JP2013063049A - カテキン類の苦味抑制剤の評価又は選択方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カテキン類の苦味抑制剤を評価又は選択する方法であって、
TAS2R14及びTAS2R40からなる群より選択される苦味受容体のいずれか1以上にカテキン類および試験物質を添加する工程;
当該試験物質およびカテキン類に対する当該受容体の応答を測定する工程;
試験物質を添加せず当該カテキン類のみを添加する工程;
当該カテキン類のみに対する当該受容体の応答を測定する工程;及び
試験物質及びカテキン類に対する当該受容体の応答と当該カテキン類のみに対する応答を比較し、試験物質及びカテキン類に対する応答が、当該カテキン類のみに対する応答よりも減少していれば、当該試験物質をカテキン類による苦味抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、方法。
【選択図】なし
Description
(1)カテキン類の苦味抑制剤を評価又は選択する方法であって、
TAS2R14及びTAS2R40からなる群より選択される苦味受容体のいずれか1種以上にカテキン類および試験物質を添加する工程;
当該試験物質及びカテキン類に対する当該受容体の応答を測定する工程;
試験物質を添加せず当該カテキン類のみを添加する工程;
当該カテキン類のみに対する当該受容体の応答を測定する工程;及び
試験物質及びカテキン類に対する当該受容体の応答と当該カテキン類のみに対する応答を比較し、試験物質及びカテキン類に対する応答が、当該カテキン類のみに対する応答よりも減少していれば、当該試験物質をカテキン類による苦味抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、方法。
(2)前記苦味受容体が、天然に苦味受容体を発現する細胞上又は苦味受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上の苦味受容体である(1)記載の方法。
尚、本発明において、カテキン類としては、例えばカテキン(C)、ガロカテキン(GC)、カテキンガレート(Cg)、ガロカテキンガレート(GCg)等の非エピ体カテキン類、エピカテキン(EC)、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキンガレート(ECg)、エピガロカテキンガレート(EGCg)等のエピ体カテキン類が挙げられる。このうち、エピガロカテキンガレート(EGCg)が好ましい。
本発明の方法においては、当該苦味受容体のうちのいずれか1つを単独で使用してもよく、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
当該組換え細胞は、苦味受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。好適には、培養細胞に発現させた苦味受容体の応答性を向上するために、キメラGタンパク質をコードする遺伝子組み込んだベクターを、苦味受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターとともに遺伝子導入する。
なお、カルシウム感受性色素としては、例えば、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等が挙げられる。
試験物質の評価は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。試験物質の非存在下に対して試験物質の存在下で、カテキン類に対する活性の抑制が確認できれば、その試験物質はカテキン類に対する苦味抑制物質と判定(評価)され得る。好ましくは、50%以上のEGCg細胞応答抑制率を示した試験物質を苦味抑制物質とすることができる。
なお、本発明において、「選択」には、上記の評価に基づいて苦味抑制物質をスクリーニングすることが包含される。
実施例1 ヒト苦味受容体遺伝子のクローニング
TAS2R14およびTAS2R40はGenBankに登録されている配列情報を基に、ヒトゲノムDNA(human genomic DNA female (Cat. No. G152A; Promega)を鋳型としたPCR法によりクローニングした。PCR法により増幅した各遺伝子をpENTRTM/D-TOPOベクター(invitrogen)にマニュアルに従って組込み、pENTRベクター上に存在するNot I、Asc Iサイトを利用して、pME18Sベクター上のFlag-Rhoタグ配列の下流に組み込んだNot I、Asc Iサイトへと組換えた。
ヒトGα16とヒトGustducinをヒト舌(26歳の健常者由来; Bio Chain)のcDNAを鋳型としたPCR法によりクローニングした。既報(Ueda T,et al.,J.Neurosci,23,7376-7380(2003))に従い、Gα16(配列番号5)のアミノ酸配列のC鎖末端側の36アミノ酸をGustducin(配列番号6)のアミノ酸配列のアミノ酸番号318〜354のアミノ酸に置換させたキメラGタンパク質をコードする遺伝子(配列番号7)を作製するため、結合部位に相当するプライマーを設計し、PCRによりキメラ遺伝子の増幅を行った。その後、増幅した遺伝子をpENTRTM/D-TOPOベクター(invitrogen)に製造メーカーの使用説明書に従って組み込み、さらに、pcDNA3.2/V5-DESTベクター(invitrogen)へ組み換えた。
1)苦味受容体発現細胞の作製
TAS2R14及びTAS2R40をそれぞれ発現させたHEK293T細胞は次のように作製した。表1に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で20分静置した後、96ウェルプレート(Becton Dickinson)の各ウェルに添加した。次いで、HEK293T(1.5×105細胞/cm2)を100μlずつ各ウェルに播種し、37℃、5%CO2を保持したインキュベータ内で24〜26時間培養した。
HEK293T細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターより入手することが可能である。
HEK293T細胞に発現させた苦味受容体は、G16gust36と共役しPLCβ2を活性化することで、細胞内カルシウム量を増加させる。本研究での苦味応答測定には、細胞内カルシウム量の変化を細胞内カルシウム感受性蛍光指示薬であるFluo-4にて蛍光値としてモニターするカルシウムイメージング法を用いた。
上記1)で作製した培養物から、培地を取り除き、表2のように調製した細胞内カルシウム感受性蛍光指示薬を含むQuencher溶液(Calcium Kit; 同仁化学)を各ウェルへ添加した。
EGCg応答=(EGCg添加後のTAS2R発現細胞における最大蛍光強度比)−(mock発現細胞における最大蛍光強度比)
TAS2R14発現細胞における各種カテキンの細胞応答は上述の実施例3と同様な方法にて測定した。
ヒト官能評価は、8種のカテキン(カテキン(C)、エピカテキン(EC)、ガロカテキン(GC)、エピガロカテキン(EGC)、カテキンガレート(Cg)、エピカテキンガレート(ECg)、ガロカテキンガレート(GCg)、エピガロカテキンガレート(EGCg))の苦味スコアをパネラー5名により評価した。硫酸キニーネを表3のような苦味強度の異なる10段階に調製し、各種カテキン(評価濃度:2 mM)の苦味強度と同等の苦味強度を示す硫酸キニーネの苦味スコアを、そのカテキンの苦味スコアと判定し、5名の平均値を求めた。評価は試験サンプル5 mlを口に含む方法で行った。
上述の実施例3と同様な方法にて測定した。なお、β-CDは最終濃度:0.5質量%で混合した。
<EGCgに対する苦味抑制率の算出方法>
各ウェルにおけるEGCgに対する応答強度は、以下の通りに算出した。
EGCg応答=(EGCg添加後のTAS2R発現細胞における最大蛍光強度比)−(mock発現細胞における最大蛍光強度比)
β-CDによるEGCg応答抑制効果(苦味抑制率)は、
苦味抑制率(%)=[1−[(β-CD存在下のEGCg応答)
/(β-CD非存在下EGCg応答)]]×100
Claims (2)
- カテキン類の苦味抑制剤を評価又は選択する方法であって、
TAS2R14及びTAS2R40からなる群より選択される苦味受容体のいずれか1以上にカテキン類および試験物質を添加する工程;
当該試験物質およびカテキン類に対する当該受容体の応答を測定する工程;
試験物質を添加せず当該カテキン類のみを添加する工程;
当該カテキン類のみに対する当該受容体の応答を測定する工程;及び
試験物質及びカテキン類に対する当該受容体の応答と当該カテキン類のみに対する応答を比較し、試験物質及びカテキン類に対する応答が、当該カテキン類のみに対する応答よりも減少していれば、当該試験物質をカテキン類による苦味抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、方法。 - 前記苦味受容体が、天然に苦味受容体を発現する細胞上又は苦味受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上の苦味受容体である請求項1記載の方法。
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