and the monoester purity relative to the total ester to be 90% or higher.

すなわち、本発明は、糖脂肪酸エステルの合成方法であって、
（１）糖類の少なくとも１つの水酸基をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾するために、エーテル化剤でエーテル化するエーテル化工程；および
（２）前記ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基の少なくとも一つの水酸基と脂肪酸のカルボキシル基とを酵素を用いる脱水縮合によりエステル化する酵素エステル化反応工程
を含む、合成方法を提供する。 That is, the present invention is a method for synthesizing a sugar fatty acid ester,
(1) an etherification step of etherification with an etherifying agent to modify at least one hydroxyl group of a saccharide with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group; and (2) the hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group There is provided a synthesis method including an enzyme esterification reaction step of esterifying at least one hydroxyl group of the above and a carboxyl group of a fatty acid by dehydration condensation using an enzyme.

本発明の合成方法においてヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾するために、エーテル化剤でエーテル化される糖類の少なくとも１つの水酸基が、その糖類の６位の水酸基であり得る。   In order to modify with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group in the synthesis method of the present invention, at least one hydroxyl group of a saccharide that is etherified with an etherifying agent may be a hydroxyl group at the 6-position of the saccharide.

本発明の合成方法に用いることができる糖類として、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオースからなる群より選択される二糖；グルコースが3〜10個結合したグルコオリゴ糖、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、もしくは単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖；またはシクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖からなる群より選択される環状糖もしくはこれらの環状糖の一分子にさらに上記オリゴ糖の一分子が結合した分岐環状糖が挙げられる。   As sugars that can be used in the synthesis method of the present invention, disaccharides selected from the group consisting of maltose, sucrose, lactose, cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose; gluco-oligosaccharide having 3 to 10 glucose bound, and fructose 3 ~ 10-linked fructooligosaccharides, or oligosaccharides in which one or more monosaccharides are mixed and bonded; or a cyclic sugar selected from the group consisting of cyclodextrin, cyclofructan, and cyclic tetrasaccharide, or of these cyclic sugars Examples thereof include branched cyclic sugars in which one molecule of the above oligosaccharide is further bonded to one molecule.

本発明の合成方法において、エーテル化剤として、非置換もしくは１〜４個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されたエチレンオキシド、またはエチレンクロルヒドリンなどから選択されるクロルヒドリンが挙げられる。   In the synthesis method of the present invention, examples of the etherifying agent include chlorohydrin selected from unsubstituted or ethylene oxide substituted with 1 to 4 alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, or ethylene chlorohydrin.

本発明のエーテル化工程において、非置換もしくは１〜４個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されたエチレンオキシドとして、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド（１,２−ブチレンオキシド、２,３−ブチレンオキシド、イソブチレンオキシド）、ペンチレンオキシド（２−プロピルエチレンオキシド、１−メチル−２−エチルエチレンオキシド、１−メチル−２,２−ジメチル−エチレンオキシド、２−エチル−２−メチル−エチレンオキシド、２−イソプロピルエチレンオキシド）などの炭素数２〜５個のアルキレンオキシドが好ましく、クロルヒドリンとして、エチレンクロルヒドリンが好ましい。   In the etherification step of the present invention, ethylene oxide, propylene oxide, butylene oxide (1,2-butylene oxide, 2,3-butylene oxide) may be used as ethylene oxide which is unsubstituted or substituted with 1 to 4 alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms. Butylene oxide, isobutylene oxide), pentylene oxide (2-propylethylene oxide, 1-methyl-2-ethylethylene oxide, 1-methyl-2,2-dimethyl-ethylene oxide, 2-ethyl-2-methyl-ethylene oxide, 2-isopropyl C 2-5 alkylene oxides such as ethylene oxide are preferred, and ethylene chlorohydrin is preferred as the chlorohydrin.

本発明の合成方法に用いることができる脂肪酸として、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、イコサン酸、ドコサン酸、2-エチルヘキサン酸、3,5,5-トリメチルへキサン酸、イソステアリン酸、9-テトラデセン酸、2-ヘキサデセン酸、9-ヘキサデセン酸、9-オクタデセン酸（オレイン酸）、9,12-オクタデカンジエン酸（リノール酸）、6,9,12-オクタデカントリエン酸（α-リノレン酸）、γ-リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸からなる群より選択される炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸；または、ベンゼンカルボン酸（安息香酸）、3-フェニル-2-プロペン酸（ケイ皮酸）、ヒドロキシケイ皮酸、4-メトキシケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシケイ皮酸（カフェ酸）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸からなる群より選択される芳香族カルボン酸；またはそれらの組合せが挙げられる。   As fatty acids that can be used in the synthesis method of the present invention, butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid (caprylic acid), nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), octadecanoic acid ( Stearic acid), icosanoic acid, docosanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, 3,5,5-trimethylhexanoic acid, isostearic acid, 9-tetradecenoic acid, 2-hexadecenoic acid, 9-hexadecenoic acid, 9-octadecenoic acid ( Oleic acid), 9,12-octadecanedienic acid (linoleic acid), 6,9,12-octadecanetrienoic acid (α-linolenic acid), γ-linolenic acid, arachidonic acid, dihomo-γ-linolenic acid, eicosapentaenoic acid , Aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms selected from the group consisting of docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid; or benzenecarboxylic acid Benzoic acid), 3-phenyl-2-propenoic acid (cinnamic acid), hydroxycinnamic acid, 4-methoxycinnamic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid), α-cyano-4-hydroxy An aromatic carboxylic acid selected from the group consisting of cinnamic acid, sinapinic acid; or combinations thereof.

本発明に用いることができる酵素として、動物の膵臓由来リパーゼ；種子由来リパーゼ；またはカンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)由来のフラクションＡリパーゼ（CALA)もしくはフラクションＢリパーゼ（CALB)、カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa)由来、ジオトリカム・カンジダム (Geotrichum candidum)由来、シュードモナス属 (Pseudomonas sp.)由来、シュードモナス・アエルギノザ (Pseudomonas aeruginosa)由来、ブルクホルデリア・セパシア (Burkholderia cepacia)由来、アルカリゲネス属 (Alcaligenes sp.)由来、セラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens)由来、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens)由来、リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei)由来、リゾプス・オリザエ (Rhizopus oryzae)由来、サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa)由来、フザリウム・ヘテロスポラム (Fusarium heterosporum)由来、ペニシリウム・カマンベルティ (Penicillium camembertii)由来、アスペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)由来、もしくはそれらと近縁の微生物由来のリパーゼからなる群より適宜選択される。 Enzymes that can be used in the present invention include animal pancreatic lipase; seed lipase; or Candida antarctica fraction A lipase (CALA) or fraction B lipase (CALB), Candida rugosa ( Candida rugosa). ) Origin, Geotrichum candidum origin, Pseudomonas sp. Origin, Pseudomonas aeruginosa origin, Burkholderia cepacia origin, Alcaligenes sp. Serratia marcescens (Serratia marcescens) derived from Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) derived from Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei) origin, derived from Rhizopus oryzae (Rhizopus oryzae), thermo Mrs. Ranuginoza (Thermomyces lanug inosa ), Fusarium heterosporum , Penicillium camembertii , Aspergillus niger , or closely related lipase .

本発明は、さらに、本発明による糖脂肪酸エステルの合成方法に適した糖脂肪酸エステルの前駆体として、糖類の少なくとも一つの水酸基がヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾された糖類および前記ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基修飾糖類と脂肪酸との糖脂肪酸エステルも提供する。   The present invention further provides a saccharide wherein at least one hydroxyl group of a saccharide is modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group as a precursor of a saccharide fatty acid ester suitable for the method for synthesizing a saccharide fatty acid ester according to the present invention, and the hydroxy A sugar fatty acid ester of a terminal-type (poly) oxyalkylene group-modified saccharide and a fatty acid is also provided.

本発明は、糖類の少なくとも１つの水酸基を修飾するヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基の少なくとも１つの水酸基と脂肪酸のカルボキシル基とのエステル結合を有する糖脂肪酸エステルを含む組成物を提供する。   The present invention provides a composition comprising a sugar fatty acid ester having an ester bond between at least one hydroxyl group of a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group that modifies at least one hydroxyl group of a saccharide and a carboxyl group of a fatty acid.

本発明の組成物において、ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾される糖類の少なくとも１つの水酸基が、その糖類の６位の水酸基であり得る。   In the composition of the present invention, at least one hydroxyl group of a saccharide modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group may be a hydroxyl group at the 6-position of the saccharide.

本発明の組成物において、前記糖脂肪酸エステルは、一般式（１）：   In the composition of the present invention, the sugar fatty acid ester has the general formula (1):

｛式中、Ｓは、糖類の少なくとも１つの水酸基を除いた残基を示し、ｍは１〜ｐの整数を示し、かつ、ｐは前記糖類が有する水酸基の最大個数を示し、ｍ個のＸは、それぞれ独立して、一般式（２）：

{In the formula, S represents a residue obtained by removing at least one hydroxyl group of a saccharide, m represents an integer of 1 to p, and p represents the maximum number of hydroxyl groups of the saccharide, and m X Are each independently a general formula (2):

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈまたは炭素数１〜３のアルキル基を示し、ｎは１〜６の整数を示す。）で表されるヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基；または一般式（３）：

(Wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ independently represent H or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 6). Terminal (poly) oxyalkylene group; or general formula (3):

［Ｒ^５は炭素数４〜２２の脂肪酸からカルボキシル基を除いた残基を示し、Ｌは、存在しないか、または、独立して、一般式（４）：

[R ⁵ represents a residue obtained by removing a carboxyl group from a fatty acid having 4 to 22 carbon atoms, and L is absent or, independently, represented by the general formula (4):

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈまたは炭素数１〜３のアルキル基を示し、ｎは１〜６の整数を示す。）で表される（ポリ）オキシアルキレン基のリンカーを示す。］で表される基である。ただし、少なくとも１つのＸは、一般式（３）で表される基であり、かつ、少なくとも１つのＬは前記（ポリ）オキシアルキレン基のリンカーである。｝で表される。ここで、（ポリ）オキシアルキレン基は、オキシアルキレン基およびポリオキシアルキレン基を含むことを意図している。

(Wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ independently represent H or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 6) ( The linker of a poly) oxyalkylene group is shown. ]. However, at least one X is a group represented by the general formula (3), and at least one L is a linker of the (poly) oxyalkylene group. }. Here, the (poly) oxyalkylene group is intended to include an oxyalkylene group and a polyoxyalkylene group.

前記一般式（２）および（４）中のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基である。 R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ in the general formulas (2) and (4) are independently H, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or an isopropyl group.

本発明の組成物において、前記糖類として、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオースからなる群より選択される二糖；グルコースが3〜10個結合したグルコオリゴ糖、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、もしくは単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖；またはシクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖からなる群より選択される環状糖もしくはこれらの環状糖の一分子にさらに上記オリゴ糖の一分子が結合した分岐環状糖が挙げられる。   In the composition of the present invention, as the saccharide, a disaccharide selected from the group consisting of maltose, sucrose, lactose, cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose; glucooligosaccharide having 3 to 10 glucose bound thereto, and 3 to 10 fructose Single-linked fructooligosaccharides, or oligosaccharides bonded by mixing one or more types of monosaccharides; or cyclic sugars selected from the group consisting of cyclodextrins, cyclofructans, and cyclic tetrasaccharides, or one molecule of these cyclic sugars Furthermore, branched cyclic saccharides in which one molecule of the above oligosaccharide is bonded.

前記一般式（１）において、ｐは前記糖類が有する水酸基の最大個数である。具体的には、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオースからなる群より選択される二糖；および、グルコースが3〜10個結合したグルコオリゴ糖、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、もしくは単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖の有する水酸基の最大個数はｐ＝３ｑ+２（ｑは、結合するグルコース、フラクトースまたは１種類もしくは複数種類混合して結合する単糖の個数を示す。）で表される。例えば、マルトースなどの二糖類の有する水酸基の最大個数ｐは８であり、マルトトリオースなどの三糖類の有する最大個数ｐは１１である。シクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖からなる群から選択される環状糖の有する水酸基の最大個数はｐ＝３ｒ（ｒは、環状糖に含まれる糖類の個数を示す。）で表される。例えば、α-シクロデキストリンの有する水酸基の最大個数ｐは１８である。上記の環状糖の一分子にさらに上記オリゴ糖の一分子が結合した分岐環状糖の有する水酸基の最大個数はｐ＝３（ｑ＋ｒ）（ｑは、結合するグルコース、フラクトースまたは１種類もしくは複数種類混合して結合する単糖の個数を示し、ｒは、環状糖に含まれる糖類の個数を示す。）で表される。   In the general formula (1), p is the maximum number of hydroxyl groups that the saccharide has. Specifically, disaccharides selected from the group consisting of maltose, sucrose, lactose, cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose; and gluco-oligosaccharides with 3-10 glucose bound, fructo-oligos with 3-10 fructose bound The maximum number of hydroxyl groups in an oligosaccharide to which one or more types of sugars or monosaccharides are bonded is p = 3q + 2 (q is glucose, fructose to be bonded, or one or more types are mixed and bonded. The number of monosaccharides is shown.) For example, the maximum number p of hydroxyl groups possessed by disaccharides such as maltose is 8, and the maximum number p possessed by trisaccharides such as maltotriose is 11. The maximum number of hydroxyl groups of a cyclic sugar selected from the group consisting of cyclodextrin, cyclofructan, and cyclic tetrasaccharide is represented by p = 3r (r is the number of sugars contained in the cyclic sugar). For example, the maximum number p of hydroxyl groups possessed by α-cyclodextrin is 18. The maximum number of hydroxyl groups in the branched cyclic saccharide in which one molecule of the oligosaccharide is further bonded to one molecule of the cyclic saccharide is p = 3 (q + r) (q is glucose to be bound, fructose, or one or a plurality of types mixed) And r represents the number of saccharides contained in the cyclic saccharide).

本発明において、一般式（２）で表されるヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基とは、（ポリ）オキシアルキレン基の末端が水素化された結果、末端に水酸基が形成されている基を意味する。一般式（２）で表されるヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基は、ｎが１であるとき、「ヒドロキシアルキル基」ということもできる。いずれにしても、末端に水酸基を有することを特徴とする。
また、糖類の水酸基が一般式（２）で表されるヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基での修飾は、ｎが１であるとき、「ヒドロキシアルキル化」ということもできる。 In the present invention, the hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group represented by the general formula (2) is a group having a hydroxyl group formed at the terminal as a result of hydrogenation of the terminal of the (poly) oxyalkylene group. means. When n is 1, the hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group represented by the general formula (2) can also be referred to as a “hydroxyalkyl group”. In any case, it has a hydroxyl group at the terminal.
The modification with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group in which the hydroxyl group of the saccharide is represented by the general formula (2) can also be referred to as “hydroxyalkylation” when n is 1.

前記一般式（３）において、Ｌが存在しない場合、脂肪酸が直接糖類の水酸基とエステル結合し、Ｌが存在する場合、脂肪酸と糖類とは直接エステル結合せず、（ポリ）オキシアルキレン基であるリンカーを介して結合する。   In the general formula (3), when L is not present, the fatty acid is directly ester-bonded to the hydroxyl group of the saccharide, and when L is present, the fatty acid and saccharide are not directly ester-bonded and are a (poly) oxyalkylene group. Bond through a linker.

本発明の組成物において、前記脂肪酸として、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、イコサン酸、ドコサン酸、2-エチルヘキサン酸、3,5,5-トリメチルへキサン酸、イソステアリン酸、9-テトラデセン酸、2-ヘキサデセン酸、9-ヘキサデセン酸、9-オクタデセン酸（オレイン酸）、9,12-オクタデカンジエン酸（リノール酸）、6,9,12-オクタデカントリエン酸（α-リノレン酸）、γ-リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸からなる群より選択される炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸；または、ベンゼンカルボン酸（安息香酸）、3-フェニル-2-プロペン酸（ケイ皮酸）、ヒドロキシケイ皮酸、4-メトキシケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシケイ皮酸（カフェ酸）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸からなる群より選択される芳香族カルボン酸；またはそれらの組合せが挙げられる。   In the composition of the present invention, as the fatty acid, butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid (caprylic acid), nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), octadecanoic acid (stearic acid) ), Icosanoic acid, docosanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, 3,5,5-trimethylhexanoic acid, isostearic acid, 9-tetradecenoic acid, 2-hexadecenoic acid, 9-hexadecenoic acid, 9-octadecenoic acid (oleic acid) ), 9,12-octadecanedienic acid (linoleic acid), 6,9,12-octadecanetrienoic acid (α-linolenic acid), γ-linolenic acid, arachidonic acid, dihomo-γ-linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosa An aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms selected from the group consisting of pentaenoic acid and docosahexaenoic acid; or benzenecarboxylic acid (benzoic acid) ), 3-phenyl-2-propenoic acid (cinnamic acid), hydroxycinnamic acid, 4-methoxycinnamic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid An aromatic carboxylic acid selected from the group consisting of acid, sinapinic acid; or combinations thereof.

本発明の糖脂肪酸エステルにおいて、糖類の水酸基には４つの状態がある。すなわち、ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾された水酸基、脂肪酸エステル化された水酸基、（ポリ）オキシアルキレン基のリンカーを介して脂肪酸エステル化された水酸基および未修飾の水酸基である。   In the sugar fatty acid ester of the present invention, the hydroxyl group of the sugar has four states. That is, a hydroxyl group modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group, a hydroxyl group esterified with a fatty acid, a hydroxyl group esterified with a fatty acid ester via a linker of a (poly) oxyalkylene group, and an unmodified hydroxyl group.

以下、本発明の方法により、二糖類であるマルトースからヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基修飾糖類およびそのオレイン酸の糖脂肪酸エステルを得る反応スキームを例示する。
この糖脂肪酸エステルは、マルトースの６位の水酸基がヒドロキシプロピル基で修飾され、さらに、ヒドロキシプロピル基の水酸基が脂肪酸と酵素エステル化された特異的な具体例である。 Hereinafter, a reaction scheme for obtaining a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group-modified saccharide and a sugar fatty acid ester of oleic acid from maltose, which is a disaccharide, is exemplified.
This sugar fatty acid ester is a specific example in which the hydroxyl group at the 6-position of maltose is modified with a hydroxypropyl group, and the hydroxyl group of the hydroxypropyl group is enzymatically esterified with a fatty acid.

まず、二糖類であるマルトース（G2）を、例えば、プロピレンオキシドを用いて、ヒドロキシプロピル化する。この図では、反応条件により、結合している２つの単糖分子（還元末端または非還元末端）のいずれか一つの６位の水酸基がヒドロキシプロピル基で修飾された状態が示されている。つぎに、リパーゼを用いて、このヒドロキシプロピル化マルトースをオレイン酸でエステル化する。この図では、特異的に、前記ヒドロキシプロピル基の水酸基にてエステル化が生じている状態が示されている。   First, maltose (G2), which is a disaccharide, is hydroxypropylated using, for example, propylene oxide. This figure shows a state in which the hydroxyl group at the 6-position of any one of the two linked monosaccharide molecules (reducing terminal or non-reducing terminal) is modified with a hydroxypropyl group depending on the reaction conditions. The hydroxypropylated maltose is then esterified with oleic acid using lipase. In this figure, a state in which esterification has occurred specifically at the hydroxyl group of the hydroxypropyl group is shown.

二糖または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリンなどの環状糖をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾することにより、有機溶媒中でのリパーゼによる脂肪酸とのエステル化反応が格段に向上し、糖脂肪酸モノエステルが効率よく合成できる。   The esterification reaction with fatty acids by lipase in organic solvents is greatly improved by modifying cyclic sugars such as cyclosaccharides with disaccharides or trisaccharide or higher oligosaccharide mixtures or cyclodextrins. In addition, sugar fatty acid monoesters can be synthesized efficiently.

二糖、三糖以上のオリゴ糖混合物、シクロデキストリンなどの環状糖を構成する最小単位である単糖は特に制限されないが、エリトロース、トレオース等の四炭糖（テトラオース）、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース等の五炭糖（ペントース）、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖（ヘキソース）などが好ましいものとして挙げられる。これらの中でも特に、グルコースおよびフラクトースがより好ましい。   Monosaccharides that are the smallest units that constitute cyclic sugars such as disaccharides, trisaccharide or higher oligosaccharide mixtures, and cyclodextrins are not particularly limited. However, tetrasaccharides such as erythrose and threose (tetraose), ribose, arabinose, xylose, Preferable examples include pentoses such as lyxose, hexoses such as allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, and talose. Among these, glucose and fructose are more preferable.

二糖としては、例えば、スクロース（ショ糖）、マルトース（麦芽糖）、ラクトース（乳糖）、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオース等が好ましいものとして挙げられる。   Preferred examples of the disaccharide include sucrose (sucrose), maltose (maltose), lactose (lactose), cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose and the like.

オリゴ糖としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコースが3〜10個結合したもの、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、および単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖などが代表として挙げられるが、これら以外のオリゴ糖であってもよい。   As oligosaccharides, one or more types of monosaccharides mixed with 3-10 glucoses such as maltotriose, maltotetraose and maltopentaose, 3-10 fructose-linked fructose Examples of the oligosaccharides bonded to each other include oligosaccharides other than these.

環状糖としては、シクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖などが挙げられる。シクロデキストリンとしては、α-、β-、γ-シクロデキストリンなどが挙げられる。
これらの環状糖にさらに上記オリゴ糖が結合した分岐環状糖であってもよい。 Examples of cyclic sugars include cyclodextrin, cyclofructan, cyclic tetrasaccharide and the like. Examples of the cyclodextrin include α-, β-, and γ-cyclodextrin.
A branched cyclic saccharide in which the oligosaccharide is further bonded to these cyclic saccharides may be used.

二糖、三糖以上のオリゴ糖混合物、シクロデキストリンなどの環状糖および分岐環状糖の水酸基をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾する物質としては、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドなどのアルキレンオキシドや、エチレンクロルヒドリンなどのアルキレンクロルヒドリン等のエーテル化剤が挙げられるが、反応が容易であるという点と、ヒドロキシプロピル化シクロデキストリンが既に化粧品、医薬品、消臭スプレー、柔軟剤として利用されているという点から、プロピレンオキシドが特に好ましいものとして挙げられる。   Disaccharide, oligosaccharide mixture of trisaccharide or more, cyclic sugar such as cyclodextrin, and substance that modifies hydroxyl group of branched cyclic sugar with hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group include alkylene such as ethylene oxide, propylene oxide, butylene oxide Examples include oxides and etherifying agents such as alkylene chlorohydrins such as ethylene chlorohydrin, but the reaction is easy, and hydroxypropylated cyclodextrins are already used as cosmetics, pharmaceuticals, deodorant sprays, and softeners. From the viewpoint of being used, propylene oxide is particularly preferable.

また、糖の水酸基をエステル化させるアシル供与体の脂肪酸（カルボン酸）としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されず、炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸、または芳香族カルボン酸であることが好ましい。   The fatty acid (carboxylic acid) of the acyl donor that esterifies the hydroxyl group of the sugar is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and is an aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms, or aromatic A carboxylic acid is preferred.

前記炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸（脂肪酸）としては、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、イコサン酸、ドコサン酸などの直鎖飽和脂肪酸、2-エチルヘキサン酸、3,5,5-トリメチルへキサン酸、イソステアリン酸などの分岐飽和脂肪酸、9-テトラデセン酸、2-ヘキサデセン酸、9-ヘキサデセン酸、9-オクタデセン酸（オレイン酸）、9,12-オクタデカンジエン酸（リノール酸）、6,9,12-オクタデカントリエン酸（α-リノレン酸）、γ-リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸などが挙げられる。なかでも、反応効率の観点から、炭素数6〜16の直鎖飽和脂肪族カルボン酸がより好ましく、カプリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸が特に好ましい。   Examples of the aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms (fatty acid) include butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid (caprylic acid), nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid) , Linear saturated fatty acids such as octadecanoic acid (stearic acid), icosanoic acid, docosanoic acid, branched saturated fatty acids such as 2-ethylhexanoic acid, 3,5,5-trimethylhexanoic acid, isostearic acid, 9-tetradecenoic acid, 2-hexadecenoic acid, 9-hexadecenoic acid, 9-octadecenoic acid (oleic acid), 9,12-octadecanedienic acid (linoleic acid), 6,9,12-octadecanetrienoic acid (α-linolenic acid), γ-linolenic acid And unsaturated fatty acids such as acid, arachidonic acid, dihomo-γ-linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. Among these, from the viewpoint of reaction efficiency, a linear saturated aliphatic carboxylic acid having 6 to 16 carbon atoms is more preferable, and caprylic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, and α-linolenic acid are particularly preferable.

前記芳香族カルボン酸としては、ベンゼンカルボン酸（安息香酸）、3-フェニル-2-プロペン酸（ケイ皮酸）、ヒドロキシケイ皮酸、4-メトキシケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシケイ皮酸（カフェ酸）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸などが挙げられる。   Examples of the aromatic carboxylic acid include benzenecarboxylic acid (benzoic acid), 3-phenyl-2-propenoic acid (cinnamic acid), hydroxycinnamic acid, 4-methoxycinnamic acid, and 3,4-dihydroxycinnamic acid. (Caffeic acid), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, sinapinic acid and the like.

これらの脂肪酸、カルボン酸は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。   These fatty acids and carboxylic acids may be used alone or in combination of two or more.

リパーゼ等の酵素を用いたエステル化反応は、有機溶媒中での反応、水溶液中での反応、無溶媒下での反応のいずれでもよいが、反応効率の観点から、有機溶媒中での反応が好ましい。用いる有機溶媒は、一級水酸基、二級水酸基を有しない溶媒が好ましく、例えば、アセトン、tert−ブタノール、tert−アミルアルコール、アセトニトリルなどのケトン類、三級アルコール類、ニトリル類ならいずれでもよいが、好ましくはアセトン、tert−ブタノールであり、また前述有機溶媒を適宜混合した溶媒でも構わない。また、ピリジンや、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリジノンジプロピルスルホキシドなどの有機溶媒を混ぜて反応させてもよい。   The esterification reaction using an enzyme such as lipase may be a reaction in an organic solvent, a reaction in an aqueous solution, or a reaction in the absence of a solvent. From the viewpoint of reaction efficiency, the reaction in an organic solvent may be performed. preferable. The organic solvent to be used is preferably a solvent having no primary hydroxyl group or secondary hydroxyl group. For example, ketones such as acetone, tert-butanol, tert-amyl alcohol, acetonitrile, tertiary alcohols, and nitriles may be used. Acetone and tert-butanol are preferable, and a solvent in which the above organic solvent is appropriately mixed may be used. Further, an organic solvent such as pyridine, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, N-methylpyrrolidone, N-methyl-2-pyrrolidinone dipropyl sulfoxide may be mixed and reacted.

糖類の水酸基と脂肪酸のカルボキシル基をエステル化する酵素は、水酸基とカルボキシル基をエステル結合させる触媒活性をもつ酵素であれば特に制限されず、例えばリパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が好ましい酵素として挙げられ、リパーゼがより好ましい酵素として挙げられる。   The enzyme that esterifies the hydroxyl group of the saccharide and the carboxyl group of the fatty acid is not particularly limited as long as the enzyme has a catalytic activity to ester bond the hydroxyl group and the carboxyl group. For example, a hydrolase such as lipase, esterase, or protease is preferable. And lipase is a more preferred enzyme.

当該リパーゼとしては、本発明の効果を損なわない酵素であれば特に制限されず、動物由来、微生物由来、又は植物由来のいずれであってもよい。例えば、豚や人などの動物の膵臓由来リパーゼ、小麦胚芽などの種子由来リパーゼ、カンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)由来(シュードザイマ・アンタクティカ (Psudozyma antarctica)ともいう)のフラクションＡリパーゼ（CALA)またはフラクションＢリパーゼ（CALB)、カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa)由来(旧称：カンジダ・シリンドラセア (Candida cylindracea))、ジオトリカム・カンジダム (Geotrichum candidum)由来、シュードモナス属 (Pseudomonas sp.)由来、シュードモナス・アエルギノザ (Pseudomonas aeruginosa)由来、ブルクホルデリア・セパシア (Burkholderia cepacia)由来(旧称：シュードモナス・セパシア (Pseudomonas cepacia))、アルカリゲネス属 (Alcaligenes sp.)由来、セラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens)由来、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens)由来、リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei)由来、リゾプス・オリザエ (Rhizopus oryzae)由来(旧称：リゾプス・デレマー (Rhizopus delemar))、サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa) (旧称：フミコーラ・ラヌギノザ (Humicola lanuginosa))由来、フザリウム・ヘテロスポラム (Fusarium heterosporum)由来、ペニシリウム・カマンベルティ (Penicillium camembertii)由来、アスペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)由来、またはそれらと近縁の微生物由来のリパーゼを好ましい酵素として挙げることができる。これらの中でも、特に、カンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)由来のフラクションＢリパーゼ（CALB)、リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei)由来のリパーゼ、サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa)由来のリパーゼ、アルカリゲネス属 (Alcaligenes sp.)由来のリパーゼが好ましい酵素として挙げられる。 The lipase is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and may be any of animal origin, microorganism origin, or plant origin. For example, lipase derived from pancreas of animals such as pigs and humans, lipase derived from seeds such as wheat germ, fraction A lipase (CALA) or fraction B derived from Candida antarctica (also referred to as Psudozyma antarctica ) lipase (CALB), Candida Rugoza (Candida rugosa) derived from: (. Pseudomonas sp) (formerly known as Candida cylindracea (Candida cylindracea)), Jiotorikamu-Kanjidamu (Geotrichum candidum) derived from Pseudomonas derived from the genus Pseudomonas Aeruginoza (Pseudomonas aeruginosa) origin, Burkholderia cepacia (Burkholderia cepacia) derived from: (. Alcaligenes sp) (formerly known as Pseudomonas cepacia (Pseudomonas cepacia)), Alcaligenes derived from the genus, Serratia marcescens (Serratia marcescens) derived from Pseudomonas fluorescens (Ps eudomonas fluorescens) derived from Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei) derived from Rhizopus oryzae (Rhizopus oryzae) derived from (formerly known as: Rhizopus delemar (Rhizopus delemar)), Thermo Mrs. Ranuginoza (Thermomyces lanuginosa) (formerly Humicola Ranuginoza (Humicola lanuginosa )), Fusarium heterosporum , Penicillium camembertii , Aspergillus niger , or closely related lipases. it can. Among these, in particular, the fraction B lipase derived from Candida antarctica (CALB), the lipase derived from Rhizomucor miehei , the lipase derived from Thermomyces lanuginosa , and the genus Alcaligenes sp. .) Derived lipase is a preferred enzyme.

前記酵素は、遊離のリパーゼで用いてもよいし、担体に固定化して用いてもよいが、酵素を固定化した方が反応溶液から固定化酵素を容易に回収することができ、また当該固定化酵素を容易に再利用することができる。   The enzyme may be used as a free lipase or may be immobilized on a carrier, but the immobilized enzyme can be easily recovered from the reaction solution when the enzyme is immobilized. The enzyme can be easily reused.

酵素の固定化の方法としては、セライトなどの不活性担体に物理化学的に吸着又は結合させたり、イオン交換樹脂に結合させたりする担体結合法、ポリアクリルアミドなどのポリマーからなるゲルの格子中に酵素を包含させる包括法などの公知の方法を適用できる。   Enzyme immobilization methods include physicochemical adsorption or binding to an inert carrier such as Celite, or binding to an ion exchange resin, in a gel lattice made of a polymer such as polyacrylamide. A known method such as a comprehensive method including an enzyme can be applied.

また、酵素は１種類の酵素を単独で用いてもよいし、複数の酵素を組合せて用いてもよい。   As the enzyme, one kind of enzyme may be used alone, or a plurality of enzymes may be used in combination.

用いる酵素の量は、本発明の効果を損なわない限り特に制限されないが、通常は反応原料である糖1 gに対して10〜100,000ユニット(U)、より好ましくは1,000〜50,000 Uを添加することが好ましい。ここでの１Uとは、オリーブ油などの油脂の加水分解反応において、１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離する酵素量のことである。   The amount of the enzyme to be used is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. Usually, 10 to 100,000 units (U), more preferably 1,000 to 50,000 U, is added to 1 g of sugar as a reaction raw material. Is preferred. Here, 1U is the amount of enzyme that liberates 1 micromole of fatty acid per minute in the hydrolysis reaction of fats and oils such as olive oil.

酵素反応を行う温度は、酵素が活性を失わない温度ならばいずれでもよいが、好ましくは0〜80℃、より好ましくは20〜60℃である。   The temperature at which the enzyme reaction is performed may be any temperature as long as the enzyme does not lose its activity, but is preferably 0 to 80 ° C, more preferably 20 to 60 ° C.

当該エステル化反応を行う反応時間は、生成物である糖脂肪酸エステルが得られる反応時間であれば特に制限されない。当該反応温度、酵素量、基質量にもよるが、通常は2〜120時間程度で、充分に当該エステル化反応を行うことができる。   The reaction time for performing the esterification reaction is not particularly limited as long as it is a reaction time for obtaining a sugar fatty acid ester as a product. Although depending on the reaction temperature, the amount of enzyme, and the base mass, the esterification reaction can be sufficiently carried out usually in about 2 to 120 hours.

原料である糖と脂肪酸のモル比は、生成物である糖脂肪酸エステルが得られるならばいずれでもよいが、好ましくは脂肪酸/糖＝0.5〜20、より好ましくは脂肪酸/糖＝1〜6である。   The molar ratio of the raw material sugar to fatty acid may be any as long as the product sugar fatty acid ester can be obtained, but preferably fatty acid / sugar = 0.5 to 20, more preferably fatty acid / sugar = 1 to 6 .

有機溶媒に溶かす糖と脂肪酸の量は、生成物である糖脂肪酸エステルが得られるならばいずれでもよいが、好ましくは1 mLの溶媒に対して、糖と脂肪酸の合計が1〜300 mg、より好ましくは4〜100 mgである。   The amount of sugar and fatty acid dissolved in the organic solvent may be any as long as the product sugar fatty acid ester can be obtained. Preferably, the total amount of sugar and fatty acid is 1 to 300 mg per 1 mL of solvent. Preferably it is 4-100 mg.

反応系には、有機溶媒、糖、脂肪酸、酵素だけを添加して振盪または撹拌しながら反応させるだけでもよいが、反応効率を上げるため、エステル化に伴う生成水を除きながら反応を行うのが望ましい。当該生成水を除くためには、減圧下で反応を行う、モレキュラーシーブなどの公知の脱水剤を用いる方法などが採用できる。   It is sufficient to add only an organic solvent, sugar, fatty acid, and enzyme to the reaction system and react while shaking or stirring, but in order to increase the reaction efficiency, the reaction is carried out while removing the water produced during esterification. desirable. In order to remove the generated water, a method using a known dehydrating agent such as molecular sieve, which performs the reaction under reduced pressure, can be employed.

以上の方法で合成した糖脂肪酸エステルは次の方法で定量および分析を行うことができる。   The sugar fatty acid ester synthesized by the above method can be quantified and analyzed by the following method.

＜HPLCによる二糖脂肪酸モノエステル、ジエステルの分析条件＞
反応液から上清を回収後、この上清100μＬとメタノール100μＬを混合し、遠心分離により上清を回収した。この遠心分離により得られた沈殿をメタノール200μＬで洗浄・遠心分離後、上清を回収し、先程の上清と混合した。減圧下で溶媒を除去後、残渣を400μＬのアセトン：アセトニトリル：TFA＝33:67:0.05（容量比）に溶かした。このうちの40μＬを、コスモシール5C18-MS (ナカライテスク社製、4.6 x 250 mm、40℃)に負荷し、二糖脂肪酸モノエステルおよびジエステルを分析した。この分析の時の溶出溶媒はアセトン：アセトニトリル：TFA＝33:67:0.05（容量比）、流速0.5 mL／分であり、検出器は示差屈折計を用いた。 <Analytical conditions for disaccharide fatty acid monoesters and diesters by HPLC>
After recovering the supernatant from the reaction solution, 100 μL of this supernatant and 100 μL of methanol were mixed, and the supernatant was recovered by centrifugation. The precipitate obtained by this centrifugation was washed with 200 μL of methanol and centrifuged, and the supernatant was collected and mixed with the previous supernatant. After removing the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in 400 μL of acetone: acetonitrile: TFA = 33: 67: 0.05 (volume ratio). 40 μL of this was loaded onto Cosmo Seal 5C18-MS (Nacalai Tesque, 4.6 × 250 mm, 40 ° C.), and the disaccharide fatty acid monoester and diester were analyzed. The elution solvent at the time of this analysis was acetone: acetonitrile: TFA = 33: 67: 0.05 (volume ratio), the flow rate was 0.5 mL / min, and a differential refractometer was used as a detector.

後述の実施例に記載する反応により生成した生成物（オレイン酸とヒドロキシプロピルマルトース(HP-G2)とのエステル体）を、上記のHPLC条件で分取・精製し、検量線を作成後、この検量線から生成物の量を算出し、基質に対する生成物（モノエステルおよびジエステル）への変換率を求めた。ここで、例えばモノエステルへの変換率が50%、ジエステルへの変換率が5％とある場合は、原料となるHP-G2が100分子あった場合、50分子のHP-G2がモノエステルに、5分子のHP-G2がジエステルにそれぞれ変換されたことを意味する。   The product (ester of oleic acid and hydroxypropyl maltose (HP-G2)) produced by the reaction described in the examples below is fractionated and purified under the above-mentioned HPLC conditions, and a calibration curve is prepared. The amount of the product was calculated from the calibration curve, and the conversion rate to the product (monoester and diester) relative to the substrate was determined. Here, for example, when the conversion rate to a monoester is 50% and the conversion rate to a diester is 5%, when there are 100 molecules of HP-G2 as a raw material, 50 molecules of HP-G2 are converted into a monoester. , Which means that 5 molecules of HP-G2 were each converted to diester.

＜ケン化分解法によるエステル化率の測定＞
三糖以上のオリゴ糖混合物、およびシクロデキストリンなどの環状糖は、この方法で分析した。0.6 mLの反応液に含まれる溶媒を減圧下で脱溶媒後、残渣を0.6 mLのヘキサンに懸濁し、遠心分離後、未反応の脂肪酸を含む溶媒層を除去した。（この時、溶媒層には、未反応の脂肪酸以外は存在しなかった。）沈殿を0.2 mLのヘキサンで洗浄後、遠心分離で得られた沈殿を0.6 mLのイソプロパノールに溶解させた。モレキュラーシーブまたは酵素由来の不溶物を遠心分離により除去後、２マイクロモルの内部標準（パルミチン酸）を添加し、この溶液を均等に0.3 mLずつに分けた。そのうちの一方は無処理でGC分析し、もう一方はケン化分解後にGC分析した。 <Measurement of esterification rate by saponification decomposition method>
Mixtures of tri- or higher oligosaccharides and cyclic sugars such as cyclodextrins were analyzed in this way. After removing the solvent contained in 0.6 mL of the reaction solution under reduced pressure, the residue was suspended in 0.6 mL of hexane, centrifuged, and the solvent layer containing unreacted fatty acid was removed. (At this time, there was no other than unreacted fatty acid in the solvent layer.) After washing the precipitate with 0.2 mL of hexane, the precipitate obtained by centrifugation was dissolved in 0.6 mL of isopropanol. After removing molecular sieves or enzyme-derived insoluble matter by centrifugation, 2 micromolar internal standard (palmitic acid) was added, and this solution was divided equally into 0.3 mL portions. One of them was subjected to GC analysis without treatment, and the other was subjected to GC analysis after saponification decomposition.

ケン化分解は以下のようにして行った。試料を溶かしたイソプロパノール溶液0.3 mLに1.5 mLの0.1M NaOH/92%エタノール溶液を添加し、65℃で10分間加熱した。室温まで冷却後、水を2.5 mL添加し、酸性になるまで2M塩酸を添加した。2 mLヘキサンで脂肪酸を抽出後、ヘキサン層を回収した。エバポレーターで脱溶媒後、0.5 mLのトルエン・ヘキサン・メタノール(4:1:1, v/v/v)溶液を添加し、2Mのトリメチルシリルジアゾメタンジエチルエーテル溶液で脂肪酸をメチルエステル化後、GC分析した。   Saponification decomposition was performed as follows. To 0.3 mL of the isopropanol solution in which the sample was dissolved, 1.5 mL of 0.1 M NaOH / 92% ethanol solution was added and heated at 65 ° C. for 10 minutes. After cooling to room temperature, 2.5 mL of water was added, and 2M hydrochloric acid was added until acidic. After extracting the fatty acid with 2 mL hexane, the hexane layer was recovered. After removing the solvent with an evaporator, 0.5 mL of toluene / hexane / methanol (4: 1: 1, v / v / v) solution was added, and fatty acid was methyl esterified with 2M trimethylsilyldiazomethane diethyl ether solution, followed by GC analysis. .

無処理でGC分析する場合は、試料を溶かしたイソプロパノール溶液0.3 mLを脱溶媒後、0.5 mLのトルエン・ヘキサン・メタノール溶液(4:1:1, v/v/v)溶液を添加し、トリメチルシリルジアゾメタンで脂肪酸をメチルエステル化後、GC分析した。ケン化分解した時の内部標準に対するオレイン酸の相対量、ケン化分解しなかった時の内部標準に対するオレイン酸の相対量をそれぞれ算出し、両者の差を糖に結合したオレイン酸の量とした。内部標準に対するオレイン酸の量と反応系中の基質の量から、糖1分子に対するオレイン酸のエステル化率を計算した。ここで、例えばヒドロキシプロピル化β-シクロデキストリンにおいて、原料となるヒドロキシプロピル化β-シクロデキストリンが100分子あった場合、50分子のヒドロキシプロピル化β-シクロデキストリンがモノエステルに、5分子のヒドロキシプロピル化β-シクロデキストリンがジエステルにそれぞれ変換された場合、ケン化分解法では結合している脂肪酸の量だけを定量していることから、50+5x2=60分子の脂肪酸が定量されることになる。糖1分子に対するオレイン酸のエステル化率で定義することから、エステル化率は60%となる。このケン化分解分析の後、MS分析等によりモノエステルとジエステルの比率が１０：１と分析されたならば、エステル化率60%から、ヒドロキシプロピル化β-シクロデキストリンからモノエステルへの変換率は50%、ジエステルへの変換率は5%と算出できる。   For GC analysis without treatment, remove 0.3 mL of the isopropanol solution in which the sample was dissolved, add 0.5 mL of a toluene / hexane / methanol solution (4: 1: 1, v / v / v), and trimethylsilyl. After fatty acid was methyl esterified with diazomethane, GC analysis was performed. Calculate the relative amount of oleic acid with respect to the internal standard when saponified and decomposed, and the relative amount of oleic acid with respect to the internal standard when not saponified and decomposed, and the difference between them was defined as the amount of oleic acid bound to the sugar. . The esterification rate of oleic acid per sugar molecule was calculated from the amount of oleic acid relative to the internal standard and the amount of substrate in the reaction system. Here, for example, in hydroxypropylated β-cyclodextrin, if there are 100 molecules of hydroxypropylated β-cyclodextrin as a raw material, 50 molecules of hydroxypropylated β-cyclodextrin become monoester, 5 molecules of hydroxypropylated When each β-cyclodextrin is converted to a diester, 50 + 5x2 = 60 molecules of fatty acid will be quantified because the saponification decomposition method only quantifies the amount of bound fatty acid. . Since it is defined by the esterification rate of oleic acid per sugar molecule, the esterification rate is 60%. After this saponification decomposition analysis, if the ratio of monoester to diester is analyzed to 10: 1 by MS analysis etc., conversion rate from 60% esterification to conversion rate from hydroxypropylated β-cyclodextrin to monoester Can be calculated as 50% and the conversion rate to diester is 5%.

（製造例１）プロピレンオキシドを用いたヒドロキシプロピル化マルトース(HP-G2)の調製
20 gの水、0.3 gの水酸化ナトリウム、30 gのマルトース（G2）、および9 gのプロピレンオキシドを添加し、42℃、振盪しながら１晩反応させた。反応後、1.2 M HClを添加してpHを5に調製後、減圧下で未反応のプロピレンオキシドと水を除去し、粗精製HP-G2を調製した。 (Production Example 1) Preparation of hydroxypropylated maltose (HP-G2) using propylene oxide
20 g of water, 0.3 g of sodium hydroxide, 30 g of maltose (G2), and 9 g of propylene oxide were added and reacted overnight at 42 ° C. with shaking. After the reaction, 1.2 M HCl was added to adjust the pH to 5, and then unreacted propylene oxide and water were removed under reduced pressure to prepare crude purified HP-G2.

この粗精製HP-G2を、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHBA)をマトリックスとしてMALDI/TOF-MS（AXIMA Confidence、島津製作所）で分析した結果、(HP)₁-G2含量は51.3 モル％であった。分析結果を表１に示す。 This crude purified HP-G2 was analyzed by MALDI / TOF-MS (AXIMA Confidence, Shimadzu Corporation) using 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) as a matrix. As a result, the (HP) ₁ -G2 content was 51.3 mol%. there were. The analysis results are shown in Table 1.

ここで、G2はマルトース、(HP)₁-G2はマルトースの水酸基の１か所がヒドロキシプロピル化された物質、(HP)₂-G2はマルトースの水酸基の２か所がヒドロキシプロピル化された物質、(HP)₃-G2はマルトースの水酸基の３か所がヒドロキシプロピル化された物質をそれぞれ意味する。また、HP-G2は、(HP)₁-G2、(HP)₂-G2および(HP)₃-G2の混合物を意味するか、または、ヒドロキシプロピル化された水酸基の個数を特定せずに包括的に表す場合に用いる。他のヒドロキシアルキル化糖類についても同様である。 Where G2 is maltose, (HP) ₁ -G2 is a substance in which one of the maltose hydroxyl groups is hydroxypropylated, and (HP) ₂ -G2 is a substance in which _two maltose hydroxyl groups are hydroxypropylated , (HP) ₃ -G2 means a substance obtained by hydroxypropylation of three of the maltose hydroxyl groups. HP-G2 means a mixture of (HP) ₁ -G2, (HP) ₂ -G2 and (HP) ₃ -G2, or includes all the hydroxypropylated hydroxyl groups without specifying the number. This is used to express it. The same applies to other hydroxyalkylated saccharides.

次に、4 gの粗精製HP-G2を830 mLの活性炭カラムに負荷し、0%エタノール(1.5 L)/50%エタノール(1.5 L)のグラジエントでG2、(HP)₁-G2、(HP)₂-G2等を溶出した。(HP)₁-G2を主成分とするフラクションを回収し、エバポレーターによる脱エタノールと凍結乾燥により、1.1 gの精製HP-G2を得た。 Next, 4 g of crude purified HP-G2 was loaded onto an 830 mL activated carbon column, and G2, (HP) ₁ -G2 (HP) with a gradient of 0% ethanol (1.5 L) / 50% ethanol (1.5 L) ) ₂ -G2 and the like were eluted. Fractions mainly composed of (HP) ₁ -G2 were collected, and 1.1 g of purified HP-G2 was obtained by deethanol and lyophilization using an evaporator.

この精製HP-G2を、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで分析した結果を表１に示す。その結果、(HP)₁-G2含量は94.4 モル％であった。また、精製HP-G2をイオントラップ型LC-MS（Finnigan LCQ^DECA、Thermo Quest）で分析したところ、m/z=423.3のナトリウムイオン付加分子[M+Na⁺]が観測され、マルトースの水酸基の１か所がヒドロキシプロピル化された物質であることが確認された。 Table 1 shows the results of analyzing this purified HP-G2 by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix. As a result, the (HP) ₁ -G2 content was 94.4 mol%. Moreover, when purified HP-G2 was analyzed by ion trap LC-MS (Finnigan LCQ ^DECA , Thermo Quest), a sodium ion addition molecule [M + Na ⁺ ] with m / z = 423.3 was observed. It was confirmed that one site was a hydroxypropylated material.

（実施例１）水酸基のヒドロキシプロピル化による糖類の溶解度の影響
適量のマルトース（G2）または精製HP-G2を１ｍＬの有機溶媒（tert-ブタノール、アセトン）に添加し、５０℃に加熱して、一時間撹拌した。遠心分離により上清を回収し、脱溶媒後、残渣の重量を測定した。この値を有機溶媒１ｍＬあたりの溶解度（ｍｇ／ｍＬ）とした。その結果を表２に示す。 (Example 1) Effect of saccharide solubility due to hydroxypropylation of hydroxyl group An appropriate amount of maltose (G2) or purified HP-G2 was added to 1 mL of an organic solvent (tert-butanol, acetone) and heated to 50 ° C. Stir for 1 hour. The supernatant was collected by centrifugation, and after removing the solvent, the weight of the residue was measured. This value was defined as the solubility (mg / mL) per mL of the organic solvent. The results are shown in Table 2.

（実施例２）リパーゼを用いた精製HP-G2とオレイン酸とのエステル化
25 mgの基質（G2、および製造例１で調製した精製HP-G2）、100 mgのオレイン酸（東京化成、純度約90%）、5 mLのtert-ブタノール（和光純薬）、100 mgのカンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)リパーゼ（Novozym 435、ノボザイムズジャパン）、および500 mgのモレキュラーシーブ3A（関東化学）を混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１、３および５日後にサンプリングし、HPLCで生成物（G2または精製HP-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、G2、および精製HP-G2に対するモノエステルおよびジエステルへの変換率を算出した。結果を表３に示す。 (Example 2) Esterification of purified HP-G2 and oleic acid using lipase
25 mg of substrate (G2, and purified HP-G2 prepared in Production Example 1), 100 mg of oleic acid (Tokyo Kasei, purity of about 90%), 5 mL of tert-butanol (Wako Pure Chemical Industries), 100 mg Candida antarctica lipase (Novozym 435, Novozymes Japan) and 500 mg of molecular sieve 3A (Kanto Chemical) were mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Samples are taken after 1, 3 and 5 days and the content of the product (G2 or purified HP-G2 oleic acid monoesters and diesters) is determined by HPLC and converted to monoesters and diesters for G2 and purified HP-G2 The rate was calculated. The results are shown in Table 3.

精製HP-G2を基質としたときの変換率は、G2を基質とした時に比べて、反応初期の１日目で31倍、反応後期の５日目で７．７倍高いことが分かった。したがって、二糖であるマルトースの水酸基をヒドロキシプロピル基で修飾することにより、リパーゼ反応を用いて、ヒドロキシプロピル化マルトースオレイン酸エステルが効率よく合成できることが分かった。   It was found that the conversion rate when purified HP-G2 was used as a substrate was 31 times higher on the first day of the reaction and 7.7 times higher on the fifth day of the reaction later than when G2 was used as the substrate. Therefore, it was found that hydroxypropylated maltose oleate can be efficiently synthesized by modifying the hydroxyl group of maltose, which is a disaccharide, with a hydroxypropyl group using a lipase reaction.

効率よく合成できる理由として、（１）固型の基質にはきわめて作用しにくいリパーゼが、糖をヒドロキシアルキル化することにより、糖の有機溶媒への溶解性が高まり、作用しやすくなった、（２）糖の水酸基に（ポリ）オキシアルキレン基などのリンカーが存在するので、リパーゼの活性中心にヒドロキシアルキル基の水酸基が入りやすくなり、リパーゼの反応性が高まる、等が考えられる。   Reasons for efficient synthesis are as follows: (1) Lipase, which is extremely difficult to act on solid substrates, has been improved by increasing the solubility of sugar in organic solvents by hydroxyalkylating sugar. 2) Since a linker such as a (poly) oxyalkylene group is present at the hydroxyl group of the sugar, the hydroxyl group of the hydroxyalkyl group can easily enter the active center of the lipase, and the reactivity of the lipase is increased.

マルトースの水酸基をヒドロキシプロピル基で修飾する反応は簡便で温和な条件下での反応であり、ピリジンなどの悪臭のある試薬を用いない反応である。これに引き続くリパーゼを用いるエステル化反応は、従来法（ヒドロキシプロピル化していないマルトースを用いた反応）よりも反応効率が高く、かつ、温和な条件下での反応であり、脂肪酸の劣化の危険性も低いことから、本合成法は、新規で優れた合成法である。   The reaction for modifying the hydroxyl group of maltose with a hydroxypropyl group is a reaction under simple and mild conditions, and does not use a reagent having a bad odor such as pyridine. The subsequent esterification reaction using lipase has a higher reaction efficiency than the conventional method (reaction using maltose that is not hydroxypropylated) and is mild under the conditions, and there is a risk of fatty acid degradation. Therefore, this synthesis method is a novel and excellent synthesis method.

（実施例３）(HP)₁-G2オレイン酸モノエステルのLC/MS分析
実施例２で合成されたモノエステルおよびジエステルをHPLCで分取・精製し、LC-MSで分析した。その結果、モノエステルおよびジエステルは、それぞれm/z=687.4およびm/z=951.5のナトリウム付加分子[M+Na⁺]として検出された。ナトリウム付加分子を親イオンピークとして衝突誘起開裂したところ、モノエステルにおいては、[M-OCOR-H+Na⁺]のフラグメントイオン m/z=405 (R=CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇)、および[M-OCH₂CH(CH₃)OCOR-H+Na⁺]のフラグメントイオンm/z=347が検出された。一方、ジエステルにおいては、[M-OCOR-H+Na⁺]のフラグメントイオンm/z=669、および[M-OCH₂CH(CH₃)OCOR-H+Na⁺]のフラグメントイオンm/z=611がそれぞれ検出された。以上のことから、(HP)₁-G2にオレイン酸が１または２個エステル結合したヒドロキシプロピル化マルトースオレイン酸モノエステルおよびヒドロキシプロピル化マルトースオレイン酸ジエステルであることが確認された。なお、MALDI/TOF-MSの分析の結果、トリエステルは検出されなかった。 Example 3 LC / MS Analysis of (HP) ₁ -G2 Oleic Acid Monoester The monoester and diester synthesized in Example 2 were fractionated and purified by HPLC and analyzed by LC-MS. As a result, monoesters and diesters were detected as sodium-added molecules [M + Na ⁺ ] with m / z = 687.4 and m / z = 951.5, respectively. Collision-induced cleavage with sodium adduct molecules as parent ion peaks showed that in monoester, [M-OCOR-H + Na ⁺ ] fragment ion m / z = 405 (R = CH ₃ (CH ₂ ) ₇ CH = CH (CH ₂ ) ₇ ) and [M-OCH ₂ CH (CH ₃ ) OCOR-H + Na ⁺ ] fragment ions m / z = 347 were detected. On the other hand, in the diester, [M-OCOR-H + Na +] in the fragment ion m / z = 669, and _{[M-OCH 2 CH (CH} 3) OCOR-H + Na +] in the fragment ion m / z = 611 was detected respectively. From the above, it was confirmed that they were hydroxypropylated maltose oleic acid monoester and hydroxypropylated maltose oleic acid diester in which one or two oleic acids were ester-bonded to (HP) ₁ -G2. As a result of MALDI / TOF-MS analysis, no triester was detected.

（実施例４）リパーゼを用いたヒドロキシプロピル化二糖と脂肪酸のエステル化における二糖の種類の影響
マルトース以外の二糖においても、水酸基をヒドロキシプロピル化することにより、二糖脂肪酸エステルが効率よく合成できるかどうかを調べた。製造例１と同じ方法により、スクロース（ショ糖）またはラクトースから、粗精製HP-スクロースおよび粗精製HP-ラクトースを調製した。これらを、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで生成物の組成比を分析した。その結果、粗精製HP-スクロースにおいては、未反応のスクロースは5.4モル％、水酸基の１か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₁-スクロースが28.1モル％、水酸基の２か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₂-スクロースが36.5モル％、水酸基の３か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₃-スクロースが23.6モル％、および水酸基の４か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₄-スクロースが6.4モル％であった。粗精製HP-ラクトースにおいては、未反応のラクトースは38.7モル％、水酸基の１か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₁-ラクトースが49.3モル％、水酸基の２か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₂-ラクトースが9.3モル％、および水酸基の３か所がヒドロキシプロピル化された(HP)₃-ラクトースが2.7モル％であった。 (Example 4) Effect of disaccharide type on esterification of hydroxypropylated disaccharide and fatty acid using lipase Also in disaccharides other than maltose, disaccharide fatty acid ester is efficiently obtained by hydroxypropylating the hydroxyl group. It was investigated whether it could be synthesized. By the same method as in Production Example 1, crude purified HP-sucrose and crude purified HP-lactose were prepared from sucrose (sucrose) or lactose. These were analyzed for the composition ratio of the product by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix. As a result, in crude purified HP-sucrose, unreacted sucrose was 5.4 mol%, one hydroxyl group was hydroxypropylated (HP) ₁ -sucrose 28.1 mol%, and two hydroxyl groups were hydroxypropyl (HP) ₂ -sucrose was 36.5 mol%, 3 hydroxyl groups were hydroxypropylated (HP) ₃ -sucrose was 23.6 mol%, and 4 hydroxyl groups were hydroxypropylated (HP ₄ ) Sucrose was 6.4 mol%. In the crude purified HP-lactose, unreacted lactose was 38.7 mol%, one hydroxyl group was hydroxypropylated (HP) ₁ -lactose was 49.3 mol%, and two hydroxyl groups were hydroxypropylated (HP) ₂ -Lactose was 9.3 mol%, and (HP) ₃ -Lactose in which three hydroxyl groups were hydroxypropylated was 2.7 mol%.

25 mgの基質（スクロース、粗精製HP-スクロース、ラクトース、粗精製HP-ラクトース、マルトース(G2)、および粗精製HP-G2）、100 mgのオレイン酸、5 mLのtert-ブタノール、100 mgのNovozym 435、および500 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１、３および５日後にサンプリングし、HPLCで生成物（オレイン酸モノエステル）の含量を測定し、原料に対するモノエステルへの変換率を算出した。その結果を表４に示す。   25 mg substrate (sucrose, crude HP-sucrose, lactose, crude HP-lactose, maltose (G2), and crude HP-G2), 100 mg oleic acid, 5 mL tert-butanol, 100 mg Novozym 435 and 500 mg of molecular sieve 3A were mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Sampling was performed after 1, 3 and 5 days, and the content of the product (oleic acid monoester) was measured by HPLC, and the conversion ratio of the raw material to the monoester was calculated. The results are shown in Table 4.

その結果、マルトースだけではなく、スクロースやラクトースなどの二糖の水酸基をヒドロキシプロピル化することにより、リパーゼを用いて、ヒドロキシプロピル化二糖脂肪酸エステルが効率よく合成できることが分かり、本技術が幅広い二糖に適用できることが分かった。   As a result, it was found that hydroxypropylated disaccharide fatty acid esters can be efficiently synthesized using lipase by hydroxypropylating not only maltose but also the hydroxyl group of disaccharides such as sucrose and lactose. It was found that it can be applied to sugar.

（実施例５）リパーゼを用いた精製HP-G2と脂肪酸のエステル化における脂肪酸の種類の影響
25 mgの精製HP-G2、100 mgの脂肪酸（カプリル酸、パルミチン酸、リノール酸、いずれも東京化成）、5 mLのtert-ブタノール、100 mgのNovozym 435、および500 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１、３および５日後にサンプリングし、HPLCで生成物（精製HP-G2の各種脂肪酸モノエステル）の含量を測定し、精製HP-G2に対するモノエステルへの変換率を算出した。その結果を表５に示す。 (Example 5) Effect of fatty acid type on esterification of purified HP-G2 and fatty acid using lipase
Mix 25 mg purified HP-G2, 100 mg fatty acid (caprylic acid, palmitic acid, linoleic acid, Tokyo Chemical), 5 mL tert-butanol, 100 mg Novozym 435, and 500 mg molecular sieve 3A And reacted at 50 ° C. with shaking. 1, 3, and 5 days after sampling, the content of the product (various fatty acid monoesters of purified HP-G2) was measured by HPLC, and the conversion rate of the purified HP-G2 into a monoester was calculated. The results are shown in Table 5.

その結果、炭素数18個、二重結合１個で常温液状のオレイン酸(C18:1)だけではなく、オレイン酸よりも二重結合が多い(２個)のリノール酸(C18:2)、炭素数16個で二重結合がなく常温で固形のパルミチン酸(C16:0)、炭素数が短くて（８個）二重結合がないカプリル酸(C8:0)においても、オレイン酸と同様、リパーゼを用いて、ヒドロキシプロピル化マルトース脂肪酸モノエステルが効率よく合成できることがわかり、本技術が幅広い脂肪酸に適用できることが分かった。   As a result, not only liquid oleic acid (C18: 1) with 18 carbon atoms and one double bond, but also linoleic acid (C18: 2) with more double bonds than oleic acid (2), Similar to oleic acid, palmitic acid (C16: 0), which has 16 carbon atoms and no double bonds, is solid at room temperature, and caprylic acid (C8: 0), which has a short carbon number (8) and has no double bonds, is the same as oleic acid. It was found that hydroxypropylated maltose fatty acid monoester can be efficiently synthesized using lipase, and that this technology can be applied to a wide range of fatty acids.

（実施例６）リパーゼを用いた精製HP-G2とオレイン酸のエステル化における溶媒の種類の影響
25 mgの精製HP-G2、100 mgのオレイン酸、5 mLの溶媒（ヘキサン、アセトニトリル、アセトン）、100 mgのNovozym 435、および500 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１、３および５日後にサンプリングし、HPLCで生成物（精製HP-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、精製HP-G2に対するモノエステルおよびジエステルへの変換率を算出した。その結果を表６に示す。なお、実施例２におけるtert-ブタノール中の反応も併記した。 (Example 6) Effect of solvent type on esterification of purified HP-G2 and oleic acid using lipase
Mix 25 mg purified HP-G2, 100 mg oleic acid, 5 mL solvent (hexane, acetonitrile, acetone), 100 mg Novozym 435, and 500 mg molecular sieve 3A and react at 50 ° C with shaking I let you. Samples were taken after 1, 3 and 5 days, and the content of the product (oleic acid monoesters and diesters of purified HP-G2) was measured by HPLC, and the conversion ratio of the purified HP-G2 to monoesters and diesters was calculated. The results are shown in Table 6. The reaction in tert-butanol in Example 2 is also shown.

その結果、tert-ブタノールだけではなく、アセトニトリルおよびアセトン中でも効率よくエステル化反応が進行することが分かった。特にアセトン中における１日目のエステル化率は、tert-ブタノール中における１日目のエステル化率よりも大きいことが分かった。   As a result, it was found that the esterification reaction proceeds efficiently not only in tert-butanol but also in acetonitrile and acetone. In particular, the esterification rate on the first day in acetone was found to be greater than the esterification rate on the first day in tert-butanol.

（実施例７）リパーゼを用いた精製HP-G2とオレイン酸のエステル化におけるモル比の影響
25 mgの基質（G2または精製HP-G2）、100 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:6 (モル比)）または16.4 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1(モル比)）、5 mLのアセトン、100 mgのNovozym 435、および500 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１および２日後にサンプリングし、HPLCで生成物（G2または精製HP-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、G2または精製HP-G2に対するモノエステルおよびジエステルへの変換率を算出した。その結果を表７に示す。 (Example 7) Effect of molar ratio on esterification of purified HP-G2 and oleic acid using lipase
25 mg substrate (G2 or purified HP-G2), 100 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 6 (molar ratio)) or 16.4 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio) )), 5 mL acetone, 100 mg Novozym 435, and 500 mg molecular sieve 3A were mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Sampling after 1 and 2 days, measuring the content of the product (G2 or purified HP-G2 oleic acid monoester and diester) by HPLC and calculating the conversion rate of monoester and diester to G2 or purified HP-G2 did. The results are shown in Table 7.

その結果、実施例２におけるtert-ブタノール中での反応と同様、オレイン酸過剰量存在中でのアセトン中での反応では、G2よりも精製HP-G2の方がエステル化率は高かった。一方、オレイン酸が過剰量存在するとき、ジエステルが多く存在していた。しかし、オレイン酸量を減らして基質：オレイン酸＝1:1(モル比)とした時、精製HP-G2の１日目での反応では、モノエステル：ジエステル=60:4(モル比)であったことから、オレイン酸量を基質に対して等モル使用することにより、モノエステルを選択的(エステル体の合計に対するモノエステルのモル比が90％以上)に合成できることが分かった。また、アセトン中でオレイン酸量を基質に対して等モル使用した場合でも、G2よりも精製HP-G2の方がエステル化率は約６倍高かった。なお、MALDI/TOF-MS分析の結果、モル比1:1、1:6のいずれにおいても、トリエステルは検出されなかった。このように、基質（糖類および脂肪酸）のバランスを考慮することにより、モノエステルとジエステルの生成量比をコントロールできることが分かった。   As a result, similar to the reaction in tert-butanol in Example 2, in the reaction in acetone in the presence of an excess amount of oleic acid, purified HP-G2 had a higher esterification rate than G2. On the other hand, when oleic acid was present in excess, a large amount of diester was present. However, when the amount of oleic acid is reduced to the substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio), the monoester: diester = 60: 4 (molar ratio) in the reaction on the first day of purified HP-G2 Therefore, it was found that by using equimolar amounts of oleic acid with respect to the substrate, it was possible to synthesize monoesters selectively (the molar ratio of monoesters to the total of ester bodies was 90% or more). Further, even when equimolar amounts of oleic acid were used in acetone relative to the substrate, purified HP-G2 was about 6 times higher in esterification than G2. As a result of MALDI / TOF-MS analysis, no triester was detected at any of the molar ratios of 1: 1 and 1: 6. Thus, it was found that the production ratio of monoesters and diesters can be controlled by considering the balance of the substrates (saccharides and fatty acids).

（実施例８）リパーゼを用いた精製HP-G2とオレイン酸のエステル化におけるモレキュラーシーブ3Aの量の影響
25 mgの精製HP-G2、16.4 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1 (モル比)）、5 mLのアセトン、100 mgのNovozym 435、およびモレキュラーシーブ3A（0, 100, 300, 500 mg）を混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１および２日後にサンプリングし、HPLCで生成物（精製HP-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、精製HP-G2に対するモノエステルおよびジエステルへの変換率を算出した。その結果を表８に示す。 (Example 8) Effect of amount of molecular sieve 3A on esterification of purified HP-G2 and oleic acid using lipase
25 mg purified HP-G2, 16.4 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio)), 5 mL acetone, 100 mg Novozym 435, and molecular sieve 3A (0, 100, 300, 500 mg) was mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Sampling was conducted after 1 and 2 days, and the content of the product (oleic acid monoester and diester of purified HP-G2) was measured by HPLC, and the conversion ratio of monoester and diester to purified HP-G2 was calculated. The results are shown in Table 8.

その結果、エステル化反応に伴って生成する水を除去するモレキュラーシーブが反応系になくても反応はするものの、モレキュラーシーブがあった方が反応性は高いことが分かり、本反応条件下においては、モレキュラーシーブ量が300 mgの時に最も生成物含量が高かった。   As a result, although the molecular sieve that removes the water generated during the esterification reaction does not exist in the reaction system, the reaction is found to be more reactive. The product content was highest when the molecular sieve amount was 300 mg.

（実施例９）リパーゼを用いた精製HP-G2とオレイン酸のエステル化における基質量の影響
25, 75, 150, 300 mgの精製HP-G2、16.4, 49.2, 98.4, 196.8 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1(モル比)）、5 mLのアセトン、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１、２および３日後にサンプリングし、HPLCで生成物（精製HP-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、5 mLの反応系に生成するモノエステルおよびジエステルの量を算出した。その結果を表９に示す。 (Example 9) Effect of base mass on esterification of purified HP-G2 and oleic acid using lipase
25, 75, 150, 300 mg purified HP-G2, 16.4, 49.2, 98.4, 196.8 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio)), 5 mL acetone, 100 mg Novozym 435 , And 300 mg of molecular sieve 3A were mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Samples were taken after 1, 2 and 3 days, the content of the product (purified HP-G2 oleic acid monoester and diester) was measured by HPLC, and the amount of monoester and diester produced in the 5 mL reaction system was calculated. . The results are shown in Table 9.

その結果、25 mgまたは75 mgの基質を用いた時は90%以上の純度（モノエステル/（モノエステル+ジエステル））でモノエステルが合成できるが、それよりも基質が多くなった時は、生成物の総量が多くなり、ジエステルの比率も高くなった。また、基質量をコントロールすることにより、モノエステルとジエステルの生成量比をコントロールできることが分かった。   As a result, when 25 mg or 75 mg of substrate is used, monoester can be synthesized with a purity of 90% or more (monoester / (monoester + diester)), but when there are more substrates, The total amount of product increased and the diester ratio also increased. Moreover, it turned out that the production amount ratio of a monoester and a diester can be controlled by controlling the base mass.

（実施例１０）精製HP-G2とオレイン酸のエステル化におけるリパーゼの種類の影響
25 mgの精製HP-G2、16.4または100 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1(モル比)または1:6）、5 mLのtert-ブタノールまたはアセトン、100 mgの固定化リパーゼ（Novozym 435、Lipozym TLIM (サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa) 由来、ノボザイムズジャパン)、Lipozym RMIM (リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei) 由来、ノボザイムズジャパン)、イオン交換樹脂Duolite A568 (Rhom and Haas社製、輸入元：住化ケムテックス)に固定化したLipase-QLM (アルカリゲネス属 (Alkaligenes sp.) 名糖産業)）または100 mgの遊離型リパーゼ （Lipase-QLM、Lipase-OF (カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa) 名糖産業)）、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた。１〜５日後にサンプリングし、HPLCで生成物（精製HP-G2のオレイン酸モノエステル）の組成を測定し、精製HP-G2に対するモノエステルへの変換率を算出した。その結果を表１０に示す。 (Example 10) Effect of lipase type on esterification of purified HP-G2 and oleic acid
25 mg purified HP-G2, 16.4 or 100 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio) or 1: 6), 5 mL tert-butanol or acetone, 100 mg immobilized lipase ( Novozym 435, Lipozym TLIM (from Thermomyces lanuginosa , Novozymes Japan), Lipozym RMIM (from Rhizomucor miehei , Novozymes Japan), ion exchange resin Duolite A568 (Rhom and Haas) Ltd., importer Sumika Chemtex) to immobilized lipase-QLM (. Alcaligenes (Alkaligenes sp) Meito Sangyo)) or 100 mg of free lipase (lipase-QLM, lipase-oF ( Candida Rugoza (Candida rugosa ), name sugar industry)), and 300 mg of molecular sieve 3A were mixed and reacted at 50 ° C. with shaking. Sampling was conducted after 1 to 5 days, and the composition of the product (purified HP-G2 oleic acid monoester) was measured by HPLC, and the conversion rate of the purified HP-G2 into a monoester was calculated. The results are shown in Table 10.

その結果、固定化Novozym 435だけではなく、固定化されているLipozym TLIM、Lipozym RMIM 、Lipase-QLM、固定化していない遊離型のLipase-QLM、Lipase-OFでも生成物が有意に認められた。   As a result, not only the immobilized Novozym 435 but also the immobilized Lipozym TLIM, Lipozym RMIM, Lipase-QLM, non-immobilized free Lipase-QLM, and Lipase-OF were found to have significant products.

（製造例２）エチレンクロルヒドリンを用いたヒドロキシエチル化マルトース（HE-G2）の調製
300 gの水、6 gの水酸化ナトリウム、300 gのマルトース（G2）、および90 gのエチレンクロルヒドリンを添加し、38℃、撹拌しながら、ｐHを11.8以下にならない様に24％ NaOH溶液を適宜滴下しながら１晩反応させた。反応後、1.2 M HClを添加してpHを5に調製後、活性炭カラムクロマトに供して、30％エタノールで溶出し、粗精製HE-G2液を得た。その液を、エバポレーションにより濃縮、乾固させ、粗精製HE-G2を得た。 (Production Example 2) Preparation of hydroxyethylated maltose (HE-G2) using ethylene chlorohydrin
Add 300 g of water, 6 g of sodium hydroxide, 300 g of maltose (G2), and 90 g of ethylene chlorohydrin, and with stirring at 38 ° C, 24% NaOH to keep the pH below 11.8 The solution was reacted overnight while dropping the solution as appropriate. After the reaction, 1.2 M HCl was added to adjust the pH to 5, then subjected to activated carbon column chromatography and eluted with 30% ethanol to obtain a crude purified HE-G2 solution. The liquid was concentrated by evaporation and dried to obtain crude purified HE-G2.

これを、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで生成物の組成比を分析したところ、未反応のG2は5.6モル％、水酸基の１か所がヒドロキシエチル化された(HE)₁-G2が52.8モル％、水酸基の２か所がヒドロキシエチル化された(HE)₂-G2が35.5モル％、水酸基の３か所がヒドロキシエチル化された(HE)₃-G2が6.1モル％であった。 When the composition ratio of the product was analyzed by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix, unreacted G2 was 5.6 mol%, and one hydroxyl group was hydroxyethylated (HE) ₁ -G2 52.8 mol%, (HE) ₂ -G2 hydroxy-ethylated at _two hydroxyl groups was 35.5 mol%, and hydroxy-hydroxylated three (HE) ₃ -G2 was 6.1 mol% .

（実施例１１）
25 mgの粗精製HE-G2、16.4 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1(モル比)）、5 mLのアセトン、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で反応させた１および２日後にサンプリングし、HPLCで生成物（粗精製HE-G2のオレイン酸モノエステルおよびジエステル）の含量を測定し、粗精製HE-G2に対するモノエステルおよびジエステルへの変換率を算出した。その結果を表１１に示す。 (Example 11)
Mix 25 mg crude HE-G2, 16.4 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio)), 5 mL acetone, 100 mg Novozym 435, and 300 mg molecular sieve 3A. 1 and 2 days after reaction at 50 ° C. with shaking, the content of the product (oleic acid monoester and diester of crude HE-G2) was determined by HPLC, and the monoester for crude HE-G2 And the conversion rate to diester was calculated. The results are shown in Table 11.

その結果、マルトースの水酸基をヒドロキシプルピル基で修飾するだけではなく、ヒドロキシエチル基で修飾しても、リパーゼの反応性が向上することが分かった。また、エステル化反応後の生成物をMALDI/TOF-MSで分析したところ、(HE)₁-G2、(HE)₂-G2のモノエステル体は、それぞれ、m/z=673.2、717.2のナトリウム付加分子[M+Na⁺]として検出された。なお、トリエステルのナトリウム付加分子[M+Na⁺]は検出されなかった。 As a result, it was found that the reactivity of lipase was improved not only by modifying the hydroxyl group of maltose with a hydroxypropyl group but also with a hydroxyethyl group. In addition, when the product after the esterification reaction was analyzed by MALDI / TOF-MS, the monoesters of (HE) ₁ -G2 and (HE) ₂ -G2 were m / z = 673.2 and 717.2 sodium, respectively. It was detected as an additional molecule [M + Na ⁺ ]. The triester sodium-added molecule [M + Na ⁺ ] was not detected.

（製造例３）三糖以上のオリゴ糖混合物の製造
三糖以上のオリゴ糖混合物を以下の方法で試作した。特開平9-143191号公報に記載の方法に準じて、タピオカ澱粉をα-アミラーゼで分解し、還元糖が２５のマルトオリゴ糖を得た。その後、そのマルトオリゴ糖を４０％水溶液に調整し、生イースト（オリエンタル酵母株式会社製）をマルトオリゴ糖に対して４％添加し、３５℃で２日間撹拌した。その後、珪藻土、活性炭、イオン交換樹脂による精製、噴霧乾燥を行って最終製品とした。その結果、G2以下を0.7 wt%、マルトトリオース(G3)を18.1 wt%、マルトテトラオース(G4)を19.9 wt%、マルトペンタオース(G5)を28.4 wt%、マルトヘキサオース(G6)を14.3 wt%、マルトヘプタオース(G7)以上を18.6 wt%含むオリゴ糖混合物（平均で４．６個のグルコースが結合する。）を得た。 (Production Example 3) Production of oligosaccharide mixture having three or more sugars An oligosaccharide mixture having three or more sugars was produced by the following method. In accordance with the method described in JP-A-9-143191, tapioca starch was decomposed with α-amylase to obtain a maltooligosaccharide having a reducing sugar of 25. Thereafter, the maltooligosaccharide was adjusted to a 40% aqueous solution, 4% of fresh yeast (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was added to the maltooligosaccharide, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 2 days. Thereafter, purification with diatomaceous earth, activated carbon, ion exchange resin, and spray drying were performed to obtain a final product. As a result, 0.7 wt% for G2 or less, 18.1 wt% for maltotriose (G3), 19.9 wt% for maltotetraose (G4), 28.4 wt% for maltopentaose (G5), and maltohexaose (G6) An oligosaccharide mixture containing 14.3 wt% and 18.6 wt% of maltoheptaose (G7) or more (an average of 4.6 glucose bonds) was obtained.

（実施例１２）リパーゼを用いた三糖以上のオリゴ糖混合物のヒドロキシプロピル化物とオレイン酸のエステル化
マルトースを製造例３で製造したオリゴ糖混合物（No.3L-P）に変更した以外は、製造例１と同様にして反応を行い、粗精製ヒドロキシプロピル化した三糖以上のオリゴ糖混合物(粗精製HP-No.3L-P)を調製した。これをMALDI/TOF-MSで分析した結果、1分子あたりに結合しているヒドロキシプロピル基の数は、G3は1.62個、G4は1.76個、G5は2.03個、G6は2.17個であった。 (Example 12) Hydroxypropylation of trisaccharide or higher oligosaccharide mixture using lipase and esterification of oleic acid Maltoose was changed to the oligosaccharide mixture (No.3L-P) produced in Production Example 3, The reaction was carried out in the same manner as in Production Example 1 to prepare a crudely purified hydroxypropylated trisaccharide or higher oligosaccharide mixture (crude purified HP-No. 3L-P). As a result of analysis by MALDI / TOF-MS, the number of hydroxypropyl groups bonded per molecule was 1.62 for G3, 1.76 for G4, 2.03 for G5, and 2.17 for G6.

25 mgのNo.3L-P（製造例３で製造したオリゴ糖混合物）または粗精製HP-No.3L-P（粗精製ヒドロキシプロピル化した三糖以上のオリゴ糖混合物）、100 mgのオレイン酸、5 mLのアセトンまたはtert-ブタノール、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で3日間反応させた。ケン化分解法により、1分子（平均4.6個のグルコースが結合する。）のHP-No.3L-P（粗精製ヒドロキシプロピル化した三糖以上のオリゴ糖混合物）に対するオレイン酸のエステル化率（＝（ケン化分解により遊離したオレイン酸のモル数）/（粗精製HP-No.3L-P（粗精製ヒドロキシプロピル化した三糖以上のオリゴ糖混合物）のモル数）x 100）を算出した。その結果を表１２に示す。   25 mg of No.3L-P (oligosaccharide mixture produced in Production Example 3) or crude purified HP-No.3L-P (crudely purified hydroxypropylated trisaccharide or higher oligosaccharide mixture), 100 mg oleic acid , 5 mL of acetone or tert-butanol, 100 mg of Novozym 435, and 300 mg of molecular sieve 3A were mixed and reacted at 50 ° C. for 3 days with shaking. Esterification rate of oleic acid to HP-No.3L-P (a crudely purified hydroxypropylated trisaccharide or higher oligosaccharide mixture) of 1 molecule (average 4.6 glucose binds) by saponification decomposition method ( = (Number of moles of oleic acid released by saponification decomposition) / (number of moles of crudely purified HP-No.3L-P (a mixture of crudely purified hydroxypropylated trisaccharide or more oligosaccharides)) x 100) . The results are shown in Table 12.

その結果、No.3L-Pをヒドロキシプロピル化することにより、エステル化率が有意に高くなることが分かった。   As a result, it was found that the esterification rate was significantly increased by hydroxypropylating No. 3L-P.

また、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで反応液を分析したところ、オリゴ糖のオレイン酸モノエステル体は、表１３に示すようなナトリウムイオン付加分子[M+Na⁺]として検出され、生成物と確認された。一方、ヒドロキシプロピル化オリゴ糖のジエステル体のナトリウムイオン付加分子は検出されなかった。 When the reaction solution was analyzed by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix, the oligosaccharide oleate monoester was detected as a sodium ion addition molecule [M + Na ⁺ ] as shown in Table 13 and produced. Confirmed. On the other hand, no sodium ion addition molecule in the diester form of hydroxypropylated oligosaccharide was detected.

（実施例１３）リパーゼを用いたヒドロキシプロピル化α-シクロデキストリンとオレイン酸のエステル化
グルコースが環状に６個結合したα-シクロデキストリン(α-CD)のエステル化を行った。マルトースをα-CDに変更した以外は、製造例１と同様にして反応を行い、粗精製ヒドロキシプロピル化α-CD (粗精製HP-α-CD)を調製した。これを、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで生成物の組成比を分析したところ、１分子のα-CDのあたり8.1個の水酸基がヒドロキシプロピル化されていることが分かった。 (Example 13) Esterification of hydroxypropylated α-cyclodextrin and oleic acid using lipase Esterification of α-cyclodextrin (α-CD) in which 6 glucoses were bound cyclically was carried out. A reaction was carried out in the same manner as in Production Example 1 except that maltose was changed to α-CD to prepare crude purified hydroxypropylated α-CD (crude purified HP-α-CD). When the composition ratio of the product was analyzed by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix, it was found that 8.1 hydroxyl groups per molecule of α-CD were hydroxypropylated.

25 mgのα-CDまたは粗精製HP-α-CD、100 mgのオレイン酸、5 mLのtert-ブタノール、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で3日間反応させた。ケン化分解法により、１分子の粗精製HP-α-CDに対するオレイン酸のエステル化率（＝（ケン化分解により遊離したオレイン酸のモル数）/粗精製（HP-α-CDのモル数）x 100）を算出した。その結果を表１４に示す。   Mix 25 mg α-CD or crude HP-α-CD, 100 mg oleic acid, 5 mL tert-butanol, 100 mg Novozym 435, and 300 mg molecular sieve 3A at 50 ° C with shaking For 3 days. Esterification rate of oleic acid to one molecule of crude purified HP-α-CD (= (moles of oleic acid liberated by saponification)) / crude purification (moles of HP-α-CD) ) X 100). The results are shown in Table 14.

その結果、α-CDをヒドロキシプロピル化することにより、エステル化率が有意に高くなることが分かった。   As a result, it was found that the esterification rate was significantly increased by hydroxypropylating α-CD.

また、粗精製HP-α-CDをオレイン酸でエステル化した後の試料に含まれるオレイン酸を除去後、MALDI/TOF-MSで分析したところ、ヒドロキシプロピル基が6から10個結合したヒドロキシプロピル化α-CDのモノエステル体は、m/z=1607.7, 1665.3, 1723.6, 1781.5, 1839.6のナトリウムイオン付加分子[M+Na⁺]としてそれぞれ検出された。一方、ヒドロキシプロピル化α-CDのジエステル体のナトリウムイオン付加分子[M+Na⁺]は検出されなかった。また、α-CDをオレイン酸でエステル化した後の試料を同様にしてMALDI/TOF-MSで分析したところ、エステル体のピークは確認されなかった。従って、表１４におけるα-CDに対するエステル化率が2.5%とあるのは、ケン化分解法によるエステル化率測定のバックグラウンドレベルの値であると推定される。これらの結果から、粗精製HP-α-CDに対するモノエステル体への変換率は11.8-2.5=9.3%、ジエステル体への変換率は0%と推定できる。 In addition, after removing oleic acid contained in the sample after esterification of crude purified HP-α-CD with oleic acid, analysis by MALDI / TOF-MS revealed that hydroxypropyl groups having 6 to 10 hydroxypropyl groups bonded thereto. The monoesters of isomerized α-CD were detected as sodium ion addition molecules [M + Na ⁺ ] at m / z = 1607.7, 1665.3, 1723.6, 1781.5, and 1839.6, respectively. On the other hand, a sodium ion addition molecule [M + Na ⁺ ] in the diester form of hydroxypropylated α-CD was not detected. Further, when the sample after esterifying α-CD with oleic acid was similarly analyzed by MALDI / TOF-MS, the peak of the ester was not confirmed. Therefore, the esterification rate with respect to α-CD in Table 14 is estimated to be 2.5% because of the background level value of the esterification rate measurement by the saponification decomposition method. From these results, it can be estimated that the conversion ratio of the crude purified HP-α-CD to the monoester form is 11.8-2.5 = 9.3%, and the conversion ratio to the diester form is 0%.

（実施例１４）リパーゼを用いたヒドロキシプロピル化β−シクロデキストリンとオレイン酸のエステル化
グルコースが環状に7個結合したβ−シクロデキストリン(β-CD)のエステル化を行った。マルトースをβ-CDに変更した以外は、製造例１と同様にして反応を行い、粗精製ヒドロキシプロピル化β-CD1 (粗精製HP-β-CD1)を調製した。これを、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで生成物の組成比を分析したところ、１分子のβ-CDのあたり5.9個の水酸基がヒドロキシプロピル化されていることが分かった。 (Example 14) Esterification of hydroxypropylated β-cyclodextrin and oleic acid using lipase Esterification of β-cyclodextrin (β-CD) in which seven glucoses were bound cyclically was carried out. A reaction was carried out in the same manner as in Production Example 1 except that maltose was changed to β-CD to prepare crude purified hydroxypropylated β-CD1 (crude purified HP-β-CD1). When the composition ratio of the product was analyzed by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix, it was found that 5.9 hydroxyl groups per molecule of β-CD were hydroxypropylated.

また、製造例１と同様の反応において、用いるプロピレンオキシドの量を1.5倍とし、さらにヒドロキシプロピル化反応を２日間に延ばした。その結果、１分子のβ-CDのあたり9.8個の水酸基がヒドロキシプロピル化されている粗精製ヒドロキシプロピル化β-CD2 (粗精製HP-β-CD2)を調製した。   In the same reaction as in Production Example 1, the amount of propylene oxide used was increased 1.5 times, and the hydroxypropylation reaction was extended to 2 days. As a result, crude purified hydroxypropylated β-CD2 (crude purified HP-β-CD2) in which 9.8 hydroxyl groups were hydroxypropylated per molecule of β-CD was prepared.

25 mgのβ-CDまたは粗精製HP-β-CD1または粗精製HP-β-CD2、100 mgのオレイン酸、5 mLのtert-ブタノールまたはアセトン、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で3または10日間反応させた。ケン化分解法により、１分子の粗精製HP-β-CDに対するオレイン酸のエステル化率（＝（ケン化分解により遊離したオレイン酸のモル数）/粗精製（HP-β-CDのモル数）x 100）を算出した。その結果を表１５に示す。   25 mg β-CD or crude HP-β-CD1 or crude HP-β-CD2, 100 mg oleic acid, 5 mL tert-butanol or acetone, 100 mg Novozym 435, and 300 mg molecular sieve 3A was mixed and reacted at 50 ° C. for 3 or 10 days with shaking. Esterification rate of oleic acid to one molecule of crude purified HP-β-CD (= (number of moles of oleic acid liberated by saponification)) / crude purification (number of moles of HP-β-CD) ) X 100). The results are shown in Table 15.

その結果、β-CDをヒドロキシプロピル化することによって、エステル化率が有意に高くなることが分かった。また、β-CDに結合しているヒドロキシプロピル基を増やした方がエステル化率は高く、またtert-ブタノール中での反応よりアセトン中での反応の方がエステル化率は高かった。   As a result, it was found that esterification rate was significantly increased by hydroxypropylating β-CD. The esterification rate was higher when the number of hydroxypropyl groups bonded to β-CD was increased, and the esterification rate was higher in the reaction in acetone than in tert-butanol.

また、アセトン中で粗精製HP-β-CD2をオレイン酸で3日間エステル化した後の試料に含まれるオレイン酸を除去後、MALDI/TOF-MSで分析したところ、ヒドロキシプロピル基が8から12個結合したヒドロキシプロピル化β-CDのモノエステル体は、m/z=1885.9, 1943.8, 2001.8, 2059.8, 2117.8のナトリウム付加分子[M+Na⁺]としてそれぞれ検出された。一方、ヒドロキシプロピル化β-CDのジエステル体のナトリウム付加分子[M+Na⁺]は検出されず、またβ-CDの反応後の試料中にモノ及びジエステル体のナトリウム付加分子[M+Na⁺]は検出されなかった。これらの結果から、粗精製HP-β-CDに対するモノエステル体への変換率は33.4-2.１=31.3%、ジエステル体への変換率は0%と推定できる。 Further, after removing oleic acid contained in the sample after esterification of crude purified HP-β-CD2 with oleic acid in acetone for 3 days, analysis by MALDI / TOF-MS revealed that the hydroxypropyl group was 8 to 12 Single-linked hydroxypropylated β-CD monoesters were detected as sodium-added molecules [M + Na ⁺ ] at m / z = 1885.9, 1943.8, 2001.8, 2059.8, 2117.8, respectively. On the other hand, sodium adduct molecular diester of hydroxypropylated ^{β-CD [M + Na +} ] is not detected, also sodium adduct molecules of mono- and diester in the sample after reaction of β-CD [M ⁺ Na + ] Was not detected. From these results, it can be estimated that the conversion ratio of the crude purified HP-β-CD to the monoester form is 33.4.2-1 = 31.3%, and the conversion ratio to the diester form is 0%.

（実施例１５）リパーゼを用いたヒドロキシブチル化β−シクロデキストリンとオレイン酸のエステル化
マルトースをβ-CDに、プロピレンオキシドをブチレンオキシドに変更し、添加するNaOH量を2倍にし、反応時間を2日間に変更した以外は、製造例１と同様にして反応を行い、粗精製ヒドロキシブチル化β-CD (粗精製HB-β-CD)を調製した。これを、DHBAをマトリックスとしてMALDI/TOF-MSで生成物の組成比を分析したところ、１分子のβ-CDのあたり4.6個の水酸基がヒドロキシブチル化されていることが分かった。 (Example 15) Esterification of hydroxybutylated β-cyclodextrin and oleic acid using lipase Maltose was changed to β-CD, propylene oxide was changed to butylene oxide, the amount of NaOH added was doubled, and the reaction time was increased. A reaction was carried out in the same manner as in Production Example 1 except that the period was changed to 2 days to prepare crude purified hydroxybutylated β-CD (crude purified HB-β-CD). When the composition ratio of the product was analyzed by MALDI / TOF-MS using DHBA as a matrix, it was found that 4.6 hydroxyl groups per molecule of β-CD were hydroxybutylated.

25 mgのβ-CDまたは粗精製HB-β-CD、100 mgのオレイン酸、5 mLのtert-ブタノール、100 mgのNovozym 435、および300 mgのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で3日間反応させた。ケン化分解法により、１分子の粗精製HB-β-CDに対するオレイン酸のエステル化率（＝（ケン化分解により遊離したオレイン酸のモル数）/粗精製（HB-β-CDのモル数）x 100）を算出した。その結果を表１６に示す。   Mix 25 mg β-CD or crude HB-β-CD, 100 mg oleic acid, 5 mL tert-butanol, 100 mg Novozym 435, and 300 mg molecular sieve 3A at 50 ° C with shaking For 3 days. Esterification rate of oleic acid to one molecule of crude purified HB-β-CD (= (number of moles of oleic acid released by saponification)) / crude purification (number of moles of HB-β-CD) ) X 100). The results are shown in Table 16.

その結果、β-CDをヒドロキシブチル化することによって、エステル化率が高くなることが分かった。このように、ヒドロキシエチル化、ヒドロキシプロピル化だけでなく、ヒドロキシブチル化を行ったβ-CDにおいてもエステル化の基質になることが確認できた。   As a result, it was found that esterification rate was increased by hydroxybutylation of β-CD. Thus, it was confirmed that not only hydroxyethylation and hydroxypropylation, but also β-CD subjected to hydroxybutylation became a substrate for esterification.

（実施例１６）ヒドロキシプロピル化マルトースオレイン酸エステルおよびヒドロキシプロピル化β-CDオレイン酸エステルの臨界ミセル濃度の測定
250 mgの粗精製HP-G2（製造例１で調製）、164 mgのオレイン酸（基質：オレイン酸＝1:1 (モル比)）、50 mLのアセトン、1 gのNovozym 435、および3 gのモレキュラーシーブ3Aを混合し、振盪しながら50℃で2日間反応させた。これと同じ反応を4回行った。反応後、全ての溶媒層を回収し、遠心分離により不溶物を除去後、エバポレーターで脱溶媒した。シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝80 : 20（vol/vol））により未反応のオレイン酸を除去した。その結果、0.7 gの生成物が得られた。この生成物をMALDI/TOF-MSで分析した結果、未反応の粗精製HP-G2：モノエステル：ジエステルのピーク強度比は3.5 : 80.3 : 16.2であった。 Example 16: Determination of critical micelle concentration of hydroxypropylated maltose oleate and hydroxypropylated β-CD oleate
250 mg crude HP-G2 (prepared in Production Example 1), 164 mg oleic acid (substrate: oleic acid = 1: 1 (molar ratio)), 50 mL acetone, 1 g Novozym 435, and 3 g Of molecular sieves 3A were mixed and reacted at 50 ° C. for 2 days with shaking. The same reaction was performed 4 times. After the reaction, all solvent layers were collected, insolubles were removed by centrifugation, and then the solvent was removed with an evaporator. Unreacted oleic acid was removed by silica gel chromatography (elution solvent: hexane: ethyl acetate = 80: 20 (vol / vol)). As a result, 0.7 g of product was obtained. As a result of analyzing this product by MALDI / TOF-MS, the peak intensity ratio of unreacted crude purified HP-G2: monoester: diester was 3.5: 80.3: 16.2.

生成物の10^-2 mol/L溶液を25 mL調製した後、これを蒸留水で適宜希釈し、10^-6〜10^-2mol/Lの溶液を調製した。自動表面張力計CBVP-A3型（協和界面科学株式会社）を用いて、これらの希釈液の表面張力を測定した。その結果、臨界ミセル濃度は8.7 x 10^-6 mol/Lであった。同様にして、ヒドロキシプロピル化β-CDオレイン酸エステル（表１５のアセトン中10日間反応物をヘキサン洗浄により未反応のオレイン酸を除去したもの）の臨界ミセル濃度は、1.3 x 10^-5 mol/Lであった。これらの値は、従来のショ糖脂肪酸モノエステルの臨界ミセル濃度と同レベルである。従って、ヒドロキシプロピル化マルトースオレイン酸モノエステルを主成分とする生成物は、ショ糖脂肪酸モノエステルと同等の機能、つまり、界面活性能を有し、乳化剤などとして食品添加物、界面活性剤、化成品などの分野に幅広く利用することができる。 After preparing 25 mL of a 10 ⁻² mol / L solution of the product, this was appropriately diluted with distilled water to prepare a solution of 10 ⁻⁶ to 10 ⁻² mol / L. The surface tension of these diluted solutions was measured using an automatic surface tension meter CBVP-A3 type (Kyowa Interface Science Co., Ltd.). As a result, the critical micelle concentration was 8.7 × 10 ⁻⁶ mol / L. Similarly, the critical micelle concentration of hydroxypropylated β-CD oleate (reacted product in acetone in Table 15 for 10 days with hexane washed to remove unreacted oleic acid) was 1.3 x 10 ^-5 mol / L. These values are at the same level as the critical micelle concentration of conventional sucrose fatty acid monoesters. Therefore, the product composed mainly of hydroxypropylated maltose oleic acid monoester has the same function as sucrose fatty acid monoester, that is, has a surface activity, and is used as a food additive, a surfactant, It can be widely used in the field of products.

（実施例１７）ヒドロキシプロピル化β-CDオレイン酸エステルとトリプトファンメチルの包接
3 mgのトリプトファンメチル（メチル基の水素3分子が重水素に置換、Trp-Me）、0.8 mgのβ-CD またはHP-β-CDまたはHP-β-CDオレイン酸エステル（表１５のアセトン中10日間反応物をヘキサン洗浄により未反応のオレイン酸を除去したもの）、および0.05 mLの水を混合した。 Example 17 Inclusion of Hydroxypropylated β-CD Oleate with Tryptophan Methyl
3 mg tryptophan methyl (3 hydrogen atoms in the methyl group are replaced by deuterium, Trp-Me), 0.8 mg β-CD or HP-β-CD or HP-β-CD oleate (in Table 15 in acetone) The reaction mixture was washed with hexane for 10 days to remove unreacted oleic acid), and 0.05 mL of water was mixed.

これらを、イオントラップ型LC-MS（Finnigan LCQ^DECA、Thermo Quest）で分析したところ、β-CDにおいては、β-CDとTrp-Meの包接物のナトリウムイオン付加分子[M+Na⁺]と水素イオン付加分子[M+H⁺]が、HP-β-CDにおいては、HP-β-CDとTrp-Meの包接物の水素イオン付加分子[M+H⁺]が、HP-β-CDオレイン酸エステルにおいては、HP-β-CDオレイン酸エステルとTrp-Meの包接物の水素イオン付加分子[M+H⁺]が、それぞれ確認された。 These were analyzed by ion trap LC-MS (Finnigan LCQ ^DECA , Thermo Quest). In β-CD, sodium ion addition molecule [M + Na ⁺ ] of inclusion of β-CD and Trp-Me hydrogen ion adduct molecules [M ⁺ H +] is in the HP-beta-CD, hydrogen ion adduct molecules of HP-beta-CD and inclusion of ^{Trp-Me [M + H +} ] is, HP-beta In -CD oleate, the hydrogen ion addition molecule [M + H ⁺ ] of the inclusion product of HP-β-CD oleate and Trp-Me was confirmed.

α-、β-、γ-シクロデキストリンは、その分子内にビタミンAやコエンザイムQ10などの各種機能性食品、ヨウ素などの各種抗菌剤、ワサビなどの各種食品フレーバー、プロスタグランジンなどの各種医薬品を包接することが分かっており、物質の安定化、徐放性、可溶化などの機能がある。シクロデキストリンに脂肪酸をエステル結合させることにより、両親媒性、つまり界面活性剤としての機能を持つようになる。従って、本実施例で得られた物質は、機能性物質の包接の機能と界面活性の機能を併せ持つ新規素材として期待できる。   α-, β-, and γ-cyclodextrins contain various functional foods such as vitamin A and coenzyme Q10 in the molecule, various antibacterial agents such as iodine, various food flavors such as wasabi, and various pharmaceuticals such as prostaglandins. It is known to be included, and has functions such as substance stabilization, sustained release, and solubilization. By esterifying a fatty acid to cyclodextrin, it becomes amphiphilic, that is, has a function as a surfactant. Therefore, the substance obtained in this example can be expected as a new material having both the inclusion function and the surface activity function of the functional substance.

本発明によれば、二糖または三糖以上のオリゴ糖混合物またはシクロデキストリン等の環状糖などの水酸基を予めヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾し、ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基修飾された糖類と脂肪酸とを混合し、温和な条件下で反応可能な酵素（リパーゼ）を反応させて、糖脂肪酸エステルの純度を制御するので、多様な糖脂肪酸エステルの適用分野に対応することができる。   According to the present invention, a hydroxyl group such as a disaccharide or a mixture of oligosaccharides of three or more sugars or a cyclic sugar such as cyclodextrin is previously modified with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group, and a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group is obtained. The modified sugar and fatty acid are mixed, and the enzyme (lipase) that can react under mild conditions is reacted to control the purity of the sugar fatty acid ester. Can do.

Claims (13)

糖脂肪酸エステルの合成方法であって、
（１）糖類の少なくとも１つの水酸基をヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基で修飾するために、エーテル化剤でエーテル化するエーテル化工程；および
（２）前記ヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基の少なくとも一つの水酸基と脂肪酸のカルボキシル基とを酵素を用いる脱水縮合によりエステル化する酵素エステル化反応工程
を含む、合成方法。 A method for synthesizing sugar fatty acid esters,
(1) an etherification step of etherification with an etherifying agent to modify at least one hydroxyl group of a saccharide with a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group; and (2) the hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group A synthetic method comprising an enzyme esterification reaction step of esterifying at least one hydroxyl group of the fatty acid and a carboxyl group of a fatty acid by dehydration condensation using an enzyme. 前記糖類の少なくとも１つの水酸基が糖類の６位の水酸基である、請求項１に記載の合成方法。   The synthesis method according to claim 1, wherein at least one hydroxyl group of the saccharide is a hydroxyl group at the 6-position of the saccharide. 前記糖類が、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオースからなる群より選択される二糖；グルコースが3〜10個結合したグルコオリゴ糖、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、もしくは単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖；またはシクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖からなる群より選択される環状糖もしくはこれらの環状糖の一分子にさらに上記オリゴ糖の一分子が結合した分岐環状糖である、請求項１に記載の合成方法。   The saccharide is a disaccharide selected from the group consisting of maltose, sucrose, lactose, cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose; glucooligosaccharide having 3 to 10 glucose bound thereto, fructo oligosaccharide having 3 to 10 fructose bound thereto, or An oligosaccharide in which one or more monosaccharides are mixed and bonded; or a cyclic sugar selected from the group consisting of cyclodextrin, cyclofructan and cyclic tetrasaccharide, or one molecule of these cyclic sugars and one oligosaccharide The synthesis method according to claim 1, which is a branched cyclic sugar to which molecules are bound. 前記エーテル化剤が、非置換もしくは１〜４個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されたエチレンオキシドまたはエチレンクロルヒドリンである、請求項１に記載の合成方法。   The synthesis method according to claim 1, wherein the etherifying agent is ethylene oxide or ethylene chlorohydrin which is unsubstituted or substituted with 1 to 4 alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms. 前記エーテル化剤が、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド（１,２−ブチレンオキシド、２,３−ブチレンオキシド、イソブチレンオキシド）、ペンチレンオキシド（２−プロピルエチレンオキシド、１−メチル−２−エチルエチレンオキシド、１−メチル−２,２−ジメチル−エチレンオキシド、２−エチル−２−メチル−エチレンオキシド、２−イソプロピルエチレンオキシド）およびエチレンクロルヒドリンからなる群より選択される、請求項１に記載の合成方法。   The etherifying agent is ethylene oxide, propylene oxide, butylene oxide (1,2-butylene oxide, 2,3-butylene oxide, isobutylene oxide), pentylene oxide (2-propylethylene oxide, 1-methyl-2-ethylethylene oxide, The synthesis method according to claim 1, which is selected from the group consisting of 1-methyl-2,2-dimethyl-ethylene oxide, 2-ethyl-2-methyl-ethylene oxide, 2-isopropylethylene oxide) and ethylene chlorohydrin. 前記脂肪酸が、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、イコサン酸、ドコサン酸、2-エチルヘキサン酸、3,5,5-トリメチルへキサン酸、イソステアリン酸、9-テトラデセン酸、2-ヘキサデセン酸、9-ヘキサデセン酸、9-オクタデセン酸（オレイン酸）、9,12-オクタデカンジエン酸（リノール酸）、6,9,12-オクタデカントリエン酸（α-リノレン酸）、γ-リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸からなる群より選択される炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸；または、ベンゼンカルボン酸（安息香酸）、3-フェニル-2-プロペン酸（ケイ皮酸）、ヒドロキシケイ皮酸、4-メトキシケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシケイ皮酸（カフェ酸）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸からなる群より選択される芳香族カルボン酸；またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。   The fatty acid is butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid (caprylic acid), nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), octadecanoic acid (stearic acid), icosanoic acid, docosanoic acid , 2-ethylhexanoic acid, 3,5,5-trimethylhexanoic acid, isostearic acid, 9-tetradecenoic acid, 2-hexadecenoic acid, 9-hexadecenoic acid, 9-octadecenoic acid (oleic acid), 9,12-octadecane From dienoic acid (linoleic acid), 6,9,12-octadecanetrienoic acid (α-linolenic acid), γ-linolenic acid, arachidonic acid, dihomo-γ-linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid An aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms selected from the group consisting of: benzenecarboxylic acid (benzoic acid), 3-phenyl-2-propenoic acid ( Cinnamic acid), hydroxycinnamic acid, 4-methoxycinnamic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, sinapinic acid The method of claim 1, which is an aromatic carboxylic acid; or a combination thereof. 前記酵素が、動物の膵臓由来リパーゼ；種子由来リパーゼ；またはカンジダ・アンタクティカ (Candida antarctica)由来のフラクションＡリパーゼ（CALA)もしくはフラクションＢリパーゼ（CALB)、カンジダ・ルゴザ (Candida rugosa)由来、ジオトリカム・カンジダム (Geotrichum candidum)由来、シュードモナス属 (Pseudomonas sp.)由来、シュードモナス・アエルギノザ (Pseudomonas aeruginosa)由来、ブルクホルデリア・セパシア (Burkholderia cepacia)由来、アルカリゲネス属 (Alcaligenes sp.)由来、セラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens)由来、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens)由来、リゾムコール・ミーヘイ (Rhizomucor miehei)由来、リゾプス・オリザエ (Rhizopus oryzae)由来、サーモミセス・ラヌギノザ (Thermomyces lanuginosa)由来、フザリウム・ヘテロスポラム (Fusarium heterosporum)由来、ペニシリウム・カマンベルティ (Penicillium camembertii)由来、アスペルギラス・ニガー (Aspergillus niger)由来、もしくはそれらと近縁の微生物由来のリパーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 The enzyme is an animal pancreatic lipase; a seed lipase; or a Candida antarctica fraction A lipase (CALA) or a fraction B lipase (CALB), a Candida rugosa Candida rugosa , Geotricum candidum ( Geotrichum candidum ), Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa , Burkholderia cepacia , Alcaligenes sp., Serratia marcescen ) derived from Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) derived from Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei) derived from Rhizopus oryzae (Rhizopus oryzae) origin, derived from thermo Mrs. Ranuginoza (Thermomyces lanuginosa), Fusarium f Rosuporamu (Fusarium heterosporum) derived from Penicillium Kaman Berti (Penicillium camembertii) derived from Aspergillus niger (Aspergillus niger) derived or selected from the group consisting of lipases derived from microorganisms of them closely related, according to claim 1 Method. 請求項１〜７いずれかに記載の方法により得ることができる糖脂肪酸エステルを含む組成物。   A composition comprising a sugar fatty acid ester obtainable by the method according to claim 1. 糖類の少なくとも１つの水酸基を修飾するヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基の少なくとも１つの水酸基と脂肪酸のカルボキシル基とのエステル結合を有する糖脂肪酸エステルを含む組成物。   A composition comprising a sugar fatty acid ester having an ester bond between at least one hydroxyl group of a hydroxy-terminated (poly) oxyalkylene group that modifies at least one hydroxyl group of a saccharide and a carboxyl group of a fatty acid. 前記糖類の少なくとも１つの水酸基が糖類の６位の水酸基である、請求項９に記載の組成物。   The composition according to claim 9, wherein at least one hydroxyl group of the saccharide is a hydroxyl group at the 6-position of the saccharide. 前記糖脂肪酸エステルが、一般式（１）：

｛式中、Ｓは、糖類の少なくとも１つの水酸基を除いた残基を示し、ｍは１〜ｐの整数を示し、かつ、ｐは前記糖類が有する水酸基の最大個数を示し、ｍ個のＸは、それぞれ独立して、一般式（２）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈまたは炭素数１〜３のアルキル基を示し、ｎは１〜６の整数を示す。）で表されるヒドロキシ終端型（ポリ）オキシアルキレン基；または一般式（３）：

［Ｒ^５は炭素数４〜２２の脂肪酸からカルボキシル基を除いた残基を示し、Ｌは、存在しないか、または、独立して、一般式（４）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈまたは炭素数１〜３のアルキル基を示し、ｎは１〜６の整数を示す。）で表される（ポリ）オキシアルキレン基のリンカーを示す。］で表される基である。ただし、少なくとも１つのＸは、一般式（３）で表される基であり、かつ、少なくとも１つのＬは前記（ポリ）オキシアルキレン基のリンカーである。｝で表される、請求項９または１０に記載の組成物。 The sugar fatty acid ester is represented by the general formula (1):

{In the formula, S represents a residue obtained by removing at least one hydroxyl group of a saccharide, m represents an integer of 1 to p, and p represents the maximum number of hydroxyl groups of the saccharide, and m X Are each independently a general formula (2):

(Wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ independently represent H or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 6). Terminal (poly) oxyalkylene group; or general formula (3):

[R ⁵ represents a residue obtained by removing a carboxyl group from a fatty acid having 4 to 22 carbon atoms, and L is absent or, independently, represented by the general formula (4):

(Wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ independently represent H or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 6) ( The linker of a poly) oxyalkylene group is shown. ]. However, at least one X is a group represented by the general formula (3), and at least one L is a linker of the (poly) oxyalkylene group. } The composition of Claim 9 or 10 represented by these. 前記糖類が、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、キシロビオース、メリビオースからなる群より選択される二糖；グルコースが3〜10個結合したグルコオリゴ糖、フラクトースが3〜10個結合したフラクトオリゴ糖、もしくは単糖が１種類もしくは複数種類混合して結合したオリゴ糖；またはシクロデキストリン、シクロフラクタン、環状四糖からなる群より選択される環状糖もしくはこれらの環状糖の一分子にさらに上記オリゴ糖の一分子が結合した分岐環状糖である、請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。   The saccharide is a disaccharide selected from the group consisting of maltose, sucrose, lactose, cellobiose, trehalose, xylobiose, melibiose; glucooligosaccharide having 3 to 10 glucose bound thereto, fructo oligosaccharide having 3 to 10 fructose bound thereto, or An oligosaccharide in which one or more monosaccharides are mixed and bonded; or a cyclic sugar selected from the group consisting of cyclodextrin, cyclofructan and cyclic tetrasaccharide, or one molecule of these cyclic sugars and one oligosaccharide The composition according to any one of claims 9 to 11, which is a branched cyclic sugar to which molecules are bound. 前記脂肪酸が、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、イコサン酸、ドコサン酸、2-エチルヘキサン酸、3,5,5-トリメチルへキサン酸、イソステアリン酸、9-テトラデセン酸、2-ヘキサデセン酸、9-ヘキサデセン酸、9-オクタデセン酸（オレイン酸）、9,12-オクタデカンジエン酸（リノール酸）、6,9,12-オクタデカントリエン酸（α-リノレン酸）、γ-リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸からなる群より選択される炭素数4〜22の脂肪族カルボン酸；または、ベンゼンカルボン酸（安息香酸）、3-フェニル-2-プロペン酸（ケイ皮酸）、ヒドロキシケイ皮酸、4-メトキシケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシケイ皮酸（カフェ酸）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸からなる群より選択される芳香族カルボン酸；またはそれらの組合せである、請求項９〜１２のいずれかに記載の組成物。   The fatty acid is butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid (caprylic acid), nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), octadecanoic acid (stearic acid), icosanoic acid, docosanoic acid , 2-ethylhexanoic acid, 3,5,5-trimethylhexanoic acid, isostearic acid, 9-tetradecenoic acid, 2-hexadecenoic acid, 9-hexadecenoic acid, 9-octadecenoic acid (oleic acid), 9,12-octadecane From dienoic acid (linoleic acid), 6,9,12-octadecanetrienoic acid (α-linolenic acid), γ-linolenic acid, arachidonic acid, dihomo-γ-linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid An aliphatic carboxylic acid having 4 to 22 carbon atoms selected from the group consisting of: benzenecarboxylic acid (benzoic acid), 3-phenyl-2-propenoic acid ( Cinnamic acid), hydroxycinnamic acid, 4-methoxycinnamic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, sinapinic acid The composition according to any one of claims 9 to 12, which is an aromatic carboxylic acid; or a combination thereof.