JP2013172682A - Mutation-type reductase and utilization thereof - Google Patents

Mutation-type reductase and utilization thereof Download PDF

Info

Publication number
JP2013172682A
JP2013172682A JP2012039796A JP2012039796A JP2013172682A JP 2013172682 A JP2013172682 A JP 2013172682A JP 2012039796 A JP2012039796 A JP 2012039796A JP 2012039796 A JP2012039796 A JP 2012039796A JP 2013172682 A JP2013172682 A JP 2013172682A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
mutation
replaced
mutations
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2012039796A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Shinya Ito
伸哉 伊藤
Hiroyuki Asako
弘之 朝子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyama Prefecture
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Toyama Prefecture
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyama Prefecture, Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Toyama Prefecture
Priority to JP2012039796A priority Critical patent/JP2013172682A/en
Publication of JP2013172682A publication Critical patent/JP2013172682A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a mutation-type reductase utilizable in a reduction reaction, and to provide the utilization or the like of the reductase.SOLUTION: There is provided an enzyme having an amino acid sequence equivalent to an original amino acid sequence except having four or more amino acid mutations including the whole of the following basic amino acid mutations (a) to (d) in a specific amino acid sequence originated from Rhodococcus erythropolis, and further having the ability for reducing a substrate. <The basic amino acid mutation>: (a) the amino acid mutation by the substitution of the 12th glutamic acid with glycine; (b) the amino acid mutation by the substitution of the 42th aspartic acid with valine; (c) the amino acid mutation by the substitution of the 67th lysine with arginine; and (d) the amino acid mutation by the substitution of the 317th serine with alanine.

Description

本発明は、還元反応に利用可能な変異型還元酵素及びその利用に関するものである。   The present invention relates to a mutant reductase that can be used in a reduction reaction and the use thereof.

還元反応に利用可能な酵素、即ち、還元酵素は、基質を還元する能力を有し、医農薬の有効成分となる化合物やその製造中間体、特に光学活性化合物等を製造する為の有機合成反応に利用されている。
例えば、特許文献１には、ライフソニア エスピー(Leifsonia sp.)Ｓ−７４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）から還元酵素の遺伝子をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。また、種々のアミノ酸変異を導入して得られる変異型還元酵素も報告されている（例えば、特許文献１参照）。 Enzymes that can be used in reductive reactions, ie, reductases, have the ability to reduce substrates, and organic synthesis reactions for producing compounds that are active ingredients of medicines and agrochemicals and their intermediates, especially optically active compounds Has been used.
For example, Patent Document 1 discloses that a reductase gene is cloned from Leifsonia sp. S-749 (FERM BP-8291), and an optically active alcohol is obtained using a transformant expressing the reductase. A method of manufacturing is disclosed. Also, mutant reductases obtained by introducing various amino acid mutations have been reported (see, for example, Patent Document 1).

光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素は、当該酵素による還元反応における反応生成物の光学純度が高いこと、基質の絶対立体配置に対する当該酵素の認識性が高いこと、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等の各種反応条件に対する安定性が高いこと等の性能を備えていることが望ましい。中でも温度に対する還元酵素の安定性（即ち、熱安定性）が高いと、反応温度を高くすることが可能となり、反応速度を高めるだけでなく、反応中の還元酵素の失活を軽減することができる（例えば、非特許文献１参照）。   The reductase used industrially to produce optically active compounds and production intermediates thereof has high optical purity of the reaction product in the reduction reaction by the enzyme, and recognition of the enzyme with respect to the absolute configuration of the substrate. It is desirable to have performance such as high performance and high stability to various reaction conditions such as temperature, pH, solvent, and pressure. Above all, when the stability of the reductase with respect to temperature (that is, thermal stability) is high, it becomes possible to increase the reaction temperature and not only increase the reaction rate but also reduce the deactivation of the reductase during the reaction. (For example, refer nonpatent literature 1).

特許第４３６６０９７号公報Japanese Patent No. 4366097

Applied Microbiology Biotechnology，８０，８０５−８１２（２００８）Applied Microbiology Biotechnology, 80, 805-812 (2008)

本発明は、還元反応に利用可能な変異型還元酵素及びその利用等を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a mutant reductase that can be used in a reduction reaction, use thereof, and the like.

本発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、ある種の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他の特定のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する還元酵素（即ち、変異型還元酵素）が優れた熱安定性を示すことを見い出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素（以下、本発明酵素と記すこともある。）；
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異 As a result of intensive studies under such circumstances, the present inventor has found that a reductase having an amino acid sequence in which a specific amino acid is substituted with another specific amino acid in the amino acid sequence of a certain type of wild-type reductase ( That is, it was found that the mutant reductase) exhibits excellent thermal stability, and has led to the present invention.
That is, the present invention
1. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has four or more amino acid mutations including all of the following basic amino acid mutations (a) to (d) An enzyme having an amino acid sequence and an ability to reduce a substrate (hereinafter sometimes referred to as the enzyme of the present invention);
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is replaced by alanine

２．アミノ酸変異が４個のみであることを特徴とする前項１記載の酵素；
３．アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）を１個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
４．アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）を１個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
５．アミノ酸変異が６個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）及び（ｇ）を２個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異 2. 2. The enzyme according to item 1 above, wherein there are only 4 amino acid mutations;
3. 2. The enzyme according to item 1 above, wherein the enzyme has 5 amino acid mutations and contains one of the following additional amino acid mutations (e) in addition to the four basic amino acid mutations described above;
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline. 2. The enzyme according to item 1 above, wherein the number of amino acid mutations is 5 and one of the following additional amino acid mutations (f) is included in addition to the four basic amino acid mutations described above;
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is substituted with valine 2. The amino acid mutation is 6 and the following additional amino acid mutations (e) and (g) are included in addition to the 4 basic amino acid mutations described above, enzyme;
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine

６．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
７．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異 6). 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (e), (g) and (h) below in addition to the 4 basic amino acid mutations described above The enzyme according to item 1;
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (e), (h) and (i) below in addition to the 4 basic amino acid mutations described above The enzyme according to item 1;
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine (i) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with arginine

８．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
９．アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を４個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異 8). 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (f), (g) and (h) below in addition to the above 4 basic amino acid mutations The enzyme according to item 1;
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which 339th serine is replaced with asparagine (h) 27th glutamic acid is replaced with glutamine There are 8 amino acid mutations, and in addition to the 4 basic amino acid mutations described above, the following additional amino acid mutations (e), (g), (h) and (j) are included. The enzyme according to item 1, characterized by the following:
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine (j) 28th Amino Acid Mutation That Replaces Valine in Isoleucine

１０．アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）を４個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
１１．下記の配列番号２乃至９のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素；
１２．アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする前項１記載の酵素；
１３．アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする前項１記載の酵素； 10. There are 8 amino acid mutations, and in addition to the 4 basic amino acid mutations described above, the following additional amino acid mutations (f), (g), (h) and (k) are included. The enzyme according to item 1, characterized by the following:
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which 27th glutamic acid is replaced with glutamine (k) 28th Amino acid mutations in which the valine is replaced by methionine11. An enzyme having an amino acid sequence of any one of the following SEQ ID NOs: 2 to 9 and having an ability to reduce a substrate;
12 2. The enzyme according to item 1 above, wherein the amino acid mutation is 5 or more and 8 or less;
13. 2. The enzyme according to item 1 above, wherein the amino acid mutation is 5 or more and 8 or less;

１４．前項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）；
１５．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１４記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド；
１６．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１７．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は前項１６記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１８．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１７記載の形質転換体；
１９．微生物が大腸菌であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２０．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は前項１６記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法（以下、本発明形質転換体製造方法と記すこともある。）； 14 A polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme according to any one of claims 1 to 13 (hereinafter sometimes referred to as the polynucleotide of the present invention);
15. A polynucleotide comprising a promoter capable of functioning in a host cell and the polynucleotide described in 14 above in a functional manner;
16. A vector comprising the polynucleotide according to item 14 or 15 above (hereinafter sometimes referred to as a vector of the present invention);
17. A transformant obtained by introducing the polynucleotide according to item 14 or 15 or the vector according to item 16 into a host cell (hereinafter sometimes referred to as the transformant of the present invention);
18. 18. The transformant according to item 17 above, wherein the host cell is a microorganism;
19. 19. The transformant according to item 18 above, wherein the microorganism is Escherichia coli;
20. A method for producing a transformant comprising the step of introducing the polynucleotide according to item 14 or 15 or the vector according to item 16 into a host cell (hereinafter sometimes referred to as the method for producing the transformant of the present invention). );

２１．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素若しくはそれらを産生する微生物又は前項１７乃至１９のいずれかの請求項記載の形質転換体、或いは、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法（以下、本発明アルコール化合物製造方法と記すこともある。）；
２２．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明酵素改変方法と記すこともある。）；
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異 21. The enzyme according to any one of claims 1 to 13, the microorganism producing them, or the transformant according to any one of claims 17 to 19 or a processed product thereof into a ketone compound or an aldehyde compound. A method for producing an alcohol compound, which is characterized by acting (hereinafter sometimes referred to as the method for producing an alcohol compound of the present invention);
22. A method for modifying an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 comprises 4 amino acid mutations including all of the following basic amino acid mutations (a) to (d): A step of introducing an amino acid mutation so as to have an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an ability of the enzyme to reduce a substrate, except that it has at least one (Hereinafter sometimes referred to as the enzyme modification method of the present invention);
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is replaced by alanine

２３．配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明ポリヌクレオチド改変方法と記すこともある。）；
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
等を提供するものである。 23. A method for modifying a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is based on the following basic base mutation (a ′): (D ') has a base sequence equivalent to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that it has 4 or more base mutations including all of the above, and the enzyme reduces the substrate A method characterized by including a step of introducing a base mutation so as to become a base sequence encoding an amino acid sequence having the ability (hereinafter also referred to as the polynucleotide modification method of the present invention);
<Basic base mutation>
(A ′) 34th to 36th codons encoding glutamic acid are replaced with codons encoding glycine (b ′) 124th to 126th codons encoding aspartic acid, Base mutations (c ') substituted for codons encoding valine (c') Base mutations (d ') from 199th to 951th, where lysine-encoding codons are replaced with codons encoding arginine The present invention provides a base mutation in which the codon encoding serine is replaced with a codon encoding alanine.

本発明により、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコール化合物を製造するために優れた変異型還元酵素等が提供可能になる。   According to the present invention, it is possible to provide an excellent mutant reductase or the like for producing an alcohol compound from a ketone compound or an aldehyde compound.

文中で特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。   Unless defined otherwise in the text, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described below. All publications and patents mentioned in this specification are herein incorporated by reference for the purpose of describing and disclosing constructs and methodologies described in, for example, publications that may be used in connection with the described invention. Incorporated into the book.

以下、更に詳細に本発明を説明する。
本出願において、例えば「E12G」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１２番目（「12」：アミノ酸配列のＮ末端からの位置番号）のグルタミン酸（「E」：一文字表記）がグリシン（「G」：一文字表記）に置換されるアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有する酵素を意味している。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
In the present application, for example, “E12G” means that the 12th (“12”: position number from the N-terminal of the amino acid sequence) glutamic acid (“E”: single letter code) is glycine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It means an enzyme having an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 except that it has an amino acid mutation to be substituted ("G": single letter notation).

本発明において「熱安定性」とは、例えば、６５℃で３０分間の保温処理を行った後の還元酵素活性の残存率が、同様に処理した野生型還元酵素の還元酵素活性の残存率よりも高いことを意味する。   In the present invention, “thermal stability” means, for example, that the residual rate of reductase activity after performing a heat treatment at 65 ° C. for 30 minutes is based on the residual rate of the reductase activity of the wild-type reductase treated in the same manner. Means high.

まず、本発明における変異型還元酵素、即ち、本発明酵素について説明する。
配列番号１で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列とは、３４８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物由来の還元酵素である。当該還元酵素及び本発明酵素の還元酵素活性（即ち、基質を還元する能力）は、これらのタンパク質を、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド、ＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、遊離するＮＡＤ＋量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。 First, the mutant reductase in the present invention, that is, the enzyme of the present invention will be described.
The amino acid sequence of the wild-type reductase represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence consisting of 348 amino acid residues and is derived from a microorganism belonging to the genus Rhodococcus (preferably Rhodococcus erythropolis) It is a reductase. The reductase activity (that is, the ability to reduce a substrate) of the reductase and the enzyme of the present invention is determined by mixing these proteins with, for example, m-chlorophenacyl chloride, NADH, keeping it at 30 ° C., and releasing NAD. The + amount can be measured by quantifying the absorbance at 340 nm of the reaction solution as an index.

尚、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。   The microorganism belonging to the genus Rhodococcus (preferably Rhodococcus erythropolis) may be isolated from nature or purchased from a strain storage organization or the like.

天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を滅菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、ＰＹ培地（Bacto Peptoneを５ｇ／Ｌ、Yeast Extractを５ｇ／Ｌの割合で水に溶解した後、ｐＨを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養する。数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、得られたコロニーを新鮮な培地、例えば、ＰＹ培地等の微生物分離用固体培地に移植した後、これを更に２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.): Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物であるかを同定することにより、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を選抜すればよい。   When separating from nature, soil is first collected from the field. After the collected soil is suspended in sterilized water, the suspension is dissolved in, for example, PY medium (5 g / L of Bacto Peptone and 5 g / L of Yeast Extract in water at a pH of 7). Is applied to a solid medium for separating microorganisms such as 0. and cultured at 25 ° C. An independent colony of fungi that has grown several days later is cut out, and the obtained colony is transplanted to a fresh medium, for example, a solid medium for microorganism separation such as PY medium, and further cultured at 25 ° C. The grown bacteria are described in SNEATH, (PHA), MAIR, (NS) SHARPE, (ME) and HOLT, (JG): Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol. 2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore. The microorganism belonging to the genus Rhodococcus may be selected by identifying whether the microorganism belongs to the genus Rhodococcus in accordance with the method to be performed.

次いで、選抜されたロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物から、当該微生物の３−オキソ酪酸エチル等のケトン化合物を還元して３−ヒドロキシ酪酸エチル等のアルコール化合物を生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を選抜すればよい。   Next, from the selected microorganism belonging to the genus Rhodococcus, the presence or absence of the ability to produce an alcohol compound such as ethyl 3-hydroxybutyrate by reducing a ketone compound such as ethyl 3-oxobutyrate of the microorganism, for example, A microorganism belonging to the genus Rhodococcus used in the present invention may be selected by confirming according to a method as described in Examples described later.

このように選抜されたロドコッカス(Rhodococcus)に属する微生物のうち、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ＳＴ−１０株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３１５０の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成４年９月８日）。   Among the microorganisms belonging to Rhodococcus thus selected, Rhodococcus erythropolis ST-10 strain has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary and is registered as FERM BP-13150. A deposit number is given (original deposit date: September 8, 1992).

本発明酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有する。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）は、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ＳＴ−１０株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）由来の公知の還元酵素である。 The enzyme of the present invention is represented by SEQ ID NO: 1 except that it has four or more amino acid mutations including all of the following basic amino acid mutations (a) to (d) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Has an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence to be reduced and has the ability to reduce the substrate.
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 An amino acid mutation in which the second serine is substituted with alanine. The enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having the ability to reduce the substrate (wild-type reductase) is Rhodococcus erythropolis. It is a known reductase derived from ST-10 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center).

本発明酵素としては、４個以上のアミノ酸変異（例えば、４個以上８個以下のアミノ酸変異、好ましくは４個以上７個以下のアミノ酸変異、より好ましくは４個以上６個以下のアミノ酸変異、特に好ましくは４個以上５個以下のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異）を含むが、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までのアミノ酸変異の他に、他のアミノ酸変異（例えば、１個以上４個以下の他のアミノ酸変異、好ましくは１個以上３個以下の他のアミノ酸変異、より好ましくは１個以上２個以下の他のアミノ酸変異、１つの他のアミノ酸変異）を含むことができる。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異 As the enzyme of the present invention, 4 or more amino acid mutations (for example, 4 to 8 amino acid mutations, preferably 4 to 7 amino acid mutations, more preferably 4 to 6 amino acid mutations, 4 to 5 amino acid mutations and 5 amino acid mutations are particularly preferable. For example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, from the following basic amino acid mutations (a) to (d): Other amino acid mutations (for example, 1 to 4 other amino acid mutations, preferably 1 to 3 other amino acid mutations, more preferably 1 to 2 amino acid mutations). Other amino acid mutations, one other amino acid mutation).
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is replaced by alanine

前記の「他のアミノ酸変異」としては、例えば、
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
等を挙げることができる。 As the “other amino acid mutation”, for example,
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (f) Amino acid mutation in which the 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) 27th position Amino acid mutation in which glutamic acid is substituted with glutamine (i) amino acid mutation in which 339th serine is replaced with arginine (j) amino acid mutation in which 28th valine is replaced with isoleucine (k) 28th valine is replaced with methionine Examples include amino acid mutations to be substituted.

前記の「・・・アミノ酸変異を４個以上有する・・・」としては、例えば、４個のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異、６個のアミノ酸変異、７個のアミノ酸変異、８個のアミノ酸変異等を挙げることができる。   As the above-mentioned “... having 4 or more amino acid mutations ...”, for example, 4 amino acid mutations, 5 amino acid mutations, 6 amino acid mutations, 7 amino acid mutations, 8 amino acid mutations Mutation etc. can be mentioned.

前記の「５個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 As the above-mentioned “5 amino acid mutations”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine of the 1st is substituted with alanine (e) An amino acid mutation in which the serine of the 107th is substituted with proline can be mentioned.

前記の「５個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 As the above-mentioned “5 amino acid mutations”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine at the 2nd is substituted with alanine (f) An amino acid mutation in which the alanine at the 228th is substituted with valine can be mentioned.

前記の「６個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 As the “six amino acid mutation”, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Examples include amino acid mutations in which the serine is replaced with alanine (e) amino acid mutations in which the 107th serine is replaced with proline (g) amino acid mutations in which the 339th serine is replaced with asparagine.

また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 In addition, as the “seven amino acid mutation”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine is replaced with alanine (e) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) The 27th glutamic acid is glutamine Amino acid mutations to be substituted.

また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 In addition, as the “seven amino acid mutation”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine is replaced with alanine (e) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine (i) The 339th serine is arginine Amino acid mutations to be substituted.

また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 In addition, as the “seven amino acid mutation”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine is replaced with alanine (f) Amino acid mutation in which the 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) The 27th glutamic acid is glutamine Amino acid mutations to be substituted.

また、前記の「８個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 In addition, as the “eight amino acid mutation”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine is replaced with alanine (e) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) The 27th glutamic acid is glutamine (J) Amino acid mutation in which the 28th valine is replaced with isoleucine.

また、前記の「８個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。 In addition, as the “eight amino acid mutation”, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the serine is replaced with alanine (f) Amino acid mutation in which the 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) The 27th glutamic acid is glutamine (K) Amino acid mutation in which the 28th valine is replaced with methionine.

本発明酵素は、熱安定性の向上した変異型還元酵素である。当該還元酵素は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物の存在下であっても活性を高く保持でき、及び／または、高い基質濃度下で変換反応が可能であることから、工業的なアルコール化合物の製造において有利である。
本発明酵素は、例えば、６５℃で３０分間保温処理した後、３μｍｏｌの３−オキソ酪酸エチルの存在下において２５℃で還元反応を行った場合の還元酵素活性が、同様に保温処理した場合の、野生型還元酵素、特許第４５５８４１４号公報に記載される変異型還元酵素等の還元酵素活性よりも高く、耐熱性に優れる。 The enzyme of the present invention is a mutant reductase with improved thermal stability. Since the reductase can maintain a high activity even in the presence of a substrate ketone compound or aldehyde compound and / or can undergo a conversion reaction under a high substrate concentration, It is advantageous in manufacturing.
The enzyme of the present invention is obtained when, for example, the reductase activity when the reductive reaction is carried out at 25 ° C. in the presence of 3 μmol of ethyl 3-oxobutyrate after the heat treatment at 65 ° C. for 30 minutes, It is higher than the reductase activity of a wild type reductase, a mutant reductase described in Japanese Patent No. 4558414, etc., and is excellent in heat resistance.

次いで、本発明ポリヌクレオチドについて説明する。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する変異型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された変異型遺伝子であってもよい。また、特許第４５５８４１４号公報や、特許第４７４５７６２号公報に記載される還元酵素をコードするポリヌクレオチドを人工合成したものに変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された変異型遺伝子であってもよい。更には、人工的に全ヌクレオチドを合成した人工合成ポリヌクレオチドであってもよい。上記のような変異型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物をその対象として挙げることができる。 Next, the polynucleotide of the present invention will be described.
The polynucleotide of the present invention may be a naturally occurring mutant gene, or a mutant that is created by introducing a mutation into a natural wild-type gene (site-directed mutagenesis, mutation treatment, etc.) It may be a gene. Further, by introducing a mutation (site-directed mutagenesis, mutation treatment, etc.) into an artificially synthesized polynucleotide encoding the reductase described in Japanese Patent No. 4558414 and Japanese Patent No. 4745762. It may be a created mutant gene. Further, it may be an artificially synthesized polynucleotide obtained by artificially synthesizing all nucleotides. When searching for the mutant gene and the wild-type gene as described above, for example, a microorganism having the ability to reduce m-chlorophenacyl chloride to produce 1- (3-chlorophenyl) -2-chloroethanol is selected. For example, a microorganism belonging to the genus Rhodococcus (preferably Rhodococcus erythropolis) can be mentioned as the object.

本発明酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明ポリヌクレオチド）を取得するには、例えば、以下の方法を用いればよい。
まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、野生型遺伝子）を取得するとよい。ここで、野生型遺伝子とは、配列番号１０に示される塩基配列を有する遺伝子であり、例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物から取得することができる。 In order to obtain a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme of the present invention (that is, the polynucleotide of the present invention), for example, the following method may be used.
First, a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of wild type reductase (that is, a wild type gene) may be obtained. Here, the wild-type gene is a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, for example, by J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, cold It can be obtained from microorganisms belonging to Rhodococcus erythropolis according to the usual genetic engineering technique described in Spring Spring Harbor Laboratory, 1989, etc.

具体的には、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）ＳＴ−１０株（尚、当該菌株は、例えば、特許第４５５８４１４号公報の段落番号「0011」等に記載される公知の菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、微工研菌寄第１３１５０号の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成４年９月８日））から「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、且つ、適切なプライマー（具体的には例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの両者）を用いてＰＣＲを行うか、または、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 386-392等に記載される公知のプラスミドであるｐＵＡＲ（野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）を鋳型として、且つ、適切なプライマー（具体的には例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの両者）を用いてＰＣＲを行う。   Specifically, Rhodococcus erythropolis ST-10 strain (in addition, the said strain is a well-known strain described in the paragraph number "0011" etc. of patent 4558414, for example, independent administration) From the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center, which has been given the deposit number No. 13150 of Microbiological Laboratories (original deposit date: September 8, 1992)) A DNA library was prepared according to the method described in “Protocol” (Department of Cancer Research, University of Tokyo, Shujunsha, 1993), using the prepared DNA library as a template and appropriate Primer (specifically, for example, both an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12) PUAR (a plasmid carrying a wild-type reductase gene, accession number FERM) which is a known plasmid described in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 386-392, etc. P-18127) as a template and appropriate primers (specifically, for example, both an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12) To perform PCR.

そして、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０で示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅し、これを回収することにより、野生型遺伝子及び本発明ポリヌクレオチドを作製するためのポリヌクレオチドを調製する。   A polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, a polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, wherein one or more bases have been deleted, substituted or added, etc. Then, by collecting this, a wild-type gene and a polynucleotide for producing the polynucleotide of the present invention are prepared.

次いで、調製された野生型遺伝子及び本発明ポリヌクレオチドを作製するためのポリヌクレオチドに部位特異的な塩基変異を順次導入することによって、本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。部位特異的な塩基変異の導入法としては、例えば、Olfert Landt ら(Gene 96 125-128 1990)、Smithら(Genetic Engineering 3 1 Setlow, J. and Hollaender, A Plenum: New York)、Vlasukら(Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M.: Academic Press, New York)、Hos. N. Huntら(Gene 77 51 1989)の方法やMutan-Express Km（宝酒造社製）やTaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）の市販キットの利用等を挙げることができる。このようにして、例えば、配列番号１の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、４個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。   Next, the polynucleotide of the present invention can be prepared by sequentially introducing site-specific base mutations into the prepared wild-type gene and the polynucleotide for producing the polynucleotide of the present invention. Examples of methods for introducing site-specific base mutations include Olfert Landt et al. (Gene 96 125-128 1990), Smith et al. (Genetic Engineering 3 1 Setlow, J. and Hollaender, A Plenum: New York), Vlasuk et al. Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M .: Academic Press, New York), Hos. N. Hunt et al. (Gene 77 51 1989), Mutan-Express Km (Takara Shuzo) or TaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit The use of a commercial kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can be mentioned. In this way, for example, a mutant reductase having four amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A) introduced in the amino acid sequence of the wild-type reductase of SEQ ID NO: 1 can be obtained.

また、同様にして５個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして５個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして６個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S339N)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, E27Q, S399R)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして８個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q, V28I)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして８個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q, V28M)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。 Similarly, a mutant reductase in which five amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, S107P) are introduced can be obtained.
Similarly, a mutant reductase in which five amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, A228V) are introduced can be obtained.
Similarly, a mutant reductase having 6 amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S339N) introduced therein can be obtained.
Similarly, a mutant reductase into which seven amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q) have been introduced can be obtained.
Similarly, a mutant reductase into which seven amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, E27Q, S399R) have been introduced can be obtained.
Similarly, a mutant reductase into which seven amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q) have been introduced can be obtained.
Similarly, a mutant reductase having 8 amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q, V28I) can be obtained.
Similarly, a mutant reductase into which 8 amino acid mutations (E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q, V28M) have been introduced can be obtained.

具体的には例えば、Ｏｌｆｅｒｔ Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入してなるポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）を、例えば、Ｊ．Sａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載される方法に準じて調製する。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異 Specifically, for example, in the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 using the method of Old Landt et al. (Gene 96 125-128 1990), the following basic amino acid mutation (a) ( d) an amino acid sequence having an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 except that it has 4 or more amino acid mutations including all of the above and having the ability of the enzyme to reduce a substrate In order to prepare a polynucleotide obtained by introducing a base mutation so as to obtain a base sequence to be prepared, first, a vector (DNA) in which a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (wild type gene) is incorporated For example, J. et al. Sambrook, E .; F. Fritsch, T.W. Prepared according to the method described by Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and the like.
<Basic base mutation>
(A ′) 34th to 36th codons encoding glutamic acid are replaced with codons encoding glycine (b ′) 124th to 126th codons encoding aspartic acid, Base mutations (c ') substituted for codons encoding valine (c') Base mutations (d ') from 199th to 951th, where lysine-encoding codons are replaced with codons encoding arginine The base mutation in which the codon encoding serine is replaced with the codon encoding alanine

また、本発明ポリヌクレオチドは、例えば、微生物又はファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、当該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。   In addition, the polynucleotide of the present invention comprises, for example, a base sequence of about 15 bases or more having a partial base sequence selected from the base sequences of the polynucleotide of the present invention in a DNA library inserted into a vector derived from a microorganism or phage. It can also be obtained by hybridizing DNA as a probe under the conditions described later and detecting the DNA to which the probe specifically binds.

染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。   Examples of the method for hybridizing the probe to the chromosomal DNA or DNA library include colony hybridization and plaque hybridization, and the method should be selected according to the type of vector used for the preparation of the library. Can do.

使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、当該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。   When the library to be used is prepared using a plasmid vector, colony hybridization may be used. Specifically, a transformant is obtained by introducing the DNA of the library into a host microorganism, and after the obtained transformant is diluted, the diluted product is spread on an agar medium and cultured until colonies appear. To do.

使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、更に軟寒天培地と混合した後、当該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。   When the library to be used is prepared using a phage vector, plaque hybridization may be used. Specifically, the host microorganism and the library phage are mixed under infectious conditions, and further mixed with a soft agar medium. The mixture is then spread on an agar medium and cultured until plaques appear.

次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを当該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを当該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、当該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで当該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。 Next, in any hybridization, a membrane is placed on the agar medium in which the above culture is performed, and the transformant or phage is adsorbed and transferred onto the membrane. This membrane is treated with an alkali, then neutralized, and then treated to fix the DNA to the membrane. More specifically, for example, in the case of plaque hybridization, a nitrocellulose membrane or a nylon membrane (for example, Hybond-N + (registered trademark of Amersham)) is placed on the agar medium and allowed to stand for about 1 minute. The phage particles are adsorbed and transferred to the membrane. Next, the membrane is immersed in an alkaline solution (for example, 1.5 M sodium chloride, 0.5 M sodium hydroxide) for about 3 minutes to dissolve the phage particles to elute the phage DNA on the membrane, and then neutralize the solution. Soak in (for example, 1.5 M sodium chloride, 0.5 M Tris-HCl buffer solution pH 7.5) for about 5 minutes. Next, the membrane is washed with a washing solution (eg, 0.3 M sodium chloride, 30 mM citric acid, 0.2 M Tris-HCl buffer pH 7.5) for about 5 minutes, and then heated at, for example, about 80 ° C. for about 90 minutes. To fix the phage DNA to the membrane.

このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。 Using the membrane thus prepared, hybridization is performed using the DNA as a probe. Hybridization example, J.Sambrook, EFFrisch, T.Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition (1989) " Cold can be carried out according to the description such as Spring Harbor Laboratory Press.

プローブに用いられるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。   The DNA used for the probe may be labeled with a radioisotope or labeled with a fluorescent dye.

プローブに用いられるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いられるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。 As a method for labeling the DNA used for the probe with a radioisotope, for example, by using a Random Primer Labeling Kit (Takara Shuzo) or the like, dCTP in the PCR reaction solution is replaced with (α- 32 P) dCTP. And a method of performing PCR using DNA used for the probe as a template.

また、プローブに用いられるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。   In addition, when the DNA used for the probe is labeled with a fluorescent dye, for example, ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System manufactured by Amersham can be used.

ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ２当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。 Hybridization can be performed, for example, as follows.
450-900 mM sodium chloride and 45-90 mM sodium citrate containing sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration of 0.1-1.0% by weight, and denatured non-specific DNA at 0-200 μl / ml A prehybridization solution (preferably 900 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate, 1 mM), which may contain albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. A prehybridization solution containing 0.0 wt% SDS and 100 μl / ml denatured Calf-thymus DNA) was prepared at a rate of 50 to 200 μl per 1 cm 2 of the membrane prepared as described above. Immerse the membrane and hold at 42-65 ° C for 1-4 hours Warm up.

次いで、例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ２当たり１．０×１０４〜２．０×１０６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ２当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。 Then, for example, 450-900 mM sodium chloride and 45-90 mM sodium citrate, SDS at a concentration of 0.1-1.0% by weight, and denatured non-specific DNA at 0-200 μg / ml. A hybridization solution (preferably 900 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate, which may contain albumin, ficoll, polovinylpyrrolidone, etc.) A hybridization solution containing 1.0 wt% SDS and 100 μg / ml denatured Calf-thymus DNA) and the probe prepared by the above method (1.0 × 10 4 to 2.0 per 1 cm 2 of membrane) × 10 6 cpm equivalent amount) in a ratio of 50 to 200 μl per 1 cm 2 of membrane And soak in the hybridization solution and incubate at 42-65 ° C. for 12-20 hours.

当該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２ｘＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。   After the hybridization, the membrane is taken out, and a washing solution at 42 to 65 ° C. (preferably 15 mM chloride) containing 15 to 300 mM sodium chloride 1.5 to 30 mM sodium citrate and 0.1 to 1.0% by weight SDS or the like. Wash with sodium, 1.5 mM sodium citrate and 1.0 wt% SDS at 65 ° C. The washed membrane is lightly rinsed with 2 × SSC (300 mM sodium chloride, 30 mM sodium citrate) and then dried. The membrane is subjected to, for example, autoradiography to detect the position of the probe on the membrane, and a clone corresponding to the position on the membrane of the DNA hybridizing with the probe used is identified on the original agar medium, By clone this, a clone having the DNA is isolated.

このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。   The polynucleotide of the present invention can be prepared from cultured cells obtained by culturing the clones thus obtained.

更に、本発明のポリヌクレオチドは、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、９５頁〜１００頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、１９９７年７月１日刊行に記載の方法などを参考に合成することもできる。この方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してＤＮＡを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３’末端に約１０ｂｐ〜約１２ｂｐの相補鎖またはオーバーラップをもつように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長は、約６０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒ、好ましくは約８０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒである。   Furthermore, the polynucleotide of the present invention is disclosed in Cell Engineering Supplement, Plant Cell Engineering Series 7 “Plant PCR Experiment Protocol”, pages 95 to 100, Shimamoto, Takuji Sasaki, Shujunsha, published July 1, 1997. It can also be synthesized with reference to the method described. In this method, DNA is synthesized using only long synthetic oligonucleotide primers. The primer pair is synthesized so that each 3 'end of the primer has a complementary strand or overlap of about 10 bp to about 12 bp, and DNA synthesis is performed using each primer as a template. The total length of the primer is about 60 mer to about 100 mer, preferably about 80 mer to about 100 mer.

具体的には、まず、設計された塩基配列をもとに例えば約９０塩基ごとにプライマーとするＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。ＤＮＡオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。
設計した塩基配列の中央部付近から５’側約９０残基上流までの配列を用いて第１のＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。次にこの第１のＤＮＡオリゴマーの３’側１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のＤＮＡオリゴマーとする。また、第１のＤＮＡオリゴマーの５’側１２残基を含み、この部分より遺伝子の５’上流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のＤＮＡオリゴマーとする。更に、第２のＤＮＡオリゴマーの５’側（遺伝子側からみると３’側）の１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に第２のＤＮＡオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のＤＮＡオリゴマーとする。以下同様に第５、第６とＤＮＡオリゴマーを合成し、全部の領域をカバーできるまで更にオリゴマーを合成する。 Specifically, first, based on the designed base sequence, a DNA oligomer is designed and synthesized, for example, every about 90 bases. The synthesis of the DNA oligomer can be performed using a DNA synthesizer by the β-cyanoethyl phosphoramidide method.
A first DNA oligomer is designed and synthesized using a sequence from the vicinity of the center of the designed base sequence to about 90 residues upstream of the 5 ′ side. Next, a complementary-strand oligomer having a length of about 90 residues is synthesized on the 3 ′ downstream side of the gene, including the sequence of 12 residues on the 3 ′ side of the first DNA oligomer. A DNA oligomer is used. In addition, it comprises 12 residues on the 5 ′ side of the first DNA oligomer, and a complementary strand oligomer having a length of about 90 residues is synthesized 5 ′ upstream of the gene from this portion, and this is synthesized as a third DNA oligomer. To do. In addition, it contains a 12-residue sequence on the 5 'side of the second DNA oligomer (3' side when viewed from the gene side), and the complementary strand of the second DNA oligomer is synthesized 3 'downstream of the gene from this part. This is the fourth DNA oligomer. Similarly, the fifth, sixth and DNA oligomers are synthesized, and further oligomers are synthesized until the entire region can be covered.

次に、これらオリゴマーを順番にＰＣＲ反応により結合する。まず第１のＤＮＡオリゴマーと第２のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。次にこのＰＣＲ産物を鋳型として、第３のＤＮＡオリゴマーと第４のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、例えば、変性温度９４℃１分、アニール温度５１℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度９４℃１分、アニール温度６０℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットして２０サイクル反応を行う。反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下この操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングしたり、セルフライゲーションによってプラスミドを構築する。得られたポリヌクレオチドの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得られたことを確認する。   Next, these oligomers are sequentially bound by a PCR reaction. First, a PCR reaction is performed using both the first DNA oligomer and the second DNA oligomer as primers. Next, PCR reaction is performed using the PCR product as a template and both the third DNA oligomer and the fourth DNA oligomer as primers. The PCR reaction is, for example, a denaturation temperature of 94 ° C. for 1 minute, an annealing temperature of 51 ° C. for 1 minute, an extension temperature of 72 ° C. for 2 minutes as a set for 5 cycles, a denaturation temperature of 94 ° C. for 1 minute, and an annealing temperature of 60 ° C. for 1 minute. The reaction is carried out for 20 cycles with one set of elongation temperature 72 ° C. for 2 minutes. The DNA polymerase used in the reaction is preferably an enzyme with a low base incorporation error rate. Thereafter, this operation is repeated to extend the base sequence to obtain the target base sequence. Restriction enzyme sites are provided at both ends of the target base sequence, if necessary, introduced into a cloning vector according to a conventional method, and subcloned or a plasmid is constructed by self-ligation. The base sequence of the obtained polynucleotide is confirmed with a DNA sequencer to confirm that the target base sequence has been obtained.

上記のようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ (Invitrogen社製)、ｐＴｒｃ９９Ａ (Pharmacia社製)、ｐＫＫ２２３−３ (Pharmacia社製)等を挙げることができる。 A polynucleotide of the invention which is prepared as described above "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition " (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons , The vector of the present invention can be obtained by cloning into a vector according to the method described in Inc. ISBNO-471-50338-X or the like. Specific examples of the vector used include pUC119 (Takara Shuzo), pTV118N (Takara Shuzo), pBluescript II (Toyobo), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia). ), PKK223-3 (manufactured by Pharmacia), and the like.

また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著, Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。   Further, the base sequence of the aforementioned DNA is determined by the dideoxy terminator method described in F. Sanger, S. Nicklen, ARCoulson, Proceeding of Natural Academy of Science USA (1977) 74: 5463-5467, etc. Can be analyzed. For sample preparation for base sequence analysis, for example, commercially available reagents such as Perkin Elmer ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit may be used.

上述のようにして得られるＤＮＡが、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。   The DNA obtained as described above encodes an amino acid sequence of a protein having the ability to reduce m-chlorophenacyl chloride to produce 1- (3-chlorophenyl) -2-chloroethanol preferentially. This confirmation can be performed as follows, for example.

まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで当該形質転換体の培養物をｍ−クロロフェナシルクロライドに作用させる。反応生成物中の１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。   First, as described below, the DNA obtained as described above is inserted into a vector so as to be connected downstream of a promoter that can function in the host cell, and this vector is introduced into the host cell to obtain a transformant. . Next, the culture of the transformant is allowed to act on m-chlorophenacyl chloride. By analyzing the amount of 1- (3-chlorophenyl) -2-chloroethanol in the reaction product, it can be confirmed that the obtained DNA encodes an amino acid sequence of a protein having such ability.

次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、更に７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する条件を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする１個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。   Next, using the obtained vector (DNA) as a template, for example, an oligonucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence in which the 12th glutamic acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with glycine (for example, a sequence The oligonucleotide having the base sequence shown by No. 13) is used as a primer on one side, and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID No. 11 is used as a primer on the other side to amplify a DNA fragment by the PCR method. Do. Here, the PCR reaction conditions are, for example, 20 cycles of incubation at 94 ° C. for 5 minutes, followed by incubation at 94 ° C. for 1 minute, then 50 ° C. for 2 minutes, and further at 75 ° C. for 3 minutes. And finally a condition of keeping the temperature at 75 ° C. for 8 minutes. After purifying the thus amplified DNA fragment, a vector (DNA) in which a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is incorporated into the obtained DNA fragment, and SEQ ID NO: An oligonucleotide primer having the base sequence shown by 12 is added, and the DNA fragment is amplified by PCR. The amplified DNA fragment is digested with, for example, restriction enzymes EcoRI and PstI, and a vector (DNA) containing a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 subjected to the same restriction enzyme digestion. ) And a ligation reaction, a vector (DNA) containing a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence having one desired amino acid mutation can be obtained.

次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。   Subsequently, the obtained vector (DNA) is used as a template, and the base sequence encoding the amino acid sequence in which the 42nd aspartic acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with valine is obtained by the same operation as described above. PCR method using an oligonucleotide (for example, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 14) as a primer on one side and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 as a primer on the other side Amplification of DNA fragments by After purifying the thus amplified DNA fragment, a vector (DNA) in which a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is incorporated into the obtained DNA fragment, and SEQ ID NO: An oligonucleotide primer having the base sequence shown by 12 is added, and the DNA fragment is amplified by PCR. The amplified DNA fragment is digested with, for example, restriction enzymes EcoRI and PstI, and a vector (DNA) containing a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 subjected to the same restriction enzyme digestion. ) And a ligation reaction, a vector (DNA) containing a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence having two target amino acid mutations can be obtained.

次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における６７番目のリジンがアルギニン酸に置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。   Next, the obtained vector (DNA) is used as a template, and the base sequence encoding the amino acid sequence in which the 67th lysine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with arginic acid is obtained in the same manner as described above. PCR method using an oligonucleotide (for example, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 15) as a primer on one side and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 as a primer on the other side Amplification of DNA fragments by After purifying the thus amplified DNA fragment, a vector (DNA) in which a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is incorporated into the obtained DNA fragment, and SEQ ID NO: An oligonucleotide primer having the base sequence shown by 12 is added, and the DNA fragment is amplified by PCR. The amplified DNA fragment is digested with, for example, restriction enzymes EcoRI and PstI, and a vector (DNA) containing a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 subjected to the same restriction enzyme digestion. ) And a ligation reaction, a vector (DNA) containing a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence having two target amino acid mutations can be obtained.

次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。   Subsequently, using the obtained vector (DNA) as a template, an oligo having a base sequence encoding an amino acid sequence in which the 317th serine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine by the same operation as described above By using a nucleotide (for example, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 16) as a primer on one side and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 as a primer on the other side, Amplify the DNA fragment. After purifying the thus amplified DNA fragment, a vector (DNA) in which a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is incorporated into the obtained DNA fragment, and SEQ ID NO: An oligonucleotide primer having the base sequence shown by 12 is added, and the DNA fragment is amplified by PCR. The amplified DNA fragment is digested with, for example, restriction enzymes EcoRI and PstI, and a vector (DNA) containing a polynucleotide (wild type gene) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 subjected to the same restriction enzyme digestion. ) And a ligation reaction, a vector (DNA) containing a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence having two target amino acid mutations can be obtained.

尚、必要に応じて、上記の基本的なアミノ酸変異を導入する方法と同様な操作で、上記の追加的なアミノ酸変異を1個または複数個導入することにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。   If necessary, the target polynucleotide of the present invention can be obtained by introducing one or more of the above-mentioned additional amino acid mutations in the same manner as the above-described method of introducing the basic amino acid mutation. Can be obtained.

本発明ベクターは、本発明ポリヌクレオチド又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド等を含有する。   The vector of the present invention contains the polynucleotide of the present invention or a polynucleotide in which a promoter that can function in a host cell and the polynucleotide of the present invention are connected in a functional manner.

本発明ベクターの調製は、本発明ポリヌクレオチド又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド等を、本発明ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを持つベクター（以下、基本ベクターと記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。   The vector of the present invention is prepared by preparing a polynucleotide in which the polynucleotide of the present invention or a promoter capable of functioning in the host cell and the polynucleotide of the present invention are functionally connected, etc., and the host into which the polynucleotide of the present invention is introduced. A vector that can be used in a cell, for example, a vector that contains genetic information that can be replicated in a host cell, can be propagated autonomously, can be isolated and purified from the host cell, and has a detectable marker (hereinafter, In some cases, it may be referred to as a basic vector).

ここで「基本ベクター」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等を挙げることができる。また、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを挙げることができる。   Here, examples of the “basic vector” include Escherichia coli host cells, such as vector pUC119 (Takara Shuzo), phagemid pBluescript II (Stratagene), and the like. Moreover, when using budding yeast as a host cell, vectors pGBT9, pGAD424, pACT2 (manufactured by Clontech) and the like can be exemplified. When mammalian cells are used as host cells, for example, vectors such as pRc / RSV and pRc / CMV (manufactured by Invitrogen), bovine papilloma virus vector pBPV (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), EB virus vector pCEP4 ( Invitrogen) and other virus-derived vectors containing autonomous origins of replication, viruses such as vaccinia virus, and the like. In addition, when insect animal cells are used as host cells, for example, insect viruses such as baculovirus can be mentioned.

尚、本発明ベクターを、自律複製起点を含むベクター（具体的には例えば、酵母用ベクターｐＡＣＴ２、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等）を用いて構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。   When the vector of the present invention is constructed using a vector containing an autonomous origin of replication (specifically, for example, yeast vector pACT2, bovine papilloma virus vector pBPV, EB virus vector pCEP4, etc.), the vector is introduced into the host cell. It is retained in the cell as an episome.

尚、本発明ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すればよい。   In order to express the polynucleotide of the present invention in a host cell, for example, a polynucleotide in which a promoter that can function in the host cell and the polynucleotide of the present invention are operably connected is introduced into the host cell. Good.

ここで、「機能可能な形で」とは、本発明ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明ポリヌクレオチドが発現されるように、当該プロモーターと本発明ポリヌクレオチドとを接続させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や***酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等を挙げることができる。また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えば、ＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ 〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ ら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１ ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）等を挙げることができる。   Here, “in a functional form” means that the promoter and the polynucleotide of the present invention are expressed so that the polynucleotide of the present invention is expressed under the control of the promoter in the host cell into which the polynucleotide of the present invention is introduced. It means to connect. Examples of a promoter that can function in a host cell include DNA that exhibits promoter activity in the host cell into which it is introduced. For example, when the host cell is E. coli, the lactose operon promoter (lacP), tryptophan operon promoter (trpP), arginine operon promoter (argP), galactose operon promoter (galP), tac promoter, T7 Examples include promoters, T3 promoters, λ phage promoters (λ-pL, λ-pR), and the like. When the host cell is an animal cell or fission yeast, for example, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus (SV40) early or late promoter, mouse papilloma virus ( MMTV) promoter and the like. When the host cell is budding yeast, for example, the ADH1 promoter (wherein the ADH1 promoter is available from, for example, the yeast expression vector pAAH5, which holds the ADH1 promoter and the terminator, Washington Research Foundation, Ammerer et al., Method. in Enzymology, 101 part (p.192-201)] and the like by a conventional genetic engineering method.

また、宿主細胞において機能するプロモーターを予め保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続するように、上記のプロモーターの下流に本発明ポリヌクレオチドを挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本発明ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明ポリヌクレオチドを発現させることができる。これらのベクターには予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクターを導入すると、細胞内でベクターのコピー数が非常に増大し、結果として当該ベクターに組み込まれた本発明ポリヌクレオチドを大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該ベクター又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明ポリヌクレオチドを挿入すれば、本発明ポリヌクレオチドを、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。   In addition, when a basic vector having a promoter that functions in a host cell in advance is used, the polynucleotide of the present invention is downstream of the promoter so that the promoter and the polynucleotide of the present invention are connected in a functional manner. Can be inserted. For example, in the case of pRc / RSV, pRc / CMV, etc., a cloning site is provided downstream of a promoter that can function in animal cells. By introducing a vector obtained by inserting the polynucleotide of the present invention into the cloning site into an animal cell, the polynucleotide of the present invention can be expressed in the animal cell. Since these vectors have SV40 autonomous replication origin (ori) incorporated in advance, when the vector is introduced into cultured cells transformed with the SV40 genome lacking ori, such as COS cells, As a result, the copy number of the vector is greatly increased, and as a result, the polynucleotide of the present invention incorporated into the vector can be expressed in large quantities. Further, the above yeast vector pACT2 has an ADH1 promoter, and if the polynucleotide of the present invention is inserted downstream of the ADH1 promoter of the vector or a derivative thereof, the polynucleotide of the present invention is converted to, for example, CG1945 (manufactured by Clontech). A vector that can be expressed in large quantities in budding yeast such as the above can be constructed.

本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を、宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を作製する。次いで作製された本発明形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養することにより、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。   The transformant of the present invention is prepared by introducing the polynucleotide of the present invention or the vector of the present invention into a host cell. Subsequently, the enzyme of the present invention can be produced in large quantities and obtained by culturing the produced transformant of the present invention according to a normal cell culture method.

宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクターを導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。   Examples of host cells include eukaryotes and prokaryotes in the case of microorganisms. Preferable examples include E. coli. A host cell can be transformed by introducing the vector as described above into the host cell by an ordinary genetic engineering method.

本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「モレキュラー・クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の遺伝子導入法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上記のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。   As a method for introducing the vector of the present invention into a host cell, a normal introduction method corresponding to the host cell may be applied. When Escherichia coli is used as a host cell, for example, J. et al. Sambrook, E .; F. Frisch, T .; Maniatis; “Normal Cloning 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory, published in 1989), etc. In addition, when mammalian cells or insect animal cells are used as host cells, for example, normal gene transfer methods such as calcium phosphate method, DEAE dextran method, electroporation method, lipofection method, etc. In addition, when yeast is used as a host cell, the lithium method used in, for example, Yeast transformation kit (Clontech) and the like In addition, when a virus is used as a vector, the virus genome can be introduced into a host cell by a general gene transfer method as described above, and a virus into which the gene of the present invention is inserted It is also possible to introduce the genome of the virus into the host cell by infecting the host cell with a virus particle containing the genome.

自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
尚、基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。 When the vector of the present invention is constructed using a vector containing an autonomous origin of replication, such as the above-described yeast vector pACT2, bovine papilloma virus vector pBPV, EB virus vector pCEP4, etc., the vector is episomal when introduced into a host cell. As retained in the cell.
In addition, when a vector containing a selection marker gene (for example, an antibiotic resistance-conferring gene such as a kanamycin resistance gene or a neomycin resistance gene) is used as a basic vector, a transformant into which the vector has been introduced is expressed as the selection marker gene. Selection can be made using the type or the like as an index.

また本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有してもよい。このような本発明ベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に保有する本発明形質転換体を作製することもできる。   The vector of the present invention also comprises a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein having an ability to convert oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide to a reduced form. Furthermore, you may contain. By using such a vector of the present invention, a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein having an ability to convert oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide to a reduced form It is also possible to produce the transformant of the present invention that further possesses a polynucleotide having.

更には、上記、本発明ポリヌクレオチドと基本ベクターとを含み、更には酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有していてもよいポリヌクレオチドを人工合成したポリヌクレオチドとして、本発明ベクターを合成し、宿主細胞に導入してなる本発明形質転換体を作製することもできる。また、特許第４７４５７６２号公報に記載されるベクターｐＨＡＲ１のポリヌクレオチドを人工合成したものに（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された本発明ベクターを構築し、宿主細胞に導入してなる本発明形質転換体を作製することもできる。   Furthermore, a protein comprising the above-described polynucleotide of the present invention and a basic vector, and further having an ability to convert oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide to a reduced form A transformant of the present invention is prepared by synthesizing the vector of the present invention as a polynucleotide obtained by artificially synthesizing a polynucleotide that may further contain a polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence, and introducing it into a host cell. You can also In addition, the vector of the present invention produced by artificially synthesizing the polynucleotide of vector pHAR1 described in Japanese Patent No. 4745762 (site-directed mutagenesis, mutation treatment, etc.) is constructed, and the host cell It is also possible to produce the transformant of the present invention introduced into the above.

宿主細胞において本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等を挙げることができる。   Examples of the host cell into which the polynucleotide of the present invention or the vector of the present invention is introduced into the host cell include, for example, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces and Aspergillus. Can be mentioned.

宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。 The method of introducing the polynucleotide of the present invention or the vector of the present invention, which is operably connected to a promoter that can function in the host cell, into the host cell can be used as long as it is a method commonly used depending on the host cell used. well, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition " (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons , Inc. ISBNO-471-50338-X And the electroporation method described in “Methods in Electroporation: Gene Pulser / E. Coli Pulser System” Bio-Rad Laboratories, (1993) and the like.

宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。   In order to select a transformant introduced with a polynucleotide of the present invention or a vector of the present invention that is operably connected to a promoter that can function in a host cell, for example, selection included in the vector as described above Selection may be performed using the phenotype of the marker gene as an index.

本発明酵素は、例えば、後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより製造することができる。   The enzyme of the present invention can be produced, for example, by culturing a transformant (that is, the transformant of the present invention) obtained by introducing a polynucleotide of the present invention described later or a vector of the present invention described later into a host cell. .

本発明遺伝子又は本発明ベクターを含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、通常の細胞培養方法によって行えばよい。
本発明形質転換体が微生物である場合には、例えば、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。 The culture of the transformant containing the gene of the present invention or the vector of the present invention (namely, the transformant of the present invention) may be carried out by an ordinary cell culture method.
When the transformant of the present invention is a microorganism, for example, the transformant uses various media appropriately containing a carbon source and a nitrogen source, organic or inorganic salts, etc., used for normal culture in general microorganisms. Can be cultured.

炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜等を挙げることができる。これらの炭素源の培地への添加量としては培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。   Examples of the carbon source include sugars such as glucose, dextrin and sucrose, sugar alcohols such as glycerol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and pyruvic acid, animal oils, vegetable oils and molasses. The amount of these carbon sources added to the medium is usually about 0.1% (w / v) to 30% (w / v) with respect to the culture solution.

窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー(Corn Steep Liquor)、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素等を挙げることができる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量としては培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度を挙げることができる。   Examples of nitrogen sources include meat extract, peptone, yeast extract, malt extract, soybean flour, corn steep liquor, cottonseed flour, dried yeast, casamino acid and other natural organic nitrogen sources, amino acids And ammonium salts of inorganic acids such as sodium nitrate, ammonium salts of inorganic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, and urea. Of these, ammonium salts of organic acids, natural organic nitrogen sources, amino acids and the like can be used as carbon sources in many cases. The amount of these nitrogen sources added to the medium can be generally about 0.1% (w / v) to 30% (w / v) with respect to the culture solution.

有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩等を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウム等を挙げることができる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量としては培養液に対して通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）程度を挙げることができる。   Examples of the organic salt and inorganic salt include chlorides such as potassium, sodium, magnesium, iron, manganese, cobalt, and zinc, sulfates, acetates, carbonates, and phosphates. Specifically, for example, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, cobalt chloride, zinc sulfate, copper sulfate, sodium acetate, calcium carbonate, monopotassium hydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate Etc. The amount of these organic salts and / or inorganic salts added to the medium can usually be about 0.0001% (w / v) to 5% (w / v) with respect to the culture solution.

尚、あらかじめ培地中に原料となる基質を少量添加しておくと、本発明形質転換体が有する基質を還元する能力を高めることができる。添加する基質の量としては、例えば、０．００１％程度以上を挙げることができる。好ましくは０．１％程度〜１％程度を挙げることができる。   In addition, the ability to reduce the substrate of the transformant of the present invention can be enhanced by adding a small amount of a raw material substrate in the medium in advance. Examples of the amount of the substrate to be added include about 0.001% or more. Preferably, about 0.1% to about 1% can be mentioned.

更に、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプの宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。   Furthermore, a gene in which a promoter capable of functioning in a host cell of the type induced by allolactose such as tac promoter, trc promoter and lac promoter and the polynucleotide of the present invention is functionally connected is introduced. In the case of the transformant, for example, isopropyl thio-β-D-galactoside (IPTG) can be added to the medium in a small amount as an inducer for inducing production of the enzyme of the present invention.

後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、微生物等の宿主細胞の培養における通常使用される方法に準じて行えばよい。例えば、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター(JarFermenter)培養、タンク培養等）等が可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１倍／分〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間が望ましい。温度シフト型やＩＰＴＧ誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は１日間以内が好ましく、通常数時間である。   Cultivation of a transformant obtained by introducing the polynucleotide of the present invention described later or the vector of the present invention described later into a host cell (ie, the transformant of the present invention) is a commonly used method for culturing host cells such as microorganisms. According to the above. For example, solid culture, liquid culture (swivel shake culture, reciprocating shake culture, jar fermenter culture, tank culture, etc.) are possible. In particular, in the case of using a jar fermenter, it is necessary to introduce aseptic air. Usually, aeration conditions of about 0.1 times / minute to about 2 times / minute of the culture solution amount are used. The culture temperature and the pH of the medium can be appropriately selected from the range in which the microorganism grows. For example, the culture is preferably performed at a culture temperature of about 15 ° C. to about 40 ° C. in a medium having a pH of about 6 to about 8. . Although the culture time varies depending on various culture conditions, it is usually preferably about 1 day to about 5 days. When an expression vector having an inducible promoter such as a temperature shift type or an IPTG inducible type is used, the induction time is preferably within one day, and usually several hours.

後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養物から本発明酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。   As a method for purifying the enzyme of the present invention from the culture of a transformant obtained by introducing the polynucleotide of the present invention described later or the vector of the present invention described below into a host cell (ie, the transformant of the present invention) The method used in the purification of can be applied, for example, the following method can be mentioned.

まず、当該形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明酵素を精製することができる。   First, cells are collected from the culture of the transformant by centrifugation or the like, and then this is subjected to a physical disruption method such as ultrasonic treatment, dynomill treatment, French press treatment, or a lytic enzyme such as a surfactant or lysozyme. Crush by chemical crushing method. A cell-free extract is prepared by removing impurities from the obtained crushed liquid by centrifugation, membrane filter filtration, etc., and this is prepared by cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography. The enzyme of the present invention can be purified by fractionation using an appropriate separation and purification method such as metal chelate chromatography.

クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、TSK-gel G3000SW（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。   Examples of the carrier used for the chromatography include insoluble polymer carriers such as cellulose, dextrin, or agarose into which carboxymethyl (CM) group, diethylaminoethyl (DEAE) group, phenyl group or butyl group is introduced. Commercially available carrier-filled columns can also be used. Examples of such commercially available carrier-filled columns include Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP (trade names, both manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), TSK-gel G3000SW (Trade name, manufactured by Tosoh Corporation).

尚、本発明酵素を含む画分を選抜するには、例えば、本発明における還元酵素活性の存在有無又はその程度に基づき選抜すればよい。勿論、基質となるケトン化合物（具体的には例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド）を還元して対応するアルコール化合物（具体的には例えば、１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノール）を優先的に生産する能力を測定することにより選抜してもよい。   In order to select the fraction containing the enzyme of the present invention, for example, it may be selected based on the presence or absence of the reductase activity in the present invention or the degree thereof. Of course, a ketone compound (specifically, for example, m-chlorophenacyl chloride) as a substrate is reduced to give a corresponding alcohol compound (specifically, for example, 1- (3-chlorophenyl) -2-chloroethanol). You may select by measuring the ability to preferentially produce.

本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能な本発明ベクターを導入した場合には、本発明酵素の酵素活性に基づく検出方法を用いることもできる。   In order to select the transformant of the present invention, for example, a host cell into which a marker gene has been introduced simultaneously with the vector of the present invention may be cultured by a method according to the nature of the marker gene. For example, when the marker gene is a gene that confers drug resistance to a selective drug exhibiting lethal activity on the host cell, the host cell into which the vector of the present invention has been introduced is used using a medium to which the selective drug is added. What is necessary is just to culture. Examples of the combination of a gene imparting drug resistance and a selective drug include, for example, a combination of a neomycin resistance-conferring gene and neomycin, a combination of a hygromycin resistance-conferring gene and hygromycin, a blasticidin S resistance-conferring gene and a blasticidin Combinations with S can be mentioned. Further, when the marker gene is a gene that complements the auxotrophy of the host cell, the cell into which the vector of the present invention is introduced is cultured using a minimal medium that does not contain nutrients corresponding to the auxotrophy. Good. Moreover, when the vector of the present invention capable of expressing the gene of the present invention in a host cell is introduced, a detection method based on the enzyme activity of the enzyme of the present invention can also be used.

本発明遺伝子が宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本発明ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記本発明遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。   In order to obtain the transformant of the present invention in which the gene of the present invention is located in the chromosome of the host cell, for example, first, the vector of the present invention and the vector having the marker gene are linearized by digestion with a restriction enzyme or the like. These are then introduced into the host cell by the method described above. Subsequently, the cells are usually cultured for several weeks, and then a desired transformant may be selected and obtained based on the expression level of the introduced marker gene. In addition, for example, first, the vector of the present invention having a gene that imparts a selective drug as described above as a marker gene is introduced into a host cell by the method described above. Subsequently, the cells are subcultured for several weeks or more in a medium to which a selective drug is added, and then the selective drug-resistant clones that have survived in a colony form are purified and cultured to introduce the gene of the present invention into the host cell chromosome. The transformant of the present invention can also be selected and obtained. In order to confirm that the introduced gene of the present invention was integrated into the host cell chromosome, the genomic DNA of the cell was prepared according to the usual genetic engineering method, and introduced from the prepared genomic DNA. The presence of the gene of the present invention may be detected using a method such as PCR or Southern hybridization using a DNA having a partial base sequence of the gene of the present invention as a primer or probe. Since the transformant can be cryopreserved and can be used after sleeping, it can save time and labor for preparation of the transformant for each experiment. It becomes possible to carry out the test using the confirmed transformant.

本発明形質転換体が本発明ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。 The transformant of the present invention owns the present invention polynucleotides can be, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition " (1989), according to the conventional methods described in Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc. Thus, it can be confirmed by performing restriction enzyme site confirmation, nucleotide sequence analysis, Southern hybridization, Western hybridization and the like.

このようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを用いて、前述の如く、通常の遺伝子工学的方法及び微生物培養方法等に準じ、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。   Using the polynucleotide of the present invention thus prepared, as described above, the enzyme of the present invention can be produced and obtained in large quantities according to the usual genetic engineering method and microorganism culture method.

このようにして調製された本発明酵素を産生する本発明形質転換体又はその処理物は、基質を還元するバイオリアクターとして、例えば医農薬の有効成分となる化合物やその製造中間体、特に光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為の有機合成反応に利用することが可能である。   The transformant of the present invention that produces the enzyme of the present invention thus prepared or a processed product thereof is used as a bioreactor for reducing a substrate, for example, a compound that is an active ingredient of a pharmaceutical or agrochemical or an intermediate for its production, particularly optical activity. It can be used in an organic synthesis reaction for producing a compound, its production intermediate or the like.

次に、本発明アルコール化合物製造方法について説明する。
ケトン化合物又はアルデヒド化合物としては、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、ｍ−クロロフェナシルクロライド、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、Ｎ−ベンジルピロリジノン、Ｎ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、４−アセチル安息香酸、Ｄ−（＋）−グルコース等を挙げることができる。 Next, the method for producing an alcohol compound of the present invention will be described.
Examples of the ketone compound or aldehyde compound include propionaldehyde, n-butyraldehyde, n-valeraldehyde, n-hexylaldehyde, n-peptylaldehyde, n-decylaldehyde, 2-oxopropionaldehyde, trans-cinnamaldehyde, 4-bromobenzaldehyde, 2-nitrobenzaldehyde, 3-nitrobenzaldehyde, phenylacetaldehyde, 4-chlorobenzaldehyde, 2-pentanone, 2-hexanone, 2-heptanone, 2-octanone, 2-nonanone, 3-pentanone, 3-chloro -2-butanone, tert-butyl acetoacetate, 4-hydroxy-2-butanone, hydroxyacetone, 1,1-dichloroacetone, chloroacetone, dihydroxyacetone, 1,1-dichloro Loacetone, methyl 3-oxobutanoate, ethyl 3-oxabutanoate, ethyl 4-chloroacetoacetate, methyl 4-bromo-3-oxabutanoate, ethyl 4-bromo-3-oxabutanoate, N -Tert-butoxycarbonyl-3-pyrrolidinone, isopropyl 4-cyano-3-oxobutanoate, ethyl 4-cyano-3-oxobutanoate, methyl 4-cyano-3-oxobutanoate, methyl 3-oxo Pentanoate, m-chlorophenacyl chloride, acetophenone, 2'-bromoacetophenone, 3'-bromoacetophenone, 4'-bromoacetophenone, 2-chloroacetophenone, 3'-chloroacetophenone, 4'-chloroacetophenone, benzylacetone 1-phenyl-2-butanone, m-methoxyacetophenone, 3,4-dimethoxyacetophenone, 4′-methoxyacetophenone, 2,3′-dichloroacetophenone, 3,4-dimethoxyphenylacetone, cyclopentanone, N-benzylpyrrolidinone, N-Boc-pyrrolidinone, 4 -Acetylbenzoic acid, D-(+)-glucose and the like can be mentioned.

本発明アルコール化合物製造方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。   The alcohol compound production method of the present invention is usually performed in the presence of water and reduced nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NADH). The water used at this time may be a buffered aqueous solution. Examples of the buffer used in the buffer aqueous solution include alkali metal phosphates such as sodium phosphate and potassium phosphate, alkali metal acetates such as sodium acetate aqueous solution and potassium acetate, and mixtures thereof.

本発明アルコール化合物製造方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物等を挙げることができる。   In the method for producing an alcohol compound of the present invention, an organic solvent can coexist in addition to water. Examples of the organic solvent that can coexist include ethers such as t-butyl methyl ether, diisopropyl ether, and tetrahydrofuran, ethyl formate, ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, ethyl propionate, butyl propionate, and the like. Esters, hydrocarbons such as toluene, hexane, cyclohexane, heptane, isooctane, alcohols such as methanol, ethanol, 2-propanol, butanol, t-butyl alcohol, organic sulfur compounds such as dimethyl sulfoxide, acetone, etc. Mention may be made of ketones, nitriles such as acetonitrile, and mixtures thereof.

本発明アルコール化合物製造方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０℃〜６０℃の範囲である。   The pH during the reaction in the method for producing an alcohol compound of the present invention can be appropriately selected, but is usually in the range of pH 3 to pH 10. The reaction temperature can be appropriately selected, but is usually in the range of 0 ° C. to 60 ° C. in terms of the stability of the raw materials and products and the reaction rate.

反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常、０．５時間から１０日間の範囲である。 The end point of the reaction can be determined, for example, by following the amount of ketone compound or aldehyde compound in the reaction solution by liquid chromatography or the like.
The reaction time can be appropriately selected, but is usually in the range of 0.5 hours to 10 days.

反応液からのアルコール化合物の回収は、一般に知られている方法を適宜選んで行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。 Recovery of the alcohol compound from the reaction solution may be performed by appropriately selecting a generally known method.
For example, a method of purifying by performing post-treatment such as organic solvent extraction operation and concentration operation of the reaction solution in combination with column chromatography, distillation or the like, if necessary, can be mentioned.

本発明酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で本発明アルコール化合物製造方法に用いることができる。   The enzyme of the present invention, the transformant producing the enzyme, or the processed product thereof can be used in the method for producing an alcohol compound of the present invention in various forms.

具体的な形態としては、例えば、本発明形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物を挙げることができる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物を挙げることができる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明酵素等を閉じ込める方法）を挙げることができる。   Specific examples include a culture of the transformant of the present invention, a processed product of the transformant, a cell-free extract, a crude purified protein, a purified protein, and the like, and an immobilized product thereof. Here, the processed product of the transformant is, for example, a freeze-dried transformant, an organic solvent-treated transformant, a dried transformant, a transformant grind, an autolysate of the transformant, or a transformant. Examples thereof include an ultrasonically treated product, a transformant extract, and an alkali-treated product of the transformant. Examples of a method for obtaining an immobilized product include a carrier binding method (a method of adsorbing the enzyme of the present invention on an inorganic carrier such as silica gel and ceramic, cellulose, an ion exchange resin, etc.) and a comprehensive method (polyacrylamide, sulfur-containing polysaccharide). And a method of confining the enzyme of the present invention in a polymer network such as a gel (for example, carrageenan gel), alginate gel, agar gel and the like.

尚、本発明形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、未処理状態の形質転換体を用いる方法よりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法の方が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン、抗生物質）を挙げることができる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明酵素の還元酵素活性を失活させず、且つ、反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。   If industrial production using the transformant of the present invention is taken into consideration, the method using the treated product obtained by killing the transformant is more suitable for production than the method using the untreated transformant. This is preferable in that there are few restrictions. As a killing treatment method for that purpose, for example, physical sterilization methods (heating, drying, freezing, light, ultrasonic waves, filtration, energization) and sterilization methods using chemicals (alkali, acid, halogen, oxidizing agent, Sulfur, boron, arsenic, metal, alcohol, phenol, amine, sulfide, ether, aldehyde, ketone, cyan, antibiotics). Generally, among these sterilization methods, it is desirable to select a treatment method that does not inactivate the reductase activity of the enzyme of the present invention as much as possible and has little influence on the reaction system, such as residue and contamination.

また、本発明アルコール化合物製造方法は、ＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ＋は、ＮＡＤ＋を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、本発明アルコール化合物製造方法の反応系内には、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。 The alcohol compound production method of the present invention is carried out in the presence of NADH. As the reduction reaction of the ketone compound or aldehyde compound proceeds, the NADH is converted into oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NAD + ). Is written). Since NAD + generated by the conversion can be returned to the original NADH by a protein having the ability to convert NAD + to reduced form (NADH), NAD + is contained in the reaction system of the alcohol compound production method of the present invention. A protein having the ability to convert to NADH can also coexist.

ＮＡＤ+を、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等を挙げることができる。 Examples of proteins having the ability to convert NAD + to NADH include glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase (malic acid). Dehydrogenase, etc.).

また、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。 Further, when the protein having the ability to convert to NAD + or NADH is glucose dehydrogenase, the activity of the protein may be enhanced by coexisting glucose or the like in the reaction system. These may be added to the liquid.

また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素を持つ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。更にまた、ＮＡＤ+を、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。 The protein may be the enzyme itself, or may coexist in the reaction system in the form of a microorganism having the enzyme or a processed product of the microorganism. Furthermore, the transformant containing the gene which has a base sequence which codes the amino acid sequence of the protein which has the capability to convert NAD + into NADH, or its processed material may be sufficient. Here, the treated product means an equivalent of the above-mentioned “treated product of transformant”.

更に、本発明アルコール化合物製造方法では、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。 Further, in the alcohol compound production method of the present invention, glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic dehydrogenase (malate dehydrogenase, etc.) It is also possible to use a transformant that simultaneously holds a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein having the ability to convert NAD + to NADH.

この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等を挙げることができる。更に、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。   In this transformant, methods for introducing both genes into the host cell include, for example, a method in which a single vector containing both genes is introduced into the host cell, and both genes separately in a plurality of vectors having different origins of replication. And a method for transforming host cells with the recombinant vector introduced in (1). Furthermore, one or both genes may be introduced into the host cell chromosome.

尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。   In addition, as a method for introducing a single vector containing both genes into a host cell, for example, a recombinant vector can be constructed by linking regions involved in expression control such as promoter and terminator to each of both genes. Alternatively, a recombinant vector that is expressed as an operon containing a plurality of cistrons such as lactose operon may be constructed.

本発明酵素改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含む。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
本発明酵素改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明ポリヌクレオチドの調製等に関する説明）及び後述の実施例と同様な方法に準じて行なえばよい。 The enzyme modification method of the present invention is a method for modifying an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and includes the following basic amino acid mutations (a) to (d) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The amino acid has an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that it has 4 or more amino acid mutations including all, and an enzyme has an ability to reduce a substrate. Including a step of introducing a mutation.
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is substituted with alanine The steps included in the enzyme modification method of the present invention are the same as those described above (for example, the preparation of the enzyme of the present invention and the polynucleotide of the present invention) and the examples described later. What is necessary is just to carry out according to the method.

本発明遺伝子改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含む。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
本発明遺伝子改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明ポリヌクレオチドの調製等に関する説明）及び後述の実施例と同様な方法に準じて行なえばよい。 The gene modification method of the present invention is a method for modifying a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Having a base sequence equivalent to the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 except having four or more base mutations including all of base mutations (a ′) to (d ′), and And a step of introducing a base mutation so that the enzyme has a base sequence encoding an amino acid sequence having the ability to reduce a substrate.
<Basic base mutation>
(A ′) 34th to 36th codons encoding glutamic acid are replaced with codons encoding glycine (b ′) 124th to 126th codons encoding aspartic acid, Base mutations (c ') substituted for codons encoding valine (c') Base mutations (d ') from 199th to 951th, where lysine-encoding codons are replaced with codons encoding arginine The base mutation in which the codon encoding serine is replaced by the codon encoding alanine The steps included in the gene modification method of the present invention relate to the above-described explanation (for example, preparation of the enzyme of the present invention and the polynucleotide of the present invention, etc.) The method may be performed in accordance with the same method as described in the description) and examples described later.

以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example etc. demonstrate this invention further in detail, this invention is not limited at all by those Examples. In addition, the reagents, devices, and materials used in the present invention are commercially available unless otherwise specified.

実施例１ （多重変異型プラスミドＤＮＡの調製）
（１−１） 部位特異的な塩基変異の導入用プライマー合成（その１）
１２５番目のメチオニンをロイシンに、１７３番目のプロリンをセリンに、３２７番目のバリンをアラニンに変換するための変異プライマーとして、配列番号１７から配列番号２２に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマー）を合成した。アミノ酸変異と対応する配列番号及び塩基配列を表１に示す。 Example 1 (Preparation of Multiple Mutation Plasmid DNA)
(1-1) Synthesis of a primer for introducing a site-specific base mutation (part 1)
As mutated primers for converting the 125th methionine to leucine, the 173rd proline to serine, and the 327th valine to alanine, various syntheses corresponding to each amino acid as shown in SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 22 Oligonucleotides (mutant primers) were synthesized. Table 1 shows SEQ ID NOs and base sequences corresponding to amino acid mutations.

Figure 2013172682
Figure 2013172682

（１−２）プラスミドｐＳＡＲ２５６８の調製
配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、特許第４５５８４１４号公報に記載されるベクターｐＳＡＲ２６８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ａ）と記す。 (1-2) Preparation of plasmid pSAR2568 It describes in patent 4558414 using the oligonucleotide which has a base sequence shown by sequence number 17, and the oligonucleotide which has the base sequence shown by sequence number 18 as a primer. PCR was performed using the vector pSAR268 as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (A).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２６８ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pSAR268 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（Ａ）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (A), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−３） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR２５６８）を含有する形質転換体を取得した。 (1-3) Determination of the base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-2), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pSAR2568) was obtained.

（１−４）プラスミドｐＳＡＲ２５６７８の調製
配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、（１−３）にて得られたベクターｐＳＡＲ２５６８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（B）と記す。 (1-4) Preparation of plasmid pSAR25678 Using the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 19 and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 20 as primers, the plasmid pSAR25678 was obtained in (1-3). PCR was carried out using the vector pSAR2568 as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (B).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２５６８ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pSAR2568 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（B）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (B), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−５） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−４）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR２５６７８）を含有する形質転換体を取得した。 (1-5) Determination of the base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-4), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this manner, a transformant containing a mutant vector (vector pSAR25678) was obtained.

（１−６）プラスミドｐＳＡＲ１３４の調製
配列番号２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、（１−５）にて得られたベクターｐＳＡＲ２５６７８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（C）と記す。 (1-6) Preparation of plasmid pSAR134 Using the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 as primers, the plasmid pSAR134 was obtained in (1-5). Using the vector pSAR25678 as a template, PCR was carried out under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (C).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２５６７８ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pSAR25678 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（C）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (C), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−７） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−６）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR１３４）を含有する形質転換体を取得した。 (1-7) Determination of nucleotide mutation in the nucleotide sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-6), the nucleotide sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing the mutant vector (vector pSAR134) was obtained.

（１−８） 部位特異的な塩基変異の導入用プライマー合成（その２）
２７番目のグルタミン酸をグルタミンに、２８番目のバリンをメチオニンに、１０７番目のセリンをプロリンに、２２８番目のアラニンをバリンに、３１７番目のをセリンにアラニンに、３３９番目のセリンをアスパラギンに、３３９番目のセリンをアルギニンに、２８番目のバリンをイソロイシンに変換するための変異プライマーとして、配列番号２３から配列番号３８に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマー）を合成した。アミノ酸変異と対応する配列番号及び塩基配列を表２に示す。 (1-8) Primer synthesis for introducing site-specific base mutation (part 2)
27th glutamic acid is glutamine, 28th valine is methionine, 107th serine is proline, 228th alanine is valine, 317th is serine and alanine, 339th serine is asparagine, 339 As a mutation primer for converting the second serine into arginine and the 28th valine into isoleucine, various synthetic oligonucleotides (mutation primers) corresponding to each amino acid were synthesized as shown in SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 38. . Table 2 shows SEQ ID NOs and base sequences corresponding to the amino acid mutations.

Figure 2013172682
Figure 2013172682

（１−９）プラスミドｐＳ３１７Ａの調製
配列番号３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−７）で得られたベクターｐＳＡＲ１３４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（D）と記す。 (1-9) Preparation of Plasmid pS317A Using the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 31 and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 32 as primers, Using the vector pSAR134 as a template, PCR was carried out under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (D).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ１３４ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pSAR134 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（D）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (D), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１０） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−９）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐS３１７A）を含有する形質転換体を取得した。 (1-10) Determination of base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-9), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing the mutant vector (vector pS317A) was obtained.

（１−１１）プラスミドｐＨＰＡＲ１−１３の調製
配列番号２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１０）で得られたベクターｐＳ３１７Ａを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｅ）と記す。 (1-11) Preparation of plasmid pHPAR1-13 Using the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 27 and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 28 as primers, the above (1-10) PCR was performed using the obtained vector pS317A as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as PCR reaction solution (E).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳ３１７Ａベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pS317A vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（Ｅ）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (E), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１２） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ１−１３）を含有する形質転換体を取得した。 (1-12) Determination of nucleotide mutation in the nucleotide sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-11), the nucleotide sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR1-13) was obtained.

（１−１３）プラスミドｐＨＰＡＲ１−２の調製
配列番号３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１２）で得られたベクターｐＨＰＡＲ１−１３を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｆ）と記す。 (1-13) Preparation of plasmid pHPAR1-2 Using (1-12) the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 34 as primers, PCR was performed using the obtained vector pHPAR1-13 as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (F).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ１−１３ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR1-13 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（Ｆ）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the resulting PCR reaction solution (F), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１４） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ１−２）を含有する形質転換体を取得した。 (1-14) Determination of base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-13), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR1-2) was obtained.

（１−１５）プラスミドｐＨＰＡＲ６７−１１の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１４）で得られたベクターｐＨＰＡＲ１−２を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（G）と記す。 (1-15) Preparation of plasmid pHPAR67-11 Using the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 as primers, the above (1-14) PCR was carried out using the obtained vector pHPAR1-2 as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (G).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ１−２ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR1-2 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（G）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (G), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１６） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１５）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ６７−１１）を含有する形質転換体を取得した。 (1-16) Determination of the base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-15), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR67-11) was obtained.

（１−１７）プラスミドｐＨＰＡＲ８４−２の調製
配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１６）で得られたベクターｐＨＰＡＲ６７−１１を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（H）と記す。 (1-17) Preparation of plasmid pHPAR84-2 Using the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 as primers, the above (1-16) PCR was performed using the obtained vector pHPAR67-11 as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (H).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ６７−１１ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR67-11 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（H）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (H), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１８） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１５）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ８４−２）を含有する形質転換体を取得した。 (1-18) Determination of base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-15), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR84-2) was obtained.

（１−１９）プラスミドｐＨＰＡＲ１−７の調製
（１−１９−１）プラスミドｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１２）で得られたベクターｐHPAR1-13を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（I）と記す。 (1-19) Preparation of plasmid pHPAR1-7 (1-19-1) Preparation of plasmid pHPAR1-1 3 (E27Q) Oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 Using oligonucleotides as primers and the vector pHPAR1-13 obtained in (1-12) above as a template, PCR was performed under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (QuikChange II manufactured by STRATAGENE). Use Site-Directed Mutagenesis Kit). The obtained PCR reaction solution is referred to as PCR reaction solution (I).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR1-13ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR1-13 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（I）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the resulting PCR reaction solution (I), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１９−２） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１９−１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)）を含有する形質転換体を取得した。
（１−１９−３）プラスミドｐHPAR1-7の調製
配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１９−２）で得られたベクターｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（J）と記す。 (1-19-2) Determination of base mutation in base sequence of mutant vector After extracting a vector from the transformant obtained in (1-19-1), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method. It was determined and it was confirmed that the designed base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR1-1 3 (E27Q)) was obtained.
(1-19-3) Preparation of plasmid pHPAR1-7 Using the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 as primers, the above (1-19 -2) Using the vector pHPAR1-1-3 (E27Q) obtained in 2) as a template, PCR was performed under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as PCR reaction solution (J).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR1-1 3 (E27Q) vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（J）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (J), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−１９−４） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１９−３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR1-7）を含有する形質転換体を取得した。 (1-19-4) Determination of base mutation in base sequence of mutant vector After extracting a vector from the transformant obtained in (1-19-3), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method. It was determined and it was confirmed that the designed base mutation was introduced. In this manner, a transformant containing the mutant vector (vector pHPAR1-7) was obtained.

（１−２０）プラスミドｐＨＰＡＲ８４−４の調製
配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１０）で得られたベクターｐＳ３１７Ａを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（K）と記す。 (1-20) Preparation of plasmid pHPAR84-4 Using the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 as primers, the above (1-10) PCR was performed using the obtained vector pS317A as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as PCR reaction solution (K).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳ３１７Ａベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pS317A vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（K）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (K), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−２１） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２０）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ８４−４）を含有する形質転換体を取得した。 (1-21) Determination of base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-20), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR84-4) was obtained.

（１−２２）プラスミドｐＨＰＡＲ８３−４の調製
（１−２２−１）プラスミドｐHPAR８４-４(S339N)の調製
配列番号３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２１）で得られたベクターｐHPAR８４-４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（L）と記す。 (1-22) Preparation of plasmid pHPAR83-4 (1-22-1) Preparation of plasmid pHPAR84-4 (S339N) Having an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 Using oligonucleotides as primers and the vector pHPAR84-4 obtained in (1-21) above as a template, PCR was performed under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (QuikChange II manufactured by STRATAGENE). Use Site-Directed Mutagenesis Kit). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (L).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８４-４ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR84-4 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（L）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the above Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (L), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−２２−２） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２２−１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR８４-４(S339N)を含有する形質転換体を取得した。
（１−２２−３）プラスミドｐHPAR８３-４の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２２−２）で得られたベクターｐHPAR８４-４(S339N)を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（M）と記す。 (1-22-2) Determination of base mutation in base sequence of mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-22-1), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method. It was determined and it was confirmed that the designed base mutation was introduced. In this way, a transformant containing the mutant vector (vector pHPAR84-4 (S339N) was obtained.
(1-22-3) Preparation of plasmid pHPAR83-4 Using the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 and the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 as primers, the above (1-22) -2) Using the vector pHPAR84-4 (S339N) obtained in step 2) as a template, PCR was performed under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as a PCR reaction solution (M).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８４-４(S339N)ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR84-4 (S339N) vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（M）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (M), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−２２−４） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２２−３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR８３-４）を含有する形質転換体を取得した。 (1-22-4) Determination of base mutation in base sequence of mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-2-2), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method. It was determined and it was confirmed that the designed base mutation was introduced. In this way, a transformant containing a mutant vector (vector pHPAR83-4) was obtained.

（１−２３）プラスミドｐＨＰＡＲ６８Ｆａｓｔ−１の調製
配列番号２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２２−４）で得られたベクターｐHPAR８３-４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（N）と記す。 (1-23) Preparation of plasmid pHPAR68Fast-1 Using the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 25 and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 26 as primers, the above (1-2-2-4) ) Using the vector pHPAR83-4 obtained in step 1) as a template under the following PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions (using QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit manufactured by STRATAGENE). The obtained PCR reaction solution is referred to as PCR reaction solution (N).

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８３-４ベクター溶液 １．７μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
センスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに付属されたもの） １μｌ
超純水 ４１．５μｌ <Composition of PCR reaction solution>
pHPAR83-4 vector solution 1.7 μl
dNTP mix (attached to Kit above) 1 μl
Sense primer (50 μM) 0.4 μl
Antisense primer (50 μM) 0.4 μl
10xbuffer (attached to Kit above) 5μl
PfuUltra (attached to Kit above) 1 μl
Ultrapure water 41.5μl

＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 <PCR reaction conditions>
A container containing the PCR reaction solution having the PCR reaction solution composition described above was set in the PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then kept at 95 ° C. (50 seconds) -55 ° C. (1 minute) -68. A cycle of 12 ° C. (5 minutes) was performed 12 times, and then stored at 4 ° C.

得られたＰＣＲ反応液（N）に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ JM109を形質転換した。   1 μl of DpnI restriction enzyme (attached to the Kit) was added to the obtained PCR reaction solution (N), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Using the obtained heat retaining solution, E. coli. E. coli JM109 was transformed.

（１−２４） 変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ６８Ｆａｓｔ−１）を含有する形質転換体を取得した。 (1-24) Determination of the base mutation in the base sequence of the mutant vector After extracting the vector from the transformant obtained in (1-23), the base sequence of the mutation site is determined by the dideoxy method and designed. It was confirmed that the same base mutation was introduced. In this way, a transformant containing the mutant vector (vector pHPAR68Fast-1) was obtained.

実施例２ （本発明形質転換体による本発明酵素の産生）
実施例１によって得られた８種類の本発明酵素を宿主細胞内で発現させるためのプラスミド（pHPAR1-13、pHPAR1-２、pHPAR67-11、pHPAR８４-２、pHPAR1-7、pHPAR８４-４、pHPAR８３-４、pHPAR68FAST-1）を有する形質転換体（大腸菌）、特許第４５５８４１４号公報に記載されるベクターｐＥＡＲ２を有する形質転換体（大腸菌）を、各々別々にして、終濃度０．０１％となるように塩化亜鉛を加えたＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．４ｍＭになる様に添加することにより、本発明酵素の宿主細胞内での発現を誘導した。培養終了後、遠心分離（１００００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収した後、回収された菌体をバイディングバッファー（２０ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐH7.4）、４０ｍMイミダゾール、２００ｍM塩化ナトリウム）に懸濁し、超音波破砕機を用いて破砕した。得られた破砕液を再び遠心分離することにより、粗酵素液として上清液を得た。得られた粗酵素液をバイディングバッファーと溶出バッファー（２０ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐH7.4）、５００ｍMイミダゾール）とを用いて、Ni Sephaorose(GEヘルスケア・ジャパン)処理することにより、８種類の本発明酵素（HPAR1-13、HPAR1-２、HPAR67-11、HPAR８４-２、HPAR1-7、HPAR８４-４、HPAR８３-４、HPAR68FAST-1）、及びＥＡＲ２（野生型酵素）を各々別々に取得した。 Example 2 (Production of the enzyme of the present invention by the transformant of the present invention)
Plasmids (pHPAR1-13, pHPAR1-2, pHPAR67-11, pHPAR84-2, pHPAR1-7, pHPAR84-4, pHPAR83-) for expressing the eight kinds of enzymes of the present invention obtained in Example 1 in host cells 4, transformant having pHPAR68FAST-1) (Escherichia coli) and transformant having vector pEAR2 described in Japanese Patent No. 4558414 (Escherichia coli) are separately prepared so that the final concentration becomes 0.01%. Inoculated in LB medium (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%) added to zinc chloride, cultured at 37 ° C., and IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyra in the logarithmic growth phase. Noside) was added to a final concentration of 0.4 mM to induce expression of the enzyme of the present invention in the host cell. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (10000 g, 10 minutes, 4 ° C.), and then the collected cells were combined with a binding buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 40 mM imidazole, 200 mM sodium chloride). ) And crushed using an ultrasonic crusher. The obtained crushed liquid was centrifuged again to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. The obtained crude enzyme solution was treated with Ni Sephaorose (GE Healthcare Japan) using a binding buffer and an elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 500 mM imidazole). The enzyme of the present invention (HPAR1-13, HPAR1-2, HPAR67-11, HPAR84-2, HPAR1-7, HPAR84-4, HPAR83-4, HPAR68FAST-1) and EAR2 (wild type enzyme) were obtained separately. .

実施例３ （本発明酵素が有する熱安定性の評価）
実施例２で得られた８種類の本発明酵素と、ＥＡＲ２(野生型酵素)を、各々別々にして、６５℃で３０分間保温処理した。このように保温処理された供試酵素１０μｍｏｌに、３−オキソ酪酸エチルを３μｍｏｌ、ＮＡＤＨを０．３μｍｏｌ、リン酸カリウムバッファー（ｐH７．０）５０ｍＭを添加した。これを２５℃、１０分間保温した後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
尚、１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量とし、上記の保温処理を行った後の供試酵素の還元酵素活性を、上記の保温処理を行う前の供試酵素の還元酵素活性を１００％として、残存活性率を算出した。その結果を表３に示す。 Example 3 (Evaluation of thermal stability of the enzyme of the present invention)
Eight kinds of the enzymes of the present invention obtained in Example 2 and EAR2 (wild type enzyme) were separately treated at 65 ° C. for 30 minutes. 3 μmol ethyl 3-oxobutyrate, 0.3 μmol NADH, and 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) were added to 10 μmol of the test enzyme thus incubated. After keeping this at 25 ° C. for 10 minutes, the absorbance at 340 nm was measured.
In addition, 1U is the amount of enzyme that consumes 1 μmol of NADH per minute, and the reductase activity of the test enzyme after the above heat retention treatment is the reductase activity of the test enzyme before the above heat treatment. Was assumed to be 100%, and the residual activity rate was calculated. The results are shown in Table 3.

Figure 2013172682
Figure 2013172682

本発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される、熱安定性に優れた還元酵素等が提供可能となる。そして、本発明酵素を利用すれば、反応時間の短縮および反応効率の向上が可能となる。   According to the present invention, there is a reductase having excellent thermal stability, which is used in an organic synthesis reaction for producing a compound or an intermediate thereof, particularly an optically active compound or a production intermediate thereof. It can be provided. If the enzyme of the present invention is used, the reaction time can be shortened and the reaction efficiency can be improved.

配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー SEQ ID NO: 11
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 12
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 13
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 14
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 15
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 16
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 17
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 18
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 19
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 20
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 21
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 22
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 23
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 24
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 25
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 26
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 27
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 28
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 29
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 30
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 31
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 32
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 33
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 34
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 35
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 36
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 37
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 38
Oligonucleotide primers designed for PCR

Claims (23)

配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has four or more amino acid mutations including all of the following basic amino acid mutations (a) to (d) An enzyme having an amino acid sequence and an ability to reduce a substrate.
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is replaced by alanine アミノ酸変異が４個のみであることを特徴とする請求項１記載の酵素。   2. The enzyme according to claim 1, wherein only 4 amino acid mutations are present. アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）を１個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異 The enzyme according to claim 1, wherein the number of amino acid mutations is 5, and one of the following additional amino acid mutations (e) is included in addition to the four basic amino acid mutations.
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）を１個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異 The enzyme according to claim 1, wherein the number of amino acid mutations is 5, and one of the following additional amino acid mutations (f) is included in addition to the four basic amino acid mutations.
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is replaced by valine アミノ酸変異が６個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）及び（ｇ）を２個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異 The number of amino acid mutations is 6, and, in addition to the four basic amino acid mutations, the following two additional amino acid mutations (e) and (g) are included. Enzyme.
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (e), (g) and (h) below in addition to the 4 basic amino acid mutations described above The enzyme according to claim 1.
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (e), (h) and (i) below in addition to the 4 basic amino acid mutations described above The enzyme according to claim 1.
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine (i) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with arginine アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異 7 amino acid mutations and 3 additional amino acid mutations (f), (g) and (h) below in addition to the above 4 basic amino acid mutations The enzyme according to claim 1.
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which 27th glutamic acid is replaced with glutamine アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を４個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異 There are 8 amino acid mutations, and in addition to the 4 basic amino acid mutations described above, the following additional amino acid mutations (e), (g), (h) and (j) are included. The enzyme according to claim 1.
<Additional amino acid mutation>
(E) Amino acid mutation in which the 107th serine is replaced with proline (g) Amino acid mutation in which the 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which the 27th glutamic acid is replaced with glutamine (j) 28th Amino Acid Mutation That Replaces Valine in Isoleucine アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）を４個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異 There are 8 amino acid mutations, and in addition to the 4 basic amino acid mutations described above, the following additional amino acid mutations (f), (g), (h) and (k) are included. The enzyme according to claim 1.
<Additional amino acid mutation>
(F) Amino acid mutation in which 228th alanine is replaced with valine (g) Amino acid mutation in which 339th serine is replaced with asparagine (h) Amino acid mutation in which 27th glutamic acid is replaced with glutamine (k) 28th Amino acid mutation in which valine is replaced by methionine 下記の配列番号２乃至９のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。   An enzyme having the amino acid sequence of any one of the following SEQ ID NOs: 2 to 9, and having an ability to reduce a substrate. アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素。   The enzyme according to claim 1, wherein the amino acid mutation is 5 or more and 8 or less. アミノ酸変異が５個以上７個以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素。   The enzyme according to claim 1, wherein the amino acid mutation is 5 or more and 7 or less. 請求項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme according to any one of claims 1 to 13. 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１４記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide comprising a promoter capable of functioning in a host cell and the polynucleotide according to claim 14 operatively connected. 請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。   A vector comprising the polynucleotide according to claim 14 or 15. 請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は請求項１５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。   A transformant obtained by introducing the polynucleotide according to claim 14 or 15 or the vector according to claim 15 into a host cell. 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換体。   The transformant according to claim 17, wherein the host cell is a microorganism. 微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換体。   The transformant according to claim 18, wherein the microorganism is Escherichia coli. 請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は請求項１６記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。   A method for producing a transformant comprising the step of introducing the polynucleotide according to claim 14 or 15 or the vector according to claim 16 into a host cell. ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素若しくはそれらを産生する微生物又は請求項１７乃至１９のいずれかの請求項記載の形質転換体、或いは、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法。   The enzyme according to any one of claims 1 to 13, the microorganism producing them, the transformant according to any one of claims 17 to 19, or a treatment thereof, on a ketone compound or an aldehyde compound A method for producing an alcohol compound, characterized by reacting a product. 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異 A method for modifying an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 comprises 4 amino acid mutations including all of the following basic amino acid mutations (a) to (d): A step of introducing an amino acid mutation so as to have an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an ability of the enzyme to reduce a substrate, except that it has at least one A method characterized by that.
<Basic amino acid mutation>
(A) Amino acid mutation in which the 12th glutamic acid is replaced with glycine (b) Amino acid mutation in which the 42nd aspartic acid is replaced with valine (c) Amino acid mutation in which the 67th lysine is replaced with arginine (d) 317 Amino acid mutation in which the second serine is replaced by alanine 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異 A method for modifying a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is based on the following basic base mutation (a ′): (D ') has a base sequence equivalent to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that it has 4 or more base mutations including all of the above, and the enzyme reduces the substrate A method comprising a step of introducing a base mutation so as to become a base sequence encoding an amino acid sequence having ability.
<Basic base mutation>
(A ′) 34th to 36th codons encoding glutamic acid are replaced with codons encoding glycine (b ′) 124th to 126th codons encoding aspartic acid, Base mutations (c ') substituted for codons encoding valine (c') Base mutations (d ') from 199th to 951th, where lysine-encoding codons are replaced with codons encoding arginine The base mutation in which the codon encoding serine is replaced with the codon encoding alanine
JP2012039796A 2012-02-27 2012-02-27 Mutation-type reductase and utilization thereof Pending JP2013172682A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012039796A JP2013172682A (en) 2012-02-27 2012-02-27 Mutation-type reductase and utilization thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012039796A JP2013172682A (en) 2012-02-27 2012-02-27 Mutation-type reductase and utilization thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2013172682A true JP2013172682A (en) 2013-09-05

Family

ID=49266265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012039796A Pending JP2013172682A (en) 2012-02-27 2012-02-27 Mutation-type reductase and utilization thereof

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2013172682A (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005523702A (en) * 2002-04-26 2005-08-11 デグサ アクチエンゲゼルシャフト ADH from Ryudococcus erythropolis
JP2006061111A (en) * 2004-08-30 2006-03-09 Sumitomo Chemical Co Ltd Reductase and its use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005523702A (en) * 2002-04-26 2005-08-11 デグサ アクチエンゲゼルシャフト ADH from Ryudococcus erythropolis
JP2006061111A (en) * 2004-08-30 2006-03-09 Sumitomo Chemical Co Ltd Reductase and its use

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4736654B2 (en) Reductase gene and its use
US7172894B2 (en) Reductase gene and use of the same
KR102093546B1 (en) A method for producing acetoin from ethanol
KR102013058B1 (en) A method for producing butandiol from ethanol
JP5230234B2 (en) Reductase and its use
JP4228606B2 (en) Modified reductase, its gene and use thereof
JP4745762B2 (en) Reductase and its use
JP6551407B2 (en) Oxidase, polynucleotide encoding it, and use thereof
JP4558414B2 (en) Reductase and its use
JP2013172682A (en) Mutation-type reductase and utilization thereof
JP4228605B2 (en) Modified reductase, its gene and use thereof
JP4039037B2 (en) Reductase gene and its use
JP5724194B2 (en) Mutant reductase
JP6460106B2 (en) Oxidase, polynucleotide encoding the same, and use thereof
JP6064183B2 (en) Reductase gene amplification primer set and reductase gene acquisition method
JP5724190B2 (en) Mutant reductase
JP5724191B2 (en) Mutant reductase
JP5724193B2 (en) Mutant reductase
JP5724192B2 (en) Mutant reductase
JPWO2015064517A1 (en) Formate dehydrogenase and its utilization
JP5537796B2 (en) Method for obtaining reductase gene and reductase gene
WO2011115288A1 (en) Mutant reductase
JP2012010673A (en) METHOD FOR PRODUCING SULFUR-CONTAINING α-AMINO ACID COMPOUND

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150225

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150617

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20151127

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160105

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160510