JP2013085501A - Enzyme complex - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To saccharify a noncrystalline cellulose in high efficiency in a technique for producing bioethanol from a cellulose-based biomass.SOLUTION: The enzyme complex has an enzyme for degrading the noncrystalline cellulose, and a carrier adsorbing or bonding with a protein, wherein the carrier has magnetism. Preferably, the enzyme is endoglucanase, cellobio-hydrolase, β-glucosidase, an enzyme similar thereto, or a mixture thereof. In another embodiment, the saccharification efficiency for producing the glucose from the cellulose can be improved by the enzyme complex in which the carrier is a carbon nanotube (CNT), and the enzyme complex can be recovered by being attracted by a magnet.

Description

本発明は、セルロース系バイオマス、特にシュレッダー紙からバイオエタノールを作製する際に使用する酵素であるセルラーゼの複合体に関するものである。   The present invention relates to a complex of cellulase, which is an enzyme used for producing bioethanol from cellulosic biomass, particularly from shredder paper.

セルロース系バイオマスをバイオエタノールに変換するためには、セルロースをグルコース単位まで糖化する必要がある。   In order to convert cellulosic biomass into bioethanol, it is necessary to saccharify cellulose to glucose units.

しかし、セルロースは、グルコースがb-1,4結合していることにより、セルロース繊維間が水素結合で強く結合しており簡単には糖化できない、という問題があった。   However, the cellulose has a problem that the cellulose fibers are strongly bonded by hydrogen bonds due to the b-1,4 bonding of glucose and cannot be easily saccharified.

この問題に対して、一般的にはトリコデルマ・リーゼイ菌が産生するセルラーゼが存在する。   In general, cellulases produced by Trichoderma reesei are present for this problem.

セルラーゼを多く産生するトリコデルマ・リーゼイ菌を選択し、さらに糖化する活性を向上するために、特定の種類のセルラーゼを補充することで、セルラーゼの糖化活性を向上している。   Cellulase saccharification activity is improved by selecting Trichoderma reesei bacteria that produce a large amount of cellulase and supplementing a specific type of cellulase in order to improve saccharification activity.

一方、現状では上記セルラーゼでは実用化できるほどの糖化活性が得られていないという問題があった。   On the other hand, there is a problem that the saccharification activity that can be put into practical use has not been obtained with the above cellulase.

この問題に対して、遺伝子工学技術を利用し、骨格タンパク質によりセルラーゼを連結させた酵素複合体、セルロソーム、というタンパク質の構築により、糖化活性を向上する取組みがある（非特許文献１および２）。   In response to this problem, there is an approach to improve saccharification activity by constructing a protein called cellulosome, an enzyme complex in which cellulase is linked by a skeletal protein using genetic engineering technology (Non-patent Documents 1 and 2).

従来の酵素複合体としては、菌体であるサーモビフィダ・フスカやクロストリジウム・サーモセラムが産生するセルロソームがあった。   Conventional enzyme complexes include cellulosomes produced by fungal cells such as Thermobifida fusca and Clostridium thermocellum.

セルロソームは、セルロースを糖化するための酵素活性部位と酵素活性部位を連結する骨格タンパク質部位から構成されている。   Cellulosome is composed of an enzyme active site for saccharifying cellulose and a skeletal protein site that links the enzyme active site.

前述の菌から、酵素活性部位および骨格タンパク質部位の遺伝子配列を抽出し、大腸菌等によりタンパク質を発現する。   The gene sequences of the enzyme active site and the skeletal protein site are extracted from the aforementioned bacteria, and the protein is expressed by Escherichia coli or the like.

上記非特許文献１および２では、発現した酵素活性部位を２つまたは３つ、骨格タンパク質部位により連結させることで、糖化活性を向上させるセルロソームを構築していた。   In the said nonpatent literature 1 and 2, the cellulosome which improves a saccharification activity was constructed | assembled by connecting the expressed enzyme active site by 2 or 3 and a skeleton protein site | part.

特許第４４６９９５９号公報Japanese Patent No. 4469959 特開平１１−２４３９５１号公報JP-A-11-243951 特開２００７−３１４３８７号公報JP 2007-314387 A

Syst Synth Biol (2010) 4:193-201Syst Synth Biol (2010) 4: 193-201 Biotechnol Lett (2009) 31:465-476Biotechnol Lett (2009) 31: 465-476

しかしながら、前記従来の酵素複合体では、実用化できる酵素活性を達成することができていない、活性評価するために遺伝子の抽出からタンパク質の作製までにコストおよび数週間以上の時間がかかる、セルロース糖化後、セルロソームを回収できないためバイオエタノール作製にかかる酵素コストが増加する、といった課題を有していた。   However, in the conventional enzyme complex, the enzyme activity that can be put to practical use has not been achieved, and it takes time and several weeks or more from gene extraction to protein production to evaluate the activity. Later, cellulosomes could not be recovered, and there was a problem that the enzyme cost for bioethanol production increased.

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、従来のセルラーゼを利用し簡便に糖化活性を向上でき、簡易的にセルラーゼを回収することが可能な酵素複合体を提供することを目的とする。   The present invention solves the above-described conventional problems, and an object thereof is to provide an enzyme complex that can easily improve saccharification activity using a conventional cellulase and can easily recover the cellulase. .

前記従来の課題を解決するために、本発明の酵素複合体は、非結晶性セルロースを分解する酵素と、タンパク質と吸着または結合する担体と、を備え、前記担体が磁性を有し、セルロースの糖化を行う。   In order to solve the above-mentioned conventional problems, the enzyme complex of the present invention comprises an enzyme that degrades amorphous cellulose and a carrier that adsorbs or binds to protein, and the carrier is magnetic, Perform saccharification.

本構成によって、セルロースを効率よく糖化し、さらに、担体が磁性を有することでセルラーゼの回収を容易にすることができる。   According to this configuration, cellulose can be efficiently saccharified, and further, the recovery of cellulase can be facilitated because the carrier has magnetism.

本発明の酵素複合体によれば、セルロースを効率よく糖化することができ、さらにセルラーゼの回収を容易にすることができる。   According to the enzyme complex of the present invention, cellulose can be efficiently saccharified and cellulase can be easily recovered.

本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図Configuration diagram of enzyme complex in Embodiment 1 of the present invention 本発明の実施の形態２における酵素複合体の構成図Configuration diagram of enzyme complex in Embodiment 2 of the present invention 従来のセルラーゼのセルロース糖化メカニズムを示す図Diagram showing cellulose saccharification mechanism of conventional cellulase 従来のセルロソームの構成図Configuration diagram of conventional cellulosome 本発明の実施例における糖化活性の向上を示すグラフThe graph which shows the improvement of saccharification activity in the Example of this invention 本発明の実施例における酵素複合体の磁石への吸引を示す図The figure which shows attraction | suction to the magnet of the enzyme complex in the Example of this invention

以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。   Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.

図３は、３つのセルラーゼが共同しながらセルロースをグルコースへ糖化するメカニズムを示す。   FIG. 3 shows the mechanism by which three cellulases cooperate to saccharify cellulose into glucose.

例えば、ａはエンドグルカナーゼであり、ｂはセロビオハイドロラーゼであり、ｃはbグルコシダーゼである。   For example, a is an endoglucanase, b is a cellobiohydrolase, and c is a b glucosidase.

一般的にセルロースはグルコースが１，４−b結合することで直鎖的な結合を有し、それゆえセルロース鎖同士が水素結合により強固に結合している（結晶構造）。   In general, cellulose has a linear bond due to 1,4-b bonding of glucose, and therefore the cellulose chains are strongly bonded by hydrogen bonds (crystal structure).

それゆえ、セルロースは水に不溶で、酵素などで糖化されにくい。   Therefore, cellulose is insoluble in water and is not easily saccharified by enzymes or the like.

しかし、セルロース鎖の一部は非結晶構造となっており、水分子が入り込める構造が存在する。   However, a part of the cellulose chain has an amorphous structure, and there is a structure in which water molecules can enter.

エンドグルカナーゼはその非結晶構造へアタックし、セルロース鎖を切断する。   Endoglucanase attacks to its amorphous structure and cleaves the cellulose chain.

次に、セロビオハイドロラーゼが切断されたセルロース鎖の末端からセルロース鎖をセロビオース単位に分解する。   Next, the cellulose chain is decomposed into cellobiose units from the end of the cellulose chain cleaved by cellobiohydrolase.

最後に、グルコシダーゼがセロビオースを分解することにより、グルコースが生成される。   Finally, glucose is produced by glucosidase degrading cellobiose.

このように、セルロースは主に３種類のセルラーゼによってグルコースに糖化される。   Thus, cellulose is saccharified into glucose mainly by three types of cellulases.

図４は、従来のセルロソームの構成を示した図である。   FIG. 4 is a diagram showing the configuration of a conventional cellulosome.

骨格タンパク質１０５はコヘシンとドックリンというタンパク質から成り、リンカー１０７によりセルラーゼの酵素活性部位１０８、１０９および１１０と結合している。   Skeletal protein 105 is composed of proteins called cohesin and dockrin, and is linked to cellulase enzyme active sites 108, 109, and 110 by a linker 107.

セルロース結合モジュール１０６は、セルロースの表面に結合するタンパク質である。   The cellulose binding module 106 is a protein that binds to the surface of cellulose.

セルロソームは、セルロース結合モジュール１０６によりセルロース表面へ結合し、酵素活性部位１０８、１０９および１１０がセルロースをごく近場にてグルコースへ糖化する。   Cellulosomes are bound to the cellulose surface by the cellulose binding module 106, and the enzyme active sites 108, 109 and 110 saccharify the cellulose into glucose in the immediate vicinity.

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図である。 (Embodiment 1)
FIG. 1 is a configuration diagram of an enzyme complex according to Embodiment 1 of the present invention.

図１において、セルラーゼ１０１、１０２および１０３は、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびβグルコシダーゼまたはそれらに類するセルラーゼのいずれかである。   In FIG. 1, cellulases 101, 102, and 103 are endoglucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase or a similar cellulase.

カーボンナノチューブ１０４は、単層または複層が存在するが、好ましくは単層である。   The carbon nanotube 104 has a single wall or multiple wall, but is preferably a single wall.

カーボンナノチューブ１０４は、ＣＮＴと略されることもある。   The carbon nanotube 104 may be abbreviated as CNT.

ＣＮＴ１０４は、単層または複層であるが、好ましくは単層であることがよい。   The CNT 104 is a single layer or a plurality of layers, but preferably a single layer.

前記セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、物理的に吸着させる。   The solution mixed with the cellulases 101, 102 and 103 and the CNT 104 are mixed and physically adsorbed.

物理的な吸着により、セルラーゼ１０１、１０２および１０３はランダムにＣＮＴ１０４上に吸着する。   Due to physical adsorption, cellulases 101, 102 and 103 are adsorbed on CNT 104 randomly.

セルラーゼ１０１、１０２および１０３がＣＮＴ１０４上にランダムに吸着することにより、図３に示すごとくセルラーゼが共同してセルロースをグルコースに糖化する作用がＣＮＴ１０４上にて連続的に行われ、糖化効率が向上することになる。   Cellulase 101, 102 and 103 are adsorbed randomly on CNT 104, and as shown in FIG. 3, the action of cellulase jointly saccharifying cellulose into glucose is continuously performed on CNT 104, improving saccharification efficiency. It will be.

かかる構成によればセルラーゼ１０１、１０２および１０３がランダムにＣＮＴ１０４上に吸着することにより、セルロース鎖と極めて近い反応場にて接触することとなり、セルロース鎖を連続的にグルコースまで糖化することができるため、糖化効率を向上することができる。   According to this configuration, cellulases 101, 102, and 103 are randomly adsorbed on the CNT 104, so that they come into contact with the cellulose chain in a very close reaction field, and the cellulose chain can be continuously saccharified to glucose. , Saccharification efficiency can be improved.

なお、本実施の形態において、ＣＮＴ１０４とセルラーゼ１０１、１０２および１０３は物理的吸着としたが、ＣＮＴ１０４へ化学的な修飾を施し、セルラーゼを固定化しても良い。   In this embodiment, the CNT 104 and the cellulases 101, 102, and 103 are physically adsorbed, but the CNT 104 may be chemically modified to immobilize the cellulase.

（実施の形態２）
図２は、本発明の実施の形態１の酵素複合体の別の形態を示す図である。 (Embodiment 2)
FIG. 2 is a diagram showing another form of the enzyme complex according to Embodiment 1 of the present invention.

図２において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。   In FIG. 2, the same components as those in FIG.

実施の形態１においては、セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、複合体を形成したが、図２のように、セルラーゼ１０１、１０２および１０３を各々ＣＮＴ１０４と混合し複合体を形成した後、混在させてもよい。   In Embodiment 1, a solution in which cellulases 101, 102, and 103 are mixed with CNT 104 is mixed to form a complex. However, as shown in FIG. 2, cellulases 101, 102, and 103 are mixed with CNT 104 to form a complex. You may mix after forming.

（実施例）
セルラーゼ１０１，１０２および１０３の混合溶液として、セルラーゼ（シグマアルドリッチ社製、品番C8546）を用いた。 (Example)
Cellulase (manufactured by Sigma-Aldrich, product number C8546) was used as a mixed solution of cellulases 101, 102 and 103.

ＣＮＴ１０４として、単層カーボンナノチューブ（ＫＨケミカル社製）およびラテックスビーズ（Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。   As the CNT 104, single-walled carbon nanotubes (manufactured by KH Chemical) and latex beads (Duke Scientific Corporation) were used.

反応溶液として、ｐＨ５．０のクエン酸バッファーを用いた。   A citrate buffer having a pH of 5.0 was used as a reaction solution.

セルロースとして、ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１（シグマアルドリッチ社製）を用いた。   AvicelPH-101 (manufactured by Sigma Aldrich) was used as the cellulose.

濃度が２ｍｇ/ｍＬおよび体積パーセントで２０％となるように、セルラーゼおよびＣＮＴを調製し、室温において一晩揺動混合しながら、セルラーゼとＣＮＴを吸着させた。   Cellulase and CNT were prepared so as to have a concentration of 2 mg / mL and 20% in volume percent, and the cellulase and CNT were adsorbed while shaking and mixing overnight at room temperature.

セルロースを２ｇ/ｍＬとなるように調整し、セルラーゼ・ＣＮＴ混合溶液を等量ずつ（５００ｕＬ：５００ｕＬ）混合し、３７度において１時間糖化反応した。   Cellulose was adjusted to 2 g / mL, and the cellulase / CNT mixed solution was mixed in equal amounts (500 uL: 500 uL), and saccharified at 37 ° C. for 1 hour.

反応溶液に含まれるセルラーゼを失活するため、９８度にて１５分間、反応溶液を熱処理した。   In order to deactivate the cellulase contained in the reaction solution, the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 15 minutes.

反応溶液の上澄みを回収するため、反応溶液を１．５ｍＬチューブに入れ、12,500rpmで１０分間遠心した。   In order to collect the supernatant of the reaction solution, the reaction solution was placed in a 1.5 mL tube and centrifuged at 12,500 rpm for 10 minutes.

さらに、上澄みを０．２ｕｍフィルターへ通し、通った上澄みを用いて含まれるグルコース量を測定した。   Further, the supernatant was passed through a 0.2 um filter, and the amount of glucose contained was measured using the passed supernatant.

グルコース量の測定には、グルコースアッセイキット（フナコシ社）を用い、プロトコールに従って行った。   The glucose amount was measured using a glucose assay kit (Funakoshi) according to the protocol.

図５に、測定結果を示した。   FIG. 5 shows the measurement results.

ラテックスビーズでは、コントロール（cont.）と同程度のグルコース生産量であるのに対し、ＣＮＴでは最大で２．４倍量のグルコースが産生されていることがわかった。   It was found that the latex beads produced the same amount of glucose as the control (cont.), Whereas the CNT produced 2.4 times the maximum amount of glucose.

図６に、ＣＮＴとセルラーゼの複合体と磁石（ネオジウム）の相互作用を示した。   FIG. 6 shows the interaction between a complex of CNT and cellulase and a magnet (neodymium).

セルラーゼが吸着したＣＮＴが、ネオジウム磁石へ吸引されている様子が確認された。   It was confirmed that CNT adsorbed with cellulase was attracted to a neodymium magnet.

本発明にかかる酵素複合体は、担体にランダムに結合した３つ、もしくはそれ以上のセルラーゼを有し、さらに担体が磁性を有することで磁石による回収を可能とし、セルロース系バイオマスからバイオエタノールを生産する等においてコスト削減の手段として有用である。セルロースを含むゴミの削減等の用途にも応用できる。   The enzyme complex according to the present invention has three or more cellulases randomly bound to a carrier, and the carrier is magnetic so that it can be recovered by a magnet and produce bioethanol from cellulosic biomass. This is useful as a means for reducing costs. It can also be applied to uses such as reduction of waste containing cellulose.

１０１ セルラーゼの１種
１０２ セルラーゼの１種
１０３ セルラーゼの１種
１０４ カーボンナノチューブ
１０５ 骨格タンパク質
１０６ セルロースバインディングモジュール
１０７ リンカー
１０８ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１０９ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１１０ ある種のセルラーゼの触媒活性部位 101 One Cellulase 102 One Cellulase 103 One Cellulase 104 Carbon Nanotube 105 Skeletal Protein 106 Cellulose Binding Module 107 Linker 108 Catalytic Active Site of Some Cellulases 109 Catalytic Active Site of Some Cellulases 110 Some Cellulases Catalytic active site

Claims (3)

非結晶性セルロースを分解する酵素と、
タンパク質と吸着または結合する担体と、
を備え、
前記担体が磁性を有した酵素複合体。 An enzyme that degrades amorphous cellulose;
A carrier that adsorbs or binds to the protein;
With
An enzyme complex in which the carrier has magnetism. 前記酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼまたはそれらに類する酵素であり、また、それらの混合物であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。   The enzyme complex according to claim 1, wherein the enzyme is endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, or an enzyme similar to these, or a mixture thereof. 前記担体が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。 The enzyme complex according to claim 1, wherein the carrier is a carbon nanotube (CNT).

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