JP2013100243A - Hyaluronidase activity inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ブドウの乳酸発酵物を有効成分として含有するヒアルロニダーゼ活性阻害剤に関する。 The present invention relates to a hyaluronidase activity inhibitor containing a lactic acid fermented product of grape as an active ingredient.
ヒアルロン酸は、皮膚、関節液やじん帯などに広く分布し、保水性や柔軟性等の維持等、様々な機能を有している。 Hyaluronic acid is widely distributed in the skin, joint fluid, ligaments, etc., and has various functions such as maintenance of water retention and flexibility.
しかしながら、加齢や紫外線の照射などに伴い、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性が亢進すると、生体内におけるヒアルロン酸が減少して、組織の柔軟性や潤滑性が失われ、皮膚の老化であるしわやたるみが起きたり、関節痛などが発症する。 However, as the activity of hyaluronidase, a hyaluronic acid-degrading enzyme, increases with aging and ultraviolet irradiation, hyaluronic acid in the body decreases, and tissue flexibility and lubricity are lost. Wrinkles and sagging occur, and joint pain develops.
ヒアルロニダーゼの活性を阻害できれば、加齢等に伴う皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できることが期待でき、天然成分を利用したヒアルロニダーゼ活性阻害剤が近年種々検討されている。 If the activity of hyaluronidase can be inhibited, it can be expected that diseases such as aging of the skin and joint pain associated with aging and the like can be suppressed, and various hyaluronidase activity inhibitors using natural components have been recently studied.
特許文献１には、ブドウ種子及び／又はブドウ搾汁粕の抽出物を有効成分として含有してなるヒアルロニダーゼ活性阻害剤が開示されている。 Patent Document 1 discloses a hyaluronidase activity inhibitor containing a grape seed and / or grape juice extract as an active ingredient.
しかしながら、上記特許文献１のヒアルロニダーゼ活性阻害剤では、その効果は十分ではなかった。 However, the hyaluronidase activity inhibitor described in Patent Document 1 has not been sufficiently effective.
したがって、本発明の目的は、日常的に手軽かつ安全に摂取でき、ヒアルロニダーゼ活性阻害に優れたヒアルロニダーゼ活性阻害剤を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a hyaluronidase activity inhibitor that can be taken easily and safely on a daily basis and is excellent in inhibiting hyaluronidase activity.
本発明者は、種々の検討の結果、ブドウの乳酸発酵物を経口摂取することで、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できることを見出し、上記目的を達成するに至った。 As a result of various studies, the inventor has found that hyaluronidase activity can be effectively inhibited by orally ingesting a lactic acid fermented product of grapes, and has achieved the above object.
すなわち、本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの乳酸発酵物及び／又はその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。 That is, the hyaluronidase activity inhibitor of the present invention is characterized by containing a grape lactic acid fermentation product and / or an extract thereof as an active ingredient.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、天然成分を利用したものであり、安全性が高く、日常的に手軽かつ安全に摂取できる。また、これを経口摂取することにより、ブドウやその抽出物をそのまま経口摂取した場合よりもヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できる。この理由は、詳細は明らかではないが、ブドウに含まれるポリフェノール類が、乳酸発酵により増加すると共に、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合する等の要因により体内への吸収性が向上してポリフェノール類による生理活性効果が高まり、更には、ポリフェノール類と乳酸菌とが相乗的に作用しているのではないかと考えられる。 The hyaluronidase activity inhibitor of the present invention uses natural ingredients, is highly safe, and can be taken easily and safely on a daily basis. Moreover, by ingesting this, hyaluronidase activity can be more effectively inhibited than when ingesting grapes and their extracts as they are. The reason for this is not clear in detail, but polyphenols contained in grapes are increased by lactic acid fermentation, and the glycosides of polyphenols are cleaved and organic acids bind to the body. It is considered that the bioactivity by polyphenols is enhanced and the polyphenols and lactic acid bacteria are acting synergistically.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の前記乳酸発酵物は、ブドウを、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含む乳酸菌で発酵して得られたものであることが好ましく、ラクトバチルス・プランタルム及びラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含む乳酸菌で発酵して得られたものであることがより好ましい。ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスで、ブドウを発酵することにより、ブドウに含まれるポリフェノール類の体内への吸収性が高まり、更には、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとの相乗作用により、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できる。そして、ブドウを、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとで混合発酵することで、ヒアルロニダーゼ活性をより効果的に阻害できる。 The lactic acid fermented product of the hyaluronidase activity inhibitor of the present invention is preferably obtained by fermenting grapes with lactic acid bacteria containing at least Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis, and Lactobacillus plantarum. And lactic acid bacteria containing at least Lactobacillus brevis. By fermenting grapes with Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis, the absorbability of polyphenols contained in the grape into the body is increased, and furthermore, with Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis, As a result, the hyaluronidase activity can be effectively inhibited. And hyaluronidase activity can be inhibited more effectively by carrying out mixed fermentation of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、前記抽出物が、水抽出物及び／又はアルコール抽出物であることが好ましい。 In the hyaluronidase activity inhibitor of the present invention, the extract is preferably a water extract and / or an alcohol extract.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの種子及び／又は果皮を原料とすることが好ましい。ブドウの種子や果皮には、アントシアニンやプロアントシアニジンなどが多量に含まれているので、より優れた効果が得られ、更には、安価な原料素材なので、製造コストを抑えることができる。また、ブドウの種子や果皮は、渋みが強く、飲食し難いものであるが、乳酸発酵することにより、渋みなどが改善されて、風味が向上し、飲食し易くなる。 The hyaluronidase activity inhibitor of the present invention is preferably made from grape seeds and / or pericarp. Grape seeds and pericarp contain a large amount of anthocyanins, proanthocyanidins, and the like, so that a more excellent effect can be obtained, and furthermore, since the raw material is inexpensive, manufacturing costs can be reduced. Grape seeds and pericarp are strongly astringent and difficult to eat and drink, but by lactic acid fermentation, astringency and the like are improved, the flavor is improved, and it is easy to eat and drink.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、天然素材由来であることから、安全性が高く、日常的に手軽かつ安全に摂取できる。また、これを経口摂取することにより、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害でき、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少を抑制して、皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。 Since the hyaluronidase activity inhibitor of the present invention is derived from a natural material, it is highly safe and can be taken easily and safely on a daily basis. Moreover, by orally ingesting this, hyaluronidase activity can be effectively inhibited, and the reduction of hyaluronic acid in the living body accompanying aging and the like can be suppressed, and diseases such as skin aging and joint pain can be suppressed.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの乳酸発酵物及び／又はその抽出物を有効成分として含有してなるものである。 The hyaluronidase activity inhibitor of the present invention comprises a lactic acid fermentation product of grape and / or an extract thereof as an active ingredient.
本発明において、原料となるブドウとしては、特に限定はなく、白系ブドウ、赤系ブドウ等のいずれでもよい。白系ブドウとしては、シャルドネ種、リースリング種、マスカット種などが挙げられる。赤系ブドウとしては、甲州種、巨峰種、ピオーネ種、カベルネ・フラン種、カベルネ・ソービニヨン種、メルロ種、ピノ・ノアール種、ピノ・ムニエ種、マスカット・ベリーＡ種、シラー種、ガメイ種、グルナッシュ種、ムールヴェードル種、サンソー種、グロロー種などが挙げられる。なかでも、赤系ブドウの果皮には、アントシアニンやフラボノイドなどが比較的多量に含まれているので、赤系ブドウが好ましく用いられる。原料ブドウの使用部位は、果皮、果肉、果汁、種子のいずれでも良いが、ポリフェノール類の含有量が高く、安価な原料素材であるという理由から、種子、果皮を用いることが好ましい。 In the present invention, the grape as a raw material is not particularly limited, and may be white grape, red grape or the like. Examples of white grapes include Chardonnay, Riesling, and Muscat. As red grapes, Koshu, Kyoho, Pione, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinot Noir, Pinot Meunier, Muscat Berry A, Schiller, Gamay, Examples include Grenache, Mourvedre, Sunsaw and Gloro. Among them, red grapes are preferably used because the skin of red grapes contains a relatively large amount of anthocyanins and flavonoids. The raw grapes may be used in any of the skin, pulp, fruit juice, and seeds. However, it is preferable to use seeds and skins because of the high content of polyphenols and inexpensive raw materials.
本発明において、原料ブドウの乳酸発酵に用いる乳酸菌としては、食品として利用可能なものであればいずれも好ましく用いることができる。例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・マラドラートス、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナール、ロイコノストック・クレモリス、ロイコノストック・シトロボラム、ロイコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・セルビシェ、ペディオコッカス・ハロフィルス、ストレプトコッカス・アセトイニカス、ストレプトコッカス・エビウム、ストレプトコッカス・クレモリス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・サングィウス、ストレプトコッカス・ソイエ、ストレプトコッカス・デュランス、ストレプトコッカス・パラシトロボルス、ストレプトコッカス・ラクチス等の乳酸球菌、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティクス等の乳酸桿菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等のビフィズス菌等が挙げられる。なかでも、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビスが好ましく、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとを併用することがより好ましい。ブドウを、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとを含む乳酸菌で混合発酵することにより、ブドウに含まれるポリフェノール類が増加し、更には、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合してこれらの体内への吸収性が高まり、ヒアルロニダーゼの活性阻害が向上する。また、渋み、苦味、青臭さが低減され、風味が向上する。更にまた、ポリフェノール類と、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとが相乗的に作用して、ヒアルロニダーゼ活性阻害が相乗的に向上し、更にはこれらの乳酸菌が持つ様々な生理活性効果が得られる。その結果、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少が抑制され、加齢等に伴う皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。 In the present invention, any lactic acid bacteria used for lactic acid fermentation of raw grapes can be preferably used as long as they can be used as food. For example, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus abium, Enterococcus dulans, Enterococcus maladolats, Enterococcus caselliflavus, Enterococcus galinar, Leuconostok cremoris, Leuconostoc citrope Coccus cerevisiae, pediococcus halophyllus, streptococcus acetinicus, streptococcus ebium, streptococcus cremoris, streptococcus thermophilus, streptococcus sangius, streptococcus soyet, streptococcus rotoculicus Lactococcus such as Lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivaius, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helvetics, Lactobacillus, Bifidobacterium bifidum, Bibi Examples include bifidobacteria such as Fidobacterium longum and Bifidobacterium breve. Among these, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis are preferable, and it is more preferable to use Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis in combination. Grape is mixed and fermented with lactic acid bacteria containing Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis to increase the amount of polyphenols contained in the grape, and further, the glycosides of polyphenols are cleaved, organic The acid binds to increase the absorbability into the body and improves the inhibition of hyaluronidase activity. In addition, astringency, bitterness and blue odor are reduced, and flavor is improved. Furthermore, polyphenols and Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis act synergistically to improve synergistic inhibition of hyaluronidase activity, and furthermore, various physiological activity effects possessed by these lactic acid bacteria. can get. As a result, a decrease in hyaluronic acid in the living body accompanying aging and the like is suppressed, and diseases such as skin aging and joint pain accompanying aging and the like can be suppressed.
ブドウの乳酸発酵物の抽出に用いる溶媒としては、特に限定は無い。水、メタノールやエタノール等のアルコール等が挙げられる。好ましくは、安全性や抽出効率が高いという理由から、エタノールが適している。 There is no limitation in particular as a solvent used for extraction of the lactic acid fermented product of grape. Water, alcohol, such as methanol and ethanol, etc. are mentioned. Preferably, ethanol is suitable because of its high safety and high extraction efficiency.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、例えば以下のようにして製造することができる。 The hyaluronidase activity inhibitor of the present invention can be produced, for example, as follows.
まず、原料ブドウを粉砕し、ブドウ粉砕物を得る。好ましくは、粒径が１００μｍ以下となるまで粉砕する。ブドウ粉砕物の粒径が１００μｍ以下であれば、ザラツキ感が無くなり、食感の良いものとなり、更には、乳酸菌による発酵効率も向上する。原料ブドウとしては、ブドウの種子及び果皮を含むものが好ましく、それによって、ポリフェノール成分に富む乳酸発酵物が得られる。なお、ブドウの種子、果皮を原料ブドウとして用いる場合、種子や果皮を含むブドウの果実そのものを用いてもよく、ブドウの果実から果肉や果汁を回収して残った種子や果皮を含む残渣を用いてもよい。 First, raw grapes are pulverized to obtain a pulverized grape product. Preferably, it grind | pulverizes until a particle size will be 100 micrometers or less. When the grain size of the pulverized grape is 100 μm or less, the graininess is lost, the texture is improved, and the fermentation efficiency by lactic acid bacteria is improved. As a raw material grape, what contains the seed and fruit peel of grape is preferable, and the lactic acid fermented product rich in a polyphenol component is obtained by it. In addition, when using grape seeds and pericarp as raw grapes, the fruits of the grapes including the seeds and pericarps may be used, or the residue containing the seeds and pericarps remaining after recovering the fruit and juice from the grape fruits is used. May be.
原料ブドウの粉砕方法は、湿式粉砕が好ましい。湿式粉砕は、例えば、磨砕機、カッター等を用いて行うことができる。 The method for pulverizing the raw grapes is preferably wet pulverization. The wet pulverization can be performed using, for example, a grinder, a cutter or the like.
次に、得られたブドウ粉砕物に適当量の水を加え、加熱殺菌して培地を調製する。 Next, an appropriate amount of water is added to the obtained grape pulverized product, and heat-sterilized to prepare a medium.
培地中のブドウ粉砕物の濃度は、１０〜４０質量％が好ましく、２５〜３５質量％がより好ましい。ブドウ粉砕物の濃度が１０質量％未満であると、乾燥コストがかさんだり、嵩比重が小さくなり製剤化に不都合が生じる。また、ブドウ粉砕物の濃度が４０質量％を超えると、粘度が上昇して攪拌し難くなり、乳酸発酵が不均一に行われる傾向にあり、更には、乳酸菌の増殖に時間がかかって生産性が低下する。 10-40 mass% is preferable and, as for the density | concentration of the grape ground material in a culture medium, 25-35 mass% is more preferable. When the concentration of the pulverized grape is less than 10% by mass, the drying cost is increased, and the bulk specific gravity is reduced, resulting in inconvenience in preparation. Further, when the concentration of the pulverized grape product exceeds 40% by mass, the viscosity increases and it becomes difficult to stir, and lactic acid fermentation tends to be performed unevenly. Decreases.
加熱殺菌は、１１０〜１２５℃で、１０〜３０分間行うことが好ましく、１１５〜１２０℃で、１０〜２０分間行うことがより好ましい。上記条件で加熱殺菌を行うことにより、ポリフェノール類を破壊することなく、雑菌などの繁殖を抑制できる。 The heat sterilization is preferably performed at 110 to 125 ° C. for 10 to 30 minutes, more preferably at 115 to 120 ° C. for 10 to 20 minutes. By performing the heat sterilization under the above conditions, it is possible to suppress the propagation of germs and the like without destroying the polyphenols.
次に、上記培地に、乳酸菌を添加して乳酸発酵を行う。乳酸菌としては、前述したように、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含むものが好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとを少なくとも含むものを用いる。 Next, lactic acid bacteria are added to the medium to perform lactic acid fermentation. As mentioned above, the lactic acid bacteria preferably include at least Lactobacillus plantarum and / or Lactobacillus brevis. More preferably, one containing at least Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis is used.
乳酸菌の添加量は特に限定されないが、培地１リットルに対して、１×１０９〜１×１０１０個となるように添加することが好ましく、ラクトバチルス・プランタルムの菌体数が１×１０９〜５×１０９個、ラクトバチルス・ブレビスの菌体数が１×１０９〜５×１０９個となるように添加することがより好ましい。 Although the addition amount of lactic acid bacteria is not particularly limited, it is preferably added to 1 × 10 9 to 1 × 10 10 cells per liter of the medium, and the number of Lactobacillus plantarum cells is 1 × 10 9. It is more preferable to add so that the number of cells of ˜5 × 10 9 and Lactobacillus brevis may be 1 × 10 9 to 5 × 10 9 .
乳酸発酵は、温度２７〜３７℃、ｐＨ３〜７、培養時間２４〜７２時間の条件で行うことが好ましく、より好ましくは、温度３０〜３３℃、ｐＨ４．５〜６、培養時間４０〜５０時間の条件で行う。 Lactic acid fermentation is preferably performed under conditions of a temperature of 27 to 37 ° C., a pH of 3 to 7, and a culture time of 24 to 72 hours, and more preferably a temperature of 30 to 33 ° C., a pH of 4.5 to 6 and a culture time of 40 to 50 hours. Perform under the conditions of
このようにして乳酸発酵して得られるブドウの乳酸発酵物は、乳酸発酵前の状態に比べてポリフェノール含量が増加し、かつ、ポリフェノール類の体内への吸収性が高められている。この理由としては、乳酸発酵により、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合したものによると考えられる。また、この乳酸発酵物には、乳酸発酵物の固形分１００ｍｇ中に、乳酸菌が１×１０８〜１×１０１０個含まれていることが好ましい。ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビスは、同発酵物の固形分１００ｍｇ中に、ラクトバチルス・プランタルムの菌体数が５×１０８〜５×１０９個、ラクトバチルス・ブレビスの菌体数が５×１０８〜５×１０９個含まれていることが好ましい。 Thus, the lactic acid fermented product of grape obtained by lactic acid fermentation has an increased polyphenol content as compared with the state before lactic acid fermentation, and the absorbability of polyphenols into the body is enhanced. The reason for this is thought to be that glycosides of polyphenols are cleaved or bound with organic acids by lactic acid fermentation. Further, the lactic acid fermentation product, in solid 100mg of lactic acid fermentation product, it is preferable that lactic acid bacteria are contained 10 10 1 × 10 8 ~1 ×. Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis have 5 × 10 8 to 5 × 10 9 cells of Lactobacillus plantarum and 100 cells of Lactobacillus brevis in a solid content of 100 mg of the same fermented product. It is preferable that 5 * 10 < 8 > -5 * 10 < 9 > pieces are contained.
そして、上記乳酸発酵物を、６０〜８０℃で、５〜１０分間加熱殺菌し、必要に応じて、ガラクトオリゴ糖、ショ糖などの糖類や、果汁などを加えることで、液状のヒアルロニダーゼ活性阻害剤が得られる。 And the said lactic-acid fermented product is heat-sterilized at 60-80 degreeC for 5 to 10 minutes, and saccharides, such as galactooligosaccharide and sucrose, fruit juice, etc. are added as needed, and a liquid hyaluronidase activity inhibitor Is obtained.
また、加熱殺菌後の上記乳酸発酵物を乾燥、粉末化することで、粉末状のヒアルロニダーゼ活性阻害剤が得られる。加熱殺菌後の乳酸発酵物の乾燥方法としては、例えば熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥などが挙げられるが、ポリフェノール類の破壊が少なく、優れた生理活性を維持し易いという理由から凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥は、例えば、発酵物を−６０〜−４０℃で１〜３時間凍結し、圧力０．１ｍｂｒ以下、時間２４〜４８時間、温度２０〜３０℃の条件で行うことが好ましい。 Moreover, a powdery hyaluronidase activity inhibitor can be obtained by drying and pulverizing the lactic acid fermented product after heat sterilization. Examples of the method for drying a fermented lactic acid product after heat sterilization include hot air drying, spray drying, drum drying, vacuum drying, etc., but freezing because it is easy to maintain excellent physiological activity with little destruction of polyphenols. Drying is preferred. The freeze-drying is preferably performed, for example, by freezing the fermented product at −60 to −40 ° C. for 1 to 3 hours and under a pressure of 0.1 mbr or less, a time of 24 to 48 hours, and a temperature of 20 to 30 ° C.
また、粉末化した乳酸発酵物を、水、メタノールやエタノール等のアルコール等の抽出媒体を用いて抽出することで、乳酸発酵物の抽出物が得られる。抽出方法としては、粉末化した乳酸発酵物を抽出媒体に懸濁させ、２０〜４０℃で、２〜４８時間振とうする方法等が挙げられる。 Moreover, the extract of a lactic acid fermented product is obtained by extracting the powdered lactic acid fermented product using extraction media, such as water, alcohol, such as methanol and ethanol. Examples of the extraction method include a method in which a powdered lactic acid fermentation product is suspended in an extraction medium and shaken at 20 to 40 ° C. for 2 to 48 hours.
このようにして得られる抽出物を、そのままあるいは固形物を濾過除去したものをヒアルロニダーゼ活性阻害剤として用いてもよく、更に、濃縮あるいは乾燥粉末化したものをヒアルロニダーゼ活性阻害剤として用いてもよい。 The extract thus obtained may be used as it is or after removing solids by filtration as a hyaluronidase activity inhibitor, and further, concentrated or dried powder may be used as a hyaluronidase activity inhibitor.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ヒアルロニダーゼ活性阻害の点において優れた効果を示し、これを経口摂取することにより、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少を抑制でき、皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。そして、医薬品、食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。 The hyaluronidase activity inhibitor of the present invention exhibits an excellent effect in terms of inhibiting hyaluronidase activity, and by taking it orally, it can suppress a decrease in hyaluronic acid in the living body due to aging, etc. Diseases such as pain can be suppressed. And it is used in various fields, such as a pharmaceutical and a foodstuff, and can be used as a pharmaceutical active ingredient, a food raw material, etc.
例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。 For example, in the case of a pharmaceutical product, it can be formulated with a pharmaceutically acceptable substrate or carrier and provided as a pharmaceutical composition. Examples of the form of the pharmaceutical composition include dosage forms such as pills, powders, tablets, granules, capsules, syrups, liquids, jellies, and lozenges.
また、本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。 Moreover, when adding and ingesting the hyaluronidase activity inhibitor of this invention to food-drinks, it can mix | blend and use for food for specific health, a dietary supplement, a functional food, etc. other than general food.
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の有効摂取量は、成人一日当り、固形分換算で１００ｍｇ〜３ｇが好ましい。 The effective intake of the hyaluronidase activity inhibitor of the present invention is preferably 100 mg to 3 g in terms of solid content per adult day.
以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
［測定方法］
・総ポリフェノールの測定方法
試料１００ｍｇを８０％メタノール１０ｍｌに溶解させ、振とうしながら３時間、室温で抽出した。抽出液を１／５濃度に希釈した溶液について、没食子酸を標準物質としたＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法で測定した。
[Measuring method]
-Method for measuring total polyphenol 100 mg of a sample was dissolved in 10 ml of 80% methanol and extracted at room temperature for 3 hours while shaking. The solution obtained by diluting the extract to 1/5 concentration was measured by the Folin-Ciocalteu method using gallic acid as a standard substance.
・ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定方法
試料１００ｍｇを８０％メタノール１０ｍｌに溶解させ、振とうしながら３時間、室温で抽出した。抽出液を５０〜２００倍に希釈した溶液について、ＤＰＰＨラジカル消去活性を須田らの方法に従い測定した。
すなわち、測定溶液２ｍｌに２００ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ、蒸留水２００μｌ、５０％メタノール８００μｌを順次加えた溶液に、２００μＭ ＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）メタノール溶液を１ｍｌ添加し、室温で２０分放置した後５２０ｎｍの吸光度を測定した。
標準物質としてＴｒｏｌｏｘを用い、検量線を作成してＴｒｏｌｏｘ相当量で表した。
-Method for measuring DPPH radical scavenging activity 100 mg of a sample was dissolved in 10 ml of 80% methanol and extracted at room temperature for 3 hours while shaking. About the solution which diluted the extract 50 to 200 times, DPPH radical scavenging activity was measured according to the method of Suda et al.
That is, 200 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydryl) was added to a solution obtained by sequentially adding 1 ml of 200 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) buffer (pH 6.0), 200 μl of distilled water, and 800 μl of 50% methanol to 2 ml of the measurement solution. ) 1 ml of methanol solution was added, and after standing at room temperature for 20 minutes, the absorbance at 520 nm was measured.
Using Trolox as a standard substance, a calibration curve was prepared and expressed in terms of Trolox equivalent.
・ヒアルロニダーゼ活性阻害率の測定方法
試料１００μｌにヒアルロニダーゼ（牛睾丸由来８５０Ｕ／ｍｇ、シグマ社）４０Ｕを、酢酸緩衝液５０μｌに溶解して添加し、３７℃、２０分間反応させた。次に、酢酸緩衝液に０．０１％濃度に溶解したＣｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（ナカライテスク社）溶液１００μｌを添加し、３７℃、２０分間加温した。次に、ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業社）を、酢酸緩衝液に０．０８％濃度に溶解し、その２５０μｌを添加して、３７℃、４０分間反応させた。反応後、０．４Ｎ−ＮａＯＨ溶液１００μｌを添加して、反応を停止させた。次に、９．９％濃度に溶解したホウ酸溶液（１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨ９．１に調整）１００μｌを氷冷下で添加した後、沸騰水中で３分間加熱した。次に、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの１０ｇ、１０Ｎ−ＨＣｌの１２．５ｍｌ、酢酸の８７．５ｍｌを混合し、使用直前に酢酸で１０倍に希釈したもの）３ｍｌを添加し、３７℃、２０分間加温した後、５８５ｎｍの吸光度を測定した。
ヒアルロニダーゼを添加しないものをブランクとし、試料を添加しないものをコントロールとし、下式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率を求めた。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）
＝〔（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）〕／（Ａ−Ｂ）×１００
Ａ；コントロールの吸光度
Ｂ；コントロールのブランクの吸光度
Ｃ；試料の吸光度
Ｄ；試料のブランクの吸光度
-Measurement method of hyaluronidase activity inhibition rate 40 U of hyaluronidase (850 U / mg derived from bull testicles, Sigma) was dissolved in 50 µl of acetic acid buffer and added to 100 µl of sample and reacted at 37 ° C for 20 minutes. Next, 100 μl of Compound 48/80 (Nacalai Tesque) solution dissolved in 0.01% concentration in acetate buffer was added and heated at 37 ° C. for 20 minutes. Next, sodium hyaluronate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in an acetic acid buffer solution at a concentration of 0.08%, 250 μl thereof was added and reacted at 37 ° C. for 40 minutes. After the reaction, 100 μl of 0.4N NaOH solution was added to stop the reaction. Next, 100 μl of boric acid solution dissolved in 9.9% concentration (adjusted to pH 9.1 with 1N-NaOH solution) was added under ice cooling, and then heated in boiling water for 3 minutes. Next, 3 ml of p-dimethylaminobenzaldehyde reagent (10 g of p-dimethylaminobenzaldehyde, 12.5 ml of 10N-HCl, 87.5 ml of acetic acid was mixed and diluted 10-fold with acetic acid immediately before use) was added. Then, after heating at 37 ° C. for 20 minutes, the absorbance at 585 nm was measured.
A sample without addition of hyaluronidase was used as a blank, a sample without addition of a sample was used as a control, and the inhibition rate of hyaluronidase activity was determined by the following equation.
Hyaluronidase activity inhibition rate (%)
= [(A−B) − (C−D)] / (A−B) × 100
A: Absorbance of control B: Absorbance of control blank C: Absorbance of sample D: Absorbance of sample blank
（実施例１）
甲州種のブドウ果皮及び種子を１ｋｇに、１Ｌの水を加え、微粒磨砕機を用いて湿式粉砕し、粒径１００μｍ以下のブドウ粉砕物を得た。このブドウ粉砕物の総ポリフェノール含有量は、没食子酸相当量で１０ｍｇであり、ＤＰＰＨラジカル消去活性は、Ｔｒｏｌｏｘ相当量で６７μｍｏｌであった。
上記ブドウ粉砕物２ｋｇに、水１Ｌを加え、ｐＨを６とし、１２０℃、２０分間加熱殺菌して培地を調製した。
上記培地に、ラクトバチルス・プランタルムを５ｍｌ（菌体数５×１０９個）、ラクトバチルス・ブレビスを５ｍｌ（菌体数５×１０９個）を加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した。
発酵終了後、７０℃で１０分間加熱殺菌し、−４０℃に凍結させた後、圧力０．１ｍｂｒ以下、２４時間、３０℃の条件で凍結乾燥して、粉末状のブドウの乳酸発酵物を２５０ｇ得た。このブドウの乳酸発酵物１００ｍｇ中には、ラクトバチルス・プランタルムの死菌体が５×１０８個、ラクトバチルス・ブレビスの死菌体が５×１０８個含まれていた。また、総ポリフェノール含有量は、没食子酸相当量で２３ｍｇであり、ＤＰＰＨラジカル消去活性は、Ｔｒｏｌｏｘ相当量で２４２μｍｏｌであった。
上記粉末状のブドウの乳酸発酵物の１００ｍｇを、含水メタノール（水２０％、メタノール８０％）の１０ｍｌに懸濁させ、室温（２５℃）で４時間振とうして抽出を行った。抽出後、懸濁液を濾過処理して固形物が除去された抽出液を得た。この抽出液を、エバポレーターを使ってメタノールを除去し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で全量を１０ｍｌに調整して、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．２ｍｇ／ｍｌ濃度のもので４６％であり、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので６８％であり、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のもので８７％であった。
Example 1
1 kg of Koshu grape skin and seed was added to 1 kg of water, and wet pulverized using a fine grinder to obtain a crushed grape having a particle size of 100 μm or less. The total polyphenol content of this pulverized grape was 10 mg in terms of gallic acid, and the DPPH radical scavenging activity was 67 μmol in terms of Trolox.
1 L of water was added to 2 kg of the pulverized grape product, the pH was adjusted to 6, and the medium was prepared by heat sterilization at 120 ° C. for 20 minutes.
To the above medium, 5 ml of Lactobacillus plantarum (5 × 10 9 cells) and 5 ml of Lactobacillus brevis (5 × 10 9 cells) are added, and the culture temperature is maintained at 33 ± 1 ° C. And fermented for 48 hours.
After the fermentation is completed, the mixture is sterilized by heating at 70 ° C. for 10 minutes, frozen at −40 ° C., and then freeze-dried under the conditions of a pressure of 0.1 mbr or less for 24 hours at 30 ° C. 250 g was obtained. The grapes during lactic acid fermentation product 100mg of killed microbial cells of Lactobacillus plantarum is 5 × 10 8 cells, dead cells of Lactobacillus brevis was included 5 × 10 8 pieces. The total polyphenol content was 23 mg in terms of gallic acid, and the DPPH radical scavenging activity was 242 μmol in terms of Trolox.
100 mg of the powdered lactic acid fermentation product of grape was suspended in 10 ml of water-containing methanol (water 20%, methanol 80%) and extracted by shaking at room temperature (25 ° C.) for 4 hours. After extraction, the suspension was filtered to obtain an extract from which solids were removed. Methanol was removed from this extract using an evaporator, the total volume was adjusted to 10 ml with 0.1 M acetate buffer (pH 4.0), and a hyaluronidase activity inhibitor (methanol extract of lactic acid fermentation product of grapes) Obtained.
The hyaluronidase activity inhibition rate of this hyaluronidase activity inhibitor was 46% at the 0.2 mg / ml concentration, 68% at the 0.5 mg / ml concentration, and 87 at the 0.8 mg / ml concentration. %Met.
（実施例２）
実施例１において、培地に、ラクトバチルス・ブレビスを５ｍｌ（菌体数５×１０９個）加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した以外は、実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので６２％であった。
(Example 2)
In Example 1, 5 ml of Lactobacillus brevis (5 × 10 9 cells) was added to the medium, the culture temperature was maintained at 33 ± 1 ° C., and fermentation was performed for 48 hours. Thus, a hyaluronidase activity inhibitor (methanol extract of lactic acid fermentation product of grape) was obtained.
The hyaluronidase activity inhibition rate of this hyaluronidase activity inhibitor was 62% at a concentration of 0.5 mg / ml.
（実施例３）
実施例１において、培地に、ラクトバチルス・プランタルムを５ｍｌ（菌体数５×１０９個）加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した以外は、実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので５８％であった。
(Example 3)
In Example 1, 5 ml of Lactobacillus plantarum (5 × 10 9 cells) was added to the medium, the culture temperature was maintained at 33 ± 1 ° C., and fermentation was performed for 48 hours. Thus, a hyaluronidase activity inhibitor (methanol extract of lactic acid fermentation product of grape) was obtained.
The hyaluronidase activity inhibition rate of this hyaluronidase activity inhibitor was 58% at a concentration of 0.5 mg / ml.
（比較例１）
実施例１で用いたブドウ粉砕物２ｋｇに、水１Ｌを加え、ｐＨを６とし、１２０℃、２０分間加熱殺菌して培地を調製した。この培地を−４０℃に凍結させた後、圧力０．１ｍｂｒ以下、２４時間、３０℃の条件で凍結乾燥して凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物１００ｍｇを、含水メタノール（水２０％、メタノール８０％）の１０ｍｌに懸濁させ、室温（２５℃）で４時間振とうして抽出を行った。抽出後、懸濁液を濾過処理して固形物が除去された抽出液を得た。この抽出液を、エバポレーターを使ってメタノールを除去し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で全量を１０ｍｌに調整してヒアルロニダーゼ活性阻害剤を得た。このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．２ｍｇ／ｍｌ濃度のもので２２％であり、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので３５％、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のもので３５％であった。
(Comparative Example 1)
1 L of water was added to 2 kg of the crushed grape used in Example 1 to adjust the pH to 6, and the medium was prepared by heat sterilization at 120 ° C. for 20 minutes. This medium was frozen at −40 ° C. and then freeze-dried under the conditions of a pressure of 0.1 mbr or less and a temperature of 30 ° C. for 24 hours to obtain a freeze-dried product. 100 mg of the resulting lyophilized product was suspended in 10 ml of water-containing methanol (water 20%, methanol 80%) and extracted by shaking at room temperature (25 ° C.) for 4 hours. After extraction, the suspension was filtered to obtain an extract from which solids were removed. Methanol was removed from this extract using an evaporator, and the total amount was adjusted to 10 ml with 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) to obtain a hyaluronidase activity inhibitor. The hyaluronidase activity inhibition rate of this hyaluronidase activity inhibitor was 22% at 0.2 mg / ml, 35% at 0.5 mg / ml, and 35% at 0.8 mg / ml. there were.
実施例１〜３及び比較例１の試験結果を図１にまとめて記す。 The test results of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 are collectively shown in FIG.
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