JP2013203707A - 1,5−d−アンヒドロフルクトースからなる抗肥満作用剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 安全性が高く、入手が容易でヒトへの利用が可能なグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤、転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤を提供すること。
【解決手段】 1,5−D−アンヒドロフルクトースからなるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤ならびに脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβの産生抑制剤。
【選択図】なし
【解決手段】 1,5−D−アンヒドロフルクトースからなるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤ならびに脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβの産生抑制剤。
【選択図】なし
Description
本発明は1,5−D−アンヒドロフルクトースからなる抗肥満作用剤に関する。さらに詳しくは、1,5−D−アンヒドロフルクトースによる、脂肪細胞の肥大化を抑制するための活性阻害剤または産生抑制剤に関する。
近年、過食や運動不足が原因で摂取エネルギーが消費エネルギーを上回ることで発症する肥満者数は、年々増加していることが世界的な社会問題となっている。肥満は、脂肪細胞から分泌される様々なアディポサイトカインの分泌異常から、高血圧、糖代謝異常(糖尿病)、脂質代謝異常(脂質異常症)を発症する。肥満を基礎疾患として、高血圧、糖尿病、脂質異常症のうち、2つ以上が併発するとメタボリックシンドロームを招く。メタボリックシンドロームは易動脈硬化発症状態であり、さらに、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの重大な疾病へとつながっていくことが知られている。
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼはグルコースからのトリアシルグルセロールの合成に係る酵素であり、その中間経路であるジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール−3−リン酸に変換する酵素である。この酵素を阻害することでトリアシルグルセロールの二つの前駆体であるアシルCoAとグリセロール−3−リン酸のうち、グリセロール−3−リン酸の合成が阻害されるため、結果としてトリアシルグリセロールの合成が阻害される。従って、本酵素を阻害すれば抗肥満につながると考えられており、このグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤が医薬、食品の分野で注目されている。
この阻害剤としてはα−リポ酸、フラボノイド、フェノール酸類、ギムネマ酸などが報告されている。
また、PPARγとC/EBPβは脂肪合成や脂肪酸の取り込みなど脂肪細胞の特徴をもたらす多くの遺伝子の転写制御を担っている。これらの転写因子の発現が抑制されると前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制や脂肪細胞の肥大化が抑制される。
脂肪細胞分化の転写因子であるPPARγとC/EBPβはこれらの発現が抑制されると脂肪合成酵素活性が下がり脂肪細胞分化が抑制される。
肥満の対策としては食事量を減らすことによる摂取エネルギーの削減、運動量を増やすことによる消費エネルギーの増加などが効果的ではある。しかしながら飽食であり、交通機関や移動手段の発達した現在においては、これらを継続的に行うことには難しい。そこで、より簡単に抗肥満効果を得る手段として抗肥満作用を持つ食品や特定保健用食品あるいは医薬品、医薬部外品などを摂取することによる体重コントロールへの期待が高まっている。
抗肥満作用を示す物質としては中性脂肪の合成に係る酵素、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害する物質あるいは脂肪細胞の分化に係る転写因子PPARγやC/EBPβを抑制することなどが考えられる。
1,5−D−アンヒドロフルクトース(以下、1,5−AFという)は澱粉やグリコーゲンなどを酵素α−1,4−グルカンリアーゼで分解することで生成する単糖で抗酸化性や抗菌性を示すこと、生理作用としては抗炎症性や抗アレルギー性などを有することも報告されている(特許文献1〜4)。また、アディポネクチンの産生増強剤としても特許出願されている(特許文献5)。1,5−AFは食品素材として利用されており、経口摂取する物質としては安全面において全く問題の無い素材である。
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼはグルコースからのトリアシルグルセロールの合成に係る酵素であり、その中間経路であるジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール−3−リン酸に変換する酵素である。この酵素を阻害することでトリアシルグルセロールの二つの前駆体であるアシルCoAとグリセロール−3−リン酸のうち、グリセロール−3−リン酸の合成が阻害されるため、結果としてトリアシルグリセロールの合成が阻害される。従って、本酵素を阻害すれば抗肥満につながると考えられており、このグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤が医薬、食品の分野で注目されている。
この阻害剤としてはα−リポ酸、フラボノイド、フェノール酸類、ギムネマ酸などが報告されている。
また、PPARγとC/EBPβは脂肪合成や脂肪酸の取り込みなど脂肪細胞の特徴をもたらす多くの遺伝子の転写制御を担っている。これらの転写因子の発現が抑制されると前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の抑制や脂肪細胞の肥大化が抑制される。
脂肪細胞分化の転写因子であるPPARγとC/EBPβはこれらの発現が抑制されると脂肪合成酵素活性が下がり脂肪細胞分化が抑制される。
肥満の対策としては食事量を減らすことによる摂取エネルギーの削減、運動量を増やすことによる消費エネルギーの増加などが効果的ではある。しかしながら飽食であり、交通機関や移動手段の発達した現在においては、これらを継続的に行うことには難しい。そこで、より簡単に抗肥満効果を得る手段として抗肥満作用を持つ食品や特定保健用食品あるいは医薬品、医薬部外品などを摂取することによる体重コントロールへの期待が高まっている。
抗肥満作用を示す物質としては中性脂肪の合成に係る酵素、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害する物質あるいは脂肪細胞の分化に係る転写因子PPARγやC/EBPβを抑制することなどが考えられる。
1,5−D−アンヒドロフルクトース(以下、1,5−AFという)は澱粉やグリコーゲンなどを酵素α−1,4−グルカンリアーゼで分解することで生成する単糖で抗酸化性や抗菌性を示すこと、生理作用としては抗炎症性や抗アレルギー性などを有することも報告されている(特許文献1〜4)。また、アディポネクチンの産生増強剤としても特許出願されている(特許文献5)。1,5−AFは食品素材として利用されており、経口摂取する物質としては安全面において全く問題の無い素材である。
本発明の目的は、安全性が高く、入手が容易でヒトへの利用が可能なグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤、転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤を提供することにある。
本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、1,5−AFが脂肪細胞に対してグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害すること、さらには脂肪細胞の分化に係る転写因子PPARγやC/EBPβの産生を抑制することを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第1に、
1,5−D−アンヒドロフルクトースからなるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤により達成される。
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第2に
1,5−D−アンヒドロフルクトースからなる脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβの産生抑制剤により達成される。
すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第1に、
1,5−D−アンヒドロフルクトースからなるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤により達成される。
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第2に
1,5−D−アンヒドロフルクトースからなる脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβの産生抑制剤により達成される。
本発明の有効成分である1,5−AFはヒトや環境に対して安全であり、1,5−AFをヒトに投与することで脂質代謝や糖代謝を活性化できるので、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖、脂質代謝異常(脂質異常症)、動脈硬化、高コレステロール血症などの生活習慣病の予防・改善に極めて有用である。
本発明において使用される1,5−AFは、既に公知の方法、例えば、特許文献1に記載の方法によって調製可能である。
すなわち、紅藻オゴノリより抽出した酵素α−1,4−グルカンリアーゼを澱粉に作用させることで1,5−AFを得ることができる。
本発明において、1,5−AFは、脂肪細胞に対し細胞毒として作用せず、脂肪細胞が前駆脂肪細胞および成熟脂肪細胞のいずれであっても上記活性阻害剤および上記産生抑制剤としての作用を発現する。
本発明において1,5−AF(1,5−アンヒドロ−D−フルクトース)は、いかなる形態にあっても良く、特に限定されない。希薄な水溶液や高濃度の水溶液、凍結乾燥粉末、結晶状態などの形態をとることもできる。1,5−AFに加えて他の成分が存在しても良い。ぶどう糖やマルトデキストリンなど糖質、エチルアルコール、蛋白質、アミノ酸、脂質、食物繊維、ビタミン、ミネラルなどの他の成分と混合された形態もとりうる。
さらに本発明の効果を奏する限り、本発明の剤は、1,5−AFに加えて、他のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害化合物や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制化合物を含むことも可能である。
すなわち、紅藻オゴノリより抽出した酵素α−1,4−グルカンリアーゼを澱粉に作用させることで1,5−AFを得ることができる。
本発明において、1,5−AFは、脂肪細胞に対し細胞毒として作用せず、脂肪細胞が前駆脂肪細胞および成熟脂肪細胞のいずれであっても上記活性阻害剤および上記産生抑制剤としての作用を発現する。
本発明において1,5−AF(1,5−アンヒドロ−D−フルクトース)は、いかなる形態にあっても良く、特に限定されない。希薄な水溶液や高濃度の水溶液、凍結乾燥粉末、結晶状態などの形態をとることもできる。1,5−AFに加えて他の成分が存在しても良い。ぶどう糖やマルトデキストリンなど糖質、エチルアルコール、蛋白質、アミノ酸、脂質、食物繊維、ビタミン、ミネラルなどの他の成分と混合された形態もとりうる。
さらに本発明の効果を奏する限り、本発明の剤は、1,5−AFに加えて、他のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害化合物や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制化合物を含むことも可能である。
本発明のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤は、それ自体公知の種々の方法でその剤型に応じて投与することが可能であり、投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合などを考慮して決定することができる。投与方法としては、例えば、経口投与、あるいは注射や点滴などの方法によって静脈内や皮下、腹腔内など直接体内に投与する方法や外用とすることができ、特別に制限されない。
本発明における剤の投与量は、その剤型、投与方法、あるいは予防もしくは治療しようとする症状により異なるが、例えば、体重1kg当りの投与量として1,5−AFで0.1μg〜1,000mg、好ましくは、1mg〜1,000mgとすることができ、1日1回あるいは数回、あるいは数日毎に1回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。
本発明における剤の投与量は、その剤型、投与方法、あるいは予防もしくは治療しようとする症状により異なるが、例えば、体重1kg当りの投与量として1,5−AFで0.1μg〜1,000mg、好ましくは、1mg〜1,000mgとすることができ、1日1回あるいは数回、あるいは数日毎に1回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。
本発明のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、吸入薬等が挙げられるが、特に制限されない。また、製剤を調製するうえで必要な成分、例えば、製剤担体や賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、安定剤等を含有することもできる。
さらに、本発明の効果を奏する限り、他の抗動脈硬化薬、抗糖尿病薬あるいはその他の薬理成分あるいは栄養成分を含むことも可能である。
また、本発明のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤の利用は医薬品用途に限られるものではなく、医薬部外品、食品、飲料等に配合することも可能である。例えば、1,5−AFを食品に添加して、動脈硬化症の治療を目的とした機能性食品のような形態をとることもできる。
本発明を食品として用いる場合の形態としては飲料、乳製品、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、冷凍食品などの各種食品が挙げられる。
また、本発明のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤の利用は医薬品用途に限られるものではなく、医薬部外品、食品、飲料等に配合することも可能である。例えば、1,5−AFを食品に添加して、動脈硬化症の治療を目的とした機能性食品のような形態をとることもできる。
本発明を食品として用いる場合の形態としては飲料、乳製品、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、冷凍食品などの各種食品が挙げられる。
本発明のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤は、人間以外の哺乳動物にも投与することができる。すなわち、その場合、哺乳動物に対し、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤や転写因子PPARγやC/EBPβの産生抑制剤を適量投与することによって、肥満、高血圧、脂質代謝異常(脂質異常症)、糖尿病、動脈硬化、肝線維症、癌の予防や治療を行うことができる。
以下に、本発明の実施例を示すが本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
1.実験方法
(1)前駆脂肪細胞の培養
マウス線維芽細胞である3T3−L1細胞は10%牛胎児血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、明治製菓)およびストレプトマイシン(50mg/ml、明治製菓(株))を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 培地 (日水製薬(株))で37℃、5% CO2に調整したインキュベーター内において、6〜7日間前培養を行った。トリプシン/EDTA溶液処理で細胞を剥がした後、細胞数を1.0×105cells/ml になるように調整した。
(2)前駆脂肪細胞の継代
培地を取り除き、細胞をリン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、トリプシン/EDTA溶液で細胞が一部剥がれるまで作用させた後、中和液(FBS:PBS=1:2)を添加した。細胞を回収した後、懸濁して遠心分離 (3,000rpm、5分間、4℃) し、上清を取り除いてDMEM培地を加え、細胞数を1.0×105〜1.0×106cells/mlになるように調整した。
(3)前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化誘導
前駆脂肪細胞をプレコンフルエント状態にまで培養した後に、牛由来インスリン(0.2μM、和光純薬工業(株))、デキサメタゾン0.25μM、和光純薬工業(株))、3−イソブチル−1−メチルキサンチン (0.5mM、和光純薬工業)を添加したDMEM培地に交換した。2日後にインスリン(0.2μM) のみを添加した培地に交換し、以後2日ごとに新しいDMEM培地に交換して、誘導開始8日目に分化誘導を完了した。なお、サンプルの添加は培地を交換する2日ごとに行った。
1.実験方法
(1)前駆脂肪細胞の培養
マウス線維芽細胞である3T3−L1細胞は10%牛胎児血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、明治製菓)およびストレプトマイシン(50mg/ml、明治製菓(株))を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 培地 (日水製薬(株))で37℃、5% CO2に調整したインキュベーター内において、6〜7日間前培養を行った。トリプシン/EDTA溶液処理で細胞を剥がした後、細胞数を1.0×105cells/ml になるように調整した。
(2)前駆脂肪細胞の継代
培地を取り除き、細胞をリン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、トリプシン/EDTA溶液で細胞が一部剥がれるまで作用させた後、中和液(FBS:PBS=1:2)を添加した。細胞を回収した後、懸濁して遠心分離 (3,000rpm、5分間、4℃) し、上清を取り除いてDMEM培地を加え、細胞数を1.0×105〜1.0×106cells/mlになるように調整した。
(3)前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化誘導
前駆脂肪細胞をプレコンフルエント状態にまで培養した後に、牛由来インスリン(0.2μM、和光純薬工業(株))、デキサメタゾン0.25μM、和光純薬工業(株))、3−イソブチル−1−メチルキサンチン (0.5mM、和光純薬工業)を添加したDMEM培地に交換した。2日後にインスリン(0.2μM) のみを添加した培地に交換し、以後2日ごとに新しいDMEM培地に交換して、誘導開始8日目に分化誘導を完了した。なお、サンプルの添加は培地を交換する2日ごとに行った。
(4)3T3−L1成熟脂肪細胞の培養
分化誘導を完了し脂肪滴が蓄積した状態となった3T3−L1成熟脂肪細胞に、1,5−AFを添加して培養3日後に各種測定を行った。
(5)前駆脂肪細胞の生存率の測定 (Neutral red 法)
Neutral redは損傷を受けていない細胞膜を通過し、生存細胞のリソソームに取り込まれる。この性質を利用して細胞内に取り込まれた Neutral red量を測定し、生存細胞の割合を測定することによって細胞生存率を算出した。
1,5−AFを添加して24時間後に培地を除去し、Neutral red試薬 (0.25mg/ml、和光純薬工業(株))を最終濃度が50 μg/mlになるように細胞に加えた。37℃で2時間インキュベーションした後、細胞を1%ホルムアルデヒド、1%塩化カルシウム、98%超純水の混合液で2回洗い、連続して1%酢酸、50%エタノール、49%超純水を含む 脱色抽出液1mlを細胞に加え、30分間静置した。
リソソームの Neutral red吸収量は吸光光度計(Beckman Coulter,DU530)を用いて540nmで測定した。細胞生存率はコントロールの吸光度を100%とした時の相対値で表した。
分化誘導を完了し脂肪滴が蓄積した状態となった3T3−L1成熟脂肪細胞に、1,5−AFを添加して培養3日後に各種測定を行った。
(5)前駆脂肪細胞の生存率の測定 (Neutral red 法)
Neutral redは損傷を受けていない細胞膜を通過し、生存細胞のリソソームに取り込まれる。この性質を利用して細胞内に取り込まれた Neutral red量を測定し、生存細胞の割合を測定することによって細胞生存率を算出した。
1,5−AFを添加して24時間後に培地を除去し、Neutral red試薬 (0.25mg/ml、和光純薬工業(株))を最終濃度が50 μg/mlになるように細胞に加えた。37℃で2時間インキュベーションした後、細胞を1%ホルムアルデヒド、1%塩化カルシウム、98%超純水の混合液で2回洗い、連続して1%酢酸、50%エタノール、49%超純水を含む 脱色抽出液1mlを細胞に加え、30分間静置した。
リソソームの Neutral red吸収量は吸光光度計(Beckman Coulter,DU530)を用いて540nmで測定した。細胞生存率はコントロールの吸光度を100%とした時の相対値で表した。
(6)トリアシルグリセロール(TG)蓄積量(Oil red O染色法)
Oil red O/イソプロパノール飽和溶液をよく振ってから、飽和溶液:超純水=6:4の割合で混合した後、10分後に0.45μmフィルターを用いて濾過した。細胞の分化誘導終了後、アスピレーターで培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄した。
70%エタノールで30秒間固定した後、Oil red O染色液を2ml添加し、室温で2時間放置した。50%エタノールで10秒洗浄した後、脱イオン水で水の赤みが消えるまで洗浄した。倒立顕微鏡(OLYMPUS IX−70)を用いて明視野で倍率を200倍にして観察し、写真撮影した後、イソプロパノール3mlを添加し、Oil red O染色液を抽出した。さらに、その抽出液を520nmの波長で吸光度を測定した。
Oil red O/イソプロパノール飽和溶液をよく振ってから、飽和溶液:超純水=6:4の割合で混合した後、10分後に0.45μmフィルターを用いて濾過した。細胞の分化誘導終了後、アスピレーターで培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄した。
70%エタノールで30秒間固定した後、Oil red O染色液を2ml添加し、室温で2時間放置した。50%エタノールで10秒洗浄した後、脱イオン水で水の赤みが消えるまで洗浄した。倒立顕微鏡(OLYMPUS IX−70)を用いて明視野で倍率を200倍にして観察し、写真撮影した後、イソプロパノール3mlを添加し、Oil red O染色液を抽出した。さらに、その抽出液を520nmの波長で吸光度を測定した。
(7)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ (GPDH) 活性の測定
100mM トリエタノールアミン/2.5mM EDTA溶液をウォーターバス上の試験管内で28℃に保っておいた。本培養終了後、dishをPBSで2回洗浄し、100mM トリエタノールアミン/2.5mM EDTA溶液を300μl添加してセルスクレイパーで細胞を回収した。その後、超音波処理によって細胞を破壊し、すばやく遠心分離 (13,000rpm、5分間、4℃)し、上清を細胞液として使用した。ウォーターバス上の試験管に6mM 2−メルカプトエタノール(最終濃度0.1mM)、7.2mM NADH(最終濃度0.12mM)、12mM ジヒドロキシアセトンリン酸(最終濃度0.2mM)、細胞液を加え、340nmの吸光度にて3分間測定した。GPDHの活性はNADHの吸光係数6.22 mM−1cm−1を用いて計算し、1分間当たりのNADHの変化量をもとに算出した。酵素活性は コントロール(100%)に対する値で表した。
100mM トリエタノールアミン/2.5mM EDTA溶液をウォーターバス上の試験管内で28℃に保っておいた。本培養終了後、dishをPBSで2回洗浄し、100mM トリエタノールアミン/2.5mM EDTA溶液を300μl添加してセルスクレイパーで細胞を回収した。その後、超音波処理によって細胞を破壊し、すばやく遠心分離 (13,000rpm、5分間、4℃)し、上清を細胞液として使用した。ウォーターバス上の試験管に6mM 2−メルカプトエタノール(最終濃度0.1mM)、7.2mM NADH(最終濃度0.12mM)、12mM ジヒドロキシアセトンリン酸(最終濃度0.2mM)、細胞液を加え、340nmの吸光度にて3分間測定した。GPDHの活性はNADHの吸光係数6.22 mM−1cm−1を用いて計算し、1分間当たりのNADHの変化量をもとに算出した。酵素活性は コントロール(100%)に対する値で表した。
(8)転写調節因子発現の検出(ウェスタンブロッティング法)
1,5−AFを添加して48時間後、dishをPBSで1回洗浄し、Buffer X(表1)で細胞を回収し、遠心分離(10,000rpm、10分間、4℃)を行った後、上清を取り除いてBuffer Y(表2)を加えた。その後、凍結−解凍を2回行い、超音波処理で細胞膜を破壊した。すばやく遠心分離 (3,500rpm、10分間、4℃)し、核画分を含む沈殿物を得た。
沈殿物にBuffer Yを添加し、よくピペッティングをして沈殿を分散させた後、冷置(30分間、4℃)した。さらに、超音波処理で核を破壊した。その後、すばやく遠心分離(15,000rpm、10分間、4℃)し、上清を核タンパク質として使用した。20μgのタンパク質をLaemmliらの方法を用いて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分離した。SDS−PAGEによってタンパク質の分離を行ったゲルは、BIO−RAD Trans blot SDを用いてブロッティングを行った。ブロッティング終了後、PVDFメンブレンはSNAPid(Milipore社)を用いて、酵素抗体法による転写調節因子の検出を行った。用いた抗体は、抗PPARγマウスモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechunology社)、抗C/EBPαウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology社)、抗C/EBPβ マウスモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechunology社)である。また、恒常的に発現することが知られているβ−アクチンおよびチューブリンβをコントロールとして用いた。
1,5−AFを添加して48時間後、dishをPBSで1回洗浄し、Buffer X(表1)で細胞を回収し、遠心分離(10,000rpm、10分間、4℃)を行った後、上清を取り除いてBuffer Y(表2)を加えた。その後、凍結−解凍を2回行い、超音波処理で細胞膜を破壊した。すばやく遠心分離 (3,500rpm、10分間、4℃)し、核画分を含む沈殿物を得た。
沈殿物にBuffer Yを添加し、よくピペッティングをして沈殿を分散させた後、冷置(30分間、4℃)した。さらに、超音波処理で核を破壊した。その後、すばやく遠心分離(15,000rpm、10分間、4℃)し、上清を核タンパク質として使用した。20μgのタンパク質をLaemmliらの方法を用いて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分離した。SDS−PAGEによってタンパク質の分離を行ったゲルは、BIO−RAD Trans blot SDを用いてブロッティングを行った。ブロッティング終了後、PVDFメンブレンはSNAPid(Milipore社)を用いて、酵素抗体法による転写調節因子の検出を行った。用いた抗体は、抗PPARγマウスモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechunology社)、抗C/EBPαウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology社)、抗C/EBPβ マウスモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechunology社)である。また、恒常的に発現することが知られているβ−アクチンおよびチューブリンβをコントロールとして用いた。
2.実験結果
前駆脂肪細胞の生存率に及ぼす1,5−AFの影響を調べた結果を図1に示す。細胞生存率は、培地中の1,5−AF濃度が200〜800μg/mlの範囲ではコントロール群と差がないことから1,5−AFは前駆脂肪細胞に対して細胞毒性を示さなかった。
前駆脂肪細胞は成熟脂肪細胞へと分化すると、細胞内に脂肪滴を蓄積するようになる。前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化の度合いを評価するため、Oil red O法によって脂肪滴を染色した。その結果、図2に示すように、Oil red O法によって染色された前駆脂肪細胞の細胞内脂肪滴は、コントロールでは、大小様々な大きさの脂肪滴が数多く観察されるが、1,5−AFを添加すると、細胞内の脂肪滴は、大きさが小さくなり、その数も減少した。さらに、800μg/mlの1,5−AFを添加すると、脂肪滴はほとんど観察されなかった。
このことから、1,5−AF添加によって脂肪前駆細胞からの脂肪細胞への分化が抑制されることが解った。
前駆脂肪細胞の生存率に及ぼす1,5−AFの影響を調べた結果を図1に示す。細胞生存率は、培地中の1,5−AF濃度が200〜800μg/mlの範囲ではコントロール群と差がないことから1,5−AFは前駆脂肪細胞に対して細胞毒性を示さなかった。
前駆脂肪細胞は成熟脂肪細胞へと分化すると、細胞内に脂肪滴を蓄積するようになる。前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化の度合いを評価するため、Oil red O法によって脂肪滴を染色した。その結果、図2に示すように、Oil red O法によって染色された前駆脂肪細胞の細胞内脂肪滴は、コントロールでは、大小様々な大きさの脂肪滴が数多く観察されるが、1,5−AFを添加すると、細胞内の脂肪滴は、大きさが小さくなり、その数も減少した。さらに、800μg/mlの1,5−AFを添加すると、脂肪滴はほとんど観察されなかった。
このことから、1,5−AF添加によって脂肪前駆細胞からの脂肪細胞への分化が抑制されることが解った。
TGは脂肪酸とグルコースから生合成されるが、その合成段階にはGPDHも関与していることから、GPDHは、TG合成の律速酵素となっている。そこで、GPDH活性を測定した。その結果、200〜800μg/mlの範囲で1,5−AFの添加濃度に依存してGPDH活性が阻害された(図3)。
PPARγおよびC/EBPα は核内転写調節因子であり、脂肪細胞の分化において重要な役割を果たしている。また、C/EBPβはPPARγやC/EBPαの上流に位置する。そこで、細胞内PPARγやC/EBPβ量に及ぼす1,5−AFによる影響を調べた。その結果、図4および図5に示すように、1,5−AFは濃度依存的にこれら二つの転写因子の発現を抑制した。このことから、1,5−AFによる細胞内PPARγやC/EBPαの発現抑制が脂肪合成酵素を阻害することによって、脂肪蓄積量の減少につながったものと考えられた。
PPARγおよびC/EBPα は核内転写調節因子であり、脂肪細胞の分化において重要な役割を果たしている。また、C/EBPβはPPARγやC/EBPαの上流に位置する。そこで、細胞内PPARγやC/EBPβ量に及ぼす1,5−AFによる影響を調べた。その結果、図4および図5に示すように、1,5−AFは濃度依存的にこれら二つの転写因子の発現を抑制した。このことから、1,5−AFによる細胞内PPARγやC/EBPαの発現抑制が脂肪合成酵素を阻害することによって、脂肪蓄積量の減少につながったものと考えられた。
次に、成熟脂肪細胞の肥大化の抑制に及ぼす1,5−AFの影響を調べた。1,5−AFを添加しても、成熟脂肪細胞の生存率はコントロール群と同じであったことから、1,5−AFは成熟脂肪細胞に対しても細胞毒性を示さなかった(図6)。細胞内のTG蓄積量は、1,5−AFを400〜800μg/mlの範囲で添加することによって、濃度依存的に減少した(図7)。また、Oil red O法によって染色された成熟脂肪細胞の細胞内脂肪滴は、コントロールでは、大きな脂肪滴が数多く観察されるが、1,5−AFを添加すると、細胞内の脂肪滴は、大きさが小さくなり、その数も減少した。この効果は、1,5−AFの添加濃度に依存していた(図8)。さらに、脂肪合成の転写因子であるPPARγ発現量も1,5−AFの添加濃度に依存して顕著に減少した(図9)。
以上の結果から、1,5−AFは前駆脂肪細胞の分化を抑制すること、成熟脂肪細胞の脂肪蓄積量を低下させることが明らかになった。さらに、これらのことは、PPARγやC/EBPαなどの転写因子が1,5−AFによって抑制されることが関与することを示唆している。
以上の結果から、1,5−AFは前駆脂肪細胞の分化を抑制すること、成熟脂肪細胞の脂肪蓄積量を低下させることが明らかになった。さらに、これらのことは、PPARγやC/EBPαなどの転写因子が1,5−AFによって抑制されることが関与することを示唆している。
Claims (5)
- 1,5−D−アンヒドロフルクトースからなるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの活性阻害剤。
- 1,5−D−アンヒドロフルクトースからなる脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβの産生抑制剤。
- グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼが前駆脂肪細胞または成熟脂肪細胞に由来する請求項1の活性阻害剤。
- 脂肪合成転写因子PPARγおよび/またはC/EBPβが前駆脂肪細胞または成熟脂肪細胞に由来する請求項2の産生抑制剤。
- 成熟脂肪細胞内の脂肪滴の大きさの縮小を伴う請求項2の産生抑制剤。
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