JP2013203733A

JP2013203733A - DETECTION OF INFECTION WITH DIROFILARIA IMMITIS USING DIROFILARIA IMMITIS 22 kDa PROTEIN

Info

Publication number: JP2013203733A
Application number: JP2012077977A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Imanishi; 重雄今西; Yoshiya Yoshida; 芳哉吉田; Akira Majima; 景馬嶋; Atsushi Kobayashi; 淳小林; Kazuhide Nakagaki; 和英中垣; Sadao Nogami; 貞雄野上
Original assignee: BACULOTECHNOLOGIES CO Ltd; SHIMA KENKYUSHO KK; Nihon University; National Institute of Agrobiological Sciences; Nippon Medical School Foundation
Current assignee: BACULOTECHNOLOGIES CO Ltd; SHIMA KENKYUSHO KK; Nihon University; National Institute of Agrobiological Sciences; Nippon Medical School Foundation
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-10-07

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection method of infection with Dirofilaria immitis using a Dirofilaria immitis 22 kDa protein as a marker, and an antibody for Dirofilaria immitis 22 kDa protein used for the detection.SOLUTION: An antibody for the Dirofilaria immitis 22 kDa protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID 2, and a detection method of infection with Dirofilaria immitis including measuring the Dirofilaria immitis 22 kDa protein or anti-Dirofilaria immitis 22 kDa protein antibody in dog blood are provided.

Description

本発明は、イヌ糸状虫感染犬血液中に存在するイヌ糸状虫（犬糸状虫：イヌシジョウチュウ、Dirofilaria immitis）由来ヒトフィラリア（Brugia malayi）small heat shock protein類似タンパク質（22kDaタンパク質）を検出することを特徴とするイヌ糸状虫感染検査法に係わる。さらに、本発明は、前記22 kDaタンパク質に対する抗体を用いて血液中の該タンパク質を検出することを特徴とする。 The present invention detects a human filaria (Brugia malayi) small heat shock protein-like protein (22 kDa protein) derived from a dog filamentous worm (Dirofilaria immitis) present in dog blood infected with a dog filamentous worm. The present invention relates to a method for inspecting canine filamentous infection. Furthermore, the present invention is characterized in that the protein in blood is detected using an antibody against the 22 kDa protein.

イヌ糸状虫（犬糸状虫：イヌシジョウチュウ、Dirofilaria immitis）はイヌ科やネコ科動物の心臓の右心房と肺動脈に寄生し、寄生された動物は、心臓や肺のみでなく肝臓、腎臓等に種々の異常をきたすイヌ糸状虫症を発症する。糸状虫は感染宿主動物の血液中にミクロフィラリアと呼ばれる子虫を産み、ミクロフィラリアは２ヶ月ほどで2cm前後の体長の幼虫となり、血液から心臓や肺動脈に移動する。従来はイヌ糸状虫感染を診断するためには、血液中にミクロフィラリアが存在するかを顕微鏡を用いて検査していた。しかし、この方法では、成虫がミクロフィラリアを産み出していないときには診断ができなかった。また、血液中のイヌ糸状虫に対する抗体を検出することにより感染を診断する方法もあったが、糸状虫が感染していても陽性にならないことがあった。 Dog filamentous worms (Dirofilaria immitis) parasitize the right atrium and pulmonary artery of the heart of canines and felines, and parasitized animals not only in the heart and lungs but also in the liver, kidneys, etc. Canine filariasis causes various abnormalities. Filamentous worms produce microfilariae called microfilariae in the blood of infected host animals. Microfilariae become larvae with a body length of about 2 cm in about two months, and move from the blood to the heart and pulmonary arteries. Conventionally, in order to diagnose canine filamentous infection, the presence of microfilariae in the blood was examined using a microscope. However, this method failed to diagnose when the adults did not produce microfilariae. There was also a method of diagnosing infection by detecting antibodies against canine filamentous worms in the blood, but there were cases in which the infection was not positive even if the filamentous worms were infected.

さらに、血液中に抗原が放出している抗原を検出することにより感染を診断する方法もあった。例えば、DiT33タンパク質を検出する方法（特許文献１を参照）やDi33タンパク質を検出する方法（特許文献２を参照）等が報告されていた。 There has also been a method of diagnosing infection by detecting an antigen released in the blood. For example, a method for detecting DiT33 protein (see Patent Document 1), a method for detecting Di33 protein (see Patent Document 2), and the like have been reported.

特表平11-503609号公報Japanese National Publication No.11-503609 特表平2001-502896号公報Japanese National Patent Publication No. 2001-502896

本発明は、イヌ糸状虫22kDaタンパク質をマーカーとして用いるイヌ糸状虫感染の検出法、および該検出に用いるイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for detecting a canine filamentous worm infection using the canine filamentous worm 22 kDa protein as a marker, and an antibody against the canine filamentous worm 22 kDa protein used for the detection.

上記のように、イヌ糸状虫（犬糸状虫：イヌシジョウチュウ、Dirofilaria immitis）感染犬の血清中にはイヌ糸状虫由来タンパク質が存在すると考えられ、従って当該タンパク質のいずれかを検出することによりイヌ糸状虫感染の有無を調べることができる可能性がある。しかし、数万種あるイヌ糸状虫由来タンパク質のうちのどのタンパク質を検出することによって実用的な感染検査法が開発できるかをあらかじめ予測することはできない。あるいは、それを知るためには本発明の開発過程と同程度の多大な試行錯誤が必要である。 As described above, it is considered that a protein derived from canine filamentous worms is present in the serum of dogs infected with canine filamentous worms (Dirofilaria immitis), and therefore, by detecting any of these proteins, It may be possible to check for the presence of filamentous infection. However, it is impossible to predict in advance which one of the tens of thousands of canine filamentous worm-derived proteins can be developed by detecting a practical infection test method. Alternatively, in order to know this, a great deal of trial and error similar to the development process of the present invention is required.

本発明者らは、イヌの寄生虫であるイヌ糸状虫の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)からcDNAライブラリーを作製し、そこから昆虫細胞内で発現可能な配列を有する（開始コドンを有する）約400クローンを選抜した。それらをそれぞれ一過性発現ベクター（pA3hr5GW）とカイコ培養細胞株NIAS-Bm-Ke17の系で発現し、発現されたタンパク質についてイヌ糸状虫感染犬血清を用いたウエスタンブロット解析を行い、ウサギ抗イヌ糸状虫特異ポリクローナル抗体と特異的に反応するタンパク質を発現するクローンを４クローン選抜した。このうちでもっとも反応性の高かった、22kDaのタンパク質をコードするcDNAクローン（BmGWNo.122）を選び、感染検査のための陽性抗原候補とした。ついで、該タンパク質の大量発現のため、発現用バキュロウイルスベクター（pBmGW）およびNIAS-Bm-Ke17細胞の系により、22 kDaタンパク質を発現させ、ウサギおよびマウスに免疫して、ウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体を作製した。 The present inventors made a cDNA library from the fifth stage larvae (immature adults) and adult adult worms of the canine filamentous worms, from which insect intracellular About 400 clones having a sequence that can be expressed in (having a start codon) were selected. They were expressed in the transient expression vector (pA3hr5GW) and the silkworm cultured cell line NIAS-Bm-Ke17, respectively, and the expressed proteins were subjected to Western blot analysis using canine silkworm-infected dog sera, and rabbit anti-dogs were analyzed. Four clones expressing a protein that specifically reacts with a filamentous insect-specific polyclonal antibody were selected. Among these, the cDNA clone (BmGWNo.122) encoding the 22 kDa protein, which had the highest reactivity, was selected and used as a positive antigen candidate for the infection test. Then, for the large-scale expression of the protein, a 22 kDa protein was expressed by the baculovirus vector for expression (pBmGW) and the NIAS-Bm-Ke17 cell system, and rabbits and mice were immunized with rabbit polyclonal antibodies and mouse monoclonals. Antibodies were made.

本発明者らは、前記ウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA検査系を作製した。この検査系および市販のイヌ糸状虫感染検出キット（IDEXX）を用いて、イヌ糸状虫を人工的に実験感染したビーグル犬の血清を検査したところ、本発明の検査系によれば５頭中５頭が陽性と判定されたが、市販の検出キットでは５頭中４頭のみが陽性と判定されるに過ぎなかった。また、市販キットで陽性および陰性と判定された血清（それぞれ３１検体）について本発明の検査系で調べたところ、両検査法による判定結果は一致した。以上の結果から、イヌ糸状虫の22kDaタンパク質をマーカーとして利用する本発明の検査系が、市販の検出キットと比較して同等以上の性能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors prepared a sandwich ELISA test system using the rabbit polyclonal antibody and mouse monoclonal antibody. Using this test system and a commercially available canine filamentous infection detection kit (IDEXX), the serum of a beagle dog artificially infected with a dog filamentous insect was tested. According to the test system of the present invention, 5 out of 5 animals were tested. Although the head was determined to be positive, only 4 out of 5 were determined to be positive in the commercially available detection kit. Moreover, when the test system of this invention was investigated about the serum (each 31 samples) determined to be positive and negative with the commercial kit, the determination result by both test methods corresponded. From the above results, it has been found that the test system of the present invention using the 22 kDa protein of canine filamentous worm as a marker has equivalent or better performance than a commercially available detection kit, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体。
[２] モノクローナル抗体である、[１]のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体。
[３] [１]または[２]のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体を用いて、イヌ血液中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を測定することにより、イヌ糸状虫感染を検出する方法。
[４] イヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を用いて、イヌ血液中の抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を測定することにより、イヌ糸状虫感染を検出する方法。
[５] [１]または[２]のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体を含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。
[６] イヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。
[７] イヌ糸状虫22kDaタンパク質からなる、イヌ糸状虫感染を検出するための診断用マーカー。
[８] イヌ糸状虫22kDaタンパク質の、イヌ糸状虫感染を検出するための、検出用マーカーとしての使用。 That is, the present invention is as follows.
[1] An antibody against a canine filamentous worm 22 kDa protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[2] An antibody against the canine filamentous worm 22 kDa protein of [1], which is a monoclonal antibody.
[3] A method for detecting canine filamentous insect infection by measuring the canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof in dog blood using the antibody against the canine filamentous 22 kDa protein of [1] or [2].
[4] A method for detecting canine filamentous infection by measuring an anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody in canine blood using a canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof.
[5] A kit for detecting canine filamentous infection, comprising an antibody against the canine filamentous 22 kDa protein of [1] or [2].
[6] A kit for detecting canine filamentous infection, comprising a canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof.
[7] A diagnostic marker for detecting canine filamentous infection, comprising a 22 kDa protein of the canine filamentous worm.
[8] Use of canine filamentous worm 22 kDa protein as a detection marker for detecting canine filamentous infection.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質は、イヌ糸状虫に感染したイヌにおいて、感染から比較的早期の段階で、イヌ糸状虫で発現される。その結果、比較的早期の段階で、イヌ糸状虫22kDaタンパク質はイヌ血液内に存在する。また、イヌ糸状虫22kDaタンパク質は、イヌ血液中で抗体が結合していないフリーの抗原として存在する。そのため、in vitroで抗原抗体反応を利用して測定する場合、測定用抗体が結合する抗原決定基がイヌ抗体でブロックされることがないので、測定用抗体を利用して確実に正確に高感度で測定することができる。このように、イヌ糸状虫22kDaタンパク質をマーカーとして利用した場合、感染から比較的早期の段階で高感度でイヌ糸状虫の感染を検出することができる。 The canine filamentous 22 kDa protein is expressed in canine filamentous worms at a relatively early stage after infection in dogs infected with canine filamentous worms. As a result, the canine filamentous 22 kDa protein is present in canine blood at a relatively early stage. In addition, the canine filamentous worm 22 kDa protein exists as a free antigen to which no antibody is bound in dog blood. Therefore, when measuring using an antigen-antibody reaction in vitro, the antigenic determinant to which the antibody for measurement binds is not blocked by the canine antibody. Can be measured. Thus, when the canine filamentous worm 22 kDa protein is used as a marker, canine filamentous worm infection can be detected with high sensitivity at a relatively early stage after infection.

経時的感染血清のイヌ糸状虫抗原に対する抗体価の推移を示す図である。It is a figure which shows transition of the antibody titer with respect to the canine filamentous antigen of a time-dependent infected serum. イヌ糸状虫抗原（22kDaタンパク質）のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the western blot analysis of a dog filamentous worm antigen (22kDa protein). 抗イヌ糸状虫抗原（22kDaタンパク質）モノクローナル抗体の検定の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the test of an anti- canine filamentous worm antigen (22kDa protein) monoclonal antibody. ELISAキットによる人工感染犬経時血清中のイヌ糸状虫関連抗原検出の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of canine filamentous insect related antigen detection in artificially infected dog time-lapse serum by ELISA kit.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はイヌ糸状虫（犬糸状虫：イヌシジョウチュウ、Dirofilaria immitis）に存在する22kDaタンパク質に対する抗体である。該22kDaタンパク質はイヌ糸状虫の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)が有しており、該タンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号１に示し、該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。該22kDaタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトフィラリア（Brugia malayi）のsmall heat shock protein Ov25-1 Bm1_14535とDNAレベルで82.68%、アミノ酸レベルで87.15％の相同性を有する。従って、イヌ糸状虫の22kDaタンパク質を、イヌ糸状虫由来ヒトフィラリアsmall heat shock protein類似タンパク質（22kDa）ともいう。以下においては、該タンパク質をイヌ糸状虫22kDaタンパク質と呼ぶ。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is an antibody against a 22 kDa protein present in canine filamentous worms (canine filamentous worms: Dirofilaria immitis). The 22 kDa protein is present in the fifth stage larvae (immature adult) and adult adult worms of the dog filamentous worm, and the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 2. The gene encoding the 22 kDa protein has a homology of 82.68% at the DNA level and 87.15% at the amino acid level with the small heat shock protein Ov25-1 Bm1_14535 of human filaria (Brugia malayi). Accordingly, the 22 kDa protein of the dog filamentous worm is also referred to as a human filaria small heat shock protein-like protein (22 kDa) derived from the canine filamentous worm. In the following, the protein is referred to as the canine filamentous 22 kDa protein.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質をコードするDNAは、配列番号１に示される各塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、あるいは、配列番号１に示される塩基配列と、BLAST、FASTAなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する。）を用いて計算したときに、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するDNA、あるいは、これらのDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１もしくは複数、好ましくは1もしくは数個、例えば、１〜10個、好ましくは１〜7個、さらに好ましくは１〜5個、さらに好ましくは１〜3個、さらに好ましくは1個もしくは2個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAも含む。また、イヌ糸状虫22kDaタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数、好ましくは1もしくは数個、例えば、１〜10個、好ましくは1〜7個、さらに好ましくは１〜5個、さらに好ましくは１〜3個、さらに好ましくは1個もしくは2個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と、BLAST、FASTAなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する。）を用いて計算したときに、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも97％、98％もしくは99％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を有するものも含む。 DNA encoding the canine filamentous worm 22 kDa protein is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence complementary to each base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the base shown in SEQ ID NO: 1 At least 60%, at least 70%, at least 80% when calculated using sequences and known algorithms for homology searches such as BLAST, FASTA (eg, using default or default parameters) DNA having at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, particularly preferably at least 97%, 98% or 99% sequence identity, or the amino acids of the proteins encoded by these DNAs 1 or more, preferably 1 or several, for example 1 to 10, preferably 1 to 7, and more It also includes DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence preferably having 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids deleted, substituted, inserted and / or added. . In addition, the canine filamentous 22 kDa protein has one or more, preferably 1 or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2. More preferably, 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, or the amino acid sequence and homology search such as BLAST and FASTA At least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, preferably at least 90%, when calculated using known algorithms for (e.g., using default or default parameters) More preferably having an amino acid sequence having at least 95%, particularly preferably at least 97%, 98% or 99% sequence identity Including.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質はイヌにおけるイヌ糸状虫の感染を検出するためのマーカーとなり、イヌ生体試料中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質を測定してもよいし、イヌ生体試料中の抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を測定してもよい。 Canine filamentous worm 22kDa protein can be used as a marker for detecting canine filamentous worm infection in dogs. Canine filamentous worm 22kDa protein can be measured in canine biological samples, or canine filamentous worm 22kDa protein in canine biological samples Antibodies may be measured.

イヌ糸状虫は、蚊を媒介として感染し、感染イヌ宿主の血液中にミクロフィラリア（第１期幼虫（Ｌ１））と呼ばれる子虫を産み、ミクロフィラリアはイヌ血液中に潜んでいる。イヌが蚊に吸血されるとミクロフィラリアは蚊の体内に移動し、蚊の体内で２回脱皮し、感染幼虫である体長約１mmの第３期幼虫（Ｌ３）へと成長する。第３期幼虫を持つ蚊がイヌを吸血するときに第３期幼虫は蚊の刺した傷からイヌの体内へ移動する。イヌの体内に入った第３期幼虫はイヌの皮下組織等に潜み、そこで２回脱皮し、感染後約２ヶ月で第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）となる。第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）はさらに約１〜２ヶ月で静脈を通ってイヌの心臓に移動し、肺動脈に定着し、感染から約６〜７ヶ月で成熟し成虫となり、雌雄が揃えば、ミクロフィラリアを産む。 Dog filamentous worms are transmitted through mosquitoes as a vector, and larvae called microfilariae (first stage larvae (L1)) are born in the blood of infected dog hosts, and microfilariae lurk in dog blood. When the dog is sucked by mosquitoes, microfilariae move into the mosquito body, molt twice in the mosquito body, and grow into a third stage larva (L3) having a body length of about 1 mm, which is an infected larva. When a mosquito having a third stage larva sucks a dog, the third stage larva moves from the wound of the mosquito into the dog's body. The third stage larvae that entered the dog's body lurk in the dog's subcutaneous tissue, etc., where they molt twice and become the fifth stage larvae (immature adults) approximately two months after infection. The fifth stage larvae (immature adults) move through the veins to the dog's heart in about 1-2 months, settle in the pulmonary artery, mature and become adults in about 6-7 months after infection, If you have, you will produce microfilariae.

本発明でイヌ糸状虫感染のマーカーとして用いるイヌ糸状虫の22kDaタンパク質は、cDNAライブラリーの解析から、感染後150日程度の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)において発現していた。従来のイヌ糸状虫の感染の検出において、マーカーとして用いられていた抗原は感染後190〜200日程度の成虫でのみ発現しているので、感染後190〜200日程度経過しないと測定することはできなかった。イヌ糸状虫22kDaタンパク質は上記のように感染後150日程度の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟成虫(adult worms)において発現し、発現した糸状虫22kDaタンパク質は第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟成虫(adult worms)から放出され、イヌ血液中に存在する。そのため、糸状虫22kDaタンパク質をマーカーとして用いた場合、成熟以前の比較的早期にイヌ糸状虫の感染を検出することができる。 The 22 kDa protein of canine filamentous worms used as a marker of canine filamentous worm infection in the present invention was analyzed from a cDNA library, and the fifth larvae (immature adult) and adult female (female) about 150 days after infection. It was expressed in adult worms). In the detection of conventional canine filamentous infection, since the antigen used as a marker is expressed only in adults about 190 to 200 days after infection, it can be measured that about 190 to 200 days have not passed since infection. could not. As described above, the canine filamentous 22 kDa protein is expressed in the fifth stage larvae (immature adults) and adult worms about 150 days after infection, and the expressed filamentous 22 kDa protein is the fifth stage larvae. Released from (immature adult) and adult worms and present in dog blood. Therefore, when the filamentous worm 22 kDa protein is used as a marker, it is possible to detect canine filamentous infection at a relatively early stage before maturation.

また、イヌ糸状虫の22kDaタンパク質は、イヌ血液中において抗体と結合せず遊離の状態で存在し得る。イヌ血液中の抗原を抗原抗体反応を利用してin vitroで測定しようとする場合、測定試薬として作製した該抗原に対する抗体がin vitroで抗原と結合する必要がある。しかしながら、測定しようとする抗原にイヌ血液中でイヌ抗体が結合すると、抗原と抗体の複合体を形成し、該抗原の抗原決定基（エピトープ）がブロックされるので、in vitroで測定に用いようとする抗体が測定しようとする抗原に結合することができない。この結果、抗原に対する抗体を用いて抗原抗体反応を利用した測定が困難になる。特に、抗原上の複数の抗原決定基を利用して測定を行うサンドイッチアッセイの実施が困難になる。 Also, the 22 kDa protein of canine filamentous worms can exist in a free state without binding to antibodies in dog blood. When an antigen in dog blood is to be measured in vitro using an antigen-antibody reaction, an antibody against the antigen prepared as a measurement reagent needs to bind to the antigen in vitro. However, when a canine antibody binds to the antigen to be measured in dog blood, a complex of the antigen and the antibody is formed and the antigenic determinant (epitope) of the antigen is blocked. Antibody cannot bind to the antigen to be measured. As a result, measurement using an antigen-antibody reaction using an antibody against the antigen becomes difficult. In particular, it becomes difficult to perform a sandwich assay in which measurement is performed using a plurality of antigenic determinants on an antigen.

本発明でマーカーとして用いるイヌ糸状虫22kDaタンパク質はイヌ血液中で抗原決定基をブロックされることなく、フリーの状態で存在する。その結果、22kDaタンパク質に測定用抗体が結合し、正確に高感度で測定することができる。 The dog filamentous 22 kDa protein used as a marker in the present invention exists in a free state without blocking an antigenic determinant in dog blood. As a result, the antibody for measurement binds to the 22 kDa protein, and measurement can be performed accurately with high sensitivity.

イヌ糸状虫の22kDaタンパク質は、上記の塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法によりリコンビナントタンパク質として作製することができ、抗体の作製のための免疫原として用いることができる。また、上記のアミノ酸配列情報に基づいて、全長タンパク質または全長タンパク質の部分断片を合成し、免疫原として用いることもできる。また、イヌ糸状虫から抽出することもできる。 The canine filamentous 22 kDa protein can be prepared as a recombinant protein by genetic engineering techniques based on the above base sequence information, and can be used as an immunogen for the production of antibodies. Further, based on the above amino acid sequence information, a full-length protein or a partial fragment of the full-length protein can be synthesized and used as an immunogen. It can also be extracted from dog filamentous worms.

イヌ糸状虫の22kDaタンパク質を測定するための抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は、22kDaタンパク質をマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヌートリア、モルモット、ヒツジ、ブタ、ウマ等の動物に投与することにより作製することができる。モノクローナル抗体も例えば、ケーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975）等の公知の方法により作製し得る。例えば、イヌ糸状虫22kDaタンパク質で免疫したマウスの脾細胞またはリンパ節細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの培養上清または該ハイブリドーマを腹腔内に投与したマウスの腹水から調製することができる。被免疫動物は、マウスに限定されずラット、モルモット等も利用可能である。ミエローマ細胞は、一般に被免疫動物と同種の動物より得られたものを用いるが、異種間でも可能な場合がある。また、免疫されていない動物の脾細胞またはリンパ節をin vitroで免疫して、感作細胞を得ることもできる。ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法で実施することができ、例えばELISA法、ウエスタンブロット法等が利用できる。ハイブリドーマ上清またはマウス腹水からのモノクローナル抗体の調製は、当業者に知られた免疫グロブリン精製法を用いればよく、例えば、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過等により行うことができる。 The antibody for measuring the 22 kDa protein of the dog filamentous worm may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Polyclonal antibodies can be produced by administering 22 kDa protein to animals such as mice, rats, rabbits, goats, nutria, guinea pigs, sheep, pigs, horses and the like. Monoclonal antibodies can also be produced by known methods such as the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975). For example, a hybridoma obtained by cell fusion of a mouse spleen cell or lymph node cell immunized with a canine filamentous 22 kDa protein and a mouse myeloma cell was prepared, and the culture supernatant of the hybridoma or the hybridoma was administered intraperitoneally It can be prepared from mouse ascites. Immunized animals are not limited to mice, and rats, guinea pigs, and the like can also be used. Myeloma cells are generally obtained from the same species as the immunized animal, but may be possible between different species. Sensitized cells can also be obtained by immunizing in vitro spleen cells or lymph nodes of non-immunized animals. Hybridoma screening can be performed by various immunochemical methods such as ELISA and Western blotting. For preparation of monoclonal antibodies from hybridoma supernatant or mouse ascites, immunoglobulin purification methods known to those skilled in the art may be used, for example, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, etc. be able to.

本発明で用いる抗体は、完全抗体であっても、Fab、Fab’、F(ab‘)₂、Fv等の抗原結合部位を有するフラグメントであってもよい。あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、イヌ糸状虫の22kDaタンパク質に特異的なこれらの断片をも包含する。これらの断片の調製方法はこの分野において周知である。このようにして得られた抗体を用いて、イヌ生体試料中のイヌ糸状虫の22kDaタンパク質の濃度を測定（定量）することができる。イヌ生体試料としては、血漿、血清、全血等を用いることができる。 The antibody used in the present invention may be a complete antibody or a fragment having an antigen binding site such as Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ and Fv. Alternatively, it may be a recombinant antibody such as scFv, dsFv, diabody or minibody expressed as a recombinant. In the context of the present invention, the term “antibody” also encompasses those fragments specific for the canine filamentous 22 kDa protein. Methods for preparing these fragments are well known in the art. The antibody thus obtained can be used to measure (quantify) the concentration of the 22 kDa protein of the dog filamentous worm in the canine biological sample. As the canine biological sample, plasma, serum, whole blood or the like can be used.

測定は、ELISAなどの酵素免疫測定法（EIA）、放射線免疫測定法（RIA）、蛍光抗体法、凝集反応を利用した方法、イムノクロマトグラフィー法等の当業者に知られた方法により行うことができる。これらの方法は抗原抗体反応を利用した測定法の一例であり、これらの方法には限定されず、抗原抗体反応を利用したあらゆる測定法を適用することができる。 The measurement can be performed by methods known to those skilled in the art such as enzyme immunoassay (EIA) such as ELISA, radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, method utilizing agglutination, and immunochromatography. . These methods are examples of measuring methods using antigen-antibody reaction, and are not limited to these methods, and any measuring method using antigen-antibody reaction can be applied.

例えば、ELISAにおいては、抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体をマイクロタイタープレート等の担体に物理吸着や化学結合により固相化する。固相化量は、特に限定されないが、担体がマイクロタイタープレートの場合、1ウェル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切なバッファーに溶解し、担体と接触させ行うことができる。例えば、マイクロタイターウェルを用いる場合、抗体溶液をマイクロタイタープレートのウェルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。基質を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。次いで、固相化担体とサンプルを反応させ、洗浄後、標識した抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を反応させる。標識は、β-D-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼやグルコースオキシダーゼ等の酵素を用いて行うことができる。また、この際、抗体をビオチンで標識し、さらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させることもできる。次いで、酵素に対応した基質を反応させ、発色を測定することによりサンプル中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質を定量することができる。ELISAにおいては、多数のウェル（例えば、96穴）を有するマイクロタイタープレートに基質を固相化させ、ウェル中で抗原抗体反応を行わせることにより一度に大量測定が可能になる。また、全自動EIA測定装置などの自動測定機器を用いることも可能になる。 For example, in ELISA, an anti-canine filamentous worm 22 kDa protein antibody is immobilized on a carrier such as a microtiter plate by physical adsorption or chemical bonding. The amount of the solid phase is not particularly limited, but when the carrier is a microtiter plate, it is preferably several ng to several tens of μg per well. Immobilization can be carried out by dissolving the antibody to be immobilized in an appropriate buffer and bringing it into contact with a carrier. For example, when microtiter wells are used, the antibody solution can be solidified by dispensing into a well of a microtiter plate and placing it for a certain period of time. After immobilizing the substrate, blocking is preferably performed using a blocking solution containing bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin and the like in order to prevent non-specific binding during the assay. Next, the immobilized carrier and the sample are reacted, and after washing, a labeled anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody is reacted. The labeling can be performed using an enzyme such as β-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. At this time, the antibody can be labeled with biotin, and enzyme-labeled streptavidin can be further bound thereto. Next, the canine filamentous 22 kDa protein in the sample can be quantified by reacting a substrate corresponding to the enzyme and measuring the color development. In ELISA, a substrate can be immobilized on a microtiter plate having a large number of wells (for example, 96 wells), and an antigen-antibody reaction can be carried out in the wells, thereby enabling mass measurement at a time. It is also possible to use an automatic measuring device such as a fully automatic EIA measuring device.

凝集反応を利用した方法は、粒子に結合した抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体と検体試料とを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてイヌ糸状虫22kDaタンパクを測定する。該方法において用いられる粒子としては、直径0.05〜10μmの、好ましくは直径0.1〜0.4μmのラテックス、直径0.5〜10μmのゼラチン粒子および動物赤血球を挙げることができる。粒子への抗体の結合方法は、この分野において周知であり、物理吸着あるいは共有結合のどちらの結合様式も適応可能である。 In the method using the agglutination reaction, the anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody bound to the particle is reacted with the specimen sample to cause the agglutination reaction, and then the canine filamentous 22 kDa protein is converted based on the degree of aggregation obtained. taking measurement. Examples of the particles used in the method include latex having a diameter of 0.05 to 10 μm, preferably 0.1 to 0.4 μm, gelatin particles having a diameter of 0.5 to 10 μm, and animal erythrocytes. Methods for conjugating antibodies to particles are well known in the art, and either physisorption or covalent conjugation modes can be applied.

該方法において、粒子上に抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体が結合されている粒子と検体試料とを、例えば、黒色のスライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無を観察することにより検体試料中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質を検出することができる。また、この凝集の吸光度測定によりイヌ糸状虫22kDaタンパク質を定量することもできる。更にまた、Pulse Immunoassayにより検出することも可能である。 In this method, by mixing particles on which anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody is bound on a particle and a specimen sample, for example, on a black slide glass, and observing the presence or absence of particles that aggregate and precipitate Canine filamentous worm 22 kDa protein can be detected in the specimen sample. The canine filamentous worm 22 kDa protein can also be quantified by measuring the absorbance of this aggregation. Furthermore, it is also possible to detect by Pulse Immunoassay.

凝集反応は、スライドグラス、96ウェル平底プレート、96ウェルU底プレート、96ウェルV底プレート等を用いて行わせることができる。また、凝集反応を行わせる際に、非特異的な反応を抑制するために、TritonX-100、Tween20、Tween80等の適当な界面活性剤を添加してもよい。 The agglutination reaction can be performed using a slide glass, a 96 well flat bottom plate, a 96 well U bottom plate, a 96 well V bottom plate, or the like. In addition, when performing the agglutination reaction, an appropriate surfactant such as Triton X-100, Tween 20, or Tween 80 may be added in order to suppress non-specific reactions.

凝集の有無は、肉眼で判定することができる。また、光学的機器を用いれば、大量にかつ正確に判定することができる。光学的機器を用いる場合、最終的な凝集像を得る必要は必ずしもなく、凝集反応に伴う反応液系の濁度の変化を測定すればよい。光学的機器による測定は、散乱光、吸光度または透過光強度を検出することにより行うことができる。 The presence or absence of aggregation can be determined with the naked eye. Moreover, if an optical apparatus is used, it can determine in large quantities and correctly. When using an optical instrument, it is not always necessary to obtain a final aggregated image, and it is only necessary to measure the change in turbidity of the reaction liquid system accompanying the aggregation reaction. Measurement with an optical instrument can be performed by detecting scattered light, absorbance, or transmitted light intensity.

イムノクロマトグラフィーにおいては、ニトロセルロース膜等の適当な固相支持体上に抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を固定化し、該固相支持体に毛管現象を利用して、金コロイド等の適当な標識物質で標識した抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体とイヌ糸状虫22kDaタンパク質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した抗体-タンパク質-標識抗体の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、イヌ糸状虫22kDaタンパク質を検出することができる。イムノクロマトグラフィー装置の製造およびイムノクロマトグラフィーによる検出は公知の方法で行うことができる。イムノクロマトグラフィーによれば、イヌ検体試料中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質を30分以内、好ましくは15分以内、さらに好ましくは10分以内で検出することが可能である。 In immunochromatography, an anti-canine filamentous worm 22 kDa protein antibody is immobilized on a suitable solid support such as a nitrocellulose membrane, and an appropriate labeling substance such as gold colloid is utilized on the solid support using capillary action. The anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody and the canine filamentous 22 kDa protein complex labeled with are deployed and transferred. As a result, an immobilized antibody-protein-labeled antibody complex is formed on the solid support, and the signal of the labeling reagent emitted from the complex (in the case of gold colloid, the anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody is immobilized. By detecting that the solid phase support portion turned red), the canine filamentous worm 22 kDa protein can be detected. Production of the immunochromatography apparatus and detection by immunochromatography can be performed by a known method. According to immunochromatography, the canine filamentous worm 22 kDa protein in a dog specimen sample can be detected within 30 minutes, preferably within 15 minutes, more preferably within 10 minutes.

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ cDNA抽出用のイヌ糸状虫体の作出
血液検査により、イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）のミクロフィラリアが陽性であることを確認したビーグル犬をネンブタールで麻酔し、吸血部分の毛をバリカンで刈り、麻酔処置したイヌの上にトウゴウヤブカ飼育ケージを載せトウゴウヤブカに吸血させた。トウゴウヤブカをその後２５℃で飼育し、吸血後２週間後に吸血したトウゴウヤブカから感染幼虫（第３期幼虫：Ｌ３）を採取した。該感染幼虫を５頭の５歳の雄ビーグル犬に100虫ずつ皮下に注入することによりイヌ糸状虫のイヌへの人工感染を行った。 Example 1 Production of canine filamentous worm body for cDNA extraction A beagle dog confirmed to be positive for Dirofilaria immitis microfilariae by blood test is anesthetized with Nembutal, and the hair of the blood-sucking part is clipped with a clipper A catfish breeding cage was placed on a dog that had been cut and anesthetized, and the catfish were sucked. Scarlet beetle was then bred at 25 ° C., and infected larvae (third stage larva: L3) were collected from Spodoptera serrata that had sucked blood two weeks after blood sucking. By injecting 100 infected larvae subcutaneously into five 5-year-old male beagle dogs, the dogs were artificially infected with dogs.

イヌへの感染後剖検により雌88虫体、雄94雄虫体を回収し、抗体産生およびイヌ糸状虫抗原の遺伝子ライブラリー作製のために用いた。 After the infection of dogs, 88 female bodies and 94 male male bodies were collected by autopsy and used for antibody production and construction of a gene library of canine filamentous antigens.

上記のイヌ糸状虫を感染させた５頭のビーグル犬から、感染０、２、４、６、８、10、12、14、18、22、26および29週後に、経時的感染血清採取して血清ライブラリーを構築した。感染0週および29週間後の血清を以下の検討に用いた。また、自然感染犬から標準陽性血清を作製した。以下の実施例において、経時的感染血清をパネル血清ということがある。 From 5 beagle dogs infected with the above canine filamentous worms, time-dependent infected serum was collected at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26 and 29 weeks after infection. A serum library was constructed. Serum at 0 and 29 weeks after infection was used for the following studies. Standard positive sera were prepared from naturally infected dogs. In the following examples, the time-dependent infected serum may be referred to as panel serum.

表１に、用いた５頭の人工感染ビーグル犬における虫体回収数および抗原保有状況を示す。血中抗原は、スナップ・ハートワームＲＴ(米国IDEXX Laboratories, Inc.社製、IDEXX日本販売)を用いて検出した。試験方法は、キット添付の説明書に従い、供試血清と添付の試薬を反応させたものをディバイスに反応させ、青色の陽性反応スポットが出
現したものを陽性とした。 Table 1 shows the number of insects recovered and the antigen possession status in the five artificially infected beagle dogs used. Blood antigens were detected using Snap Heartworm RT (made by IDEXX Laboratories, Inc., USA, IDEXX Japan sales). According to the test method attached to the kit, the reaction of the test serum and the attached reagent was allowed to react with the device, and the one where a blue positive reaction spot appeared was regarded as positive.

実施例２イヌ糸状虫感染犬の抗体の分析
実施例１で作製した経時的感染血清のイヌ糸状虫抗原に対する抗体価の推移を、IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgMの各抗体クラスまたはサブクラスについてELISAで測定した）。結果を図１に示す。IgG1、IgG2およびIgM抗体は感染4週間後までに陽転した。本実施例の結果から、イヌ糸状虫成虫に含まれるタンパク質抗原であって特異性の高いタンパク質抗原が得られればイヌの糸状虫の感染を早期に診断できることが判明した。 Example 2 Antibody analysis of dogs infected with canine filamentous insects The change in antibody titer against the canine filamentous antigens of the time-infected serum prepared in Example 1 is shown for each antibody class or subclass of IgG1, IgG2, IgA, IgE, and IgM. Measured by ELISA). The results are shown in FIG. IgG1, IgG2 and IgM antibodies were overturned by 4 weeks after infection. From the results of this Example, it was found that if a protein antigen contained in an adult canine filamentous worm and a highly specific protein antigen is obtained, infection of the canine filamentous worm can be diagnosed at an early stage.

実施例３イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）cDNAライブラリー作製とクローン選択
凍結保存（-80℃）されたイヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)それぞれにTRIzol（登録商標）試薬(15596；Invitrogen)を加え、液体窒素内で、ポリトロンホモジナイザー（PT 10-35；Kinematica）にかけて粉砕した。このホモジネートに添加TRIzol量の1/5量のクロロフォルム（和光純薬）を加えボルテックスで攪拌後、冷却高速遠心機（Allegra X-15R；Beckman-Coulter）で遠心分離した。水層を新しいマイクロ遠心管に回収し、等量のイソプロパノール（和光純薬）を加えて、総RNAを沈殿分離した。さらに、この総RNAからキット（polyAtract mRNA キットz5200；Promega）を用いてmRNAを精製し、oligo-d(T)20-attB2-Biotin primerを用いて、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (5081955；Roche Applied Science)の手順に従ってcDNAへの逆転写を行った。相補鎖を合成後cDNA分画カラム（18092015;Invitrogen）で高分子cDNAを回収した。以下、クロンマイナーキット（A11180 ;Invitrogen）の操作手順に従って、エントリークローン作製のため、pDONR221ベクターへイヌ糸状虫遺伝子の挿入を行い、Gateway cDNAライブラリーを作製した。このGateway成虫cDNAライブラリーからクローニングを行い、挿入遺伝子の長さをcolony direct PCRで調べ、挿入部分のシークエンス解析を行った。 Example 3 Preparation of a Dirofilaria immitis cDNA library and selection of clones Fifth stage larvae (Immature adult) and adult female adults of cryopreserved (Dirofilaria immitis) canine filamentous worms (Dirofilaria immitis) TRIzol (registered trademark) reagent (15596; Invitrogen) was added to each (female adult worms), and the mixture was pulverized in liquid nitrogen using a polytron homogenizer (PT 10-35; Kinematica). To this homogenate, chloroform (Wako Pure Chemical Industries), which is 1/5 of the amount of TRIzol added, was added and stirred by vortexing, and then centrifuged with a cooling high-speed centrifuge (Allegra X-15R; Beckman-Coulter). The aqueous layer was collected in a new microcentrifuge tube, and an equal volume of isopropanol (Wako Pure Chemical Industries) was added to precipitate and separate total RNA. Furthermore, mRNA was purified from this total RNA using a kit (polyAtract mRNA kit z5200; Promega), and using Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (5081955; Roche Applied) using oligo-d (T) 20-attB2-Biotin primer. Science) reverse transcription into cDNA was performed. After synthesizing the complementary strand, high-molecular cDNA was recovered with a cDNA fractionation column (18092015; Invitrogen). Hereinafter, in accordance with the operating procedure of the cron minor kit (A11180; Invitrogen), a canine filamentous worm gene was inserted into the pDONR221 vector to prepare an entry clone, and a Gateway cDNA library was prepared. Cloning was performed from this Gateway adult cDNA library, the length of the inserted gene was examined by colony direct PCR, and the sequence of the inserted portion was analyzed.

実施例４イヌ糸状虫遺伝子の解析および発現
１.イヌ糸状虫遺伝子の解析
イヌ糸状虫cDNAライブラリーの解析
実施例３の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)より作製したcDNA（エントリークローン）ライブラリーから、約2,000個のクローンの末端の塩基配列を決定し、データベースを利用した遺伝子ホモログ検索を行った。その結果、イヌ糸状虫の遺伝子（推定）の開始コドンを含むものが約400個見つかった。 Example 4 Analysis and Expression of Dog Filament Gene 1. Analysis of Dog Filament Gene Analysis of Dog Filament cDNA Library Example 5 fifth stage larvae (immature adult: immature adult) and adult female adult (female adult) From the cDNA (entry clone) library prepared from worms), the base sequences of the ends of about 2,000 clones were determined, and gene homolog search using a database was performed. As a result, about 400 of them were found to contain the initiation codon of the canine filamentous worm gene (presumed).

２.イヌ糸状虫遺伝子の一過性発現
上記１．で配列解析したエントリークローンのうち、開始コドンを有する上記の全長クローン（約400個）を選別して、Gatewayクローニングシステム（Invitrogen社）を利用して、遺伝子をクローニングし、一過性発現させた。すなわち、すべての遺伝子を培養細胞に導入後2日で発現が確認できる新規に開発したGateway対応一過性発現ベクター（pA3 hr5 GW）に挿入し、カイコ培養細胞（NIAS-Bm-Ke17；特願2009-200187、特願2010-193674）で遺伝子発現を行った。Gateway対応一過性発現ベクター（pA3 hr5 GW）は、pA3 hr5発現ベクターattR1 attR2配列を持つGatewayリーディングフレームカセットを組み込むことによりGateway対応発現ベクターとした。 2. Transient expression of canine filamentous worm gene The above-mentioned full-length clones (about 400) having the start codon were selected from the entry clones sequenced in step 1, and the gene was cloned and transiently expressed using the Gateway cloning system (Invitrogen). . In other words, all genes inserted into cultured cells were inserted into a newly developed gateway-compatible transient expression vector (pA3 hr5 GW) whose expression can be confirmed 2 days later. Silkworm cultured cells (NIAS-Bm-Ke17; patent application) Gene expression was performed in 2009-200187 and Japanese Patent Application 2010-193674). The gateway-compatible transient expression vector (pA3 hr5 GW) was used as a Gateway-compatible expression vector by incorporating a Gateway reading frame cassette having the pA3 hr5 expression vector attR1 attR2 sequence.

上記のカイコ胚子組織由来培養細胞株NIAS-Bm-Ke17細胞は、無血清培養液SH-Ke117（シマ研究所製：東京都板橋区）を用いて、５×100,000細胞数/(ｍｌ培養液)の初期密度で25℃設定の恒温器内で培養を開始し、培養開始後４日目の対数的増殖期の細胞を組換えウイルスの接種用に準備した。cDNAクローンのBmGWNo.122をGatewayベクターに導入した組換えBmNPVウイルスの接種の前に、上記の細胞を、2.5℃の冷蔵庫内に48時間保存した。これは導入遺伝子の転写を促すという新たに開発したアイデアを利活用するためである（Imanishi et al. (2012) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. Vol.48,No.3,p137-142）。次に、これらの低温処理細胞を細胞培養用フラスコ（住友ベークライト製：MS-21050）に、４×1,000,000細胞数/(４ｍｌ培養液)を加え、そして細胞培養液の2.5％量のカイコ熱処理体液を加えた。ウイルス感染と細胞培養は、27℃に設定した恒温室内で96時間保持することによってウイルスの感染を促し、所定の時間経過後、細胞液をパスツールピペット等を用いて、培養フラスコからプラスティック製無菌遠心管（住友ベークライト製：MS-56500）に回収し、遠心分離（1,000rpm、５分間）により、感染細胞を沈殿させ、上清を除去して、発現タンパク質の精製用とした。 The above silkworm embryo tissue-derived cultured cell line NIAS-Bm-Ke17 cells is obtained by using serum-free culture solution SH-Ke117 (manufactured by Shima Research Institute: Itabashi-ku, Tokyo), 5 × 100,000 cells / (ml culture solution) Culturing was started in an incubator set at 25 ° C. at an initial density of 4, and cells in the logarithmic growth phase 4 days after the start of culturing were prepared for inoculation with the recombinant virus. The cells were stored in a refrigerator at 2.5 ° C. for 48 hours prior to inoculation with the recombinant BmNPV virus in which the cDNA clone BmGWNo. 122 was introduced into the Gateway vector. This is to take advantage of the newly developed idea to promote transgene transcription (Imanishi et al. (2012) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. Vol.48, No.3, p137-142). . Next, these low-temperature treated cells are added to a cell culture flask (Sumitomo Bakelite: MS-21050) at 4 × 1,000,000 cells / (4 ml culture solution), and the silkworm heat treatment body fluid is 2.5% of the cell culture solution. Was added. Virus infection and cell culture are maintained in a thermostatic chamber set at 27 ° C for 96 hours to promote virus infection. After a predetermined time, the cell fluid is aseptically made from plastic culture flasks using a Pasteur pipette. The cells were collected in a centrifuge tube (manufactured by Sumitomo Bakelite: MS-56500), and the infected cells were precipitated by centrifugation (1,000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed to purify the expressed protein.

組換えウイルスの細胞への接種に当たっては、NIAS-Bm-Ke17細胞は無血清培地で培養のため、ウイルス等の感受性は著しく劣る。そのため、感受性の増強のため、先に記述した細胞の低温処理に加えて、増強剤としてカイコの熱処理体液を培養液に添加する必要がある。カイコ体液は普通育蚕品種（ここでは、日137号×支147号を用いた）を桑葉により、稚蚕期は28℃で飼育し、壮蚕期は25℃で飼育し、壮蚕期の５齢の３日目〜４日目の最大肥大蚕の脚部をはさみで切断することにより、カイコの体液をプラスティック製無菌遠心管（住友ベークライト製：MS-56500）に氷冷下で採取した。遠心管の総容量の８割位採取した時点で、60℃に温めたウオーターバス内に30分間浸漬した。その後、再度氷中にて冷却後、遠心分離（3,000rpm、30分間）し、熱凝固タンパクを沈殿させ、上澄みの体液を別の無菌遠心管に移して-80℃の冷凍庫内で使用まで保存した。培養液への添加に先立って、カイコ熱処理体液は、0.45μｍ孔径サイズのディスポーザブルフィルター（ザルトリウスメカトロニクスジャパン：ミニザルト0.45μｍ孔径）を用いて除菌した。 When inoculating the recombinant virus cells, NIAS-Bm-Ke17 cells are cultured in a serum-free medium, and thus the sensitivity of viruses and the like is significantly inferior. Therefore, in order to enhance sensitivity, it is necessary to add silkworm heat-treated body fluid as a potentiator to the culture medium in addition to the low-temperature treatment of cells described above. For silkworm body fluid, normal breeding varieties (here, No. 137 x No. 147) were cultivated with mulberry leaves at 28 ° C in juvenile season, and at 25 ° C in magnificent season. The body fluid of silkworm was collected in a plastic aseptic centrifuge tube (Sumitomo Bakelite: MS-56500) under ice-cooling by cutting the legs of the 3rd to 4th day of the 5th year old with the scissors. did. When 80% of the total capacity of the centrifuge tube was collected, it was immersed in a water bath heated to 60 ° C. for 30 minutes. Then, after cooling again in ice, centrifuge (3,000 rpm, 30 minutes) to precipitate the thermocoagulated protein, transfer the supernatant fluid to another sterile centrifuge tube, and store it in a -80 ° C freezer until use did. Prior to addition to the culture solution, the silkworm heat-treated body fluid was sterilized using a 0.45 μm pore size disposable filter (Sartorius Mechatronics Japan: Minisart 0.45 μm pore size).

実施例５イヌ糸状虫抗原（22kDaタンパク質）の検定
一過性発現細胞試料の作製
実施例３の方法によりイヌ糸状虫の第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）と成熟雌成虫(female adult worms)から作製したcDNAライブラリーを一過性発現ベクター（pA3hr5GW）に組込み、カイコ培養細胞株NIAS-Bm-Ke17の系にて発現した、約400個cDNA発現細胞をそれぞれ1mlずつマイクロチューブにとり3000rpmで遠心して沈殿物をPBS 1mlで遠心洗浄を3回行った。この沈殿物を氷中浴槽にて冷却しながらマイクロチューブホモジナイザーで1分破砕を5回行いSDS-PAGEの試料とした。SDS-PAGEに供した試料は、イヌ糸状虫由来のcDNAのうち、遺伝子情報が判明している一過性発現細胞が発現する試料であった（No.52、66、73、113、122、135、142、143、151、166、167、170、171および177）。 Example 5 Assay of canine filamentous worm antigen (22 kDa protein) Preparation of transiently expressed cell sample According to the method of Example 3, the fifth stage larvae (immature adult) and adult female adult (female adult) of canine filamentous worms worms) was inserted into a transient expression vector (pA3hr5GW) and about 400 cDNA-expressing cells expressed in the silkworm cultured cell line NIAS-Bm-Ke17 were placed in a microtube at 3000 rpm. The precipitate was centrifuged and washed with 1 ml of PBS three times. While this precipitate was cooled in an ice bath, it was crushed with a microtube homogenizer 5 times for 1 minute and used as a sample for SDS-PAGE. The samples subjected to SDS-PAGE were samples in which transiently expressed cells whose genetic information was known were expressed from cDNA derived from canine filamentous worms (No. 52, 66, 73, 113, 122, 135, 142, 143, 151, 166, 167, 170, 171 and 177).

SDS-PAGEおよびウエスタンブロット解析
サンプルの調整：
トリス塩酸バッファー（pH6.8）中にSDSと2−メルカプトエタノールを含む×2のサンプルバッファーと1:1に混合した一過性発現細胞抽出タンパク質は100℃5分の加熱処理を行った。
SDS-PAGE：
17ウエルの既製12.5%Poly-Acrylamide Gel （マルチゲルIIミニ 12.5%：コスモバイオ）に10μlずつ各ウエルに流し込みLaemmliの泳動バッファーで20 mA約90分間電気泳動を行った。
ウエスタンブロット：
泳動終了後ゲルは5分間精製水中にて振とうした後にメタノールを含まないTowbinの不連続バッファーにて5分間振とうした。このとき、ブロットするPVDF膜は、メタノール中にて5分間振とう後、Towbinの不連続バッファー中にて10分以上振とうした。またブロットに用いるろ紙は、メタノールを含まないTowbinの不連続バッファーに浸漬し、ガラス棒などを用いてろ紙に含まれる空気を除いた。これらを用いてセミドライ式ブロッティング装置にて陰極側からろ紙、アクリルアミドゲル、PVDF膜、ろ紙の順に重ね、PVDF膜1cm²あたり2mAの電流を60分間流すことでブロットした。ブロットされたPVDF膜はpH7.2のPBSで調製した0.1%(w/v)ブロックエース（雪印乳業）に60分間浸漬し、0.1%Tween含有PBSにて洗浄後、PBSにて希釈したHRP標識抗糸状虫ポリクローナルウサギ抗体（後記の実施例５で作製）と60分間反応させた。この後にPVDF膜を0.1%Tween含有PBSにて洗浄し、TMB Membrane Peroxidase Substrate（KPL）を用いて発色させた。ウエスタンブロットにおいて、後記の実施例５で作製した抗イヌ糸状虫特異ポリクローナル抗体を用いた。 Preparation of SDS-PAGE and Western blot analysis samples:
The transiently expressed cell-extracted protein mixed 1: 1 with x2 sample buffer containing SDS and 2-mercaptoethanol in Tris-HCl buffer (pH 6.8) was heat-treated at 100 ° C. for 5 minutes.
SDS-PAGE:
10 μl each was poured into 17-well ready-made 12.5% Poly-Acrylamide Gel (Multigel II Mini 12.5%: Cosmo Bio) and electrophoresed with Laemmli running buffer for about 90 minutes at 20 mA.
Western blot:
After completion of the electrophoresis, the gel was shaken in purified water for 5 minutes and then shaken in a Towbin discontinuous buffer containing no methanol for 5 minutes. At this time, the PVDF membrane to be blotted was shaken in methanol for 5 minutes and then in Towbin's discontinuous buffer for 10 minutes or more. The filter paper used for blotting was immersed in a Towbin discontinuous buffer not containing methanol, and air contained in the filter paper was removed using a glass rod or the like. Using these samples, blotting was carried out in a semi-dry blotting apparatus in the order of filter paper, acrylamide gel, PVDF membrane, and filter paper in this order from the cathode side, and a current of ² mA per 1 cm ^{2 of} PVDF membrane was allowed to flow for 60 minutes. The blotted PVDF membrane was immersed in 0.1% (w / v) Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) prepared with PBS pH 7.2 for 60 minutes, washed with PBS containing 0.1% Tween, and diluted with PBS. The mixture was reacted with an anti-filamentous polyclonal rabbit antibody (prepared in Example 5 described later) for 60 minutes. Thereafter, the PVDF membrane was washed with PBS containing 0.1% Tween, and developed with TMB Membrane Peroxidase Substrate (KPL). In Western blotting, the anti-canine filamentous insect specific polyclonal antibody prepared in Example 5 described later was used.

結果を図２に示す。図２中、数字はcDNAの番号を示し、Mは分子量マーカー、nは陰性コントロールを示す。図２に示すように、分子量20kDa付近の位置に一過性発現No.122で陽性のラインが確認できた。この発現cDNA No.122のホモロジーを確認したところ、該22kDaタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトフィラリアsmall heat shock proteinの22kDaタンパク質をコードする遺伝子を配列相同性が高かったので、イヌ糸状虫由来ヒトフィラリアsmall heat shock protein類似タンパク質（22kDa）と名付けた。該22kDaタンパク質をコードするcDNAクローンをBmGWNo.122とした。
なお、cDNA No.122は第５期幼虫（未成熟虫:immature adult）由来であった。 The results are shown in FIG. In FIG. 2, numbers indicate the cDNA numbers, M indicates a molecular weight marker, and n indicates a negative control. As shown in FIG. 2, a positive line with transient expression No. 122 was confirmed at a position around a molecular weight of 20 kDa. The homology of the expressed cDNA No. 122 was confirmed. The gene encoding the 22 kDa protein had a high sequence homology with the gene encoding the 22 kDa protein of human filaria small heat shock protein. It was named small heat shock protein similar protein (22kDa). The cDNA clone encoding the 22 kDa protein was designated as BmGWNo.122.
CDNA No. 122 was derived from the fifth stage larvae (immature adult).

実施例６抗イヌ糸状虫抗体の作製
（１）イヌ糸状虫破砕液を抗原として用いたポリクローナル抗体の作製
イヌ糸状虫5gを-80℃に凍結して乳鉢にて良く磨りつぶし生理食塩水2mlにて乳鉢からガラス-テフロンホモジナイザーに洗い込み氷中浴槽にて冷却しながら10分間破砕を行った。この破砕液を遠心管にとり、2000rpmで5分間遠心をして上清をOD280にて吸光度を測定し、吸光度よりタンパク濃度を換算して1mg/mlの濃度で1週間おきに4回フロイント完全アジュバントと混合してウサギ皮下に免疫をして1ヶ月後に採血を行った。採血した血清はイヌ血清タンパク質を結合したアフィニティークロマトカラムにて非特異抗体を除去後にプロテインGカラムにてIgGに精製して抗イヌ糸状虫特異ポリクローナル抗体とした。 Example 6 Production of anti-canine filamentous worm antibody (1) Production of polyclonal antibody using canine filamentous worm crushing solution as antigen Frozen dog worms were frozen at -80 ° C and ground well in a mortar to 2 ml of physiological saline. Then, it was washed from a mortar into a glass-Teflon homogenizer and crushed for 10 minutes while cooling in an ice bath. Take this crushed liquid in a centrifuge tube, centrifuge at 2000 rpm for 5 minutes, measure the absorbance of the supernatant with OD280, convert the protein concentration from the absorbance, and add 4 times Freund's complete adjuvant at a concentration of 1 mg / ml every other week. 1 month later, blood was collected. The collected blood serum was purified to IgG with a protein G column after removing non-specific antibodies with an affinity chromatography column to which canine serum proteins were bound, to obtain anti-canine filamentous insect-specific polyclonal antibodies.

（２）マウスモノクローナル抗体の作製
免疫抗原の調整：
実施例４に記載の一過性発現で陽性と判定できたクローンBmGWNo.122をバキュロウイルス発現ベクター（pBmGate）に挿入し、BmNPVウイルスに導入し組み換えウイルスを作製した。該組換えウイルスをカイコ培養細胞株（NIAS-Bm−Ke17）に感染させて、以下のように、22kDaタンパク質の大量発現を行った。 (2) Preparation of mouse monoclonal antibody Preparation of immune antigen:
Clone BmGWNo.122, which was determined to be positive by transient expression described in Example 4, was inserted into a baculovirus expression vector (pBmGate) and introduced into BmNPV virus to produce a recombinant virus. The recombinant virus was infected into a silkworm cultured cell line (NIAS-Bm-Ke17), and a large amount of 22 kDa protein was expressed as follows.

NIAS-Bm-Ke17細胞を細胞培養フラスコ（住友ベークライト株式会社製：MS−21050）で数多く培養し、培養開始７日目において、全フラスコの細胞数を計測した。次に先の細胞培養フラスコより、大型の細胞培養フラスコ（住友ベークライト製：MS-21250）に１個当たり、５×1000,000細胞数になるように調整して、細胞を含む15mlの培養液を加えた。１回の実験につき、20個のフラスコ、すなわち１×100,000,000細胞数を用いた。これらの20個の細胞培養フラスコを2.5℃の冷蔵庫に48時間保存した。次にNo.122の組換えウイルスをこれらの細胞にMOI１になるウイルス濃度で接種し、細胞培養フラスコを27℃に96時間おいてウイルスの感染と組換え遺伝子の大量発現を行った。 Many NIAS-Bm-Ke17 cells were cultured in a cell culture flask (Sumitomo Bakelite Co., Ltd .: MS-21050), and the number of cells in all flasks was counted on the 7th day after the start of the culture. Next, adjust the cell culture flask from the previous cell culture flask to a large cell culture flask (Sumitomo Bakelite: MS-21250) so that the number of cells is 5 x 1,000,000 cells. Was added. Twenty flasks, ie 1 × 100,000,000 cells, were used per experiment. These 20 cell culture flasks were stored in a 2.5 ° C. refrigerator for 48 hours. Next, the No. 122 recombinant virus was inoculated into these cells at a virus concentration of MOI1, and the cell culture flask was placed at 27 ° C. for 96 hours to carry out virus infection and large-scale expression of the recombinant gene.

大量発現培養を行った1Lの細胞と培養混液をアセトンドライアイスにより凍結融解を５回繰り返し、培養液を3000 rpmで10分間遠心分離を行い、限外ろ過法にて5mlまで濃縮を行った。この濃縮培養上清液の2mlを0.2％アジ化ナトリウム加PBSで平衡化したセファアクリルS-200にてゲルろ過を行った。フラクションコレクターで分収した各フラクションをSDS-PAGE電気泳動にて確認を行い、目的のフラクションを分取して限外濃縮で1mlに濃縮した後に1000mlのPBSにて透析を行った。 1 L of cells subjected to mass expression culture and the culture mixture were freeze-thawed 5 times with acetone dry ice, the culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and concentrated to 5 ml by ultrafiltration. 2 ml of this concentrated culture supernatant was subjected to gel filtration using Sephaacryl S-200 equilibrated with PBS containing 0.2% sodium azide. Each fraction collected by the fraction collector was confirmed by SDS-PAGE electrophoresis, the target fraction was collected, concentrated to 1 ml by ultraconcentration, and then dialyzed against 1000 ml of PBS.

細胞融合：
透析後のタンパク質濃度は波長270ナノメートルの紫外線吸光度から、タンパク質濃度を決定後、タンパク質濃度を１mg/mlとなるように調整して完全フロイントアジュバントと1:1でよく混和しての5週齢♀のBALB/Cマウスに0.5ml/匹で3匹の腹腔内に免疫を行った。 Cell fusion:
The protein concentration after dialysis is determined from the UV absorbance at a wavelength of 270 nanometers. After determining the protein concentration, adjust the protein concentration to 1 mg / ml and mix well with complete Freund's adjuvant 1: 1. Acupuncture BALB / C mice were immunized intraperitoneally at 0.5 ml / mouse.

4週間後に同濃度のタンパク質を0.2ml皮下に接種したのち72時間目に脾臓を無菌的に摘出してあらかじめ継代培養を進めていたP3U1マウスミエローマ細胞と脾臓細胞の比率を1：10でPEG1500を使って融合を行った。融合を行った細胞は、96穴マイクロプレートの各穴に脾臓細胞が10万個になるように調整して各穴に分注を行った。播種して24時間後に2倍のHAT培地を同量加えて融合細胞の選択を行った。 Four weeks later, 0.2 ml of the same concentration of protein was inoculated subcutaneously, and 72 hours later, the spleen was aseptically removed and subcultured in advance. The ratio of P3U1 mouse myeloma cells to spleen cells was 1:10 at PEG 1500 Fusion was performed using. The fused cells were adjusted so that there were 100,000 spleen cells in each well of a 96-well microplate and dispensed into each well. 24 hours after seeding, fused cells were selected by adding the same amount of 2-fold HAT medium.

陽性抗体の確認：
HAT培地により選択された融合細胞より分泌する陽性抗体の選択には虫体抽出抗原を用いた。抽出抗原を5μl/mlとなるように希釈をして96穴マイクロプレートに50μlずつ分注後にマイクロプレートを4℃にて24時間以上静置した。静置後のマイクロプレートはPBSにてよく洗浄後PBSに1％になるようにBSAを溶解した液を100μlずつ分注してさらに24時間4℃に静置してブロッキングを行った。このプレートをPBSで3回洗浄後に細胞融合マイクロプレートの上清を50μl滴下して37℃で1時間反応後にPBSで3回洗浄して抗マウスイムノグロブリンHRP標識ウサギ抗体で結合した融合抗体を検出した。結果を図３に示す。図３左の欄は、検定を行ったモノクローナル抗体のクローン番号を示す。虫体抽出抗原と強く反応するモノクローナル抗体（クローン名、３Ｈ２；サブクラス、ＩｇＭ）が得られた。 Confirmation of positive antibody:
Parasite extract antigens were used for selection of positive antibodies secreted from fused cells selected by HAT medium. The extracted antigen was diluted to 5 μl / ml, and 50 μl was dispensed into a 96-well microplate, and then the microplate was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours or more. The microplate after standing was washed well with PBS, and 100 μl of BSA-dissolved solution was dispensed at 1% in PBS, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours for blocking. After washing this plate 3 times with PBS, 50 μl of the cell fusion microplate supernatant was dropped and reacted at 37 ° C for 1 hour, followed by washing 3 times with PBS to detect the fusion antibody bound with anti-mouse immunoglobulin HRP-labeled rabbit antibody. did. The results are shown in FIG. The left column of FIG. 3 shows the clone number of the monoclonal antibody subjected to the assay. A monoclonal antibody (clone name, 3H2; subclass, IgM) that strongly reacts with the insect extract antigen was obtained.

（３）イヌ糸状虫陽性血清との反応確認
上記（１）で作製した抗糸状虫体ポリクローナル抗体を20μg/mlとなるようにPBSで調整して50μlずつマイクロプレートの各穴に滴下後同様に感作、ブロッキング後にイヌ糸状虫感染パネル血清を50μl滴下して37℃で1時間反応した。このプレートをよく洗浄後に融合細胞で陽性となったマウスモノクローナル抗体（3H2)を50μl滴下して37℃で1時間反応後によく洗浄して抗マウスガンマーグロブリンHRP標識ウサギ抗体で反応後によく洗浄して定法により発色を行った。 (3) Confirmation of reaction with canine filamentous worm-positive serum The anti-filamentous body polyclonal antibody prepared in (1) above was adjusted to 20 μg / ml with PBS and added dropwise to each well of the microplate in a volume of 50 μl. After sensitization and blocking, 50 μl of canine silkworm-infected panel serum was dropped and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the plate well, 50 μl of mouse monoclonal antibody (3H2) that became positive in the fused cells was dropped and washed at 37 ° C. for 1 hour, washed well and washed with anti-mouse gamma globulin HRP-labeled rabbit antibody. Color was developed by a conventional method.

（４）イヌ糸状虫感染イヌ検出用ELISA測定系の確立
感染犬パネル血清と反応するモノクローナル抗体(3H2)を産生するハイブリドーマを無血清培地にて培養し、モノクローナル抗体を製造し、定法に従い抗体に直接HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を標識した。 (4) Establishment of an ELISA measurement system for detection of dogs infected with canine filamentous insects Hybridomas producing monoclonal antibodies (3H2) that react with infected dog panel sera are cultured in serum-free medium to produce monoclonal antibodies. Directly labeled HRP (horseradish peroxidase).

96穴マイクロプレートは虫体免疫で得られた抗イヌ糸状虫体ウサギポリクローナル抗体を20μg/mlで感作し固相した後に1％BSAでブロッキングして減圧乾燥後に密封して保管した。 The 96-well microplate was sensitized with 20 μg / ml of anti-canine filamentous rabbit rabbit polyclonal antibody obtained by parasite immunization, solid-phased, blocked with 1% BSA, dried under reduced pressure, sealed and stored.

前記の抗イヌ糸状虫体ウサギポリクローナル抗体固相化プレートおよびHRP標識抗22kDaタンパク質を用いたELISA系を確立した。 An ELISA system using the above-mentioned anti-canine filamentous worm rabbit polyclonal antibody-immobilized plate and HRP-labeled anti-22 kDa protein was established.

確立したELISA系を用いて抗22kDa抗体を使用したイヌ糸状虫感染の検出系の性能を評価した。 The performance of a detection system for canine filamentous infection using an anti-22 kDa antibody was evaluated using an established ELISA system.

上記ELISAプレートに、一次抗体として実施例１の5頭のイヌ糸状虫人工感染イヌ血清の経時血清（感染前から感染29週間後）、4頭の陽性イヌ標準血清（自然感染イヌ）、4頭の陰性犬標準血清（ビーグル犬）、二次抗体として上記（４）で製造したHRP標識モノクローナル抗体（3H2）を反応させ、この際、対照として標準陽性犬4頭（陽性対照：Positive control）と陰性犬4頭の血清（陰性対照：Negative control）を用いた。ELISAを行った。モノクローナル抗体（3H2）を用いた場合に、感染前血清の吸光度（0.118〜0.124）と標準陰性血清の吸光度（0.102〜0.122）と比較して、陽性標準血清の吸光度は0.302〜0.806であった。人工感染イヌ血清においては、４頭とも26〜29週で陰性対照よりも抗体価が高くなり、また、No.3およびNo.5のイヌ個体では人工感染29週間後血清における吸光度は高い反応順から0.339、0.219、0.180、1.78、0.141であり、吸光度0.180以上の検体は市販キットの陽性成績と一致した。モノクローナル抗体（3H2）を用いた測定の結果を図４に示す。 On the above ELISA plate, as a primary antibody, the time-dependent sera of 5 dogs of artificially infected silkworm of Example 1 (29 weeks after infection), 4 positive canine standard sera (naturally infected dogs), 4 Negative dog standard serum (beagle dog) and HRP-labeled monoclonal antibody (3H2) produced in (4) above as a secondary antibody were reacted. At this time, four standard positive dogs (positive control) were used as controls. Sera from 4 negative dogs (negative control: Negative control) were used. An ELISA was performed. When the monoclonal antibody (3H2) was used, the absorbance of the positive standard serum was 0.302 to 0.806 compared with the absorbance of the pre-infection serum (0.118 to 0.124) and the absorbance of the standard negative serum (0.102 to 0.122). In the artificially infected dog sera, the antibody titer was higher in all four animals at 26 to 29 weeks than in the negative control, and in the No. 3 and No. 5 dog individuals, the absorbance in the serum after 29 weeks of artificial infection was higher in the order of reaction. From 0.339, 0.219, 0.180, 1.78, and 0.141, specimens with an absorbance of 0.180 or more agreed with the positive results of the commercial kit. The results of the measurement using the monoclonal antibody (3H2) are shown in FIG.

（５）イヌ糸状虫感染犬検出用ラテックス凝集試薬の開発
結合基処理を行ったラテックス粒子（JSR社製）を１％(v/v)にPBSで調整して抗糸状虫マウスモノクローナル抗体（3H2)を等量混合し、50℃で1時間振盪監査を行った。感作したラテックス粒子は洗浄後1%BSAを含むPBSにて4℃一昼夜ブロッキングを行った。
抗イヌ糸状虫コートラテックス凝集法によるイヌ糸状虫陽性血清の測定
市販イヌ糸状虫診断キットで陽性と判断したイヌ血清と陰性の血清をそれぞれ50検体ずつ作製したラテックス凝集試薬で測定を行った。 (5) Development of latex agglutination reagent for detection of dogs infected with canine silkworms Latex particles (manufactured by JSR) treated with binding group (JSR) were adjusted to 1% (v / v) with PBS and anti-filamentous mouse monoclonal antibody (3H2 ) Were mixed in equal amounts, and a shake inspection was conducted at 50 ° C. for 1 hour. Sensitized latex particles were washed and blocked with PBS containing 1% BSA at 4 ° C. overnight.
Measurement of canine filamentous worm-positive serum by anti-canine filamentous coat latex agglutination method Measurement was performed with a latex agglutination reagent in which 50 samples of dog serum and negative serum each determined to be positive by a commercially available canine filamentous worm diagnostic kit were prepared.

各血清を5倍、10倍に0.5%BSA加PBSにて希釈して混合し、ラテックス凝集自動分析機（日立7180）にて測定を行った。 Each serum was diluted 5 times and 10 times with 0.5% BSA-added PBS and mixed, and measured with a latex agglutination automatic analyzer (Hitachi 7180).

本発明の方法により、イヌのイヌ糸状虫による感染を早期に正確に診断することができる。 By the method of the present invention, it is possible to accurately and accurately diagnose an infection caused by a canine filamentous worm at an early stage.

Claims

配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体。 An antibody against canine filamentous worm 22 kDa protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

モノクローナル抗体である、請求項１記載のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体。 The antibody against the canine filamentous worm 22 kDa protein according to claim 1, which is a monoclonal antibody.

請求項１または２に記載のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体を用いて、イヌ血液中のイヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を測定することにより、イヌ糸状虫感染を検出する方法。 A method for detecting canine filamentous infection by measuring canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof in dog blood using the antibody against canine filamentous 22 kDa protein according to claim 1 or 2.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を用いて、イヌ血液中の抗イヌ糸状虫22kDaタンパク質抗体を測定することにより、イヌ糸状虫感染を検出する方法。 A method for detecting canine filamentous infection by measuring anti-canine filamentous 22 kDa protein antibody in dog blood using canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof.

請求項１または２に記載のイヌ糸状虫22kDaタンパク質に対する抗体を含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。 A kit for detecting canine filamentous infection, comprising an antibody against the canine filamentous 22 kDa protein according to claim 1 or 2.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質またはその断片を含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。 A kit for detecting canine filamentous infection, comprising a canine filamentous 22 kDa protein or a fragment thereof.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質からなる、イヌ糸状虫感染を検出するための診断用マーカー。 A diagnostic marker for detecting canine filamentous infection, comprising a canine filamentous 22 kDa protein.

イヌ糸状虫22kDaタンパク質の、イヌ糸状虫感染を検出するための、検出用マーカーとしての使用。 Use of the canine filamentous 22 kDa protein as a marker for detection to detect canine filamentous infection.