JP2013099353A - 不斉酸化反応を有する蛋白質複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】動植物粗蛋白質を濃縮する第1の工程と、該粗蛋白質をアルギン酸カルシウムゲルに包括して空気酸化させた後、目的の蛋白質複合体を作成し抽出する第2の工程と、得られる蛋白質複合体溶液を、結晶化沈殿させる第3の工程と、沈殿した結晶化蛋白質複合体を架橋固定化する第4の工程により、蛋白質複合体を製造する。また、第5の工程により、該蛋白質複合体を凍結乾燥(FD)処理して水分を取り除き、粉砕する。好適に常温保存に富む不斉酸化触媒を作ることができる。
【選択図】図10
Description
1)該抽出・精製酵素を水不溶性の担体、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、及びポリアクリルアミドゲル等に結合させる担体結合法、2)該抽出・精製酵素を2個もしくはそれ以上の官能基を有する試薬を用いて該抽出・精製酵素間に架橋結合を形成させて固定する架橋法、3)該抽出・精製酵素を、ゲル、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる(格子型)か、半透明膜の皮膜によって被覆する(マイクロカプセル型)包括法がある。
・高純度の酵素は必要としない(部分的に精製された調製品に適用可能)
・簡単な操作と広い応用
・室温で長期間(1年以上)安定
・実質100%活性なタンパク質(高い容積測定(volumetric)と触媒生産性)
・単独酵素と比較して高い温度安定性と有機溶媒への耐性
・高い活性と選択性(単独酵素よりも高い場合もある)
・水媒体中で酵素を濾す必要はない
・迅速な至適化(HTEを使用して)は開発時間を短くする
・触媒カスケードプロセス用に1つ以上の酵素を含むコンビCLEA
本発明の蛋白質複合体は、蛋白質を少なくとも含み、且つ、FT−IRにおいて、(1085±50cm−1)の領域、および(1411±50cm−1)の領域に、それぞれ少なくとも1個のピークを有することを特徴とする。ここに、FT−IR測定は、後述するように、例えば、Thermo Fisher Scientific製フーリエ変換赤外分光分析装置Magna-750および赤外顕微鏡Nic−Planを用い、顕微ATR法(Geクリスタル)により、例えば波数分解能8cm−1、積算回数32回の条件で測定することができる。(このようなFT−IR測定の詳細に関しては、例えば、文献”Carbohydrate Polymers”66,191−197,(2005)(Enzymatically produced nano-ordered short elements containing cellulose Iβ crystalline domains)「Noriko Hayashiら;Bioconversion Laboratory, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI)」に実施例があり、吸収波長の評価に関しては、本「ACADEMIC PRESS; New York and London 1971; A Subsidiory of Harcourt Brace Jovanovich, Publishers」”INFRARED SPECTRA OF INORGANIC COMPOUNDS (3800−45cm−1)”「Richard A. Nyquist and Renald O. Kagel; Chemistry Physics Research Laboratory, The Dow Chemical Company Midland MichiGAn」を参照できる。
本発明の蛋白質複合体において、上記FT−IR測定におけるピーク強度は、以下の通りであることが好ましい。
(1)(1085±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク1」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであるか、または最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、(1/10)×I0以上のピーク強度を有することが好ましい。このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
(2)(1411±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク2」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであるか、または最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、(1/10)×I0以上のピーク強度を有することが好ましい。このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
本発明の蛋白質複合体において、上記した「ピーク1」および「ピーク2」以外のIRピークは特に制限されない。本発明の蛋白質複合体は、例えば、下記の領域にピークを有していても良い。
(1)(1085±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク1」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであり、最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、2番目に強度が大きいピークが(1411±50cm−1)にあり、このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
(2)(1411±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク2」という)は、測定されたIRスペクトル中の2番目に最も強度が大きいピークであり、2番目に強度が大きいピークの強度をI0とした際に、3番目に強度が大きいピークが(1649±50cm−1)にありこのピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
上記の場合にも、本発明の蛋白質複合体において、上記した「ピーク1」および「ピーク2」以外のIRピークは特に制限されない。本発明の蛋白質複合体は、例えば、下記の領域にピークを有していても良い。
本発明の蛋白質複合体は、蛋白質およびカルシウムを少なくとも含むことが好ましい。また、蛋白質複合体は、不斉酸化反応を触媒する活性を有することが好ましい。このような「蛋白質およびカルシウムを少なくとも含む」こと、および「不斉酸化反応を触媒する活性を有する」は、後述する方法によって好適に確認することができる。
本発明の蛋白質複合体の不斉酸化反応の好ましい態様は、例えば、後述する実施例12の条件下で、基質ラセミ−1−オクテン−3−オール(マツタケオール)を作用させた場合に得られるR−1−オクテン−3−オールの光学純度(%ee)で好適に表すことができる。本発明の蛋白質複合体は、この実施例12の条件で、85%以上の化学収率で、R−1−オクテン−3−オールを与えることが好ましい。更には、この光学純度は、95%ee以上(特に98%ee以上)であることが好ましい。
本発明の蛋白質複合体は、下記の好適な特製のうち、1以上を有することが好ましい。
(1) 上記蛋白質複合体が、更に糖を含むこと。
(2) 前記蛋白質が、架橋結晶化蛋白質であること。
(3) 前記不斉酸化反応が、基質ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に与える酸化反応であること。
(4) 前記不斉酸化により得られるケトンが、更に不斉酸化されるデラセミ化反応を与える活性を、前記蛋白質複合体が有すること。
本発明者の知見によれば、本発明において、好適な動植物由来の蛋白質複合体が提供されるのは以下の理由によるものと推定される。
上記した本発明の「推定メカニズム」のサポートに関しては、例えば、以下の文献を挙げることができる。
図12は、文献“Biochemical and Biophysical Research ComMunications”300,pp1−4(2003)(Multiple roles of cysteine in biocatalysis)「Niroshini M, Gilesら;School of Chemistry, University of Exeter」で公知のように、細胞内システイン酸化により形成された様々な酵素の機能に関してなど示されている。1)Peptidase、2)glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)、3)alcohol dehydrogenase (ADH)、4)bacterial nitrile hydratase (NHase)、5)ribonucleotide reductase (RNRase)、6)pyruvate formate lyase (PFL)、7)benzylsuccinate synthase (BSS)、8)reduction of glutathione disulfide (GSSG)、9)thioredoxin (Trx)、10)glutathion reductase (GR)、11)thioredoxin reductase (TR)、12)NADH oxidase (Nox), 13)NADH peroxidase (Npx)。
以下、本発明の製造方法を構成する各工程について説明する。
本発明の第1の工程における水溶性蛋白質の抽出においては、穀類又は豆類を砕き粒の大きい部分と殻部を取り除き、このようにして得られた穀類及び豆類粉砕粉を約20〜60℃、好ましくは約40℃で、pH約6〜8、好ましくは約pH7.0において、穀類または豆類の約7〜15重量倍の水で、30分以上抽出する。約45分で抽出するのが最も効果的であって、これ以上長く抽出しても抽出物の量は変わらない。pHの調製が必要なときは、H2SO4、HCl、H3PO4などの食品級酸、又はNaOHなどの食品級アルカリを用いて上記適性範囲を調製できる。上記水溶性蛋白質抽出液、又はこの抽出液から、デカンター、遠心分離などにより食物繊維部を分離した、タンパクカードをそのまま第2工程に移すか、必要に応じて噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥などにより粉末としてから、再溶解して第2工程に移しても良い。種子(外皮(ふすま、ぬか)、胚芽(スプラウト))に関しては、上記の穀類及び豆類粉砕粉の工程にて得ることができる。外皮(ふすま、ぬか)、胚芽(スプラウト)、葉(若葉、新芽)、茎、根、花を凍結乾燥(FD)、熱風乾燥(AD)、真空乾燥などで水分を除去して乾燥後、ボールミルなどを利用して5μm以下まで細かく粉砕する。
第2の工程において、該抽出蛋白質を包括化する方法は、例えば、該抽出蛋白質を、ゲル、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる(格子型)か、半透膜性の皮膜によって被覆する(マイクロカプセル型)包括法があるが、蛋白質複合体を作成する上では、海草より抽出するアルギン酸のカルシウムを用いた包括化法が安価で環境に優しく、かつ、包括操作が平易な点で最も好ましい。この包括化されたビーズは、蛋白質複合体を水溶液中に溶出させる為に、温水温度30℃〜45℃で、且つ、溶存酸素濃度がゼロにならないように酸素供給が必要で、且つ、ビーズが振れる回転数で振とうさせることが望ましい。
第3の工程において、蛋白質を結晶化沈殿するためには、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコール/塩化リチウム,2−メチル−2,4−ペンタジオール,塩化ナトリウム,マロン酸ナトリウム等があり、いずれの結晶化沈殿剤として本願発明において用いることができる。しかしながら、最も安価な硫酸アンモニウムを用いるのがトータルコストダウンの観点から有益である。蛋白質の結晶化は、通常濃度が10〜50mg/mLのタンパク質溶液で用いて行うことが望ましく、サンプルをセントリコンやアミコンウルトラなどで濃縮する手法ある。
第4の工程において、結晶化沈殿された蛋白質を架橋するためにはグルタルアルデヒド(以下、「GA」と略称する)、フォルムアルデヒド(以下、「FA」と略称する)等があり、いずれも架橋剤として本願発明において用いることができる。グルタルアルデヒドは、示性式OHC(CH2)3CHO として表される有機化合物で、反応は、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基との間で起こるが、α−アミノ基やSH基との間でも起こり、分子間架橋を形成することができる。ひとつのグルタルアルデヒド分子が単独で架橋形成を起こせるとは考えられていない。(参考文献;重中義信/監修『原生動物の観察と実験法』(共立出版株式会社、1998年)ISBN 4320053532)GAは2つのアルデヒド基、FAは1つアルデヒド基を持っており、架橋させることで、1)室温で長期間(1年以上)安定、2)実質100%活性なタンパク質(高い容積測定(volumetric)と触媒生産性)、3)容易な回収と再使用、4)単独酵素と比較して高い温度安定性と有機溶媒への耐性、5)単独酵素よりも高い活性と選択性になるなど、産業用酵素試薬として実用レベルで広く活用できるようになる。
第5の工程において、乾燥粉体化するためには、1)熱風乾燥(AD)、2)凍結真空乾燥(FD)、3)加圧乾燥、4)減圧乾燥、5)自然乾燥など本願発明において用いることができる。しかしながら、凍結真空乾燥(FD)は水分を完全に除去でき、引き続く粉砕の工程に有利であり、尚且つ保存性も高くなる。
以下、図面に示した各データを説明する。
サンプル10 μLを,2×サンプルバッファー(0.1 M Tris/HCl pH 6.8,3 % SDS,10 %グリセリン,10% β‐メルカプトエタノール,0.1% BPB)10 μLと混合し,100℃で5 min加熱した。これらについて,SDS−PAGE mini(4−20 %グラジエントゲル,TEFCO社)を用いて分子量マーカー(SDS−PAGEスタンダード Broad,Bio−Rad)と共に泳動(18 mA定電流,泳動バッファー:25 mM Tris/HCl,0.19 M Glycine,0.1 % SDS,pH 8.3)を行った後,CBB染色(PHastGel Blue R,Amersham Biosciences社)を行った。
A:1649cm−1付近・・・ペプチド結合(−C(=O)−N−)に特徴となるピーク。
B:1528cm−1付近・・・ペプチド結合(−C(=O)−N−)に特徴となるピーク。
C:1411cm−1付近・・・カルボキシラート(−C(=O)−O−Na)のケトン基に特徴となるピーク。
D:1122cm−1付近(1085cm−1、1032cm−1)・・・糖エーテル(−C−O−C−)特徴となるピーク。
E:1085cm−1付近・・・硫安((NH4)2SO4)に特徴のピーク。
サンプル(i)・・・振とう培養器製架橋結晶化蛋白質複合体
サンプル(ii)・・・20mM塩化Ca/50mMトリス塩酸バッファー(pH6.0)
サンプル(iii)・・・20mM塩化Ca/50mMトリス塩酸バッファー(pH8.0)
サンプル(iv)・・・エンドウ蛋白質粉末
図9cおよび図9d:2回目の実験の結果
図9eおよび図9f:3回目の実験の結果
図9gおよび図9h:4回目の実験の結果
Ca濃度(FD)・・・FD乾燥後サンプルの酸分解法による原子吸光光度計によるCa濃度(mg/g)測定結果。
×・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間に殆ど不斉酸化されない場合(生成ケトン10%以下)。
△・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間までに不斉酸化が途中で止まる場合(生成ケトン30%以下)。
○・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間で不斉酸化される場合(生成ケトン40%以上)。
本発明の蛋白質複合体は、動植物由来粗蛋白質の空気酸化形成物であって、且つ、不斉酸化反応を示すなど酵素様活性を有することを特徴とする。
本発明の不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の活性は、例えば、後述(実施例15「抽出作業の条件」内6.不斉酸化活性)に記載する方法により好適に測定可能である。
本発明において、蛋白質複合体の精製方法は特に限定されない。蛋白質複合体の収量を増やす目的から、ろ過の必要はないが、アルギン酸カルシウムゲルビーズとの分離の意味でガラスビーズなどを用いることができる。この場合、口径サイズが40−200μmで可能であるが、口径200μmであることが好ましい。
(架橋結晶化した豌豆由来の蛋白質複合体の一般的な製造方法)
先ず第1の工程として、豌豆を粉砕して殻を取り除き、pH7.0付近の蒸留水(約40℃)9重量倍にて、約45分間に溶解される豌豆蛋白質成分をNaOH水溶液を用いてpH7.0にして沈殿成分の食物繊維を除去し、水溶性蛋白部分をアルカリ条件(pH9.5付近)又は酸性条件(pH4.5付近)にして蛋白質を等電点沈殿させ、蛋白沈殿部をpH7.0の蒸留水にて再溶解して得られる豌豆蛋白水溶液(試料濃度5.0%)を噴霧乾燥処理を行い粉体の豌豆蛋白を調製する。また、3%アルギン酸ナトリウム水溶液はオートクレーブの条件、温度121℃、時間20分で、アルギン酸ナトリウムを水溶液中に溶解して調整する。
(第2の工程における豌豆(PP)、大豆(SP)、小麦(WP)蛋白質由来蛋白質複合体の基質特異性の検討)
第2の工程において、豌豆(PP)、大豆(SP)、小麦(WP)由来粗蛋白質は種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し、水溶液画分を噴霧乾燥して得られる粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の200mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られた豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、豌豆蛋白含有・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製する。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養器の温度設定40℃、振とう数55rpmにて10時間以上の振とう後、基質変換反応を行った。基質としては2−ナフチルエタノール(naphthyl/1)と、メタ、パラ位に塩素(Cl−/2a、2b)、臭素(Br−/3a、3b)、フッ素(F−/4a、4b)、メチル(Me−/5a、5b)、メトキシ(MeO−/6a、6b)、ニトロ(NO2−/7a、7b)を置換させたフェニルエタノールを用いた結果、反応時間、生成物、光学純度、化学収率を以下の表にまとめる。
(第2の工程におけるその他植物由来組織材料由来蛋白質複合体の基質特異性の検討)
第2の工程において、小麦若葉(YWL)、大麦若葉(YBL)、ヨモギの葉(AVI)、小麦ふすま(WB)、ワカメ(WS)、ニンジン(C)、カボチャ(P)といった草や雑草をも含めた種子、葉、茎、根、花、実からの不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の溶出を確認する目的で、温水60℃以上で10分間漬け置き洗浄後、必要により薄くスライスして、凍結真空乾燥(FD)後、ボールミルを用いて細かく粉砕した。これらの植物材料粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%アルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量200ml加えて均一になるまで攪拌し、得られた植物組織含有・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、植物組織含有・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製する。該ビーズに、植物組織含有粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう温度設定40℃、振とう数55rpmの条件にして、10時間以上の振とう後、基質変換反応を行った。基質としてはメタ、パラ位に臭素(Br−/1m、1p)、塩素(Cl−/2m、2p)、フッ素(F−/3m、3p)、メチル(Me−/4m、4p)、メトキシ(MeO−/5m、5p)、2−ナフチルエタノール(naphthyl/6)を置換させたフェニルエタノール類を作用させて、得られた結果については、反応時間、生成物、光学純度、化学収率を以下の表にまとめた。
(第2の工程における卵白アルブミン由来蛋白質複合体のパラ位置置換基質の基質特異性の検討)
第2の工程において、卵白から分離されたオボアルブミンから作成される蛋白質複合体の活性測定を目的として、鶏卵より卵白を分離し、硫安沈殿にてオボアルブミンを分離し、0.1〜0.5%のオボアルブミンの濃度になるように水に溶解後噴霧乾燥処理して、粉末の卵白アルブミン粉末を調整した。これらの卵白アルブミン粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%アルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量200mlを加えて均一にし、得られた卵白アルブミン・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、卵白アルブミン・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製した。該ビーズに、卵白アルブミン粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養設定40℃、振とう数55rpmにて、10時間以上振とう後、基質変換反応を行った。基質としてはパラ位に臭素(Br−/1)、塩素(Cl−/2)、メトキシ(MeO−/5)、2−ナフチルエタノール(naphthyl/6)を置換させたラセミ−フェニルエタノール類を作用させて、得られた反応時間、生成物、光学純度、化学収率の結果については以下の表7にまとめた。
(第2の工程、恒温振とう器中で10時間の空振とうする理由)
図1は第2の工程において、豌豆蛋白4gを40mlの蒸留水に溶かして、更に3%アルギン酸ナトリウム(40ml)を加えて均一化した溶液を、4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して調整された、豌豆蛋白・アルギン酸カルシウムゲルビーズに、120mlの蒸留水を加えて、恒温振とう器設定温度40℃、振とう数55rpmにて振とうさせて、空振とう開始後0時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、25時間後、35時間後、45時間後、そして55時間後に基質R−2−ナフチルエタノールを加えた時の、その豌豆蛋白質由来蛋白質複合体の不斉酸化活性に伴う基質残量%を示している。
(第2の工程、基質特異性の検討)
図2aは、図1と同一条件で振とう開始後10時間後、a)は基質特異性を調べる目的で、基質ラセミー2−ナフチルエタノール、R−2−ナフチルエタノール、2−アセトナフトンをそれぞれ50mgづつ添加したときの反応時間に伴う基質と生成物の%比率をモニターリングしたものである。その結果、空振とう10時間後に現れる活性は、S体アルコールは酸化せず、基質ラセミー2−ナフチルエタノールのR体のみを立体選択的に不斉酸化することが判った。
(第2の工程、反応箇所の検討)
図2bは第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸ナトリウムを調製後、空振とう10時間後の水溶液(120ml)、空振とう10時間後の水溶液(240ml)、空振とう10時間後ビーズ+蒸留水(DW:120ml)、新しいビーズ+空振とう10時間後の水溶液(120ml)でそれぞれ基質R−2−ナフチルエタノール(50mg、75mg、又は100mg)を加え、不斉酸化活性をモニタリングした図である。
その結果、空振とう10時間後に現れる蛋白質複合体は、ビーズ中ではなく、水溶液中に反応の場があり、好適に2−ナフチルエタノールのR体のみに作用することが判った。
(第2の工程、包括ゲル化塩化カルシウム濃度の活性に及ぼす効果)
図2cは第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸ナトリウム混液を調整後、異なる塩化カルシウム濃度(5g/L、7.5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L)中に滴下してゲル化して、同じ条件にて10時間空振とう後、基質R−2−ナフチルエタノールを加えて、その塩化カルシウム濃度に及ぼす蛋白質複合体の活性強度の差をまとめた図である。
(第2の工程、豌豆蛋白量の最適化)
図2dは第2の工程における、豌豆アルギン酸ゲルを調製時の豌豆蛋白量(2g、3g、4g、5g)の活性に及ぼす影響について調べた。この場合、塩化カルシウム濃度10g/Lで、豌豆・アルギン酸カルシウムゲルを調製し、空振とう10時間後に得られる蛋白質複合体が及ぼす、基質R−2−ナフチルエタノール(50mg)への影響を示した図である。
(第2の工程、香料であるR−1−オクテン−3−オールの合成検討)
図8は第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸カルシウムゲルに包括化し、空振とう10時間後に得られる蛋白質複合体の、基質ラセミ−1−オクテン−3−オールの分割に関わる効果を調べた図である。
(第3の工程の蛋白質複合体の抽出、好適な硫安濃度の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液を、50mLプラスチック遠心管中に40ml移して、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として20時間以上静置後、2)遠心分離(10.000rpm、15min)して、硫安溶液をデカンテーション除去後、3)50mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール3ppmを10ml加えて不斉酸化活性を測定した。4)デカンテーション後の溶液画分は更に、3.1g硫安を加え飽和40%にして20時間以上静置後、遠心分離して得られる沈殿物は、その有する不斉酸化活性を同様な方法で検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.15g硫安を加え、飽和50%にして静置後、遠心沈殿して同様にその酸化活性を検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.3g硫安を加え、飽和60%にして遠心分離して静置後、同様に酸化活性を検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.45g硫安を加え、飽和70%にして遠心分離して静置後、同様に酸化活性を調べた。その結果を以下に示す。
(第3の工程の結晶化蛋白質複合体が処理する基質濃度)
実施例1の条件で得られる結晶化蛋白質複合体水溶液を、50mLプラスチック遠心管に移して、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として静置し、2)遠心分離(10.000rpm、15min)してデカンテーション後、沈殿して得られる結晶化蛋白質複合体に、3)50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度溶液(1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm)分を各10mL加えて調べた。
(第4の工程の結晶化蛋白質複合体の抽出、及びグルタルアルデヒド架橋濃度0.1%と1.0%の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液を、50mLプラスチック遠心管中に40ml移し取り、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として20時間以上静置後、2)25%グルタルアルデヒド溶液をそれぞれ0.1%(0.32ml/40ml)、1.0%(1.6ml/40ml)になるように加えて10時間以上静置後、3)遠心分離(10.000rpm、15min)して、上清の硫安・グルタルアルデヒド溶液をデカンテーション除去した。沈殿の蛋白質複合体は、50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度3ppm分を10ml加えて不斉酸化の活性を確認した。
(第4の工程の蛋白質複合体粉末に関わる連続再利用の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液40mlを、50mLプラスチック遠心管4本分にそれぞれ移し、1)各8.8g硫安をそれぞれ加えて飽和30%とし、一昼夜静置後、2)25%グルタルアルデヒド溶液をそれぞれ0.1%になるように0.32ml/40ml加え、2〜4時間静置した。上清の硫安・グルタルアルデヒド溶液はそれぞれ、3)遠心分離(10.000rpm、15min)してデカンテーション除去して、目的の沈殿物蛋白質複合体は更に、凍結真空乾燥(FD)後に粉砕した。蛋白質複合体粉4)358mg分を3ppmラセミ−2−ナフチルエタノール・50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)に溶かし、活性を測定した。連続再利用は、9時間後と15時間後に行い、遠心分離後に沈殿物を回収して、新たに3ppmラセミ−2−ナフチルエタノール・50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)を加え、この繰り返し作業にて検討した。その結果は次の通りである。
(第4の工程の蛋白質複合体粉末の連続再利用に関わる香料(R-1−オクテンー3−オール)の合成)
実施例11で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末5gに、ラセミ-1-オクテン-3-オール濃度10ppmの50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液150mlを加えて、500ml三角フラスコ中で不斉酸化反応を試みた。30時間後又は60時間後に5mlの反応溶液を遠心分離(10000rpm、15min)により上清のみを回収し、ジエチルエーテルで基質を抽出後、GC測定を行った。尚、連続再利用の操作は、実施例11と同様な方法にて光学純度と収率を導いた。反応は60時間で止め、遠心分離した上清部をジエチルエーテルにて抽出後、飽和塩水にて洗浄、シリカゲルクロマトグラフィーにて単離・精製を行って化学収率と光学純度を求めた。
これまでの結果から、下記の反応式に示すように、ベンゼンやナフタレン骨格を有するアリール系基質に関しては50%の生成ケトンは還元され難いが、1−オクテン−3−オールなどのアルキル鎖系基質に関しては生成ケトンが更に不斉還元されるデラセミ化が生じることが判った。
(蛋白質複合体の分子量決定(SDS−page))
図3は豌豆−Caアルギン酸ゲルを10時間以上温水中にて振とう後、溶出される蛋白質複合体を硫安30%にて結晶化沈殿して得られる沈殿物のSDS−pageである。図に示す「酵素溶液」レーンは、10時間以上温水振とう後、溶出される温水溶液そのものであり、「硫安沈殿」レーンは、該温水溶液を硫安30%飽和になるように結晶化沈殿し、該沈殿物に水を加えて再溶解させたものであり、「上清」レーンは、該硫安沈殿物を遠心分離して得られる上清に示すSDS−page結果である。
図5は、フーリエ変換赤外分光分析(FT−IR)を用いるサンプル(i)〜(vi)の定性分析結果である。各サンプル間の分子構造上の違いを比較する目的で行った。尚、サンプル(i)〜(vi)のサンプル情報は以下の通りである。
(1)エンドウ蛋白質粉末・・・前述の実施例1に記載の方法にて得られる。
(3)振とう培養器製の架橋結晶化蛋白質複合体粉末・・・後述の実施例15に記載の方法にて得られる。
(図5(iii)及び図6(i)に記載の振とう培養器製による蛋白質複合体の製造法)
第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆(PP)由来蛋白粉末30gに、10倍等量の蒸留水300mlを加えて十分に攪拌・溶解後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の300mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られる豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中(pH9.16)に滴下してゲルビーズを作製した。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(500ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養器の温度設定40℃、振とう数55rpmにて10時間以上の振とうした。
使用装置
(1)反応槽:恒温振とう培養器3器中にそれぞれ5000ml三角フラスコを設置。
振とう数:55rpm
温度設定:40℃
1.豌豆蛋白質(30g)・アルギン酸カルシウムゲル(約600mL)
2.蒸留水:500mL×3(器)×3(日分)
3.抽出回数:3回/3日(1日に1回づつ回収)
1.一日分の培養水溶液500mL×3(器分)をビーズと分離、回収した。
2.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
3.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
4.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
5.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
6.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
7.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA−300)にて測定した。
・Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプルCa量を酸分解処理後、原子吸光光度計にて測定した。
・R体酸化(%)・・・図9記載のスケールに反応させて7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
(基質ラセミアルコールのR体50%が選択的に酸化されてケトンになる為、ケトン%が50%に近いかそれ以上の場合、もう一方のS体アルコールの光学純度は100%近い。)
・光学純度(%e.e.)・・・GCの「S−アルコール(面積%)−R−アルコール(面積%)」より求める。
第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆(PP)由来蛋白粉末50gに、10倍等量の蒸留水500mlを加えて十分に攪拌・溶解後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の500mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られる豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液(1000mL分)を4.0%の塩化カルシウム水溶液中(pH9.16)に滴下してゲルビーズを作製した。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(1000mL分)を反応溶液として添加し、高崎科学製5L用ジャーファメンタの温度設定40℃、振とう数800rpmにて振とうした。
(1)反応槽:高崎科学製5L用ジャーファメンタ
羽根:2枚簡易式棒状パドル 800rpm
温度:40℃
酸素供給:0.5mg/L
攪拌(培養)作業の条件
4.豌豆蛋白質(30g)・アルギン酸カルシウムゲル(約1000mL)
5.蒸留水:1000mL×3(日分)
6.抽出回数:3回/3日(1日に1回づつ回収)
1.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
2.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
3.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
4.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
5.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
6.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA−300)にて測定した。
・Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプルCa量を酸分解処理後、原子吸光光度計にて測定した。
・R体酸化(%)・・・図9記載のスケールに反応させて7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
(基質ラセミアルコールのR体50%が選択的に酸化されてケトンになる為、ケトン%が50%に近いかそれ以上の場合、もう一方のS体アルコールの光学純度は100%近い。)
・光学純度(%e.e.)・・・GCの「S−アルコール(面積%)− R−アルコール(面積%)」より求める。
アルギン酸カルシウムゲルに包括する第2の工程の必要性を確認する目的で、第2の工程(アルギン酸カルシウムゲルへ包括)を省き、エンドウ粗蛋白質(4g)を2%塩化カルシウム/50mMトリス塩酸バッファー溶液/120ml((v)pH6.0又は(vi)pH8.0)で恒温振とう(55rpm、40℃、24時間)した。振とう後、エンドウ蛋白質カルシウム溶液は、30%飽和になるように硫安を加えて24時間以上静置後(第3の工程)、結晶化沈殿物を0.25%グルタルアルデヒドにて架橋し(第4の工程)、得られる架橋結晶化したエンドウ粗蛋白質を凍結乾燥(FD)処理して粉末とした。
振とう数:55rpm
温度設定:40℃
7.豌豆蛋白質(4g)
8.2%塩化カルシウム/50mMトリス塩酸バッファー溶液(120m)
9.抽出回数:1回/1日
1.硫安沈殿・・・恒温振とう(55rpm、40℃、24時間)後、30%飽和になるように硫安を加えた。
2.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加して2時間以上置き。
3.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
4.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
5.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
6.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA-300)にて測定した。
・R体酸化(%)・・・7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
・不斉酸化活性
×・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間に殆ど不斉酸化されない場合(生成ケトン10%以下)。
△・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間までに不斉酸化が途中で止まる場合(生成ケトン30%以下)。
○・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間で不斉酸化される場合(生成ケトン40%以上)。
(第2の工程のアルギン酸カルシウム包括ビーズの空気酸化の時間に及ぼす6時間後の不斉酸化活性(右軸)と蛋白質複合体収量への影響)
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作製後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に酸化活性を示す。
(第2の工程の蛋白質複合体の100Lジャー生産におけるpHとDO(溶存酸素濃度)の推移)
図9は第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆蛋白粉末1kgは定法に従って、10倍等量の蒸留水10Lを加えて攪拌混合後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の10Lを加えて、均一になるまで攪拌して得られた豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液(約20L)を、ゲル調整装置を用いて4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、直径1〜2mm程度の球状のビーズを作製し、架橋結晶化蛋白質複合体を作成する際に加える蒸留水(20L)のpHとDO(溶存酸素)をモニターリングした図である。
(2)反応槽:400φ×700H(TL−TL)竪型円筒槽
羽根:4枚傾斜パドル 200φ 35rpm
温度:40℃
(3)晶析槽
420φ×460H 竪型円筒槽
羽根:6枚羽根タービン 120φ
A.攪拌(培養)作業の条件
1.豌豆蛋白質(1kg)・アルギン酸カルシウムゲル(約20L)
2.蒸留水: 1回目−20Lで3日間攪拌(酸素供給なし)後第3.4工程
2回目−20Lで2日間攪拌(酸素供給なし)後第3.4工程
3回目−20Lで1日間攪拌(酸素供給あり)後第3.4工程
4回目−20Lで1日間攪拌(酸素供給あり)後第3.4工程
1.各攪拌後の培養水溶液20L分をビーズと分離、回収した。
2.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
3.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
4.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
5.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
6.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化させて、R体が酸化して得られるケトン%を表している。
7.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA-300)にて測定した。
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作成後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(第2の工程の3%アルギン酸カルシウム包括ビーズの空気酸化の時間に及ぼす6時間後の不斉酸化活性(右軸)と蛋白質複合体収量(左軸)への影響)
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作成後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(第2の工程のアルギン酸Na濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%)に及ぼすアルギン酸カルシウム包括ビーズ空気酸化7時間後の不斉酸化活性6時間後(右軸)と蛋白質複合体収量への影響)
図13は第2の工程において、定法に従い球状又は棒状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズ(アルギン酸Na濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%))を作成後、該ビーズを空気中に7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(基質濃度(10ppm)に対する蛋白質複合体(50mg、75mg、100mg、200mg、300mg)の不斉酸化速度の違い)
図14は、実施例20で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末(50mg、75mg、100mg、200mg、300mg)にラセミ−2−ナフチルエタノール濃度10ppmの50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液40mlを200ml三角フラスコ中に加えて、恒温振とう培養機(40℃、55rpm)にて温水振とうして反応させ、4時間置きにGCにて、不斉酸化されるR体−2−ナフチルエタノールの残留比(%)について追跡を行った結果を示している。
(蛋白質複合体(300mg)に対する基質濃度(10−30ppm、30−90ppm、90−110ppm、110−140ppm)の不斉酸化速度の違い)
図15は、実施例20で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末(300mg)にラセミ−2−ナフチルエタノール濃度(10−140ppm)の50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液40mlを200ml三角フラスコ中に加えて、恒温振とう培養機(40℃、55rpm)にて温水振とうして反応させ、不斉酸化されるR体−2−ナフチルエタノールの残留比(%)について4時間置きにGC追跡を行った結果を示している。
1)該抽出・精製酵素を水不溶性の担体、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、及びポリアクリルアミドゲル等に結合させる担体結合法、2)該抽出・精製酵素を2個もしくはそれ以上の官能基を有する試薬を用いて該抽出・精製酵素間に架橋結合を形成させて固定する架橋法、3)該抽出・精製酵素を、ゲル、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる(格子型)か、半透明膜の皮膜によって被覆する(マイクロカプセル型)包括法がある。
・高純度の酵素は必要としない(部分的に精製された調製品に適用可能)
・簡単な操作と広い応用
・室温で長期間(1年以上)安定
・実質100%活性なタンパク質(高い容積測定(volumetric)と触媒生産性)
・単独酵素と比較して高い温度安定性と有機溶媒への耐性
・高い活性と選択性(単独酵素よりも高い場合もある)
・水媒体中で酵素を濾す必要はない
・迅速な至適化(HTEを使用して)は開発時間を短くする
・触媒カスケードプロセス用に1つ以上の酵素を含むコンビCLEA
前記蛋白質をゲルに包括して空気酸化させた後、該ゲルから蛋白質複合体を抽出する第2の工程と、
抽出された蛋白質複合体を水溶液中にて結晶化沈殿させる第3の工程と、
沈殿した蛋白質複合体を架橋化する第4の工程を含むことを特徴とする架橋結晶化蛋白質複合体の製造方法。
本発明の蛋白質複合体は、蛋白質を少なくとも含み、且つ、FT−IRにおいて、(1085±50cm−1)の領域、および(1411±50cm−1)の領域に、それぞれ少なくとも1個のピークを有することを特徴とする。ここに、FT−IR測定は、後述するように、例えば、Thermo Fisher Scientific製フーリエ変換赤外分光分析装置Magna-750および赤外顕微鏡Nic−Planを用い、顕微ATR法(Geクリスタル)により、例えば波数分解能8cm−1、積算回数32回の条件で測定することができる。(このようなFT−IR測定の詳細に関しては、例えば、文献“Carbohydrate Polymers”66,191−197,(2005)(Enzymatically produced nano-ordered short elements containing cellulose Iβ crystalline domains)「Noriko Hayashiら;Bioconversion Laboratory, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI)」に実施例があり、吸収波長の評価に関しては、本「ACADEMIC PRESS; New York and London 1971; A Subsidiory of Harcourt Brace Jovanovich, Publishers」“INFRARED SPECTRA OF INORGANIC COMPOUNDS (3800−45cm−1)”「Richard A. Nyquist and Renald O. Kagel; Chemistry Physics Research Laboratory, The Dow Chemical Company Midland MichiGAn」を参照できる。
本発明の蛋白質複合体において、上記FT−IR測定におけるピーク強度は、以下の通りであることが好ましい。
(1)(1085±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク1」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであるか、または最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、(1/10)×I0以上のピーク強度を有することが好ましい。このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
(2)(1411±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク2」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであるか、または最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、(1/10)×I0以上のピーク強度を有することが好ましい。このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
本発明の蛋白質複合体において、上記した「ピーク1」および「ピーク2」以外のIRピークは特に制限されない。本発明の蛋白質複合体は、例えば、下記の領域にピークを有していても良い。
(1)(1085±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク1」という)は、測定されたIRスペクトル中の最も強度が大きいピークであり、最も強度が大きいピークの強度をI0とした際に、2番目に強度が大きいピークが(1411±50cm−1)にあり、このピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
(2)(1411±50cm−1)の領域におけるピーク(以下、「ピーク2」という)は、測定されたIRスペクトル中の2番目に最も強度が大きいピークであり、2番目に強度が大きいピークの強度をI0とした際に、3番目に強度が大きいピークが(1649±50cm−1)にありこのピーク強度は、更には(1/5)×I0以上(特に(1/3)×I0以上)であることが好ましい。
上記の場合にも、本発明の蛋白質複合体において、上記した「ピーク1」および「ピーク2」以外のIRピークは特に制限されない。本発明の蛋白質複合体は、例えば、下記の領域にピークを有していても良い。
本発明の蛋白質複合体は、蛋白質およびカルシウムを少なくとも含むことが好ましい。また、蛋白質複合体は、不斉酸化反応を触媒する活性を有することが好ましい。このような「蛋白質およびカルシウムを少なくとも含む」こと、および「不斉酸化反応を触媒する活性を有する」は、後述する方法によって好適に確認することができる。
本発明の蛋白質複合体の不斉酸化反応の好ましい態様は、例えば、後述する実施例12の条件下で、基質ラセミ−1−オクテン−3−オール(マツタケオール)を作用させた場合に得られるR−1−オクテン−3−オールの光学純度(%ee)で好適に表すことができる。本発明の蛋白質複合体は、この実施例12の条件で、85%以上の化学収率で、R−1−オクテン−3−オールを与えることが好ましい。更には、この光学純度は、95%ee以上(特に98%ee以上)であることが好ましい。
本発明の蛋白質複合体は、下記の好適な特製のうち、1以上を有することが好ましい。
(1) 上記蛋白質複合体が、更に糖を含むこと。
(2) 前記蛋白質が、架橋結晶化蛋白質であること。
(3) 前記不斉酸化反応が、基質ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に与える酸化反応であること。
(4) 前記不斉酸化により得られるケトンが、更に不斉酸化されるデラセミ化反応を与える活性を、前記蛋白質複合体が有すること。
本発明者の知見によれば、本発明において、好適な動植物由来の蛋白質複合体が提供されるのは以下の理由によるものと推定される。
上記した本発明の「推定メカニズム」のサポートに関しては、例えば、以下の文献を挙げることができる。
図12は、文献“Biochemical and Biophysical Research ComMunications”300,pp1−4(2003)(Multiple roles of cysteine in biocatalysis)「Niroshini M, Gilesら;School of Chemistry, University of Exeter」で公知のように、細胞内システイン酸化により形成された様々な酵素の機能に関してなど示されている。1)Peptidase、2)glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)、3)alcohol dehydrogenase (ADH)、4)bacterial nitrile hydratase (NHase)、5)ribonucleotide reductase (RNRase)、6)pyruvate formate lyase (PFL)、7)benzylsuccinate synthase (BSS)、8)reduction of glutathione disulfide (GSSG)、9)thioredoxin (Trx)、10)glutathion reductase (GR)、11)thioredoxin reductase (TR)、12)NADH oxidase (Nox), 13)NADH peroxidase (Npx)。
以下、本発明の製造方法を構成する各工程について説明する。
本発明の第1の工程における水溶性蛋白質の抽出においては、穀類又は豆類を砕き粒の大きい部分と殻部を取り除き、このようにして得られた穀類及び豆類粉砕粉を約20〜60℃、好ましくは約40℃で、pH約6〜8、好ましくは約pH7.0において、穀類または豆類の約7〜15重量倍の水で、30分以上抽出する。約45分で抽出するのが最も効果的であって、これ以上長く抽出しても抽出物の量は変わらない。pHの調製が必要なときは、H2SO4、HCl、H3PO4などの食品級酸、又はNaOHなどの食品級アルカリを用いて上記適性範囲を調製できる。上記水溶性蛋白質抽出液、又はこの抽出液から、デカンター、遠心分離などにより食物繊維部を分離した、タンパクカードをそのまま第2工程に移すか、必要に応じて噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥などにより粉末としてから、再溶解して第2工程に移しても良い。種子(外皮(ふすま、ぬか)、胚芽(スプラウト))に関しては、上記の穀類及び豆類粉砕粉の工程にて得ることができる。外皮(ふすま、ぬか)、胚芽(スプラウト)、葉(若葉、新芽)、茎、根、花を凍結乾燥(FD)、熱風乾燥(AD)、真空乾燥などで水分を除去して乾燥後、ボールミルなどを利用して5μm以下まで細かく粉砕する。
第2の工程において、該抽出蛋白質を包括化する方法は、例えば、該抽出蛋白質を、ゲル、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる(格子型)か、半透膜性の皮膜によって被覆する(マイクロカプセル型)包括法があるが、蛋白質複合体を作成する上では、海草より抽出するアルギン酸のカルシウムを用いた包括化法が安価で環境に優しく、かつ、包括操作が平易な点で最も好ましい。この包括化されたビーズは、蛋白質複合体を水溶液中に溶出させる為に、温水温度30℃〜45℃で、且つ、溶存酸素濃度がゼロにならないように酸素供給が必要で、且つ、ビーズが振れる回転数で振とうさせることが望ましい。
第3の工程において、蛋白質を結晶化沈殿するためには、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコール/塩化リチウム,2−メチル−2,4−ペンタジオール,塩化ナトリウム,マロン酸ナトリウム等があり、いずれの結晶化沈殿剤として本願発明において用いることができる。しかしながら、最も安価な硫酸アンモニウムを用いるのがトータルコストダウンの観点から有益である。蛋白質の結晶化は、通常濃度が10〜50mg/mLのタンパク質溶液で用いて行うことが望ましく、サンプルをセントリコンやアミコンウルトラなどで濃縮する手法ある。
第4の工程において、結晶化沈殿された蛋白質を架橋するためにはグルタルアルデヒド(以下、「GA」と略称する)、フォルムアルデヒド(以下、「FA」と略称する)等があり、いずれも架橋剤として本願発明において用いることができる。グルタルアルデヒドは、示性式OHC(CH2)3CHO として表される有機化合物で、反応は、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基との間で起こるが、α−アミノ基やSH基との間でも起こり、分子間架橋を形成することができる。ひとつのグルタルアルデヒド分子が単独で架橋形成を起こせるとは考えられていない。(参考文献;重中義信/監修『原生動物の観察と実験法』(共立出版株式会社、1998年)ISBN 4320053532)GAは2つのアルデヒド基、FAは1つアルデヒド基を持っており、架橋させることで、1)室温で長期間(1年以上)安定、2)実質100%活性なタンパク質(高い容積測定(volumetric)と触媒生産性)、3)容易な回収と再使用、4)単独酵素と比較して高い温度安定性と有機溶媒への耐性、5)単独酵素よりも高い活性と選択性になるなど、産業用酵素試薬として実用レベルで広く活用できるようになる。
第5の工程において、乾燥粉体化するためには、1)熱風乾燥(AD)、2)凍結真空乾燥(FD)、3)加圧乾燥、4)減圧乾燥、5)自然乾燥など本願発明において用いることができる。しかしながら、凍結真空乾燥(FD)は水分を完全に除去でき、引き続く粉砕の工程に有利であり、尚且つ保存性も高くなる。
以下、図面に示した各データを説明する。
サンプル10 μLを,2×サンプルバッファー(0.1 M Tris/HCl pH 6.8,3 % SDS,10 %グリセリン,10% β‐メルカプトエタノール,0.1% BPB)10 μLと混合し,100℃で5 min加熱した。これらについて,SDS−PAGE mini(4−20 %グラジエントゲル,TEFCO社)を用いて分子量マーカー(SDS−PAGEスタンダード Broad,Bio−Rad)と共に泳動(18 mA定電流,泳動バッファー:25 mM Tris/HCl,0.19 M Glycine,0.1 % SDS,pH 8.3)を行った後,CBB染色(PHastGel Blue R,Amersham Biosciences社)を行った。
A:1649cm−1付近・・・ペプチド結合(−C(=O)−N−)に特徴となるピーク。
B:1528cm−1付近・・・ペプチド結合(−C(=O)−N−)に特徴となるピーク。
C:1411cm−1付近・・・カルボキシラート(−C(=O)−O−Na)のケトン基に特徴となるピーク。
D:1122cm−1付近(1085cm−1、1032cm−1)・・・糖エーテル(−C−O−C−)特徴となるピーク。
E:1085cm−1付近・・・硫安((NH4)2SO4)に特徴のピーク。
サンプル(i)・・・振とう培養器製架橋結晶化蛋白質複合体
サンプル(ii)・・・20mM塩化Ca/50mMトリス塩酸バッファー(pH6.0)
サンプル(iii)・・・20mM塩化Ca/50mMトリス塩酸バッファー(pH8.0)
サンプル(iv)・・・エンドウ蛋白質粉末
図9cおよび図9d:2回目の実験の結果
図9eおよび図9f:3回目の実験の結果
図9gおよび図9h:4回目の実験の結果
Ca濃度(FD)・・・FD乾燥後サンプルの酸分解法による原子吸光光度計によるCa濃度(mg/g)測定結果。
×・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間に殆ど不斉酸化されない場合(生成ケトン10%以下)。
△・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間までに不斉酸化が途中で止まる場合(生成ケトン30%以下)。
○・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間で不斉酸化される場合(生成ケトン40%以上)。
本発明の蛋白質複合体は、動植物由来粗蛋白質の空気酸化形成物であって、且つ、不斉酸化反応を示すなど酵素様活性を有することを特徴とする。
本発明の不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の活性は、例えば、後述(実施例15「抽出作業の条件」内6.不斉酸化活性)に記載する方法により好適に測定可能である。
本発明において、蛋白質複合体の精製方法は特に限定されない。蛋白質複合体の収量を増やす目的から、ろ過の必要はないが、アルギン酸カルシウムゲルビーズとの分離の意味でガラスビーズなどを用いることができる。この場合、口径サイズが40−200μmで可能であるが、口径200μmであることが好ましい。
(架橋結晶化した豌豆由来の蛋白質複合体の一般的な製造方法)
先ず第1の工程として、豌豆を粉砕して殻を取り除き、pH7.0付近の蒸留水(約40℃)9重量倍にて、約45分間に溶解される豌豆蛋白質成分をNaOH水溶液を用いてpH7.0にして沈殿成分の食物繊維を除去し、水溶性蛋白部分をアルカリ条件(pH9.5付近)又は酸性条件(pH4.5付近)にして蛋白質を等電点沈殿させ、蛋白沈殿部をpH7.0の蒸留水にて再溶解して得られる豌豆蛋白水溶液(試料濃度5.0%)を噴霧乾燥処理を行い粉体の豌豆蛋白を調製する。また、3%アルギン酸ナトリウム水溶液はオートクレーブの条件、温度121℃、時間20分で、アルギン酸ナトリウムを水溶液中に溶解して調整する。
(第2の工程における豌豆(PP)、大豆(SP)、小麦(WP)蛋白質由来蛋白質複合体の基質特異性の検討)
第2の工程において、豌豆(PP)、大豆(SP)、小麦(WP)由来粗蛋白質は種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し、水溶液画分を噴霧乾燥して得られる粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の200mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られた豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、豌豆蛋白含有・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製する。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養器の温度設定40℃、振とう数55rpmにて10時間以上の振とう後、基質変換反応を行った。基質としては2−ナフチルエタノール(naphthyl/1)と、メタ、パラ位に塩素(Cl−/2a、2b)、臭素(Br−/3a、3b)、フッ素(F−/4a、4b)、メチル(Me−/5a、5b)、メトキシ(MeO−/6a、6b)、ニトロ(NO2−/7a、7b)を置換させたフェニルエタノールを用いた結果、反応時間、生成物、光学純度、化学収率を以下の表にまとめる。
(第2の工程におけるその他植物由来組織材料由来蛋白質複合体の基質特異性の検討)
第2の工程において、小麦若葉(YWL)、大麦若葉(YBL)、ヨモギの葉(AVI)、小麦ふすま(WB)、ワカメ(WS)、ニンジン(C)、カボチャ(P)といった草や雑草をも含めた種子、葉、茎、根、花、実からの不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の溶出を確認する目的で、温水60℃以上で10分間漬け置き洗浄後、必要により薄くスライスして、凍結真空乾燥(FD)後、ボールミルを用いて細かく粉砕した。これらの植物材料粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%アルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量200ml加えて均一になるまで攪拌し、得られた植物組織含有・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、植物組織含有・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製する。該ビーズに、植物組織含有粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう温度設定40℃、振とう数55rpmの条件にして、10時間以上の振とう後、基質変換反応を行った。基質としてはメタ、パラ位に臭素(Br−/1m、1p)、塩素(Cl−/2m、2p)、フッ素(F−/3m、3p)、メチル(Me−/4m、4p)、メトキシ(MeO−/5m、5p)、2−ナフチルエタノール(naphthyl/6)を置換させたフェニルエタノール類を作用させて、得られた結果については、反応時間、生成物、光学純度、化学収率を以下の表にまとめた。
(第2の工程における卵白アルブミン由来蛋白質複合体のパラ位置置換基質の基質特異性の検討)
第2の工程において、卵白から分離されたオボアルブミンから作成される蛋白質複合体の活性測定を目的として、鶏卵より卵白を分離し、硫安沈殿にてオボアルブミンを分離し、0.1〜0.5%のオボアルブミンの濃度になるように水に溶解後噴霧乾燥処理して、粉末の卵白アルブミン粉末を調整した。これらの卵白アルブミン粉末20gは定法に従って、10倍等量の蒸留水200mlを加えて、3%アルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量200mlを加えて均一にし、得られた卵白アルブミン・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、卵白アルブミン・アルギン酸カルシウムゲルビーズを作製した。該ビーズに、卵白アルブミン粉の20倍等量の蒸留水(400ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養設定40℃、振とう数55rpmにて、10時間以上振とう後、基質変換反応を行った。基質としてはパラ位に臭素(Br−/1)、塩素(Cl−/2)、メトキシ(MeO−/5)、2−ナフチルエタノール(naphthyl/6)を置換させたラセミ−フェニルエタノール類を作用させて、得られた反応時間、生成物、光学純度、化学収率の結果については以下の表7にまとめた。
(第2の工程、恒温振とう器中で10時間の空振とうする理由)
図1は第2の工程において、豌豆蛋白4gを40mlの蒸留水に溶かして、更に3%アルギン酸ナトリウム(40ml)を加えて均一化した溶液を、4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して調整された、豌豆蛋白・アルギン酸カルシウムゲルビーズに、120mlの蒸留水を加えて、恒温振とう器設定温度40℃、振とう数55rpmにて振とうさせて、空振とう開始後0時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、25時間後、35時間後、45時間後、そして55時間後に基質R−2−ナフチルエタノールを加えた時の、その豌豆蛋白質由来蛋白質複合体の不斉酸化活性に伴う基質残量%を示している。
(第2の工程、基質特異性の検討)
図2aは、図1と同一条件で振とう開始後10時間後、a)は基質特異性を調べる目的で、基質ラセミー2−ナフチルエタノール、R−2−ナフチルエタノール、2−アセトナフトンをそれぞれ50mgづつ添加したときの反応時間に伴う基質と生成物の%比率をモニターリングしたものである。その結果、空振とう10時間後に現れる活性は、S体アルコールは酸化せず、基質ラセミー2−ナフチルエタノールのR体のみを立体選択的に不斉酸化することが判った。
(第2の工程、反応箇所の検討)
図2bは第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸ナトリウムを調製後、空振とう10時間後の水溶液(120ml)、空振とう10時間後の水溶液(240ml)、空振とう10時間後ビーズ+蒸留水(DW:120ml)、新しいビーズ+空振とう10時間後の水溶液(120ml)でそれぞれ基質R−2−ナフチルエタノール(50mg、75mg、又は100mg)を加え、不斉酸化活性をモニタリングした図である。
その結果、空振とう10時間後に現れる蛋白質複合体は、ビーズ中ではなく、水溶液中に反応の場があり、好適に2−ナフチルエタノールのR体のみに作用することが判った。
(第2の工程、包括ゲル化塩化カルシウム濃度の活性に及ぼす効果)
図2cは第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸ナトリウム混液を調整後、異なる塩化カルシウム濃度(5g/L、7.5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L)中に滴下してゲル化して、同じ条件にて10時間空振とう後、基質R−2−ナフチルエタノールを加えて、その塩化カルシウム濃度に及ぼす蛋白質複合体の活性強度の差をまとめた図である。
(第2の工程、豌豆蛋白量の最適化)
図2dは第2の工程における、豌豆アルギン酸ゲルを調製時の豌豆蛋白量(2g、3g、4g、5g)の活性に及ぼす影響について調べた。この場合、塩化カルシウム濃度10g/Lで、豌豆・アルギン酸カルシウムゲルを調製し、空振とう10時間後に得られる蛋白質複合体が及ぼす、基質R−2−ナフチルエタノール(50mg)への影響を示した図である。
(第2の工程、香料であるR−1−オクテン−3−オールの合成検討)
図8は第2の工程において、図1と同一条件で豌豆・アルギン酸カルシウムゲルに包括化し、空振とう10時間後に得られる蛋白質複合体の、基質ラセミ−1−オクテン−3−オールの分割に関わる効果を調べた図である。
(第3の工程の蛋白質複合体の抽出、好適な硫安濃度の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液を、50mLプラスチック遠心管中に40ml移して、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として20時間以上静置後、2)遠心分離(10.000rpm、15min)して、硫安溶液をデカンテーション除去後、3)50mMTris塩酸緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール3ppmを10ml加えて不斉酸化活性を測定した。4)デカンテーション後の溶液画分は更に、3.1g硫安を加え飽和40%にして20時間以上静置後、遠心分離して得られる沈殿物は、その有する不斉酸化活性を同様な方法で検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.15g硫安を加え、飽和50%にして静置後、遠心沈殿して同様にその酸化活性を検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.3g硫安を加え、飽和60%にして遠心分離して静置後、同様に酸化活性を検査した。デカンテーション後の溶液画分は更に、3.45g硫安を加え、飽和70%にして遠心分離して静置後、同様に酸化活性を調べた。その結果を以下に示す。
(第3の工程の結晶化蛋白質複合体が処理する基質濃度)
実施例1の条件で得られる結晶化蛋白質複合体水溶液を、50mLプラスチック遠心管に移して、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として静置し、2)遠心分離(10.000rpm、15min)してデカンテーション後、沈殿して得られる結晶化蛋白質複合体に、3)50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度溶液(1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm)分を各10mL加えて調べた。
(第4の工程の結晶化蛋白質複合体の抽出、及びグルタルアルデヒド架橋濃度0.1%と1.0%の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液を、50mLプラスチック遠心管中に40ml移し取り、1)各8.8g硫安を加え飽和30%として20時間以上静置後、2)25%グルタルアルデヒド溶液をそれぞれ0.1%(0.32ml/40ml)、1.0%(1.6ml/40ml)になるように加えて10時間以上静置後、3)遠心分離(10.000rpm、15min)して、上清の硫安・グルタルアルデヒド溶液をデカンテーション除去した。沈殿の蛋白質複合体は、50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度3ppm分を10ml加えて不斉酸化の活性を確認した。
(第4の工程の蛋白質複合体粉末に関わる連続再利用の検討)
実施例1の条件で得られる蛋白質複合体溶液40mlを、50mLプラスチック遠心管4本分にそれぞれ移し、1)各8.8g硫安をそれぞれ加えて飽和30%とし、一昼夜静置後、2)25%グルタルアルデヒド溶液をそれぞれ0.1%になるように0.32ml/40ml加え、2〜4時間静置した。上清の硫安・グルタルアルデヒド溶液はそれぞれ、3)遠心分離(10.000rpm、15min)してデカンテーション除去して、目的の沈殿物蛋白質複合体は更に、凍結真空乾燥(FD)後に粉砕した。蛋白質複合体粉4)358mg分を3ppmラセミ−2−ナフチルエタノール・50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)に溶かし、活性を測定した。連続再利用は、9時間後と15時間後に行い、遠心分離後に沈殿物を回収して、新たに3ppmラセミ−2−ナフチルエタノール・50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)を加え、この繰り返し作業にて検討した。その結果は次の通りである。
(第4の工程の蛋白質複合体粉末の連続再利用に関わる香料(R-1−オクテンー3−オール)の合成)
実施例11で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末5gに、ラセミ-1-オクテン-3-オール濃度10ppmの50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液150mlを加えて、500ml三角フラスコ中で不斉酸化反応を試みた。30時間後又は60時間後に5mlの反応溶液を遠心分離(10000rpm、15min)により上清のみを回収し、ジエチルエーテルで基質を抽出後、GC測定を行った。尚、連続再利用の操作は、実施例11と同様な方法にて光学純度と収率を導いた。反応は60時間で止め、遠心分離した上清部をジエチルエーテルにて抽出後、飽和塩水にて洗浄、シリカゲルクロマトグラフィーにて単離・精製を行って化学収率と光学純度を求めた。
これまでの結果から、下記の反応式に示すように、ベンゼンやナフタレン骨格を有するアリール系基質に関しては50%の生成ケトンは還元され難いが、1−オクテン−3−オールなどのアルキル鎖系基質に関しては生成ケトンが更に不斉還元されるデラセミ化が生じることが判った。
(蛋白質複合体の分子量決定(SDS−page))
図3は豌豆−Caアルギン酸ゲルを10時間以上温水中にて振とう後、溶出される蛋白質複合体を硫安30%にて結晶化沈殿して得られる沈殿物のSDS−pageである。図に示す「酵素溶液」レーンは、10時間以上温水振とう後、溶出される温水溶液そのものであり、「硫安沈殿」レーンは、該温水溶液を硫安30%飽和になるように結晶化沈殿し、該沈殿物に水を加えて再溶解させたものであり、「上清」レーンは、該硫安沈殿物を遠心分離して得られる上清に示すSDS−page結果である。
図5は、フーリエ変換赤外分光分析(FT−IR)を用いるサンプル(i)〜(vi)の定性分析結果である。各サンプル間の分子構造上の違いを比較する目的で行った。尚、サンプル(i)〜(vi)のサンプル情報は以下の通りである。
(1)エンドウ蛋白質粉末・・・前述の実施例1に記載の方法にて得られる。
(3)振とう培養器製の架橋結晶化蛋白質複合体粉末・・・後述の実施例15に記載の方法にて得られる。
(図5(iii)及び図6(i)に記載の振とう培養器製による蛋白質複合体の製造法)
第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆(PP)由来蛋白粉末30gに、10倍等量の蒸留水300mlを加えて十分に攪拌・溶解後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の300mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られる豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液を4.0%の塩化カルシウム水溶液中(pH9.16)に滴下してゲルビーズを作製した。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(500ml)を反応溶液として添加し、恒温振とう培養器の温度設定40℃、振とう数55rpmにて10時間以上の振とうした。
使用装置
(1)反応槽:恒温振とう培養器3器中にそれぞれ5000ml三角フラスコを設置。
振とう数:55rpm
温度設定:40℃
1.豌豆蛋白質(30g)・アルギン酸カルシウムゲル(約600mL)
2.蒸留水:500mL×3(器)×3(日分)
3.抽出回数:3回/3日(1日に1回づつ回収)
1.一日分の培養水溶液500mL×3(器分)をビーズと分離、回収した。
2.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
3.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
4.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
5.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
6.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
7.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA−300)にて測定した。
・Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプルCa量を酸分解処理後、原子吸光光度計にて測定した。
・R体酸化(%)・・・図9記載のスケールに反応させて7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
(基質ラセミアルコールのR体50%が選択的に酸化されてケトンになる為、ケトン%が50%に近いかそれ以上の場合、もう一方のS体アルコールの光学純度は100%近い。)
・光学純度(%e.e.)・・・GCの「S−アルコール(面積%)−R−アルコール(面積%)」より求める。
第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆(PP)由来蛋白粉末50gに、10倍等量の蒸留水500mlを加えて十分に攪拌・溶解後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の500mlを加えて均一になるまで攪拌し、得られる豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液(1000mL分)を4.0%の塩化カルシウム水溶液中(pH9.16)に滴下してゲルビーズを作製した。該作製ビーズに豌豆蛋白粉の20倍等量の蒸留水(1000mL分)を反応溶液として添加し、高崎科学製5L用ジャーファメンタの温度設定40℃、振とう数800rpmにて振とうした。
(1)反応槽:高崎科学製5L用ジャーファメンタ
羽根:2枚簡易式棒状パドル 800rpm
温度:40℃
酸素供給:0.5mg/L
攪拌(培養)作業の条件
4.豌豆蛋白質(30g)・アルギン酸カルシウムゲル(約1000mL)
5.蒸留水:1000mL×3(日分)
6.抽出回数:3回/3日(1日に1回づつ回収)
1.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
2.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
3.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
4.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
5.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
6.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA−300)にて測定した。
・Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプルCa量を酸分解処理後、原子吸光光度計にて測定した。
・R体酸化(%)・・・図9記載のスケールに反応させて7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
(基質ラセミアルコールのR体50%が選択的に酸化されてケトンになる為、ケトン%が50%に近いかそれ以上の場合、もう一方のS体アルコールの光学純度は100%近い。)
・光学純度(%e.e.)・・・GCの「S−アルコール(面積%)− R−アルコール(面積%)」より求める。
アルギン酸カルシウムゲルに包括する第2の工程の必要性を確認する目的で、第2の工程(アルギン酸カルシウムゲルへ包括)を省き、エンドウ粗蛋白質(4g)を2%塩化カルシウム/50mMトリス塩酸バッファー溶液/120ml((v)pH6.0又は(vi)pH8.0)で恒温振とう(55rpm、40℃、24時間)した。振とう後、エンドウ蛋白質カルシウム溶液は、30%飽和になるように硫安を加えて24時間以上静置後(第3の工程)、結晶化沈殿物を0.25%グルタルアルデヒドにて架橋し(第4の工程)、得られる架橋結晶化したエンドウ粗蛋白質を凍結乾燥(FD)処理して粉末とした。
振とう数:55rpm
温度設定:40℃
7.豌豆蛋白質(4g)
8.2%塩化カルシウム/50mMトリス塩酸バッファー溶液(120m)
9.抽出回数:1回/1日
1.硫安沈殿・・・恒温振とう(55rpm、40℃、24時間)後、30%飽和になるように硫安を加えた。
2.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加して2時間以上置き。
3.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
4.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
5.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化活性を検討した。
6.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA-300)にて測定した。
・R体酸化(%)・・・7hr後、20hr後のGC測定による生成ケトン(%)を記載した。
・不斉酸化活性
×・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間に殆ど不斉酸化されない場合(生成ケトン10%以下)。
△・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間までに不斉酸化が途中で止まる場合(生成ケトン30%以下)。
○・・・「蛋白質複合体」(350mg)によって、ラセミ−2−ナフチルエタノール(10ppm、40ml)溶液のR体のみが20時間で不斉酸化される場合(生成ケトン40%以上)。
(第2の工程のアルギン酸カルシウム包括ビーズの空気酸化の時間に及ぼす6時間後の不斉酸化活性(右軸)と蛋白質複合体収量への影響)
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作製後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0、40mL)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に酸化活性を示す。
(第2の工程の蛋白質複合体の100Lジャー生産におけるpHとDO(溶存酸素濃度)の推移)
図9は第2の工程において、種子を粉砕して、水を加えて1時間後に沈殿物のオカラ画分を除去し水溶性画分を噴霧乾燥して得られる豌豆蛋白粉末1kgは定法に従って、10倍等量の蒸留水10Lを加えて攪拌混合後、3%のアルギン酸ナトリウム水溶液を1倍等量の10Lを加えて、均一になるまで攪拌して得られた豌豆・アルギン酸ナトリウム混合液(約20L)を、ゲル調整装置を用いて4.0%の塩化カルシウム水溶液中に滴下して、直径1〜2mm程度の球状のビーズを作製し、架橋結晶化蛋白質複合体を作成する際に加える蒸留水(20L)のpHとDO(溶存酸素)をモニターリングした図である。
(2)反応槽:400φ×700H(TL−TL)竪型円筒槽
羽根:4枚傾斜パドル 200φ 35rpm
温度:40℃
(3)晶析槽
420φ×460H 竪型円筒槽
羽根:6枚羽根タービン 120φ
A.攪拌(培養)作業の条件
1.豌豆蛋白質(1kg)・アルギン酸カルシウムゲル(約20L)
2.蒸留水: 1回目−20Lで3日間攪拌(酸素供給なし)後第3.4工程
2回目−20Lで2日間攪拌(酸素供給なし)後第3.4工程
3回目−20Lで1日間攪拌(酸素供給あり)後第3.4工程
4回目−20Lで1日間攪拌(酸素供給あり)後第3.4工程
1.各攪拌後の培養水溶液20L分をビーズと分離、回収した。
2.硫安沈殿・・・30%飽和硫安になるように工業用硫安を添加、結晶化沈殿の為に1日置き。
3.架橋・・・結晶化沈殿溶液に25%グルタルアルデヒド(GA)溶液濃度を0.25%に成る様に添加し、2時間以上置き。
4.遠心分離(洗浄)・・・10000rpm・15minにて沈殿物を回収、上清を除去後、蒸留水を加えて2回繰り返して不純物の洗浄。
5.フリーズドライ(粉末化)・・・凍結真空乾燥機(FD)により実施。
6.不斉酸化活性・・・凍結真空乾燥(FD)粉350mgを50mMTrisHCl緩衝液(pH8.0)に溶かしたラセミ−2−ナフチルエタノール濃度10ppmを40mL加えて酸化させて、R体が酸化して得られるケトン%を表している。
7.Ca濃度(mg/g)・・・FD後の粉末サンプル酸分解処理後、Ca量を原子吸光光度計(Contr.AA-300)にて測定した。
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作成後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(第2の工程の3%アルギン酸カルシウム包括ビーズの空気酸化の時間に及ぼす6時間後の不斉酸化活性(右軸)と蛋白質複合体収量(左軸)への影響)
図7は第2の工程において、定法に従い球状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズを作成後、該ビーズを空気中に0時間、0.5時間、1時間、3時間、5時間、7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(第2の工程のアルギン酸Na濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%)に及ぼすアルギン酸カルシウム包括ビーズ空気酸化7時間後の不斉酸化活性6時間後(右軸)と蛋白質複合体収量への影響)
図13は第2の工程において、定法に従い球状又は棒状のエンドウ蛋白・アルギン酸カルシウムビーズ(アルギン酸Na濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%))を作成後、該ビーズを空気中に7時間放置後、定法の恒温振とう培養(40℃、55rpm)にて温水振とう抽出(2日間(1回目)、更に1日間(2回目))を行い、温水抽出液を定法に従い飽和30%硫安で一昼夜静置して沈殿させて、更に、0.25%グルタルアルデヒド濃度にて架橋させ、得られた架橋結晶化蛋白質複合体(CLPCs)を凍結乾燥処理した後、ボールミル粉砕したものの収量及び酸化活性をまとめたグラフである。不斉酸化活性は、架橋結晶化蛋白質複合体350mgに10ppmラセミ−2−ナフチルエタノール溶液/50mMtris HCl緩衝液(pH8.0、40ml)を加えて、恒温振とう培養(40℃、55rpm)6時間後に示す酸化活性である。
(基質濃度(10ppm)に対する蛋白質複合体(50mg、75mg、100mg、200mg、300mg)の不斉酸化速度の違い)
図14は、実施例20で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末(50mg、75mg、100mg、200mg、300mg)にラセミ−2−ナフチルエタノール濃度10ppmの50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液40mlを200ml三角フラスコ中に加えて、恒温振とう培養機(40℃、55rpm)にて温水振とうして反応させ、4時間置きにGCにて、不斉酸化されるR体−2−ナフチルエタノールの残留比(%)について追跡を行った結果を示している。
(蛋白質複合体(300mg)に対する基質濃度(10−30ppm、30−90ppm、90−110ppm、110−140ppm)の不斉酸化速度の違い)
図15は、実施例20で得られる蛋白質複合体の凍結真空乾燥(FD)粉末(300mg)にラセミ−2−ナフチルエタノール濃度(10−140ppm)の50mMTrisHCl(pH8.0)緩衝液40mlを200ml三角フラスコ中に加えて、恒温振とう培養機(40℃、55rpm)にて温水振とうして反応させ、不斉酸化されるR体−2−ナフチルエタノールの残留比(%)について4時間置きにGC追跡を行った結果を示している。
Claims (33)
- 動植物由来水溶性部分から粗蛋白質を濃縮する第1の工程と、
前記蛋白質をゲルに包括して空気酸化させた後、該ゲルから蛋白質複合体を抽出する第2の工程と、
抽出された蛋白質複合体を水溶液中にて結晶化沈殿させる第3の工程と、
沈殿した蛋白質複合体を架橋化する第4の工程を含むことを特徴とする架橋結晶化蛋白質複合体の製造方法。 - 前記蛋白質複合体が、蛋白質およびカルシウムを少なくとも含む蛋白質複合体である請求項1に記載の製造方法。
- 前記蛋白質複合体が、更に糖を含む蛋白質複合体である請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記蛋白質複合体が、不斉酸化反応を触媒する活性を有する蛋白質複合体である請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第1の工程において、動植物由来組織を凍結真空乾燥(FD)させて細かく粉砕した後、水にて溶出される粗蛋白質を沈殿して濃縮する請求項1〜4のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第1の工程において、動植物由来組織を凍結真空乾燥(FD)させて細かく粉砕した後、水にて溶出される粗蛋白質を噴霧乾燥して濃縮する請求項1〜5のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程におけるゲルがアルギン酸カルシウムゲルである請求項1〜6のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程における空気酸化が、前記ゲルを空気中で静置させることにより行われる請求項1〜7のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、前記ゲルから温水中に蛋白質複合体を抽出する請求項1〜8のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記アルギン酸カルシウムゲルを作成するための塩化カルシウム水溶液の濃度が50mM以上である請求項7に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、前記アルギン酸カルシウムゲルを温水中で振るときの温水量が、アルギン酸カルシウムゲル量の1.5倍以下である請求項7または10に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程における空気酸化が酸化活性強度に関連している請求項1〜11のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、ゲルを空気中で30分以上静置させて空気酸化する請求項1〜12のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記空気酸化が、蛋白質複合体の形成および該複合体の水溶性を高める効果を与える請求項1〜13のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、前記温水中で振る工程が、恒温振とう培養器を用いて行われる請求項11に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程、前記温水中で振る工程が、ジャーファメンターを用いることによる請求項11に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、前記蛋白質複合体が高分子グルテニン、低分子グルテニン、及びグリアジンに類似する性質を有する蛋白質複合体である請求項1〜16のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第2の工程において、蛋白質複合体が微量の塩の存在下において凝集し、分子間距離を短縮させる性質を有する請求項1〜17のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記微量の塩が、カルシウムイオンを与える塩である請求項18に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第3の工程において得られる蛋白質複合体を結晶化させる際に、硫安を用いる請求項1〜19のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記硫安の濃度が飽和30%以下である請求項20に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第4の工程において、蛋白質複合体を架橋結晶化させる架橋剤が、グルタルアルデヒド(GA)及び/又はフォルムアルデヒド(FA)である請求項1〜21のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第1の工程における植物が、蕎麦、アマランサス、米、小麦、大麦、トウモロコシ、エンバク、ライ麦、粟、ヒエ、キビ、ハト麦、モロコシの穀類;および小豆、インゲン豆、豌豆、リョクトウ、大豆等の豆類から選ばれる請求項1〜22のいずれか一項に記載の架橋結晶化蛋白質複合体の製造方法。
- 前記穀類や豆類が、粉砕時の組織として得られる種子外皮、胚芽、葉、茎、根、花の植物資源を含む請求項23に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 前記第1の工程における動物が、鶏類、両生類、魚類、鶏卵由来の卵アルブミンや筋肉から選ばれる請求項1〜22のいずれか一項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
- 基質たるラセミ体アルコールを、蛋白質複合体と反応させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得る光学活性アルコールの製造方法。
- 蛋白質複合体を用いて、基質ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を立体選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を高い光学純度で得る光学活性アルコールの製造方法。
- 蛋白質を少なくとも含む蛋白質複合体であって;且つ、FT−IRにおいて、(1085±50cm−1)の領域、および(1411±50cm−1)の領域に、それぞれ少なくとも1個のピークを有することを特徴とする蛋白質複合体。
- 不斉酸化反応を触媒する活性を有する請求項28に記載の蛋白質複合体。
- 更に糖を含む請求項28または29に記載の蛋白質複合体。
- 前記蛋白質が、架橋結晶化蛋白質である請求項28〜30のいずれか一項に記載の蛋白質複合体。
- 前記不斉酸化反応が、基質ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に与える酸化反応である請求項29に記載の蛋白質複合体。
- 前記不斉酸化反応により得られるケトンが、更に不斉還元されるデラセミ化反応を与える活性を有する請求項29または32に記載の蛋白質複合体。
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