JP2013076691A - Fatigue biomarker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とした疲労の判定方法に関する。 The present invention relates to a fatigue determination method using the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample as an index.
疲労は日常生活の中で、誰もが感じる一般的な感覚である。多忙を極める現代社会において、疲労の蓄積を事前に回避するような環境下で生活することは、困難な状況にある。このような生活環境を考慮すると、回復困難な疲労状態に陥る前に適切な疲労対策を講じるということが、ＱＯＬを維持する上で、重要なポイントとなる。 Fatigue is a common sensation that everyone feels in daily life. In today's busy society, it is difficult to live in an environment that avoids the accumulation of fatigue in advance. In consideration of such a living environment, taking an appropriate fatigue measure before falling into a difficult-to-recovery fatigue state is an important point in maintaining QOL.
個人の疲労状態に合わせた適切な疲労対策を講じるためには、疲労の程度を客観的に把握することが重要である。疲労の程度を判定する方法については公的な対策も推進されており、広く知られている公的対策の一つとしては、睡眠の時間や質、労働時間、疲労感や抑うつ感などの項目からなる簡易な自己判断方法（労働者の疲労蓄積度チェックリストなど）が挙げられる（非特許文献１）。また、栄養素、サイトカインやその受容体、さらには細胞内シグナル伝達機構などの研究成果を活用し、疲労の程度を客観的に判定するための方法の開発が試みられている（非特許文献２）。例えば、血液中の複数のアミノ酸（特許文献１）、ＴＧＦ-β（特許文献２）、唾液中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）の遺伝子の発現量（特許文献３）、コルチゾール、副腎性ホルモン又はそれらの代謝物、クロモグラニンＡ、モノアミン類、尿中のイソプラスタン、８-ハイドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の測定が挙げられる。しかしながら上記の疲労判定方法で用いられる物質、例えばイソプラスタンや８−ＯＨｄＧは、疲労だけでなく糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病とも密接に関係しており、疲労特異的に相関性を示す物質とは言い難い。そのため、日常生活における疲労のバイオマーカーとして使用するには課題が残されている。疲労の回復を促進するような医薬品等を簡便かつ適正に評価するためにも、客観的かつ疲労特異的に疲労の程度を評価できるバイオマーカーを見出すことが求められている。 It is important to objectively grasp the degree of fatigue in order to take appropriate fatigue measures that are tailored to the individual's fatigue state. Public measures are being promoted to determine the degree of fatigue, and one of the well-known public measures is items such as sleep time and quality, working hours, feeling of fatigue and depression A simple self-judgment method (such as a worker fatigue accumulation check list) is included (Non-Patent Document 1). Further, development of a method for objectively determining the degree of fatigue has been attempted by utilizing research results such as nutrients, cytokines and their receptors, and intracellular signal transduction mechanisms (Non-patent Document 2). . For example, a plurality of amino acids in blood (Patent Document 1), TGF-β (Patent Document 2), expression level of human herpesvirus type 6 (HHV-6) gene in saliva (Patent Document 3), cortisol, adrenal gland Examples include sex hormones or metabolites thereof, chromogranin A, monoamines, urinary isoplastane, and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG). However, substances used in the above-described fatigue determination methods, such as isoplastane and 8-OHdG, are closely related not only to fatigue but also to lifestyle-related diseases such as diabetes and arteriosclerosis, and show a fatigue-specific correlation. It is hard to say that it is a substance. Therefore, the subject remains to be used as a biomarker of fatigue in daily life. In order to easily and appropriately evaluate pharmaceuticals that promote recovery from fatigue, it is necessary to find a biomarker that can objectively and fatigue-specifically evaluate the degree of fatigue.
疲労の状態、あるいは疲労の回復度合いを簡便かつ適正に評価できなければ、疲労の回復促進に有効な医薬品等の評価が的確になし得ず、疲労の回復に有効な医薬品等の開発にも支障を生じることとなる。 If the state of fatigue or the degree of recovery from fatigue cannot be evaluated easily and appropriately, it will not be possible to accurately evaluate pharmaceuticals that are effective in promoting fatigue recovery, and this will hinder the development of pharmaceuticals that are effective in recovering from fatigue. Will result.
そこで、本発明の課題は、客観的に疲労を測定できる評価方法を提供することを解決すべき課題とした。 Then, the subject of this invention made it the subject which should be solved to provide the evaluation method which can measure fatigue objectively.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼを指標として疲労を客観的に測定しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that fatigue can be objectively measured using eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample as an index, and the present invention is completed. It came.
かかる本発明の態様は、次のとおりである。
（１）生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とした疲労の判定方法。
（２）生体試料が、血液又は肝臓又は筋肉である前記（１）に記載の疲労の判定方法。
（３）疲労が、肉体疲労である前記（１）から（２）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
（４）好酸球由来リボヌクレアーゼが、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）又は好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）である前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
（５）好酸球由来リボヌクレアーゼが、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３又はそれらのホモログである前記（１）から（４）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
Such embodiments of the present invention are as follows.
(1) A fatigue determination method using the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample as an index.
(2) The fatigue determination method according to (1), wherein the biological sample is blood, liver, or muscle.
(3) The method for determining fatigue according to any one of (1) to (2), wherein the fatigue is physical fatigue.
(4) The determination of fatigue according to any one of (1) to (3), wherein the eosinophil-derived ribonuclease is eosinophil cationic protein (ECP) or eosinophil-derived neurotoxin (EDN). Method.
(5) The fatigue determination method according to any one of (1) to (4), wherein the eosinophil-derived ribonuclease is RNASE2, RNASE3, or a homologue thereof.
走行運動負荷により疲労状態にさせたマウスの生体試料において、非疲労状態と比較して発現増加が認められる遺伝子としてＥａｒ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）遺伝子群を見出した。これら遺伝子群のうち、顕著な発現上昇が認められたＥａｒ１１と近縁のＥａｒ５に焦点をあて検討したところ、被験物質（抗疲労物質）を投与したマウスでは、走行運動負荷を行っても上記のようなＥａｒ１１、Ｅａｒ５遺伝子の発現量の上昇は認められなかった。 An ear (eosinophil-associated ribonuclease) gene group was found as a gene in which increased expression was observed in a biological sample of a mouse that had been fatigued by running exercise load as compared to a non-fatigue state. Among these gene groups, studies were conducted focusing on Ear11 and closely related Ear5, in which a marked increase in expression was observed. In mice administered with the test substance (anti-fatigue substance), the above-mentioned effects were observed even when running exercise load was applied. Such an increase in the expression level of the Ear11 and Ear5 genes was not observed.
本発明の疲労の判定方法としては，疲労の程度を判定する方法のみならず、本発明を用いた被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、あるいは本方法を用いた疲労判定試薬又は疲労判定キットも含むが、これらに限ったものではない。 As a method for determining fatigue according to the present invention, not only a method for determining the degree of fatigue, but also a method for determining the effectiveness of a test substance against fatigue using the present invention, a substance that can recover, improve, or prevent fatigue is searched. Including, but not limited to, a fatigue determination reagent or fatigue determination kit using the method.
本発明で用いる生体試料の起源（被験体）としては、好ましくは哺乳動物であり、ヒトである事が特に好ましい。生体試料としては、血液、唾液、***などの体液、肝臓、心筋、骨格筋などの組織や細胞が挙げられる。これらの試料は、倫理的な問題が生じないように採血、採取又はバイオプシーなどにより、被験体から分離されることが望ましい。好ましくは、生体試料が血液又は肝臓又は筋肉であり、特に好ましくは血液である。 The origin (subject) of the biological sample used in the present invention is preferably a mammal, and particularly preferably a human. Examples of biological samples include body fluids such as blood, saliva, and semen, and tissues and cells such as liver, heart muscle, and skeletal muscle. These samples are preferably separated from the subject by blood collection, collection or biopsy so as not to cause ethical problems. Preferably, the biological sample is blood or liver or muscle, particularly preferably blood.
本発明における「疲労」とは、肉体疲労、身体疲労、筋肉疲労、運動疲労、精神疲労などであり、身体に負荷を与える作業（身体作業）により末梢組織（肝臓、心筋、骨格筋など）が疲労することに起因する肉体疲労（身体作業による肉体疲労）などが特に好ましい。ここで言う「身体作業」には、産業活動における労働作業のみでなく、日常生活における作業や運動、走行、自転車こぎ、階段の昇降などの動作も含む。疲労した状態とは、例えば、身体作業あるいは精神作業などにより、身体あるいは精神に負荷を与えた際に生じる作業効率（パフォーマンス）が低下した状態を示す。疲労の程度（疲労度）とは、上記疲労した状態の程度（度合い）を意味し、パフォーマンスの低下等の指標で表すことも可能である。 “Fatigue” in the present invention is physical fatigue, physical fatigue, muscle fatigue, exercise fatigue, mental fatigue, etc., and peripheral tissues (liver, heart muscle, skeletal muscle, etc.) are affected by work (physical work) that applies a load to the body. Physical fatigue (physical fatigue due to physical work) resulting from fatigue is particularly preferable. The “physical work” referred to here includes not only labor work in industrial activities, but also work such as work and exercise in daily life, running, cycling, and climbing up and down stairs. The fatigued state refers to a state in which work efficiency (performance) that occurs when a load is applied to the body or mind due to, for example, physical work or mental work is reduced. The degree of fatigue (fatigue degree) means the degree (degree) of the above-mentioned fatigued state, and can also be expressed by an index such as a decrease in performance.
本発明における「好酸球由来リボヌクレアーゼ」とは、ウイルスや細菌に感染した際に好酸球から脱顆粒される好酸球顆粒タンパク質のうち、リボヌクレアーゼ活性を示すタンパク質で、ヒトではＥＣＰとＥＤＮを示す。 The “eosinophil-derived ribonuclease” in the present invention is a protein showing ribonuclease activity among eosinophil granule proteins degranulated from eosinophils when infected with viruses or bacteria. In humans, ECP and EDN are expressed. Show.
本発明の好酸球由来リボヌクレアーゼは、タンパク質そのものばかりでなく、好酸球由来リボヌクレアーゼをコードする遺伝子も含まれる。 The eosinophil-derived ribonuclease of the present invention includes not only the protein itself but also a gene encoding eosinophil-derived ribonuclease.
本発明におけるＥＣＰはＲＮＡＳＥ３遺伝子によりコードされる。一方、ＥＤＮはＲＮＡＳＥ２遺伝子によりコードされる。 The ECP in the present invention is encoded by the RNASE3 gene. On the other hand, EDN is encoded by the RNASE2 gene.
本発明における好酸球由来リボヌクレアーゼは、ヒト、ゴリラ、チンパンジーなどの霊長類ばかりでなく、マウス、ラットなどのげっ歯類からも同定されており、マウスではＥａｒ遺伝子群によってコードされる。ここでＥａｒ遺伝子群とは、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、Ｅａｒ６、Ｅａｒ７、Ｅａｒ１、Ｅａｒ８、Ｅａｒ１０、Ｅａｒ９、Ｅａｒ２、Ｅａｒ３、Ｅａｒ４、Ｅａｒ１４を示し、中でもＥａｒ１１はＲＮＡＳＥ２と、Ｅａｒ５はＲＮＡＳＥ３と相同性が高い。 The eosinophil-derived ribonuclease in the present invention has been identified not only from primates such as humans, gorillas and chimpanzees, but also from rodents such as mice and rats, and is encoded by the Ear gene group in mice. Here, the Ear gene group indicates Ear11, Ear5, Ear6, Ear7, Ear1, Ear8, Ear10, Ear9, Ear2, Ear3, Ear4, and Ear14. Among them, Ear11 has high homology with RNASE2, and Ear5 has high homology with RNASE3.
本発明における「遺伝子」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれもでもよく、ゲノムＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃＲＮＡ及びｃＤＮＡなども含むものであり、全長遺伝子のみでなく、その一部を含む遺伝子（ＥＳＴ）でもよい。 The “gene” in the present invention may be either DNA or RNA, and includes not only genomic DNA but also mRNA, aRNA, cRNA, cDNA, and the like. (EST) may be used.
ここで言う「その一部を含む遺伝子」とは、ハイブリダイズする際に十分な配列長を有するものであれば、その長さは特に限定されないが、好ましくは少なくとも１０塩基以上である。また、遺伝子には、塩基配列又はアミノ酸配列などによって特定される遺伝子、例えば、塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズする遺伝子が含まれる。 The “gene including a part thereof” as used herein is not particularly limited as long as it has a sufficient sequence length for hybridization, but is preferably at least 10 bases or more. Further, the gene includes a gene that hybridizes with a gene specified by a base sequence or an amino acid sequence, for example, a gene having a base sequence complementary to the base sequence.
本発明における「ホモログ」とは、対象となる遺伝子又はタンパク質と、塩基配列又はアミノ酸配列において、高い相同性を有しており、その相同性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。「ホモログ」がタンパク質として存在する場合には、上記塩基配列又はアミノ酸配列の相同性に加えて、対象となるタンパク質と同様の生物学的機能を有することが好ましい。本発明における生物学的機能としては、例えば「リボヌクレアーゼ活性」が挙げられる。 The “homolog” in the present invention has a high homology with the target gene or protein in the base sequence or amino acid sequence, and the homology is at least 50% or more, preferably 60% or more. Preferably it is 70% or more, More preferably, it is 80% or more, More preferably, it is 90% or more, Most preferably, it is 95% or more. When a “homolog” exists as a protein, it preferably has the same biological function as the target protein in addition to the homology of the base sequence or amino acid sequence. Examples of the biological function in the present invention include “ribonuclease activity”.
本発明で用いる遺伝子又はタンパク質は、少なくともヒト、マウス又はラットにて公知の遺伝子又はタンパク質であり、その塩基配列又はアミノ酸配列は公知であり、当業者に利用可能なものである。これら遺伝子又はタンパク質は、Ｔｈｅ ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ （ＨＧＮＣ）、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースに登録されており、これらのデータベースにおいて遺伝子シンボル、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ（ＥＧＩＤ）、ＨＧＮＣ ＩＤ、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）又はアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｏｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）などによって容易に塩基配列又はアミノ酸配列などの情報を入手する事ができる。これら遺伝子又はタンパク質のいくつかは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）、ＢｉｏＣａｒｔａ、ＧｅｎＭＡＰＰなどのパスウェイデータベースや遺伝子オントコロジー（ＧＯ）データベースにも登録されており、機能的情報を容易に得ることもできる。 The gene or protein used in the present invention is a gene or protein known at least in humans, mice or rats, and its base sequence or amino acid sequence is known and can be used by those skilled in the art. These genes or proteins are registered in databases such as The HUGO Gene Nomenclature (HGNC), National Center for Biotechnology Information (NCBI), European Institute for Molecular Biology (EMBL), Japan DNA Data Bank (DDBJ), etc. In these databases, information such as base sequences or amino acid sequences can be easily obtained by gene symbols, Entrez GeneID (EGID), HGNC ID, Mouse Genome Informations (MGI), or accession numbers (Accession numbers). Some of these genes or proteins are also registered in pathway databases and gene ontology (GO) databases such as KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), BioCarta, and GenMAPP, and functional information can be easily obtained. it can.
本発明の方法においては、好ましくは以下に記載した１個以上の遺伝子又はそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子の発現量の変動を分析及び／又は比較する。 In the method of the present invention, preferably, variation in the expression level of at least one gene selected from one or more genes described below or homologous genes thereof is analyzed and / or compared.
本発明における、好ましい特定の遺伝子としては、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、Ｅａｒ６、Ｅａｒ７、Ｅａｒ１、Ｅａｒ８、Ｅａｒ１０、Ｅａｒ９、Ｅａｒ２、Ｅａｒ３、Ｅａｒ４、Ｅａｒ１４及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
より好ましくは、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
さらに好ましい特定の遺伝子としては、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
In the present invention, preferable specific genes are at least one selected from RNASE2, RNASE3, Ear11, Ear5, Ear6, Ear7, Ear1, Ear8, Ear10, Ear9, Ear2, Ear3, Ear4, Ear14 and homologous genes thereof. It is a gene.
More preferably, it is at least one gene selected from RNASE2, RNASE3, Ear11, Ear5, and homologous genes thereof.
Further preferred specific genes are at least one gene selected from RNASE2, RNASE3, and homologous genes thereof.
以下の遺伝子（括弧内にはアクセッション番号を併記する）の塩基配列をそれぞれ、配列表の配列番号１から１４に記載する。
RNASE2（NM_002934.2）配列番号１
RNASE3（NM_002935.2）配列番号２
Ear11（NM_053113.2）配列番号３
Ear5（NM_019398.2）配列番号４
Ear6（NM_053111.2）配列番号５
Ear7（NM_017385.1）配列番号６
Ear１（NM_007894.2）配列番号７
Ear8（AF238404.1）配列番号８
Ear10（AF512014.1）配列番号９
Ear9（AF238426.1）配列番号１０
Ear2（NM_007895.2）配列番号１１
Ear3（NM_017388.1）配列番号１２
Ear4（NM_001017422.1）配列番号１３
Ear14（NM_017389.2）配列番号１４
The base sequences of the following genes (with accession numbers in parentheses) are described in SEQ ID NOS: 1 to 14 in the sequence listing, respectively.
RNASE2 (NM_002934.2) SEQ ID NO: 1
RNASE3 (NM_002935.2) SEQ ID NO: 2
Ear11 (NM_053113.2) SEQ ID NO: 3
Ear5 (NM_019398.2) SEQ ID NO: 4
Ear6 (NM_053111.2) SEQ ID NO: 5
Ear7 (NM_017385.1) SEQ ID NO: 6
Ear1 (NM_007894.2) SEQ ID NO: 7
Ear8 (AF238404.1) SEQ ID NO: 8
Ear10 (AF512014.1) SEQ ID NO: 9
Ear9 (AF238426.1) SEQ ID NO: 10
Ear2 (NM_007895.2) SEQ ID NO: 11
Ear3 (NM_017388.1) SEQ ID NO: 12
Ear4 (NM_001017422.1) SEQ ID NO: 13
Ear14 (NM_017389.2) SEQ ID NO: 14
本発明における「好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量」とは、遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量のいずれでもよい。 The “expression level of eosinophil-derived ribonuclease” in the present invention may be either a gene expression level or a protein expression level.
遺伝子の発現量を測定する方法としては、例えば、当該遺伝子を認識するプライマーを用いた遺伝子の増幅手法が挙げられる。ここで使用する遺伝子にはｍＲＮＡのみでなく、ＲＮＡから調整されたｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はａＲＮＡも含まれる。測定のためには先ずｍＲＮＡを抽出するが、ＲＮＡは、当該分野で公知の方法によって抽出してもよいし、市販のキットを用いて行ってもよい。「プライマーを用いた遺伝子の増幅手法」としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した方法（ＰＣＲ法、Ｑ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などを挙げることができる。これらの増幅手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。 Examples of a method for measuring the expression level of a gene include a gene amplification method using a primer that recognizes the gene. The gene used here includes not only mRNA but also cRNA, cDNA or aRNA prepared from RNA. For measurement, mRNA is first extracted, but RNA may be extracted by a method known in the art or may be performed using a commercially available kit. The “amplification method of a gene using a primer” is not particularly limited, but a method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method (PCR method, Q-PCR method, RT-PCR method, etc.), LAMP method, Examples include the ICAN method. The conditions and methods of these amplification techniques are known to those skilled in the art, and can be set as appropriate by those skilled in the art.
遺伝子の発現量を測定する他の方法としては、当該遺伝子を認識するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法やノーザンハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。これらのハイブリダイゼーション手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。 Examples of other methods for measuring the expression level of a gene include a Southern hybridization method and a Northern hybridization method using a probe that recognizes the gene. Conditions and methods for these hybridization techniques are known to those skilled in the art, and can be set as appropriate by those skilled in the art.
タンパク質の発現量を測定する方法としては、当該タンパク質を認識する抗体等を利用する方法などがある（ウェスタンブロッティング法など）。ここで使用する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでもよく、市販の抗体を用いてもよい。また、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって作製することができる。これらの抗体は修飾されていてもよい。 As a method for measuring the expression level of a protein, there is a method using an antibody or the like that recognizes the protein (Western blotting method or the like). The antibody used here may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or a commercially available antibody. Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by methods well known in the art. These antibodies may be modified.
タンパク質の発現量を測定する他の方法としては、タンパク質の活性を測定してもよい。本発明では、「好酸球由来リボヌクレアーゼ活性」を当業者に公知の方法に基づき測定することが可能である。 As another method for measuring the expression level of the protein, the activity of the protein may be measured. In the present invention, “eosinophil-derived ribonuclease activity” can be measured based on a method known to those skilled in the art.
タンパク質の発現量を測定する他の方法として、二次元電気泳動、ＬＣ／ＭＳ質量分析法、クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡなどの方法も使用可能であり、特に限定されない。 Other methods for measuring protein expression levels include two-dimensional electrophoresis, LC / MS mass spectrometry, chromatography, nuclear magnetic resonance spectroscopy, immunoprecipitation, ELISA, etc., and are not particularly limited. .
遺伝子やタンパク質の発現量は、必要に応じて、疲労の状態の有無において発現量がほとんど変動しない遺伝子又はタンパク質（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現量に基づいて補正することができる。「ハウスキーピング遺伝子」としては、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）やβ−アクチン（ＡＣＴＢ）などを挙げることができる。 The expression level of a gene or protein can be corrected as necessary based on the expression level of a gene or protein (for example, a housekeeping gene) whose expression level hardly fluctuates in the presence or absence of a fatigue state. Examples of the “housekeeping gene” include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and β-actin (ACTB).
本発明においては、疲労の程度が未知である被験体由来の生体試料における、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とすることによって”疲労の程度”を判定する。具体的には、疲労の程度が未知である被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量が非疲労の状態の被験体由来の生体試料（健常対照体）における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量と比較して増加している場合に、当該被験体が疲労の状態であると判定することができる。 In the present invention, the “degree of fatigue” is determined by using the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from a subject whose degree of fatigue is unknown as an index. Specifically, eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from a subject in which the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from a subject whose degree of fatigue is unknown is not fatigued (healthy control). It can be determined that the subject is in a fatigued state when the amount is increased compared to the expression level of.
好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の“増加”又は“減少”の判断をする際には、例えば、一定の倍率をもって“増加”又は“減少”と判断するＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ比較の方法により判断する方法が好ましい。例えば、一定の倍率を「１．５倍」とした場合には、ある被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量が非疲労の状態の被験体由来の生体試料（健常対照体）における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量と比較して１．５倍以上増加（５０％以上増加）又は減少（５０％以上減少）している場合に、“増加”又は“減少”と判断し、当該被験体は疲労の状態であると判定することができる。一定の倍率は１．５倍以上が好ましいが、特には限定されない。 When determining “increase” or “decrease” in the expression level of eosinophil-derived ribonuclease, for example, there is a method of determining by the method of Fold Change comparison that determines “increase” or “decrease” at a certain magnification. preferable. For example, when the fixed magnification is “1.5 times”, a biological sample derived from a subject in which the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from a subject is non-fatigue (a healthy control subject) ) If the expression level of eosinophil-derived ribonuclease is increased by 1.5 times or more (increased by 50% or more) or decreased (decreased by 50% or more), it is judged as “increase” or “decrease”. The subject can be determined to be in a fatigued state. The constant magnification is preferably 1.5 times or more, but is not particularly limited.
また、統計的処理によって好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の“増加”又は“減少”の判断をすることも可能である。例えば、ｔ−検定（２群の場合）、分散分析（３群以上の場合）、多変量解析、クラスタリング、判別分析などの方法、回帰直線を求める方法、相関係数を求める方法など、公知の方法が広く知られている。これらの統計的処理における基準の設定は、当業者であれば、適宜行うことができる。 It is also possible to determine “increase” or “decrease” in the expression level of eosinophil-derived ribonuclease by statistical processing. For example, known methods such as t-test (in the case of two groups), analysis of variance (in the case of three or more groups), multivariate analysis, clustering, discriminant analysis, a method for obtaining a regression line, a method for obtaining a correlation coefficient, etc. The method is widely known. Those skilled in the art can appropriately set the standard in these statistical processes.
本発明によれば、被験体に被験物質を投与し、当該被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の変動を測定することによって、当該被験物質の疲労に対する有効性（効果）を判定することができる。被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法としては、例えば、疲労の状態である被験体において、被験物質の投与前と投与後に好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を比較し、薬物投与により発現量が減少している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。また、被験物質を投与する前に、疲労の状態である被験体を被験物質投与群と被験物質非投与群に分け、これらの群における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を比較し、被験物質を投与した群の発現量が、被験物質を投与しなかった群の発現量より減少している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。被験体への被験物質の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれでもよく、身体作業による身体への負荷と組み合わせる場合は、被験物質の特性に応じて、身体作業の前でも後でもよく、前後でもよく、投与の時期は特に限定されない。細胞培養培地への被験物質の添加においても、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を変動させる処置の前でも後でもよく、前後に添加してもよい。 According to the present invention, a test substance is administered to a subject, and the fluctuation (efficacy) of the test substance against fatigue is measured by measuring a change in the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from the subject. Can be determined. As a method for determining the effectiveness of a test substance against fatigue, for example, in a subject in fatigue, the expression level of eosinophil-derived ribonuclease is compared before and after administration of the test substance, and the expression level is determined by drug administration. Can be determined to be effective against fatigue. Also, before administering the test substance, divide the subject in fatigue into a test substance administration group and a test substance non-administration group, compare the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in these groups, When the expression level of the administered group is lower than the expression level of the group not administered with the test substance, it can be determined that the test substance is effective against fatigue. Administration of the test substance to the subject may be either oral or parenteral, and when combined with physical stress due to physical work, it may be before or after physical work, depending on the characteristics of the test substance, It may be before or after, and the timing of administration is not particularly limited. The test substance may be added to the cell culture medium either before or after the treatment for changing the expression level of eosinophil-derived ribonuclease, or before or after the treatment.
本発明においては、疲労状態の被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を減少させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することによって、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索することができる。 In the present invention, a test substance is administered to a subject in fatigue, and a substance that decreases the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in a biological sample derived from the subject is a candidate substance that can recover, improve, or prevent fatigue. By selecting, it is possible to search for substances that can recover, ameliorate, or prevent fatigue.
本発明によれば、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を測定し疲労の程度を判定するための疲労判定試薬又は疲労判定キットが提供される。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、好酸球由来リボヌクレアーゼに特異的な抗体などが含まれている。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、更に所望により、標識、標識二次抗体、担体、サンプル希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質、リン脂質酸化体及び／又はその代謝物の発現量や特徴などから疲労の程度を判定するための資料などを含めてもよい。さらに必要に応じて、洗浄バッファー、保存剤、防腐剤などを加えることもできる。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットに含まれる抗体などは、１種のみでもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。これらは、固体でも液体でもよく、単一又複数の固相上に固定されているもの、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレートに個別に分注された状態となっていてもよい。本発明にかかる疲労判定キットは、被験体の血液などの生体試料を採取するための手段を含んでいてもよい。また、疲労判定キットの包装材に付されたラベル又は添付された文書に、生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標として被験体の疲労の程度を判定するために使用できることを表示していてもよい。さらに、本発明にかかる疲労判定キットは、コンピューターなどの従来公知の演算装置を用いてなるキットとなっていてもよい。 According to the present invention, a fatigue determination reagent or fatigue determination kit for measuring the expression level of eosinophil-derived ribonuclease and determining the degree of fatigue is provided. The fatigue determination reagent or fatigue determination kit of the present invention includes an antibody specific for eosinophil-derived ribonuclease. The fatigue determination reagent or fatigue determination kit of the present invention further includes a label, a labeled secondary antibody, a carrier, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, a standard substance, a phospholipid oxidant and / or a metabolite thereof, as desired. Materials for determining the degree of fatigue based on the expression level and characteristics of can be included. Further, a washing buffer, preservative, preservative and the like can be added as necessary. Only one type of antibody or the like contained in the fatigue determination reagent or fatigue determination kit of the present invention may be used, or two or more types may be combined. These may be solid or liquid, and may be individually dispensed on a plate fixed on a single or a plurality of solid phases, for example, a microtiter plate. The fatigue determination kit according to the present invention may include means for collecting a biological sample such as blood of a subject. In addition, the label attached to the packaging material of the fatigue determination kit or the attached document indicates that it can be used to determine the degree of fatigue of the subject using the expression level of eosinophil-derived ribonuclease in the biological sample as an index. It may be. Furthermore, the fatigue determination kit according to the present invention may be a kit using a conventionally known arithmetic device such as a computer.
本発明においては、好酸球由来リボヌクレアーゼを疲労のバイオマーカー（生物学的指標）として用いることができる。「バイオマーカー」とは、例えば、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性である。即ち、正常なプロセスや病的プロセス、あるいは治療に対する薬理学的な反応の指標として客観的に測定・評価される項目であり、治癒の程度を特徴づけるバイオマーカーは新薬の臨床試験での有効性を確認するためのサロゲートマーカーとして使われる項目である。バイオマーカーは、疾患にかかった後の治療効果の判定だけでなく、疾患を未然に防ぐための日常的な指標として疾患の予防にも用いることができる。 In the present invention, eosinophil-derived ribonuclease can be used as a fatigue biomarker (biological indicator). A “biomarker” is a characteristic that is objectively measured and evaluated, for example, as an indicator of a normal biological process, pathological process, or pharmacological response to a therapeutic intervention. In other words, it is an item that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal or pathological processes, or pharmacological responses to treatment, and biomarkers that characterize the degree of healing are effective in clinical trials of new drugs This item is used as a surrogate marker for confirming. The biomarker can be used not only for the determination of the therapeutic effect after getting a disease, but also for the prevention of a disease as a daily indicator for preventing the disease in advance.
以下に試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。
試験例１ 抗疲労物質の作用評価
＜方法＞
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群８匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動を負荷し、走行不能となる第１限界走行速度を算出した。その後、休憩時間を４時間挟み、再度、同じ条件にて、走行運動を負荷し、走行不能となる第２限界走行速度を算出した。
被験物質（タウリン）は走行運動試験の前日まで１日１回で２１日間の連続投与を行った（３００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）。走行運動試験当日は、１度目の走行運動試験終了直後に投与した。
＜結果＞
第１限界走行速度に対する第２限界走行速度の低下率を算出した結果、対照群（タウリン非投与群）では休憩時間４時間のときの第２限界走行速度の低下率は１６．４％であった。一方、タウリン投与群では第２限界走行速度の低下率は６．３％であり、有意な低下率の抑制、すなわちパフォーマンスの低下の改善が認められ、抗疲労効果が確認された。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to test examples.
Test Example 1 Anti-fatigue substance action evaluation <Method>
The inclination angle of the treadmill apparatus (manufactured by Panlab) was set to 10 °, and BALB / c male mice (Japan SLC, 8 mice per group) were gradually increased from 5 cm every 4 minutes from 15 cm / s. The first limit traveling speed at which the traveling becomes impossible is calculated by applying a traveling motion to the vehicle. Thereafter, a break time was sandwiched for 4 hours, and again, under the same conditions, a running exercise was loaded, and the second limit running speed at which running was impossible was calculated.
The test substance (taurine) was administered continuously for 21 days once a day until the day before the running exercise test (300 mg / kg, po). On the day of the running exercise test, administration was performed immediately after the end of the first running exercise test.
<Result>
As a result of calculating the decrease rate of the second limit travel speed with respect to the first limit travel speed, the decrease rate of the second limit travel speed at the rest time of 4 hours in the control group (taurine non-administered group) was 16.4%. It was. On the other hand, in the taurine-administered group, the rate of decrease in the second limit running speed was 6.3%, and a significant suppression of the rate of decrease, that is, an improvement in performance was observed, confirming the anti-fatigue effect.
試験例２ 遺伝子発現量の変化（ＤＮＡマイクロアレイ）
＜方法＞
行った試験は、（１）走行運動の負荷、（２）組織の採取、（３）ＲＮＡの抽出、（４）遺伝子の発現量の分析及び比較、の工程よりなる。
（１）走行運動の負荷
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群４匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動をさせ、疲労を負荷した。
（２）組織の採取
走行運動負荷群は、走行４時間後に深麻酔条件下で腹部大静脈から血液を１ｍＬ採取した。採取した血液には、ヌクレアーゼ不含水１ｍＬを添加し、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ(ニッポンジーン)２ｍＬを添加し、血液を溶解した。血液を採取したマウスを安楽死処置後、肝臓及び腓腹筋を採取した。溶解した血液、肝臓及び腓腹筋は液体窒素中で急速凍結後、−８０℃で一時保管し、後日ＲＮＡ抽出に供した。非走行群に対しても、同様の方法で採取した。
Test Example 2 Changes in gene expression level (DNA microarray)
<Method>
The test performed comprises the steps of (1) running exercise load, (2) tissue collection, (3) RNA extraction, and (4) gene expression level analysis and comparison.
(1) Load of running motion The inclination angle of the treadmill device (manufactured by Panlab) was set to 10 °, and BALB / c male mice (Japan SLC, 4 mice per group) were gradually increased (15 cm / Fatigue was loaded by increasing the speed by 5 cm / s every 4 minutes from s).
(2) Tissue Collection The running exercise load group collected 1 mL of blood from the abdominal vena cava under deep anesthesia conditions 4 hours after running. To the collected blood, 1 mL of nuclease-free water was added, and 2 mL of Isogen-LS (Nippon Gene) was added to dissolve the blood. After euthanizing the mouse from which blood was collected, the liver and gastrocnemius muscle were collected. Dissolved blood, liver and gastrocnemius muscle were snap frozen in liquid nitrogen, temporarily stored at −80 ° C., and later subjected to RNA extraction. The non-running group was also collected in the same manner.
（３）ＲＮＡの抽出
血液サンプルのＲＮＡ抽出は、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ(ニッポンジーン社)に溶解されている血液サンプル４ｍＬの半量を用いて精製を行った。Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ溶解サンプル２ｍＬに対し、クロロホルム４００μＬを加えて、十分ボルテックスし遠心の後、水層８００から１０００μＬをＲＮＡ粗抽出液として回収した。得られたＲＮＡ粗抽出液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ中のＣｏｌｕｍｎに流し入れ、ＲＮＡを吸着させた。洗浄後６０μＬのヌクレアーゼ不含水に溶解させた。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。
ヌクレアーゼ不含水１μＬ中のＲＮＡを、常法により変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。その後、５μｇの抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡから、ＧＬＯＢＩＮｃｌｅａｒＴＭ−Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、同キットの規定プロトコールに従って、血液中に大量に含まれるグロビンｍＲＮＡの除去処理を行い、３０μＬのＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。ＲＮＡを含むＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。Ｋｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １μＬ中のＲＮＡを、常法により変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
肝臓及び腓腹筋サンプルのＲＮＡ抽出は、−８０℃で一時保管された組織１００ｍｇをＲＮＡｉｓｏ４ｍＬ中でホモジェナイズし、筋組織のＲＮＡｉｓｏ溶液とした。筋組織のＲＮＡｉｓｏ溶液１ｍＬクロロホルム０．２ｍＬを加えて、十分ボルテックスし遠心の後、水層５００から７００μＬをＲＮＡ粗抽出液として回収した。得られたＲＮＡ粗抽出液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）中のＣｏｌｕｍｎに流し入れ、ＲＮＡを吸着させた。洗浄後６０μＬのヌクレアーゼ不含水に溶解させた。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを常法によりＲＮＡを変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
(3) Extraction of RNA RNA extraction of a blood sample was performed using a half amount of a 4 mL blood sample dissolved in Isogen-LS (Nippon Gene). To 2 mL of the Isogen-LS-dissolved sample, 400 μL of chloroform was added, and vortexed sufficiently. After centrifugation, 1000 μL of the aqueous layer 800 was collected as a crude RNA extract. The obtained RNA crude extract was poured into Column in RNeasy Mini kit to adsorb RNA. After washing, it was dissolved in 60 μL of nuclease-free water. RNA containing nuclease-free water (1 μL) was subjected to RNA quantification and quality confirmation using a purity index using NanoDrop Spectrophotometer (NanoDrop).
RNA in 1 μL of nuclease-free water was denatured by a conventional method, then electrophoresed using BioAnalyzer 2100 (Agilent), and quality was confirmed using a degradation index. Thereafter, globin mRNA contained in a large amount in blood is removed from 5 μg of extracted total RNA using GLOBINclearTM-Mouse / Rat Kit (Ambion) according to the protocol specified in the kit, and 30 μL of Kit is attached. Dissolved in Elution Buffer. 1 μL of Kit-attached Elution Buffer containing RNA was subjected to RNA quantification and quality confirmation using a purity index using NanoDrop Spectrophotometer (NanoDrop). RNA in 1 μL of Kit-attached Elution Buffer was denatured by a conventional method and then electrophoresed using BioAnalyzer 2100 (Agilent), and the quality was confirmed using a degradation index.
For RNA extraction of liver and gastrocnemius muscle samples, 100 mg of tissue temporarily stored at −80 ° C. was homogenized in 4 mL of RNAiso to obtain an RNAiso solution of muscle tissue. After adding 1 mL of RNAiso solution of muscle tissue and 0.2 mL of chloroform, vortexing sufficiently and centrifuging, 700 μL of aqueous layer 500 to 500 μL was recovered as a crude RNA extract. The obtained RNA crude extract was poured into Column in RNeasy Mini kit (QIAGEN) to adsorb RNA. After washing, it was dissolved in 60 μL of nuclease-free water. RNA containing nuclease-free water (1 μL) was subjected to RNA quantification and quality confirmation using a purity index using NanoDrop Spectrophotometer (NanoDrop). RNA was denatured with 1 μL of nuclease-free water containing RNA by a conventional method, then electrophoresed using BioAnalyzer 2100 (Agilent), and quality was confirmed using a degradation index.
（４）遺伝子の発現量の分析及び比較
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社において作製されたゲノム上の既知、及び想定される２８８５３個の遺伝子について２５ｍｅｒ×７７０３１７個の対象と完全一致するオリゴヌクレオチド・プローブ（パーフェクトマッチプローブ）が搭載されたＤＮＡマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ）を用い、遺伝子発現量の解析を行った。具体的には、次の手順で行った。
ＷＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、プロトコールに従って、２５０ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡより、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ鎖ｃＲＮＡの合成を介して、ｓｅｎｓｅ 鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＷＴ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、合成したｃＤＮＡを断片化し、その５’末端にビオチンラベルを行った。中途産物であるｃＲＮＡを常法により変性後、断片化前のｃＤＮＡ及び断片化後のｃＤＮＡ（１００から３７５ｎｇ）をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて電気泳動し、品質確認を行った。
５μｇの断片化ビオチンラベルｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙへハイブリダイズさせるハイブリカクテルを調製した。ハイブリカクテルを、まず９９℃で５分間ヒートブロックを用いてインキュベーションし、続けて４５℃で５分間ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｙｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いてインキュベーションし、微量高速遠心機で室温、２０，４００×ｇ、１分間遠心した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙへハイブリカクテル８０μｌを注入し、４５℃で１７時間、毎分６０回転で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｙｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４０内で、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション完了後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ ＫｉｔとＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓａｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、システム制御ソフトウェア・Ａｆｆｙｍｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ （ＡＧＣＣ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上の規定プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙの染色及び洗浄を行った。同じくＣｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ 上の規定プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によりＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙをスキャンし、各遺伝子プローブの蛍光強度を遺伝子発現データのアレイ毎の画像ファイル（ＤＡＴファイル）として取得した。更に Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅを用いて、ＤＡＴファイルを数値化可能なＣＥＬファイルへ変換した。
解析ソフトウェア・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、ＣＥＬファイルから標準化された発現シグナル値の数値データをテキストファイルとして出力した。発現シグナル値の標準化には、本アレイにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社標準のＲＭＡ−ｓｋｅｃｈ法を用いた。
(4) Analysis and Comparison of Gene Expression Levels Oligonucleotide probes (perfect match probes) that perfectly match 25mer × 770317 subjects for the known and assumed 28853 genes on the genome produced by Affymetrix. The gene expression level was analyzed using a DNA microarray (GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array). Specifically, the procedure was as follows.
Using a WT Expression Kit (Ambion), a sense strand cDNA was synthesized from 250 ng of total RNA via synthesis of an anti-sense strand cRNA according to the protocol. Thereafter, the synthesized cDNA was fragmented using WT Terminal Labeling and Control Kit (Affymetrix), and biotin-labeled at the 5 ′ end. After denatured cRNA as an intermediate product by a conventional method, cDNA before fragmentation and cDNA after fragmentation (100 to 375 ng) were electrophoresed using BioAnalyzer 2100, and the quality was confirmed.
A hybrid cocktail was prepared by hybridizing 5 μg of fragmented biotin-labeled cDNA to GeneChip Array according to the protocol using GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit (Affymetrix). The hybrid cocktail is first incubated with a heat block at 99 ° C. for 5 minutes, followed by incubation with GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix) for 5 minutes at 45 ° C., then at room temperature, 20,400 × in a micro high speed centrifuge. g Centrifuge for 1 minute. 80 μl of a hybrid cocktail was injected into the GeneChip Array, and hybridization was performed in the GeneChip Hybridization Oven 640 at 45 ° C. for 17 hours at 60 rpm.
After hybridization, GeneChip Hybridization Stain Kit and GeneChip Fluidics Sat 450 (Affymetrix) are used in accordance with the system control software Affymetrix GeneChip Acone (AGCC). Went. The GeneChip Array was scanned by GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix) according to the same protocol as defined in the Command Console, and the fluorescence intensity of each gene probe was obtained as an image file (DAT file) for each gene expression data array. Furthermore, the DAT file was converted into a CEL file that can be quantified by using Command Console.
Using the analysis software Expression Console (Affymetrix), the numerical data of expression signal values normalized from the CEL file was output as a text file. For standardization of the expression signal value, the standard RMA-skech method of Affymetrix in this array was used.
＜結果＞
走行運動負荷群と非走行群の各アレイの遺伝子発現データについて、非走行群の発現シグナル値を分母とし、走行運動負荷群の発現シグナル値を分子として発現比を求めた。その結果、非走行状態と比較して発現増加が認められる遺伝子として表１で示されるＥａｒ遺伝子群を見出した。また血液、肝臓及び腓腹筋いずれにおいても顕著に発現増加が認められる遺伝子としてＥａｒ１１を見出した。
<Result>
For the gene expression data of each array of the running exercise load group and the non-running group, the expression ratio was determined using the expression signal value of the non-running group as the denominator and the expression signal value of the running exercise load group as the numerator. As a result, the Ear gene group shown in Table 1 was found as a gene whose expression was increased compared to the non-running state. Moreover, Ear11 was found as a gene whose expression is remarkably increased in blood, liver and gastrocnemius muscles.
試験例３ 遺伝子発現量の変化（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
＜方法＞
行った試験は、（１）走行運動の負荷、（２）組織の採取、（３）遺伝子発現量の測定の工程よりなる。
（１）走行運動の負荷
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群４匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動をさせ、疲労を負荷した。被験物質（タウリン）は走行運動試験の前日まで１日１回で１４日間の連続投与を行った（３００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）。
（２）組織の採取
走行運動負荷を行ったマウスは、走行２または２４時間後に深麻酔条件下で腹部大静脈から脱血処置を行い、マウスを安楽死処置後、腓腹筋を採取した。採取した腓腹筋は液体窒素中で急速凍結後、−８０℃で一時保管し、後日遺伝子発現量の測定に供した。非走行マウスに対しても、同様の方法で採取した。
（３）遺伝子発現量の測定
得られた腓腹筋から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用い、付属のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、付属の使用説明書に従いＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社）を使用して逆転写を行い、ｃＤＮＡサンプルを作成した。
得られたｃＤＮＡサンプルに対し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、その使用説明書に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。使用したプライマーとして、Ｅａｒ１１はＭＡ０６６９２７−Ｆ（ターゲットポイント：２７３、シークエンス：ＣＣＧＴＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＣＡＣＧＴＡＡＧ、タカラバイオ株式会社）とＭＡ０６６９２７−Ｒ（ターゲットポイント：３８７、シークエンス：ＡＴＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧ、タカラバイオ株式会社）を用い、Ｅａｒ５はＭＡ０８６０８２−Ｆ（ターゲットポイント：１２、シークエンス：ＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＣ、タカラバイオ株式会社）とＭＡ０８６０８２−Ｒ（ターゲットポイント：１５９、シークエンス：ＧＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣ、タカラバイオ株式会社）を用いた。内部標準として３６Ｂ４を使用し、相対定量法によりＥａｒ１１、Ｅａｒ５の発現レベルを比較した。結果を図１、２に示す。
Test Example 3 Change in gene expression level (real-time RT-PCR)
<Method>
The tests performed consisted of (1) running exercise load, (2) tissue sampling, and (3) gene expression level measurement.
(1) Load of running motion The inclination angle of the treadmill device (manufactured by Panlab) was set to 10 °, and BALB / c male mice (Japan SLC, 4 mice per group) were gradually increased (15 cm / Fatigue was loaded by increasing the speed by 5 cm / s every 4 minutes from s). The test substance (taurine) was administered continuously for 14 days once a day until the day before the running exercise test (300 mg / kg, po).
(2) Collection of tissue Mice subjected to running exercise were subjected to blood removal treatment from the abdominal vena cava under deep anesthesia conditions 2 or 24 hours after running, and the gastrocnemius muscle was collected after euthanasia of the mice. The collected gastrocnemius muscle was quickly frozen in liquid nitrogen, temporarily stored at −80 ° C., and used for measurement of the gene expression level at a later date. Non-running mice were collected in the same manner.
(3) Measurement of gene expression level RNA was extracted from the obtained gastrocnemius muscle using TRIzol reagent (invitrogen) according to the attached protocol. The extracted RNA was reverse-transcribed using a High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Applied Biosystems) using a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) according to the attached instruction manual. Created.
Real-time RT-PCR was performed on the obtained cDNA sample using Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) according to the instruction manual. For real-time RT-PCR, StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) was used. As primers used, Ear11 uses MA066927-F (target point: 273, sequence: CCGTGTGTGTATATACCCACGTAAG, Takara Bio Inc.) and MA0669927-R (target point: 387, sequence: ATGACTGGCCGGAGTGTGGAG, Takara Bio Inc.) -F (target point: 12, sequence: GCTGCTTGAATCCAGACTTTGTTCTC, Takara Bio Inc.) and MA086082-R (target point: 159, sequence: GACCCGCATTGCATCATCAC, Takara Bio Inc.) were used. Using 36B4 as an internal standard, the expression levels of Ear11 and Ear5 were compared by a relative quantification method. The results are shown in FIGS.
＜結果＞
図１、２によるとマウス腓腹筋において、走行運動負荷を行った対照群にＥａｒ１１、Ｅａｒ５の発現レベルの上昇が認められた。一方、タウリン投与群のマウス腓腹筋においては、走行運動負荷後においても、Ｅａｒ１１及びＥａｒ５の発現の上昇は認められなかった。
本発明の評価方法を用いることにより、疲労の程度を評価できること、疲労の回復に有効な物質の評価が可能であることが明らかとなった。
<Result>
According to FIGS. 1 and 2, in the mouse gastrocnemius muscle, an increase in expression levels of Ear11 and Ear5 was observed in the control group subjected to running exercise load. On the other hand, in the mouse gastrocnemius muscle of the taurine administration group, no increase in the expression of Ear11 and Ear5 was observed even after running exercise load.
By using the evaluation method of the present invention, it became clear that the degree of fatigue can be evaluated and that a substance effective for recovery from fatigue can be evaluated.
本発明は、疲労の研究や判定などの分野、疲労を改善するための医薬や食品の評価などの分野、そのためのキットの製造の分野などにおいて利用可能である。例えば、本発明を利用することにより、日常生活における生理的疲労、末梢性疲労、特に肉体疲労の程度を客観的に判定することが可能になる。また、医薬品や食品等による疲労の回復、改善及び予防の予測が容易になる。さらには、本発明により、疲労の程度の判定するために使用するバイオマーカーやサロゲートマーカーの提供が可能となる。 The present invention can be used in the field of fatigue research and determination, the field of medicine and food evaluation for improving fatigue, the field of manufacturing kits therefor, and the like. For example, by using the present invention, it becomes possible to objectively determine the degree of physiological fatigue, peripheral fatigue, especially physical fatigue in daily life. In addition, it becomes easy to predict recovery, improvement and prevention of fatigue caused by pharmaceuticals and foods. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a biomarker or a surrogate marker used for determining the degree of fatigue.
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