JP2013042750A - 核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、多種多様な被検試料に適用可能であり、PCR法やRT−PCR法等の遺伝子増幅反応に直接使用可能な核酸鋳型を、簡便かつ迅速に、好ましくは温和な条件で、調製する方法を提供することにある。
【解決手段】
本発明は両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬を、被検試料と接触させる工程を含む、核酸抽出方法に関する。好ましくは、核酸抽出用試薬は、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む。
【選択図】なし
Description
そのため、より短時間かつ少ない工程で、RNAが調製可能な方法、特に、遺伝子増幅反応に供することのできるRNAの鋳型が調製可能な方法が望まれている。
(1) 両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬を、被検試料と接触させる工程を含む、核酸抽出方法。
(2) 核酸抽出用試薬が、タンパク質分解酵素および/または界面活性剤を含む、(1)に記載の核酸抽出方法。
(3) タンパク質分解酵素が、プロテアーゼKである、(2)に記載の核酸抽出方法。
(4) 核酸抽出用試薬中におけるタンパク質分解酵素の濃度が、0.09〜45U/mLである、(2)または(3)に記載の核酸抽出方法。
(5) 界面活性剤が、ステロイド骨格を有する界面活性剤である、(2)〜(4)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(6) 界面活性剤が、グリココール酸またはその塩である、(2)〜(5)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(7) 核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、0.009〜9mmol/Lである、(2)〜(6)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(8) 両性イオン性緩衝液が、グッド緩衝液である、(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(9) 両性イオン性緩衝液が、トリシンを含む、(1)〜(8)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(10) 核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、9〜364mmol/Lである、(1)〜(9)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(11) 被検試料が、細胞壁を有する生物由来の試料である、(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(12) 細胞壁を有する生物が、グラム陽性菌、真菌または酵母である、(1)〜(11)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(13) 被検試料から核酸としてDNAおよび/またはRNAが、抽出される、(1)〜(12)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(14) 被検試料と接触させ、被検試料から核酸を抽出した核酸抽出用試薬は、核酸増幅反応に供されるものである、(1)〜(13)のいずれかに記載の核酸抽出方法。
(15) 両性イオン性緩衝液を含む、核酸抽出用試薬。
(16) 核酸抽出用試薬を構成する両性イオン性緩衝液と各構成成分とを含む、核酸抽出試薬キット。
本発明の核酸抽出方法の説明に先立ち、まず、本発明の核酸抽出用試薬および核酸抽出試薬キットについて説明する。
両性イオン性緩衝液は、緩衝剤として両性イオン性化合物を含むものであり、一定のpH範囲において、当該化合物は、正電荷と負電荷とを同時に有する両性イオンとして両性イオン性緩衝液中に存在する。核酸抽出試薬がこのような両性イオン性緩衝液を含むことにより、抽出および遺伝子増幅反応における検体試料中に含まれる夾雑成分による影響を低減することができ、この結果、被検試料の種類や夾雑成分の有無を考慮することなく、核酸を抽出することができるとともに、核酸抽出後における精製作業の省略が可能となる。このような効果が得られる理由は完全に解明されていないが、例えば、負電荷を有する核酸等に付着することで、核酸がDNAポリメラーゼと結合することを妨害すると考えられている陽イオン性の夾雑物を、両性イオン性化合物が、その負電荷により捕獲するとともに、DNAポリメラーゼが活性化する際に必須な2価の陽イオン(マグネシウムイオン等)を電気的に中和することで、DNAポリメラーゼの活性を阻害すると考えられている陰イオン性の夾雑物を、両性イオン性化合物が、その正電荷により捕獲し、これらの夾雑物を凝集、沈降させる結果、夾雑物による核酸やポリメラーゼ等への影響を低減できるためであると考えられる。
核酸抽出試薬は、核酸抽出試薬キットにおいて、その各構成成分が混合された状態で存在してもよいし、保存安定性の向上、製造コストの低減等の観点から、必要に応じて、これらの成分が分離して存在してもよい。
また、核酸抽出試薬キットは、その目的に応じ、他の試薬を有していてもよい。例えば、核酸抽出試薬キットは、目的とする核酸以外の核酸を分解するための核酸分解試薬(例えば、DNA分解試薬、RNA分解試薬)、RNA分解酵素の活性を阻害するタンパク質(RNase Inhibitor)、PCR等の遺伝子増幅試薬(DNAポリメラーゼ、プライマー、核酸塩基、Mg含有緩衝液)、遺伝子増幅産物を検出するための電気泳動関連試薬(アガロースゲル、分子量マーカー、移動度マーカー、検出試薬)等を、1種または2種以上組み合わせて有することができる。
また、本発明の核酸抽出試薬キットは、後述する核酸の抽出方法を実施するための器具(例えば、密閉容器等)を備えていてもよい。
図1に、本発明の核酸抽出方法の好適な実施態様の一例を示すフローチャート図を示す。なお、図中に記載された試薬中の構成成分や反応条件等については、あくまでも本発明の実施態様の一例を示すものであり、本発明はこれに限定されるべきではない。
本発明の核酸抽出方法は、両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬(試薬1)を、被検試料と接触させる工程を含む。
混合液の温度は、例えば、核酸抽出用試薬にタンパク質分解酵素が含まれる場合には、この至適温度付近(例えば、至適温度より5℃低い温度から、至適温度より5℃高い温度範囲内)とすることができる。
また、核酸抽出用試薬にタンパク質分解酵素が含まれない場合には、混合液の温度は、25〜70℃とすることができる。
また、静置時間は、特に限定されないが、例えば、5〜30分、好ましくは、5〜10分とすることができる。
静置時間は、特に限定されないが、例えば、3〜15分、好ましくは、3〜5分とすることができる。
このような場合、図1にあるように、本実施態様では、さらにDNA分解試薬(試薬2)を抽出液に接触させる工程を有する。
上記工程としては、例えば、核酸抽出試薬キットに含まれるDNA分解試薬を抽出液に添加し、抽出液を所定の温度に調節し、一定時間静置することにより行うことができる。
また、静置時間は、DNAが十分に分解可能な時間であれば特に限定されないが、例えば、10〜30分、好ましくは、10〜15分とすることができる。
静置時間は、特に限定されないが、例えば、5〜30分、好ましくは、5〜15分とすることができる。
以上の操作により、DNAが除去され、かつRNAを含む抽出液を得ることができる。そして、この処理後の抽出液中に残存するRNAをRT−PCR法の鋳型として使用することが可能となる。
まず、核酸の抽出に用いる試薬として、以下の組成の試薬1および試薬2を調製し、試薬1および試薬2からなる核酸抽出試薬キットを準備した。
プロテアーゼK 18 U/mL
Tris−HCl pH 7.5 0.9 mM
酢酸カルシウム 0.09 mM
グリココール酸ナトリウム 9 mM
EDTA・2Na 0.9 mM
トリシン pH 8.5 182 mM
塩化ナトリウム 9 mM
グリセリン 5 %(v/v)
DNase I 1 U/μL
Tris−HCl pH 7.5 20 mM
塩化マグネシウム 50 mM
グリセリン 50 %(v/v)
なお、別段の記載がない限り、以下で述べる試薬1および2の組成は上記のとおりである。
増幅対象がDNAに由来する場合: 検体(1μL)を試薬1(100μL)で懸濁し、65℃で6分間、94℃で3分間連続的に加温する。その後、遠心操作(10,000×g、5分)で上清を回収して抽出液を得、これをPCR法の鋳型として使用する。
・プロテアーゼK濃度が異なる試薬1を用いたDNAの抽出
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、37℃で一晩好気培養した。得られたコロニーを被検試料とした。プロテアーゼKのみ0〜45U/mLの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬1を用いて、増幅対象をDNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製した。
図中、各レーンの実験において、試薬1中のプロテアーゼK濃度を以下のように構成した。
レーン1: 0 U/mL
レーン2: 0.009 U/mL
レーン3: 0.09 U/mL
レーン4: 0.9 U/mL
レーン5: 9 U/mL
レーン6: 45 U/mL
レーンM: 100bp DNA Ladder
・グリココール酸濃度が異なる試薬1を用いたDNAの抽出
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、37℃で一晩好気培養した。得られたコロニーを被検試料とした。グリココール酸Naのみ0〜9mmol/Lの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬1を用いて、増幅対象をDNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製した。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 0 mmol/L
レーン2: 0.009 mmol/L
レーン3: 0.09 mmol/L
レーン4: 0.9 mmol/L
レーン5: 9 mmol/L
図3に示された結果において、試薬1中のグリココール酸Naの濃度が0.009〜9mmol/Lの範囲の場合には、増幅産物量が比較的多いことが確認できた。
・トリシン濃度の異なる試薬1を用いたDNAの抽出
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、37℃で一晩好気培養した。得られたコロニー1μLをヒトプール血清10μLに懸濁し、この全量を被検試料とした。トリシンのみ0〜364mmol/Lの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬1を用いて、増幅対象をDNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製した。なお、トリシンを含まない試薬1は、対照として用いた。
図中、各レーンの実験において、試薬1中のトリシン濃度を以下のように構成した。
レーン1: 0 mmol/L
レーン2: 9 mmol/L
レーン3: 91 mmol/L
レーン4: 182 mmol/L
レーン5: 364 mmol/L
レーンM: 100bp DNA Ladder
・本発明の核酸抽出試薬キットを用いた、黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、大腸菌O157(グラム陰性菌)、真菌(出芽酵母)からのDNAの抽出
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus、NBRC 102141)と大腸菌O157(Escherichia coli、ATCC 35150)とをSCD寒天培地に、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地にそれぞれ播種し、37℃で一晩好気培養した。得られた各コロニーを被検試料として、上記試薬1を用いて、増幅対象をDNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製した。また、本発明(試薬1)の代わりに超純水を用いて同様の操作を行い、これを対照の鋳型とした。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌O157、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 本発明の試薬1を用いて調製したPCR用鋳型
レーン2: 本発明の試薬1の代わりに超純水を用いて調製したPCR用鋳型(対照)
図5に示された結果において、3種全ての被検試料において増幅産物に由来するバンドが検出されたことが確認された。特に、黄色ブドウ球菌や出芽酵母に対しては、対照よりも多くの増幅産物が得られることが確認された。
・従来の核酸抽出試薬キットを用いた、黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、大腸菌O157(グラム陰性菌)、真菌(出芽酵母)からのDNAの抽出
本発明の核酸抽出試薬キットに変えて、既存製品(シカジーニアスDNA抽出試薬、関東化学社製)を用い、核酸の抽出およびPCR法の鋳型の調製を同製品の製品マニュアルに従って行った以外は、前記実施例4と同様にして、PCR法の鋳型を調製し、当該鋳型の増幅を行った。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌O157、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 従来の核酸抽出試薬キット(シカジーニアスDNA抽出試薬、関東化学社製)を用いて調製した試料
レーン2: 上記試薬に代えて超純水を用いて調製した試料(対照)
図6に示された結果において、黄色ブドウ球菌およびO157の被検試料においては、実施例4(図5)と同等の増幅産物由来のバンドが検出されたが、出芽酵母の被検試料においては、増幅産物量が有意に少ないことが確認された。
本発明の核酸抽出試薬キットまたは既存製品(セルイーズ マウステール)を用いた、動物細胞からのDNAの抽出
マウステールを約3mm切り取ったものを動物細胞の被検試料として用いた。
試薬1を用いて、増幅対象をDNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製した(実施例5)。一方、既存製品(セルイーズ マウステール;関東化学)のマニュアルに従って被検試料から核酸の抽出を行い、PCR法の鋳型を調製し、これを対照として用いた(参考例1)。
図中、本発明の核酸酸抽出キットおよび既存製品(セルイーズ マウステール;関東化学)のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 本発明の試薬1もしくは既存製品を用いて調製した試料
レーン2: 本発明の試薬1もしくは既存製品の代わりに超純水を用いて調製した試料(対照)
・黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、大腸菌O157(グラム陰性菌)、真菌(出芽酵母)からのRNAの抽出
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus、NBRC 102141)と大腸菌O157(Escherichia coli、ATCC 35150)をSCD寒天培地に、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、37℃で一晩好気培養した。得られた各コロニーを被検試料として、上記試薬1および試薬を用いて、増幅対象をRNAとして被検試料から核酸の抽出を行い、RT−PCR法の鋳型を調製した。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌O157、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 本発明の試薬1および試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript
RT Enzyme Mix Iを添加した状態)
レーン2: 本発明の試薬1および試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript
RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態)
レーン3: 本発明の試薬1を超純水に置き換え、さらに試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態)
レーン4: 本発明の試薬1を超純水に置き換え、さらに試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態)
図8に示された結果において、3種全ての被検試料において増幅産物由来のバンドが確認された。
・血液成分が混入した真菌(出芽酵母)試料における核酸の抽出
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、ATCC 9763)をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、37℃で一晩好気培養した。得られたコロニー1μLをヒトプール血清10μLに懸濁し、この全量を被検試料とした。
図9において、本発明の核酸抽出試薬キットおよび既存製品(シカジーニアスDNA抽出試薬;関東化学)のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 本発明の試薬1もしくは既存製品を用いて調製した試料
レーン2: 本発明の試薬1もしくは既存製品の代わりに超純水を用いて調製した試料
また、図10において、各レーンは下記の構成とした。
レーンM: 100bp DNA Ladder
レーン1: 本発明の核酸抽出試薬キット(試薬1および試薬2)を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態)
レーン2: 本発明の核酸抽出試薬キット(試薬1および試薬2)を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態)
レーン3: 本発明の試薬1を超純水に置き換え、さらに試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態)
レーン4: 本発明の試薬1を超純水に置き換え、さらに試薬2を用いて調製した試料(PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態)
Claims (16)
- 両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬を、被検試料と接触させる工程を含む、核酸抽出方法。
- 核酸抽出用試薬が、タンパク質分解酵素および/または界面活性剤を含む、請求項1に記載の核酸抽出方法。
- タンパク質分解酵素が、プロテアーゼKである、請求項2に記載の核酸抽出方法。
- 核酸抽出用試薬中におけるタンパク質分解酵素の濃度が、0.09〜45U/mLである、請求項2または3に記載の核酸抽出方法。
- 界面活性剤が、ステロイド骨格を有する界面活性剤である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 界面活性剤が、グリココール酸またはその塩である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、0.009〜9mmol/Lである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 両性イオン性緩衝液が、グッド緩衝液である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 両性イオン性緩衝液が、トリシンを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、9〜364mmol/Lである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 被検試料が、細胞壁を有する生物由来の試料である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 細胞壁を有する生物が、グラム陽性菌、真菌または酵母である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 被検試料から核酸としてDNAおよび/またはRNAが、抽出される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 被検試料と接触させ、被検試料から核酸を抽出した核酸抽出用試薬は、核酸増幅反応に供されるものである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
- 両性イオン性緩衝液を含む、核酸抽出用試薬。
- 核酸抽出用試薬を構成する両性イオン性緩衝液と各構成成分とを含む、核酸抽出試薬キット。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018168600A1 (ja) * | 2017-03-13 | 2018-09-20 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出および増幅試薬 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2718260B1 (en) | 2011-06-08 | 2018-07-25 | Life Technologies Corporation | Design and development of novel detergents for use in pcr systems |
WO2012170907A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
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CN111549024B (zh) * | 2020-05-09 | 2023-06-30 | 浙江省中药研究所有限公司 | 一种核酸提取试纸条及其使用方法 |
CN113106148A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-13 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11501504A (ja) * | 1994-12-12 | 1999-02-09 | ダイナル エイ/エス | 核酸の単離方法 |
JP2004201558A (ja) * | 2002-12-25 | 2004-07-22 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Dna遊離方法 |
JP2004254525A (ja) * | 2003-02-24 | 2004-09-16 | Kubota Corp | クリプトスポリジウムの種識別的検出方法 |
JP2006061041A (ja) * | 2004-08-25 | 2006-03-09 | Kubota Corp | 核酸抽出方法及び核酸抽出キット |
JP2006524987A (ja) * | 2002-12-17 | 2006-11-09 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー | 生体サンプルからの核酸抽出のための組成物および方法 |
WO2007052765A1 (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Shimadzu Corporation | Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法 |
JP2007124926A (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-24 | Visionbio Corp | Dna抽出剤およびそれを用いるdna抽出方法 |
JP2007143563A (ja) * | 1997-07-07 | 2007-06-14 | Medical Res Council | 核酸濃度を増大させる方法 |
WO2007116450A1 (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Biocosm Inc. | 核酸抽出方法及び核酸抽出キット |
JP2008531039A (ja) * | 2005-02-28 | 2008-08-14 | バイオクエスト インク | 核酸分子が含まれる直接酵素反応方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6914137B2 (en) * | 1997-12-06 | 2005-07-05 | Dna Research Innovations Limited | Isolation of nucleic acids |
EP2535428B1 (en) * | 2007-10-01 | 2015-09-09 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | Biological specimen collection and transport system and methods of use |
-
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- 2011-08-26 JP JP2011185275A patent/JP5924888B2/ja active Active
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2012
- 2012-08-23 US US13/592,390 patent/US20130066062A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11501504A (ja) * | 1994-12-12 | 1999-02-09 | ダイナル エイ/エス | 核酸の単離方法 |
JP2007143563A (ja) * | 1997-07-07 | 2007-06-14 | Medical Res Council | 核酸濃度を増大させる方法 |
JP2006524987A (ja) * | 2002-12-17 | 2006-11-09 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー | 生体サンプルからの核酸抽出のための組成物および方法 |
JP2004201558A (ja) * | 2002-12-25 | 2004-07-22 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Dna遊離方法 |
JP2004254525A (ja) * | 2003-02-24 | 2004-09-16 | Kubota Corp | クリプトスポリジウムの種識別的検出方法 |
JP2006061041A (ja) * | 2004-08-25 | 2006-03-09 | Kubota Corp | 核酸抽出方法及び核酸抽出キット |
JP2008531039A (ja) * | 2005-02-28 | 2008-08-14 | バイオクエスト インク | 核酸分子が含まれる直接酵素反応方法 |
WO2007052765A1 (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Shimadzu Corporation | Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法 |
JP2007124926A (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-24 | Visionbio Corp | Dna抽出剤およびそれを用いるdna抽出方法 |
WO2007116450A1 (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Biocosm Inc. | 核酸抽出方法及び核酸抽出キット |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018168600A1 (ja) * | 2017-03-13 | 2018-09-20 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出および増幅試薬 |
US11208686B2 (en) | 2017-03-13 | 2021-12-28 | Tosoh Corporation | Reagent for extracting and amplifying nucleic acid |
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