JP2013166699A - 不活化したウイルス粒子を含む複合体及びその用途 - Google Patents

不活化したウイルス粒子を含む複合体及びその用途 Download PDF

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Abstract

【課題】抗原結合リポソームのCTL活性化効果を増強する新たな技術を提供すること。
【解決手段】不活化したウイルス粒子、抗原及びリポソームを含む複合体であって、該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し、且つ該リポソームの表面に該ウイルス粒子及び該抗原が結合している、複合体。
【選択図】なし

Description

本発明は、不活化したウイルス粒子を含む複合体及びその用途に関する。より詳しくは、リポソームに不活化したウイルス粒子を結合させることにより、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の誘導活性を増強させた、不活化したウイルス粒子、抗原、及びリポソームを含む複合体及びその用途に関する。
ヒト、家畜及びペットなどの哺乳動物、更には魚類に関して、ウイルスなどの病原体が細胞に感染することにより生じる様々な疾病が知られており、このような感染症の予防のためワクチンが広く利用されている。細胞に感染する病原体、たとえば、HIV、マイコプラズマ、結核菌、クラミジア、マラリアなどによる感染症を治療又は予防するためには、その病原体感染細胞を効果的に殺傷することが必要である。この病原体感染細胞の殺傷は、CD8+Tリンパ球を主体とするCTLの働きによって可能であり、このCTLの効果的な増強方法について、様々な検討がなされている。
生ウイルスあるいは弱毒ウイルスを投与することにより、効果的なCTL増強を達成することができるので、これらはワクチンとして実用化されている。しかしながら、この方法が適用できる病原体の種類が限定されることなどの理由から、より普遍的な病原体に適用可能なワクチンの開発が望まれている。
病原体の一部分、例えば、CTLが特異的細胞殺傷のための攻撃反応を起こすための抗原基を含むタンパク質あるいはペプチドを明らかとし、この抗原性物質を病原体感染細胞の殺傷のためのワクチンとして実用化するための検討も多くされている。しかしながら、このような病原体の一部のみを投与しても、ワクチンとして十分なCTL活性化を達成することができない場合があり、CTL活性化効果を増強する技術の開発が求められている。
本発明者らは、特定の構成を有するリポソームの表面に抗原を結合させた抗原結合リポソームを用いて、CTLを効率よく特異的に活性化する技術を開発している（特許文献１）。
抗原結合リポソームのCTL活性化効果は、CpG等のアジュバントを用いることにより更に増強することが出来る。しかしながら、アジュバントの多くが、高価であったり、安全性の検証段階にあるため、抗原結合リポソームのCTL活性化効果を増強する新たな技術の開発が求められている。
特開2008-37831号公報
本発明が解決しようとする課題は、抗原結合リポソームのCTL活性化効果を増強する新たな技術を提供することである。
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、意外にも、不活化したウイルス粒子を上記抗原結合リポソームへ更に結合させると、不活化したウイルス粒子部分がアジュバントとして作用し、抗原結合リポソームのCTL活性化効果が増強されることを見出して、本発明を完成させた。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］不活化したウイルス粒子、抗原及びリポソームを含む複合体であって、該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し、且つ該リポソームの表面に該ウイルス粒子及び該抗原が結合している、複合体。
［２］抗原が、該ウイルスに由来しない抗原である、［１］記載の複合体。
［３］抗原が、単離された抗原性ポリペプチドである、［１］記載の複合体。
［４］ウイルスが、RNAウイルスである、［１］記載の複合体。
［５］RNAウイルスが、インフルエンザウイルスである、［４］記載の複合体。
［６］リポソームに含有されるリン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するリン脂質である、［１］記載の複合体。
［７］アシル基がオレオイル基である、［１］記載の複合体。
［８］リポソームに含有されるリン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも1つである、［１］記載の複合体。
［９］リポソームの安定化剤がコレステロールである、［１］記載の複合体。
［１０］抗原が、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、［１］記載の複合体。
［１１］リポソームが以下の組成を有する、［１］記載の複合体：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質 1〜99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤 0.2〜75モル%。
［１２］リポソームが以下の組成を有する、［１］記載の複合体：
(I)不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する酸性リン脂質 1〜85モル%；
(II)不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する中性リン脂質 0.01〜80モル%；
(III)ウイルス粒子又は抗原が結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質 0.2〜80モル%；
(IV)リポソームの安定化剤 0.2〜75モル%。
［１３］［１］〜［１２］のいずれか記載の複合体を含む、医薬組成物。
［１４］［１］〜［１２］のいずれか記載の複合体を含む、当該抗原に特異的な細胞傷害性Tリンパ球の活性化剤。
本発明の複合体を用いれば、任意の抗原に対して特異的なCTLを強力に誘導することが可能である。不活化したウイルスとして、既にワクチン等として使用され、安全性が確立したウイルスを採用することにより、安全に、CTLを強力に誘導することが可能である。また、不活化したウイルスは比較的安価で調製可能であるため、本発明の複合体を用いれば比較的安価にワクチンを提供することが可能である。本発明の複合体を用いれば、病原体感染細胞や癌細胞等を殺傷するCTLを効率よく特異的に増強することができ、感染症や癌を予防・治療することができる。
本発明の複合体の模式図。本発明の複合体においては、リポソームの表面に不活化ウイルス粒子及び抗原が結合している。 インビボ細胞傷害性アッセイの結果を示すフローサイトメトリー解析。各グラフにおいては、横軸が細胞の蛍光強度、縦軸が細胞数を表す。免疫を行わなかったコントロールマウス（図中、ネガティブコントロール）、（１）ウイルス全粒子が結合したリポソームで免疫したマウス（図中、WP結合リポソーム）、（２）OVA257-264（配列番号１）が結合したリポソームで免疫したマウス（図中、OVA257-264結合リポソーム）、（３）ウイルス全粒子及びOVA257-264（配列番号１）が結合したリポソームで免疫したマウス（図中、OVA257-264+WP（同一リポソーム））、（４）ウイルス全粒子が結合したリポソームとOVA257-264（配列番号１）が結合したリポソームの混合液で免疫したマウス（図中、OVA257-264+WP（混合））。右端のピークは、OVA257-264ペプチドをパルスした蛍光色素標識標的細胞を示す。真中付近のピークは、OVA257-264ペプチドをパルスせず蛍光色素で標識した標的細胞を示す。免疫によるCTL誘導活性の高さは、右端のピークの細胞数の減少の程度として表示される。上記投与群はそれぞれ2匹のマウスによって構成され、（１）〜（４）の投与群については、各個体から調製した細胞について別々に実験した結果のグラフを全て示す。各グラフの右下に示すパーセンテージは、免疫を行わなかったコントロールと比較した、CTL誘導についての相対活性を示す。
本発明は、不活化したウイルス粒子、抗原及びリポソームを含む複合体であって、該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し、且つ該リポソームの表面に該ウイルス粒子及び該抗原が結合している、複合体（本発明の複合体）を提供する。
本発明の複合体においては、不活化したウイルス粒子と抗原が、同一のリポソームの表面に結合している。特定の構成を有するリポソームの表面に抗原を結合させた抗原結合リポソームは、CTLを効率よく当該抗原特異的に活性化するが（特開2008-37831号公報）、このリポソームの表面上にさらに不活化したウイルス粒子が結合することにより、抗原特異的なCTLの活性化が増強される。本発明の複合体の模式図を図１に示す。
本発明の複合体に含まれるウイルスの種類としては、本発明の複合体において用いた際、抗原特異的なCTLの活性化を増強し得るものであれば特に限定されないが、好ましくはRNAウイルスである。RNAウイルスに含まれるRNAが自然免疫を刺激するため、抗原特異的なCTLの活性化を増強する観点から好ましい。RNAウイルスとしては、例えばインフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（SARS）ウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、腎症候性出血熱ウイルス、デング出血熱ウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、ジステンバーウイルス、感染性気管支炎ウイルス、伝染性白血病ウイルス、成人T細胞白血病ウイルス、エイズウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスである。
本発明に用いるウイルス粒子には、不活化した、DNA又はRNAゲノムを含む完全ウイルス粒子や、不完全ウイルス粒子、DNA又はRNAゲノムを含まないウイルス様粒子（VLP）が包含される。ウイルス粒子は、好ましくは不活化した完全ウイルス粒子又は不完全ウイルス粒子である。
ウイルス粒子の調製方法は当該技術分野において周知である。例えば、ウイルス全粒子又は不完全ウイルス粒子を用いる場合、所望のウイルスに感染した動物の器官・組織を単離・破砕するか、又は感染後増殖させた宿主培養細胞を回収して破砕し、得られた破砕液を遠心分離（例えば密度勾配遠心）に付して目的とするウイルスを含有する画分を単離することにより、単離されたウイルス粒子を得ることが出来る。VLPの場合、ウイルスゲノムから調製されたウイルスタンパク質の発現ベクターを培養細胞等の宿主細胞に導入してウイルスタンパク質を発現させ、得られた細胞を遠心分離（例えば密度勾配遠心）に付すことにより、該細胞中で自己会合したVLPを単離することができる。例えばインフルエンザウイルスの場合には、以下のようにして調製することができる。有精卵（受精卵）を孵卵機内で約11日間、38〜39℃で保温し、胚の発生を確認した後、卵殻に注射針が通る程度の穴をあけ、そこから漿尿液にインフルエンザウイルスを直接注入し、その穴をふさぎ、再度、孵卵機に戻し、32〜36℃で3日ほど保温する。その後、ウイルス接種卵を冷蔵庫に一晩入れ、卵殻を切り取り、漿尿液を無菌的に採取する。採取液中の血液などの混入物を除いた後、ゾーナル遠心機を用いた蔗糖密度勾配遠心法によりウイルス粒子を精製濃縮する。
ウイルスの不活化方法は当該技術分野において周知であり、ウイルスの宿主への感染力を失わせる方法であれば特に限定されない。不活化の方法としては例えば該ウイルス粒子をエーテル、ホルマリン、塩素、水銀、アルコール、β-プロピオラクトン等の化学物質で処理して失活させるか、又は熱、超音波、紫外線、X線等に曝すことにより失活させる方法が挙げられる。ウイルス粒子の不活化は、ウイルスの感染力を失わせる一方で、ウイルス粒子の抗原性が極力失われないように行うことが好ましい。このような観点から、ウイルスの不活化は日本の厚生労働省が定めた生物学的製剤基準（厚生労働省告示第155号（平成16年3月30日））に即して行うことが好ましい。例えば、不活化させるウイルスがインフルエンザウイルスの場合には、生物学的製剤基準の医薬品各条「インフルエンザワクチン」2項に記載の手法に基づき不活化することで、ウイルスの感染力を失わせる一方で、ウイルス粒子の抗原性が極力失われないようにすることができる。
本発明で用いられる不活化したウイルス粒子は、単離されていることが好ましい。「単離」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された不活化したウイルス粒子」における、目的とする不活化したウイルス粒子の含有量（重量%）は、通常20%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは100%である。
本発明の複合体に含まれる抗原としては、Tリンパ球（好ましくは細胞傷害性Tリンパ球）が抗原として認識し得る限り、特に限定されるものではなく、ヒト；犬、猫、小鳥などのペット；鶏、アヒル、豚、牛、羊などの家畜を対象として、抗原となるあらゆる物質を用いることができる。該抗原としては、具体的には、例えば、細胞内感染性の病原体由来の抗原や、癌化した細胞に関連した抗原（腫瘍抗原）等を用いることができる。これらの抗原は細胞傷害性Tリンパ球により認識されることが知られている。
細胞内感染性の病原体由来の抗原としては、病原体そのもの又はその一部、あるいは不活化又は弱毒化した病原体そのもの又はその一部等が挙げられる。これらの抗原としては、例えば、破傷風、ジフテリア等の各種トキソイド；インフルエンザ、ポリオ、日本脳炎、麻疹、おたふくかぜ、風疹、狂犬病、黄熱、水痘、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、腎症候性出血熱、テング出血熱、ロタウイルス感染症、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンバーウイルス、レプトスピラー、感染性気管支炎ウイルス、伝染性白血病ウイルス、エイズなどのウイルス由来の抗原；マイコプラズマ等のバクテリア由来の抗原；マラリア原虫、住血吸虫等の細胞内寄生性の原虫由来の抗原等が挙げられる。上記抗原は、1種又は2種以上を組合せて使用することもできる。
癌化した細胞に関連した抗原としては、癌化した細胞において特異的に発現する蛋白質、糖鎖、ペプチドなどであれば特に限定されるものではなく、例えば、乳癌、胃癌、肝臓癌、肺癌等に特異的な組織適合抗原や、腫瘍特異移植抗原（TSTA）、腫瘍関連抗原（Tumor Associated Antigen: TAA）等が挙げられる。具体的には、癌化した細胞に関連した抗原としては、a-フェトプロテイン（a-FP）、PIVKA-2、CEA、CA19-9、CA125、CA15-3、シフラ、神経特異エノラーゼ（NSE）、前立腺特異抗原（PSA）、a-フェトプロテインL3分画（AFP-L3）、トータルa-フェトプロテイン（Total-AFP）、NCC-ST439、乳頭分泌液中CEA（ラナマンモCEA）、SCC等を挙げることが出来る。上記抗原は、1種又は2種以上を組合せて使用することもできる。
細胞傷害性Tリンパ球は、MHCクラスI上に提示されたポリペプチドや糖脂質をTCRを介して認識する。従って、本発明において用いられる抗原としては、哺乳動物（例えばヒト）のMHCクラスI上に提示されることにより、哺乳動物（例えばヒト）の細胞傷害性Tリンパ球上のTCRが認識可能なポリペプチドや糖脂質；哺乳動物（例えばヒト）の細胞内プロテアソームでの分解により当該ポリペプチドや糖脂質を生じるタンパク質、病原体や癌細胞の一部（抽出物等）等が好ましい。
本発明に用いる抗原は、好ましくは抗原性を有するポリペプチドである。MHCクラスI上に提示されるポリペプチドの長さは、通常8〜10アミノ酸であるので、本発明に用いる抗原性ポリペプチドの長さは、通常8アミノ酸以上、好ましくは8〜10アミノ酸である。
一態様において、本発明の複合体に含まれる抗原は、当該複合体に含まれるウイルスに由来しない抗原である。「抗原Aが、ウイルスXに由来しない」とは、抗原Aが、当該ウイルスXに構成因子として含まれていないことを意味する。例えば、抗原Aがポリペプチドである場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、ウイルスXのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸配列中に存在しないことを意味する。
また、別の態様において、本発明の複合体に含まれる抗原は、当該複合体に含まれるウイルスに由来する抗原である。「抗原Aが、ウイルスXに由来する」とは、抗原Aが、当該ウイルスXに構成因子として含まれることを意味する。例えば、抗原Aがポリペプチドである場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、ウイルスXのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸配列中に存在することを意味する。
本発明で用いられる抗原は、単離されていることが好ましい。「単離」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された抗原」における、目的とする抗原の含有量（重量％）は、通常20%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは100%である。
本明細書において、リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜を指す。本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。
不活化したウイルス粒子及び抗原は、それらが有する官能基を介してリポソームの表面に結合することができる。リポソーム表面への結合に用いられる不活化したウイルス粒子及び抗原中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基又はメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基及びジスルフィド基は共有結合により、アミノ基及びカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、不活化したウイルス粒子及び抗原をリポソームの表面に結合することができる。不活化したウイルス粒子及び抗原は、好ましくはアミノ基、カルボキシル基又はチオール基を介してリポソームの表面に結合する。
不活化したウイルス粒子及び抗原が有する官能基を介して、不活化したウイルス粒子及び抗原が安定にリポソームに結合するため、リポソームを構成するリン脂質膜は、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等の官能基を有することが望ましい。リポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基は、好ましくは、アミノ基、サクシンイミド基又はマレイミド基である。不活化したウイルス粒子及び抗原のリポソームへの結合に関与する、不活化したウイルス粒子及び抗原の有する官能基とリポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基の組み合わせは、本発明の効果に影響しない範囲において自由に選択することができるが、好ましい組み合わせとしては、それぞれ、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とアミノ基、アミノ基とサクシンイミド基、チオール基とマレイミド基等が挙げられる。イオン結合及び疎水結合は、リポソームへの不活化したウイルス粒子及び抗原の結合手順が簡便であり、本発明の複合体の調製容易性の点から好ましく、また、共有結合は、リポソーム表面の不活化したウイルス粒子及び抗原の結合安定性の点又は本発明の複合体を実用する際の保存安定性の点から好ましい。本発明の複合体は、その構成成分である不活化したウイルス粒子及び抗原が、同一のリポソームの表面に結合していることを1つの特徴としており、これにより優れたCTL活性化効果を達成している。従って、実用段階で、例えば注射行為によって生体内に投与された後にも、不活化したウイルス粒子及び抗原がリポソームの表面に安定に結合していることが、本発明の効果をより高める点で好ましい。このような観点から、不活化したウイルス粒子とリポソームとの結合並びに抗原とリポソームとの結合としては、共有結合が好ましい。
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有してなる。
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは16〜22であり、更に好ましくは18〜22であり、最も好ましくは18である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは16〜22であリ、更に好ましくは18〜22であり、最も好ましくは18である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、C20モノエン基、C22モノエン基、C24モノエン基等が挙げられる。
リン脂質が有するグリセリン残基の1-位、及び2-位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、1-位及び2-位の基が同一であることが好ましい。
CTLを効率よく抗原特異的に活性化させる点から、リン脂質は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が13未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またCTL活性化効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が24を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、不活化したウイルス粒子及び抗原を結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質等の種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。CTLを効率よく抗原特異的に活性化する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、本発明の複合体が水性溶媒中にある際のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、CTLの抗原特異的な活性化を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及び不活化したウイルス粒子又は抗原を結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明の複合体のリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、中性リン脂質を含有することが好ましい。CTLの抗原特異的な活性化を達成するために用いる酸性リン脂質、不活化したウイルス粒子又は抗原結合のための反応性リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
好ましい態様において、本発明の複合体においては、不活化したウイルス粒子及び抗原がリポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。
この不活化したウイルス粒子及び抗原結合のためのリン脂質として、不活化したウイルス粒子及び抗原が結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が24を超えるか、14未満である場合は好ましくない。
反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、不活化したウイルス粒子及び抗原との結合工程の簡便性、収率等の点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に不活化したウイルス粒子及び抗原を結合することのできるアミノ基を有する。更に、CTLを効率よく抗原特異的に活性化する点、リポソームでの安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼDを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼD及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム/メタノール/水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比等のカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に2価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。2価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート（DSS）、又はジサクシンイミジルグルタレートが等挙げられる。
また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような2価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような2価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
リポソームの表面に不活化したウイルス粒子及び抗原を結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次に不活化したウイルス粒子及び抗原を加えてリポソーム表面の反応性リン脂質に不活化したウイルス粒子及び抗原を結合する方法を挙げることができる。また、予め不活化したウイルス粒子及び抗原をそれぞれ反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られた不活化したウイルス粒子が結合した反応性リン脂質及び抗原が結合した反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及びリポソームの安定化剤と混合することによっても、不活化したウイルス粒子及び抗原を表面に結合したリポソームを得ることができる。反応性リン脂質への不活化したウイルス粒子及び抗原の結合方法は、該技術分野において周知である。
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上含有する。
例えば、本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上の、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
また、本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する中性リン脂質、及び
不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する反応性リン脂質
を、それぞれ、少なくとも1種含有することが好ましい。
本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。前記のステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール等が挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。前記のトコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性等の点から、市販のα-トコフェロールが好ましく挙げられる。
さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、リポソームを構成することのできる、公知の構成成分を更に含んでいてもよい。
本発明の複合体のリポソーム部分を構成するリン脂質膜の組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質 1〜99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤 0.2〜75モル%
尚、各成分の含有量は、特に断りのない限り、本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜の全構成成分に対するモル%として表示する。
上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは10〜90モル%、より好ましくは30〜80モル%、更に好ましくは50〜70モル%である。
上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは5〜70モル%、より好ましくは10〜60モル%、更に好ましくは20〜50モル%である。安定化剤の含有量が75モル%を超えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）不活化したウイルス粒子又は抗原が結合していない、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）不活化したウイルス粒子又は抗原が結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質。
上記成分（ａ）の含有量は、通常0.01〜85モル%、好ましくは0.1〜80モル%、より好ましくは0.1〜60モル%、更に好ましくは0.1〜50モル%である。
上記成分（ｂ）の含有量は、通常0.2〜80モル%、好ましくは0.3〜60モル%、より好ましくは0.4〜50モル%、更に好ましくは0.5〜25モル%である。含有量が0.2モル%未満であると、ウイルス粒子及び抗原の量が低下するため、実用上十分なレベルにCTLを活性化することが困難となり、80モル%を超えると、リポソームの安定性が低下する。
上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
酸性リン脂質の含有量は、通常1〜85モル%、好ましくは2〜80モル%、より好ましくは4〜60モル%、更に好ましくは5〜40モル%である。含有量が1モル%未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルにCTLを活性化することが困難となる。一方、含有量が85モル%を超えると、結果として、リポソーム中の不活化したウイルス粒子又は抗原が結合したリン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルにCTLを活性化することが困難となる。
中性リン脂質の含有量は、通常0.01〜80モル%、好ましくは0.1〜70モル%、より好ましくは0.1〜60モル%、更に好ましくは0.1〜50モル%である。含有量が80.0モル%を超えると、リポソームに含まれる酸性リン脂質、不活化したウイルス粒子又は抗原が結合したリン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルにCTLを活性化することが困難となる。
不活化したウイルス粒子又は抗原が結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質に不活化したウイルス粒子又は抗原が結合して得られるもので、反応性リン脂質が不活化したウイルス粒子又は抗原と結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜実施して選択することができる。
例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に2価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の10〜99%を不活化したウイルス粒子又は抗原と結合することができる。この場合、不活化したウイルス粒子又は抗原と結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソームに含有される。
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜の好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
(I) 不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する酸性リン脂質1〜85モル%；
(II) 不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する中性リン脂質0.01〜80モル%；
(III)ウイルス粒子又は抗原が結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質0.2〜80モル%；
(IV) リポソームの安定化剤0.2〜75モル%。
（合計100モル%）
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜のより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I) 2〜80モル%
上記成分(II) 0.1〜70モル%
上記成分(III) 0.3〜60モル%
上記成分(IV) 10〜70モル%
（合計100モル%）
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜の更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I) 4〜60モル%
上記成分(II) 0.1〜60モル%
上記成分(III) 0.4〜50モル%
上記成分(IV) 20〜60モル%
（合計100モル%）
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜のとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I) 5〜40モル%
上記成分(II) 0.1〜50モル%
上記成分(III) 0.5〜25モル%
上記成分(IV) 25〜55モル%
（合計100モル%）
本発明の複合体は、それに含まれるリポソームを構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が14〜24であることを１つの特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が14未満又は24を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を更に含んでいても差支えない。本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が14〜24である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは75%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは97%以上（例えば実質的に100%）である。
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、CTLの抗原特異的な活性化が達成される限り、炭素数が14〜24の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は40モル%以下であり、好ましくは20モル%以下、より好ましくは10モル%以下、更に好ましくは5モル%以下（例えば実質的に0モル%）である。
本発明の複合体に含まれるリポソームは、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤、不活化したウイルス粒子、抗原等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加する等の方法で得ることができる。
例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、W/O/Wエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等の製造方法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、前記のリポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性等の点から、粒径は20〜600nmが挙げられ、好ましくは30〜500nm、次に好ましくは40〜400nmであり、更に好ましくは、50〜300nmであり、最も好ましくは70〜230nmである。尚、本明細書においてリポソームの粒径は、重量平均粒子径で表わす。
なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び/又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存或いは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖或いは多価アルコールを添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコール等が挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
前記多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール等が挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量400〜10,000のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
リポソームの内水相及び/又は外水相に含ませる、糖類或いは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば1〜20重量%が挙げられ、好ましくは2〜10重量%が挙げられる。
本発明の複合体を製造する場合、不活化したウイルス粒子及び抗原を結合させる前のリポソームを作製した後、不活化したウイルス粒子及び抗原をリポソームの表面に結合させることにより簡便に本発明の複合体を得ることができる。
例えば、リン脂質、リポソームの安定化剤及び膜表面に不活化したウイルス粒子及び抗原を結合するための反応性リン脂質を含有したリポソームの懸濁液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを2〜10重量%程度加えて溶解する。この糖添加製剤を10mlガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、-40℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。
ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定の不活化したウイルス粒子及び抗原を加えて後の工程を実施することにより、本発明の複合体を簡便に迅速に得ることができる。不活化したウイルス粒子又は抗原とリポソームとの相互作用が強く不安定性が強い場合等は、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際に不活化したウイルス粒子及び抗原を結合して用いると非常に簡便である。
本発明の複合体に含まれるリポソームを構成するリン脂質膜は、不活化したウイルス粒子が結合したリン脂質及び抗原が結合したリン脂質を有し得る。不活化したウイルス粒子が結合したリン脂質及び抗原が結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これに不活化したウイルス粒子、抗原及び2価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、不活化したウイルス粒子又は抗原の官能基とを、2価反応性化合物を介して連結する方法。ここで用いることができる2価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することができる。かかる2価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これに不活化したウイルス粒子及び抗原を添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、不活化したウイルス粒子又は抗原の官能基を連結して結合させる方法。
前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。
以上の2つの方法いずれとも、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる反応性リン脂質にウイルス粒子又は抗原を結合することができ、リポソームにウイルス粒子及び抗原を結合したリン脂質が形成される。
前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームと不活化したウイルス粒子との間、並びにリポソームと抗原との間を2価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームと不活化したウイルス粒子又は抗原とを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、不活化したウイルス粒子又は抗原を該リポソームの懸濁液に添加し、次に、2価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と不活化したウイルス粒子又は抗原中のアミノ基とをシッフ塩基を介して結合する方法を挙げることができる。
この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ−１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ−２）前記リポソーム懸濁液に、不活化したウイルス粒子及び抗原を添加する。
（Ａ−３）次に、2価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームと不活化したウイルス粒子との間、並びにリポソームと抗原との間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ−４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ−５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により、リポソームに未結合の不活化したウイルス粒子、抗原、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、本発明の複合体の懸濁液を得る。
前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合等を形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質を、リポソームを構成するリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等が挙げられる。
リポソームを構成するリン脂質膜に導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ−１）不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ−２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、リポソームの安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソームを作成する。
（Ｂ−３）前記リポソーム懸濁液に、不活化したウイルス粒子及び抗原を加え、不活化したウイルス粒子及び抗原中のアミノ基と、リポソーム表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ−４）未反応の不活化したウイルス粒子、抗原、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去して、不活化したウイルス粒子結合リン脂質及び抗原結合リン脂質を含有するリポソームの懸濁液を得る。
リポソームと不活化したウイルス粒子及び抗原とを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることができる。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることができる。
本発明の複合体には、抗原特異的なCTL活性化を増強する量の不活化したウイルス粒子が含まれる。「抗原特異的なCTL活性化を増強する量」とは、不活化したウイルス粒子を含有しないことを除き、本発明の複合体と同一の構成を有する抗原-リポソーム複合体（抗原結合リポソーム）と比較して、当該抗原に特異的なCTL活性化効果を有意に増強する量を意味する。抗原特異的なCTL活性化効果は、例えばJ Exp Med 198, 889-901（2003）に記載された方法により評価することが出来る。「抗原特異的なCTL活性化を増強する量」は当業者であれば、ウイルスの種類や、本発明の複合体に含まれる抗原の量等に応じて、適宜設定することが出来る。
本発明の複合体の調製において、リポソームに結合させる不活化ウイルス粒子の量は本発明の複合体中、0.01重量%〜5重量%、好ましくは0.03重量%〜1重量%である。
本発明の複合体には、抗原特異的にCTLを活性化する量の抗原が含まれる。「抗原特異的にCTLを活性化する量」とは、抗原を含有しないことを除き、本発明の複合体と同一の構成を有する不活化したウイルス粒子−リポソーム複合体と比較して、当該抗原に特異的なCTLを有意に活性化する量を意味する。抗原特異的なCTL活性化効果は、例えばJ Exp Med 198, 889-901（2003）に記載された方法により評価することが出来る。「抗原特異的にCTLを活性化する量」は当業者であれば、抗原の種類や、本発明の複合体に含まれる不活化したウイルス粒子の量等に応じて、適宜設定することが出来る。
本発明の複合体の調製において、リポソームに結合させる抗原の量は本発明の複合体中、0.01重量%〜10重量%、好ましくは0.4重量%〜6重量%である。
また本発明の複合体に含まれる不活化したウイルス粒子と抗原の量比（重量比）は、1：3〜1：50、好ましくは1：5〜1：10である。
本発明の複合体を用いれば、当該複合体に含まれる抗原に特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を強力に活性化させることが可能となる。細胞傷害性Tリンパ球は、細胞性免疫における主要なエフェクター細胞であり、抗原特異的に細胞内感染性の病原体（ウイルス、マラリア原虫等）により感染した細胞や腫瘍細胞を殺傷することにより、これらの細胞を除去することが知られている。細胞傷害性Tリンパ球は、通常、CD8＋の表現型を有するTリンパ球である。従って、抗原として、所望の病原体や腫瘍細胞に由来する抗原を採用して、本発明の複合体を調製し、これを当該病原体や腫瘍細胞に起因する疾患に罹患している哺乳動物（例えばヒト）、又は当該疾患に罹患する可能性のある哺乳動物（例えばヒト）に投与することにより、当該疾患を予防又は治療することが出来る。例えば、本発明の複合体を、ポリオ、インフルエンザ、日本脳炎、麻疹、風疹、おたふくかぜ、狂犬病、黄熱病、水痘、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、腎症候性出血熱、テング出血熱、ロタウイルス感染症、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンバーウイルス、レプトスピラー、感染性気管支炎ウイルス、伝染性白血病ウイルス、エイズ、SARS、高病原性鳥インフルエンザウイルス、小児下痢病ウイルス等のウイルス感染症；結核、百日せき、ジフテリア、破傷風、コレラ等の細菌感染症；マイコプラズマ等の細胞内感染性バクテリアによる感染症；マラリア原虫、住血吸虫等の細胞内寄生性の原虫による感染症；癌（肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、膵・胆嚢癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、絨毛癌、前立腺癌、胃癌、等）等の患者や、上記疾患に罹患する可能性のあるヒトに投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を抗原特異的に活性化させ、上記疾患を予防・治療することが出来る。即ち、本発明の複合体は、上記感染症、癌等の疾患の予防・治療剤として有用である。
本発明の複合体をCTL活性化剤や、上記疾患の予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明の複合体は低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）、魚類（サケ、マス、ブリ、カンパチ、ハマチ、タイ、ヒラメ、コイ等）等に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明の複合体の投与対象である動物は、通常、ヒトを含む哺乳動物及び鳥類である。本発明の複合体は、通常、非経口的に投与される。
本発明の剤は、その有効成分である本発明の複合体自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記本発明の複合体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水系溶媒のpHは5〜10が挙げられ、好ましくは6〜8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
また、本発明の複合体の懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明の複合体の粉末製剤を調製することもできる。本発明の複合体を粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
医薬組成物中の有効成分（本発明の複合体）の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1〜100重量%、好ましくは約1〜99重量%、さらに好ましくは約10〜90重量%程度である。
本発明の複合体の投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、例えば、皮下投与或いは経鼻投与により生体内のCTLを活性化する場合には、通常成人1人（体重60kg）当たり、一回当たり1μg〜1000μgの範囲、好ましくは20μg〜100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［参考例１］
抗原結合リポソームの調製
オボアルブミン（ovalbumin）由来のペプチド、OVA257-264（配列番号１）と結合したリポソームを、J Immunol 177, 2324-2330（2006）に記載の方法と同様に、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）を用いて調製した。具体的には、10mlの0.136mMのジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）及び24mlのトリエチルアミン（TEA）の混合物を、0.681mM DSSを含む26.6mlの無水クロロホルム溶液中に滴下して加え、40℃で5時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、酢酸エチル及びテトラヒドロフランの2:1混合物18mlを加えて残渣を溶解した。この溶液に36mlの100mMリン酸ナトリウム（pH 5.5）及び90mlの飽和NaCl水溶液を加えた。この混合物を1分間震盪して分離させた。不要な物質を除去するために同一の緩衝液で上層を洗浄した。溶媒を蒸発させた後、3mlのアセトンを加えて残渣を溶解した。次いで、100mlの氷冷アセトンを滴下して加え、氷上に30分間保持して沈殿させた。結晶を回収して5mlのクロロホルム中に溶解した。蒸発後、34.4mgのDOPE-DSSを得、次いで0.18mMのジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、0.03mMのDOPE-DSS、0.21mMのコレステロール及び0.06mMのジオレオイルホスファチジルグリセロールを10mlのクロロホルム／メタノール中に溶解した。減圧下で溶媒を蒸発させ、5.8mlのリン酸緩衝液（pH 7.2）を加えて4.8%の脂質懸濁液を作成した。ベシクルの分散液を0.2μmのポリカーボネート膜を通して押し出し、リポソームサイズを調整した。このようにして得られた脂質合計45mg/mlであるDSSを導入したリポソームの懸濁液2ml及び10mg/mlのペプチド溶液0.5mlを混合して4℃で3日間撹拌した。CL-4Bカラムクロマトグラフィーを用いてリポソームとカップリングしたペプチドとしていないペプチドを分離した。その結果、脂質合計10mg/mlであるペプチド結合リポソームのPBS溶液9mlが生じ、それを濾過滅菌して使用時まで4℃で保持した。
［参考例２］
ウイルス粒子結合リポソームの調製
インフルエンザウイルスH3N2(A/Uruguay)全粒子を常法により単離・精製し、生物学的製剤基準に則してホルマリンにより不活化した。具体的には、精製ウイルス浮遊液をタンパク質濃度が1000μg/mlとなるようにPBSで希釈した。その後、0.04 vol%ホルマリン含有PBSを等量加え、不活化時のタンパク質濃度が500μg/ml、ホルマリン濃度が0.02 vol%になるように調製した。攪拌後、別の容器に移し替え、4℃冷房下にて不活化を行った。１週間毎にサンプリングを行い、2週連続で、ウイルス陰性となった段階で、ウイルス粒子を回収した。不活化試験の感度を上げるため、リン酸プレドニゾロンナトリウムを卵1個あたり20μgとなるように、検体接種前の発育鶏卵に投与した。不活化期間は8週間であった。
不活化全粒子を再蒸留水（DDW）中に溶解してタンパク質量で847μg／mlの濃度にした。10mg／ml OVA257-264の代わりに当該ウイルス全粒子溶液1mlを用い、参考例１と同様にしてウイルス粒子結合リポソームを調製した。その結果、脂質合計10mg/mlであるウイルス粒子結合リポソームのPBS溶液が生じ、それを濾過滅菌して使用時まで4℃で保持した。
［実施例１］
不活化したウイルス粒子及び抗原結合リポソームの調製
参考例２で調製した不活化ウイルス全粒子溶液1ml及び参考例１のOVA257-264ペプチド溶液0.5mlを用い、参考例１と同様にしてウイルス粒子及び抗原結合リポソームを調製した。その結果、脂質合計10mg/mlであるウイルス粒子及び抗原結合リポソームのPBS溶液が生じ、それを濾過滅菌して使用時まで4℃で保持した。
［実施例２］
CTL活性の検出
参考例１及び２並びに実施例１において調製した各標品についてのCTL誘導活性の検出は、CBF1マウスを用い、J Exp Med 198, 889-901（2003）に記載された方法で行った。（１）参考例２で調製したウイルス全粒子と結合したリポソーム50μl、（２）参考例１で調製したOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソーム50μl、（３）実施例１で調製したウイルス全粒子及びOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソーム100μl、（４）参考例２で調製したウイルス全粒子と結合したリポソーム50μlと参考例１で調製したOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソーム50μlの混合液100μl、のfp投与により各マウスをそれぞれ1回免疫した。免疫から2週間後、OVA257-264（配列番号１）をパルスし、蛍光色素（CFDA-SE）で標識した標的細胞（CBF1マウス脾細胞1×107個/匹）を対照とともに静脈内投与し、12時間後、脾臓細胞を調製して、その中の標的細胞の特異的溶解をフローサイトメーターにより解析した。
脾臓接着細胞（SAC）、CD4+及びCD8+Tリンパ球の調製
脾臓細胞懸濁液を10%FCSを含有するRPMI-1640を用いて調製した。5mlの10%FCSを含有する培地中の細胞（5×107個）を50mmプラスチック組織培養ディッシュ（No.#3002; BectonDickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）中に播種し、加湿5%CO2雰囲気下、37℃にて2時間インキュベートした。培養後、非接着細胞を、暖かい培地中での穏やかな洗浄（washing）により除去し、次に接着細胞をセルスクレーパーにより回収した。各ペプチド−リポソームで免疫されたマウスの脾臓細胞（SC）からのCD4+及びCD8+Tリンパ球精製は、磁気セルソーターシステムMACSにより、製造者のプロトコールに従って、抗CD4及び抗CD8抗体被覆マイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて行った。Tリンパ球は、10%FCSを含むRPMI-1640中に、2×106mlの細胞密度で懸濁された。
インビボ細胞傷害性Tリンパ球アッセイ（CTL活性の測定）
上記マウスの脾細胞を0.25又は2.5μM CFDA-SE（Molecular probes, Eugene, OR, USA）により室温で15分間標識し、2回洗浄した。次に、CFDA-SEが明るい細胞を、10μM各ペプチドによりパルスした。CFDA-SEが暗い細胞はパルスせず、対照として用いた。細胞を1：1の比で混合し、全部で2×107個の細胞を、2週間前に前記（１）〜（４）の標品が注入されたマウスへ静注した。8時間後にそれぞれのマウスから回収された脾細胞をフローサイトメトリーにより解析した。OVA257-264（配列番号１）ペプチドでパルスされた画分の蛍光標識脾細胞の減少の程度をCTL活性の指標とした。OVA257-264（配列番号１）ペプチド結合リポソームにより免疫されたマウスにCTLが誘導されていれば、OVA257-264（配列番号１）ペプチドでパルスされた画分の蛍光標識脾細胞のみが消滅することとなる。結果を図２に示す。
結果
（３）実施例１で調製したウイルス全粒子及びOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソームは、免疫を行わなかったコントロール、（１）参考例２で調製したウイルス全粒子と結合したリポソーム、（２）参考例１で調製したOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソーム、（４）参考例２で調製したウイルス全粒子と結合したリポソームと参考例１で調製したOVA257-264（配列番号１）と結合したリポソームの混合液に比べて非常に高いCTL誘導活性を示した（図２）。このことは、抗原が結合したリポソームに不活化したウイルス粒子を更に結合させることにより、抗原特異的なCTLの活性化が飛躍的に増強すること、及び抗原と不活化したウイルス粒子が同一リポソーム表面上に結合していることが重要であることを示す。
本発明の複合体を用いることにより、強力にCTLを活性化させることが可能となり、経済性及び汎用性も備える、効果の高いCTL活性化剤を提供することができる。本発明により、様々な感染症や癌等の疾患に対処できる、効果の高い当該CTL活性化剤を従来に比べより安価に、より大量に供給することができるようになる。

Claims (14)

  1. 不活化したウイルス粒子、抗原及びリポソームを含む複合体であって、該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し、且つ該リポソームの表面に該ウイルス粒子及び該抗原が結合している、複合体。
  2. 抗原が、該ウイルスに由来しない抗原である、請求項１記載の複合体。
  3. 抗原が、単離された抗原性ポリペプチドである、請求項１記載の複合体。
  4. ウイルスが、RNAウイルスである、請求項１記載の複合体。
  5. RNAウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項４記載の複合体。
  6. リポソームに含有されるリン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基を有するリン脂質である、請求項１記載の複合体。
  7. アシル基がオレオイル基である、請求項１記載の複合体。
  8. リポソームに含有されるリン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項１記載の複合体。
  9. リポソームの安定化剤がコレステロールである、請求項１記載の複合体。
  10. 抗原が、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項１記載の複合体。
  11. リポソームが以下の組成を有する、請求項１記載の複合体：
    （Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質 1〜99.8モル%；
    （Ｂ）リポソームの安定化剤 0.2〜75モル%。
  12. リポソームが以下の組成を有する、請求項１記載の複合体：
    (I)不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する酸性リン脂質 1〜85モル%；
    (II)不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有する中性リン脂質 0.01〜80モル%；
    (III)ウイルス粒子又は抗原が結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質 0.2〜80モル%；
    (IV)リポソームの安定化剤 0.2〜75モル%。
  13. 請求項１〜請求項１２のいずれか1項記載の複合体を含む、医薬組成物。
  14. 請求項１〜請求項１２のいずれか1項記載の複合体を含む、当該抗原に特異的な細胞傷害性Tリンパ球の活性化剤。
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