JP2013036943A - Parasite detecting method and kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、寄生虫の検出方法、及び、キットに関する。 The present invention relates to a method for detecting a parasite and a kit.
近年、食後数時間程度で一過性の下痢や嘔吐を呈し、軽症で終わる有症事例が報告されている。当該の有症事例は平成１２年以降、中四国（瀬戸内沿岸）において発生が認識され、現在は多くの都道府県において報告されている。有症事例が集積されるに従い、喫食状況の調査結果も蓄積され、原因食品の１つにヒラメが推測されるようになった。平成２０年度に市場に流通しているヒラメを対照に、細菌学的検査及び寄生虫学的検査が行われた。その結果、６０検体中、２検体の腎臓からStreptococcus parauberisが検出され、１検体の筋肉部分から粘液胞子虫の一種、Kudoa属の寄生虫が検出された（非特許文献１参照）。 In recent years, there have been reports of symptomatic cases that show transient diarrhea and vomiting within a few hours after meals and end with mild symptoms. This symptomatic case has been recognized since 2000 in Chu-Shikoku (Setouchi Coast), and has been reported in many prefectures. As symptom cases were accumulated, the survey results of eating conditions were accumulated, and flounder was estimated as one of the causative foods. In 2008, bacteriological and parasitological tests were conducted against Japanese flounder, which is in circulation in the market. As a result, Streptococcus parauberis was detected from 2 kidneys out of 60 samples, and a kind of myxosporeworm, Kudoa parasite was detected from the muscle portion of 1 sample (see Non-Patent Document 1).
非特許文献１には、コンベンションＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）及びＲＮＡを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Real Time-PCR）を用いて、検出されたKudoa属寄生虫を対照に、ヒラメ検体を測定したことが開示されている。 In Non-Patent Document 1, flounder samples were measured using convention PCR (Polymerase Chain Reaction) and quantitative RT-PCR (Real Time-PCR) using RNA, with the detected Kudoa parasite as a control. It is disclosed.
非特許文献１に開示される測定方法（検出方法）では、寄生虫を検出するためにＰＣＲ法を用いているが、ＰＣＲ法は検出処理を行う前に検体を前処理する必要があるため検出処理が煩雑であり、また、検体を測定して当該検体から寄生虫を検出するまでの時間が長い等の問題がある。 In the measurement method (detection method) disclosed in Non-Patent Document 1, the PCR method is used to detect parasites. However, the PCR method requires detection of a sample before the detection process is performed. Processing is complicated, and there is a problem that it takes a long time to measure a specimen and detect a parasite from the specimen.
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、検体から寄生虫を簡便に検出する寄生虫の検出方法、及び、キットを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a parasite detection method and kit for simply detecting a parasite from a specimen.
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る寄生虫の検出方法は、
検体の筋肉から肉片を採取する採取工程と、
前記採取された肉片を抗原とする固相抗原をプレートに調製するプレート調製工程と、
Kudoa septempunctataを免疫原として動物に免疫させた後、当該動物から得られる抗血清からなる１次抗体を、前記調製されたプレートに添加する１次抗体添加工程と、
酵素により標識され、前記１次抗体と結合する２次抗体を、前記調製されたプレートに添加する２次抗体添加工程と、
前記酵素と反応する酵素基質を前記調製されたプレートに添加し、当該酵素と当該酵素基質とが反応して蛍光する蛍光強度から前記検体に寄生する寄生虫を検出する検出工程と、を備える、
ことを特徴とする。
In order to achieve the above object, a method for detecting a parasite according to the first aspect of the present invention includes:
A collection process for collecting a piece of meat from the muscle of the specimen;
A plate preparation step of preparing a solid phase antigen using the collected piece of meat as an antigen on a plate;
A primary antibody addition step of immunizing an animal with Kudoa septempunctata as an immunogen and then adding a primary antibody comprising antiserum obtained from the animal to the prepared plate;
A secondary antibody addition step of adding a secondary antibody that is labeled with an enzyme and binds to the primary antibody to the prepared plate;
Adding an enzyme substrate that reacts with the enzyme to the prepared plate, and detecting a parasite that parasitizes the specimen from the fluorescence intensity that the enzyme and the enzyme substrate react to fluoresce,
It is characterized by that.
前記蛍光強度から、前記検体に寄生する寄生虫の量を測定する寄生虫量測定工程と、
前記測定された寄生虫の量が１．０×１０６〜１．０×１０７以上の場合、毒性を警告する警告工程と、をさらに備えてもよい。
From the fluorescence intensity, a parasite amount measuring step for measuring the amount of parasites parasitic on the specimen,
When the measured amount of the parasite is 1.0 × 10 6 to 1.0 × 10 7 or more, it may further include a warning step for warning the toxicity.
前記検体は、カレイ目に属する魚でもよい。 The specimen may be a fish belonging to the flatfish.
前記寄生虫は、Kudoa septempunctata又はその亜種でもよい。 The parasite may be Kudoa septempunctata or a subspecies thereof.
前記動物は、鳥類に属する動物でもよい。 The animal may be an animal belonging to birds.
本発明の第２の観点に係るキットは、
Kudoa septempunctataを免疫原として動物に免疫させた後、当該動物から得られる抗血清からなる抗体と、
前記抗体又は前記抗体と反応する抗原を標識する酵素と、を備える、
ことを特徴とする。
The kit according to the second aspect of the present invention is:
After immunizing an animal with Kudoa septempunctata as an immunogen, an antibody comprising an antiserum obtained from the animal,
An enzyme that labels the antibody or an antigen that reacts with the antibody,
It is characterized by that.
本発明によれば、検体から寄生虫を簡便に検出することができる。 According to the present invention, parasites can be easily detected from a specimen.
本発明は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法）を用いて、検体に寄生する寄生虫を簡便に検出できる寄生虫の検出方法、及び、キットを提供する。ＥＬＩＳＡ法は、検出したい物質（ここでは、寄生虫）を抗体で特異的・選択的に捕捉する手法であり、検出を行う前の前処理（例えば、ｐＨ調製、物質洗浄等）が容易であること、物質を検出するまでの時間が短時間であること、精密で高価な分析機器を用いることなく物質を検出できること等の特徴を有する。このため、ＥＬＩＳＡ法を用いることにより、検体から寄生虫を簡便に検出することができる。 The present invention provides a method and kit for detecting a parasite that can easily detect a parasite parasitizing a specimen using an enzyme immunoassay (ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method). The ELISA method is a method for specifically and selectively capturing a substance to be detected (here, a parasite) with an antibody, and pretreatment (for example, pH adjustment, substance washing, etc.) before detection is easy. In addition, it has features such as a short time until the substance is detected and the ability to detect the substance without using a precise and expensive analytical instrument. For this reason, the parasite can be easily detected from the specimen by using the ELISA method.
本明細書において「検体」とは、カレイ目に属する魚であり、典型的には、カレイ科のカレイ、ヒラメ科のヒラメ、ウシノシタ科のウシノシタなどの食用魚である。また、本明細書において検体に寄生する「寄生虫」とは、粘液胞子虫の一種であるKudoa属septempunctata（Kudoa septempunctata）及びその亜種である。 In the present specification, the “specimen” is a fish belonging to the order of the flatfish, and is typically an edible fish such as the flatfish of the flounder family, the flatfish of the flounder family, or the bovine burs of the bovine family. In addition, the term “parasite” parasitic on a specimen in this specification refers to the genus Kudoa genus septempunctata (Kudoa septempunctata) and its subspecies.
（１．検体からの肉片採取）
まず、ＥＬＩＳＡ法に用いる対象物質である検体の肉片を、検体の筋肉から採取する。寄生虫は検体の筋肉に寄生することがわかっているため、検体の筋肉片をＥＬＩＳＡ法に用いる対象物質として用いる。検体の筋肉は、図１の○部分に示す、鰓蓋の裏部分、体幹、背骨と皮の間に走っている筋隔等である。図１に示す検体の眼がある側（有眼側）の筋肉（５ヶ所）、又は、眼がない側（無眼側、有眼側の裏側）の筋肉（５ヶ所）のいずれかから、綿棒やピンセット等を用いて、肉片を採取する。採取する肉片の量は、後述するプレートの数、サイズによって変化するものであり、任意である。なお、検体の筋肉からであれば、図１の○部分に限定されず、任意の部分から肉片を採取できる。
(1. Collecting meat pieces from specimens)
First, a piece of specimen meat that is a target substance used in the ELISA method is collected from the muscle of the specimen. Since it is known that the parasite parasitizes the muscle of the specimen, the muscle piece of the specimen is used as a target substance used in the ELISA method. The muscle of the specimen is the back part of the lid, the trunk, the muscle space running between the spine and the skin, etc., shown in the circled part of FIG. From one of the muscles (5 places) on the side of the specimen shown in FIG. 1 (the eyed side) or the muscles (5 places) on the side without the eyes (the back side of the eyeless side) Collect pieces of meat using a cotton swab or tweezers. The amount of meat pieces to be collected varies depending on the number and size of plates described later, and is arbitrary. In addition, if it is from the muscle | muscle of a test substance, it will not be limited to the (circle) part of FIG.
（２．プレートの調製）
次に、採取した肉片を抗原とする固相抗原をプレートに調製する。採取した検体の肉片を、１０％ｇｌｕｃｏｓｅ−ＰＢＳ溶液で懸濁して１０ｗ／ｖ％（weight/volume%）（湿重量）に調製し、破砕機を用いてメタルコーンで乳液状にする。乳液状の肉片を、約４℃で、約５分間、遠心分離して、上清液をＥＬＩＳＡ用プレートに分注する。上清液を分注したプレートを、約４℃で、約１５分間、遠心分離した後、約４℃で、約１６時間放置する。これにより、図２に示すように、検体から採取した抗原をプレート上に固定することにより、プレート上に固相抗原を調製できる。
(2. Preparation of plate)
Next, a solid phase antigen using the collected piece of meat as an antigen is prepared on a plate. The sampled meat pieces are suspended in a 10% glucose-PBS solution to prepare 10 w / v% (weight / volume%) (wet weight), and made into an emulsion with a metal cone using a crusher. The milky meat pieces are centrifuged at about 4 ° C. for about 5 minutes, and the supernatant is dispensed into an ELISA plate. The plate into which the supernatant has been dispensed is centrifuged at about 4 ° C. for about 15 minutes, and then left at about 4 ° C. for about 16 hours. Thereby, as shown in FIG. 2, the solid-phase antigen can be prepared on the plate by fixing the antigen collected from the specimen on the plate.
（３．１次抗体の調製）
次に、固相抗原と反応する１次抗体を調製する。検体の筋肉からパーコール法で精製したKudoa septempunctataの湿重量を測定し、当該Kudoa septempunctataを、５０％グリセリン−ＰＢＳで懸濁して１０ｍｇ（湿重量）／ｍｌ溶液とし、使用時まで約−２０℃で保存する。Kudoa septempunctataを含む懸濁液を、プラスチック試験管に分注し、超音波発生装置のマイクロチップを用いて超音波破砕する。超音波破砕したKudoa septempunctataを含む懸濁液と、懸濁液と等量のアジュバント４０ｍｇ／ｍｌ溶液とを混合して免疫原とし、約１．５ｍｇ（湿重量）の免疫原を鳥類に属する動物（例えば、ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、ウズラ等）の胸部に数カ所（例えば、６ヶ所）に分けて免疫する。同様の免疫を、約２週間ごとに３回行った後、全身麻酔した動物の心臓から全採血し、血液を、約４℃で、約１０分間、遠心分離した後、抗血清を得る。得られた抗血清を１次抗体として、固相抗原が調製されたプレートに添加して、室温で、約６０分間、十分反応させる。十分反応させた後、余剰の１次抗体をプレート上から除去する。これにより、図２に示すように、プレート上の固相抗原と当該固相抗原と反応する１次抗体とを結合させることができる。
(3.1 Preparation of primary antibody)
Next, a primary antibody that reacts with the solid phase antigen is prepared. The wet weight of Kudoa septempunctata purified from the specimen muscle by the Percoll method was measured, and the Kudoa septempunctata was suspended in 50% glycerin-PBS to form a 10 mg (wet weight) / ml solution at about −20 ° C. until use. save. The suspension containing Kudoa septempunctata is dispensed into plastic test tubes and sonicated using a microchip of an ultrasonic generator. An animal that belongs to birds is prepared by mixing an ultrasonically disrupted suspension containing Kudoa septempunctata and an equal volume of adjuvant 40 mg / ml solution to make an immunogen, and about 1.5 mg (wet weight) of the immunogen Immunize the chest of (eg, chicken, turkey, ostrich, quail, etc.) in several places (eg, 6 places). Similar immunization is performed three times about every 2 weeks, and then whole blood is collected from the heart of an anesthetized animal, and the blood is centrifuged at about 4 ° C. for about 10 minutes to obtain antiserum. The obtained antiserum is added as a primary antibody to the plate on which the solid-phase antigen has been prepared, and allowed to react for approximately 60 minutes at room temperature. After sufficient reaction, excess primary antibody is removed from the plate. Thereby, as shown in FIG. 2, the solid phase antigen on a plate and the primary antibody which reacts with the said solid phase antigen can be combined.
（４．２次抗体の調製）
次に、酵素により標識され、１次抗体と結合する２次抗体を調製する。２次抗体は、１次抗体を得た動物に依存する。抗血清を得た動物に対応する免疫グロブリンを調製（選択）することにより、２次抗体である免疫グロブリンが、１次抗体を認識することができる。例えば、１次抗体をニワトリから得た場合、２次抗体は、抗ニワトリ免疫グロブリン（例えば、抗ニワトリＩｇＡ、抗ニワトリＩｇＧ、抗ニワトリＩｇＭ等）である。２次抗体を標識する酵素は、例えば、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼである。上述した１次抗体を認識し、酵素により標識された２次抗体を、固相抗原と１次抗体とが反応したプレートに添加して、室温で、約６０分間、十分反応させる。十分反応させた後、余剰の２次抗体をプレート上から除去する。これにより、図２に示すように、固相抗原に結合した１次抗体と当該１次抗体と反応する酵素標識された２次抗体とを結合させることができる。
(4. Preparation of secondary antibody)
Next, a secondary antibody that is labeled with an enzyme and binds to the primary antibody is prepared. The secondary antibody depends on the animal from which the primary antibody was obtained. By preparing (selecting) an immunoglobulin corresponding to the animal from which the antiserum was obtained, the secondary antibody immunoglobulin can recognize the primary antibody. For example, when the primary antibody is obtained from a chicken, the secondary antibody is an anti-chicken immunoglobulin (eg, anti-chicken IgA, anti-chicken IgG, anti-chicken IgM, etc.). Enzymes that label the secondary antibody are, for example, β-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, and luciferase. A secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with an enzyme is added to a plate in which the solid phase antigen and the primary antibody have reacted, and the mixture is allowed to react for about 60 minutes at room temperature. After sufficient reaction, excess secondary antibody is removed from the plate. Thus, as shown in FIG. 2, the primary antibody bound to the solid phase antigen and the enzyme-labeled secondary antibody that reacts with the primary antibody can be bound.
（５．寄生虫の検出）
次に、酵素基質を添加して、酵素基質と酵素とが反応して蛍光する蛍光強度から検体に寄生する寄生虫を検出する。プレートに添加する酵素基質は、例えば、β-ガラクトシダーゼ用基質（アリール、アルキル-β-D-ガラクトシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド等）、ペルオキシダーゼ用基質（4-アミノフェナゾン、2,4-ジクロロフェノール、4-クロロ-1-ナフトール等）、アルカリホスファターゼ用基質（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリルホスファターゼp-トルイジン塩等）、ルシフェラーゼ用基質（D-ルシフェリン等）である。当該酵素基質を１次抗体及び２次抗体が添加されたプレートに添加して、約３７℃で、約６０分間、反応させた後、蛍光強度をプレートリーダー（蛍光光度計）で測定する。予め測定した基準となるKudoa septempunctataの蛍光強度と測定された蛍光強度と比較することにより、寄生虫（Kudoa septempunctata）を検出する。また、蛍光強度とプレート上の抗原量及び抗体量とは所定の関係（例えば、比例関係）を有するため、プレートリーダーにより測定した蛍光強度から、抗原量（寄生虫の量、数、濃度）を測定する。これにより、図２に示すように、酵素と酵素基質との蛍光反応から、寄生虫を検出し、寄生虫の量を測定できる。
(5. Detection of parasites)
Next, an enzyme substrate is added, and parasites parasitic on the specimen are detected from the fluorescence intensity that the enzyme substrate reacts with the enzyme and fluoresces. The enzyme substrate added to the plate is, for example, a substrate for β-galactosidase (aryl, alkyl-β-D-galactoside, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside, etc.), for peroxidase Substrates (4-aminophenazone, 2,4-dichlorophenol, 4-chloro-1-naphthol, etc.), alkaline phosphatase substrates (nitroblue tetrazolium chloride, 5-bromo-4-chloro-3'-indolylphosphatase p -Toluidine salts, etc.) and luciferase substrates (D-luciferin, etc.). The enzyme substrate is added to the plate to which the primary antibody and the secondary antibody have been added and reacted at about 37 ° C. for about 60 minutes, and then the fluorescence intensity is measured with a plate reader (fluorimeter). Parasites (Kudoa septempunctata) are detected by comparing the fluorescence intensity of Kudoa septempunctata, which is a previously measured standard, with the measured fluorescence intensity. In addition, since the fluorescence intensity and the amount of antigen and antibody on the plate have a predetermined relationship (for example, a proportional relationship), the amount of antigen (amount, number and concentration of parasites) is calculated from the fluorescence intensity measured by a plate reader. taking measurement. Thereby, as shown in FIG. 2, the parasite can be detected and the amount of the parasite can be measured from the fluorescence reaction between the enzyme and the enzyme substrate.
（６．毒性の警告）
動物実験等で得られた毒性を示すデータを用いてリスク評価を行う場合、安全性を確保するために安全係数が用いられる。通常、安全係数として、動物からヒトへの種差に対しての安全性として１０倍、人間の性別、年齢等の個体差に対する安全性として１０倍、両安全性を合わせて見込んで１００倍の値が採用されている。そこで、本発明では、１０〜１００倍の安全係数を採用する。資料（生食用生鮮食品を共通食とする病因物質不明有症事例を巡る経緯 平成２３年４月２５日 厚生労働省医薬食品局食品*** 監視安全課、URL:http://www.mhlw.go.jp/stf/shingi/2r9852000001ahy8-att/2r9852000001aib5.pdf）には、食中毒の発症に繋がる寄生虫（Kudoa septempunctata）の摂取量（個）が記載されている。この資料では、パーセンタイル値が７５％（クドア摂取量（個）７．２０×１０７）以上である場合に、食中毒を発症することが記載されている。このため、１０〜１００倍の安全係数を採用して、寄生虫の量が１．０×１０６〜１．０×１０７（小数点以下繰り上げ）以上の場合、毒性（食中毒の危険性）を警告する。具体的には、１０倍の安全係数を採用した場合、寄生虫の量が１．０×１０７（≒７．２０×１０７×１／１０）以上で毒性を警告し、１００倍の安全係数を採用した場合、寄生虫の量が１．０×１０６（≒７．２０×１０７×１／１００）以上で毒性を警告する。
(6. Toxicity warning)
When risk assessment is performed using data showing toxicity obtained from animal experiments or the like, a safety factor is used to ensure safety. Usually, the safety factor is 10 times the safety against species differences from animals to humans, 10 times the safety against individual differences such as human gender and age, and 100 times the value considering both safety Is adopted. Therefore, in the present invention, a safety factor of 10 to 100 times is adopted. Document (Background of cases of symptom unknown etiological substances that use fresh foods as a common food) April 25, 2011 Food Safety Department, Food Safety Department, Ministry of Health, Labor and Welfare, URL: http: //www.mhlw.go .jp / stf / shingi / 2r9852000001ahy8-att / 2r9852000001aib5.pdf) describes the intake (individuals) of parasites (Kudoa septempunctata) that lead to the development of food poisoning. This document describes that food poisoning occurs when the percentile value is 75% (quador intake (individual) 7.20 × 10 7 ) or more. For this reason, if a safety factor of 10 to 100 times is adopted and the amount of parasites is 1.0 × 10 6 to 1.0 × 10 7 (rounded up after the decimal point), toxicity (risk of food poisoning) Warning. Specifically, when a safety factor of 10 times is adopted, toxicity is warned when the amount of parasite is 1.0 × 10 7 (≈7.20 × 10 7 × 1/10) or more, and 100 times safety is achieved. When the coefficient is adopted, toxicity is warned when the amount of the parasite is 1.0 × 10 6 (≈7.20 × 10 7 × 1/100) or more.
（７．寄生虫を検出するためのキット）
本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ法を用いて、検体から寄生虫を検出するためのキットである。キットは、Kudoa septempunctataを免疫原として動物に免疫させた後、当該動物から得られる抗血清からなる抗体と、抗体又は抗体と反応する抗原を標識する酵素と、を備える。ここで、動物から得られる抗血清からなる抗体は、上述した１次抗体に相当し、抗体と反応する抗原は、上述した（固相）抗原に相当し、抗体又は抗原を標識する酵素は、上述した酵素基質と反応する酵素に相当する。
(7. Kit for detecting parasites)
The kit of the present invention is a kit for detecting a parasite from a specimen using an ELISA method. The kit comprises an antibody comprising an antiserum obtained from the animal after immunization of the animal using Kudoa septempunctata as an immunogen, and an enzyme that labels the antibody or an antigen that reacts with the antibody. Here, an antibody composed of antiserum obtained from an animal corresponds to the above-described primary antibody, an antigen that reacts with the antibody corresponds to the above-described (solid phase) antigen, and an enzyme that labels the antibody or antigen is: It corresponds to an enzyme that reacts with the enzyme substrate described above.
次に、キットを使用する方法について説明する。まず、抗血清からなる抗体をプレートに添加する。続いて、検体から採取した肉片を調製して抗原とし、当該抗原を抗体が添加されたプレートに添加する。抗体と抗原とを十分反応させた後、余剰の抗体、抗原を除去する。次に、抗体又は抗原と結合する酵素をプレートに添加して、十分反応させた後、酵素と反応する酵素基質をプレートに添加して、十分反応させる。そして、酵素と酵素基質との反応により発光した蛍光強度を、プレートリーダー等を用いて測定することにより、寄生虫を検出し、また、寄生虫の量を測定する。なお、肉片から抗原を調製する方法は、上述したプレートの調整方法と同様の方法を用いることができる。 Next, a method for using the kit will be described. First, an antibody consisting of antiserum is added to the plate. Subsequently, a piece of meat collected from the specimen is prepared as an antigen, and the antigen is added to the plate to which the antibody is added. After sufficiently reacting the antibody and the antigen, excess antibody and antigen are removed. Next, an enzyme that binds to an antibody or antigen is added to the plate and allowed to react sufficiently, and then an enzyme substrate that reacts with the enzyme is added to the plate and allowed to react sufficiently. And the parasite is detected by measuring the fluorescence intensity emitted by the reaction between the enzyme and the enzyme substrate using a plate reader or the like, and the amount of the parasite is measured. In addition, the method similar to the adjustment method of the plate mentioned above can be used for the method of preparing an antigen from a meat piece.
以上説明したように、ＥＬＩＳＡ法は検出を行う前の前処理が容易であるため、検体から寄生虫を簡便に検出することができる。また、前処理が容易であるため検出するための準備時間が短く、蛍光強度を測定する時間も短いため、検体から寄生虫を短時間で検出することができる。さらに、ＥＬＩＳＡ法では、精密で高価な分析機器を用いる必要がないため、検体から寄生虫を安価に検出することができる。 As described above, since the ELISA method is easy to pre-process before detection, the parasite can be easily detected from the specimen. In addition, since pre-processing is easy, preparation time for detection is short, and the time for measuring fluorescence intensity is short, so that parasites can be detected from the specimen in a short time. Furthermore, in the ELISA method, it is not necessary to use a precise and expensive analytical instrument, so that the parasite can be detected from the specimen at a low cost.
なお、本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。 In addition, this invention is not limited to the said embodiment, A various deformation | transformation and application are possible.
免疫原を免役させる動物は、鳥類に限定されず、任意の動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、アカゲザル等）を用いることができる。 The animal that immunizes the immunogen is not limited to birds, and any animal (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, pig, cow, rhesus monkey, etc.) can be used.
免疫原の量、免疫原を投与する部位、免疫回数、免疫を行う間隔は、動物の種類、大きさ、心臓の位置等によって任意に変更できる。 The amount of the immunogen, the site where the immunogen is administered, the number of immunizations, and the interval between immunizations can be arbitrarily changed depending on the type, size, heart position, etc.
抗原に対する免疫応答を増強したり、抗原を生体内に長時間とどまらせたりする役割を果たすアジュバントであれば、種類、量は任意である。 The type and amount of the adjuvant are arbitrary as long as the adjuvant plays a role of enhancing the immune response to the antigen or keeping the antigen in the living body for a long time.
Kudoa septempunctataが寄生した検体の肉はジェリーミート等にはなっておらず、肉眼での検査では無症状であるため、パーコール法によりKudoa septempunctataを精製したが、顕微鏡検査、ＰＣＲ法検査等、任意の方法で、Kudoa septempunctataを精製することもできる。 Kudoa septempunctata-infested specimens are not jelly meat, and are asymptomatic by visual inspection, so Kudoa septempunctata was purified by the Percoll method. Kudoa septempunctata can also be purified by the method.
１次抗体は、Kudoa septempunctata又はその亜種を検出し得る抗体であれば限定されず、例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体並びにこれらの結合活性断片等であってもよい。 The primary antibody is not limited as long as it is an antibody that can detect Kudoa septempunctata or its subspecies, and examples thereof include monoclonal and polyclonal antibodies, labeled antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and binding activity fragments thereof. Also good.
２次抗体を標識する酵素は、反応する酵素基質によって変更できるものであり、任意である。 The enzyme that labels the secondary antibody can be changed depending on the enzyme substrate to be reacted, and is optional.
２次抗体を標識する方法は、酵素活性を利用するものに限定されず、オートラジオグラフィー方法、金コロイド法等、任意である。 The method for labeling the secondary antibody is not limited to those utilizing enzyme activity, and is optional such as an autoradiography method or a gold colloid method.
免疫グロブリンのアイソタイプは、任意である。 The isotype of the immunoglobulin is arbitrary.
任意の動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、アカゲザル等）を用いて、２次抗体を調製することができ、また、２次抗体の免疫動物（２次抗体を調製する際に用いた動物）によって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも調製することもできる。 Secondary antibodies can be prepared using any animal (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, pig, cow, rhesus monkey, etc.), and immunized animals of the secondary antibody (secondary antibody Depending on the animal used for the preparation, either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be prepared.
酵素基質は、酵素と反応して蛍光するもの、化学発光するもの、吸光度が変化するものであれば任意である。 The enzyme substrate is optional as long as it reacts with the enzyme to fluoresce, chemiluminescent, or changes in absorbance.
安全係数として、子供や高齢者等のハイリスクグループに対して、より厳しい安全係数として２００〜５００倍の値を採用することもできる。 As a safety factor, a value of 200 to 500 times can be adopted as a stricter safety factor for a high-risk group such as a child or an elderly person.
本発明の寄生虫の検出方法において、酵素は、２次抗体と結合しているが、酵素と酵素基質との蛍光反応によって寄生虫を検出できればよいため、抗体、抗原のどちらと結合していてもよい。 In the method for detecting a parasite of the present invention, the enzyme is bound to the secondary antibody. However, since it is sufficient that the parasite can be detected by a fluorescent reaction between the enzyme and the enzyme substrate, the enzyme is bound to either the antibody or the antigen. Also good.
上述した反応条件（温度、時間等）は、抗原、抗体、酵素、酵素基質等の量や種類によって変化するものであり、上述した値に限定されるものではない。 The reaction conditions (temperature, time, etc.) described above vary depending on the amount and type of antigen, antibody, enzyme, enzyme substrate, etc., and are not limited to the values described above.
本発明のキットは、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等のいずれのＥＬＩＳＡ法でも使用することができる。また、キットは、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬を含んでもよい。 The kit of the present invention can be used in any ELISA method such as a direct adsorption method, a sandwich method, and a competitive method. The kit may contain reagents such as a buffer solution, a chromogenic substrate, a secondary antibody, and a blocking agent.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, an Example does not limit this invention.
（１．固相抗原プレートの調製）
ＥＬＩＳＡ法で使用する固相抗原プレートを調製した。まず、市場から２０のヒラメ検体を用意し、それぞれのヒラメ検体の筋肉から肉片を採取した。採取したそれぞれの検体の肉片を、１０％ｇｌｕｃｏｓｅ−ＰＢＳ溶液で懸濁して１０ｗ／ｖ％（湿重量）に調製し、破砕機（安井機器製マルチビーズショッカー）及びメタルコーンを用いて、２４００回転、３０秒、５回、４℃の設定で、乳液状にした。乳液状の肉片を、遠心分離器（佐久間製作所製Sakuma M-150IV）及びローター（佐久間製作所製15.2M-18A）を用いて、遠心加速度１９７００Ｇ、５分間，４℃の設定で、遠心分離した、遠心分離した上清液を、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（BD Falcon製353279）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、当該プレートを、遠心分離器（佐久間製作所製SakumaR90-23）及びローター（佐久間製作所製HM-25）を用いて、遠心加速度１６００Ｇ、１５分間，４℃の設定で、遠心分離した。遠心分離したプレートを、４℃で、１６時間放置して、ヒラメ検体の肉片を抗原とする固相抗原をプレート上に調製した。これにより、２０のヒラメ検体それぞれについて、抗原がプレートに固定化された、ＥＬＩＳＡ用プレートを得た。
(1. Preparation of solid phase antigen plate)
A solid phase antigen plate for use in the ELISA method was prepared. First, 20 flounder samples were prepared from the market, and meat pieces were collected from the muscles of each flounder sample. Meat pieces of each sample collected were suspended in 10% glucose-PBS solution to prepare 10 w / v% (wet weight), and rotated 2400 times using a crusher (multi-bead shocker manufactured by Yasui Instruments) and a metal cone. For 30 seconds, 5 times, and 4 ° C. The milky meat pieces were centrifuged using a centrifuge (Sakuma M-150IV manufactured by Sakuma Seisakusho) and a rotor (15.2M-18A manufactured by Sakuma Seisakusho) at a centrifugal acceleration of 19700 G for 5 minutes at 4 ° C. The centrifuged supernatant was dispensed into a 96-well plate for ELISA (BD Falcon, 353279) at a rate of 50 μl / well, and the plate was separated into a centrifuge (Sakuma R90-23, manufactured by Sakuma Corporation) and a rotor (HM, manufactured by Sakuma Corporation). -25), the mixture was centrifuged at a centrifugal acceleration of 1600 G for 15 minutes at a setting of 4 ° C. The centrifuged plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours to prepare a solid-phase antigen on the plate using a flesh piece of a soleus specimen as an antigen. As a result, an ELISA plate in which the antigen was immobilized on the plate was obtained for each of the 20 sole samples.
（２．抗クドア抗体の調製）
ＥＬＩＳＡ用プレートに添加する抗クドア抗体を調製した。まず、ヒラメの筋肉（体幹）から、パーコール法により、図３に示すようにKudoa septempunctataを精製した。精製したKudoa septempunctataを、５０％グリセリン−ＰＢＳで懸濁して１０ｍｇ（湿重量）／ｍｌ溶液とし、使用時まで−２０℃で保存した。Kudoa septempunctataを含む懸濁液１ｍｌを、容量１５ｍｌのプラスチック試験管（イワキ製Iwaki2325-015）に分注し、超音波発生装置（ブランソンジャパン製Branson model 185）のマイクロチップを用いて、パワー１．５、２０秒、３回の設定で、超音波破砕した。超音波破砕した懸濁液に含まれるKudoa septempunctataの蛋白質量を、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ 法）により、１０ｍｇ／ｍｌ（湿重量）＝３２μｇ／ｍｌ（血清アルブミン溶液相当）として、プロテインアッセイキット（Pierce製BCA Protein Assay kit製品番号23225）及びマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific製Model 680）を用いて測定した。Kudoa septempunctataの蛋白質量と等量のアジュバント４０ｍｇ／ｍｌ溶液（Thermo Scientific製Imject Alum 77161）とを混合して免疫原とし、１．５ｍｇ（湿重量）の免疫原をニワトリ（日本白色種、１２ 週齢、雌）の胸部に６ヶ所に分けて免疫した。同様の免疫を、２週間ごとに３回行った後、ペントバルビタールナトリウムを投与して全身麻酔したニワトリの心臓から全採血し、血液を、遠心分離器（佐久間製作所製Sakuma M-150 IV）及びローター（佐久間製作所製50F-4A）を用いて、遠心加速度３５００Ｇ、１０分間，４℃の設定で、遠心分離した後、ニワトリ抗血清を得た。得られたニワトリ抗血清は、抗クドア抗体である１次抗体である。
(2. Preparation of anti-quad antibody)
An anti-quad antibody to be added to the ELISA plate was prepared. First, Kudoa septempunctata was purified from flounder muscles (trunk) by the Percoll method as shown in FIG. The purified Kudoa septempunctata was suspended in 50% glycerin-PBS to make a 10 mg (wet weight) / ml solution, and stored at −20 ° C. until use. Dispense 1 ml of the suspension containing Kudoa septempunctata into a 15 ml plastic test tube (Iwaki2325-015 manufactured by Iwaki), and use a microchip of an ultrasonic generator (Branson model Branson model 185) with a power of 1. The ultrasonic crushing was performed for 5 to 20 seconds and 3 times. The protein amount of Kudoa septempunctata contained in the ultrasonically disrupted suspension was determined as 10 mg / ml (wet weight) = 32 μg / ml (corresponding to serum albumin solution) by the bicinchoninic acid method (BCA method). BCA Protein Assay kit product number 23225) and microplate reader (Thermo Scientific Model 680). A 40 mg / ml adjuvant (Imject Alum 77161 manufactured by Thermo Scientific) with an equal amount of Kudoa septempunctata protein was mixed to make an immunogen, and 1.5 mg (wet weight) of the immunogen was treated with chicken (Japanese white species, 12 weeks). The breasts of ages and females were immunized at 6 locations. The same immunization was performed 3 times every 2 weeks, and then whole blood was collected from the heart of a chicken anesthetized with sodium pentobarbital, and the blood was collected using a centrifuge (Sakuma M-150 IV manufactured by Sakuma Seisakusho) and Using a rotor (50F-4A manufactured by Sakuma Seisakusho), centrifugation was performed at a centrifugal acceleration of 3500 G, 10 minutes, and at a setting of 4 ° C., and then a chicken antiserum was obtained. The obtained chicken antiserum is a primary antibody which is an anti-quad antibody.
（３．ＥＬＩＳＡ法による測定）
得られたニワトリ抗血清を２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で、６０分間、反応させた後、プレートウォッシャー（バイオテック製Sera Washer Model MW-96W）を用いて、余剰のニワトリ抗血清をプレート上から除去した。２次抗体であるβ-ガラクトシダーゼ−ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（American Qualex製goat anti-chicken IgG (H&L) -β- galactosidase 製品番号 A176GN）を１０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で、６０分間、反応させた後、プレートウォッシャー（バイオテック製Sera Washer Model MW-96W）を用いて、余剰のβ-ガラクトシダーゼ−ヤギ抗ニワトリＩｇＧをプレート上から除去した。酵素基質として０．１ｍＭの４−メチルウンベリフェリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Sigma製 製品番号M1633）、０．１Ｍの２−メルカプトエタノール（ナカライテスク製、製品番号21418-42）をＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で、６０分間、酵素であるβ-ガラクトシダーゼと反応させた。プレートリーダー（蛍光：パーキンエルマー製Arvo SX）を用いて、測定時間０．１秒、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの設定で、蛍光強度を測定した。また、該当するヒラメ検体について、顕微鏡を用いて、検体の肉片１グラム当たりのKudoa septempunctataの個数を測定した。
(3. Measurement by ELISA method)
The obtained chicken antiserum was diluted 2000 times, dispensed 50 μl / well into an ELISA plate, reacted at room temperature for 60 minutes, and then a plate washer (Biotech Sera Washer Model MW-96W) was attached. Used to remove excess chicken antiserum from the plate. Secondary antibody β-galactosidase-goat anti-chicken IgG (American Qualex goat anti-chicken IgG (H & L) -β-galactosidase product number A176GN) was diluted 1000 times and dispensed into ELISA plate at 50 μl / well. After reacting at room temperature for 60 minutes, excess β-galactosidase-goat anti-chicken IgG was removed from the plate using a plate washer (Biotech Sera Washer Model MW-96W). As an enzyme substrate, 0.1 mM 4-methylumbelliferyl β-D-galactopyranoside (manufactured by Sigma, product number M1633) and 0.1M 2-mercaptoethanol (manufactured by Nacalai Tesque, product number 21418-42) were ELISA. 100 μl / well was dispensed on a plate for reaction, and reacted with β-galactosidase as an enzyme at 37 ° C. for 60 minutes. Using a plate reader (fluorescence: Arvo SX manufactured by PerkinElmer), the fluorescence intensity was measured with a measurement time of 0.1 second, an excitation wavelength of 355 nm, and a fluorescence wavelength of 460 nm. In addition, the number of Kudoa septempunctata per gram of the sample was measured for the corresponding flounder sample using a microscope.
図４は、測定結果を示す図である。図４中において、ヒラメ検体番号（hirame sup.）２１は、Kudoa septempunctataが寄生したヒラメ検体から肉片を採取した場合の蛍光強度（陽性コントロール）であり、ヒラメ検体番号２２は、Kudoa septempunctataが寄生していないヒラメ検体から肉片を採取した場合の蛍光強度（陰性コントロール）であり、ヒラメ検体番号２３（Kudoa）は、Kudoa septempunctataのみの蛍光強度である。 FIG. 4 is a diagram showing the measurement results. In FIG. 4, flounder specimen number (hirame sup.) 21 is the fluorescence intensity (positive control) when meat pieces are collected from a flounder specimen infested with Kudoa septempunctata, and flounder specimen number 22 is infested with Kudoa septempunctata. This is the fluorescence intensity (negative control) when a piece of meat is collected from a flounder specimen that is not, and flounder specimen number 23 (Kudoa) is the fluorescence intensity of only Kudoa septempunctata.
図４に示すように、ヒラメ検体番号２、３、６、７、１３、１４、１６、１７の蛍光強度は、陽性コントロールが示す蛍光強度と同等又それ以上であった。このため、これらのヒラメ検体には、Kudoa septempunctataが寄生していることがわかった。一方、ヒラメ検体番号１、４、５、８〜１２、１５、１８〜２０の蛍光強度は、陰性コントロールが示す蛍光強度と同等又はそれ以下であった。このため、これらのヒラメ検体には、Kudoa septempunctataが寄生していない、または、寄生していても数（量）が少ないため毒性を示さないことがわかった。 As shown in FIG. 4, the fluorescence intensity of flounder specimen numbers 2, 3, 6, 7, 13, 14, 16, and 17 was equal to or higher than the fluorescence intensity exhibited by the positive control. Therefore, it was found that these flounder specimens were parasitic on Kudoa septempunctata. On the other hand, the fluorescence intensity of flounder specimen numbers 1, 4, 5, 8-12, 15, 18-20 was equal to or less than the fluorescence intensity exhibited by the negative control. For this reason, it was found that these flounder samples do not show toxicity because Kudoa septempunctata is not infested, or even if it is infested, the number (amount) is small.
また、ヒラメ検体番号２、３、４、６、７、１３、１４、１６、１７、１９について、ヒラメの筋肉片１グラム当たりの寄生虫の数を、顕微鏡を用いて測定した。その結果、図４に示すように、ヒラメの筋肉片１グラム当たりのKudoa septempunctataの数が３００（×１０３Kudoa/g）以上であるヒラメ検体の蛍光強度は、陽性コントロールが示す蛍光強度と同等又はそれ以上であった。このため、ヒラメの筋肉片１グラム当たりのKudoa septempunctataの数が３．００×１０５以上である場合、当該ヒラメを喫食すると、食中毒の危険性があることがわかった。 Further, the number of parasites per gram of flounder muscle pieces was measured with a microscope for flounder specimen numbers 2, 3, 4, 6, 7, 13, 14, 16, 17, and 19. As a result, as shown in FIG. 4, the fluorescence intensity of the flounder specimen in which the number of Kudoa septempunctata per gram of flounder muscle pieces is 300 (× 10 3 Kudoa / g) or more is equivalent to the fluorescence intensity exhibited by the positive control. Or more. For this reason, it was found that if the number of Kudoa septempunctata per gram of flounder muscles is 3.00 × 10 5 or more, eating the flounder may cause food poisoning.
（４．抗クドア抗体の特異性の確認）
次に、抗原抗体反応により、ニワトリ抗血清から得られた抗クドア抗体が、Kudoa septempunctataを特異的に認識するかを確認した。まず、下痢症状のモデルとして使用されるヒト結腸癌由来の細胞株Caco-2細胞に感染させたKudoa septempunctataを、非蛍光下で微分干渉顕微鏡を用いて観察（確認）した。図５の微分干渉像に示すように、微分干渉像の矢印部にKudoa septempunctataが存在することを確認した。続いて、蛍光標識された抗クドア抗体と反応させたKudoa septempunctataを、蛍光下で蛍光顕微鏡を用いて観察した。抗原抗体反応により、抗クドア抗体がKudoa septempunctataを認識した場合、Kudoa septempunctataが存在する位置が蛍光するはずである。図５の蛍光像に示すように、微分干渉像の矢印部と同位置に、蛍光部（着色部）を確認した。このため、抗クドア抗体が、抗原であるKudoa septempunctataを特異的に認識することがわかった。また、抗クドア抗体を用いて抗原抗体反応により、Kudoa septempunctataを検出できることがわかった。
(4. Confirmation of specificity of anti-quad antibody)
Next, it was confirmed by antigen-antibody reaction whether the anti-quad antibody obtained from chicken antiserum specifically recognizes Kudoa septempunctata. First, Kudoa septempunctata infected with human colon cancer cell line Caco-2 cells used as a model of diarrhea symptoms was observed (confirmed) using a differential interference microscope under non-fluorescence. As shown in the differential interference image of FIG. 5, it was confirmed that Kudoa septempunctata was present in the arrow part of the differential interference image. Subsequently, Kudoa septempunctata reacted with a fluorescently labeled anti-quad antibody was observed under fluorescence using a fluorescence microscope. When the anti-quad antibody recognizes Kudoa septempunctata by the antigen-antibody reaction, the position where Kudoa septempunctata is present should fluoresce. As shown in the fluorescent image of FIG. 5, the fluorescent part (colored part) was confirmed at the same position as the arrow part of the differential interference image. Therefore, it was found that the anti-quad antibody specifically recognizes the antigen Kudoa septempunctata. It was also found that Kudoa septempunctata can be detected by antigen-antibody reaction using an anti-quad antibody.
以上の結果から、ヒラメの筋肉にKudoa septempunctataが寄生していることが明らかとなった。また、免疫原を投与する動物としてニワトリが有用であることが明らかとなった。また、ＥＬＩＳＡ法を用いて、検体から寄生虫を検出できることが明らかとなった。また、肉片１グラム当たり３．００×１０５以上の寄生虫が寄生している検体を喫食した場合、食中毒の危険性があることが明らかとなった。
From the above results, it was revealed that Kudoa septempunctata was parasitic on the soleus muscle. It has also been found that chickens are useful as animals to receive immunogens. Moreover, it became clear that a parasite can be detected from a specimen using an ELISA method. In addition, it was revealed that there was a risk of food poisoning when eating a specimen infested with parasites of 3.00 × 10 5 or more per gram of meat.
Claims (6)
前記採取された肉片を抗原とする固相抗原をプレートに調製するプレート調製工程と、
Kudoa septempunctataを免疫原として動物に免疫させた後、当該動物から得られる抗血清からなる１次抗体を、前記調製されたプレートに添加する１次抗体添加工程と、
酵素により標識され、前記１次抗体と結合する２次抗体を、前記調製されたプレートに添加する２次抗体添加工程と、
前記酵素と反応する酵素基質を前記調製されたプレートに添加し、当該酵素と当該酵素基質とが反応して蛍光する蛍光強度から前記検体に寄生する寄生虫を検出する検出工程と、を備える、
ことを特徴とする寄生虫の検出方法。 A collection process for collecting a piece of meat from the muscle of the specimen;
A plate preparation step of preparing a solid phase antigen using the collected piece of meat as an antigen on a plate;
A primary antibody addition step of immunizing an animal with Kudoa septempunctata as an immunogen and then adding a primary antibody comprising antiserum obtained from the animal to the prepared plate;
A secondary antibody addition step of adding a secondary antibody that is labeled with an enzyme and binds to the primary antibody to the prepared plate;
Adding an enzyme substrate that reacts with the enzyme to the prepared plate, and detecting a parasite that parasitizes the specimen from the fluorescence intensity that the enzyme and the enzyme substrate react to fluoresce,
A method for detecting a parasite characterized by the above.
前記測定された寄生虫の量が１．０×１０６〜１．０×１０７以上の場合、毒性を警告する警告工程と、をさらに備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の寄生虫の検出方法。 From the fluorescence intensity, a parasite amount measuring step for measuring the amount of parasites parasitic on the specimen,
A warning step of warning toxicity when the measured amount of parasite is 1.0 × 10 6 to 1.0 × 10 7 or more,
The method for detecting a parasite according to claim 1.
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の寄生虫の検出方法。 The specimen is a fish belonging to the flatfish,
The method of detecting a parasite according to claim 1 or 2.
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の寄生虫の検出方法。 The parasite is Kudoa septempunctata or a subspecies thereof,
The method for detecting a parasite according to any one of claims 1 to 3, wherein:
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の寄生虫の検出方法。 The animal is an animal belonging to birds.
The method for detecting a parasite according to any one of claims 1 to 4, wherein:
前記抗体又は前記抗体と反応する抗原を標識する酵素と、を備える、
ことを特徴とするキット。
After immunizing an animal with Kudoa septempunctata as an immunogen, an antibody comprising an antiserum obtained from the animal,
An enzyme that labels the antibody or an antigen that reacts with the antibody,
Kit characterized by that.
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